JP3756180B2 - 真菌類におけるリボフラビン生合成 - Google Patents
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Description
真菌類、例えばエレモテシウム・アシュビイイ(Eremothecium ashbyii)またはアシュビア・ゴシッピイ(Ashbya gossypii)の発酵によるリボフラビンの製造は、開示された(The Merck Index,Windholz他、Merck & Co.編、第1183頁(1983))。
欧州特許第405370号明細書には、枯草菌Bacillus subtilisからのリボフラビン生合成遺伝子の形質転換によって得られた、リボフラビンを過剰生産する菌株が記載されている。
細菌類と真核生物におけるリボフラビン生合成の遺伝学は、異なるものであるので、枯草菌からの上記遺伝子は、アシュビア・ゴシッピイのような真核生産体の生物体を使用することによりリボフラビンを製造するための組換え方法には不適当である。
酵母菌のサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のリボフラビン生合成遺伝子のクローン化は、1992年11月19日付けでドイツ特許庁に出願された1つの特許明細書中に記載された。
しかし、常用のハイブリッド化法によってサッカロミセス・セレビシアエrib遺伝子を使用することによりアシュビア・ゴシッピイリボフラビン生合成遺伝子をクローン化することは、不可能であり;明らかにサッカロミセス・セレビシアエとアシュビア・ゴシッピイからのrib遺伝子の相同性は、ハイブリッド化に十分である程大きくはなかった。
本発明の目的は、こうして真核生産体の生物体中でリボフラビンを製造するための組換え方法を得るために、真核生物からリボフラビン生合成遺伝子を単離することである。
この目的は、GTPから出発するリボフラビン生合成の酵素をコード化する子嚢菌類のアシュビア・ゴシッピイ中に見い出される6個の遺伝子(rib遺伝子)の単離によって達成されることが見い出された。
本発明は、次のDNA配列に関する:
SEQ ID No:2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、1個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたSEQ ID No:2で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するDNA配列。
SEQ ID No:4で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、1個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたSEQ ID No:4で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するDNA配列。
SEQ ID No:6で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、1個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたSEQ ID No:6で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するDNA配列。
SEQ ID No:8で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、1個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたSEQ ID No:8で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するDNA配列。
SEQ ID No:10で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、1個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたSEQ ID No:10で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するDNA配列。
SEQ ID No:12で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、1個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたSEQ ID No:12で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するDNA配列。
遺伝子およびその遺伝子生産物(ポリペプチド)は、一次構造が列記されている配列で示されかつ以下のように指定されている:
SEQ ID No: 1:rib 1 遺伝子
SEQ ID No: 2:rib 1 遺伝子生産物(GTPシクロヒドロラーゼII)
SEQ ID No: 3:rib 2 遺伝子
SEQ ID No: 4:rib 2 遺伝子生産物(DRAPデアミナーゼ)
SEQ ID No: 5:rib 3 遺伝子
SEQ ID No: 6:rib 3 遺伝子生産物(DBPシンターゼ)
SEQ ID No: 7:rib 4 遺伝子
SEQ ID No: 8:rib 4 遺伝子生産物(DMRLシンターゼ)
SEQ ID No: 9:rib 5 遺伝子
SEQ ID No:10:rib 5 遺伝子生産物(リボフラビンシンターゼ)
SEQ ID No:11:rib 7 遺伝子
SEQ ID No:12:rib 7 遺伝子生産物(HTPレダクターゼ)
グアノシン三リン酸(GTP)は、GTPシクロヒドロラーゼII(rib1遺伝子生産物)によって2,5−ジアミノ−6−リボシルアミノ−4(3H)−ピリミジノン5−リン酸に変換される。その後に、この化合物は、rib7遺伝子生産物によって2,5−ジアミノ−6−リビチルアミノ−2(3H)−ピリミジノン5−リン酸に還元され、次いでrib2遺伝子生産物によって5−アミノ−6−リビチルアミノ−2,4(1H,3H)−ピリミジンジオンに脱アミノされる。その後に、rib4遺伝子生産物によって触媒される1つの反応において、C4化合物DBPは、添加され、その結果6,7−ジメチル−8−リビチルルマジン(DMRL)が生じ、このDMRLからrib5遺伝子生産物によって触媒される反応においてリボフラビンが製造される。C4化合物DBP(L−3,4−ジヒドロキシ−2−ブタノン4−リン酸)は、rib3遺伝子生産物によって触媒される反応においてD−リブロース5−リン酸から形成される。
SEQ ID No:1、3、5、7、9、11に記載されたDNA配列は、SEQ ID No:2、4、6、8、10、12に記載されたポリペプチドをコード化する。
また、配列表に記載されたものは別として、適当なDNA配列は、遺伝子コードの縮重の結果として、1つの異なるDNA配列を有しているがしかし同じポリペプチドをコード化するものである。
また、本発明は、遺伝子生成物がなお本質的に配列表に記載された遺伝子生成物と同じ生物学的性質を有している限り配列表に詳説されたもの以外の一次構造を有する1つの遺伝子生成物(ポリペプチド)をコード化するようなDNA配列に関する。生物学的性質とは、殊にリボフラビンの生合成を引き起こす酵素活性を意味する。
本質的に同じ生物学的性質を有するこのように修飾された遺伝子生成物は、1つまたはそれ以上のアミノ酸またはペプチドの欠失または付加によって得ることができるかまたは他のアミノ酸によるアミノ酸の代替によって得ることができるか、或いはアシュビア・ゴシッピイ以外の有機体から単離されることができる。
修飾された遺伝子生成物をコード化するDNA配列は、概して配列表に示されたDNA配列をもって80%またはそれ以上の程度の相同性を有している。このようなDNA配列は、例えば常用のハイブリッド化法またはアシュビア・ゴシッピイ以外の真核生物からのPCR技術を用いてSEQ ID No:1、3、5、7、9、11に記載されたDNA配列から出発して単離されることができる。これらのDNA配列は、SEQ ID No:1、3、5、7、9、11に記載されたDNA配列で標準条件下にハイブリッド化する。
標準条件とは、例えば0.1〜1×SSC(1×SSC:NaCl 0.15モル、クエン酸ナトリウム15ミリモル、pH7.2)の濃度を有する緩衝水溶液中の42〜58℃の温度を意味する。DNAハイブリッド化のための実験条件は、遺伝子工学の教科書、例えばサムブルック(Sambrook)他著、“モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)”,Cold Spring Harbor Laboratory,1989に記載されている。
また、本発明は、適当なポリペプチドをコード化するDNA配列の5′方向の上流に位置している制御配列、殊にプロモーター配列にも関する。この制御配列は、配列表に記載されかつ以下に詳説されている。
rib1遺伝子のための制御配列:
SEQ ID No:1 ヌクレオチド1〜242
rib2遺伝子のための制御配列:
SEQ ID No:3 ヌクレオチド1〜450
rib3遺伝子のための制御配列:
SEQ ID No:5 ヌクレオチド1〜314
rib4遺伝子のための制御配列:
SEQ ID No:7 ヌクレオチド1〜270
rib5遺伝子のための制御配列:
SEQ ID No:9 ヌクレオチド1〜524
rib7遺伝子のための制御配列:
SEQ ID No:11 ヌクレオチド1〜352
制御配列は、機能の点で無視してよい減少を伴って5′および/または3′の方向で端が切り取られていてもよい。
制御作用について本質的なものは、概して上記の配列範囲からの30〜100、有利に40〜70のヌクレオチドの断片である。
また、この制御配列は、天然の配列を比較して直接的な突然変異誘発によって機能の点で最適化されることもできる。
本発明による制御配列は、アシュビア・ゴシッピイ中の遺伝子、殊にリボフラビン生合成を確実なものにする遺伝子の過剰表現に適している。
また、本発明は、本発明によるDNA配列1個またはそれ以上を含有する表現ベクターに関する。このような表現ベクターは、本発明によるDNA配列に適当な機能的制御信号を供給することによって得られる。このような制御信号は、表現を確実なものにするDNA配列、例えばプロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位であり、かつ宿主有機体によって認められかつ宿主有機体に従うものである。
また、例えば宿主有機体中の組換えDNAの複製または組換えを制御する他の制御信号を表現ベクターに充当することも可能である。
本発明は、同様に本発明によるDNA配列または表現ベクターで形質転換された宿主有機体にも関する。真性有機体は、有利に宿主有機体、特に好ましくはサッカロミセス(Saccharomyces)属、カンディダ(Candida)属、ピキア(Pichia)属、エレモテシウム(Eremothecium)属またはアシュビア(Ashbya)属のものが宿主有機体として使用される。特に好ましい種は、サッカロミセス・セレビシアエ、カンディダ・フラベリ(Candida flaveri)、カンディダ・ファマタ(Candida famata)、エレモテシウム・アシュビイイ(Eremothecium ashbyii)およびアシュビア・ゴシッピイである。
また、本発明は、リボフラビンを製造するための組換え方法を包含し、この場合には、本発明による形質転換された宿主有機体を常法で発酵によって培養し、発酵の間に生産されたリボフラビンを発酵媒体から単離し、必要に応じて精製する。
rib遺伝子および遺伝子生成物は、実施例中および配列表中に記載されたように単離されかつ特性決定されることができる。
例1
アシュビア・ゴシッピイのリボフラビン生合成遺伝子の単離(rib遺伝子)
a.アシュビア・ゴシッピイcDNAバンクの構成
YEPD媒体上での培養後の後期対数増殖期でリボフラビンを過剰生産する菌株のアシュビア・ゴシッピイATCC10195のミセリウム(mycelium)からRNAを完全に抽出した(Sherman他、“Methods in yeast genetics”,Cold Spring Harbor,New York,1989)。
オリゴ(dT)セルロース上での吸着およびオリゴ(dT)セルロースからの溶出によってポリ(A)+RNAを2回精製した(AvivおよびLeder,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69,1972,1408〜1412)。cDNAをグブラー(Gubler)およびホフマン(Hoffmann)の一般的な方法(Gene 25,1983,263)によって単離し、合成EcoRIアダプターを平滑断端を有するcDNA分子の端部に添加した。その後に、EcoRIでの切断後のcDNA断片をT4ポリヌクレオチドキナーゼを使用することによりリン酸化し、EcoRIで切断された脱リン酸化ベクターpYEura3にクローン化した。pYEura3(Clonetech Laboratories,Inc.,California)は、ガラクトース誘発性GAL1およびGAL10プロモーターならびにURA、CEN4およびARS1を含有する1つの酵母表現ベクターである。この酵母要素は、酵母細胞中でクローン化されたDNA断片の形質転換および表現を可能にする。
連結反応からのアリコートを高度に受容能のある(Hanahan,DNA Cloning,D.M. Glover編;IRL Press,Oxford 1985,109)大腸菌XL1−ブルー(Bullock他、Biotechniques 5(1987)376〜378)を形質転換するために使用し、形質転換体をアンピシリン耐性に基づいて選択した。
アンピシリン耐性細胞約3×105を合わせ、かつ増幅させ、プラスミドDNAを該細胞から単離した(BirnboimおよびDoly,Nucleic Acids Res.7,1979,1513)。
b.リボフラビン生産酵素をコード化するアシュビア・ゴシッピイcDNAクローンの単離
リボフラビン生産酵素をコード化するアシュビア・ゴシッピイからのcDNAクローンをリボフラビン生合成に包含されるサッカロミセス・セレビシアエ突然変異体の機能的相補によって単離した。
菌株AJ88(Mata leu2 his3 rib::URA3 ura3-52)、AJ115(Matalpha leu2 inos1 rib2::URA3 ura3-52)、AJ71(Matalpha leu2 inos1 rib3::URA3 ura3-52)、AJ106(Matalpha leu2 inos1 rib4::URA3 ura3-52)、AJ66(Mata canR inos1 rib5::URA3 ura3-52)、およびAJ121(Matalpha leu2 inos1 rib7::URA3 ura3-52)は、サッカロミセス・セレビシアエにおけるリボフラビン生合成に包含される6個の遺伝子(rib1〜rib5およびrib7)の中の1個を破壊することによって生産された突然変異菌株である。
これらの菌株をそれぞれアシュビア・ゴシッピイcDNAバンクからのcDNA25μgで形質転換し、かつリボフラビンなしにガラクトース含有媒体上に置いた。約1週間の増殖後、rib+形質転換体を培養皿から分離した。
それぞれ形質転換された突然変異体(Rib1+,Rib2+,Rib3+,Rib4+,Rib5+およびRib7+)からの1つの突然変異体をそのつど分析し、全ての場合にRib+表現型はガラクトース媒体中でのみ表現され、グルコース媒体中では表現されないことを見い出した。
この結果は、Rib+表現型がプラスミド上に位置したガラクトース誘発性GAL10プロモーターの制御下に表現されることを証明している。
プラスミドDNAを大腸菌の形質転換によるRib1+、Rib2+、Rib3+、Rib4+、Rib5+およびRib7+の突然変異体から単離し、かつpJR715、pJR669、pJR788、pJR733、pJR681およびpJR827と呼称した。
前記プラスミド中に存在するcDNA挿入断片の部分配列により、このcDNA挿入断片がサッカロミセスからのrib遺伝子生産物のタンパク質に類似しているタンパク質をコード化することが確認された。
c.リボフラビン生産酵素をコード化するアシュビア・ゴシッピイのゲノムクローンの単離。
アシュビア・ゴシッピイのリボフラビン生産遺伝子のゲノムコピーを単離するために、アシュビア・ゴシッピイATCC 10195のゲノムバンクをコスミド超Cos1(Stratagene Cloning Systems,California)中で構成させ、かつアシュビア・ゴシッピイのrib1、rib2、rib3、rib4、rib5およびrib7の遺伝子のcDNAコピーから誘導された32P標識化された試料を用いてスクリーニングした。
rib1、rib2、rib3、rib4、rib5およびrib7のDNAを有するコスミドクローンをコロニーハイブリッド化によって単離した(GrusteinおよびHogness,Proc.Natl.Acad.USA 72,1975,3961〜3965)。更に同じrib特異性cDNA試料を使用することにより酵素的に切断されたコスミドDNAのサザン分析により、アシュビア・ゴシッピイのrib1、rib2、rib3、rib4、rib5およびrib7の遺伝子を含有する定義された制限断片を同定することができた。
3.1kbの長さでありかつGTPシクロヒドラーゼIIをコード化するアシュビア・ゴシッピイの完全rib1遺伝子を含有するBanHI−ClaI DNA断片を見い出した。この断片をアガロースゲルから単離し、BamHIおよびClaIで切断されたpブルースクリプトKS(+)ファージミド(phagemid)にクローン化し、こうしてプラスミドpJR765を得た(図2)。
1329bpの長さでありかつ5′−非コード化領域の906bp、242bpおよび3′−非コード化領域の181bpのrib1開放読み枠を含有するDNA配列(SEQ ID No:1)を得た。
DRAPデアミナーゼをコード化する完全アシュビア・ゴシッピイrib2遺伝子を、3.0kbの長さでありかつpブルースクリプトKS(+)にクローン化されプラスミドpJR758を生じるEcoRI−PstI断片上に見い出した(図3)。
rib2の開放読み枠1830bp、5′−未翻訳領域450bpおよび3′−未翻訳領域347bpを有するEcoRI−PstI挿入断片からの長さ2627bpの領域を配列した(SEQ ID No:3)。
DBPシンターゼをコード化する完全アシュビア・ゴシッピイrib3遺伝子を、1.5kbの長さでありかつpブルースクリプトKS(+)にクローン化されプラスミドpJR790を生じるPstI−HindIII断片上に見い出した(図4)。
rib3の開放読み枠639bp、5′−未翻訳領域314bpおよび3′−未翻訳領域129bpを有するPstI−HindIII挿入断片からの長さ1082bpの領域を配列した(SEQ ID No:5)。
DMRLシンターゼをコード化するアシュビア・ゴシッピイrib4遺伝子を、3.2kbの長さでありかつpブルースクリプトKS(+)にクローン化されプラスミドpJR762を生じるPstI−PstI断片上に見い出した(図5)。
rib4の開放読み枠519bp、5′−未翻訳領域270bpおよび3′−未翻訳領域207bpを有するPstI−PstI挿入断片からの長さ996bpの領域を配列した(SEQ ID No:7)。
リボフラビンシンターゼをコード化する完全アシュビア・ゴシッピイrib5遺伝子を、2.5kbの長さでありかつpブルースクリプトKS(+)にクローン化されプラスミドpJR790を生じるPstI−PstI断片上に見い出した(図6)。
rib5の開放読み枠708bp、5′−未翻訳領域524bpおよび3′−未翻訳領域279bpを有するPstI−PstI挿入断片からの長さ1511bpの領域を配列した(SEQ ID No:9)。
最後に、DRAPレダクターゼをコード化するアシュビア・ゴシッピイrib7遺伝子を、4.1kbの長さでありかつpブルースクリプトKS(+)にクローン化されプラスミドpJR845を生じるEcoRI−EcoRI断片上に見い出した(図7)。
rib7の開放読み枠741bp、5′−未翻訳領域352bpおよび3′−未翻訳領域503bpを有するEcoRI−EcoRI挿入断片からの長さ1596bpの領域を配列した(SEQ ID No:11)。
例2
アシュビア・ゴシッピイrib遺伝子のmRNA分析
rib特異性転写物を同定するためにノーザン分析を実施した。全RNAを例1の記載と同様にアシュビア・ゴシッピイ菌株ATCC 10195から単離した。菌株からのRNA試料(5μg)をアガロースホルムアルデヒドゲル0.8%上での電気泳動法によってRNAサイズマーカーと一緒に分別し、かつ真空中でナイロン膜上でブロットした(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,1980,5201〜5205)。
ナイロン膜を42℃で5×SSC中でホルムアミド50%の存在下に32P−標識化されたrib特異性DNA試料を用いて別個にハイブリッド化した。アシュビア・ゴシッピイrib1遺伝子をヌクレオチド約1150個の独特のメッセージとして表現し、これをプラスミドpJR765からの長さ0.7kbのSmaI−SacI試料によって双方の菌株中で検出した(図8)。
同様に、独特のヌクレオチドの長さ1900個のrib2、ヌクレオチドの長さ900個のrib3、ヌクレオチドの長さ800個のrib4、ヌクレオチドの長さ1050個のrib5およびヌクレオチドの長さ1000個のrib7の転写物を、pJR758からの長さ0.5kbpのSmaI−SmaI断片、pJR790からの長さ0.6kbpのHindIII−KpnI断片、pJR739からの長さ0.5kbpのScaI−HindIII断片およびpJR845からの長さ0.3kbpのPstI−PstI断片を特異的試料として使用することによりブロットして検出した。
例3
サッカロミセス・セレビシアエにおけるアシュビア・ゴシッピイrib遺伝子の表現
例1と同様にして、補足的アシュビア酵素をコード化するプラスミドを存在させる場合にリボフラビンなしに培地上でのリボフラビン生合成の1つの段階では不完全である、十分に研究されたサッカロミセス・セレビシアエの突然変異体を増殖させることは、可能である。アシュビア・ゴシッピイrib遺伝子生成物の機能を試験するために、フラビンを生産する酵素活性を、表現プラスミドのpJR715、pJR669、pJR788、pJR733、pJR681およびpJR827の1つを存在させるサッカロミセス・セレビシアエ突然変異体からの細胞不含の抽出液中で測定した。
pYEura3から誘導されかつ例1に記載されている前記プラスミドは、ガラクトース誘発性のGAL10プロモーターの制御下にアシュビア・ゴシッピイrib特異性cDNA断片を含有する。
サッカロミセス・セレビシアエからの細胞不含タンパク質抽出液を、液状媒体中でOD約2の光学密度に増殖した培養液から得た。
細胞を収集し、冷たいトリスHCl 20ミリモル、pH7.5で洗浄し、かつフェニルエチルスルホニルフルオリド1ミリモルで補足された同じ緩衝液中に再懸濁させた。
細胞溶解物をガラス玉の存在下での渦動および3000gおよび4℃で20分間の遠心分離によって調製した。
GTPシクロヒドロラーゼII、DRAPデアミナーゼ、DBPシンターゼ、DMRLシンターゼ、リボフラビンシンターゼおよびDRAPレダクターゼ酵素の活性を刊行物の記載と同様にして測定した(Shavlovsky他、Arch.Microbiol.124,1980,255〜259; Richter他、J.Bacteriol.175,1993,4045〜4051; KleinおよびBacher,Z.Naturforsch.35b,1980,482〜484; Richter他、J.Bacteriol.174,1992,4050〜4056; Nielsen他、J.Biol.Chem.261,1986,3661; PlautおよびHarvey,Methods Enzymol.18B,1971,515〜538; HollanderおよびBrown,Biochem.Biophys.Res.Commun.89,1979,759〜763; Shavlovski他、Biochem.Biophys.Acta,428,1976,611〜618)。
タンパク質をピーターソン(Peterson)法によって定量化した(Anal.Biochem.83,1977,346〜356)。第1表から明らかなように、プラスミドpJR715は、サッカロミセス・セレビシアエ突然変異体AJ88中でGTPシクロヒドロラーゼII活性の表現を引き起こす。更に、この活性は、ガラクトース媒体上で増殖した細胞中にのみ存在し、このことは、アシュビア・ゴシッピイのrib1cDNA表現がガラクトース誘発性のGAL10の制御下に生じることを示す。
それ故、この結果は、rib1がアシュビア・ゴシッピイ中のGTPシクロヒドロラーゼIIをコード化することを証明する。同様に、前記真菌類において、rib2はDRAPデアミナーゼをコード化し、rib3はDBPシンターゼをコード化し、rib4はDMRLシンターゼをコード化し、rib5はリボフラビンシンターゼをコード化し、かつrib7はHTPレダクターゼをコード化することが示された。
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:
(A)名:バスフ・アクチエンゲゼルシャフト
(B)通り:カール−ボッシュ−シュトラーセ38
(C)市:ルートビヒスハーフェン
(E)国:ドイツ連邦共和国
(F)郵便番号:D−67056
(G)電話番号:0621/6048526
(H)テレファックス:0621/6043123
(I)テレックス:1762175170
(ii)発明の名称:真菌類におけるリボフラビン生合成
(iii)配列数:12
(iv)コンピューターで読み取り可能な形式:
(A)媒体のタイプ:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PCコンパチブル
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:パテントイン(Patent In)リリース#1.0、バージョン#1.25(EPO)
(2)SEQ ID No:1についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:1329個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖数:二本
(D)形状:線状
(ii)分子型:cDNAないしmRNA
(iii)仮説:なし
(iv)アンチセンス:なし
(vi)出所:
(A)有機体:アシュビア・ゴシッピイ
(ix)特徴:
(A)名称/キー:5′UTR
(B)位置:1..242
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:243..1148
(ix)特徴:
(A)名称/キー:3′UTR
(B)位置:1149..1329。
(xi)配列の記載:SEQ ID No:1:
(2)SEQ ID No:2についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:301個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)形状:線状
(ii)分子型:タンパク質
(xi)配列の記載:SEQ ID No:2:
(2)SEQ ID No:3についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:2627個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖数:二本
(D)形状:線状
(ii)分子型:cDNAないしmRNA
(iii)仮説:なし
(iv)アンチセンス:なし
(vi)出所:
(A)有機体:アシュビア・ゴシッピイ
(ix)特徴:
(A)名称/キー:5′UTR
(B)位置:1..450
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:451..2280
(ix)特徴:
(A)名称/キー:3′UTR
(B)位置:2281..2627
(xi)配列の記載:SEQ ID No:3:
(2)SEQ ID No:4についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:609個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
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(ii)分子型:タンパク質
(xi)配列の記載:SEQ ID No:4:
(2)SEQ ID No:5についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:1082個の塩基対
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(iv)アンチセンス:なし
(vi)出所:
(A)有機体:アシュビア・ゴシッピイ
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(A)名称/キー:CDS
(B)位置:315..953
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(A)名称/キー:3′UTR
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(2)SEQ ID No:6についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:212個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
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(ii)分子型:タンパク質
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(2)SEQ ID No:7についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:996個の塩基対
(B)型:核酸
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(ii)分子型:cDNAないしmRNA
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(iv)アンチセンス:なし
(vi)出所:
(A)有機体:アシュビア・ゴシッピイ
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(A)名称/キー:5′UTR
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(A)名称/キー:3′UTR
(B)位置:790..996
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(2)SEQ ID No:8についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:172個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)形状:線状
(ii)分子型:タンパク質
(xi)配列の記載:SEQ ID No:8:
(2)SEQ ID No:9についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:1511個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖数:二本
(D)形状:線状
(ii)分子型:cDNAないしmRNA
(iii)仮説:なし
(iv)アンチセンス:なし
(vi)出所:
(A)有機体:アシュビア・ゴシッピイ
(ix)特徴:
(A)名称/キー:5′UTR
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(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:525..1232
(ix)特徴:
(A)名称/キー:3′UTR
(B)位置:1233..1511
(xi)配列の記載:SEQ ID No:9:
(2)SEQ ID No:10についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:235個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)形状:線状
(ii)分子型:タンパク質
(xi)配列の記載:SEQ ID No:10:
(2)SEQ ID No:11についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:1596個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖数:二本
(D)形状:線状
(ii)分子型:cDNAないしmRNA
(iii)仮説:なし
(iv)アンチセンス:なし
(vi)出所:
(A)有機体:アシュビア・ゴシッピイ
(ix)特徴:
(A)名称/キー:5′UTR
(B)位置:1..352
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:353..1093
(ix)特徴:
(A)名称/キー:3′UTR
(B)位置:1094..1596
(xi)配列の記載:SEQ ID No:11:
(2)SEQ ID No:12についての情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:246個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)形状:線状
(ii)分子型:タンパク質
(xi)配列の記載:SEQ ID No:12:
Claims (9)
- SEQ ID No:2で示されるアミノ酸配列(グアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼII/GTPシクロヒドロラーゼII)を有するポリペプチドをコード化するDNA。
- SEQ ID No:4で示されるアミノ酸配列(2,5−ジアミノ−6−リビチルアミノ−4(3H)−ピリミジノン5−リン酸デアミナーゼ/DRAPデアミナーゼ)を有するポリペプチドをコード化するDNA。
- SEQ ID No:6で示されるアミノ酸配列(L−3,4−ジヒドロキシ−2−ブタノン4−リン酸シンターゼ/DBPシンターゼ)を有するポリペプチドをコード化するDNA。
- SEQ ID No:8で示されるアミノ酸配列(6,7−ジメチル−8−リビチルルマジンシンターゼ/DMRLシンターゼ)を有するポリペプチドをコード化するDNA。
- SEQ ID No:10で示されるアミノ酸配列(リボフラビンシンターゼ)を有するポリペプチドをコード化するDNA。
- SEQ ID No:12で示されるアミノ酸配列(2,5−ジアミノ−6−リボシルアミノ−4(3H)−ピリミジノン5−リン酸レダクターゼ/DRAPレダクターゼ)を有するポリペプチドをコード化するDNA。
- 請求項1から6までのいずれか1項に記載の1個またはそれ以上のDNAを含有する発現ベクター。
- 請求項7記載の発現系で形質転換された宿主菌株。
- リボフラビンを製造するための組換え法において、請求項8記載の宿主菌株を使用することを特徴とする、リボフラビンを製造するための組換え法。
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