JP4052553B2 - 微細自己集合体の製法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、糖脂質が自発的に集合して形成されるナノチューブ及びナノファイバーのような微細自己集合体に、水溶液中穏和な条件にて、酵素化学的に更に糖を付加させた微細自己集合体の製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の天然植物資源から分離精製したカルダノールを出発原料として合成されたグルコース置換長鎖アルキルフェノール誘導体であるカルダニルグルコシドは、水中において加熱溶解し徐冷することで糖鎖の水素結合によりナノチューブ状凝集体を形成することが知られている（G. John, M. Masuda, Y. Okada, K. Yase, and T. Shimizu, Adv. Mat., 13, 715 (2001)）。
本発明者らは、このような自己集合体の製造方法（特願２００１−３６３７６２、特願２００２−３５０３５等）や糖鎖にオリゴ糖を用いた自己集合体（特願２００２−４９２３８）を開示している。これらにおいては、糖鎖として、グルコース、ガラクトース、マンノースなどの単糖やラクトースなどの多糖類が用いられており、これらの凝集体の表面は、均一（同一）の糖で覆われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、２種類以上の異なる種類の糖もしくは糖鎖を同時に有するナノチューブ及びナノファイバーは知られていない。
従来、固体表面上への糖鎖の導入、あるいは、既に存在する糖に、別の糖を導入する方法として、いわゆる固相合成法が知られているが（例えば、眞鍋、伊藤、高分子、４７巻、９６ページ、１９９８年）、ナノチューブ及びナノファイバーのような液晶と結晶の中間の性質を有する自己集合体に対しては、固相合成による糖鎖の導入、修飾などはおこなわれておらず、また、この固相合成法は、そのほとんどが、有機合成化学的アプローチである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上述した従来技術の実状に鑑みてなされたものであり、自己集合体の表面に存在する糖脂質を酵素化学的な穏和な条件下で第２の糖を結合させて、新規な糖鎖を表面に構築する方法を提供する。また、この方法を繰り返すことにより糖鎖を連続的に導入し、より複雑な糖鎖残基を構築することができる。
即ち、本発明は、下記一般式
【化１】
（式中、Ｇは２〜３０の単糖が結合したオリゴ糖残基を表し、Ｒは炭素数６〜２５の炭化水素基を表す。）で表わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自己集合体の製法であって、１）下記一般式
【化２】
（式中、Ｘ１はグリコシル基又は２〜２９の単糖が結合したオリゴ糖残基を表し、Ｒは上記と同様である。）で表わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自己集合体、２）単糖又はその誘導体、及び３）糖転移酵素又は糖分解酵素を水中で反応させることから成る微細自己集合体の製法である。
【０００５】
この方法において、１）下記一般式
【化２】
（式中、Ｘ１及びＲは上記と同様である。）で表わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自己集合体、２）単糖と核酸の複合体、及び３）糖転移酵素を水中で反応させてもよい。この糖転移酵素はガラクトース転移酵素、シアル酸転移酵素、又はフコース転移酵素であることが好ましく、この反応系が更に蛋白質を含むことが好ましい。
【０００６】
また、上記方法において、１）下記一般式
【化２】
（式中、Ｘ１及びＲは上記と同様である。）で表わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自己集合体、２）置換されていてもよいアリール基と単糖残基との結合体、及び３）糖分解酵素を水中で反応させてもよい。この糖分解酵素はアルファガラクトシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、シアリダーゼ、アルファグルコシダーゼ、又はベータグルコシダーゼであることが好ましい。
また、これらの製法において、前記反応を多段階行うことにより、糖を多段階で導入してもよい。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で処理の対象となる自己凝集体を構成する化合物は、下記一般式
【化２】
で表わされるＯ−グリコシド型糖脂質である。
本発明においては、炭化水素基（Ｒ）は−Ｏ−Ｘ１基に対してｏ位、ｍ位又はｐ位のいずれにあってもよいが、メタ（ｍ）位にあることが好ましい。
前記一般式（化２）におけるＸ１はグリコシル基又は２〜２９の単糖が結合したオリゴ糖残基、好ましくはグリコシル基又は２〜４の単糖が結合したオリゴ糖残基２〜５、より好ましくはグリコシル基である。このようなものとしては、例えばグルコピラノース、ガラクトピラノース、マンノピラノース、アロピラノース、アルトロピラノース、グロピラノース、イドピラノース、タロピラノースのようなアルドピラノース及び対応するアルドフラノースの還元末端の水酸基から水素原子を除いた残基、ラクトース、メリビオース、セロビオース、及びガラクトシル−α（１→４）ガラクトースなど市販で入手可能な化合物、又は化学合成あるいは酵素合成で得られるオリゴ糖などが挙げられる。還元末端のアノマー位のグリコシド結合はα−アノマー及びβ−アノマー及びそれらの混合物のいずれであってもよい。
【０００８】
一方、前記一般式（化１又は２）におけるＲは、炭素数が６〜２５、好ましくは１４〜１６、より好ましくは１５の炭化水素基であり、好ましくは飽和又は二重結合を１〜５、好ましくは１〜３含む不飽和の脂肪族炭化水素から成る脂肪族炭化水素である。この炭化水素は好ましくは直鎖である。このような炭化水素基としては、例えば、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基や、これらに不飽和結合としてモノエン、ジエン、トリエンなどを含むものが挙げられるが、原料の入手が容易であるという点で、８−ペンタデセニル基、８，１０−ペンタデカジエニル基、８，１０、１２−ペンタデカトリエニル基が好ましい。
【０００９】
前記一般式（化２）で表わされるＯ−グリコシド型糖脂質は例えば次に示す方法により製造することができる。
水酸基がすべてアセチル基で保護されたオリゴ糖を一般式
【化３】
（式中、Ｒは前記と同様である。）で表わされる長鎖炭化水素フェノールに添加し、水酸基部分にグリコシド結合させ、次に糖残基のアセチル保護基を除去することにより、糖置換長鎖炭化水素フェノール誘導体を得ることができる。
アセチル化の手順として下記に一例を示す。オリゴ糖をドライピリジンに溶解させ、無水酢酸を加え、室温〜40℃で１時間〜1晩磁気撹拌する。この際、ジメチルアミノピリジンを反応系に加えておくと反応が速く進行する。トルエンとエタノール の混合溶媒で５〜７回共沸させピリジンを除き、残渣をクロロホルムに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で数回洗う。濃縮しシリカゲルカラムで精製し、濃縮して乾燥させる。
【００１０】
本発明においては微細自己集合体の製法に特に制限はないが、上記Ｏ−グリコシド型糖脂質を水に分散後、マントルヒーターを用いて加熱、約20分沸騰し、室温まで自然冷却、微細自己集合体が出来るまで室温に放置することにより得ることができる（特願２０００−２７１１９２、特願２００１−３６３７６２等）。
【００１１】
次に、本発明の微細自己集合体の合成法の一例について説明する。
まず、上記のようにして微細自己集合体（基質）を形成させ、この基質をＨＥＰＥＳ緩衝液やリン酸緩衝液中で、糖転移酵素又は糖加水分解酵素、好ましくはの糖転移酵素存在下、単糖残基を含むドナーを基質に対して過剰量（例えば、基質に対して等重量〜１００倍重量）用いて、室温〜５０℃、好ましくは３５℃近辺で、１分〜３０日間、緩やかに浸透又は放置して反応させる。
このＨＥＰＥＳ緩衝液やリン酸緩衝液の濃度は、好ましくは０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭであり、ｐＨは、好ましくは４〜８、より好ましくは６．５〜７．８である。
酵素の量は、基質に対して触媒量もしくは、過剰量（例えば、１００倍）であり、これをユニットで表すと、１ｍＵ〜１０００００００Ｕ、好ましくは１０ｍＵ〜１Ｕである。
【００１２】
この反応は用いる酵素により異なる。それぞれの場合に分けて説明する。
（１）糖転移酵素を用いる場合：
水中で、１）上記基質、２）単糖と核酸の複合体、及び３）糖転移酵素を反応させる。
核酸としてはＵＤＰやＣＭＰなど用いる酵素の反応性を考慮して選択する。複合体はこの核酸のリン酸部位と単糖の主に１位の水酸基とが結合した複合体であり、リン酸部とナトリウムなどのアルカリ金属とが結合したものでもよい。また必要に応じて、触媒量（例えば、ＵＤＰ−糖に対して１〜１０重量％）のＭｎ２＋（例えば、ＭｎＣｌ２）を添加してもよい。このような複合体としては、例えば、ＵＤＰ−糖 (例えば、uridine 5’-diphosphogalactose)、ＣＭＰ−糖(例えば、cytidine 5’-monophospho-N-acetylneuraminic acid)などが挙げられる。
糖移転酵素としては、例えば、ガラクトース転移酵素(国際生化学連合(IUB)酵素委員会報告による番号：EC. 2.4.1.22)、シアル酸転移酵素(EC. 2.4.99.1)、フコース転移酵素(EC. 2.4.1.69)などが挙げられる。
【００１３】
糖転移酵素を使用するときには、反応の経過にともない生成するジリン酸誘導体を分解するためのアルカリフォスファターゼのような酵素（その量は、１ｍＵ〜１００００Ｕ、好ましくは１０ｍＵ〜１０Ｕである。）が必要となる場合がある。さらに、対象とする基質の糖脂質（例えば、グルコース）に第２の糖を導入する場合には、ラクトアルブミンやアルブミンのような共存蛋白質（通常は、糖転移酵素に対して等モル以上。）が必要となる場合がある。
この蛋白質は、任意成分であるが、反応液内において酵素と錯体を形成し、糖供給源を微細自己集合体表面に存在する糖残基に転移させる働きをすると考えられ、この蛋白質がないと、転移の効率が大幅に減少する場合がある（Schanbacher, F. and Ebner, k. E., J. Biol. Chem., vol.245, pp5057 (1970), Brew, K., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.59, pp491 (1968), Fitzgerald, D.K., et al., J. Biol. Chem., vol.245, pp2103 (1970), Narimatsu, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.83, pp4720 (1986)）。
【００１４】
（２）糖加水分解酵素を用いる場合：
水中で、１）上記基質、２）置換されていてもよいアリール基と単糖残基との結合体、及び３）糖分解酵素を水中で反応させる。
アリール基は糖残基と結合することにより糖残基を活性化させ、糖加水分解酵素の攻撃を受けやすくするものと考えられ、好ましくはフェニル基である。この機能を強化するためにこのアリール基は例えばニトロ基のような置換基を有していてもよい。
このような結合体として、例えば、4-nitrophenyl 糖 (例えば、4-nitrophenyl β-D-galactopyranoside)、2-nitrophenyl 糖 (例えば、2-nitrophenyl β-D-galactopyranoside)、umbelliferyl 糖 (例えば、umbelliferyl β-D-galactopyranoside)のように、糖のアグリコン部分に芳香族を導入した活性化された糖が挙げられるが、フリーの糖そのもの、又は、糖−別の糖(例えば、ラクトースなど)を用いても反応を行うこともできる。
このような結合体又は糖は糖加水分解酵素により分解され、分解された糖残基は基質（先の微細自己集合体）の糖に結合する。
糖加水分解酵素としては、例えば、アルファガラクトシダーゼ(EC. 3.2.1.22)、ベータガラクトシダーゼ(EC. 3.2.1.23)、シアリダーゼ(EC. 3.2.1.18)、アルファグルコシダーゼ(EC. 3.2.1.20)、ベータグルコシダーゼ(EC. 3.2.1.21)などが挙げられる。
【００１５】
このような酵素反応の好ましい反応時間は、２４時間〜２４０時間である。酵素及びドナーは、数回にわたり分割して加えてもよい。
また、反応が進行するに伴い、ｐＨが減少（酸性サイドに傾く）するため、０．１Ｎ ＫＯＨやＮａＯＨのような塩基性水溶液で中和をすることが望ましい。ｐＨは、７．８を越えないようにするのが好ましい。
反応後の生成物の精製には、５００−２００００ｒｐｍで１分〜１時間、遠心分離する。未反応試薬を除くため、同一の緩衝液又は、蒸留水などで数回洗浄をおこなう。
このようにして、第２の糖が導入したナノチューブ及びナノファイバーに対して、上記の方法を繰り返し行うことにより、既に存在する第２の糖に対して第３の糖を導入できる。これを繰り返して、ｎ個の糖を順次導入し、糖鎖表面修飾ナノチューブ及びナノファイバーを構築できる。
【００１６】
糖鎖導入率を調べるためには、酵素反応終了後、いったん、ナノチューブ及びナノファイバーを０．１−１．０Ｍトリフルオロ酢酸のような強酸で、各糖及びアグリコン部分のアルコールとに完全加水分解を行い（８０〜１００℃、１０分〜５時間）、ここで、脂溶性のアグリコン由来の長鎖芳香族アルコールを除去し、水溶性の各構成糖を４−アミノ安息香酸エチルエステルのような蛍光発色団又は紫外可視発色団を酢酸−ＢＨ３・ピリジン錯体中、５０−１００℃で１０分−３時間反応させ、蛍光標識した各糖誘導体へと変換する。つぎに、例えば、０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．９）／アセトニトリル（９３／７，ｖ／ｖ）、又は、０．０２％ＴＦＡ／アセトニトリル（１：１，ｖ／ｖ）などを溶離液に用い、逆相カラム（Ｃ−１８など）で室温〜４０℃にてＨＰＬＣ分析を行うと、ガラクトース、マンノース、グルコースなどが溶出され、それらのピーク面積より、各構成糖の割合を求めることができる。蛍光によるモニターは、Ｅｘ．３０５ｎｍ，Ｅｍ．３６０ｎｍで、ＵＶによるモニターは、３０５ｎｍが好ましい。通常、第２の糖の導入率は、１〜３０％程度である。また、ＨＰＬＣ分析においては、スタンダードとなる糖を上記と同様の方法により、サンプルと同時に誘導体へと変換し、検量線を作成することが好ましい。
【００１７】
上記のＨＰＬＣ分析の他、ナノチューブ及びナノファイバーに対して、新たに導入した糖を分析する方法として、蛍光標識したレクチンを利用することもできる。使用するレクチンには、導入した糖に対応して認識する標準レクチンが市販されている。例えば、グルコースに対しては、例えば、concanavalin A由来（以下、Ｃｏｎ Ａという。）の、ガラクトースに対しては、Erythrina由来(以下、ECAという。)のレクチンがそれぞれ対応する。また、蛍光発色団には、ＦＩＴＣ標識、ＴＲＩＴＣ標識、ｔｅｘａｓ ｒｅｄなどがあげられ、いずれもレクチンに結合したものが市販されている。
【００１８】
上記蛍光標識したレクチンを用いた、糖残基の確認は、次のようにしておこなう。上記記載の糖脂質の自己集合化により形成されるナノチューブ及びナノファイバー（基質）をＨＥＰＥＳ緩衝液やリン酸緩衝液（いずれも、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、通常は、１０ｍＭ〜１００ｍＭが好ましい。また、ｐＨは、４〜８であるが、ｐＨ６．５〜７．８が好ましい）中、市販の蛍光標識レクチンを予想される糖残基に対して、等モル〜１００倍等量となるよう加える。通常は、数種類のモル等量の異なるレクチンを用意しておき、最適なものを選択する。レクチンにＣｏｎ Ａを使用するときには、この他に、マンガンイオン（通常は、１ｍＭ〜１００ｍＭ）が必要である。３０分〜２日間、０℃〜４０℃で、ゆっくりと浸透させるか、放置して反応させる。通常は、２０時間、室温下で放置する。
反応終了後の「後処理」は、前記記載の方法と同様である。また、該ファイバー及びチューブの蛍光標識観察には、蛍光顕微鏡下でおこなう。
【００１９】
また、対照実験として、糖に対して結合能を持たないレクチンを用いて、結合しないことの確認も必要である。さらに、必要であれば、阻害実験もおこなう。つまり、ナノチューブ及びナノファイバーの表面に存在する糖と同一の糖を、等モル〜１００倍過剰に加えておき、これに、蛍光標識レクチンを加え、該ファイバー及びチューブが標識されないことを確認することが好ましい。
必要に応じて、金コロイド微粒子などのレクチンを用いて、電子顕微鏡下（ＴＥＭ，ＳＥＭなど）で、直接、糖残基の存在を確認することもできる。実験の手順は、上記と同様である。また、上記に記載の対照実験や阻害実験も必要に応じておこなうことが好ましい。
【００２０】
【発明の効果】
本発明のような微細自己集合体の構造は、４６℃以上の温度及び有機溶媒の存在下では安定ではなく、４６℃以下の温度で、水の中でのみ安定に存在し得うる[cf. G. John, M. Masuda, Y. Okada, K. Yase, T. Shimizu, Advanced Materials, vol.13, pp715 (2001)]。このことは、仮に、該ナノチューブを修飾しようとするのであれば（例えば、該ナノチューブ表面に、別の糖鎖を導入しようとするのであれば）、有機合成化学的に種々の試薬を用い、有機溶媒中で糖を導入するか、もしくは、該ナノチューブが安定に存在し得る水溶液中にて、酵素を用いてマイルドに糖を導入するかのいずれかとなる。前者の場合、上記の理由により操作は困難である。本発明の方法によれば、自己集合時の水中もしくは、イオン強度の抑えられた緩衝液中で、有機溶媒を何ら使用することなく、生体反応に類似するほど穏和な条件で、酵素化学的に新規な糖もしくは糖鎖を導入することができる。
【００２１】
また、本発明の方法によれば、一旦ナノファイバーのような微細自己集合体を形成させて、その糖鎖に更に所望の糖鎖を結合させることができる。例えば、ＮｅｕＡｃアルファ２−３（又は６）Ｇａｌベータ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Y. Suzuki et al., J. Biol.Chem., vol.261,pp17057-17061.）のようなインフルエンザウイルスと結合できる天然のリガンド糖鎖をα２→６結合で結合させることができれば、インフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスを、捕捉・中和できる。更に、Ｏ−１５７又はそれの生産するベロ毒素と結合するＧａｌアルファ１−４Ｇａｌの構造を有する糖鎖（K. Karlsson et al., J. Biol. Chem., vol.260, pp8545 (1985).）をα１→４結合で導入できれば、病原性大腸菌O-157そのもの、もしくは、それの生産するベロ毒素を効果的に結合できる。このように、導入する糖鎖として、意義のある配列を有する糖鎖（これをリガンド糖鎖という）を導入できれば、特定の有害ウイルス、病原性細菌、毒素などを特異的に結合できるナノチューブ及びナノファイバーを提供することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
製造例１
カシューナッツオイルを約４００Ｐａで２回真空蒸留し、２２０℃から２３５℃の沸点をもつ成分を集めてカルダノールを得た。そのカルダノール１．５２ｇ（５ミリモル）を無水塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解させ、２ｇのモレキュラーシーブ４Ａの存在下、β−Ｄ−グルコースペンタアセテート３．９ｇ（５ミリモル）と三フッ化ホウ素ジエチルエーテル０．６２ｍｌ（５ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温で２４時間かきまぜたのち、５％−炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ込んだ。有機相を分別し、炭酸水素ナトリウム水溶液、続いて水で洗浄したのち、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。有機溶媒を減圧下で完全に留去し、得られた粗生成物をエタノールから再結晶させた。得られた生成固体をヘキサン／酢酸エチル（容積比７／３）混合溶媒を溶出液としてカラムクロマトグラフイーを行い、白色固体の１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドテトラアセテート）カルダノール２．３６ｇ（収率７５％）を得た。
この生成物の物理的性質は次のとおりである。
【００２３】
次に、４５質量％のトリメチルアミン水溶液を４倍体積のメチルアルコールと混合させ、得られた１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドテトラアセテート）カルダノール（１．２６ｇ、２ミリモル）と２４時間反応させた。溶媒を減圧下、留去したのち、得られたシロップ状残査をメチルアルコール／アセトニトリル（体積比１／２）混合溶媒から結晶化させ、さらに同一溶媒から再結晶することにより、目的とする脱アセチル化した１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）カルダノール（「カルダニルグルコシド」という。）をほぼ定量的に白色固体０．８８ｇ（収率９５％）として得た。
この生成物の物理的性質は次のとおりである。
このカルダニルグルコシドに、メタノール（和光純薬）中、パラジウム（小島化学）の存在下、水素気流下で接触水添を行い、飽和カルダニルβ-D-グルコピラノシドを得た。
【００２４】
製造例２
超純水（ミリＱ）１００ｍｌの入った耐圧ガラス製のオートクレーブ（耐圧硝子工業株式会社製、ハイパークラスターＴＥＭ−Ｖ１００、容量２００ｍｌ）に製造例１で得た飽和カルダニルβ-D-グルコピラノシド（２．５ｍｇ）を加え、Ｎ２ガスを導入して容器中の酸素ガスと溶存酸素を除去した後、密閉した。攪拌しながら、昇温速度２℃／分で、１１５℃（分散温度）まで加熱した。この分散温度における系の加圧圧力は０．１２ＭＰａであった。この温度に溶液を２０分間保持（分散時間）、ヒーターの電源を切り自然に室温まで冷却される条件（冷却速度１．６℃／分）で室温（２５℃）に放置した。この温度で３日間保存した後、液中に綿状の浮遊物（ナノファイバー）が肉眼で観察された。
【００２５】
実施例１
製造例１で得たナノファイバー３ｍｇを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（関東化学製（18356-40)、ｐＨ７．４，０．４ｍＬ）にけん濁させ、これに、４ｍｇのUDP-α-D-galactopyranoside 2Na塩（CalBioChem社製(670111)）、０．４ｍｇのα−ラクトアルブミン（Sigma製(L5385)）、１５ｍＵのβ−1,4-galactosyltransferase（CalBioChem社製(345649)）、５ｍＭのＭｎＣｌ２（関東化学製(25009-30)）、２Ｕのアルカリフォスファターゼ（和光純薬製（016-14631)）を加え、２５℃で２４時間インキュベートした。反応混合液を６４００ｒｐｍで遠心分離し（約１０分、ミリポア、チビタン使用）、上澄液を捨て、残さに上記の緩衝液及び試薬をすべて加え、同温、同時間インキュベートした。これを合計三回繰り返した。これにより、ナノファイバー表面に存在するグルコース残基にガラクトースを導入した。
ここで、UDP-α-D-galactopyranoside 2Na塩は付加する単糖であるガラクトースの供給源であり、β−1,4-galactosyltransferaseは転移酵素であり、α−ラクトアルブミンは反応液内においてこの酵素と錯体を形成し、ガラクトースをナノファイバー表面に存在するグルコース残基に対して４位に選択的に転移させる働きをすると考えられる。
【００２６】
次に、ナノファイバー表面に存在するグルコース残基にガラクトースを導入したことを確認するために、ＡＢＥＥ糖鎖標識化キット（生化学工業製(400871)）を用いて、糖導入率を測定した。
１０μｌの８Ｍ ＴＦＡに、上記サンプル３００μｇを加え、１００℃で３時間加熱した。室温にまで冷却後、６４００ｒｐｍで遠心分離し（約１０分）、残さを１００℃で加熱乾燥させた。乾固した残さを４０μｌの２−プロパノールに溶かし、再び減圧濃縮した。その残さに、予めメタノールに溶解した蛍光標識薬４−アミノベンゾイルエチルエステルを１６．８ｍｇとなるように加え、酢酸１７０μｌ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ・ＢＨ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ３．５８ｍｇとなるように加え、８０℃で６０分反応させた。反応後、室温に放置し、それぞれ２００μｌの蒸留水とクロロホルムを加え、分液し、１０００ｒｐｍで遠心し、水溶液画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。
【００２７】
ＨＰＬＣ分析において、カラムには、Ｈｏｎｅｎｐａｋ Ｃ１８（ホーネン（株）製(800445)、７５ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）を用い、４０℃で１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で、溶出した。Ｅｘ．３０５ｎｍ，Ｅｍ．３６０ｎｍでモニターした。同時に、３０５ｎｍのＵＶでもモニターした。７％のアセトニトリルを含む０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．９）を溶離液に用いた。その結果を表１に示す。
【表１】
この結果より、このナノファイバーには、６．６％のガラクトースが新たに導入されたことがわかる。残り（９３．４％）は、もともとナノファイバー表面に存在したグルコースである。
【００２８】
次に、ナノファイバー表面に導入されたガラクトースを直接確認するため、標識したレクチンをガラクトースと結合させて、蛍光顕微鏡により観察した。
蛍光標識したレクチン（Sigma社製(L3391)、ＦＩＴＣ標識したＥｒｙｔｈｒｉｎａ由来のレクチンで、β−ガラクトース残基に対して結合能（アフィニティー）を有する蛍光標識された蛋白質）０．１ｍｇをとり、これを０．５ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）緩衝液に溶解した。次に、上記で作成した該ナノファイバーを約０．１ｍｇとり、同緩衝液で数回置換し、先の蛍光レクチン溶液を３００μｌ加えた。混合物を１８時間放置し、上記と同様にして遠心分離を行い、残さに２００μｌの同ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え、蛍光顕微鏡及び通常の光学顕微鏡で観察した（図１）。
また、グルコース残基を特異的に認識できる別のＦＩＴＣ標識レクチン（Con A、Sigma社製（C7642)）を用い、上記と同様の観察を行った（図２）。
これらから、繊維状の像が観察され、ナノファイバー表面に存在するグルコース残基にガラクトースが導入されたことが直接確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】ナノファイバー表面に存在するグルコース残基に導入されたガラクトースと、蛍光標識したレクチンとを結合させたものの蛍光顕微鏡写真（縦７５μｍ×横１００μｍ）を示す図である。
【図２】ナノファイバー表面に存在するグルコース残基に導入されたガラクトースと、ＦＩＴＣ標識したレクチンとを結合させたものの蛍光顕微鏡写真（縦７５μｍ×横１００μｍ）を示す図である。
【発明の属する技術分野】
この発明は、糖脂質が自発的に集合して形成されるナノチューブ及びナノファイバーのような微細自己集合体に、水溶液中穏和な条件にて、酵素化学的に更に糖を付加させた微細自己集合体の製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の天然植物資源から分離精製したカルダノールを出発原料として合成されたグルコース置換長鎖アルキルフェノール誘導体であるカルダニルグルコシドは、水中において加熱溶解し徐冷することで糖鎖の水素結合によりナノチューブ状凝集体を形成することが知られている（G. John, M. Masuda, Y. Okada, K. Yase, and T. Shimizu, Adv. Mat., 13, 715 (2001)）。
本発明者らは、このような自己集合体の製造方法（特願２００１−３６３７６２、特願２００２−３５０３５等）や糖鎖にオリゴ糖を用いた自己集合体（特願２００２−４９２３８）を開示している。これらにおいては、糖鎖として、グルコース、ガラクトース、マンノースなどの単糖やラクトースなどの多糖類が用いられており、これらの凝集体の表面は、均一（同一）の糖で覆われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、２種類以上の異なる種類の糖もしくは糖鎖を同時に有するナノチューブ及びナノファイバーは知られていない。
従来、固体表面上への糖鎖の導入、あるいは、既に存在する糖に、別の糖を導入する方法として、いわゆる固相合成法が知られているが（例えば、眞鍋、伊藤、高分子、４７巻、９６ページ、１９９８年）、ナノチューブ及びナノファイバーのような液晶と結晶の中間の性質を有する自己集合体に対しては、固相合成による糖鎖の導入、修飾などはおこなわれておらず、また、この固相合成法は、そのほとんどが、有機合成化学的アプローチである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上述した従来技術の実状に鑑みてなされたものであり、自己集合体の表面に存在する糖脂質を酵素化学的な穏和な条件下で第２の糖を結合させて、新規な糖鎖を表面に構築する方法を提供する。また、この方法を繰り返すことにより糖鎖を連続的に導入し、より複雑な糖鎖残基を構築することができる。
即ち、本発明は、下記一般式
【化１】
【化２】
【０００５】
この方法において、１）下記一般式
【化２】
【０００６】
また、上記方法において、１）下記一般式
【化２】
また、これらの製法において、前記反応を多段階行うことにより、糖を多段階で導入してもよい。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で処理の対象となる自己凝集体を構成する化合物は、下記一般式
【化２】
本発明においては、炭化水素基（Ｒ）は−Ｏ−Ｘ１基に対してｏ位、ｍ位又はｐ位のいずれにあってもよいが、メタ（ｍ）位にあることが好ましい。
前記一般式（化２）におけるＸ１はグリコシル基又は２〜２９の単糖が結合したオリゴ糖残基、好ましくはグリコシル基又は２〜４の単糖が結合したオリゴ糖残基２〜５、より好ましくはグリコシル基である。このようなものとしては、例えばグルコピラノース、ガラクトピラノース、マンノピラノース、アロピラノース、アルトロピラノース、グロピラノース、イドピラノース、タロピラノースのようなアルドピラノース及び対応するアルドフラノースの還元末端の水酸基から水素原子を除いた残基、ラクトース、メリビオース、セロビオース、及びガラクトシル−α（１→４）ガラクトースなど市販で入手可能な化合物、又は化学合成あるいは酵素合成で得られるオリゴ糖などが挙げられる。還元末端のアノマー位のグリコシド結合はα−アノマー及びβ−アノマー及びそれらの混合物のいずれであってもよい。
【０００８】
一方、前記一般式（化１又は２）におけるＲは、炭素数が６〜２５、好ましくは１４〜１６、より好ましくは１５の炭化水素基であり、好ましくは飽和又は二重結合を１〜５、好ましくは１〜３含む不飽和の脂肪族炭化水素から成る脂肪族炭化水素である。この炭化水素は好ましくは直鎖である。このような炭化水素基としては、例えば、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基や、これらに不飽和結合としてモノエン、ジエン、トリエンなどを含むものが挙げられるが、原料の入手が容易であるという点で、８−ペンタデセニル基、８，１０−ペンタデカジエニル基、８，１０、１２−ペンタデカトリエニル基が好ましい。
【０００９】
前記一般式（化２）で表わされるＯ−グリコシド型糖脂質は例えば次に示す方法により製造することができる。
水酸基がすべてアセチル基で保護されたオリゴ糖を一般式
【化３】
アセチル化の手順として下記に一例を示す。オリゴ糖をドライピリジンに溶解させ、無水酢酸を加え、室温〜40℃で１時間〜1晩磁気撹拌する。この際、ジメチルアミノピリジンを反応系に加えておくと反応が速く進行する。トルエンとエタノール の混合溶媒で５〜７回共沸させピリジンを除き、残渣をクロロホルムに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で数回洗う。濃縮しシリカゲルカラムで精製し、濃縮して乾燥させる。
【００１０】
本発明においては微細自己集合体の製法に特に制限はないが、上記Ｏ−グリコシド型糖脂質を水に分散後、マントルヒーターを用いて加熱、約20分沸騰し、室温まで自然冷却、微細自己集合体が出来るまで室温に放置することにより得ることができる（特願２０００−２７１１９２、特願２００１−３６３７６２等）。
【００１１】
次に、本発明の微細自己集合体の合成法の一例について説明する。
まず、上記のようにして微細自己集合体（基質）を形成させ、この基質をＨＥＰＥＳ緩衝液やリン酸緩衝液中で、糖転移酵素又は糖加水分解酵素、好ましくはの糖転移酵素存在下、単糖残基を含むドナーを基質に対して過剰量（例えば、基質に対して等重量〜１００倍重量）用いて、室温〜５０℃、好ましくは３５℃近辺で、１分〜３０日間、緩やかに浸透又は放置して反応させる。
このＨＥＰＥＳ緩衝液やリン酸緩衝液の濃度は、好ましくは０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭであり、ｐＨは、好ましくは４〜８、より好ましくは６．５〜７．８である。
酵素の量は、基質に対して触媒量もしくは、過剰量（例えば、１００倍）であり、これをユニットで表すと、１ｍＵ〜１０００００００Ｕ、好ましくは１０ｍＵ〜１Ｕである。
【００１２】
この反応は用いる酵素により異なる。それぞれの場合に分けて説明する。
（１）糖転移酵素を用いる場合：
水中で、１）上記基質、２）単糖と核酸の複合体、及び３）糖転移酵素を反応させる。
核酸としてはＵＤＰやＣＭＰなど用いる酵素の反応性を考慮して選択する。複合体はこの核酸のリン酸部位と単糖の主に１位の水酸基とが結合した複合体であり、リン酸部とナトリウムなどのアルカリ金属とが結合したものでもよい。また必要に応じて、触媒量（例えば、ＵＤＰ−糖に対して１〜１０重量％）のＭｎ２＋（例えば、ＭｎＣｌ２）を添加してもよい。このような複合体としては、例えば、ＵＤＰ−糖 (例えば、uridine 5’-diphosphogalactose)、ＣＭＰ−糖(例えば、cytidine 5’-monophospho-N-acetylneuraminic acid)などが挙げられる。
糖移転酵素としては、例えば、ガラクトース転移酵素(国際生化学連合(IUB)酵素委員会報告による番号：EC. 2.4.1.22)、シアル酸転移酵素(EC. 2.4.99.1)、フコース転移酵素(EC. 2.4.1.69)などが挙げられる。
【００１３】
糖転移酵素を使用するときには、反応の経過にともない生成するジリン酸誘導体を分解するためのアルカリフォスファターゼのような酵素（その量は、１ｍＵ〜１００００Ｕ、好ましくは１０ｍＵ〜１０Ｕである。）が必要となる場合がある。さらに、対象とする基質の糖脂質（例えば、グルコース）に第２の糖を導入する場合には、ラクトアルブミンやアルブミンのような共存蛋白質（通常は、糖転移酵素に対して等モル以上。）が必要となる場合がある。
この蛋白質は、任意成分であるが、反応液内において酵素と錯体を形成し、糖供給源を微細自己集合体表面に存在する糖残基に転移させる働きをすると考えられ、この蛋白質がないと、転移の効率が大幅に減少する場合がある（Schanbacher, F. and Ebner, k. E., J. Biol. Chem., vol.245, pp5057 (1970), Brew, K., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.59, pp491 (1968), Fitzgerald, D.K., et al., J. Biol. Chem., vol.245, pp2103 (1970), Narimatsu, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.83, pp4720 (1986)）。
【００１４】
（２）糖加水分解酵素を用いる場合：
水中で、１）上記基質、２）置換されていてもよいアリール基と単糖残基との結合体、及び３）糖分解酵素を水中で反応させる。
アリール基は糖残基と結合することにより糖残基を活性化させ、糖加水分解酵素の攻撃を受けやすくするものと考えられ、好ましくはフェニル基である。この機能を強化するためにこのアリール基は例えばニトロ基のような置換基を有していてもよい。
このような結合体として、例えば、4-nitrophenyl 糖 (例えば、4-nitrophenyl β-D-galactopyranoside)、2-nitrophenyl 糖 (例えば、2-nitrophenyl β-D-galactopyranoside)、umbelliferyl 糖 (例えば、umbelliferyl β-D-galactopyranoside)のように、糖のアグリコン部分に芳香族を導入した活性化された糖が挙げられるが、フリーの糖そのもの、又は、糖−別の糖(例えば、ラクトースなど)を用いても反応を行うこともできる。
このような結合体又は糖は糖加水分解酵素により分解され、分解された糖残基は基質（先の微細自己集合体）の糖に結合する。
糖加水分解酵素としては、例えば、アルファガラクトシダーゼ(EC. 3.2.1.22)、ベータガラクトシダーゼ(EC. 3.2.1.23)、シアリダーゼ(EC. 3.2.1.18)、アルファグルコシダーゼ(EC. 3.2.1.20)、ベータグルコシダーゼ(EC. 3.2.1.21)などが挙げられる。
【００１５】
このような酵素反応の好ましい反応時間は、２４時間〜２４０時間である。酵素及びドナーは、数回にわたり分割して加えてもよい。
また、反応が進行するに伴い、ｐＨが減少（酸性サイドに傾く）するため、０．１Ｎ ＫＯＨやＮａＯＨのような塩基性水溶液で中和をすることが望ましい。ｐＨは、７．８を越えないようにするのが好ましい。
反応後の生成物の精製には、５００−２００００ｒｐｍで１分〜１時間、遠心分離する。未反応試薬を除くため、同一の緩衝液又は、蒸留水などで数回洗浄をおこなう。
このようにして、第２の糖が導入したナノチューブ及びナノファイバーに対して、上記の方法を繰り返し行うことにより、既に存在する第２の糖に対して第３の糖を導入できる。これを繰り返して、ｎ個の糖を順次導入し、糖鎖表面修飾ナノチューブ及びナノファイバーを構築できる。
【００１６】
糖鎖導入率を調べるためには、酵素反応終了後、いったん、ナノチューブ及びナノファイバーを０．１−１．０Ｍトリフルオロ酢酸のような強酸で、各糖及びアグリコン部分のアルコールとに完全加水分解を行い（８０〜１００℃、１０分〜５時間）、ここで、脂溶性のアグリコン由来の長鎖芳香族アルコールを除去し、水溶性の各構成糖を４−アミノ安息香酸エチルエステルのような蛍光発色団又は紫外可視発色団を酢酸−ＢＨ３・ピリジン錯体中、５０−１００℃で１０分−３時間反応させ、蛍光標識した各糖誘導体へと変換する。つぎに、例えば、０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．９）／アセトニトリル（９３／７，ｖ／ｖ）、又は、０．０２％ＴＦＡ／アセトニトリル（１：１，ｖ／ｖ）などを溶離液に用い、逆相カラム（Ｃ−１８など）で室温〜４０℃にてＨＰＬＣ分析を行うと、ガラクトース、マンノース、グルコースなどが溶出され、それらのピーク面積より、各構成糖の割合を求めることができる。蛍光によるモニターは、Ｅｘ．３０５ｎｍ，Ｅｍ．３６０ｎｍで、ＵＶによるモニターは、３０５ｎｍが好ましい。通常、第２の糖の導入率は、１〜３０％程度である。また、ＨＰＬＣ分析においては、スタンダードとなる糖を上記と同様の方法により、サンプルと同時に誘導体へと変換し、検量線を作成することが好ましい。
【００１７】
上記のＨＰＬＣ分析の他、ナノチューブ及びナノファイバーに対して、新たに導入した糖を分析する方法として、蛍光標識したレクチンを利用することもできる。使用するレクチンには、導入した糖に対応して認識する標準レクチンが市販されている。例えば、グルコースに対しては、例えば、concanavalin A由来（以下、Ｃｏｎ Ａという。）の、ガラクトースに対しては、Erythrina由来(以下、ECAという。)のレクチンがそれぞれ対応する。また、蛍光発色団には、ＦＩＴＣ標識、ＴＲＩＴＣ標識、ｔｅｘａｓ ｒｅｄなどがあげられ、いずれもレクチンに結合したものが市販されている。
【００１８】
上記蛍光標識したレクチンを用いた、糖残基の確認は、次のようにしておこなう。上記記載の糖脂質の自己集合化により形成されるナノチューブ及びナノファイバー（基質）をＨＥＰＥＳ緩衝液やリン酸緩衝液（いずれも、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、通常は、１０ｍＭ〜１００ｍＭが好ましい。また、ｐＨは、４〜８であるが、ｐＨ６．５〜７．８が好ましい）中、市販の蛍光標識レクチンを予想される糖残基に対して、等モル〜１００倍等量となるよう加える。通常は、数種類のモル等量の異なるレクチンを用意しておき、最適なものを選択する。レクチンにＣｏｎ Ａを使用するときには、この他に、マンガンイオン（通常は、１ｍＭ〜１００ｍＭ）が必要である。３０分〜２日間、０℃〜４０℃で、ゆっくりと浸透させるか、放置して反応させる。通常は、２０時間、室温下で放置する。
反応終了後の「後処理」は、前記記載の方法と同様である。また、該ファイバー及びチューブの蛍光標識観察には、蛍光顕微鏡下でおこなう。
【００１９】
また、対照実験として、糖に対して結合能を持たないレクチンを用いて、結合しないことの確認も必要である。さらに、必要であれば、阻害実験もおこなう。つまり、ナノチューブ及びナノファイバーの表面に存在する糖と同一の糖を、等モル〜１００倍過剰に加えておき、これに、蛍光標識レクチンを加え、該ファイバー及びチューブが標識されないことを確認することが好ましい。
必要に応じて、金コロイド微粒子などのレクチンを用いて、電子顕微鏡下（ＴＥＭ，ＳＥＭなど）で、直接、糖残基の存在を確認することもできる。実験の手順は、上記と同様である。また、上記に記載の対照実験や阻害実験も必要に応じておこなうことが好ましい。
【００２０】
【発明の効果】
本発明のような微細自己集合体の構造は、４６℃以上の温度及び有機溶媒の存在下では安定ではなく、４６℃以下の温度で、水の中でのみ安定に存在し得うる[cf. G. John, M. Masuda, Y. Okada, K. Yase, T. Shimizu, Advanced Materials, vol.13, pp715 (2001)]。このことは、仮に、該ナノチューブを修飾しようとするのであれば（例えば、該ナノチューブ表面に、別の糖鎖を導入しようとするのであれば）、有機合成化学的に種々の試薬を用い、有機溶媒中で糖を導入するか、もしくは、該ナノチューブが安定に存在し得る水溶液中にて、酵素を用いてマイルドに糖を導入するかのいずれかとなる。前者の場合、上記の理由により操作は困難である。本発明の方法によれば、自己集合時の水中もしくは、イオン強度の抑えられた緩衝液中で、有機溶媒を何ら使用することなく、生体反応に類似するほど穏和な条件で、酵素化学的に新規な糖もしくは糖鎖を導入することができる。
【００２１】
また、本発明の方法によれば、一旦ナノファイバーのような微細自己集合体を形成させて、その糖鎖に更に所望の糖鎖を結合させることができる。例えば、ＮｅｕＡｃアルファ２−３（又は６）Ｇａｌベータ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Y. Suzuki et al., J. Biol.Chem., vol.261,pp17057-17061.）のようなインフルエンザウイルスと結合できる天然のリガンド糖鎖をα２→６結合で結合させることができれば、インフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスを、捕捉・中和できる。更に、Ｏ−１５７又はそれの生産するベロ毒素と結合するＧａｌアルファ１−４Ｇａｌの構造を有する糖鎖（K. Karlsson et al., J. Biol. Chem., vol.260, pp8545 (1985).）をα１→４結合で導入できれば、病原性大腸菌O-157そのもの、もしくは、それの生産するベロ毒素を効果的に結合できる。このように、導入する糖鎖として、意義のある配列を有する糖鎖（これをリガンド糖鎖という）を導入できれば、特定の有害ウイルス、病原性細菌、毒素などを特異的に結合できるナノチューブ及びナノファイバーを提供することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
製造例１
カシューナッツオイルを約４００Ｐａで２回真空蒸留し、２２０℃から２３５℃の沸点をもつ成分を集めてカルダノールを得た。そのカルダノール１．５２ｇ（５ミリモル）を無水塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解させ、２ｇのモレキュラーシーブ４Ａの存在下、β−Ｄ−グルコースペンタアセテート３．９ｇ（５ミリモル）と三フッ化ホウ素ジエチルエーテル０．６２ｍｌ（５ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温で２４時間かきまぜたのち、５％−炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ込んだ。有機相を分別し、炭酸水素ナトリウム水溶液、続いて水で洗浄したのち、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。有機溶媒を減圧下で完全に留去し、得られた粗生成物をエタノールから再結晶させた。得られた生成固体をヘキサン／酢酸エチル（容積比７／３）混合溶媒を溶出液としてカラムクロマトグラフイーを行い、白色固体の１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドテトラアセテート）カルダノール２．３６ｇ（収率７５％）を得た。
この生成物の物理的性質は次のとおりである。
次に、４５質量％のトリメチルアミン水溶液を４倍体積のメチルアルコールと混合させ、得られた１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドテトラアセテート）カルダノール（１．２６ｇ、２ミリモル）と２４時間反応させた。溶媒を減圧下、留去したのち、得られたシロップ状残査をメチルアルコール／アセトニトリル（体積比１／２）混合溶媒から結晶化させ、さらに同一溶媒から再結晶することにより、目的とする脱アセチル化した１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）カルダノール（「カルダニルグルコシド」という。）をほぼ定量的に白色固体０．８８ｇ（収率９５％）として得た。
この生成物の物理的性質は次のとおりである。
【００２４】
製造例２
超純水（ミリＱ）１００ｍｌの入った耐圧ガラス製のオートクレーブ（耐圧硝子工業株式会社製、ハイパークラスターＴＥＭ−Ｖ１００、容量２００ｍｌ）に製造例１で得た飽和カルダニルβ-D-グルコピラノシド（２．５ｍｇ）を加え、Ｎ２ガスを導入して容器中の酸素ガスと溶存酸素を除去した後、密閉した。攪拌しながら、昇温速度２℃／分で、１１５℃（分散温度）まで加熱した。この分散温度における系の加圧圧力は０．１２ＭＰａであった。この温度に溶液を２０分間保持（分散時間）、ヒーターの電源を切り自然に室温まで冷却される条件（冷却速度１．６℃／分）で室温（２５℃）に放置した。この温度で３日間保存した後、液中に綿状の浮遊物（ナノファイバー）が肉眼で観察された。
【００２５】
実施例１
製造例１で得たナノファイバー３ｍｇを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（関東化学製（18356-40)、ｐＨ７．４，０．４ｍＬ）にけん濁させ、これに、４ｍｇのUDP-α-D-galactopyranoside 2Na塩（CalBioChem社製(670111)）、０．４ｍｇのα−ラクトアルブミン（Sigma製(L5385)）、１５ｍＵのβ−1,4-galactosyltransferase（CalBioChem社製(345649)）、５ｍＭのＭｎＣｌ２（関東化学製(25009-30)）、２Ｕのアルカリフォスファターゼ（和光純薬製（016-14631)）を加え、２５℃で２４時間インキュベートした。反応混合液を６４００ｒｐｍで遠心分離し（約１０分、ミリポア、チビタン使用）、上澄液を捨て、残さに上記の緩衝液及び試薬をすべて加え、同温、同時間インキュベートした。これを合計三回繰り返した。これにより、ナノファイバー表面に存在するグルコース残基にガラクトースを導入した。
ここで、UDP-α-D-galactopyranoside 2Na塩は付加する単糖であるガラクトースの供給源であり、β−1,4-galactosyltransferaseは転移酵素であり、α−ラクトアルブミンは反応液内においてこの酵素と錯体を形成し、ガラクトースをナノファイバー表面に存在するグルコース残基に対して４位に選択的に転移させる働きをすると考えられる。
【００２６】
次に、ナノファイバー表面に存在するグルコース残基にガラクトースを導入したことを確認するために、ＡＢＥＥ糖鎖標識化キット（生化学工業製(400871)）を用いて、糖導入率を測定した。
１０μｌの８Ｍ ＴＦＡに、上記サンプル３００μｇを加え、１００℃で３時間加熱した。室温にまで冷却後、６４００ｒｐｍで遠心分離し（約１０分）、残さを１００℃で加熱乾燥させた。乾固した残さを４０μｌの２−プロパノールに溶かし、再び減圧濃縮した。その残さに、予めメタノールに溶解した蛍光標識薬４−アミノベンゾイルエチルエステルを１６．８ｍｇとなるように加え、酢酸１７０μｌ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ・ＢＨ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ３．５８ｍｇとなるように加え、８０℃で６０分反応させた。反応後、室温に放置し、それぞれ２００μｌの蒸留水とクロロホルムを加え、分液し、１０００ｒｐｍで遠心し、水溶液画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。
【００２７】
ＨＰＬＣ分析において、カラムには、Ｈｏｎｅｎｐａｋ Ｃ１８（ホーネン（株）製(800445)、７５ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）を用い、４０℃で１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で、溶出した。Ｅｘ．３０５ｎｍ，Ｅｍ．３６０ｎｍでモニターした。同時に、３０５ｎｍのＵＶでもモニターした。７％のアセトニトリルを含む０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．９）を溶離液に用いた。その結果を表１に示す。
【表１】
【００２８】
次に、ナノファイバー表面に導入されたガラクトースを直接確認するため、標識したレクチンをガラクトースと結合させて、蛍光顕微鏡により観察した。
蛍光標識したレクチン（Sigma社製(L3391)、ＦＩＴＣ標識したＥｒｙｔｈｒｉｎａ由来のレクチンで、β−ガラクトース残基に対して結合能（アフィニティー）を有する蛍光標識された蛋白質）０．１ｍｇをとり、これを０．５ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）緩衝液に溶解した。次に、上記で作成した該ナノファイバーを約０．１ｍｇとり、同緩衝液で数回置換し、先の蛍光レクチン溶液を３００μｌ加えた。混合物を１８時間放置し、上記と同様にして遠心分離を行い、残さに２００μｌの同ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え、蛍光顕微鏡及び通常の光学顕微鏡で観察した（図１）。
また、グルコース残基を特異的に認識できる別のＦＩＴＣ標識レクチン（Con A、Sigma社製（C7642)）を用い、上記と同様の観察を行った（図２）。
これらから、繊維状の像が観察され、ナノファイバー表面に存在するグルコース残基にガラクトースが導入されたことが直接確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】ナノファイバー表面に存在するグルコース残基に導入されたガラクトースと、蛍光標識したレクチンとを結合させたものの蛍光顕微鏡写真（縦７５μｍ×横１００μｍ）を示す図である。
【図２】ナノファイバー表面に存在するグルコース残基に導入されたガラクトースと、ＦＩＴＣ標識したレクチンとを結合させたものの蛍光顕微鏡写真（縦７５μｍ×横１００μｍ）を示す図である。
Claims (4)
- 下記一般式
- １）下記一般式
- 前記糖転移酵素がガラクトース転移酵素、シアル酸転移酵素、又はフコース転移酵素である請求項２に記載の製法。
- 反応系に、ラクトアルブミン又はアルブミンを共存させる請求項２又は３に記載の製法。
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