JP3513192B2

JP3513192B2 - 新規なイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子

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Publication number: JP3513192B2
Application number: JP26517193A
Authority: JP
Inventors: 忠馬場; 浩章島田
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1992-10-29
Filing date: 1993-10-22
Publication date: 2004-03-31
Anticipated expiration: 2019-03-31
Also published as: JPH06261767A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規イネ澱粉枝つけ酵
素の遺伝子及びこれを用いた植物細胞中のイネ澱粉酵素
活性を変化させる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】穀類は我々にとって主要なカロリー供給
源であり、かつ脂質やタンパク質の重要な摂取源であ
る。したがって、穀類胚乳貯蔵成分の質的・量的改良は
主要な育種目標となっている。

【０００３】この目標達成のためには、穀類胚乳中の貯
蔵成分に関する遺伝資源の探索・収集とその遺伝・育種
学的評価が必要である。例えば、トウモロコシでは胚乳
成分に関する多様な遺伝的変異（突然変異）が見出され
ており、それらはトウモロコシの品質改良に重要な役割
を果たしている。さらに、これらの突然変異は生体内で
の遺伝的制御機構の解明を行なう際の貴重な情報となる
が、これらに関する遺伝子の構造や発現調節機構は解明
されていない。

【０００４】一方、イネは粒食が主体であり、胚乳澱粉
中の多糖類の含有比率や澱粉の構造的変化が、コメの食
味や調理特性を大きく変え、穀粒中の澱粉含量は食味や
加工特性と密接な関係がある。澱粉合成のメカニズムと
して３つの段階が考えられており、まず、澱粉合成の鋳
型となるオリゴサッカライドの合成、これの伸長反応、
さらにはできた直鎖形の澱粉の枝つけ反応の順で合成さ
れる。澱粉合成に関する酵素蛋白としてはワキシー蛋白
などの澱粉顆粒に結合型の澱粉合成酵素や可溶性の澱粉
合成酵素が知られており、アミロペクチン合成に関与す
る澱粉枝つけ酵素も数種類存在することが知られてい
る。しかし、これらの酵素蛋白についての知見はほとん
ど得られていない。

【０００５】ところで、澱粉は光合成の最終産物であ
り、穀類の主要成分であって、その生合成に関する研究
は、植物生理、生化学における重要な課題の１つとなっ
ている。澱粉はグルコースがα（１→４）結合した直鎖
形のアミロースと、α（１→６）結合による枝分れ構造
をもつアミロペクチンから構成されている。植物におけ
る澱粉顆粒中のアミロース、アミロペクチンの含量比
は、植物種や品種によってそれぞれ固有の値をもってお
り、その高次構造もまた特有の形態をとっていることが
知られている。

【０００６】澱粉生合成の主酵素である澱粉合成酵素
は、ADPグルコースあるいはUDPグルコースを基質とし、
アミロース分子の合成を行なう。これに対し、アミロペ
クチン分子は、α（１→４）結合を作る澱粉合成酵素
と、α（１→６）結合をつくる枝付け（ブランチング）
酵素が協調的に作用することによってつくられる。アミ
ロペクチンの枝分れ構造の形成機構に関する研究は、グ
リコーゲンでの枝分かれの機構の研究を参考にして進め
られており、植物においてもグリコーゲンの枝付け酵素
とよく似た性質の酵素が存在することが示唆されてい
る。しかし、その遺伝子に関する研究、あるいは遺伝的
調節機構についての研究はあまり進んでいなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した技
術の現状に鑑み、イネの遺伝子のうち、とりわけアミロ
ペクチン合成に重大な影響を及ぼす新規な澱粉枝つけ酵
素に着目し、その遺伝子を単離し、食糧増産、食味の優
れた米の生産、植物とくにイネの育種を行うことを課題
とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、新規な澱粉枝つ
け酵素を見出し、この酵素蛋白のアミノ酸配列を明らか
とするとともに、その遺伝子を単離し、本発明に至っ
た。

【０００９】すなわち本発明は、配列番号１に示す塩基
配列を有するイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子のcDNA、配列番
号１に示す６６〜８２５番のアミノ酸配列を有するイネ
澱粉枝つけ酵素の成熟タンパクをコードする遺伝子、配
列番号１に示す１〜６５番のアミノ酸配列を有するイネ
澱粉枝つけ酵素のトランジット蛋白をコードする遺伝
子、及び配列番号４に示す塩基配列中に含まれるイネ澱
粉枝つけ酵素遺伝子のプロモーターである。

【００１０】本発明は、また、配列番号１に示すアミノ
酸配列の全部あるいは一部をコードするＤＮＡ配列と植
物細胞内で発現可能なプロモーターとを結合したＤＮＡ
配列を導入した植物細胞あるいはイネ、及びこのイネを
栽培することにより得られる穀粒を提供する。

【００１１】さらに、本発明は、配列番号１に示すアミ
ノ酸配列の全部あるいは一部をコードするＤＮＡ配列と
植物細胞内で発現可能なプロモーターとを結合したＤＮ
Ａ配列を植物細胞内に導入することによってイネ澱粉枝
付け酵素活性を変化させる方法、イネ澱粉枝付け酵素遺
伝子プロモーターと異種遺伝子とを結合したＤＮＡ配列
を、植物細胞内に導入することによって種子特異的に前
記異種遺伝子を発現させる方法を提供する。

【００１２】本発明のイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子には、
アミロプラストにイネ澱粉枝つけ酵素を効率的に移行す
る能力を有するトランジットペプチドをコードする遺伝
子も包含されている。本明細書においては、特記しない
限り、「澱粉枝付け酵素」とは、トランジットペプチド
を含めた酵素、あるいはトランジットペプチドを除いた
酵素をいい、特にトランジットペプチドを除いた酵素を
「成熟酵素」という。また、澱粉枝付け酵素cDNAを遺伝
子として使用する場合は、これを「澱粉枝付け酵素遺伝
子」という。

【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
係るイネ澱粉枝付け酵素は、新規な酵素であり、 III型
と名付けたものである。本発明者は後述するように、イ
ネ澱粉枝付け酵素を３種に分画し、各々Ｉ、II、III型
と名付けた。

【００１４】これらのうちIII型の酵素による澱粉合成
は動物のグリコーゲン合成の際の枝つけ反応と類似であ
り、大腸菌のグリコーゲン枝つけ酵素とも相同性があ
る。この反応のメカニズムについてはあまり明らかでは
ないが、種子澱粉形成初期のアミロペクチン合成に重要
な役割を果たしており、この酵素の欠如したイネではき
わめて高アミロース含量となる。したがって、この酵素
の活性を高めることは穀粒中のアミロペクチン含量を高
めることにつながる。そのため、作物育種上、この酵素
活性を高めることは大きな意義がある。

【００１５】低アミロース化にはアミロース合成系を抑
えることによって結果的にアミロペクチン含量を高める
方法と、アミロペクチンを合成する経路を強化しその含
量を積極的に増大せしめる方法がある。後者の場合、澱
粉生産量のを高めることにもなるので、イネの育種目標
としては非常に優れているものと考えられる。

【００１６】＜１＞III型イネ澱粉枝付け酵素遺伝子遺伝子を単離するには、例えば、酵素を精製し、アミノ
酸配列を決定し、この配列をもとに合成オリゴヌクレオ
チドプローブを作製し、ハイブリダイゼーションにより
遺伝子ライブラリーから選択する方法がある。そのため
に、イネから澱粉枝付け酵素を精製する方法を以下に例
示する。

【００１７】イネの登熟種子を氷冷しながらジューサー
を用いて粉砕し、50mM Tris-HCl(pH8.5)、5mM EDTA、5m
Mメルカプトエタノ−ルを含む緩衝液に懸濁する。不溶
性の画分を濾過と遠心分離によって取り除いたあと、硫
酸アンモニウムを加えて総蛋白質を沈澱させる。沈澱し
た蛋白画分を50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、5mMメ
ルカプトエタノールからなる緩衝液に溶解し、透析後DE
AE-セルロース(Whatman DE-52)を用いてクロマトグラフ
ィーを行う。イネ澱粉枝つけ酵素を含む画分は、Boyer
とPreissの方法(Carbohydrate Res. 61, 321-334 (197
8))で検定することができる。

【００１８】こうして、イネ澱粉枝つけ酵素は３つの部
分にわかれて得られ、それぞれをＩ型、II型、III型と
した。活性画分は、さらにToyopearl HW55Fを用いたゲ
ル濾過カラムクロマトグラフィーにより、SDS-ポリアク
リルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により単一のバンド
として分離精製され、いずれも新規な酵素である。その
うちIII型の酵素は87kDaの位置に泳動されるタンパクで
ある。

【００１９】このようにして精製した酵素のＮ末端のア
ミノ酸配列を決定すれば、この配列をもとにプローブを
作製することができる。本発明において決定されたIII
型の澱粉枝付け酵素のＮ末端のアミノ配列を、配列番号
２に示した。

【００２０】尚、同様にしてＩ、II型の酵素及びその遺
伝子も得たが、これらの酵素は同一の遺伝子産物であ
り、転写後の切断等により２種類に分かれると推定して
いる。また、これらの酵素はIII型の酵素と抗原抗体反
応上、全く異なる。

【００２１】＜２＞イネ登熟種子由来のcDNAライブラリーの構築 cDNAライブラリーは、イネ登熟種子からｍＲＮＡを抽出
し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、ポリメラーゼ反
応によって２本鎖化したものをベクターに挿入し、大腸
菌等に形質転換することにより作製することができる。
cDNAクローニングキットが市販されているのでこれらを
使用してもよい。

【００２２】ライブラリーの作製に用いるベクターは、
多数種市販されており、これらを使用することができ
る。ＤＮＡの切断、連結、形質転換、遺伝子の塩基配列
の決定、ハイブリダイゼーション等一般の遺伝子組換え
に必要な方法は、各操作に使用する市販の酵素等に添付
されている説明書や、Molecular cloning (Maniatis T.
et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載
されている。

【００２３】＜３＞澱粉枝付け酵素cDNA及び染色体遺伝
子のクローニングと植物細胞における発現精製した酵素から決定したアミノ酸配列をもとに作製し
たプローブを用い、プラークハイブリダイゼーション等
を行うことにより、ｃＤＮＡライブラリーあるいは染色
体ＤＮＡライブラリーから澱粉枝付け酵素遺伝子を得る
ことができる。

【００２４】得られた遺伝子の全部あるいは一部をプロ
ーブとして用い、プラークハイブリダイゼーション等に
より、染色体ＤＮＡライブラリーから澱粉枝付け酵素遺
伝子をスクリーニングすることができる。同様にして、
植物の遺伝子ライブラリーから他の澱粉枝付け酵素遺伝
子を選択することができ、こうして得られる遺伝子も本
発明に使用することができる。

【００２５】クローン化されたcDNAあるいは染色体ＤＮ
Ａの塩基配列の決定は、Maxam-Gilbert法あるいは、ダ
イデオキシ法により行う。ダイデオキシ法による塩基配
列の決定は、市販されているキットを用いて行うことが
でき、配列決定を自動的に行うオートシークエンサーを
使用してもよい。

【００２６】このようにして得られたIII型の澱粉枝付
け酵素ｃＤＮＡの塩基配列、及びこの配列から推定され
るアミノ酸配列を配列番号１に示した。また、染色体Ｄ
ＮＡライブラリーから得られた澱粉枝付け酵素遺伝子の
プロモーター領域を、配列番号４に示す。

【００２７】このアミノ酸配列をコードする遺伝子の全
部あるいは一部をカリフラワーモザイクウイルス由来の
プロモーターなど植物で発現可能なプロモーターと結合
することによって、人工的な澱粉枝付け酵素の発現系を
構築することができる。

【００２８】また、前記澱粉枝付け酵素遺伝子の全部又
は一部を、逆方向にプロモーターに結合したものを植物
に導入し、いわゆるアンチセンスＲＮＡを発現させるこ
とによって、澱粉枝付け酵素遺伝子mRNAの翻訳を阻害
し、酵素生産量を抑制させることができる。

【００２９】さらに、プロモーターとして澱粉枝付け酵
素遺伝子のプロモーターと、澱粉枝付け酵素遺伝子ある
いは異種遺伝子とを連結して得られるＤＮＡ断片を植物
に導入すると、種子特異的にこれらの遺伝子を発現させ
ることができる。

【００３０】このようにして構築された発現系を、イ
ネ、トウモロコシなどの植物に導入することにより、植
物の形質転換を行い、形質転換植物の澱粉の含量を任意
に変化させることができる。同様にして異種遺伝子をこ
れらの植物で発現させることができる。

【００３１】本発明にいう、配列番号１に示すアミノ酸
配列の全部あるいは一部をコードするＤＮＡ配列と、植
物細胞内で発現可能なプロモーターとを結合したＤＮＡ
配列とは、各々を順方向あるいは逆方向に連結したも
の、すなわちイネ澱粉枝付け酵素遺伝子を発現させるも
のと、同遺伝子のアンチセンスＲＮＡを発現させるもの
とを含む。これは、異種遺伝子においても同様である。

【００３２】植物の形質転換は、エレクトロポレーショ
ン（電気的穿孔法）あるいはアグロバクテリウムのＴｉ
プラスミドを利用する方法などによって、プロトプラス
トにＤＮＡを導入することによって行うことができる。
以下に、イネにおける、プロトプラストの調製、エレク
トロポレーションによるプロトプラストへのＤＮＡの導
入、及び形質転換細胞の植物体への再生法を例示する。

【００３３】イネのプロトプラストの調製は、例えば以
下のようにして行う。イネの種子未成熟胚から形成させ
たカルスを、Ｒ２無機塩（Ohira, K. et al.Plant Cell
Physiol. 14, 1113 (1973)）、Ｂ５ビタミン（Gambor
g, O. et al.Expt. Cell Res. 50, 151 (1968)）、０．
３％カゼイン水解物、１ｐｐｍの２，４−Ｄ、及び３％
スクロースを含む液体培地に移し、２５℃、５００ルク
スの蛍光灯光の照射下で、６０rpmに設定したロータリ
ーシェーカーで培養する。

【００３４】一週毎に、新鮮な上記培地でサブカルチャ
ーを行い、サブカルチャー５日目の細胞１ｇを、１％マ
セロザイム（Macerozyme）Ｒ１０、４％セルラーゼＲＳ
（以上、（株）近畿ヤクルト製）、０．５％ CaCl₂・2H₂
O、０．５％デキストラン硫酸カリウム、０．４Ｍマ
ンニトールを含む１０ｍｌの酵素溶液と混合する。

【００３５】この溶液のｐＨを５．５に調整し、２７℃
で３時間振盪（４０rpm）し、続いて３時間静置する。
酵素処理により生じたプロトプラスト懸濁液を、４０μ
ｍのナイロンスクリーンを通して破砕物を除く。

【００３６】このようにして得られるプロトプラスト
へ、エレクトロポレーションによりＤＮＡを導入する方
法（Tada, Y. et al. Theor. Appl. Genet. 80, 475 (1
990)）を説明する。

【００３７】プロトプラストを、エレクトロポレーショ
ン緩衝液（70mM KCl、5mM CaCl₂、5mM 2-[モルフォリノ]エタンスル
ホン酸(MES)、0.4M マンニトール）に、２×１０⁶個／ｍ
ｌとなるように懸濁し、０〜２０μｇのＤＮＡを加え
る。ＤＮＡとしては、導入するＤＮＡ（澱粉枝付け酵素
遺伝子を含むＤＮＡ）の他にハイグロマイシン耐性遺伝
子を発現するプラスミドを加える。ハイグロマイシン耐
性遺伝子を発現するプラスミドが導入されたプロトプラ
ストには、導入しようとするＤＮＡも同時にco-transfo
rmationされる確率が高いので、ハイグロマイシンを用
いた選択により、効率よく形質転換細胞を選択すること
ができる。

【００３８】プロトプラストとＤＮＡの混合液を０℃で
２０分間放置した後、氷冷したエレクトロポレーション
・チャンバに移し、電気パルスを与える。電気パルス
は、例えば、初期電界４７５Ｖ／ｃｍ、時間減衰係数Ｔ
_1/2が３０．０ミリ秒となるように与える。エレクトロ
ポレーションには、装置が市販されているのでこれを使
用すればよい。電気パルスは、例えば、初期電界４７５
Ｖ／ｃｍ、時間減衰係数Ｔ_1/2が３０．０ミリ秒となる
ように与える。

【００３９】次に、上記のようにして得られた形質転換
細胞の植物体への再生法（Fujimura, T. et al. Plant
Tissue Culture Lett. 2, 74(1985)）を説明する。エレ
クトロポレーションを行ったプロトプラストを、遠心分
離（５０×ｇ、５分）により、Ｒ２無機塩、０．４Ｍグ
ルコースを含む洗滌培地で４回洗滌した後、２ｐｐｍの
２，４−Ｄ、０．５ｐｐｍベンジルアデニン、３％スク
ロースを添加したＮ６培地（Chu, C.-C. Proceedings o
f Symposium on Plant Tissue Culture (Scientific Pr
ess, Peking) p.43 (1978)）に懸濁し、細胞数を１０⁶
個／ｍｌに調整して２５℃、暗下で培養する。

【００４０】培養１４日目に、培地にハイグロマイシン
を５０μｇ／ｍｌ添加し、さらに２週間培養し、コロニ
ーを同濃度のハイグロマシンを含む新鮮な培地に移す。
コロニーが直径２ｍｍまで生育したら、ハイグロマイシ
ンを含まないＮ６ホルモンフリー培地に移し、蛍光灯照
射下（３０００ルクス）で培養して分化させる。試験管
内で高さが約１０ｃｍに生長した苗を、順化させた後に
温室内のポットに移し、植物体まで再生させる。

【００４１】澱粉枝付け酵素遺伝子が含まれているクロ
ーンの選択は、カルスあるいは植物体の細胞を採り、サ
ザンハイブリダイゼーション等の方法で確認することに
より行えばよい。また、再生後に、植物体の葉の抽出液
等のタンパク中の酵素量をウエスタン解析等により調べ
る一方、澱粉枝付け酵素遺伝子が導入されていることを
サザン解析等により確認することが好ましい。

【００４２】＜４＞トランジットペプチドをコードする配列の利用澱粉枝付け酵素は、アミロプラストに効率的に移行する
ための配列であるトランジットペプチドをＮ末端側に有
している。配列番号１に示した澱粉枝付け酵素遺伝子に
は、このトランジットペプチドをコードする部分も包含
されており、１２８〜３２２番の塩基配列がこれに相当
する。

【００４３】このトランジットペプチドをコードする配
列の下流に、任意のタンパクをコードする配列をフレー
ムを併せて連結すると、これらの配列を植物細胞中で発
現させた際に、このタンパクをアミロプラストに効率的
に移行させることができる。

【００４４】＜本発明の応用＞本発明によれば、III型
のイネ澱粉枝つけ酵素のトランジットペプチドと酵素活
性を有する蛋白のアミノ酸配列が明らかになったので、
これらを利用してIII型のイネ澱粉枝つけ酵素のイネに
おけるまたはイネ以外の植物での大量生産が可能とな
り、イネなどの新たな育種に本発明は利用できる。従っ
て、本発明は植物育種の領域、III型のイネ澱粉枝つけ
酵素の工業的生産に利用することができ、植物、食品製
造、酵素工業等の技術分野においてきわめて有用であ
る。

【００４５】本発明によって初めて、トランジットペプ
チドをコードする遺伝子を含むIII型のイネ澱粉枝つけ
酵素遺伝子のクローニング及び構造解析に成功した。従
って、本発明が各種の著効を奏することができ、以下に
その一例を示す。

【００４６】既述したように、本発明によって得られた
III型のイネ澱粉枝つけ酵素のcDNAは配列番号１に示す
ようにこの酵素蛋白の全領域をコードしている。したが
って、このcDNAの塩基配列とカリフラワーモザイクウイ
ルス由来のプロモーターなどと結合することによって人
工的なIII型の澱粉枝つけ酵素の発現系を構築すること
が可能となった。構築された人工遺伝子をイネ、タバコ
などの植物に電気的穿孔法あるいはアグロバクテリウム
を利用した方法などによって導入することが可能であ
り、その結果、得られた形質転換植物のIII型の澱粉枝
つけ酵素の生産量を増大させることができる。またアン
チセンス技術を利用することによって、種子中のアミロ
ース含量を高めることが可能となった。

【００４７】本発明のIII型のイネ澱粉枝つけ酵素のcDN
Aにコードされているトランジットペプチドはイネにお
いて後続する蛋白を効率的にアミロプラストに移行させ
る能力を有する。したがって、トランジットペプチドを
コードする塩基配列の後にIII型の澱粉枝つけ酵素をコ
ードする塩基配列に代えて、任意の蛋白をコードする塩
基配列を結合した場合、その蛋白を効率的にアミロプラ
ストに移行させることができる。

【００４８】さらに、III型の澱粉枝つけ酵素の酵素活
性を有する蛋白をコードしている塩基配列は、インビト
ロの転写系などの人工的な手法、あるいは大腸菌などの
微生物を用いて遺伝子の発現を行なうことによって、II
I型の澱粉枝つけ酵素を大量に、かつ純粋な形で得るこ
とができる。得られたIII型の澱粉枝つけ酵素は効率的
に澱粉合成を行なう酵素活性を有することから、澱粉の
量的改変を行なう際に有効である。またこの酵素処理を
行なうことによって澱粉の質的向上を図ることが可能と
なった。

【００４９】本発明のcDNAの塩基配列を用いて、部位特
異的置換あるいはPCR法などの手法を用いてを用いてこ
の塩基配列の一部を特異的に変異せしめ、III型の澱粉
枝つけ酵素の機能向上を求める研究に用いることができ
る。また同時に酵素蛋白の機能発現に関する研究にも用
いることができる。

【００５０】

【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。操作の
手順は特に記述しない限りCurrent Protocols in Molec
ular Biology(F. M. Ausubelら編集、John Wiley& Son
s,Inc., 1987)に記載されている方法にしたがった。

【００５１】

【実施例１】 III型のイネ澱粉枝つけ酵素ｃＤＮＡの取
得とその利用＜１＞III型のイネ澱粉枝つけ酵素の精製と性質の解析圃場で育てたコシヒカリ品種のイネの登熟種子を氷冷し
ながらジューサーを用いて粉砕し、50mM Tris-HCl(pH8.
5)、5mM EDTA、5mMメルカプトエタノ−ルを含む緩衝液
に懸濁した。不溶性の画分をろ過と遠心分離によって取
り除いたあと、硫酸アンモニウムを加えて総蛋白質を沈
澱させた。沈澱した蛋白画分を50mM Tris-HCl(pH7.5)、
5mM EDTA、5mMメルカプトエタノールからなる緩衝液に
溶解し、透析後DEAE-セルロース(Whatman DE-52)を用い
てクロマトグラフィーを行なった。

【００５２】イネ澱粉枝つけ酵素を含む画分は、Boyer
とPreissの方法(Carbohydrate Res. 61, 321-334 (197
8))で検定した。その結果、イネ澱粉枝つけ酵素はＩ
型、II型、III型と名付けた３つの部分に分かれた。次
に、活性画分をToyopearl HW55Fを用いたゲルろ過カラ
ムクロマトグラフィーを行なった。III型の澱粉枝つけ
酵素はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)
により87kDaの単一な蛋白のバンドとして分離精製され
た。

【００５３】精製されたIII型のイネ澱粉枝つけ酵素を
抗原としてウサギ抗血清を作製し、後ウェスタンブロッ
ティング解析等に用いた。

【００５４】＜２＞III型のイネ澱粉枝つけ酵素のN-末
端アミノ酸配列の決定前述のIII型のイネ澱粉枝つけ酵素溶液をSDS-PAGEによ
って分離し、イネ澱粉合成酵素活性を有する蛋白のバン
ドから蛋白質を取り出し、ＰＶＤＦメンブラン（ミリポ
ア）に吸着させた。これを、蛋白分析装置（Applied Bi
osystems Inc製）を用いてN-末端からそのアミノ酸配列
を調べた。その結果、配列番号２に示すアミノ酸配列が
得られた。尚、配列中１５番目のアミノ酸は、Ser又はC
ysのいずれかであると判定された。

【００５５】＜３＞イネ登熟種子由来のcDNAライブラリーの構築イネニッポンバレ登熟種子20gより塩化リチウム法に準
じて全RNAを調製した。さらに、オリゴdTセルロースカ
ラムクロマトグラフィーにより、mRNAを含むポリA-RNA
を単離し、それを鋳型としてオリゴdTプライマーと逆転
写酵素を用いてcDNAを合成した。全RNAからcDNAへの調
製にはファルマシア製のcDNA合成キットを用いた。得ら
れたcDNAはλgt11アームとcDNAを連結後、in vitroパッ
ケージングキット(Stratagene社製、GIGAPACK Gold)を
用い、パッケージングを行ない、大腸菌Y1090株に感染
させることによって多数の組換えλファージを得た。こ
れをイネ登熟種子のcDNAライブラリーとした。ライブラ
リーの大きさは3.3x10⁶であった。

【００５６】＜４＞イネ澱粉枝付け酵素cDNAのクローニング前述のイネ澱粉枝付け酵素のN-末端のアミノ酸配列から
DNAの塩基配列を推定し、このアミノ酸配列に対応する
合成DNA（配列番号２のアミノ酸配列中８〜２０番目の
アミノ酸配列に相当）を作製した。その配列を配列番号
３に示す。尚、配列中他の塩基（N）はイノシン酸であ
る。

【００５７】前述のイネcDNAライブラリーの中のおよそ
300,000個の独立したプラークを、寒天培地上に形成さ
せ、これをニトロセルロース膜に転写後、前述の合成DN
Aを³ ²Ｐラベルしたものをプローブとして用い、イネ澱
粉枝付け酵素のcDNAのスクリーニングを行なった。その
結果、３個の陽性を示すクローンが得られた。これらの
ファージDNAを調製し、この挿入断片は、ファージDNAを
制限酵素EcoRIで限定分解することによって単離した。
さらにこの断片をプラスミドpUC119のEcoRI部位に挿入
することによって、プラスミドクローン(pRB33)としてc
DNAを得た。

【００５８】＜５＞澱粉枝付け酵素cDNAの塩基配列の解析 pRB33に含まれる塩基配列の決定をダイデオキシ法によ
り（Messing, Methodsin Enzymol., 101, 20-78 (198
3)）行った。これにより得られた塩基配列及びこの配列
から推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。

【００５９】このアミノ酸配列の中で、トランジットペ
プチドに対応する配列は、１２８〜３２２番目の塩基配
列によってコードされる配列（アミノ酸番号１〜６５）
であり、成熟酵素に対応する配列は、３２３〜２６０２
番目の塩基配列によってコードされる配列（アミノ酸番
号６６〜８２５）である。

【００６０】上記アミノ酸配列を、澱粉合成酵素のタン
パクから決定したアミノ酸配列と比較したところ、一致
する配列が見いだされ、プラークハイブリダイゼーショ
ンにより単離されたcDNAが澱粉枝付け酵素のcDNAである
ことが確認された。さらに詳細な塩基配列の検討を行な
い、この酵素がアミロプラストへ移行するために重要な
働きを行なうトランジットペプチドを有することが明ら
かとなった。

【００６１】尚、同様にして取得し、決定したＩ型の澱
粉枝付け酵素の遺伝子は、III型の酵素の遺伝子との相
同性はほとんどなく、３０％以下であった。

【００６２】＜６＞III型のイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子
のアンチセンス遺伝子の構築とイネの形質転換前項と同様にEcoRI切断により、III型のイネ澱粉合成酵
素の遺伝情報の全領域を含む断片を単離したあと、T4 D
NA polymeraseを用いて末端を平滑化した。これをpBI22
1のSmaI部位に逆方向にクローニングし、プラスミドpBI
RBE3Rを得た。pBIRBE3Rは、pBI221に由来するカリフラ
ワーモザイクウイルスの35Sプロモーターの下流に、III
型の澱粉枝つけ酵素のcDNAがアンチセンス遺伝子の方向
で結合して存在する。したがって、このプラスミドにの
っているIII型の澱粉枝つけ酵素の遺伝情報は、前記35S
プロモーターによって発現し、アンチセンスRNAとして
転写される。

【００６３】pBIRBE3Rを用いたイネの形質転換を、前述
の方法により行った。尚、ハイグロマイシン耐性遺伝子
を有するプラスミドとして、１０μｇのpＵＣ１９−Ｈ
ＰＴを用い、２０μｇのpBIRS3とともに、イネ（ニッポ
ンバレ）の胚細胞由来のプロトプラストに導入した。

【００６４】エレクトロポレーションは、初期電圧４７
５Ｖ／ｃｍ、Ｔ_1/2が３０ミリ秒である電気パルスを与
えることにより行った。形質転換されたイネは８株得ら
れた。形質転換株から得られた登熟種子の粗抽出液を用
いて、前述の抗血清を使ったウエスタン分析を行なった
ところ、目的とするIII型の澱粉枝つけ酵素の発現量が
対照として用いたニッポンバレに比べて著しく低とへ６
いことが確認された。また、得られた種子のアミロース
含量をヨード呈色法で測定した結果、対照に比べて著し
く高いこと(30-40%)がわかった。

【００６５】本実施例とは逆に、III型の澱粉枝つけ酵
素cDNAをプロモーターに順方向に連結すれば、アミロー
ス含量の低いイネを作製することができる。

【００６６】

【実施例２】 III型の澱粉枝つけ酵素遺伝子プロモータ
ー領域の取得とその利用

【００６７】＜１＞イネゲノムDNAの調製とゲノムライ
ブラリーの構築材料としたイネ核DNAは、RogersとBendichの方法(Plant
Mol. Biol. 5, 69 (1985)に従って調製した。得られた
DNAを制限酵素Sau3AIで限定分解し、さらにショ糖密度
勾配遠心分離を行なって10kb以上の断片を得た。これら
の断片を、BamHIで切断したλEMBL3ファージのアームと
連結後、インビトロ・パッケージングキット(Stratagen
e社製、GIGAPACK Gold)を用い、パッケージングを行な
い、大腸菌LE392株に感染させることによって多数の組
換えλファージを得た。これをイネゲノムDNAライブラ
リーとした。ライブラリーの大きさは1.6×10⁶であっ
た。

【００６８】＜２＞III型のイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子
のプロモーター領域の単離前述のイネゲノムライブラリーの中のおよそ100,000個
の独立したプラークを、実施例１で得られたIII型のイ
ネ澱粉枝つけ酵素のcDNAをプローブとして、イネ枝つけ
酵素遺伝子のプロモーター領域のスクリーニングを行な
った。この結果、10個の陽性クローンが得られた。これ
らの陽性クローンからファージDNAを調製し、挿入断片
の大きさを調べた。その結果、得られたファージクロー
ンは同一の断片に由来することが示唆された。これらの
ファージクローンのうち一つを選択しλRB3と命名し
た。

【００６９】λRB3ファージゲノムに含まれる挿入フラ
グメントは、制限酵素SalIで切断した場合４つの断片に
分かれた。さらに、前述のcDNAの5'領域をプローブとし
て、サザン分析を行ない、プロモーター領域を含む断片
を特定した。プロモータ−領域を含む断片は、λRB3を
制限酵素EcoRIとBamHIによって切断することによって得
られ、これをpUC118のEcoRIとBamHIによる切断断片に挿
入し、得られたプラスミドをpRBP1と名付けた。

【００７０】＜３＞III型のイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子
のプロモーター領域の構造解析上記で得られたpRBP1の挿入断片の塩基配列を、ダイデ
オキシ法によって決定した。プロモーター領域は、得ら
れた塩基配列と前述のcDNAの塩基配列とを比較し、プロ
モーターに共通に見られる配列(TATA配列など)を調べる
こと、および、ノーザン分析等を行なうことによってそ
の構造を明らかにした。

【００７１】このようにして構造解析されたIII型のイ
ネ澱粉枝つけ酵素の遺伝子のプロモーター領域の塩基配
列を、配列表の配列番号４に示した。この領域には、一
般にプロモーターに存在することが知られている因子に
対応する塩基配列の存在が認められた（配列表参照）。

【００７２】＜４＞III型のイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子
のプロモーターの単離 pRBP1に含まれるプロモーターをPCR法によって単離する
ため、２種の合成DNAプライマーを合成した。５’側の
プライマーは、配列番号４中塩基番号４〜２３に示す配
列（配列番号５）を有し、３’側のプライマーは、配列
番号４中塩基番号９９５〜１１１５に相補的な配列（配
列番号６）を有する。これらのプライマーを用いてpRBP
1のPCR法による増幅を行ない、およそ1000bpの断片を増
幅した。得られた断片をpUC118のHincIIサイトに挿入
し、pRBP2を得た。この挿入断片の塩基配列を決定した
ところ、枝つけ酵素遺伝子のプロモーターに対応するこ
とが明かとなった。ここで得られたpRBP2は、III型のイ
ネ枝つけ酵素遺伝子のプロモーター配列の下流にXbaIお
よびBamHI、SmaIサイトが存在する。従って、これらの
制限酵素切断部位を利用して異種の遺伝子を接続するこ
とが可能である。

【００７３】＜５＞III型のイネ枝つけ酵素遺伝子のプ
ロモーターとGUS遺伝子が連結した遺伝子の構築 β−グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を有するプラスミドp
BI221（Jefferson etal.; EMBO J. 6, 3901 (1987) pBI
221はClontech社より入手)をBamHIとSstIにより切断し
てGUS遺伝子領域を切り出し、切断末端をT4 DNAポリメ
ラーゼ(宝酒造製、DNA blunting kit)を用いて平滑化し
た。これを、前述のIII型のイネ枝つけ酵素遺伝子のプ
ロモーターを有するプラスミドpRBP2のSmaI部位に挿入
した。

【００７４】こうして、III型のイネ枝つけ酵素遺伝子
のプロモーターの下流にGUS遺伝子が結合した人工遺伝
子が作製された。これをpRBG1と名付けた。

【００７５】＜６＞III型のイネ枝つけ酵素遺伝子のプ
ロモーターとGUS遺伝子が連結した人工遺伝子のイネへ
の導入 pRBG1のプラスミドを、前述のTadaらの方法に従い、イ
ネ（ニッポンバレ）のプロトプラスト細胞にエレクトロ
ポーレーション法によって導入した。得られた細胞は、
前述のFujimuraらの方法に従い、植物体に再生した。こ
れらの細胞より、DNAを抽出し、サザンハイブリダイゼ
ーションを行なったところ３株にpRBG1に由来すると思
われるDNA断片が存在していた。これらの形質転換植物
の種子のGUS活性を多田らの方法(Tada et al., EMBO
J., 10, 1803-1808 (1991))に従って調べたところ、形
質転換植物の種子は高いGUS活性を示した。

【００７６】このことから、III型のイネ澱粉枝つけ酵
素遺伝子のプロモーターを用いて異種遺伝子を種子特異
的に効率よく発現させることができることがわかった。
したがって、III型の枝つけ酵素のプロモーターを用い
れば、イネの種子中に各種の遺伝子産物を蓄積すること
が可能であることがわかった。

【００７７】＜７＞III型のイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子
のプロモーターとcDNAの結合によるセンス遺伝子の構
築。 III型のイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子のcDNAを有するプラ
スミドpRB33をEcoRIで切断し、切断末端をT4 DNAポリメ
ラーゼ(宝酒造製、DNA blunting kit)を用いて平滑化し
た。これを前述のIII型のイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子の
プロモーターを有するプラスミドpRBP2のSmaIによる切
断断片との結合を行なった。この結果、III型の枝つけ
酵素遺伝子のプロモーターの下流にIII型の枝つけ酵素
遺伝子がセンスの向きにつながったセンス枝つけ酵素遺
伝子が作成された。これを、pRBPRB3と名付けた。

【００７８】＜８＞センスIII型枝つけ酵素遺伝子のイネへの導入 pRBPRB3プラスミドDNAを、＜６＞で述べた方法で、イネ
細胞に導入した。再生植物体細胞よりDNAを抽出し、サ
ザンハイブリダイゼーションを行なったところ、５株に
pRBPRB3に由来するDNA断片が存在していた。これらの形
質転換植物から種子をとり、その胚乳での枝つけ酵素の
活性をフォスフォリラーゼ法（中村道徳、貝沼圭二編、
澱粉、関連糖質酵素実験法、学会出版センター、1989）
によって定量した。その結果、得られた植物体５株の枝
つけ酵素活性は、コントロールとした無処理の植物に比
べ105%から125%であり、これらの平均では約15%増大し
ていた。

【００７９】これらの結果から、本発明のセンスIII型
澱粉枝つけ酵素遺伝子を導入することにより、形質転換
植物の胚乳中での澱粉枝つけ酵素活性を増大させること
が可能であることが示唆された。このことによって胚乳
デンプンでのアミロペクチン含量を増加させることが可
能となることが示唆された。

【００８０】＜９＞III型のイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子
のアンチセンス遺伝子の構築とイネの形質転換イネ澱粉合成酵素の遺伝情報の全領域を含む断片を単離
したあと、T4 DNA ポリメラーゼを用いて末端を平滑化
した。これをpBI221のSmaI部位に、pBI221に含まれるカ
リフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターの転写
方向に逆方向となるようにクローニングし、プラスミド
pBIRBE3Rを得た。すなわち、III型の澱粉枝つけ酵素のc
DNAは、前記プロモーターにアンチセンス遺伝子の方向
で結合して存在し、この遺伝子の遺伝情報は35Sプロモ
ーターによって発現すると、アンチセンスRNAが作られ
る。

【００８１】pBIRBE3Rを電気的穿孔法を用いてイネ（ニ
ッポンバレ）プロトプラストに導入した。形質転換され
たイネは８株得られた。形質転換株から得られた登熟種
子の素抽出液を用いて、前述の抗血清を使ったウエスタ
ン分析を行なったところ、目的とするIII型の澱粉枝つ
け酵素の発現量が対照として用いたニッポンバレに比べ
て著しく低いことが確認された。また、得られた種子の
アミロース含量をヨード呈色法で測定した結果、対照に
比べて著しく高いこと(30〜40%)がわかった。

【００８２】

【発明の効果】本発明のIII型のイネ澱粉枝つけ酵素のc
DNAによって規定されるアミノ酸配列を有する酵素蛋白
はイネで有効に発現し、穀粒中の澱粉のアミロース、ア
ミロペクチン含量に関与するため、この塩基配列をイネ
に導入することによって穀粒に含まれる澱粉成分の含量
を任意に変化させることが可能となり、米の食味性およ
び収量の著しい向上を可能にするものである。

【００８３】また、本発明により得られたイネ澱粉枝つ
け酵素遺伝子のプロモーターを用いることにより、イネ
澱粉枝つけ酵素遺伝子あるいは外来遺伝子を、種子で特
異的に発現させることが可能となる。

【００８４】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：2918 配列の形：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：生物名：オリザサティバ（Oryza sativa）組織の種類：登熟期種子直接の起源ライブラリー名：イネ登熟期種子cDNAライブラリークローン名：pRB33 配列の特徴特徴を示す記号：5'UTR 存在位置：1..127 特徴を決定した方法：P 特徴を示す記号：mRNA 存在位置：1..2918 特徴を決定した方法：P 特徴を示す記号：transit peptide 存在位置：128..322 特徴を決定した方法：S 特徴を示す記号：mature peptide 存在位置：323..2602 特徴を決定した方法：E 特徴を示す記号：3'UTR 存在位置：2603..2918 特徴を決定した方法：P 配列 CGGCGCACAC CCACACACCG ACCACCAGGC AGCGCCTCCT CGCTTTGGCT CTCGCGTGAG 60 GAGGGTTTAG GTGGAAGCAG AGCGCGGGGG TTGCCGGGGG ATCCGATCCG GCTGCGGTGC 120 GGGCGAG ATG GCG GCG CCG GCG TCT GCG GTT CCC GGG AGC GCG GCG GGG 169 Met Ala Ala Pro Ala Ser Ala Val Pro Gly Ser Ala Ala Gly 5 10 CTA CGG GCG GGG GCC GTG CGG TTC CCC GTG CCA GCC GGG GCC CGG AGC 217 Leu Arg Ala Gly Ala Val Arg Phe Pro Val Pro Ala Gly Ala Arg Ser 15 20 25 30 TGG CGT GCG GCG GCG GAG CTC CCGACG TCG CGG TCG CTG CTC TCC GGC 265 Trp Arg Ala Ala Ala Glu Leu ProThr Ser Arg Ser Leu Leu Ser Gly 35 40 45 CGG AGA TTC CCC GGT GCC GTT CGCGTG GGG GGT TCC GGG GGG CGC GTG 313 Arg Arg Phe Pro Gly Ala Val ArgVal Gly Gly Ser Gly Gly Arg Val 50 55 60 GCC GTG CGC GCG GCG GGC GCG TCA GGG GAG GTG ATG ATC CCC GAG GGC 361 Ala Val Arg Ala Ala Gly Ala Ser Gly Glu Val Met Ile Pro Glu Gly 65 70 75 GAG AGC GAC GGG ATG CCG GTT TCA GCA GGT TCA GAC GAT CTG CAG TTG 409 Glu Ser Asp Gly Met Pro Val Ser Ala Gly Ser Asp Asp Leu Gln Leu 80 85 90 CCA GCC TTA GAT GAT GAA TTA AGC ACG GAG GTT GGA GCT GAA GTT GAG 457 Pro Ala Leu Asp Asp Glu Leu Ser Thr Glu Val Gly Ala Glu Val Glu 95 100 105 110 ATT GAG TCA TCT GGA GCA AGT GAC GTT GAA GGC GTG AAG AGA GTG GTT 505 Ile Glu Ser Ser Gly Ala Ser Asp Val Glu Gly Val Lys Arg Val Val 115 120 125 GAA GAA TTA GCT GCT GAG CAG AAA CCA CGA GTT GTC CCA CCA ACA GGA 553 Glu Glu Leu Ala Ala Glu Gln Lys Pro Arg Val Val Pro Pro Thr Gly 130 135 140 GAT GGG CAA AAA ATA TTC CAG ATG GAC TCT ATG CTT AAT GGC TAT AAG 601 Asp Gly Gln Lys Ile Phe Gln Met Asp Ser Met Leu Asn Gly Tyr Lys 145 150 155 TAC CAT CTT GAA TAT CGA TAT AGC CTA TAT AGG AGA CTG CGT TCA GAC 649 Tyr His Leu Glu Tyr Arg Tyr Ser Leu Tyr Arg Arg Leu Arg Ser Asp 160 165 170 ATT GAT CAG TAT GAA GGA GGA CTG GAA ACA TTT TCT CGC GGT TAT GAG 697 Ile Asp Gln Tyr Glu Gly Gly Leu Glu Thr Phe Ser Arg Gly Tyr Glu 175 180 185 190 AAG TTT GGA TTT AAT CAC AGT GCT GAA GGT GTC ACT TAT CGA GAA TGG 745 Lys Phe Gly Phe Asn His Ser Ala Glu Gly Val Thr Tyr Arg Glu Trp 195 200 205 GCT CCC GGG GCA CAT TCT GCA GCA TTA GTA GGT GAC TTC AAC AAT TGG 793 Ala Pro Gly Ala His Ser Ala Ala Leu Val Gly Asp Phe Asn Asn Trp 210 215 220 AAT CCA AAT GCA GAC CGC ATG AGC AAA AAT GAG TTT GGT GTT TGG GAG 841 Asn Pro Asn Ala Asp Arg Met Ser Lys Asn Glu Phe Gly Val Trp Glu 225 230 235 ATT TTT CTG CCT AAC AAT GCT GAT GGC TCA TCT CCT ATT CCA CAT GGC 889 Ile Phe Leu Pro Asn Asn Ala Asp Gly Ser Ser Pro Ile Pro His Gly 240 245 250 TCA CGT GTA AAG GTG CGA ATG GAA ACT CCA TCT GGT ATA AAG GAT TCT 937 Ser Arg Val Lys Val Arg Met Glu Thr Pro Ser Gly Ile Lys Asp Ser 255 260 265 270 ATT CCT GCC TGG ATC AAG TAC TCT GTG CAG GCC GCA GGA GAA ATC CCA 985 Ile Pro Ala Trp Ile Lys Tyr Ser Val Gln Ala Ala Gly Glu Ile Pro 275 280 285 TAC AAT GGA ATA TAT TAT GAT CCT CCT GAA GAG GAG AAG TAC ATA TTC 1033 Tyr Asn Gly Ile Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Glu Lys Tyr Ile Phe 290 295 300 AAG CAT CCT CAA CCT AAA AGA CCA AAG TCA TTG CGG ATA TAC GAA ACT 1081 Lys His Pro Gln Pro Lys Arg Pro Lys Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Thr 305 310 315 CAT GTT GGA ATG AGT AGC ACG GAG CCA AAG ATC AAC ACG TAT GCA AAC 1129 His Val Gly Met Ser Ser Thr Glu Pro Lys Ile Asn Thr Tyr Ala Asn 320 325 330 TTT AGG GAT GAG GTG CTT CCA AGA ATC AAA AAG CTT GGA TAC AAT GCA 1177 Phe Arg Asp Glu Val Leu Pro Arg Ile Lys Lys Leu Gly Tyr Asn Ala 335 340 345 350 GTG CAA ATA ATG GCA ATT CAA GAG CAT GCA TAT TAT GGA AGC TTT GGG 1225 Val Gln Ile Met Ala Ile Gln Glu His Ala Tyr Tyr Gly Ser Phe Gly 355 360 365 TAC CAT GTC ACC AAT TTC TTT GCA CCA AGT AGT CGT TTC GGG ACC CCA 1273 Tyr His Val Thr Asn Phe Phe Ala Pro Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro 370 375 380 GAA GAT TTA AAG TCA TTG ATT GAT AAA GCT CAT GAG CTT GGT TTA GTT 1321 Glu Asp Leu Lys Ser Leu Ile Asp Lys Ala His Glu Leu Gly Leu Val 385 390 395 GTG CTC ATG GAT GTT GTT CAC AGC CAT GCG TCA AAT AAT ACC CTA GAT 1369 Val Leu Met Asp Val Val His Ser His Ala Ser Asn Asn Thr Leu Asp 400 405 410 GGG TTG AAC GGT TTT GAT GGT ACA GAT ACG CAT TAC TTT CAT AGT GGT 1417 Gly Leu Asn Gly Phe Asp Gly Thr Asp Thr His Tyr Phe His Ser Gly 415 420 425 430 TCA CGC GGC CAT CAT TGG ATG TGG GAT TCT CGC CTT TTC AAC TAT GGG 1465 Ser Arg Gly His His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly 435 440 445 AAT TGG GAA GTT CTA AGA TTT CTA CTA TCC AAT GCA AGA TGG TGG CTC 1513 Asn Trp Glu Val Leu Arg Phe Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu 450 455 460 GAG GAG TAT AAG TTT GAT GGT TTC AGA TTT GAC GGT GTA ACC TCA ATG 1561 Glu Glu Tyr Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met 465 470 475 ATG TAC ACT CAT CAT GGA TTA CAA GTA GCA TTT ACG GGG AAC TAC AGT 1609 Met Tyr Thr His His Gly Leu Gln Val Ala Phe Thr Gly Asn Tyr Ser 480 485 490 GAA TAC TTT GGA TTT GCC ACT GAT GCT GAT GCA GTA GTT TAC TTG ATG 1657 Glu Tyr Phe Gly Phe Ala Thr Asp Ala Asp Ala Val Val Tyr Leu Met 495 500 505 510 CTG GTA AAT GAT TTA ATT CAT GGA CTT TAT CCT GAG GCC ATA ACC ATC 1705 Leu Val Asn Asp Leu Ile His Gly Leu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Ile 515 520 525 GGT GAA GAT GTC AGT GGA ATG CCT ACA TTT GCC CTT CCT GTT CAA GAT 1753 Gly Glu Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Phe Ala Leu Pro Val Gln Asp 530 535 540 GGT GGG GTT GGT TTT GAT TAT CGC CTT CAT ATG GCT GTT CCT GAC AAA 1801 Gly Gly Val Gly Phe Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Val Pro Asp Lys 545 550 555 TGG ATT GAA CTC CTC AAG CAA AGT GAT GAA TCT TGG AAG ATG GGT GAT 1849 Trp Ile Glu Leu Leu Lys Gln Ser Asp Glu Ser Trp Lys Met Gly Asp 560 565 570 ATT GTG CAC ACA CTG ACT AAC AGA AGG TGG TCA GAG AAG TGT GTT ACT 1897 Ile Val His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Ser Glu Lys Cys Val Thr 575 580 585 590 TAT GCT GAA AGT CAT GAT CAA GCA CTA GTT GGT GAC AAA ACT ATT GCA 1945 Tyr Ala Glu Ser His Asp Gln Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala 595 600 605 TTC TGG TTG ATG GAC AAG GAT ATG TAT GAT TTT ATG GCT CTG GAC AGA 1993 Phe Trp Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp Arg 610 615 620 CCG GCA ACA CCT AGC ATT GAT CGT GGA ATA GCA TTG CAT AAA ATG ATT 2041 Pro Ala Thr Pro Ser Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile 625 630 635 AGA CTT ATC ACA ATG GGG TTA GGA GGA GAA GGC TAT CTT AAC TTT ATG 2089 Arg Leu Ile Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met 640 645 650 GGA AAT GAG TTC GGA CAT CCT GAA TGG ATT GAT TTT CCA AGA GCT CCA 2137 Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Ala Pro 655 660 665 670 CAA GTA CTT CCA AAT GGT AAA TTC ATC CCA GGG AAT AAC AAC AGT TAT 2185 Gln Val Leu Pro Asn Gly Lys Phe Ile Pro Gly Asn Asn Asn Ser Tyr 675 680 685 GAT AAA TGC CGT CGA AGA TTT GAC CTG GGT GAT GCG GAC TAT CTT AGG 2233 Asp Lys Cys Arg Arg Arg Phe Asp Leu Gly Asp Ala Asp Tyr Leu Arg 690 695 700 TAT CGT GGC ATG CTA GAG TTT GAC CGC GCG ATG CAG TCT CTC GAG GAA 2281 Tyr Arg Gly Met Leu Glu Phe Asp Arg Ala Met Gln Ser Leu Glu Glu 705 710 715 AAA TAT GGG TTC ATG ACA TCA GAC CAC CAG TAC ATA TCT CGA AAG CAT 2329 Lys Tyr Gly Phe Met Thr Ser Asp His Gln Tyr Ile Ser Arg Lys His 720 725 730 GAA GAG GAT AAG ATG ATT ATA TTT GAG AAG GGA GAT CTG GTA TTT GTG 2377 Glu Glu Asp Lys Met Ile Ile Phe Glu Lys Gly Asp Leu Val Phe Val 735 740 745 750 TTC AAC TTC CAT TGG AGT AAC AGC TAT TTT GAC TAC CGT GTT GGT TGT 2425 Phe Asn Phe His Trp Ser Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr Arg Val Gly Cys 755 760 765 TTA AAG CCA GGG AAA TAT AAG GTG GTC TTG GAC TCA GAT GCT GGA CTC 2473 Leu Lys Pro Gly Lys Tyr Lys Val Val Leu Asp Ser Asp Ala Gly Leu 770 775 780 TTT GGT GGA TTT GGC AGG ATC CAT CAC ACT GCA GAG CAC TTC ACT GCC 2521 Phe Gly Gly Phe Gly Arg Ile His His Thr Ala Glu His Phe Thr Ala 785 790 795 GAT TGT TCA CAT GAC AAC AGG CCC TAC TCG TTC TCA GTT TAT TCT CCT 2569 Asp Cys Ser His Asp Asn Arg Pro Tyr Ser Phe Ser Val Tyr Ser Pro 800 805 810 AGC AGA ACC TGC GTT GTC TAT GCT CCA GCG GAA TGAGAACACC AAGAGGCAGC 2622 Ser Arg Thr Cys Val Val Tyr Ala Pro Ala Glu 815 820 825 ATGCAAGTGT GTGCGGCTGG CTAGTGCGAA GGAGCAAGAA AAACTAGTTG CCAGCAATCT 2682 GTGAACGGCT TTCCTAGGTT CTGCTTCGAT GAATGCCGGA TAGACTAGAC AGCTTGCTTT 2742 TGTGCTTTGC GCTCCCAATT TGTAGTTTTA GTTTGTGAGG GAAAGAAACG TTTATTTGTA 2802 ATTATCTATG GCTGTCGAAC GGCGACGAAA CCATGAACCC CGTATATTTG TTGGTACCGT 2862 TCGAACTGCC AGTTATACAT AGTTCTGCAC TTCTGTACAT CTTGTGATGC TTGAATC 2919

【００８５】配列番号：2 配列の長さ：20 配列の形：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：起源：生物名：オリザサティバ（Oryza sativa）組織の種類：登熟期種子配列 Ala Ala Gly Ala Ser Gly Glu Val Met Ile Pro Glu Gly Glu Xaa Asp 5 10 15 Gly Met Pro Val 20

【００８６】配列番号：3 配列の長さ：38 配列の形：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ACNGGCATNC CRTCRCAYTC NCCYTCNGGN ATCATNAC 38

【００８７】配列番号：4 配列の長さ：1110 配列の形：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源：生物名：オリザサティバ(Oryza sativa) 組織の種類：登熟期種子直接の起源クローン名：pRBP1 配列の特徴特徴を示す記号：promoter 存在位置：1..996 特徴を決定した方法：P 特徴を示す記号：TATA signal 存在位置：953..958 特徴を決定した方法：S 特徴を示す記号：mRNA 存在位置：997..1110 特徴を決定した方法：S 配列 GAATTCTTAA GTACTCAACT CACACGTTTG GTGTGCTTGG TTTCATGGGC TGGCCCAACA 60 GAAAAATCGC TCTGCCCAAT CCGCTGGACG CACGCGGAGT CGCCAGTCTG CTAGAGGATG 120 TGCTCCATTT TGGCAGCCCA TTGTTCACCG CGAGAAAGGA TGATGGACCA CAGGCTACTA 180 GGCTAGTCAG GTCACGCTTC GCACGAGTGC TTCTCCCTCA CGTGCTCCTC AACGTTTACA 240 CAGAGGTGAC AGAGCAGAAC AGAAAAATGA AACAACAGAG CACCGGTGTT GCGTTCTTCC 300 ATTCACTGAG AATTTGTTTC GTGTAAGCCT CCTGGGTCCA GCCCAACTCC CATCTTCCCT 360 TTTGTTGTTT TCCCTGGGTA ACAAAAAGCG CGACCAAAGA GGACAAGGAA AAACAAAAAG 420 AAGCACAGGA GTAGCAAGTA GCAGGGAGGG AGACGCGACG CAAGCGGCGT TACGGGTCGA 480 GAGGGAAAGC CTCCCCGGCG TTGGTTTCCT TTTCCTCTCC TCTTCCTCCC CAACCCGCGC 540 CGTGCCGCAC GCCGCGCCAC GCCAACTCGA TCGGTGGTGA CTCCGCCTGC CTCCACCCGC 600 GGCGCACGCC CGCTGCCCTC CACCTTCCAC CTGGCAGCAG CGGCTGGCAT GGCAGTGGAG 660 ACGGCGCGCT CCTCTCCTCT CCCTTCCCCC GGCTAACGCA AACGTGACGC CCGGGCGCGC 720 ACGGGAAAGC GGACGCTTTC ATCGCGAGGG GGGAGGGGAA AAGCCTCGCC CTCCGCCCTC 780 GCCGCCTGAC TCCGTGCGCC GCGGATTGGA CCGACGCGCA ACCGCCTCTT CCGCCCCCGT 840 CCCCCCAGTG CACGCATCGC ACACCCACCC TCGGCGGCCT CGATGCCACT CTCGCGTGAG 900 GGGTTCGCTC CATCAGGACC AGAGCTCCTC CTCCTCGTCC TCTATATAGC GCGGCGCCCT 960 CCGCTCCTCC TAGCTTCAGC ACCAGTGCAC CCGCACGCGC GCACACCCAC ACACCGACCA 1020 CCAGGCAGCG CCTCCTCGCT TTGGCTCTCG CGTGAGGAGG GTTTAGGTGG AAGCAGAGCG 1080 CGGGGGTTGC CGGGGGATCC 1100

【００８８】配列番号：5 配列の長さ：20 配列の形：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TTCTTAAGTA CTCAACTCAC 20

【００８９】配列番号：6 配列の長さ：21 配列の形：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGTGTGTGGG TGTGCGCGCGT 21

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/54 A01H 1/00 A01H 5/00 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に示す塩基配列を有するイネ
澱粉枝つけ酵素遺伝子。
【請求項２】以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパ
ク質をコードする遺伝子：（Ａ）配列番号１に示す６６〜８２５番目のアミノ酸配
列からなるイネ澱粉枝つけ酵素の成熟タンパク質（Ｂ）配列番号１に示す６６〜８２５番目のアミノ酸配
列において、１または数個のアミノ酸が置換・欠失また
は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ澱粉枝つけ酵
素活性を有するタンパク質。
【請求項３】配列番号１に示す１〜６５番目のアミノ酸
配列からなるイネ澱粉枝つけ酵素のトランジットタンパ
ク質をコードする遺伝子。
【請求項４】配列番号４に示す１〜９９６番目の塩基
配列を有するプロモーター。
【請求項５】以下の（Ｃ）または（Ｄ）に示すタンパ
ク質をコードするＤＮＡと、植物細胞内で発現可能なプ
ロモーターとを結合したＤＮＡ配列を導入することによ
り、澱粉枝つけ酵素活性が増強するように改変されたイ
ネ：（Ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるイネ澱粉
枝つけ酵素タンパク質、または（Ｄ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１また
は数個のアミノ酸が置換・欠失または挿入されたアミノ
酸配列からなり、かつ澱粉枝つけ酵素活性を有するタン
パク質。
【請求項６】前記プロモーターが請求項４記載のプロ
モーターであることを特徴とする請求項５記載のイネ。
【請求項７】請求項５または６記載のイネを栽培する
ことにより得られる、澱粉含量が増加した穀粒。
【請求項８】以下の（Ｃ）または（Ｄ）に示すタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列と、植物細胞内で発現可能
なプロモーターとを結合したＤＮＡ配列を、イネに導入
することによって澱粉枝つけ酵素活性を変化させる方
法：（Ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるイネ澱粉
枝つけ酵素タンパク質、または（Ｄ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１また
は数個のアミノ酸が置換・欠失または挿入されたアミノ
酸配列からなり、かつ澱粉枝つけ酵素活性を有するタン
パク質。
【請求項９】前記プロモーターが請求項４記載のプロ
モーターであることを特徴とする請求項８記載の澱粉枝
付け酵素活性を変化させる方法。
【請求項１０】請求項４記載のプロモーターと異種遺
伝子とを結合したＤＮＡ配列をイネに導入し、種子特異
的に前記異種遺伝子を発現させる方法。