JP4317984B2 - 活性硫酸運搬作用を有するタンパク質、組織の癌化の検出方法 - Google Patents
活性硫酸運搬作用を有するタンパク質、組織の癌化の検出方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新たな活性硫酸運搬作用を有するタンパク質、かかるタンパク質をコードする核酸、及び前記タンパク質の「被験組織における発現量の検出値」と「当該被験組織の癌化」とを関連づけることによる「組織の癌化の検出方法」に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、硫酸運搬因子としては、例えば硫酸イオン運搬因子（非特許文献１）、活性硫酸運搬因子（非特許文献２（分子量75kDaの活性硫酸運搬因子を開示）、非特許文献３（分子量230kDaの活性硫酸運搬因子を開示））等が知られていたが、活性硫酸運搬因子をクローニングして、遺伝子工学的に大量合成を可能とする技術は確立されていなかった。
【０００３】
一方、組織の癌化を検出する方法としては、様々な方法が知られており、例えばＸ線検査、内視鏡検査や、CA19-9等の腫瘍マーカー検査等があげられる。Ｘ線検査や内視鏡検査などでは組織を外観からしか観察できないため、確定的な診断はできず、また腫瘍マーカーも偽陽性、偽陰性が現れる点で確定的な診断には不十分であった。
【０００４】
組織の癌化の確定診断は実際に組織を生検により採取し、その組織の培養を行って確認する方法によって行われているが、この方法は組織の培養にそれなりの時間が必要とされる。
【０００５】
一方、内視鏡下で外科的手法により、生体組織の病変部を切除する手術は一般になされている。例えばそのような病変部について簡単に癌化の有無を確認する手法が存在すれば、癌化の早期発見にも繋げることができ、その後の患者の治療や予防に役立てることができる。
【０００６】
また、特許文献にはN-アセチルグルコサミン転移酵素をコードするDNAを検出し、その「発現の変化」と「胃癌又は膵癌」とを関連づけることで、胃癌や膵癌の検出ができることが開示されている。
【０００７】
【特許文献】
特開平１１−１５７１９０号公報
【非特許文献１】
Cell, 78(6), pp.1073-1087(1994)
【非特許文献２】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91, pp.10707-10711
【非特許文献３】
Biochemistry, 35, pp.3695-3703
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
新たな活性硫酸運搬作用を有するタンパク質が発見されれば、生体内における物質運搬の仕組みの解明に繋がるため、このような発見が大いに期待されていた。また、採取した組織からなるべく早く、信頼性の高い「組織の癌化を検出する方法」の開発が強く望まれていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、新規な核酸を見い出し、かかる核酸がコードするタンパク質が新たな「活性硫酸運搬活性」を有すること、及び「癌化した組織における、前記タンパク質の発現量」が「健常組織における発現量」よりも増加していることを発見し、これを組織の癌化検出方法に応用することで本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１）下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列に1以上２１以下の置換、欠失、挿入、又は転位を有すると共に、活性硫酸運搬作用を有するタンパク質。
（２）活性硫酸運搬作用が、3'-ホスホアデノシン-5'-ホスホ硫酸運搬作用であることを特徴とする（１）記載のタンパク質。
（３）（１）又は（２）記載のタンパク質を活性成分として含有する活性硫酸運搬作用剤。
（４）（１）又は（２）記載のタンパク質の、活性硫酸運搬作用剤としての使用。
（５）（１）又は（２）記載のタンパク質の「被検組織における発現量の検出値」と、「前記被検組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする被検組織の癌化の検出方法。
（６）（１）又は（２）記載のタンパク質の「被検組織における発現量の検出値」が、「（１）又は（２）記載のタンパク質をコードする核酸の発現量」を定量し、該定量によって得られた値と健常組織における該核酸の発現量とを対比することによって得られる差であることを特徴とする（５）記載の被検組織の癌化の検出方法。
（７）「（１）又は（２）記載のタンパク質をコードする核酸の発現量」が下記（Ａ）又は（Ｂ）記載の塩基配列からなる核酸の発現量をであることを特徴とする（６）記載の被検組織の癌化の検出方法。
（Ａ）配列番号１記載の塩基配列の一部を含み、30〜1500bpの塩基配列；
（Ｂ）配列番号１記載の塩基配列の一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み、30〜1500bpである塩基配列。
（８）「塩基配列１記載の塩基配列の一部」が、「配列番号１記載の塩基番号145〜1443からなる塩基配列」、又は「配列番号１記載の塩基番号464〜553からなる塩基配列」であることを特徴とする（７）記載の組織の癌化の検出方法。
（９）前記被検組織が胃又は大腸由来の組織であることを特徴とする（５）〜（８）何れか一項記載の組織の癌化の検出方法。
（１０）配列番号１記載の全塩基配列の一部又は該一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み、30〜1500bpであることを特徴とする核酸。
（１１）配列番号１記載の塩基番号464〜553からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸であることを特徴とする（１０）記載の核酸。
（１２）配列番号１記載の塩基番号145〜1443からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含むことを特徴とする（１０）記載の核酸。
（１３）配列番号１記載の塩基番号145〜1443からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸であることを特徴とする（１０）記載の核酸。
（１４）DNAであることを特徴とする（１０）〜（１３）何れか記載の核酸。
（１５）（１０）〜（１４）何れか記載の核酸の、組織の癌化の検出のための使用。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明タンパク質
本発明タンパク質は、下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列に1以上21以下の置換、欠失、挿入、又は転位を有すると共に、活性硫酸運搬作用を有するタンパク質。
【００１２】
本発明タンパク質のうち、上記（ａ）に示すタンパク質は、配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号145〜1443の領域（コード領域：CDS）にコードされるタンパク質である。
【００１３】
一般に酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列のうち、一若しくは数個の構成アミノ酸が置換、欠失、挿入、或いは転位しても酵素活性が維持されることが知られており、そのような変異を有するタンパク質も同一タンパク質のバリアントであると言うことができる。本発明タンパク質における（ａ）のタンパク質においても配列番号２記載のアミノ酸配列に、一若しくは数個（2以上21以下）の構成アミノ酸の置換、欠失、挿入、或いは転位が起こっていても、活性硫酸を運搬する運搬作用を保持している限りにおいて、上記（ａ）で表されるタンパク質と実質的に同一の物質であるということができ、本発明タンパク質に包含される。このような変異を有するタンパク質は、配列番号１記載の塩基番号145〜1443に1以上数個（2以上63以下であることが好ましい）の塩基の置換、欠失、挿入、又は転位を有する塩基配列にコードされるタンパク質であるということができる。
【００１４】
このような変異を有するタンパク質のアミノ酸配列は、上記（ａ）で表されるポリペプチドのアミノ酸配列と95％以上、好ましくは96％以上、さらに好ましくは97％以上の相同性を有することが好ましい。アミノ酸配列の相同性は、FASTAのような周知のコンピュータソフトウェアを用いて容易に算出することができ、このようなソフトウェアはインターネットによっても利用に供されている。
【００１５】
すなわち、天然に存在するタンパク質には、それをコードする遺伝子DNAの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにも拘わらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示す物があることが知られている。このように構造的に若干の相違があってもその機能については大きな違いが認められないタンパク質も、上記「タンパク質」に包含される。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記の様な変異を導入した場合も同様であり、この場合には更に多種多様の「変異を有するタンパク質」を作成することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリン残基に置換したタンパク質がIL-2の活性を保持することが知られている（Science, 224(1984), p.1431）。またある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれに当たり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このような活性に必須でないペプチド領域の配列を有するタンパク質は、二次構造上は異なった形で存在しているが、同等の機能を有するタンパク質であり、「本発明タンパク質」もそのような配列が連結していても良い。このような「変異を有するタンパク質」は「部位特異的変異法」などの公知の方法により容易に作成することが可能である。
【００１６】
「本発明タンパク質」が運搬する活性硫酸としては、アデノシン5'-ホスホ硫酸（以下「APS」とも記載する）及び3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸（以下「PAPS」とも記載する）が好ましく、特にPAPSが好ましい。
【００１７】
「本発明タンパク質」が有する「活性硫酸運搬作用」の確認は、例えばJ. Biol. Chem.,275, pp.13580-13587の方法等にしたがって行うことができる。すなわち、[14C]、[3H]、又は[35P]などの放射性同位元素（[35P]が好ましい）で放射能標識した「活性硫酸（PAPS等）」と、上記「本発明タンパク質」とを混合し、そこに酵母の膜画分を添加して、膜画分に移行した放射能を測定する方法で行うことができる（このような方法としては具体的には後述の実施例２記載の方法が例示される）。
【００１８】
（２）本発明核酸
「本発明核酸」は、配列番号１記載の全塩基配列の一部又は該一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み、30〜1500bpであることを特徴とする核酸である。
【００１９】
「本発明核酸」における、「配列番号１記載の全塩基配列の一部」とは、30〜1500bp、好ましくは40〜1450bp、さらに好ましくは60〜1400bp、最も好ましくは80〜1300bpの長さからなる。このような核酸としては、例えば配列番号１記載の塩基番号464〜553からなる塩基配列からなる核酸、及び配列番号１記載の塩基番号145〜1443からなる塩基配列からなる核酸等が例示される。このような核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸は、後述の「本発明検出方法」へ使用することができ、特にこのような長さの核酸は、殊にハイブリダイズ能と取り扱いやすさの双方を兼ね備えているため、ハイブリダイズ用プローブとして優れている。上記で例示される核酸以外の核酸であっても、上記例示した長さの範囲内で、配列番号１記載の塩基配列、特に塩基番号145〜1443の範囲内から適宜選択することができる。
【００２０】
なお、本明細書で核酸の長さを表す単位「bp」とは、核酸が二本鎖となっている場合にその二本鎖を形成する塩基対の数、一本鎖となっている場合には、その核酸に相補的な塩基配列からなる一本鎖がハイブリダイズした二本鎖の塩基対数に相当する数に換算した核酸の長さである。従って例えば「1000bp」の一本鎖のDNAは1000個のヌクレオチドで形成されていることになり、「1000bp」の二本鎖のDNAは2000個のヌクレオチド（1000対のヌクレオチド）で形成されていることになるが、双方とも同じ「1000個のヌクレオチドからなる鎖長」のDNAを表すことになる。
【００２１】
また、配列番号１記載の塩基配列からなる核酸又は当該塩基配列のうち塩基番号145〜1443を含む塩基配列からなる核酸は、タンパク質合成における終止コドンに相当する塩基配列を含むため、「配列番号２記載のアミノ酸番号1〜432からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」を遺伝子工学的に調製するために使用することができ、有用である。
【００２２】
「本発明核酸」は、DNAであってもRNAであっても良いが、後述の「本発明検出方法」にハイブリダイズ用プローブ等として使用する場合や、組換ベクターや組換体の調製時に安定である点で優れるため、DNAであることが好ましい。
【００２３】
また、上記「配列番号１記載の塩基配列の一部を有する核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸」に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（特にDNA）も、例えば配列番号１記載の塩基配列を有する核酸の生体内での発現状況などを検査するためのハイブリダイズ用プローブとして使用することができ、医学、生化学等の研究用の試薬又は診断薬として極めて有用である。
【００２４】
なお、ここで「ストリンジェントな条件下」とは、一般に「核酸のハイブリダイズを使用する実験手法（例えばノザンブロットハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション）」等で用いられる条件が挙げられ、好ましくは37.5％ホルムアミド、5×SSPE（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液(Denhardt's solution)、0.5％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での42℃の条件が例示される。
「本発明核酸」は例えば以下の方法により調製することが可能である。
【００２５】
公知のUDP-ガラクトース運搬関連遺伝子（human UDP-galactose transporter related:UGTREL1）の塩基配列（GenBank accession No.NM_005827）をクエリーとしてBLASTにより塩基配列を検索を行ない、配列番号１の全配列を含むクローン(GenBank accession No.XM_059770)を得ることができる。この相補配列を基にポリメラーゼチェイン反応（以下「PCR法」とも記載する）などを用いてcDNAライブラリーなどから本発明核酸（例えば本発明DNA）をPCR法等の公知の方法により増幅して調製することができる。
【００２６】
「本発明核酸」は、例えば配列番号３記載の配列を5'プライマー、配列番号４記載の配列を3'プライマーとして使用して、例えばヒトゲノムcDNAライブラリーを鋳型として常法に従って一次PCR法を行い、更に配列番号５記載の配列を5'プライマー、配列番号６記載の配列を3'プライマーとして使用して、上記一次PCR法による産物を鋳型として二次PCR法を行うことで調製することができる。
【００２７】
配列番号１記載の塩基配列のうちポリペプチドをコードしていると考えられる領域（塩基番号145〜1443）は、5'プライマーとして配列番号７の塩基配列からなるプライマー及び3'プライマーとして配列番号８の塩基配列からなるプライマーを使用してPCR法で調製することができ、配列番号１記載の全塩基配列からなる核酸の調製は、例えば配列番号９の配列を5'プライマー、配列番号１０記載の配列を3'プライマーとして使用して、市販のcDNAライブラリーを鋳型としてPCR法により調製することができる。また、配列番号１の塩基番号464〜553からなる塩基配列からなる領域は、5'プライマーとして配列番号１１の塩基配列からなるプライマーと、3'プライマーとして配列番号１２の塩基配列からなるプライマーとを使用して、同様にcDNAライブラリーから調製することができる。
【００２８】
この場合、配列番号３及び配列番号４のプライマーを使用したPCR法においては産物として1332bpのDNA断片が得られ、配列番号５及び配列番号６のプライマーを使用したPCR法においては産物として1366kbpのDNA断片が得られ、配列番号７及び配列番号８のプライマーを使用したPCR法において産物として約1.3kbpのDNA断片が得られる。これらを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりDNA断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離して「本発明核酸」を得ることができる。
【００２９】
このようにして単離した「本発明核酸」から、それがコードする「ポリペプチド」を発現する組換体を調製するために使用することができる。すなわち、「本発明核酸」の両端に制限末端（粘着末端又は平滑末端）を常法により連結し、発現ベクターに挿入することができる。当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、「本発明核酸がコードするタンパク質を発現させたい宿主細胞」に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このような発現ベクターには、上記「本発明核酸」を目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモータ領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに「本発明核酸」が適切に発現するように構築されていることが好ましい。
【００３０】
上記「本発明核酸を含む発現ベクター」を宿主細胞に組み込み、組換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。宿主細胞として真核細胞を使用する場合には「本発明核酸を含む発現ベクター」の元となるベクター（以下「基本ベクター」とも記載する）として「真核細胞用の発現ベクター」を選択し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「原核細胞用の発現ベクター」を選択する。
【００３１】
ところで「本発明核酸」はヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であり、また運搬因子に関連する遺伝子であると考えられるため、本発明においては真核細胞を組換体の宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した「本発明タンパク質」が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、好ましくはほ乳類細胞又は酵母、特にほ乳類細胞を選択することが好ましく、「本発明核酸を含む発現ベクター」の基本ベクターは真核細胞用のベクター、特にほ乳類細胞用のベクターを選択することが好ましい。
【００３２】
近年、遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。「本発明核酸を含む発現ベクター」はその「本発明核酸」がコードする「ポリペプチド」の単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に上記「ポリペプチド」を「標識ペプチド」との「融合タンパク質」の形態で発現するように構築した「本発明核酸を含む発現ベクター」を構築して遺伝子工学的に「ポリペプチド」を調製すると、単離・精製が容易となるため好ましい。
【００３３】
上記「標識ペプチド」の例としては、「本発明核酸がコードするポリペプチド」を遺伝子組み換えによって調製する際に、該「ポリペプチド」を「標識ペプチド」と結合した「融合タンパク質」として発現させることにより、形質転換体の生育物から「本発明核酸がコードするポリペプチド」の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とする機能を有したペプチドが例示される。このような「標識ペプチド」としては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のN末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内で機能している15〜30アミノ酸残基からなるペプチド：例えばOmpA、OmpT、Dsb等）、プロテインキナーゼA、プロテインA（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約42,000のタンパク質）、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ（ヒスチジン残基を6乃至10個並べて配した配列）、mycタグ（cMycタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、FLAGペプチド（8アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、T7タグ（gene10タンパク質の最初の11アミノ酸残基からなる）、Sタグ（膵臓RNaseA由来の15アミノ酸残基からなる）、HSVタグ、pelB（大腸菌外膜タンパク質pelBの22アミノ酸配列）、HAタグ（ヘマグルチニン由来の10アミノ酸残基からなる）、Trxタグ（チオレドキシン配列）、CBPタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、CBDタグ（セルロース結合ドメイン）、CBRタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β-lac/blu（βラクタマーゼ）、β-gal（βガラクトシダーゼ）、luc（ルシフェラーゼ）、HP-Thio（His-patchチオレドキシン）、HSP（熱ショックペプチド）、Lnγ（ラミニンγペプチド）、Fn（フィブロネクチン部分ペプチド）、GFP（緑色蛍光ペプチド）、YFP（黄色蛍光ペプチド）、CFP（シアン蛍光ペプチド）、BFP（青色蛍光ペプチド）、DsRed、DsRed2（赤色蛍光ペプチド）、MBP（マルトース結合ペプチド）、LacZ（ラクトースオペレーター）、IgG（免疫グロブリンG）、アビジン、プロテインG等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ、mycタグ、FLAGペプチド、T7タグ、Sタグ、HSVタグ、pelB又はHAタグが、遺伝子工学的手法による本発明タンパク質の発現、精製がより容易となることから好ましく、特にHAタグとの融合タンパク質として「本発明核酸がコードするポリペプチド」の発現の確認が容易となるため好ましい。
【００３４】
ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述のHAタグとの融合タンパク質として「本発明核酸がコードするポリペプチド」を得ることができる基本ベクターとしては例えばYEP352 GAPII（インビトロジェン社製）等が例示されるが、当業者であれば「本発明核酸がコードするポリペプチド」の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
【００３５】
なお、本発明によって「本発明核酸の塩基配列」が開示されたため、当業者であれば目的とする「本発明核酸」や調製したい「本発明核酸の一部の領域」の両端の塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いてPCR法などによって目的の領域を増幅して調製することが容易である。
【００３６】
（３）本発明検出方法
「本発明検出方法」は、本発明タンパク質の、「被検組織における発現量の検出値」と「前記被検組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする被検組織の癌化の検出方法である。
【００３７】
「本発明検出方法」における本発明タンパク質の発現量の検出は、例えば本発明タンパク質が有する活性硫酸運搬作用を測定して行うことが可能であり、また上記本発明核酸の発現量を測定することでも検出することが可能であり、例えば本発明核酸のうち「配列番号１記載の塩基番号464〜553を含むDNA」の発現量の変化」を測定することによって簡単に行なうことができる。
【００３８】
上述のDNAの発現量は、例えば上記で例示したDNAの5'末端と3'末端の塩基配列を基に作成したプライマーと、蛍光色素と消光物質を結合させたプローブとを用いた定量的リアルタイムPCR法（以下「定量的RT-PCR法」とも記載する）等を用いることで定量することが可能である。RT-PCR法に使用するプローブとしては例えば配列番号１３記載の塩基配列からなる核酸が例示される。
【００３９】
「本発明検出方法」で用いる組織としては、何れの組織であっても使用することが可能であるが、食道、胃、肺、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、小腸、大腸、直腸、結腸などが挙げられ、好ましくは食道、胃、小腸、及び大腸が例示され、最も好ましくは胃及び大腸が例示される。
【００４０】
「本発明検出方法」は、組織から分離して得られる「組織片」を使用して行うことが好ましい。すなわち生検などによって得られた組織に含まれる病変部分（被検組織）における上記DNAの発現量と、該部分の周辺の健常部分における上記DNAの発現量とを対比することで、発現量を検出することができ、癌の診断、癌治療における経過観察等に有用である。
【００４１】
また、「本発明検出方法」における「DNAの発現量の定量」は、「DNA」又は「DNAから転写されて生ずるmRNA」を増幅してその量を測定するPCR法などの方法などがあるが、必ずしも「DNA」又は「DNAから転写されて生ずるmRNA」を定量して行なうことに限定はされず、例えば上記DNAが転写・翻訳されて生ずる「本発明核酸がコードするポリペプチド」を定量して行なうことも可能である。このような「ポリペプチドの定量」は、例えば精製した「本発明核酸がコードするポリペプチド」を使用して常法によって調製した抗体などを用いて常法（ウエスタンブロッティング、エンザイムイムノアッセイ等）に従って行なうことができる。この中でも特にPCR法が好ましく、RT-PCR法が最も好ましい。
【００４２】
組織の癌化は、好ましくは健常組織と比して被検組織における上記DNAの発現量が上昇している場合に当該被検組織が癌化していると判定することが好ましく、特にRT-PCR法によって癌化を検出する場合には、健常組織と比して被検組織が上記DNAの発現量で3%以上、好ましくは5%以上、最も好ましくは10%以上となっている場合に癌化していると判定することができる。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
（実施例１）本発明核酸の調製方法
ヒトUDP-ガラクトース運搬関連遺伝子（UGTREL1）の塩基配列（GenBank accession No.MN_005827）をクエリーとして、BLAST検索を行った。その結果、STP3の塩基配列(GenBank accession No.XM_059770)がホモロジーを有することが判明し、その塩基配列は配列番号１の通りであった。この塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号２と予測された。
【００４４】
配列番号１の塩基配列からなるDNAを得るために、ヒト大腸由来のcDNAライブラリー（クロンテック社製）を鋳型とし、5'プライマーとして配列番号３記載の塩基配列、3'プライマーとして配列番号４記載の塩基配列からなるDNAを用いて常法により一次PCR法を行い、更に配列番号５記載の塩基配列を5'プライマーに、配列番号６記載の塩基配列を3'プライマーとして使用して二次PCR法を行った。PCR産物から、アガロースゲル電気泳動を用いて約2.0kbpのDNA断片を常法に従って回収した。
【００４５】
（実施例２）
実施例１で得られたDNA断片を、Gatewayクローニングシステム（インビトロジェン社製）の説明書に従って酵母発現ベクターであるYEP352 GAPIIに挿入して組換ベクターYEP352 GAPII-STP3を得た。このベクターを常法に従って、生育にウラシルを要求する酵母の株W303aに導入して形質転換体を得た。このようにして得た形質転換体をウラシルを含まないSD培地を含む寒天プレートで培養して形質転換体を選別し、得られた形質転換体をウラシルを含まないSD液体培地で大量培養した。
【００４６】
このように培養した形質転換体を10mmol/lのNaN3を含む蒸留水で洗浄した後、形質転換体約5gを5倍量の消化液（1.4mol/lのソルビトール、50mmol/lのリン酸カリウム、10mmol/lのNaN3、及び40mmol/lの2-メルカプトエタノールを含むpH7.5の溶液）に懸濁し、Zymolyase100T（生化学工業株式会社製）を1mg/g菌体となるように添加して、37℃で30分間反応させて、形質転換体の細胞壁を消化した。その後、0.8mol/lのソルビトール溶液で2回洗浄し、10mlの消化液（0.8mol/lのソルビトール、10mmol/lのトリエタノールアミン、ペプスタチンＡ、1mmol/lのフェニルメチルスルホニルフルオライドを含むpH7.2の溶液）に懸濁し、ダウンスホモジナイザーを用いて形質転換体をホモジナイズした。これを4℃、1000×gで10分間遠心分離し、上清を回収して細胞抽出液とした。
【００４７】
この細胞抽出液をまず、4℃で10,000×gの超遠心分離を15分間行い、沈殿を回収した。この沈殿からなる画分（P10）は、小胞体を多く含む画分であった。
さらに、P10を除去した上清を、4℃で100,000×gの超遠心分離を1時間行い、沈殿を回収した。この沈殿からなる画分（P100）は、ゴルジ体を多く含む画分であった。
P100を除去した超遠心分離の上清をS100とし、サイトゾル画分とした。
【００４８】
200μgのP10、P100、又はS100画分を100μlの反応液（0.25Mのショ糖、5mMのMgCl2、1mMのMnCl2、10mMの2-メルカプトエタノール、1μMの35S標識PAPSを含む20mMのTris-HCl緩衝液（pH7.5））を添加して反応を開始した。5分後に10倍量の氷冷した反応停止液（0.25Mのショ糖、5mMのMgCl2、150mMのKClを含む20mMのTris-HCl緩衝液（pH7.5））を添加し、孔径0.45μmのニトロセルロースフィルターで濾過した。このフィルターを10mlの氷冷した反応停止液で洗浄し、フィルターの放射能を液体シンチレーションカウンターを用いて測定した（図１）。陰性対照としては、YEP352 GAPIIのみによって酵母W303a株を形質転換した形質転換体を用いて調製した各画分を用いた。
【００４９】
その結果、P100画分に強いPAPS運搬作用が観察された。
更に、35S標識PAPSに代えて3H標識ウリジン二リン酸-N-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）、3H標識グアノシン二リン酸-フコース（GDP-Fuc）、3H標識ウリジン二リン酸-ガラクトース（UDP-Gal）、3H標識シチジン一リン酸-シアル酸（CMP-Sia）、3H標識ウリジン二リン酸-グルコース（UDP-Glc）、3H標識ウリジン二リン酸-N-アセチルガラクトサミン（UDP-GalNAc）、14C標識ウリジン二リン酸-グルクロン酸（UDP-GlcA）、3H標識グアノシン二リン酸-マンノース（GDP-Man）を用いてP100画分の運搬作用を測定した（図２）。
【００５０】
その結果、本発明タンパク質はPAPS以外の物質を特異的に運搬する作用を実質的には有しないことが明かとなった。
更に、添加するPAPSの濃度を変化させて運搬作用の変化を測定し（図３）、その測定値から本発明タンパク質のKm値（μM）を算出したところ、Km値は0.7μMであることが判明した（図４）。
【００５１】
（実施例３）胃癌組織における本発明DNA発現量の変化
定量的リアルタイムPCR法を用いてヒト胃癌組織と同一患者の健常胃組織での本発明DNAの発現量を比較した。ヒト胃癌組織及び健常胃組織のRNAを、RNease Mini Kit（キアゲン社製）で抽出し、Super-Script First-Strand Synthesis System（インビトロゲン社製）を用いたoligo(dT)法によりsingle strand DNAとした。このDNAを鋳型として用いてプライマー（5'プライマー：配列番号１１、3'プライマー：配列番号１２）及びTaqManプローブ（配列番号１３）を用いてABI PRISM 7700（アプライドバイオシステムス社製）により定量的リアルタイムPCR法を行なった。PCR反応の条件は、95℃で10分で反応を行った後、95℃で15秒、60℃1分のサイクルを40回繰り返して行なった。内部標準としてβ-アクチン遺伝子を用い、β-アクチン遺伝子（b-Act）の発現量に対するSTP3遺伝子の発現量の比を算出して対比した（表１、図５）。
【００５２】
【表１】
【００５３】
その結果、癌化した胃組織においてはSTP3の発現量が10%以上増加した検体が多く見られることが明かとなった。この結果から、健常組織における本発明DNAの発現量と比して、発現量が増加している胃の病態組織は、癌化しているおそれが高いことが示唆され、本発明DNAの発現量は癌化の検出に役立つことが示唆された。
【００５４】
（実施例４）大腸癌組織における本発明DNA発現量の変化
定量的リアルタイムPCR法を用いてヒト大腸癌組織と同一患者の健常大腸組織での本発明DNAの発現量を比較した。ヒト大腸癌組織及び健常大腸組織のRNAを、RNease Mini Kit（キアゲン社製）で抽出し、Super-Script First-Strand Synthesis System（インビトロゲン社製）を用いたoligo(dT)法によりsingle strand DNAとした。このDNAを鋳型として用いてプライマー（5'プライマー：配列番号１１、3'プライマー：配列番号１２）及びTaqManプローブ（配列番号１３）を用いてABI PRISM 7700（アプライドバイオシステムス社製）により定量的リアルタイムPCR法を行なった。PCR反応の条件は、95℃で10分で反応を行った後、95℃で15秒、60℃1分のサイクルを40回繰り返して行なった。内部標準としてβ-アクチン遺伝子を用い、β-アクチン遺伝子（b-Act）の発現量に対するSTP3遺伝子の発現量の比を算出して対比した（表２、図６）。また、参考として同一検体におけるCA19-9での測定した（表２、図７）。
【００５５】
【表２】
【００５６】
その結果、癌化した大腸組織においてはSTP3の発現量が増加している検体が多いことが明かとなった。またCA19-9の測定値が低い検体においてSTP3発現量が増加しており、CA19-9では検出できなかった癌化組織を本発明検出方法は検出することができることが示された。
【配列表】
【００５７】
【発明の効果】
本発明により新規核酸、及び組織の癌化の新規な検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明タンパク質のPAPS運搬作用が存在する画分を示す図である。白いバーは陰性対照を示す。
【図２】 UDP-GlcNAc、GDP-Fuc、UDP-Gal、CMP-Sia、UDP-Glc、UDP-GalNAc、UDP-GlcA、GDP-Man、及びPAPSに対する、本発明タンパク質の運搬作用を示す図である。白いバーは陰性対照を示す。
【図３】 本発明タンパク質のPAPS運搬作用へのPAPS濃度が与える影響を示す図である。
【図４】 本発明タンパク質のKm値を示す図である。
【図５】 胃組織における癌化組織と健常組織でのSTP3遺伝子発現量を示す図である。白抜きは健常組織でのSTP3発現量（β-アクチン発現量との相対値）を示し、黒塗りは癌化組織でのSTP3発現量（β-アクチン発現量との相対値）を示す。
【図６】 大腸組織における癌化組織と健常組織でのSTP3遺伝子発現量を示す図である。白抜きは健常組織でのSTP3発現量（β-アクチン発現量との相対値）を示し、黒塗りは癌化組織でのSTP3発現量（β-アクチン発現量との相対値）を示す。
【図７】 大腸における癌化組織でのCA19-9検出量を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新たな活性硫酸運搬作用を有するタンパク質、かかるタンパク質をコードする核酸、及び前記タンパク質の「被験組織における発現量の検出値」と「当該被験組織の癌化」とを関連づけることによる「組織の癌化の検出方法」に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、硫酸運搬因子としては、例えば硫酸イオン運搬因子（非特許文献１）、活性硫酸運搬因子（非特許文献２（分子量75kDaの活性硫酸運搬因子を開示）、非特許文献３（分子量230kDaの活性硫酸運搬因子を開示））等が知られていたが、活性硫酸運搬因子をクローニングして、遺伝子工学的に大量合成を可能とする技術は確立されていなかった。
【０００３】
一方、組織の癌化を検出する方法としては、様々な方法が知られており、例えばＸ線検査、内視鏡検査や、CA19-9等の腫瘍マーカー検査等があげられる。Ｘ線検査や内視鏡検査などでは組織を外観からしか観察できないため、確定的な診断はできず、また腫瘍マーカーも偽陽性、偽陰性が現れる点で確定的な診断には不十分であった。
【０００４】
組織の癌化の確定診断は実際に組織を生検により採取し、その組織の培養を行って確認する方法によって行われているが、この方法は組織の培養にそれなりの時間が必要とされる。
【０００５】
一方、内視鏡下で外科的手法により、生体組織の病変部を切除する手術は一般になされている。例えばそのような病変部について簡単に癌化の有無を確認する手法が存在すれば、癌化の早期発見にも繋げることができ、その後の患者の治療や予防に役立てることができる。
【０００６】
また、特許文献にはN-アセチルグルコサミン転移酵素をコードするDNAを検出し、その「発現の変化」と「胃癌又は膵癌」とを関連づけることで、胃癌や膵癌の検出ができることが開示されている。
【０００７】
【特許文献】
特開平１１−１５７１９０号公報
【非特許文献１】
Cell, 78(6), pp.1073-1087(1994)
【非特許文献２】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91, pp.10707-10711
【非特許文献３】
Biochemistry, 35, pp.3695-3703
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
新たな活性硫酸運搬作用を有するタンパク質が発見されれば、生体内における物質運搬の仕組みの解明に繋がるため、このような発見が大いに期待されていた。また、採取した組織からなるべく早く、信頼性の高い「組織の癌化を検出する方法」の開発が強く望まれていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、新規な核酸を見い出し、かかる核酸がコードするタンパク質が新たな「活性硫酸運搬活性」を有すること、及び「癌化した組織における、前記タンパク質の発現量」が「健常組織における発現量」よりも増加していることを発見し、これを組織の癌化検出方法に応用することで本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１）下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列に1以上２１以下の置換、欠失、挿入、又は転位を有すると共に、活性硫酸運搬作用を有するタンパク質。
（２）活性硫酸運搬作用が、3'-ホスホアデノシン-5'-ホスホ硫酸運搬作用であることを特徴とする（１）記載のタンパク質。
（３）（１）又は（２）記載のタンパク質を活性成分として含有する活性硫酸運搬作用剤。
（４）（１）又は（２）記載のタンパク質の、活性硫酸運搬作用剤としての使用。
（５）（１）又は（２）記載のタンパク質の「被検組織における発現量の検出値」と、「前記被検組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする被検組織の癌化の検出方法。
（６）（１）又は（２）記載のタンパク質の「被検組織における発現量の検出値」が、「（１）又は（２）記載のタンパク質をコードする核酸の発現量」を定量し、該定量によって得られた値と健常組織における該核酸の発現量とを対比することによって得られる差であることを特徴とする（５）記載の被検組織の癌化の検出方法。
（７）「（１）又は（２）記載のタンパク質をコードする核酸の発現量」が下記（Ａ）又は（Ｂ）記載の塩基配列からなる核酸の発現量をであることを特徴とする（６）記載の被検組織の癌化の検出方法。
（Ａ）配列番号１記載の塩基配列の一部を含み、30〜1500bpの塩基配列；
（Ｂ）配列番号１記載の塩基配列の一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み、30〜1500bpである塩基配列。
（８）「塩基配列１記載の塩基配列の一部」が、「配列番号１記載の塩基番号145〜1443からなる塩基配列」、又は「配列番号１記載の塩基番号464〜553からなる塩基配列」であることを特徴とする（７）記載の組織の癌化の検出方法。
（９）前記被検組織が胃又は大腸由来の組織であることを特徴とする（５）〜（８）何れか一項記載の組織の癌化の検出方法。
（１０）配列番号１記載の全塩基配列の一部又は該一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み、30〜1500bpであることを特徴とする核酸。
（１１）配列番号１記載の塩基番号464〜553からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸であることを特徴とする（１０）記載の核酸。
（１２）配列番号１記載の塩基番号145〜1443からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含むことを特徴とする（１０）記載の核酸。
（１３）配列番号１記載の塩基番号145〜1443からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸であることを特徴とする（１０）記載の核酸。
（１４）DNAであることを特徴とする（１０）〜（１３）何れか記載の核酸。
（１５）（１０）〜（１４）何れか記載の核酸の、組織の癌化の検出のための使用。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明タンパク質
本発明タンパク質は、下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列に1以上21以下の置換、欠失、挿入、又は転位を有すると共に、活性硫酸運搬作用を有するタンパク質。
【００１２】
本発明タンパク質のうち、上記（ａ）に示すタンパク質は、配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号145〜1443の領域（コード領域：CDS）にコードされるタンパク質である。
【００１３】
一般に酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列のうち、一若しくは数個の構成アミノ酸が置換、欠失、挿入、或いは転位しても酵素活性が維持されることが知られており、そのような変異を有するタンパク質も同一タンパク質のバリアントであると言うことができる。本発明タンパク質における（ａ）のタンパク質においても配列番号２記載のアミノ酸配列に、一若しくは数個（2以上21以下）の構成アミノ酸の置換、欠失、挿入、或いは転位が起こっていても、活性硫酸を運搬する運搬作用を保持している限りにおいて、上記（ａ）で表されるタンパク質と実質的に同一の物質であるということができ、本発明タンパク質に包含される。このような変異を有するタンパク質は、配列番号１記載の塩基番号145〜1443に1以上数個（2以上63以下であることが好ましい）の塩基の置換、欠失、挿入、又は転位を有する塩基配列にコードされるタンパク質であるということができる。
【００１４】
このような変異を有するタンパク質のアミノ酸配列は、上記（ａ）で表されるポリペプチドのアミノ酸配列と95％以上、好ましくは96％以上、さらに好ましくは97％以上の相同性を有することが好ましい。アミノ酸配列の相同性は、FASTAのような周知のコンピュータソフトウェアを用いて容易に算出することができ、このようなソフトウェアはインターネットによっても利用に供されている。
【００１５】
すなわち、天然に存在するタンパク質には、それをコードする遺伝子DNAの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにも拘わらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示す物があることが知られている。このように構造的に若干の相違があってもその機能については大きな違いが認められないタンパク質も、上記「タンパク質」に包含される。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記の様な変異を導入した場合も同様であり、この場合には更に多種多様の「変異を有するタンパク質」を作成することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリン残基に置換したタンパク質がIL-2の活性を保持することが知られている（Science, 224(1984), p.1431）。またある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれに当たり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このような活性に必須でないペプチド領域の配列を有するタンパク質は、二次構造上は異なった形で存在しているが、同等の機能を有するタンパク質であり、「本発明タンパク質」もそのような配列が連結していても良い。このような「変異を有するタンパク質」は「部位特異的変異法」などの公知の方法により容易に作成することが可能である。
【００１６】
「本発明タンパク質」が運搬する活性硫酸としては、アデノシン5'-ホスホ硫酸（以下「APS」とも記載する）及び3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸（以下「PAPS」とも記載する）が好ましく、特にPAPSが好ましい。
【００１７】
「本発明タンパク質」が有する「活性硫酸運搬作用」の確認は、例えばJ. Biol. Chem.,275, pp.13580-13587の方法等にしたがって行うことができる。すなわち、[14C]、[3H]、又は[35P]などの放射性同位元素（[35P]が好ましい）で放射能標識した「活性硫酸（PAPS等）」と、上記「本発明タンパク質」とを混合し、そこに酵母の膜画分を添加して、膜画分に移行した放射能を測定する方法で行うことができる（このような方法としては具体的には後述の実施例２記載の方法が例示される）。
【００１８】
（２）本発明核酸
「本発明核酸」は、配列番号１記載の全塩基配列の一部又は該一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み、30〜1500bpであることを特徴とする核酸である。
【００１９】
「本発明核酸」における、「配列番号１記載の全塩基配列の一部」とは、30〜1500bp、好ましくは40〜1450bp、さらに好ましくは60〜1400bp、最も好ましくは80〜1300bpの長さからなる。このような核酸としては、例えば配列番号１記載の塩基番号464〜553からなる塩基配列からなる核酸、及び配列番号１記載の塩基番号145〜1443からなる塩基配列からなる核酸等が例示される。このような核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸は、後述の「本発明検出方法」へ使用することができ、特にこのような長さの核酸は、殊にハイブリダイズ能と取り扱いやすさの双方を兼ね備えているため、ハイブリダイズ用プローブとして優れている。上記で例示される核酸以外の核酸であっても、上記例示した長さの範囲内で、配列番号１記載の塩基配列、特に塩基番号145〜1443の範囲内から適宜選択することができる。
【００２０】
なお、本明細書で核酸の長さを表す単位「bp」とは、核酸が二本鎖となっている場合にその二本鎖を形成する塩基対の数、一本鎖となっている場合には、その核酸に相補的な塩基配列からなる一本鎖がハイブリダイズした二本鎖の塩基対数に相当する数に換算した核酸の長さである。従って例えば「1000bp」の一本鎖のDNAは1000個のヌクレオチドで形成されていることになり、「1000bp」の二本鎖のDNAは2000個のヌクレオチド（1000対のヌクレオチド）で形成されていることになるが、双方とも同じ「1000個のヌクレオチドからなる鎖長」のDNAを表すことになる。
【００２１】
また、配列番号１記載の塩基配列からなる核酸又は当該塩基配列のうち塩基番号145〜1443を含む塩基配列からなる核酸は、タンパク質合成における終止コドンに相当する塩基配列を含むため、「配列番号２記載のアミノ酸番号1〜432からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」を遺伝子工学的に調製するために使用することができ、有用である。
【００２２】
「本発明核酸」は、DNAであってもRNAであっても良いが、後述の「本発明検出方法」にハイブリダイズ用プローブ等として使用する場合や、組換ベクターや組換体の調製時に安定である点で優れるため、DNAであることが好ましい。
【００２３】
また、上記「配列番号１記載の塩基配列の一部を有する核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸」に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（特にDNA）も、例えば配列番号１記載の塩基配列を有する核酸の生体内での発現状況などを検査するためのハイブリダイズ用プローブとして使用することができ、医学、生化学等の研究用の試薬又は診断薬として極めて有用である。
【００２４】
なお、ここで「ストリンジェントな条件下」とは、一般に「核酸のハイブリダイズを使用する実験手法（例えばノザンブロットハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション）」等で用いられる条件が挙げられ、好ましくは37.5％ホルムアミド、5×SSPE（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液(Denhardt's solution)、0.5％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での42℃の条件が例示される。
「本発明核酸」は例えば以下の方法により調製することが可能である。
【００２５】
公知のUDP-ガラクトース運搬関連遺伝子（human UDP-galactose transporter related:UGTREL1）の塩基配列（GenBank accession No.NM_005827）をクエリーとしてBLASTにより塩基配列を検索を行ない、配列番号１の全配列を含むクローン(GenBank accession No.XM_059770)を得ることができる。この相補配列を基にポリメラーゼチェイン反応（以下「PCR法」とも記載する）などを用いてcDNAライブラリーなどから本発明核酸（例えば本発明DNA）をPCR法等の公知の方法により増幅して調製することができる。
【００２６】
「本発明核酸」は、例えば配列番号３記載の配列を5'プライマー、配列番号４記載の配列を3'プライマーとして使用して、例えばヒトゲノムcDNAライブラリーを鋳型として常法に従って一次PCR法を行い、更に配列番号５記載の配列を5'プライマー、配列番号６記載の配列を3'プライマーとして使用して、上記一次PCR法による産物を鋳型として二次PCR法を行うことで調製することができる。
【００２７】
配列番号１記載の塩基配列のうちポリペプチドをコードしていると考えられる領域（塩基番号145〜1443）は、5'プライマーとして配列番号７の塩基配列からなるプライマー及び3'プライマーとして配列番号８の塩基配列からなるプライマーを使用してPCR法で調製することができ、配列番号１記載の全塩基配列からなる核酸の調製は、例えば配列番号９の配列を5'プライマー、配列番号１０記載の配列を3'プライマーとして使用して、市販のcDNAライブラリーを鋳型としてPCR法により調製することができる。また、配列番号１の塩基番号464〜553からなる塩基配列からなる領域は、5'プライマーとして配列番号１１の塩基配列からなるプライマーと、3'プライマーとして配列番号１２の塩基配列からなるプライマーとを使用して、同様にcDNAライブラリーから調製することができる。
【００２８】
この場合、配列番号３及び配列番号４のプライマーを使用したPCR法においては産物として1332bpのDNA断片が得られ、配列番号５及び配列番号６のプライマーを使用したPCR法においては産物として1366kbpのDNA断片が得られ、配列番号７及び配列番号８のプライマーを使用したPCR法において産物として約1.3kbpのDNA断片が得られる。これらを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりDNA断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離して「本発明核酸」を得ることができる。
【００２９】
このようにして単離した「本発明核酸」から、それがコードする「ポリペプチド」を発現する組換体を調製するために使用することができる。すなわち、「本発明核酸」の両端に制限末端（粘着末端又は平滑末端）を常法により連結し、発現ベクターに挿入することができる。当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、「本発明核酸がコードするタンパク質を発現させたい宿主細胞」に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このような発現ベクターには、上記「本発明核酸」を目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモータ領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに「本発明核酸」が適切に発現するように構築されていることが好ましい。
【００３０】
上記「本発明核酸を含む発現ベクター」を宿主細胞に組み込み、組換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。宿主細胞として真核細胞を使用する場合には「本発明核酸を含む発現ベクター」の元となるベクター（以下「基本ベクター」とも記載する）として「真核細胞用の発現ベクター」を選択し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「原核細胞用の発現ベクター」を選択する。
【００３１】
ところで「本発明核酸」はヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であり、また運搬因子に関連する遺伝子であると考えられるため、本発明においては真核細胞を組換体の宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した「本発明タンパク質」が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、好ましくはほ乳類細胞又は酵母、特にほ乳類細胞を選択することが好ましく、「本発明核酸を含む発現ベクター」の基本ベクターは真核細胞用のベクター、特にほ乳類細胞用のベクターを選択することが好ましい。
【００３２】
近年、遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。「本発明核酸を含む発現ベクター」はその「本発明核酸」がコードする「ポリペプチド」の単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に上記「ポリペプチド」を「標識ペプチド」との「融合タンパク質」の形態で発現するように構築した「本発明核酸を含む発現ベクター」を構築して遺伝子工学的に「ポリペプチド」を調製すると、単離・精製が容易となるため好ましい。
【００３３】
上記「標識ペプチド」の例としては、「本発明核酸がコードするポリペプチド」を遺伝子組み換えによって調製する際に、該「ポリペプチド」を「標識ペプチド」と結合した「融合タンパク質」として発現させることにより、形質転換体の生育物から「本発明核酸がコードするポリペプチド」の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とする機能を有したペプチドが例示される。このような「標識ペプチド」としては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のN末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内で機能している15〜30アミノ酸残基からなるペプチド：例えばOmpA、OmpT、Dsb等）、プロテインキナーゼA、プロテインA（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約42,000のタンパク質）、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ（ヒスチジン残基を6乃至10個並べて配した配列）、mycタグ（cMycタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、FLAGペプチド（8アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、T7タグ（gene10タンパク質の最初の11アミノ酸残基からなる）、Sタグ（膵臓RNaseA由来の15アミノ酸残基からなる）、HSVタグ、pelB（大腸菌外膜タンパク質pelBの22アミノ酸配列）、HAタグ（ヘマグルチニン由来の10アミノ酸残基からなる）、Trxタグ（チオレドキシン配列）、CBPタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、CBDタグ（セルロース結合ドメイン）、CBRタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β-lac/blu（βラクタマーゼ）、β-gal（βガラクトシダーゼ）、luc（ルシフェラーゼ）、HP-Thio（His-patchチオレドキシン）、HSP（熱ショックペプチド）、Lnγ（ラミニンγペプチド）、Fn（フィブロネクチン部分ペプチド）、GFP（緑色蛍光ペプチド）、YFP（黄色蛍光ペプチド）、CFP（シアン蛍光ペプチド）、BFP（青色蛍光ペプチド）、DsRed、DsRed2（赤色蛍光ペプチド）、MBP（マルトース結合ペプチド）、LacZ（ラクトースオペレーター）、IgG（免疫グロブリンG）、アビジン、プロテインG等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ、mycタグ、FLAGペプチド、T7タグ、Sタグ、HSVタグ、pelB又はHAタグが、遺伝子工学的手法による本発明タンパク質の発現、精製がより容易となることから好ましく、特にHAタグとの融合タンパク質として「本発明核酸がコードするポリペプチド」の発現の確認が容易となるため好ましい。
【００３４】
ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述のHAタグとの融合タンパク質として「本発明核酸がコードするポリペプチド」を得ることができる基本ベクターとしては例えばYEP352 GAPII（インビトロジェン社製）等が例示されるが、当業者であれば「本発明核酸がコードするポリペプチド」の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
【００３５】
なお、本発明によって「本発明核酸の塩基配列」が開示されたため、当業者であれば目的とする「本発明核酸」や調製したい「本発明核酸の一部の領域」の両端の塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いてPCR法などによって目的の領域を増幅して調製することが容易である。
【００３６】
（３）本発明検出方法
「本発明検出方法」は、本発明タンパク質の、「被検組織における発現量の検出値」と「前記被検組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする被検組織の癌化の検出方法である。
【００３７】
「本発明検出方法」における本発明タンパク質の発現量の検出は、例えば本発明タンパク質が有する活性硫酸運搬作用を測定して行うことが可能であり、また上記本発明核酸の発現量を測定することでも検出することが可能であり、例えば本発明核酸のうち「配列番号１記載の塩基番号464〜553を含むDNA」の発現量の変化」を測定することによって簡単に行なうことができる。
【００３８】
上述のDNAの発現量は、例えば上記で例示したDNAの5'末端と3'末端の塩基配列を基に作成したプライマーと、蛍光色素と消光物質を結合させたプローブとを用いた定量的リアルタイムPCR法（以下「定量的RT-PCR法」とも記載する）等を用いることで定量することが可能である。RT-PCR法に使用するプローブとしては例えば配列番号１３記載の塩基配列からなる核酸が例示される。
【００３９】
「本発明検出方法」で用いる組織としては、何れの組織であっても使用することが可能であるが、食道、胃、肺、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、小腸、大腸、直腸、結腸などが挙げられ、好ましくは食道、胃、小腸、及び大腸が例示され、最も好ましくは胃及び大腸が例示される。
【００４０】
「本発明検出方法」は、組織から分離して得られる「組織片」を使用して行うことが好ましい。すなわち生検などによって得られた組織に含まれる病変部分（被検組織）における上記DNAの発現量と、該部分の周辺の健常部分における上記DNAの発現量とを対比することで、発現量を検出することができ、癌の診断、癌治療における経過観察等に有用である。
【００４１】
また、「本発明検出方法」における「DNAの発現量の定量」は、「DNA」又は「DNAから転写されて生ずるmRNA」を増幅してその量を測定するPCR法などの方法などがあるが、必ずしも「DNA」又は「DNAから転写されて生ずるmRNA」を定量して行なうことに限定はされず、例えば上記DNAが転写・翻訳されて生ずる「本発明核酸がコードするポリペプチド」を定量して行なうことも可能である。このような「ポリペプチドの定量」は、例えば精製した「本発明核酸がコードするポリペプチド」を使用して常法によって調製した抗体などを用いて常法（ウエスタンブロッティング、エンザイムイムノアッセイ等）に従って行なうことができる。この中でも特にPCR法が好ましく、RT-PCR法が最も好ましい。
【００４２】
組織の癌化は、好ましくは健常組織と比して被検組織における上記DNAの発現量が上昇している場合に当該被検組織が癌化していると判定することが好ましく、特にRT-PCR法によって癌化を検出する場合には、健常組織と比して被検組織が上記DNAの発現量で3%以上、好ましくは5%以上、最も好ましくは10%以上となっている場合に癌化していると判定することができる。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
（実施例１）本発明核酸の調製方法
ヒトUDP-ガラクトース運搬関連遺伝子（UGTREL1）の塩基配列（GenBank accession No.MN_005827）をクエリーとして、BLAST検索を行った。その結果、STP3の塩基配列(GenBank accession No.XM_059770)がホモロジーを有することが判明し、その塩基配列は配列番号１の通りであった。この塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号２と予測された。
【００４４】
配列番号１の塩基配列からなるDNAを得るために、ヒト大腸由来のcDNAライブラリー（クロンテック社製）を鋳型とし、5'プライマーとして配列番号３記載の塩基配列、3'プライマーとして配列番号４記載の塩基配列からなるDNAを用いて常法により一次PCR法を行い、更に配列番号５記載の塩基配列を5'プライマーに、配列番号６記載の塩基配列を3'プライマーとして使用して二次PCR法を行った。PCR産物から、アガロースゲル電気泳動を用いて約2.0kbpのDNA断片を常法に従って回収した。
【００４５】
（実施例２）
実施例１で得られたDNA断片を、Gatewayクローニングシステム（インビトロジェン社製）の説明書に従って酵母発現ベクターであるYEP352 GAPIIに挿入して組換ベクターYEP352 GAPII-STP3を得た。このベクターを常法に従って、生育にウラシルを要求する酵母の株W303aに導入して形質転換体を得た。このようにして得た形質転換体をウラシルを含まないSD培地を含む寒天プレートで培養して形質転換体を選別し、得られた形質転換体をウラシルを含まないSD液体培地で大量培養した。
【００４６】
このように培養した形質転換体を10mmol/lのNaN3を含む蒸留水で洗浄した後、形質転換体約5gを5倍量の消化液（1.4mol/lのソルビトール、50mmol/lのリン酸カリウム、10mmol/lのNaN3、及び40mmol/lの2-メルカプトエタノールを含むpH7.5の溶液）に懸濁し、Zymolyase100T（生化学工業株式会社製）を1mg/g菌体となるように添加して、37℃で30分間反応させて、形質転換体の細胞壁を消化した。その後、0.8mol/lのソルビトール溶液で2回洗浄し、10mlの消化液（0.8mol/lのソルビトール、10mmol/lのトリエタノールアミン、ペプスタチンＡ、1mmol/lのフェニルメチルスルホニルフルオライドを含むpH7.2の溶液）に懸濁し、ダウンスホモジナイザーを用いて形質転換体をホモジナイズした。これを4℃、1000×gで10分間遠心分離し、上清を回収して細胞抽出液とした。
【００４７】
この細胞抽出液をまず、4℃で10,000×gの超遠心分離を15分間行い、沈殿を回収した。この沈殿からなる画分（P10）は、小胞体を多く含む画分であった。
さらに、P10を除去した上清を、4℃で100,000×gの超遠心分離を1時間行い、沈殿を回収した。この沈殿からなる画分（P100）は、ゴルジ体を多く含む画分であった。
P100を除去した超遠心分離の上清をS100とし、サイトゾル画分とした。
【００４８】
200μgのP10、P100、又はS100画分を100μlの反応液（0.25Mのショ糖、5mMのMgCl2、1mMのMnCl2、10mMの2-メルカプトエタノール、1μMの35S標識PAPSを含む20mMのTris-HCl緩衝液（pH7.5））を添加して反応を開始した。5分後に10倍量の氷冷した反応停止液（0.25Mのショ糖、5mMのMgCl2、150mMのKClを含む20mMのTris-HCl緩衝液（pH7.5））を添加し、孔径0.45μmのニトロセルロースフィルターで濾過した。このフィルターを10mlの氷冷した反応停止液で洗浄し、フィルターの放射能を液体シンチレーションカウンターを用いて測定した（図１）。陰性対照としては、YEP352 GAPIIのみによって酵母W303a株を形質転換した形質転換体を用いて調製した各画分を用いた。
【００４９】
その結果、P100画分に強いPAPS運搬作用が観察された。
更に、35S標識PAPSに代えて3H標識ウリジン二リン酸-N-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）、3H標識グアノシン二リン酸-フコース（GDP-Fuc）、3H標識ウリジン二リン酸-ガラクトース（UDP-Gal）、3H標識シチジン一リン酸-シアル酸（CMP-Sia）、3H標識ウリジン二リン酸-グルコース（UDP-Glc）、3H標識ウリジン二リン酸-N-アセチルガラクトサミン（UDP-GalNAc）、14C標識ウリジン二リン酸-グルクロン酸（UDP-GlcA）、3H標識グアノシン二リン酸-マンノース（GDP-Man）を用いてP100画分の運搬作用を測定した（図２）。
【００５０】
その結果、本発明タンパク質はPAPS以外の物質を特異的に運搬する作用を実質的には有しないことが明かとなった。
更に、添加するPAPSの濃度を変化させて運搬作用の変化を測定し（図３）、その測定値から本発明タンパク質のKm値（μM）を算出したところ、Km値は0.7μMであることが判明した（図４）。
【００５１】
（実施例３）胃癌組織における本発明DNA発現量の変化
定量的リアルタイムPCR法を用いてヒト胃癌組織と同一患者の健常胃組織での本発明DNAの発現量を比較した。ヒト胃癌組織及び健常胃組織のRNAを、RNease Mini Kit（キアゲン社製）で抽出し、Super-Script First-Strand Synthesis System（インビトロゲン社製）を用いたoligo(dT)法によりsingle strand DNAとした。このDNAを鋳型として用いてプライマー（5'プライマー：配列番号１１、3'プライマー：配列番号１２）及びTaqManプローブ（配列番号１３）を用いてABI PRISM 7700（アプライドバイオシステムス社製）により定量的リアルタイムPCR法を行なった。PCR反応の条件は、95℃で10分で反応を行った後、95℃で15秒、60℃1分のサイクルを40回繰り返して行なった。内部標準としてβ-アクチン遺伝子を用い、β-アクチン遺伝子（b-Act）の発現量に対するSTP3遺伝子の発現量の比を算出して対比した（表１、図５）。
【００５２】
【表１】
その結果、癌化した胃組織においてはSTP3の発現量が10%以上増加した検体が多く見られることが明かとなった。この結果から、健常組織における本発明DNAの発現量と比して、発現量が増加している胃の病態組織は、癌化しているおそれが高いことが示唆され、本発明DNAの発現量は癌化の検出に役立つことが示唆された。
【００５４】
（実施例４）大腸癌組織における本発明DNA発現量の変化
定量的リアルタイムPCR法を用いてヒト大腸癌組織と同一患者の健常大腸組織での本発明DNAの発現量を比較した。ヒト大腸癌組織及び健常大腸組織のRNAを、RNease Mini Kit（キアゲン社製）で抽出し、Super-Script First-Strand Synthesis System（インビトロゲン社製）を用いたoligo(dT)法によりsingle strand DNAとした。このDNAを鋳型として用いてプライマー（5'プライマー：配列番号１１、3'プライマー：配列番号１２）及びTaqManプローブ（配列番号１３）を用いてABI PRISM 7700（アプライドバイオシステムス社製）により定量的リアルタイムPCR法を行なった。PCR反応の条件は、95℃で10分で反応を行った後、95℃で15秒、60℃1分のサイクルを40回繰り返して行なった。内部標準としてβ-アクチン遺伝子を用い、β-アクチン遺伝子（b-Act）の発現量に対するSTP3遺伝子の発現量の比を算出して対比した（表２、図６）。また、参考として同一検体におけるCA19-9での測定した（表２、図７）。
【００５５】
【表２】
その結果、癌化した大腸組織においてはSTP3の発現量が増加している検体が多いことが明かとなった。またCA19-9の測定値が低い検体においてSTP3発現量が増加しており、CA19-9では検出できなかった癌化組織を本発明検出方法は検出することができることが示された。
【配列表】
【発明の効果】
本発明により新規核酸、及び組織の癌化の新規な検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明タンパク質のPAPS運搬作用が存在する画分を示す図である。白いバーは陰性対照を示す。
【図２】 UDP-GlcNAc、GDP-Fuc、UDP-Gal、CMP-Sia、UDP-Glc、UDP-GalNAc、UDP-GlcA、GDP-Man、及びPAPSに対する、本発明タンパク質の運搬作用を示す図である。白いバーは陰性対照を示す。
【図３】 本発明タンパク質のPAPS運搬作用へのPAPS濃度が与える影響を示す図である。
【図４】 本発明タンパク質のKm値を示す図である。
【図５】 胃組織における癌化組織と健常組織でのSTP3遺伝子発現量を示す図である。白抜きは健常組織でのSTP3発現量（β-アクチン発現量との相対値）を示し、黒塗りは癌化組織でのSTP3発現量（β-アクチン発現量との相対値）を示す。
【図６】 大腸組織における癌化組織と健常組織でのSTP3遺伝子発現量を示す図である。白抜きは健常組織でのSTP3発現量（β-アクチン発現量との相対値）を示し、黒塗りは癌化組織でのSTP3発現量（β-アクチン発現量との相対値）を示す。
【図７】 大腸における癌化組織でのCA19-9検出量を示す図である。
Claims (2)
- 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列番号２記載のアミノ酸配列に１以上２１以下の置換、欠失、挿入若しくは転位を有すると共に、活性硫酸運搬作用を有するタンパク質の食道、胃、小腸又は大腸由来の組織における発現量の検出値と、前記組織の癌化とを関連づけることを特徴とする前記組織の癌化の検出方法。
- 配列番号１記載の塩基番号４６４〜５５３からなる塩基配列を含む核酸の発現量を測定し、食道、胃、小腸又は大腸由来の組織における核酸の発現量の検出値と、前記組織の癌化とを関連づけることを特徴とする前記組織の癌化の検出方法。
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