JP4085341B2 - 開いたポアの生分解性マトリックス - Google Patents

Description

本発明は、ガス発泡および粒子浸出の組合せにより多孔質ポリマー材料を製造する方法に関する。本発明はまた、この方法によってつくられた多孔質ポリマー材料、特に特徴的な相互接続されたポア構造を有する該材料と、そしてそのような多孔質ポリマー材料を特に組織エンジニアリングのために使用する方法に関する。
移植に適した自己のおよび同種異系の組織の欠乏は、新しい組織が培養した細胞と生物学的材料から創製される組織エンジニヤリング分野の発達を押し進めた。これらの細胞はインビトロでふやすことができ、そして多数の患者による使用のため培養できるため有益である。生物学的材料は関心ある細胞を局在化するためのビヒクルとして、組織発達のための潜在的スペースを創出する物理的スペーサーとして、そして組織再生を誘導する鋳型として働く。乳酸およびグリコール酸の生分解性ホモポリマーおよびコポリマーは、それらの融通性あるそして良く限定された物理的性質および相対的生適合性のために、組織エンジニヤリングマトリックスをつくるための魅力ある候補である。加えて、これらポリマーの分解産物は天然の代謝物であり、そして体から容易に除去される。
溶剤キャスティング／粒子浸出（ＳＣ／ＰＬ）（Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ，Ａ．Ｊ．Ｔｈｏｒｓｅｎ，Ｌ．Ａ．Ｃｚｅｗｏｎｋａ，Ｙ．Ｂａｏ，ａｎｄ Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）ｆｏａｍｓ”，Ｐｏｌｙｍｅｒ，３５，１０６８−１０７７（１９９４））；相分離（Ｈ．Ｌｏ，Ｍ．Ｓ．Ｐｏｎｔｉｃｉｅｌｌｏ，ａｎｄ Ｋ．Ｗ．Ｌｅｏｎｇ，“Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｆｏａｍｓ ｂｙ ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ”，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｆｏａｍｓ ｂｙ ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ”，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１，１５−２８（１９９５））；繊維押出しおよび布形成加工（Ｊ．Ｆ．Ｃａｖａｌｌａｓｏ，Ｐ．Ｏ．Ｋｅｍｐ ａｎｄ Ｋ．Ｈ．Ｋｌａｕｓ，“Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｆａｂｒｉｃｓ ａｓ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４３，ｐ．７８１−７９１（１９９４））；およびガス発泡（Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ｆ．Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｎ．Ｐ．Ｓｕｈ，Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ，ａｎｄ Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，“Ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｆａｂｒｉｃａｔｅ ｐｏｒｏｕｓ ｓｐｏｎｇｅ ｏｆ ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７，１４１７−１４２２（１９９６））を含む、いくつかの技術がポリマーを組織エンジニヤリング用途のための多孔質マトリックスへ成形するために使用された。溶剤キャスティング／粒子浸出および相分離法は有機溶媒の使用を必要とする。加工後これらポリマーに残り得る有機溶媒の残留分は移植した組織および近辺の組織を損傷することができ、そして制御された放出のためポリマーマトリックス中へ添加することを欲することがある多数の生物学的に活性因子（例えば成長因子）を不活性化する。繊維形成は典型的には高温（ポリマーの転移温度以上）を必要とし、そして無定形ポリマーを加工するためには適用できない。このプロセスに使用する高温度はマトリックスへ添加しようと欲するどのような生物学的に活性な分子も変性する可能性がある。
ガス発泡方法（例えば上で引用したＭｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．）は、有機溶媒および高温度の使用を避ける高圧ガスを使用して、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）から高度に多孔質のマトリックスを成形するための技術を提供する。しかしながらこの技術は典型的には細胞移植の多数の用途において不利である閉鎖ポア構造を得る。加えて、ポリマーの中実スキンが発泡マトリックスの外表面に発生し、そしてこれは物質輸送制限へ導き得る。
本発明の一目的は、組織エンジニヤリングおよびポア構造が特に有利である他の用途のために有用である、多孔質ポリマー材料を製造するための新しいプロセスを提供することである。例えば、本発明のポリマーは、第１にガス発泡プロセスによって形成され、第２に粒子浸出の作用により形成された多孔度の二つのタイプを持つことができる。これら二つの多孔度タイプの組合せは、有益な性質の範囲を有する多孔質ポリマー材料を提供するように、処理条件および使用する材料によって調整することができる。好ましい一具体例においては、粒子浸出からの多孔度は開いポア構造を有する相互接続されたポア構造の材料を生ずる。本発明の他の目的は、このプロセスによって製造された多孔質ポリマー材料と、そして例えば組織エンジニヤリングのためそのような材料を使用する方法を含んでいる。
本明細書および請求の範囲をさらに検討する時、本発明のさらなる目的および利益は当業者に明らかになるであろう。
本発明のプロセスに従えば、任意に圧縮して所望の寸法および形状へ成形したポリマー粒子と浸出し得る粒状材料の混合物は、ガスがポリマー中へ溶解するように高圧ガス雰囲気へ服せしめられ、次に溶解したガスが核形成しそしてポリマー内でガスポアを形成するように、例えば減圧によって熱力学的不安定性が創出される。これはポリマー粒子の膨張を生じさせ、そしてそれらは膨張するにつれ融合し、粒状物質を含んでいる連続したポリマーマトリックスを創出する。最後に粒状物質が浸出剤によってポリマーから浸出され、さらなる多孔度を創出する。このように本プロセスはポアを形成するガス発泡（ＧＦ）と、他のタイプの多孔度を形成する粒子浸出（ＰＬ）のプロセスの新しい組合せを提供する。このため本プロセスは、既知の溶剤キャスティング／粒子浸出（ＳＣ／ＰＬ）プロセスと対立して、ＣＦ／ＰＬプロセスと命名することができる。
本プロセスによって製造された新規な材料は、ガス発泡から形成されたポアと、粒状物浸出によって形成されたポアを有することによって特徴化される。粒状物浸出ポアはマクロポアとも呼ばれる。好ましくは、他の要因の中でも粒状物の量と寸法によって制御することが可能な、粒子浸出から発生する多孔度は、相互接続およびそのため開いたポア構造をもたらすようなものである。典型的には、本発明のＧＦ／ＰＬ法によって製造されたマトリックスは、実施例１に従って発生した顕微鏡写真に示し、そしてそこで論じている構造に似た相互接続もしくは開いたポア構造を持つであろう。浸出し得る粒子が少なくとも５０容積％であるポリマーおよび浸出可能粒子の混合物を提供する一具体例は、部分的な相互接続もしくは開いたポア構造を生ずるであろう。完全に相互接続した構造を得るために、もっと高い浸出可能粒子の量を使用することができる。
ＳＣ／ＰＬプロセスによって製造した材料もある程度相互接続されたマトリックスを提供することができるけれども、本発明者らは本発明のＧＦ／ＰＬプロセスによって製造した材料は明白なポア構造と、そしてＳＣ／ＰＬで製造した材料を上廻る有意に有利な機械的性質を有することを発見した。この利益は、材料の製造において有機溶媒および／または高温度の必要性の不存在と、製造した材料中の有機溶媒残留物の不存在の利益への追加であり、これらの利益は本材料を以下に記載する用途に一層有用とする。例えば、本発明の材料は一層高い強度性質、例えば引張り強度を示す。例えば本発明による材料は、例えば８５０ｋＰａ，特に１１００ｋＰａまたはそれ以上の引張りモジュラスを有する材料を提供するように、引張り強さを最大化するために製造することができる。そのような高強度材料はすべての用途に対して必要としないであろうが、例えば１００ｋＰａ程の低い引張りモジュラスを持つ材料が有用であることが判明している。さらに、この材料は改善された圧縮抵抗を示す。例えば、本発明に従った材料は、例えば２５０ｋＰａ，特に２８９ｋＰａまたはそれ以上の圧縮モジュラスを有する材料を提供するように、圧縮抵抗を最大化するように製造することができる。比較のＳＣ／ＰＬ法で製造した材料は約３４４±５２ｋＰａの引張りモジュラスおよび約１５９±１３０ｋＰａの圧縮モジュラスを示す。
この理論に拘束されることを意図しないが、本発明者らのＧＦ／ＰＬプロセスによって製造された材料の改良された機械的性質およびより強いマトリックスは、少なくとも一部は、材料中のポリマー分布のより大きい均一性および／または材料中の多孔度のサイズおよび分布のより大きい均一性から生ずるものと仮説される。ＳＣ／ＰＬ法で製造したポリマーは、溶剤がポリマーから不均一態様で蒸発し、そのためポリマー濃度が材料中で不均一に変化するため、そのような均一ポア構造を持たないであろう。例えばＳＣ／ＰＬ材料は、溶剤が蒸発する時ポリマー濃度がマトリックスの底において、すなわちマトリックスがガラスカバースリップに接触する区域において増大するため典型的には不均一性を持っている。対照的に、ＧＦ／ＰＬ材料は非常に均一なポア構造を示し、ポリマーはガス発泡の間粒子ベッド全体にわたって均一に発泡することを指示する。
代わって、ＧＦ／ＰＬプロセスにおいては、機械的性質は発泡の間起こる伸長の間に起こるポリマー鎖の引張りアラインメントによって増強されると仮説される。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐ．２６４（１９９７）
どちらにせよ、本発明の材料は引張り強度および圧縮抵抗を最大化するように製造できることは、組織エンジニヤリングおよび他の用途において大きな利益である。何故ならばそれらは機械的破断なしに一層容易に取扱いそして操作することができ、そして機械的破断なしにそれらが使用される環境においてより良く生き延びることができるからである。さらに、多孔度の両方のタイプ、好ましくは相互接続多孔度を有する本発明の材料は、多数の用途のために独特のそして有益な材料を提供する。本方法は例えば０より大で９７％までの、またはそれ以上の全多孔度を有する材料を提供することができる。好ましくは全多孔度は９０〜９７％の範囲にある。
本方法のためポリマーと粒状物質の混合物が使用される。混合物は好ましくはできるだけ均一で、そして慣用の手段によって準備できる。好ましくは、混合物は最終使用のために望まれるのと実質上同じ寸法および形状へ、例えば室温または成形を実施するための他の適当な温度において圧縮成形することによって成形される。
ポリマーおよび粒状物質は、粒状物質をポリマーを溶解または他のように材料に悪影響しない浸出剤によって浸出できるように選定されなければならない。ここで議論したＳＣ／ＰＬプロセスのために有用なポリマーおよび粒状物は一般に本発明のＧＦ／ＰＬプロセスのために有用である。さらなる有用な材料は以下に論じられる。
ガスが溶解することができ、それによってポアが形成され、そしてそれへ粒状物を添加しそれから浸出することができるどのようなポリマーも本プロセスにおいて使用できる。ガスの溶解を容易化するため、ポリマーは無定形もしくは大部分無定形ポリマーであることが好ましい。しかしながら、もし結晶性ポリマーが使用されるならば、結晶化度はその中にガスが溶解することができるようなレベルへ減ずることができ、そしてその後ポアの形成後に結晶化度を回復することができる。材料の用途に応じ、ポリマーは生分解性または非生分解性であるように選ぶことができる。組織エンジニヤリングのような多数の用途のためには、ポリマーはそれが使用される環境に対して生分解性である。ポリマーの好ましい有用なクラスは乳酸およびグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマー、例えばポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、および特にコポリマー中ラクチド５０％以上を有するＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドのコポリマー（ＰＬＧＡ）である。多くの条件下においてはホモポリマーよりコポリマーが好ましいが、ホモポリマーは一部の状況において好ましいであろう。他の有用なポリマーは、例えばポリヒドロキシブチレート、ポリ−ε−カプロラクトンのような脂肪族ポリエステルである。さらにポリ無水物、ポリフォスファジン、ポリペプチドを使用し得る。
加えて、異なるポリマーのブレンド、または他の剤、特に得られるマトリックスの機械的性質に影響する剤を含んでいるポリマーを使用することができる。例えば区別し得る性質を有する異なるＰＬＧＡポリマーのブレンドを両方の性質の利点を取るために使用することができる。また、ＰＬＧＡポリマーと他のポリマーを、特にその機械的性質を修飾するためにブレンドすることができる。例えばＰＬＧＡポリマーとアルギン酸塩材料とのブレンドは、より大きい弾性とそして破断前より大きい歪みに耐える能力を有するより強靱なマトリックスを提供することが判明した。このように用途に応じて、より良い柔軟性および／または強度を持ったマトリックスを生ずるポリマーをブレンドすることが有用になり得る。それ故可塑剤、強靱化剤または他の性質の改質剤として作用する材料とのブレンドが本発明において有用である。これら材料はポリマーであるか、または一時的な態様で作用しその後マトリックスから拡散する小分子剤であることができる。
ポリマー組成および分子量も三次元マトリックス多孔度および機械的性質に大きい影響を有する。ＰＬＧＡのコポリマーはホモポリマーＰＧＡまたはＰＬＬＡのどちらかよりも一層大程度に発泡することを示した。この発見は無定形ＰＬＧＡコポリマーは結晶性ポリマーＰＧＡよりも一層発泡するとの以前の報告（Ｍｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７，１４１７−１４２２，１９９６）と一致する。このことは結晶性ポリマーに比較して無定形ポリマー中の増大したガス溶解のためであるらしい。Ｄ．Ｆ．Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｇ．Ｍａｔ．Ｔｅｃｈ．１１７，６２，１９９５；ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｖａｎ Ｋｒｅｖｅｌｅｎ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌ．，１９７６．ポリマーの分子量は足場多孔度に大きい効果を有する。高分子量（高い固有粘度）を有するポリマーは低い分子量を有する同じポリマーほど高い多孔度を持った足場を形成しなかった。高分子量ポリマーの長いポリマー鎖はより大程度にもつれ、そのため短いポリマー鎖より膨張に対して強い抵抗を提供するらしい。
好ましい一具体例においては、最大のポア形成はラクチドおよびグリコリドの低分子量無定形コポリマーの使用によって得ることができる。これらのマトリックスは口内組織の再生において大きな有用性を持つ可能性があるであろう。それらは単独でＧＴＲマトリックスとして使用することができる。それらは再生を促進するため持続性の局所態様において成長因子を放出するためにも使用し得る。加えて、それらは移植した細胞からの組織再生および宿主細胞との相互作用を促進するように部位へ直接細胞を移植するために使用できるであろう。
浸出し得る粒状物は、ポリマーマトリックスから浸出剤によって浸出することができる任意の粒状物質である。水性媒体、好ましくは水に可溶な塩類が好ましい。塩として、ＮａＣｌ，クエン酸Ｎａ，酒石酸Ｎａ，およびＫＣｌが有用な粒状物質である。溶解によって浸出し得る他の有用な粒状物は、例えばゼラチン、コラーゲンおよびアルギン酸塩粒状物を含む。溶媒がポリマーに悪影響しない場合、有機溶媒によって浸出し得る粒状物を使用することも可能であるが、しかしそのような物は有機溶媒の必要性の不存在および製品中に残留分の不存在の利益を減ずるであろうからこれは好ましくない。上で論じたように、粒状物の寸法は粒状物の浸出時に形成されるポアの寸法に影響するであろう。本発明を限定しないが、粒状物は１０ないし５００ミクロンの平均寸法を有することが好ましい。この寸法はその浸出によって形成されるポアの寸法に大よそ対応するであろう。
ガスは、ポリマーおよび粒状物の好ましくは成形された混合物のポリマー中に、混合物を系に対して不活性であり、そして適切な条件下でポリマー中に溶解するガスの加圧された雰囲気へ服させることによって溶かされる。適切なガスおよび条件は、上のＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ論文中で論じているような他のガス発泡プロセスから既知であり、そしてそれらは一般にここでも使用することができる。適切なガスの好ましい例は、ＣＯ₂、空気、窒素、ヘリウム、ネオン、クリプトン、アルゴン、キセノンまたは酸素を含む。ガス発泡温度においてガスを提供する揮発性液体、例えば水も使用することができる。しかしながらブローイング剤として有用であることが知られているガスを形成する他のガスまたは揮発性液体も使用することができる。これらは、例えばペルフッ化物を含むフッ素化炭化水素を含む。これらは、トリフルオロメタン、ジフルオロメタン、ジフルオロエタン、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロシクロヘキサン、ヘキサフルオロプロパンおよびヘプタフルオロプロパンのような炭素数８までの脂肪族、脂環族フッ素化炭化水素が好ましい。ヘキサフッ化イオウも有用ブローイング剤である。他の既知のブローイング剤はプロパン、ブタンおよびペンタンのようなアルカン；シクロブタン、シクロペンテンおよびシクロヘキセンのようなシクロアルカンおよびシクロアルケン；ジメチルエーテル、メチルエチルエーテルおよびジエチルエーテルのようなジアルキルエーテル；フランのようなシクロアルキレンエーテル；アセトンおよびメチルエチルケトンのようなケトン；およびギ酸、酢酸およびプロピオン酸のようなカルボキシレートを含む。
圧力はガスのポリマー中への溶解を容易化するように選定され、そのため使用するガス、使用するポリマーおよび温度に依存するであろう。本発明を限定するものではないが、ＣＯ₂とＰＬＧＡポリマーに対しては、約６００ないし９００ｐｓｉの圧力が一般に有用である。例えば超またはサブ臨界条件のガスさえも使用することができる。さらにポリマーに溶解でき、そして熱力学的不安定性へ課すときガスを形成する揮発性液体を使用することができる。一例として、ＣＯ₂は飽和を許容するように約４８時間加えられた約８００ｐｓｉの圧力において、ポリ〔Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸〕ポリマーとＮａＣｌ粒子の混合物中に溶解させることができる。
発泡に使用される特定のガスは多孔質マトリックスの製造において臨界的な変数になり得る。発泡に使用されるガスの選択は最終足場構造に大きい効果を有する。ＣＯ₂は高度に多孔質なマトリックスを生産したが、Ｎ₂およびＨｅは測定可能なポア形成へ導かなかった。これらの結果は、ＣＯ₂が多孔質ポリマー構造を創製するために使用された多数の以前の研究（Ｍｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７，１４１７−１４２２，１９９６）と一致する。この結果の下に横たわる正確なメカニズムは知られていないが、Ｎ₂およびＨｅの両方に比較してＣＯ₂で経験された大きい発泡の程度はＣＯ₂とＰＬＧＡのカルボニル基との間の特異的相互作用の結果であり得る。Ｋａｚａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８，１７２９−１７３６，１９９６．
ガス平衡時間および圧力放出速度は、他の変数ほど強くはないがマトリックスの多孔度および安定性に影響した。
溶解ガスの核形成および材料中のガスポアの成長を開始させるため、熱力学的不安定性がつくり出される。この現象はＰａｒｋ，Ｂａｌｄｗｉｎ ａｎｄ Ｓｕｈにより、“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｄｒｏｐ Ｒａｔｅ ｏｎ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ”，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５，ｐｐ．４３２−４４０（１９９５）に記載されている。好ましくは、これは短時間にわたってガス雰囲気の圧力を例えば大気圧へ下降させることによって行われる。ポアの核化およびポアの成長によるポリマーからのガス相分離はガスの核化部位隣接区域中への拡散によって発生する。ポア成長は代わってポリマー密度を減少する。温度上昇のような不安定性をつくり出す他の方法も使用し得るが、しかし処理の容易性のため好ましくない。生成したガスポアのポア構造およびポア寸法は、中でも使用したガスのタイプ、適用したガス雰囲気の温度、初期および最終圧力に依存するガスの量、特定のポリマー中のガスの溶解度、ポア核化の速度およびタイプ、そして核へのポリマーを通るガスの拡散速度のファクターである。これらおよび他のファクターは、適切な寸法のガスポアを提供するように調節することができる。ガスポア成長の間ポリマーが膨張する時連続的なポリマーマトリックスの形成を生じさせるのに十分なガスが溶解しなければならない。
熱力学的不安定性、ポア核化およびガスポア形成および膨張の結果、粒状物質を含んでいるポリマーはガスポアのまわりに連続相、すなわちマトリックスを形成する。
粒状物はポリマーから浸出剤で浸出される。浸出剤として有用なのはポリマーから粒状物を浸出、例えば溶解し除去する任意の剤である。上で論じたように、水系浸出剤、特に水が好ましい。ポリマーからの粒状物の浸出は、上で論じたように相互接続されたポア構造を提供することができる、ガス発泡によって形成されたものとは異なるタイプの多孔度を形成する。
以下の具体例は本発明の代表的な非限定的実施例として提供される。
ポリマー（例えばポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）とＮａＣｌの粒子からなるディスクが室温において圧縮成形され、その後高圧ＣＯ₂ガス（８００ｐｓｉ）と平衡化することが許容された。熱力学的不安定性の創出はポリマー粒子中のガスポアの核化および成長と、そして連続的ポリマーマトリックスの形成へ導いた。その後ＮａＣｌ粒子を浸出し、マクロポアおよびマクロポア構造を得た。全体の多孔度およびポア接続性はポリマー：塩粒子の比によって調整した。このアプローチにより形成したマトリックスの圧縮モジュラス（ＳＣ／ＰＬに対し１５９±１３０ｋＰａ対ＧＦ／ＰＬに対し２８９±２５ｋＰａ）と、引張りモジュラス（ＳＣ／ＰＬに対し３３４±５２ｋＰａ対ＧＦ／ＰＬに対し１１００±２３６ｋＰａ）の両方は、標準的溶剤キャスティング／粒子浸出法で形成したものよりも有意義に大きかった。新しい組織をエンジニヤリングするためのこれらマトリックスの可能性は、平滑筋細胞がこれらマトリックスへ容易に付着し、そして増殖でき、新しいそして高密度（３×１０⁷細胞／ｍｌ）を培養物中に形成するとの発見によって証明された。高圧ガス発泡と粒状物浸出技術の組合せであるこの新しいプロセスは、良く制御された多孔度およびポア構造を持つマトリックスを生分解性ポリマーから成形することを許容する。
本発明のプロセスによって製造される材料は広範囲の有用性を示す。それらは多孔質ポリマー材料、特に開放ポア構造を持つそれを必要とする任意の用途に使用することができる。さらに、これら材料は有機溶媒残留が許容されない用途、例えば生体適合性が望まれる用途に特に適用し得る。例えばこれら材料は、マトリックスをその生分解性により最終的に置換する組織置換のような、細胞がそれらの意図した機能を達成するように適合性でそして生育するマトリックスとして有用である。さらにこれら材料は、外科的に体内へ移植することができる既に細胞へ結合されたマトリックスを提供するために使用できる。さらにこれら材料は、持続性放出薬物送達システムとして、外傷修復マトリックス材料として、試験管内細胞培養研究のためのマトリックスとして、およびそれに類似の用途において使用することができる。本発明の材料の安定な構造は理想的な細胞培養条件を提供する。
ＧＦ／ＰＬプロセスによって製造された本発明の材料は、一般にＳＣ／ＰＬおよび相分離技術によって製造された材料の用途、例えば肝細胞、Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ，Ｐ．Ｍ．Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｋ．Ｓａｎｏ，Ｋ．Ｍ．ＭｃＮａｍａｒａ，Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ，ａｎｄ Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，“Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｒｏｕｓ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｋｌｅ ｓｐｏｎｇｅ”，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，２６，３４２５−３４２６）；Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ，Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｐ．Ｍ．Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｋ．Ｓａｎｏ，Ｋ．ＭｃＮａｍａｒａ，Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ，ａｎｄ Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｓｐｏｎｇｅ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，９５９−９６５（１９９５）；軟骨細胞および造骨細胞、Ｓ．Ｌ．Ｉｓｈａｕｇ，Ｍ．Ｊ．Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ，Ｒ．Ｂｉｃｉｏｇ，Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ；“Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ”，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．，２８，ｐ．１４４５−１４５３（１９９４）を含む多種類の細胞移植用途に類似の用途をさらに有する。しかしながら本発明の材料は、より良好な機械的性質を有し、そして移植したまたは移動する細胞および隣接組織を損傷し、および／または生物学的に活性な因子を不活性化し得る残留有機溶媒の問題を回避する。
平滑筋細胞は本発明のマトリックス材料へ容易に接着し、そしてポア構造内に三次元組織を創製する。そのためそれらは細胞増殖のための適切な環境を提供する。インビトロ実験はマトリックス周辺のまわりに集中した細胞生育を示す。これはスポンジの厚み（３．４ｍｍ）のためマトリックス中心における細胞へのＯ₂拡散制限によるらしい。
加えて、これらの材料は有機溶剤を使用して製造された材料よりも成長因子を添加するためのより良い可能性を有する。有機溶媒による可能性ある問題は、処理後これらポリマーに残っている残留有機溶媒が移植した細胞および近傍組織を損傷し得ることである。さらに、有機溶媒への暴露は多数の生物学的に活性な因子を不活性する。現在、生物学的材料への成長因子の添加はマイクロスファアを使用して行われる。この方法も成形中有機溶媒を使用する。この欠点は、成長因子をより良い放出が得られるようにポリマーマトリックス中へ直接添加できるため、本発明のマトリックス材料によって排除することができる。
組織エンジニヤリングおよび／または細胞増殖のためマトリックス内へ成長因子を加えるための一つの好ましい態様は、粒子形状、例えばビーズマイクロスフェアとしてポリマー構造に含まれ、または発泡のためＰＬＧＡへ加える前に他のポリマーまたは他の分子とブレンドした成長因子を提供することである。ポリマー構造は、マトリックスのバルクを形成するのに使用したＰＬＧＡと異なる速度で分解する他のＰＬＧＡのコポリマーで、またはアルギン酸塩または修飾アルギン酸塩材料のような異なるポリマー材料から形成することができる。そのようなシステムはマトリックスから分子の放出動態に追加の制御レベルと、そしてポリマー構造中に含まれる成長因子はマトリックスによって提供される放出動態に加えてそれからの制御された放出効果を提供するように設計できるためそれらのバイオアベイラビリティに追加の制御を提供する。この状況における放出は、ビーズからの因子の解離、ＰＬＧＡからの放出またはその両方によって制御されるであろう。このように放出動態に関して高程度の制御が潜在的に広い範囲にわたって提供される。さらにマトリックス中に複数の因子を含めることができ（記載した粒子の複数のタイプ中および／またはマトリックスのバルクを構成するポリマー中に）、これは変化する時間で放出する。これはもし成長因子放出のカスケードまたは同じ因子を放出の波（例えば免疫化に使用のため）を望むとしたら有用であろう。これら粒子（例えばアルギン酸塩粒子）中への成長因子の添加は、発泡マトリックスのバルクをなすポリマー中に直接固定化するよりも、長期間バイオアベイラビリティを維持するために一層適している。
ガス発泡および粒子浸出を組合せた例えばＰＬＧＡからの高度に多孔質なマトリックスは本発明によって製造することができる。本方法は有機溶媒または高温度の使用を避け、そして望ましいポア構造を有する材料を得る。これらマトリックスの多孔度およびポア構造は、例えば粒状物ポリマー比および粒状物寸法を変えることによって制御することが可能である。これらマトリックスは増大した機械的性質を示し、そして三次元組織の生成のために使用することができる。この新規な成形方法は、例えば組織エンジニヤリングマトリックスとして使用されるポリマー中へ薬物および／または成長因子添加のためのアプローチとして使用することができる。
本発明のポリマーマトリックスのための他の有用な用途は誘導組織再生（ＧＴＲ）である。この用途は、組織再生に責任ある先祖細胞は下に横たわる健康組織中に居住し、そして欠損中へ移動しそして失われた組織を再生するように誘発することができるとの前提条件に基づいている。ＧＴＲのためマトリックスの重要な特徴はポア寸法分布およびポア連続性、すなわち相互接続性によって決まる性質である、マトリックス中への細胞の輸送である。マトリックスは他の細胞タイプへのアクセスを阻止しつつ所望の細胞がマトリックスへ侵入することを許容しなければならない。
本発明の材料は、特に片側に非透過性層を有する、ポリ（乳酸）ＰＬＡ，ポリ（グリコール酸）ＰＧＡ、またはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）でつくったポリマースポンジとして、この選択的透過性を提供することができる。非透過性層は同じポリマーで構成されるが、しかし多孔度の程度がなく、そしてこの非透過性層をポリマースポンジへ連結するために種々の方法を使用することができる。
この有用性を代表する特定の具体例において、ポリマースポンジはＰＬＧＡを粉砕し、そして直径１０８ないし２５０ミクロンの粒子を得ることによってつくられた。これらのポリマー粒子は塩化ナトリウムと混合され、金型で約１５００ｐｓｉの圧力において所定形状にプレスされる。ポリマー／塩固体は、次に固体を圧力ボンベに入れ、８００ｐｓｉの圧力で４８時間ＣＯ₂へ暴露し、次いで比較的速かな圧力除去によって発泡される。この圧力除去はポア形成を生ずるＣＯ₂分布に熱力学的不安定性をつくり出す。次にポリマー／塩固体は塩を浸出するため水中に２４時間放置する。水は浸出プロセスの間交換されることに注意せよ。このプロセスは９５％以上多孔質のポリマースポンジを生産する。スポンジの分解速度は乳酸とグリコール酸の組成を変えることによって修飾することができる。
非透過性層は、好ましくは材料のガス発泡前に実施される以下の技術の一つによってスポンジの片側に形成することができる。スポンジはＰＧＡの融点より高い温度においてＰＧＡの層の上の形状に加圧することができる。溶融したＰＧＡはスポンジへ接着して薄い層を形成することができるであろう。発泡プロセスおよび浸出プロセスは純粋なＰＧＡに対し無視し得る効果しか持たないので、この層は非透過性である。ＰＬＧＡの非透過層もスポンジをＰＬＧＡの層の上に加圧することによってスポンジ上の形成することができる。クロロホルム中のＰＬＡ溶液をスポンジの片側にスプレーすることにより非透過層を形成することができる。さらに、同じポリマー材料を使用し、そして一つのセクションは開いたポア構造を形成しそして他に形成しないようにセクション毎に浸出し得る粒子の量を変えることができる。また、異なるポリマーを使って、一セクションは発泡し、そして非透過性層セクションは発泡しない材料を提供することができる。ＰＬＧＡはボンベから圧力放出後に発泡するが、浸出プロセスの間元のままを保つＰＬＧＡの薄い層の上に非透過性スキンを形成する。代わって、発泡および浸出プロセスの後に、ポリマースポンジを溶融したＰＧＡ中またはクロロホルム中のＰＬＧＡ溶液中へ浸漬することができる。これらの操作は非透過性側を持つ９５％以上の多孔度を持つスポンジをつくるために使用することができる。
ＧＴＲ用に有用な本発明に従った他のスポンジ材料を提供するため、上で論じた類縁材料に対し似た方法を適用することができる。
ＰＬＧＡマトリックスは骨形成のために適した基質を提供することができる。骨組織の置換のためのマトリックスの重要な特徴は、組織発達およびマトリックスミネラル化のために適切な環境を提供する能力である。細胞接着および組織形成を許容するＧＦ／ＰＬの能力は、以前に他の細胞タイプに対して最適化された技術（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５７，ｐ．４６−５４，１９９８）を使って、ＰＬＧＡ足場上にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（骨形成細胞ライン）を接種しそして培養することによってインビトロで評価された。細胞はＧＦ／ＰＬマトリックスへ接着し、増殖し、そして細胞外マトリックスタンパクの分泌を開始し、そして４週までに培養物中のミネラル化のパッチを観察できた。大面積のミネラル化を有する新しい組織が６週までに形成された。この期間にわたってマトリックスの寸法および形状に変化は観察されず、それらは操作された骨組織の全体の形成を制御するのに十分な機械的性質を持っていることを示唆した。
誘導組織再生に使用のためのマトリックスの重要な特徴は細胞がマトリックス中へ移動する能力である。予備実験はインビトロでマトリックス中へ全体に容易に移動した細胞を確認する。これはこれらのタイプのマトリックスでの以前の研究がインビトロで０．１〜０．３ｍｍ／ｄａｙの速度で腺維脈管内方成長を証明したので（Ｍｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４前出）予期されていた。
ＧＴＲのためのこれらスポンジ材料の他の可能性ある用途は歯周病の処置である。歯周病は歯周靱帯の歯槽骨への取付の消失によって特徴化される。歯肉の上皮細胞が歯周靱帯が取付けられた部分へ成長し始める。非透過性サイドを有する本発明によるマトリックス材料のスポンジは、適切な細胞が多孔質スポンジを占領し、それによって歯周靱帯を再生することを許容しつつ、上皮細胞の下方成長を防止するために使用することができる。そのような用途のためのさらなるガイダンスは、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ III．６，“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｉｎ Ｄｅｎｔａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”によって提供される。
細胞が本発明のマトリックス中へ接種または他のように取り込まれ、生育される他の用途については、細胞の取り込みおよび生育はこの分野で既知の態様で容易化されることができる。このような方法の例は、すべてここに参照として取り入れる米国特許Ｎｏｓ．５，０４１，１３８；５，５６７，６１２；５，６９６，１７５および５，７０９，８５４に提供されている。
さらに考究することなく、当業者は以上の説明を使用して、本発明をその全範囲において利用することができるものと信じられる。以下の好ましい実施例は、それ故、単に例証であり、開示の残部の限定ではないと解すべきである。
以上および以下に引用したすべての出願、特許および刊行物と、１９９７年３月３１日に出願された米国仮出願No.６０／０４２，１９８の全体の開示をここに参照として取り入れる。
以前および以下の実施例において、すべての温度は摂氏で述べており、そして特記しない限りすべての部およびパーセントは重量による。
実施例
実施例１
マトリックス加工
Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドの８５：１５コポリマー（ＰＬＧＡ）のペレットをＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｈｅｍｌｅｙ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入し、すべての実験におけるポリマーマトリックスを成形するために使用した。ポリマーの固有粘度は約１．３〜１．７であった。ポリマーペレットをＴｅｋｍａｎ粉砕機（Ｂｅｌ−Ａｒｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｅｑｕａｎｎｏｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて粉砕し、１０６ないし２５０μｍ範囲の粒子を得るように篩分した。ある実験においては、ポリマー粒子は塩化ナトリウム粒子（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｐａｒｉｓ，ＫＹ，ＵＳＡ）と混合した。塩粒子は一定のサイズを得るように篩分され、そしてＮａＣｌ：ＰＬＧＡ重量比が０ないし５０の範囲とされた。すべての場合、ＰＬＧＡとＮａＣｌの全質量は０．８ｇにコンスタントに保たれた。ＰＬＧＡとＮａＣｌの混合物はＫＢｒダイス（直径１．３５ｃｍ，Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）へ充填され、Ｃａｒｖｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｆｒｅｄｓ．Ｃａｒｖｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｏｍｉｎｅｅ Ｆａｌｌｓ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて１５００ｐｓｉにおいて１分間圧縮され、中実ディスク（厚み＝３．４ｍｍ）を得た。このサンプルを次に高圧ＣＯ₂ガス（８００ｐｓｉ）へ４８時間暴露し、ポリマーをガスで飽和させた。次にガス圧力を環境圧力へ減らすことによって熱力学的不安定性を創出した。これはポリマーマトリックス中のＣＯ₂ポアの核化および成長へ導いた。次にＮａＣｌ粒子をマトリックスからマトリックスを蒸留水中で４８時間浸出することによって除去した。すべての処理ステップは環境温度で実施された。
多孔質スポンジは、以前に記載された溶剤キャスティング／粒子浸出技術（Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ，Ａ．Ｊ．Ｔｈｏｒｓｅｎ，Ｌ．Ａ．Ｃｚｅｒｗｏｎｋａ，Ｙ．Ｂａｏ，ａｎｄ Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）ｆｏａｍｓ”，Ｐｏｌｙｍｅｒ，３５，１０６８−１０７７（１９９４））を用いて成形された。このプロセスにおいて、ＰＬＧＡはクロロホルム（Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ；Ｐａｒｉｓ，ＫＹ，ＵＳＡ）に１０％（ｗ：ｖ）溶液を得るように溶かされ、そしてこの溶液０．１２ｍｌを２５０〜５００ｍｍの寸法に篩分された塩化ナトリウム粒子０．４ｇを詰めたテフロンシリンダー（直径０．５ｃｍ；Ｃｏｌｅ ，Ｐａｒｍｅｒ）中へ負荷された。溶媒蒸発後、捕捉された塩粒子を有するポリマーフィルム（厚み３ｍｍ）を型から注意深く除去した。塩はフィルムを４８時間蒸留水中に浸漬することにより除去した。
特徴化
サンプルの多孔度は、以下の式を用いて処理後全体測定および重量によって最初に決定された。
式１：
多孔度（％）＝１−〔（重量／体積）／（ポリマー密度）〕×１００
サンプルは走査型電子顕微鏡（ＩＳＩ−ＤＳ１３０，Ｔｏｐｃｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて造影された。サンプルはスパッタコーター（Ｄｅｓｋ II，Ｄｅｎｔｏｎ Ｖａｃｕｕｍ，Ｃｈｅｒｒｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて金でコートされ、顕微鏡は１０ｋＶにおいてサンプルを造影するように作動された。ポラロイド５５フィルムが顕微鏡写真のために使用された。
圧縮および引張り試験はＭＴＳ Ｂｉｏｎｉｘ １００（Ｓｉｎｔｅｃｈ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡ）上で実施された。サンプルは圧縮試験のため１×１ｃｍ四方にカットされた。引張り試験のため、サンプル（１×１ｃｍ）はエポキシ接着剤を用いて板紙へ取付けられた。板紙の中心に７ｍｍのスロットをカットし、サンプルを中心決めし、次にゲージ長さを標準化するため接着した。圧縮および引張り試験はコンスタントなひずみ速度（１ｍｍ／ｍｉｎ）をもって実施された。モジュラスは応力−ひずみグラフの弾性部分のスロープから決定された。
浸出後に残っている塩残渣の量を決定するために熱重量分析が利用された。マトリックスは１０℃／ｍｉｎのコンスタント速度で１５０℃から３００℃へ加熱され、そして残存質量がモニターされた。
細胞研究
平滑筋細胞（ＳＭＣ）がすべての実験に使用された。ＳＭＣはＲｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａ．Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｊ．Ｊ．Ｋｕｌｉｋ，Ｍ．Ｂ．Ｔａｕｂｍａｎ，Ｂ．Ｃ．Ｂｅｒｋ，Ｃ．Ｗ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｂ．Ｎａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｌｏｎｅｄ ｒａｔ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉａｌ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｔｈａｔ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｓ”，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８６，１９７７−１９８６，１９９２）に記載されている技術の変法を用いて単離され、培養された。要約すると、細胞は３００〜３５０ｇ成熟雄性Ｌｅｗｉｓ ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）の大動脈から酵素解離を使用して単離された。脂肪、外膜および動脈を取り巻く結合組織を鈍い切開によって除去した後、ＳＭ組織を多数の小片にカットし、３７℃の酵素解離バッファーを収容している回転フラスコへ入れた。このバッファーは、エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）０．１２５ｍｇ／ｍｌ，コラゲナーゼ（ＣＬＳタイプＩ，２０４単位／ｍｇ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）１．０ｍｇ／ｍｌ，大豆トリプシンインヒビター（タイプ１−Ｓ，Ｓｉｇｍａ）０．２５０ｍｇ／ｍｌ，および結晶ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｙｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）２．０ｍｇ／ｍｌを含んでいる。９０分インキュベーション後、懸濁液を１００ ５ｍ Ｎｉｔｒｅｘフィルター（Ｔｅｔｋｏ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉａｒｃｌｉｆｆ Ｍａｎｏｒ，ＮＹ）を通して濾過し、２００Ｇで５分間遠心した。ペレットは、胎児ウシ血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）２０％（ｖ／ｖ），Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）２ｍＭ，およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）５０単位／ｍｌで補強した培地１９９（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁された。細胞は組織培養プラスチック上で加湿５％ＣＯ₂雰囲気中、媒地（培地１９９，胎児ウシ血清１０％（ｖ／ｖ）、ペニシリン−ストレプトマイシン５０単位／ｍｌ）を１日置きに交換して培養された。通過１７の細胞がこれらの実験に使用された。
マトリックスは、３．１４×１０⁷細胞／ｍｌを含む細胞懸濁液４０ｍｌを各マトリックスのトップに置き、細胞懸濁液がマトリックス中に吸収されるのを許容することによってＳＭＣを接種された。マトリックスは組織培養皿に収容され、３７℃において３６時間までインキュベートされた。次にポリマーマトリックスは２週間培養され、回転フラスコ（１００ｍｌ，Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）に入れられ、４０ＲＰＭで攪拌された。マトリックス中の細胞の数はヘキスト３３２５８染料および蛍光計（Ｈｏｅｆｅｒ ＤｙＮＡ Ｑｕｎｔ２００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用い、酵素消化３サンプル中のＤＮＡ含量を測定することによって以前記載されたように決定された。走査型電子顕微鏡検査のため、サンプルは１％グルタルアルデヒドおよび０．１％ホルムアルデヒド中でそれぞれ３０分間および２４時間固定され、エタノール／水溶液の段階化シリーズで脱水され、乾燥、そして次に金でスパッターコートされた。走査型電子顕微鏡（ＩＳＩ−ＤＳ１３０，Ｔｏｐｃｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）はサンプルを造影するため１０ｋＶにおいて作動された。組織学的セクションは、細胞ポリマーマトリックスを固定（１０％ホルマリン）、脱水、埋め込み、セクション化および標準技術を用いてヘマトキシリンとエオシンまたはＶｅｒｈｏｅｆＵｓで染色することによって調製された。
発泡マトリックスの保全性および多孔度／ポア構造
顕微鏡写真は、中実ポリマーのガス発泡のみが高度に多孔質のマトリックスへ導いたことを示した。しかしながら、これらのマトリックスは外表面に非多孔質のスキンを有し、そしてポアは以前の研究（Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ｆ．Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｎ．Ｐ．Ｓｕｈ，Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ，ａｎｄ Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，“Ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｆａｂｒｉｃａｔｅ Ｐｏｒｏｕｓ ｓｐｏｎｇｅ ｏｆ Ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７，１４１７−１４２２，１９９６）から予期されたように、大部分が閉鎖されていた。対照的に、本発明に従った大きい（２５０＜ｄ＜４２５μｍ）ＮａＣｌ粒子の高パーセント（９５％）を含んでいるディスクのガス発泡およびその後の浸出は、外側の非多孔質スキンの証拠なしに高度に多孔質の開いたポアマトリックスの生成へ導いた。これらマトリックスの断面に観察されたポア構造は、ＳＣ／ＰＬ技術で生成したマトリックスの断面に観察された構造と似ていた。しかしながらＳＣ／ＰＬプロセスから生成したマトリックスのポア構造は、有機溶媒の蒸発および塩ベッドに捕捉された残っている溶液のポリマー濃度のその後の上昇により、マトリックス全体を通じてしばしば均一でない。例えば、処理の間ガラスカバースリップに隣接するこれらマトリックスの表面は、顕微鏡写真においてマトリックスの残り部分よりも典型的に多孔質でないことが示される。対照的に、ガス発泡／粒子浸出（ＧＦ／ＰＬ）したマトリックスのポア構造はマトリックス全体を通じそして外表面上で均一であった。マトリックスのＴＧＡ分析はＮａＣｌの無視し得る量が浸出後残ったことを示した。皿に残った白色残渣の微量が存在した。ガス発泡が安定なマトリックスの生成に責任があることを確認するため、対照サンプルが圧縮成形され、しかし発泡されなかった。これらマトリックスからのＮａＣｌの浸出はマトリックスの完全な破壊へ導いた。
次にＧＦ／ＰＬマトリックス中のＮａＣｌ：ＰＬＧＡの比率およびＮａＣｌ粒子の寸法をこのプロセスによって得ることができる多孔度の範囲およびポア構造を決定するために変化させた（表Ｉ）。ＮａＣｌ：ＰＬＧＡの比を同様に増加する時、これらマトリックスの全体の多孔度は８５．１％±２．３から９６．５％０．５へ上昇した。コンスタントなＮａＣｌ（９５％）において、塩粒子直径の増大は全体多孔度に対し非常に少ししか効果を持たなかった。しかしながら顕微鏡写真は塩直径が増大する時ポア寸法は平行して増大することを示した。
次に圧縮および引張り機械的試験を用いてマトリックスの安定性を評価した。一般的に、ＧＦ／ＰＬマトリックスはＳＣ／ＰＬマトリックスに比較して改良された機械的性質を示した（図１を見よ）。平均圧縮モジュラスはＳＣ／ＰＬおよびＧＦ／ＰＬマトリックスに対してそれぞれ１５９±１３０ｋＰａおよび２８９±２５ｋＰａであった。平均引張りモジュラスは、ＳＣ／ＰＬマトリックスに対して３３４±５２ｋＰａおよびＧＦ／ＰＬマトリックスに対して１１００±２３６ｋＰａであった（表II）。このデータは圧縮強度において８０％増加と、引張り強度において３００％増加を表している。
合成マトリックス上の組織発達
次にＧＦ／ＰＬマトリックスが細胞接着および組織形成を許容する能力をインビトロ研究において評価した。顕微鏡写真はＳＭＣがＧＦ／ＰＬマトリックスへ接着し、接種後利用可能な表面積を覆ったことを示した。培養２週間後細胞数の有意な増加が示された。平均細胞密度は０および２週においてそれぞれ１．７１×１０⁷細胞／ｍｌおよび３．０５×１０⁷細胞／ｍｌであった。これは細胞密度の４３．８％増加である。細胞はマトリックスのポアを埋め、合成マトリックス内に新しい三次元組織を創出した。しかしながら細胞成長の大部分は比較的均一な態様においてマトリックスの周囲のまわりに発生し、そして低い細胞密度が２週においてマトリックスの中心に観察された。この期間にわたってマトリックスの寸法および形状に変化は観察されなかった。

実施例２
発泡マトリックスからの成長因子の放出
方法
１２５Ｉ−標識した脈管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を最初１％アルギン酸ナトリウム溶液へ加え、次に液滴を塩化カルシウムを含んでいる水溶液中に射出することによってこの溶液のビーズをゲル化した。アルギン酸塩ビーズ（直径約３ｍｍ）を集め、洗浄し、凍結乾燥した。凍結乾燥したビーズは８５：１５ＰＬＧＡおよびＮａＣｌ粒子と混合し、混合物を圧縮成形し、そして前に記載したように、ガス発泡／粒子浸出プロセスで処理した。塩浸出および乾燥の後、マトリックスを無血清組織培養培地へ入れ、３７℃に維持した。周期的に培地サンプルを採取し、１２５Ｉ−ＶＥＧＦの含有量（ＰＬＧＡマトリックスから放出された）について分析した。放出された成長因子は全添加成長因子に対して正規化された。
結果
添加した成長因子の約２０％の初期破裂が１日目に記録され、そして成長因子の持続性放出が実験の残りの２０日間について記録された（図２を見よ）。
実施例３：成長因子送達
マトリックス上の組織の発達を容易化する一要因は局部環境中への成長因子の送達である。これらのマトリックスからの成長因子の取り込みおよび送達は１２５Ｉ−標識した脈間内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を用いてインビトロで評価された。薬物の実質な割合が粒子浸出プロセスの間に放出されたが、しかしながら残っている薬物は実験の２１日の間持続した態様で放出された（図４）。
実施例４
マトリックス成形
ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）のペレット、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの５０：５０コポリマー（５０：５０ＰＬＧＡ）固有粘度（ｉ．ｖ．＝０．２ｄｌ／ｇ）、７５：２５ＰＬＧＡコポリマー（ｉ．ｖ．＝１．３）、および８５：１５ＰＬＧＡコポリマー（ｉ．ｖ．＝１．４）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｈｅｎｌｅｙ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。ＰＧＡ，５０：５０ＰＬＧＡ（ｉ．ｖ．＝０．８）および８５：１５ＰＬＧＡ（ｉ．ｖ．＝０．６３）はＭｅｄｉｓｏｒｂ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）から購入した。８５：１５ＰＬＧＡ（ｉ．ｖ．＝３．６５）はＰｕｒａｓｏｒｂ（Ｌｉｎｃｏｌｎｓｈｉｒｅ，ＩＬ，ＵＳＥ）から得た。
固体ポリマー（ＰＬＬＡ，ＰＬＧＡ，ＰＧＡ）はＳｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ Ｍｉｃｒｏ−Ｍｉｌｌ（Ｂｅｌ−Ａｒｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｅｑｕａｎｎｏｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて粉砕し（液体窒素で冷凍後）、直径１０６〜２０５μｍへ篩分した。Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得たＮａＣｌはいくつかの実験に使用のため２５０〜４２５μｍへ篩分した。中実ポリマーディスクは、ポリマー１５０ｍｇ（ＰＧＡ，５０：５０ＰＬＧＡ，７５：２５ＰＬＧＡ，８５：１５ＰＬＧＡ，およびＰＬＬＡ）を直径１．３５ｃｍの丸型ステンレス鋼ＫＢｒダイ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）に入れ、そしてＣａｒｖｅｒ実験室用プレス（Ｆｒｅｄ Ｓ．Ｃａｒｖｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｏｍｉｎｅｅ Ｆａｌｌｓ，ＷＩ，ＵＳＡ）中１５００ｐｓｉにおいて６０秒圧縮した。この方法は発泡すべき中実ディスクを与える。すべてのサンプルは３個つくった。
ディスクは、８５０ｐｓｉのＣＯ₂，Ｎ₂またはＨｅを用いて高圧容器中で発泡させた。このディスクがガスで平衡化（１〜４８時間）した後、圧力を環境まで下げた。発生する熱力学的不安定性はポリマーマトリックス中でガスポアの核化および成長を生じはじめた。８５：１５ポリマーディスク（ｉ．ｖ．＝１．４）はＣＯ₂中１時間発泡させ、そして圧力は圧力放出の速度がスポンジの最終構造に影響するかどうかを決定するため異なる速度（１，２．５，５，１０分）で放出された。すべての処理ステップは環境温度で実施された。
ポリマー／ＮａＣｌディスクは、ポリマー４０ｍｇとＮａＣｌを用いて同様な方法でディスクに圧縮することによって成型された。発泡後ディスクはＮａＣｌを除去するため蒸留水中に入れられた。この浸出溶液は約１８時間のコースにわたって数回交換された。この浸出浸液はＡｇＮＯ₃と沈澱を与えない時ディスクは完全に浸出されたと考えた。もし溶液中にＣｌ^-が存在すれば、それはＡｇ⁺と白色沈澱を生成し、沈澱する。この沈澱を生成しないことは、ＮａＣｌが完全に足場から除去されたことを指示する。ディスクは次に一夜風乾され、測定および計重され、そして真空下デシケーター中に貯蔵された。ポリマーディスクは発泡直後に測定および計量され、そして真空下デシケーター中に貯蔵された。
特徴化
発泡したディスクの多孔度を計算するため、各ディスクの直径および厚みを測定するためにボーリーゲージが使用された。ディスクはメットラー天秤上で計量され、以下の式が用いられた：（ｄ＝ポリマー密度，ｇ＝ディスク重量，ｃｍ³＝計算したディスク体積）
多孔度＝１００〔１−（ｇ／ｃｍ³）／ｄ〕
サンプルのいくつかは走査型電子顕微鏡（ＩＳＩ−ＤＳ１３０，Ｔｏｐｃｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて造影された。サンプルはスパッターコーター（ＤｅｓｋII，Ｄｅｎｔｏｎ Ｖａｃｕｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈｅｒｒｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて金コートされ、そして顕微鏡はサンプルを造影するため１０ｋＶで作動された。ポラロイド５５フィルムが顕微鏡写真のために使用された。
圧縮試験はＭＴＳ Ｂｉｏｎｉｘ１００（Ｓｉｎｔｅｃｈ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡ）上で実施された。中実ポリマーディスクは不規則形状に発泡したから、ポリマー／ＮａＣｌディスクのみを圧縮試験に使用した。１ｍｍ／ｍｉｎのコンスタントなひずみ速度が使用され、モジュラスは応力−ひずみ曲線から決定された。
結果
中実ポリマーディスクの発泡：
実験の第１のシリーズにおいて、中実ポリマーディスクは、ポリマーマトリックスの多孔度に対するガスタイプ、圧力放出速度、ポリマー組成および分子量の役割を検討するために発泡された。８５：１５ＰＬＧＡマトリックスがいくつかの異なるガス（ＣＯ₂，Ｎ₂，Ｈｅ）で１時間発泡された。Ｎ₂およびＨｅに比較してＣＯ₂での発泡から有意義な多孔度が得られた。“プレフォーム”多孔度とはディスク調製後のしかし高圧平衡化前の計算した多孔度を意味する（図４）。ＣＯ₂で発泡したマトリックスの可視化は大部分閉鎖したポアよりなる高度に多孔質のマトリックスを明らかにした。
次の研究において、圧力放出の速度を１から１０分へ全時間を変更した。マトリックスの多孔度はガスがチャンバー内に凍結する時の非常に速い放出の場合を除いて、圧力放出速度に関係なく比較的コンスタントであった。後者はマトリックス多孔度の小さい減少へ導いた（図２）。
ポリマー組成の影響は、ＰＬＧＡの異なるコポリマー比（純ＰＧＡ，５０：５０，７５：２５，８５：１５ＰＬＧＡおよび純ＰＬＬＡ）を用いて検討された。ＰＧＡおよびＰＬＬＡは見られるほど発泡しなかった。コポリマーはすべて９０％より大きい多孔度へ発泡した（図６）。実際に、７５：２５コポリマーは圧力放出／ガス膨張フェーズにおいてその保全性を維持せず、文字どおりばらばらに落下する程多大に発泡した。このため多孔度値はこのサンプルについては計算できなかった。
ポア生成に対するポリマー分子量の影響を検討するため、０．６３ないし３．５９ｄｌ／ｇの範囲の固有粘度（ｉ．ｖ．）を有する８５：１５ＰＬＧＡのディスクを８５０ｐｓｉＣＯ₂中２４時間と、２．５分の圧力放出をもって発泡させた。高ｉ．ｖ．ＰＬＧＡは比較的低い多孔度を持ったマトリックスへ導いたが、低いｉ．ｖ．ＰＬＧＡはもっと高い多孔度をもたらした（図７）。
ポリマー／ＮａＣｌディスクの発泡
実験の第２のシリーズにおいては、開いたポア構造をつくる目的でＮａＣｌをポリマーディスクへ加えた。足場の構造および安定性に対する影響を決定するため、異なる変数（平衡時間およびポリマー組成）を検討した。実験の第１のシリーズは、実験のこのシリーズにおいてガス発泡剤としてＣＯ₂と、２．５分の圧力放出時間を使用することへ導いた。８５：１５ＰＬＧＡとＮａＣｌをＣＯ₂中で発泡させることによって形成された典型的なマトリックスの検査は、大部分開いた相互接続したポアを有する高度に多孔質の構造を示した。
最初の研究において、平衡時間を１から４８時間へ変化させた。マトリックスの多孔度は６時間より大きい平衡時間について比較的コンスタントであったが、６時間以下の平衡時間では減少した（図８ａ）。種々の平衡時間で成形したマトリックスは、平衡時間がそれらの機械的性質に影響したかどうかを決定するために後で試験された。ガス平衡化の６時間で最大の多孔度が得られたが、スポンジ足場はもっと長い平衡時間でつくられた（図８ｂ）。
次に実験の第１のシリーズと同様な結果が得られるかどうかを決定するため、ポリマー組成が変えられた。ＰＬＧＡコポリマーはＰＧＡおよびＰＬＬＡホモポリマーよりももっと大きい多孔度へ導いた（図９ａ）。ＰＬＬＡおよびＰＧＡの両方は浸出プロセス中崩壊し、少ししか発泡が起こらなかったことを指示した。すべてのＰＬＧＡコポリマーは同様な多孔度へ導いたが、高い乳酸含量を持ったＰＬＧＡは一層剛直であった（図９ｂ）。
以上の実施例は、一般的にまたは具体的に記載された本発明の反応剤および／または作業条件をもって以上の実施例に用いたそれらを置換することにより、同様な成功度をもってくり返すことができる。
【図面の簡単な説明】
本発明の種々の目的、特徴および得られる利益は、同様な参照文字はいくつかの図を通じて同一または類似の部品を指定する添付図面を合わせて考慮する時にもっと完全に評価され、より良く理解されるであろう。
図１：ＳＣ／ＰＬおよびＧＦ／ＰＬマトリックスの機械的性質（引張り強度）を比較するグラフ。
図２：実施例２に従ったポリマーマトリックスからの放射標識した成長因子の放出プロフィルを示す。
図３：実施例３に従ったマトリックスについて経時的な累計ＶＥＧＦ放出を示す。
図４：マトリックスの多孔度に対するガスタイプの影響。８５：１５ＰＬＧＡ（ｉ．ｖ．＝１．４ｄｌ／ｇ）ディスクを圧力放出前８５０ｐｓｉガス中１時間平衡化させた。圧力放出時間は２．５分であった。
図５：ＰＬＧＡマトリックスの多孔度に対する圧力放出速度の影響。８５：１５ＰＬＧＡ（ｉ．ｖ．＝１．４）ディスクをＣＯ₂中１時間、圧力放出時間１ないし１０分で発泡させた。
図６：異なるポリマーから成形したマトリックスの多孔度。ポリマーは８５０ｐｓｉＣＯ₂へ２４時間暴露し、２．５分で圧力放出した。
図７：ＰＬＧＡマトリックスの多孔度に対する分子量の影響。変化する固有粘度を有する８５：１５ＰＬＧＡのマトリックスを２４時間８５０ｐｓｉ ＣＯ₂中、２．５分の圧力放出時間で発泡させた。
図８ａ：変化する平衡化時間でのマトリックスの多孔度。８５：１５ＰＬＧＡ（ｉ．ｖ．＝１．４）とＮａＣｌのディスクを８５０ｐｓｉ ＣＯ₂中１〜４８時間の範囲の時間発泡させた。圧力放出時間は２．５分であった。
図８ｂ：異なる平衡化時間で成形したポリマー／ＮａＣｌ足場の弾性モジュラス。８５：１５ＰＬＧＡ（ｉ．ｖ．＝１．４）ＮａＣｌディスクを８５０ｐｓｉ ＣＯ₂中１〜１２時間、２．５分圧力放出で発泡させた。
図９ａ：ポリマー／ＮａＣｌ足場の多孔度に対するポリマー組成の影響。ＰＬＧＡの異なるコポリマー、ＰＧＡおよびＰＬＬＡとＮａＣｌを２４時間８５０ｐｓｉ ＣＯ₂中２．５分圧力放出で発泡させた。
図９ｂ：異なるポリマー組成で発泡させたマトリックスの弾性モジュラス。ＰＬＧＡの異なるコポリマー比とＮａＣｌを２４時間８５０ｐｓｉ ＣＯ₂中２．５分圧力放出で発泡させた。
以上の説明から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確かめることができ、そしてその精神および範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に適応させるため本発明の種々の変更および修飾をなすことができる。

Claims (36)

1. 浸出し得る粒状物を含んでいるポリマー材料をガス発泡により、そしてその後追加の多孔度を形成するため粒状物質を浸出することを含む、多孔質ポリマー材料の製造方法。
2. ガス発泡によるポアの形成は、ポリマーの粒子と粒状物の粒子の混合物をガスがポリマー中に溶解するように不活性ガスの上昇圧雰囲気へ服せしめ、次にガスの核化および成長が発生しそして粒状物を含んでいるポリマーが連続マトリックスを形成するように熱力学的不安定性を創出することによって実施される請求項１の方法。
3. ポリマーの粒子と粒状物の粒子の混合物は、ガスポアの形成前に選定された寸法および形状に圧縮成形される請求項２の方法。
4. 熱力学的不安定性は圧力雰囲気を減らすことによって創出される請求項２の方法。
5. ガスはＣＯ₂である請求項２の方法。
6. ポリマーは生体適合性ポリマーである請求項１の方法。
7. ポリマーは生体適合性生分解性ポリマーである請求項１の方法。
8. ポリマーは乳酸および／またはグリコール酸のホモポリマーまたはコポリマーである請求項１の方法。
9. ポリマーはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）である請求項１の方法。
10. ポリマーは乳酸および／またはグリコール酸のホモポリマーもしくはコポリマーと、他のポリマーとのブレンドである請求項１の方法。
11. ポリマーは乳酸および／またはグリコール酸のホモポリマーもしくはコポリマーと、アルギン酸塩ポリマーとのブレンドである請求項１０の方法。
12. 粒状物は水溶性粒状物である請求項１の方法。
13. 粒状物は塩である請求項１の方法。
14. 粒状物はＮａＣｌである請求項１の方法。
15. 粒状物の寸法および量は多孔質ポリマー中に相互接続したポア構造が形成されるように選定される請求項１の方法。
16. 粒状物の量はポリマーの粒子と粒状物の粒子の混合物の少なくとも５０容積％である請求項１３の方法。
17. 粒状物の平均粒子寸法は１０ないし５００ミクロンである請求項１３の方法。
18. ガス発泡によって生成したポアと、ポリマーから粒状物の浸出によって生成したポアを含んでいるポリマーマトリックスよりなる多孔質ポリマー。
19. ポリマーマトリックスは生体適合性生分解性ポリマーである請求項１８のポリマー。
20. ポリマーマトリックスは乳酸および／またはグリコール酸のホモポリマーまたはコポリマーである請求項１８のポリマー。
21. ポリマーマトリックスはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）である請求項１８のポリマー。
22. ポリマーは相互接続されたポア構造を有する請求項１８のポリマー。
23. ポアの組合せは均一な開いたポア構造を提供する請求項１８のポリマー。
24. ポリマーは引張りモジュラス８５０ｋＰａまたはそれ以上を示す請求項１８のポリマー。
25. 請求項１８の多孔質ポリマー内に含められた薬物を導入することを含む薬物送達方法。
26. 薬物は、多孔質ポリマー内に含まれるあるポリマーのポリマー構造内に含められた成長因子である請求項２５による薬物送達方法。
27. 組織のためのマトリックスとして請求項１８の多孔質ポリマーを導入することを含む組織エンジニヤリング方法。
28. 請求項１８の多孔質ポリマーと移植のための細胞の組合せを投与することを含む細胞移植方法。
29. 請求項１８の多孔質ポリマーのポア中で細胞を培養することを含む細胞培養方法。
30. ガス発泡により生成したポアとポリマーから粒状物の浸出によって生成したポアとを含んでいるポリマーマトリックス、および一体に接続された非透過性ポリマーのセクションを含んでいる多孔質ポリマーよりなるポリマー材料。
31. 多孔質ポリマーは均一な開いたポア構造を有し、非透過性ポリマーは同じポリマー材料のものであるが開いたポア構造を持たない請求項３０のポリマー材料。
32. 組織再生を必要とする場所へ請求項３０のポリマー材料を導入することを含む誘導組織再生方法。
33. 多孔質ポリマーおよび非透過性ポリマーは異なるポリマー材料のものである請求項３０のポリマー材料。
34. 多孔質ポリマーのポア内に収容された薬物をさらに含んでいる請求項１８のポリマー。
35. 多孔質ポリマーのポア内に生きている細胞をさらに含んでいる請求項１８のポリマー。
36. 多孔質ポリマーのセクションのポア内に組織再生のための生きている細胞をさらに含んでいる請求項３０のポリマー材料。

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