JPH08507923A - Ｄｎａ、ｄｎａ構築物、細胞及びそれから誘導された植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 果実成熟関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を植物中に形質転換して植物の特性（特には果実の質）を改良することができる。新規なＤＮＡ配列が開示される；ｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンは寄託された；新規な成熟関連プロモーター配列もまた得られる。植物形質転換のためのセンスおよびアンチセンス構築物が記載されている。遺伝的に修飾された植物を使用して改良された果実を製造してもよく、育種プログラムにおいてそれを使用してハイブリッド種子を製造してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ、ＤＮＡ構築物、細胞及びそれから誘導された植物 本願は新規なＤＮＡ構築物、当該構築物を含有する植物細胞及びそれから誘導 された植物に関する。特に、本発明は植物における遺伝子の発現を調節するため のアンチセンスまたはセンスＲＮＡ技術の利用に関する。 植物の遺伝子発現の修飾は種々の方法によって行われる。分子生物学者は、遺 伝子発現を減少または増加させるため、あるいは特定の遺伝子の発現を空間的ま たは一時的に変えることを、さまざまな既知の方法から選択することができる。 例えば、植物における種々の標的遺伝子の発現を減少させるために、（Bird and Ray，1991，Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 9:207-227に記 載されているように）特異的なアンチセンスＲＮＡまたは部分的なセンスＲＮＡ の発現が利用されてきた。これらの技術にはアンチセンスまたはセンスＲＮＡを 発現するように設計された合成遺伝子の植物ゲノムへの取り込みが含まれる。こ れらはトマト果実の成長と成熟に関与する一連の遺伝子個々の発現をダウンレギ ュレーションする（down-regulate）ために好適に用いられてきた（Gray et al ，1992，P1ant Molecular Biology，19:69-87）。標的遺伝子の発現を増加させ る方法もまた発展してきた。例えば、標的遺伝子の完全なコード領域（coding r egion）を含有するＲＮＡを発現するように設計された別の遺伝子を、遺伝子産 物を“過剰発現”するように植物ゲノムに挿入することができる。遺伝子発現を 修飾する、例えば、他の調節配列の利用のような、種々の他の方法が知られてい る。 本発明に到る研究において、我々は成熟に関連する過程に関与するタンパク質 をコード化し（encode）、正常なトマト及び成熟阻害剤（ｒｉｎ）変異型のトマ トにおいて新規な発現パターンを示す遺伝子を同定した。これらのタンパク質を コード化するＤＮＡ配列をクローニングし、性質を調べた。植物の特性、特にト マトを含む果実の成熟特性を修飾するためにＤＮＡ配列を用いることができる。 該当する配列は以下のクローンに（ほぼ完全に）コード化される：ＥＲＴ１ｂ、 ＥＲＴ１０、ＥＲＴ１３、ＥＲＴ１４、ＥＲＴ１５、ＥＲＴ１６ｂ、ＥＲＴ１７ 、ＥＲＴＤ１、ＥＲＴＲ１及びＥＲＴＳ２（以下においては“ＥＲＴクローン” または“ＥＲＴ配列”として記載する）。 これらのクローンはトマト果実の成熟初期に発現する遺伝子を同定する研究計 画の中で単離された（Picton et al，1993，Plant Molecular Biology，印刷中 ）。 ＥＲＴクローンの単離の背景 果実の成熟過程に関与する複雑な経路の多さを考慮しても、また過去１０年間 の多くのトマト果実のｃＤＮＡライブラリーの作成及びスクリーニングにもかか わらず、果実−または成熟−特異的な遺伝子、またその機能が同定されたものは 驚くほどわずかしかない。この特異的な領域に取り組むために、野生型のトマト 果実の成熟の非常に初期の段階の果皮から新規なｃＤＮＡライブラリーが作成さ れ（ｐＥＲＴクローンシリーズ、Early Ripening Tomato（早期成熟トマト）） 、同様の成長時期の成熟阻害剤（ｒｉｎ）突然変異体果実の果皮から得られたｍ ＲＮＡを別にスクリーニングした。 １９６８年に最初に報告されたｒｉｎ突然変異は、劣性であり、５番の染色体 に位置し、マクロカリックス（macrocalyx）遺伝子座に密接している。この突然 変異は成熟に従って多面発現効果を有し、成熟の表現型を極度に遅らせる。果実 は多くの一般的な収穫後の病原体に対する抵抗性の増加を示し、正常な成熟また は悪化の兆しを見せることなく数年間維持された。果実の大規模な貯蔵に従い、 果実内で種子が発芽し、早く成長する可能性がある。植物の成長及び早期の果実 の発育の他の面は、ｒｉｎ突然変異によって影響されないように思われる。しか しながら、ｒｉｎ果実は、カロテノイド、特にリコペン（lycopene）の蓄積が減 少する結果、色素沈着の正常なレベルに達することができず、またクロロフィル の消失速度が遅いため、野生型の果実が完全に赤くなる時期に、ｒｉｎ果実は緑 のままである。数週間後、ｒｉｎ果実は次第に“成熟”して淡黄色になる。これ らの突然変異体果実はまた、多くの芳香族化合物の生成が減少しているため、こ れに関連する正常な味や香りをつくることができない。 これらの著しい欠点にも関わらず、ｒｉｎ突然変異は異型接合体の状態、すな わち果実の品質に関係する同型接合体のｒｉｎ突然変異の欠点が少なくとも部分 的に克服された遺伝学的な状態で、市販のトマト製造に利用されている。ｒｉｎ 異型接合体トマトの大きな利点は、固さを維持して、特に新鮮なままで市場に出 すためのトマトの操作性を改善できることである。 野生型及びｒｉｎ果皮の全タンパク質の解析から、野生型と比較して突然変異 体の果実ではいくつかのタンパク質がより豊富にあり、他のものは減少している という、成熟中の差異が明らかになった。インビトロでの翻訳プロフィール（tr anslation profiles）から、こうした変化は突然変異体果実における遺伝子発現 の変化の結果であることを示唆する。次いで成熟関連ｃＤＮＡクローンの解析か ら、突然変異体果実における数種のｍＲＮＡの蓄積パターンの変化が示され、ｒ ｉｎ 突然変異は多くの成熟関連遺伝子の発現に影響することが示唆される。 成熟初期に、ｒｉｎ果実は正常なトマト果実に特徴的なエチレン生成の自己触 媒的な（autocatalytic）増加を示さず、本質的に非−転換期の（non-climacter ic）果実として成熟する。従って、ｒｉｎ突然変異はエチレン受容体に影響し、 これが成熟の表現型の遅れにつながることが示唆された。しかしながら、ｒｉｎ 果実はエチレンを知覚することができるという証拠があるが、エチレン単独では 突然変異の表現型を戻すことはできない。外来性のエチレンを高濃度で適用する と、ｒｉｎ果実の赤色色素の沈着を引き出すことができ、呼吸速度の増加につな がるが、自己触媒的なエチレン生成を引き出すことはできない。エチレン処理は また、突然変異体果実で実質的に減少している数種の成熟関連ｍＲＮＡ、すなわ ちｐＴＯＭ ５（フィトエンシンターゼ）、ｐＴＯＭ １３（エチレン生成酵素 ）ｐＴＯＭ ９９（エチレン反応性遺伝子Ｅ８によってコード化されることが現 在知られている）及びＥ４に相同するものの蓄積を回復させるが、ポリガラクツ ロナーゼ（polygalacturonase：ｐＴＯＭ ６）のｍＲＮＡの蓄積を明らかに増 加させることはできない。 ｒｉｎ果実は非−転換期の背景として、多くのエチレン反応性遺伝子の転写の 活性化及び蓄積を調べるために用いられてきた。これらの実験から、ｒｉｎは転 写時及び転写後のできごとに共に影響することが示される。ポリガラクツロナー ゼ及びＥ４遺伝子の転写、及びこれに続くｍＲＮＡの蓄積はｒｉｎ果実では実際 上なくなっている。対照的に、Ｅ８（ｐＴＯＭ ９９）及びＪ４９遺伝子の転写 は減少し、これらに相当するｍＲＮＡの蓄積は減少する。Ｅ１７遺伝子の場合、ｒｉｎ 突然変異は転写に影響がないように思われるが、ｍＲＮＡの蓄積は非常に 減少する。 多くの成熟関連遺伝子の発現に影響するｒｉｎ成熟突然変異体の性質及び分子 レベルでの種々の効果からみると、これは理想的な育種手段ではない。しかしな がら、突然変異の性質のため、我々は果実成熟関連ｃＤＮＡの単離のためのプロ ーブとしてｒｉｎ果実ｍＲＮＡを利用することに決定した。果実の成熟の兆候が 最初に見られた時に野生型のトマト果実（Lycopersicon esculentum Mill．cv A ilsa Craig）の果皮から単離されたｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリ ーは、相当するｍＲＮＡがトマトの成熟突然変異体、成熟阻害剤（ｒｉｎ）の果 実中に種々のレベルで存在するクローンを同定するために別にスクリーニングさ れた。我々は今、相当するｍＲＮＡが成熟中のｒｉｎ果実で変化した発現パター ンを示す一連の新規ｃＤＮＡクローンを単離し、性質を調べ、配列を決定した。 本発明に係るＤＮＡ構築物、細胞及び植物 本発明により、我々はＥＲＴ１ｂ、ＥＲＴ１０、ＥＲＴ１３、ＥＲＴ１４、Ｅ ＲＴ１５、ＥＲＴ１６ｂ、ＥＲＴ１７、ＥＲＴＤ１、ＥＲＴＲ１及びＥＲＴＳ２ からなる群から選ばれるＥＲＴクローンによってコード化される、またはハイブ リダイゼーションプローブとして該クローンを利用することによって得られるＤ ＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物を提供する。ＤＮＡ配列はｃＤＮＡ、ゲノムの ＤＮＡまたは（最初から合成した）合成ポリヌクレオチドから誘導することがで きる。 ＥＲＴ配列をコード化するｃＤＮＡクローンはブダペスト条約の取り決めに従 い、ザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリ ン・バクテリア（The National Collections of Industrial and Marine Bacter ia（23 St Machar Drive，Aberdeen，Scotland，AB2 1RY））に以下に示す日付 及び受託（ＮＣＩＭＢ）番号で寄託された。 （１９９３年３月１８日にＮＣＩＭＢ４０５４４として寄託された）ＥＲＴ１ ｂの塩基配列は配列ＩＤ ＮＯ１で示される。 （１９９３年３月１８日にＮＣＩＭＢ４０５４５として寄託された）ＥＲＴ１ ０の塩基配列は配列ＩＤ ＮＯ２で示される。 （１９９３年３月１８日にＮＣＩＭＢ４０５４６として寄託された）ＥＲＴ１ ３の塩基配列は配列ＩＤ ＮＯ３で示される。 （１９９３年３月１８日にＮＣＩＭＢ４０５４７として寄託された）ＥＲＴ１ ４の塩基配列は配列ＩＤ ＮＯ４で示される。 （１９９３年３月１８日にＮＣＩＭＢ４０５４８として寄託された）ＥＲＴ１ ５の塩基配列は配列ＩＤ ＮＯ５で示される。 （１９９３年３月１８日にＮＣＩＭＢ４０５４９として寄託された）ＥＲＴ１ ６ｂの塩基配列は配列ＩＤ ＮＯ６で示される。 （１９９３年７月５日にＮＣＩＭＢ４０５６９として寄託された）ＥＲＴ１７ の塩基配列は配列ＩＤ ＮＯ７で示される。 （１９９３年９月３０日及び１９９３年１２月９日にＮＣＩＭＢ４０５８８と して寄託された）ＥＲＴＤＩの塩基配列は配列ＩＤ ＮＯ８で示される。 （１９９３年３月１８日にＮＣＩＭＢ４０５５０として寄託された）ＥＲＴＲ １の塩基配列は配列ＩＤ ＮＯ９で示される。 （１９９３年３月１８日にＮＣＩＭＢ４０５５１として寄託された）ＥＲＴＳ ２の塩基配列は配列ＩＤ ＮＯ１０で示される。 ＥＲＴｃＤＮＡ配列は、宿主大腸菌内での（ｐＥＲＴ１ｂ等と設計された）複 製のためにプラスミドに挿入された。 ＥＲＴ成熟関連タンパク質／酵素をコード化するｃＤＮＡクローンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０に示される配列の１つから由来す る適当なプローブを用いて、Slaterらの記載するもの（1985，Plant Molecular Biology，5:137-147）と同様の既知のスクリーニング方法によって、トマトまた は他の植物のｍＲＮＡから得ることもできる。１個または複数のＥＲＴ遺伝子に よって作られるｍＲＮＡ全体、または実質的に全体をコードする配列はこのよう にして単離される。 ＥＲＴ ＤＮＡ配列の別の起源は、特定のＥＲＴタンパク質をコード化する適 当な遺伝子である。この遺伝子はイントロンが存在する点でｃＤＮＡと異なって いても良い。イントロンはｍＲＮＡに転写されない（または、もしそのように転 写されても、続いて切り取られる）。オリゴヌクレオチドプローブまたはｃＤＮ ＡクローンはゲノムのＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって実際のＥＲ Ｔ遺伝子を単離するために用いることができる。一連のゲノムＤＮＡクローンは 、ＥＲＴｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションによってトマト（Lycopersicon e sculentum ）から既に単離されている。これらのゲノムクローンのうち３種をブ ダペスト条約の取り決めに従い、ザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・イン ダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（The National Collections of In dustrial and Marine Bacteria（23 St Machar Drive，Aberdeen，Scotland，AB 2 1RY））に寄託した： ＥＲＴ１（ｐＥＲＴ１ｂに関連するゲノムＤＮＡ）は１９９３年１２月２４日 に受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４０６０６で寄託された。 ＥＲＴ１０（ｐＥＲＴ１０に関連するゲノムＤＮＡ）は１９９３年１２月２４ 日に受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４０６０７で寄託された。 ＥＲＴ１５（ｐＥＲＴ１５に関連するゲノムＤＮＡ）は１９９３年１２月２４ 日に受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４０６０８で寄託された。 ＥＲＴのゲノム配列は、（ｇＥＲＴ１、ｇＥＲＴ１０、ｇＥＲＴ１５と設計さ れた）複製のために大腸菌Ｋ８０３平板培養細胞を用いてλバクテリオファージ ＥＭＢＬ３に挿入された。 このようなゲノムＤＮＡ配列は遺伝子プロモーター（転写開始配列）の起源と しても利用することができる。ゲノムクローンは植物ゲノムにおいて働く調節配 列を含有していても良い。従ってＥＲＴタンパク質または他のタンパク質の発現 のために用いられるプロモーター配列を単離することもできる。これらのプロモ ーターは特に成熟関連の事項及び条件に反応性があるものでも良い。ＥＲＴ遺伝 子プロモーターは標的遺伝子の発現をさせるために利用することができる。 ＥＲＴ ＤＮＡ配列を得る他の方法は、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １からＳ ＥＱ ＩＤ ＮＯ １０のいずれか１つを基にして適当な塩基から最初から合成 することである。 ＥＲＴ成熟関連タンパク質または酵素をコード化するＤＮＡ配列は、トマトか らのみでなく適当な植物種からも単離することができる。好適な遺伝子の他の起 源としては、細菌、酵母、低級及び高等の真核生物がある。 ＥＲＴ配列は植物の形質転換のために適したＤＮＡ構築物中に挿入することが できる。これらのＤＮＡ構築物は植物におけるＥＲＴ遺伝子の発現を修飾するた めに利用することができる。成長及び成熟中の果実におけるＥＲＴタンパク質の 発現を減少させるために、“アンチセンス”または“部分的センス”、あるいは 他の技術を用いることができる。ＥＲＴタンパク質の量は、例えば、（１個また は複数の）ＥＲＴ配列を更に挿入することによって増加させることもできる。挿 入する配列は果実における発現の、同様または異なる、空間的及び一時的なパタ ーンを与えるように設計することができる。ＥＲＴ遺伝子活性の全体のレベル及 び個々のＥＲＴタンパク質／酵素の相対的な活性は、植物（特に果実）の成長に 影響し、そして植物／果実の特性を決定する。従ってＥＲＴタンパク質／酵素活 性の修飾は、同様の成長段階で修飾されていない同様の植物または果実と比較し て、植物または果実の品質の種々の面を修飾するために用いることができる。 本発明は更にＥＲＴ１ｂ、ＥＲＴ１０、ＥＲＴ１３、ＥＲＴ１４、ＥＲＴ１５ 、ＥＲＴ１６ｂ、ＥＲＴ１７、ＥＲＴＤ１、ＥＲＴＲ１及びＥＲＴＳ２からなる 群から選ばれるＥＲＴクローンによってコード化される、またはハイブリダイゼ ーションプローブとして該クローンを利用することによって得られるＤＮＡ配列 を含有するＤＮＡ構築物を提供する。該ＤＮＡ配列は植物中で働く転写開始領域 の統制下にあり、そのために構築物は植物細胞内でＲＮＡを生成することができ る。こうしたＤＮＡ構築物は“アンチセンス”ＲＮＡを生成する“アンチセンス ”構築物でも、“センス”ＲＮＡを生成する（少なくとも機能的なＥＲＴタンパ ク質の１部をコード化する）“センス”構築物でも良い。“アンチセンスＲＮＡ ”とは、相当するｍＲＮＡの塩基配列に相補的、すなわち、（センスの３’から ５’ に向かって読まれる）アンチセンス配列のそれぞれの塩基（または塩基の多数） が、センスの５’から３’に向かって読まれるｍＲＮＡ配列における相当する塩 基（ＣとＧ、ＡとＵ）と対になることができるという意味で相補的なＲＮＡ配列 である。このようなアンチセンスＲＮＡは、関連遺伝子の（またはこれと実質的 な相同性を示すＤＮＡ配列の）コーディング鎖の少なくとも１部に相補的な配列 の少なくとも１部を有する転写物を生成するように配置された適当なＤＮＡ構築 物で形質転換することによって、細胞内で製造できる。“センスＲＮＡ”とは、 相当するｍＲＮＡ配列の少なくとも１部に実質的に相同なＲＮＡ配列である。こ のようなセンスＲＮＡは、関連遺伝子の（またはこれと実質的な相同性を示すＤ ＮＡ配列の）コーディング鎖の少なくとも１部に同一の配列を有する転写物を生 成するように正常な方向に配置された適当なＤＮＡ構築物で形質転換することに よって、細胞内で製造できる。好適なセンス構築物は、（国際公開公報ＷＯ９１ ／０８２９９号に記載されたように）遺伝子発現を阻害するため、またはタンパ ク質／酵素の過剰発現をさせるために用いることができる。 転写開始領域は植物内で働くプロモーターから得ることができる。転写開始領 域は（ＤＮＡ構築物を完全な、または部分的なアンチセンス構築物にする）ＥＲ Ｔ遺伝子によって作られるタンパク質をコード化するｍＲＮＡの塩基の実質的な 並び方に相補的なＲＮＡをコード化するＤＮＡ配列の転写のために配置すること ができる。 植物の部分、特に果実の性質は本発明に従い、ＤＮＡ構築物で形質転換するこ とで修飾することができる。本発明はまたこうした構築物を含有する植物細胞； 修飾された成熟の性質を示すこの細胞由来の植物；及びそのような植物の種子を 提供する。 本発明の構築物は成熟関連ＥＲＴクローンに相同の遺伝子によってコード化さ れるタンパク質の生成を調節するために植物中に挿入することができる。構築物 はいずれの双子葉植物または単子葉植物へも導入される。構築物の性質に従い、 タンパク質の生成は植物の生涯を通して、または特定の段階で増加し、または減 少する。一般に、予想されるように、タンパク質の生成は実質的に完全な内在性 のＥＲＴｍＲＮＡに相同のＲＮＡを発現する構築物によってのみ増大する。完全 な遺伝子に相当するよりも短い不完全なＤＮＡ配列を含有する構築物は、センス またはアンチセンスＲＮＡを発現するように配置されていても、一般に遺伝子発 現及びタンパク質の生成を阻害する。完全な長さのアンチセンス構築物も遺伝子 発現を阻害する。 本発明を適用できる植物は市販されている重要な実のなる植物、特にトマトを 含む。この意味で、他の表現型の修飾の中で、以下の果実の性質の１つまたはそ れ以上を有する植物が製造される。 成熟の遅延及び過剰成熟過程による収穫、梱包及び輸送中のダメージに対する 抵抗性の改善； 崩壊経路（例えば細胞壁の加水分解）の活性の減少による店頭での寿命の長期 化及び貯蔵状態の改善； 粘度、固さ、ｐＨ、弾性のような因子に寄与するタンパク質／酵素の活性を変 えることによるプロセシングの性質の改善； 糖／酸バランス及び成熟果実の性質に寄与する他の味や香りの成分の修飾によ る販売時点での味や香りの改善； 色素（例えばリコペン、ｂ−カロテン、カルコン類及びアントシアニン類）の 生合成経路に関与する酵素活性を変えることによる色の修飾； 真菌類のような収穫後の病原体に対する抵抗性の増加。 ＥＲＴタンパク質の活性は、修飾された植物の部分（果実、葉、花等）に要求 される性質に応じて増加または減少させても良い。ＥＲＴタンパク質のレベルは 、例えば、更にＥＲＴ遺伝子を挿入することによって増加させることができる。 挿入される遺伝子は果実中で同様、または異なる部分的または一時的な発現パタ ーンを示すように設計することができる。ＥＲＴタンパク質の発現を減少させる ために“アンチセンス”または“部分的センス”、あるいは他の技術を用いるこ とができる。 それぞれのＥＲＴタンパク質または酵素の活性は個々に、あるいは１つまたは それ以上の他のＥＲＴタンパク質／酵素の活性の修飾と併せて修飾することがで きる。更に、ＥＲＴタンパク質／酵素の活性は果実の成熟またはこれに関連する 過程に関与する他の酵素の活性の修飾と併せて修飾することができる。 本発明のＤＮＡ構築物はＲＮＡに転写するために少なくとも１０塩基の長さ（ 好ましくは少なくとも３５塩基の長さ）の塩基配列を含有する。塩基配列に理論 的には上限はない−細胞によって作られる関連のｍＲＮＡと同じ位の長さでも良 い−が、便宜的には一般に１００から１０００塩基の長さの配列を用いるのが好 適であることがわかるであろう。このような構築物の調製は以下により詳細に記 載する。 転写のためのＤＮＡ塩基配列の起源として、適当なｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡま たは合成ポリヌクレオチドを用いることができる。好適なＥＲＴ配列の単離は上 記の通りである；AberdeenのＮＣＩＭＢに寄託されたＥＲＴクローンに由来する ＤＮＡ配列を用いるのが便利である。適当なＥＲＴタンパク質の全体、または実 質的に全体をコードする配列がこうして得られる。このＤＮＡ配列の適当な長さ のものが制限酵素によって利用のために切り取られる。転写のための塩基配列の 起源としてゲノムＤＮＡを用いる場合は、イントロンまたはエクソン領域、ある いはこれらの組み合わさったものを利用することができる。 植物細胞における適当なＥＲＴ関連配列の発現のために好適な構築物を得るた めに、ｐＥＲＴプラスミドの１つにみられるｃＤＮＡ配列、あるいはｇＥＲＴベ クターまたは植物の染色体中にみられる遺伝子配列が利用できる。標準的な技術 を用いて組換えＤＮＡ構築物を作ることができる。例えば、転写のためのＤＮＡ 配列が該配列を含有するベクターを制限酵素で処理して適当な部分に切り取るこ とによって得られる。転写のためのＤＮＡ配列はまた、合成オリゴヌクレオチド のアニーリング及び結合により、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に合成 オリゴヌクレオチドを用いることにより、それぞれの末端に適当な制限部位を有 するように作ることができる。次いで上流にプロモーター配列を、下流にターミ ネーター配列を有するベクターにＤＮＡ配列をクローン化する。アンチセンスＤ ＮＡが必要であれば、切り取ったＤＮＡ配列が切り取られた鎖中の配列と逆向き になるようにクローニングを行う。 アンチセンスＲＮＡを発現する構築物において、前に鋳型鎖であった鎖はコー ド鎖（coding strand）になり、また、前にコード鎖であった鎖は鋳型鎖となる 。構築物はこうしてＥＲＴタンパク質をコード化するｍＲＮＡの１部または全て の配列に相補的な塩基配列のＲＮＡをコード化することができる。こうして２本 のＲＮＡ鎖が塩基配列だけでなくその方向性（５’から３’）においても相補的 である。 センスＲＮＡを発現する構築物において、鋳型鎖及びコード鎖は、基になる植 物遺伝子の内容及び方向性を保持している。センスＲＮＡを発現する構築物は、 ｍＲＮＡの１部または全ての配列に相同な塩基配列のＲＮＡをコード化する。機 能的なＥＲＴタンパク質を発現する構築物では、遺伝子のコード領域の全体が植 物において発現できる転写調節配列につながっている。 例えば、本発明の構築物は以下のように作成することができる。転写のために 要求される塩基配列を含有する適当なベクター（ｐＥＲＴまたはｇＥＲＴベクタ ーのようなもの）を制限酵素で処理して配列を切り取る。得られたＤＮＡ鎖を必 要なプロモーター配列及び必要なターミネーター配列を有する第二のベクターに （必要であれば逆向きに）クローン化する。好適なプロモーターとしては、３５ ｓカリフラワーモザイクウイルスのプロモーター及びトマトのポリガラクツロナ ーゼ遺伝子のプロモーター配列（Bird et al，1988，Plant Molecular Biology ，11:651-662）または他の成長段階で調節される果実のプロモーターがある。好 適なターミネーター配列としてはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agro bacterium tumefaciens）のノパリン（nopaline）合成遺伝子（nos３’末端）の ものがある。 植物で働く転写開始領域（またはプロモーター）は、状況に応じて（３５ｓカ リフラワーモザイクウイルスプロモーターのような）構成的プロモーターでも、 あるいは（果実特異的プロモーターのような）誘導性または成長段階で調節され るプロモーターでも良い。例えば、ＥＲＴタンパク質の活性を修飾することは、 果実の成長及び／または成熟段階においてのみ必要である。構成的プロモーター の利用は植物の全部分のＥＲＴタンパク質レベル及び機能に影響する傾向があり 、 一方、組織特異的プロモーターの利用は遺伝子発現及びこれに影響される機能の より選択的な調節ができる。このように本発明を（例えばトマトに）適用するに あたり、果実の成長及び／または成熟中の遺伝子を発現させるプロモーターを利 用するのが便利であることがわかる。このようにして、その作用が必要である器 官においてのみ、及び／または必要な時期にのみアンチセンスまたはセンスＲＮ Ａが作られる。利用できる果実の成長及び／または成熟特異的なプロモーターと しては、成熟増大性ポリガラクツロナーゼプロモーター（国際特許出願公開番号 ＷＯ９２／０８７９８号）、Ｅ８プロモーター（Diekman & Fischer，1988，EMB O 7:3315-3320）、果実特異的２Ａ１１プロモーター（Pear et al，1989，Plant Molecular Biology，13:639-651）、ヒスチジン脱炭酸酵素プロモーター（HDC ，Sibia）及びフィトエン（phytoene）シンターゼプロモーターがある。 ＥＲＴタンパク質または酵素活性（及び成熟関連過程及び果実成熟の性質）は 、植物細胞中での適当なＥＲＴタンパク質のセンスまたはアンチセンスｍＲＮＡ の生成度合を調節することによって、より大きい、またはより小さい程度に修飾 することができる。これは、プロモーター配列の適当な選択によって、または植 物ゲノム中に導入されるＤＮＡ配列のコピーまたは統合部位の数を選択すること によって、達成できる。例えば、ＥＲＴタンパク質をコード化する２個以上のＤ ＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物、または２個以上の組換え構築物をそれそれの 植物細胞中に導入することができる。 それぞれのＥＲＴタンパク質の活性は、ＥＲＴ配列を含有する適当なＤＮＡ構 築物で形質転換することによって別々に修飾することができる。更に、細胞に２ 種またはそれ以上の別々の構築物：（ＥＲＴ１ｂのような）最初のＥＲＴ配列を 含有する最初のものと、（ＥＲＴ１０及び／またはＥＲＴ１３等のような）第二 のＥＲＴ配列を含有する第二の（またはそれ以上の）もの、を導入することによ って、２種またはそれ以上のＥＲＴタンパク質の活性を同時に修飾することがで きる。あるいはまた、植物細胞は最初のＥＲＴ配列及び第二のＥＲＴ配列を共に 含有する１個のＤＮＡ構築物で形質転換することができる。 １個またはそれ以上の他の酵素の活性を修飾すると共にＥＲＴタンパク質の活 性を修飾することも可能である。他の酵素は細胞の代謝または果実の成長及び成 熟に関与するものであっても良い。ＥＲＴタンパク質と共に修飾することのでき る細胞壁代謝酵素としては、ペクチンエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、β −ガラクタナーゼ、β−グルカナーゼがあるが、これらに限定されるものではな い。ＥＲＴタンパク質と共に修飾することのできる、果実の成長及び成熟に関与 する他の酵素としては、エチレン生合成酵素、フィトエンシンターゼを含むカロ テノイド生合成酵素、インベルターゼを含む炭水化物代謝酵素があるが、これら に限定されるものではない。 他の酵素と共にＥＲＴタンパク質の活性を修飾するために、数種の方法が利用 できる。例えば、最初の植物をＥＲＴ構築物で形質転換し、次いでもう１つの酵 素をコード化する構築物で形質転換した第二の植物と交配させても良い。更に別 の例として、植物をＥＲＴ構築物及び他の酵素の活性を修飾する適当な構築物で 連続して、または同時に形質転換させても良い。また別の例としては、他の酵素 の活性を修飾する別の遺伝子をそれ自体含有するＥＲＴ構築物での植物の形質転 換がある。ＥＲＴ構築物は、ＥＲＴ配列に隣接する他の酵素の発現の調節のため のＤＮＡ配列を含有していても良い。これらの別の配列は国際特許出願の公開番 号ＷＯ９３／２３５５１号に記載されているようにセンスまたはアンチセンスの 方向のいずれでも良い（異なる標的遺伝子に相同なＤＮＡ領域を有する１個の構 築物）。こうした方法を用いることにより、ＥＲＴタンパク質の活性を修飾する 利点は他の酵素の活性を修飾する利点とつながるかもしれない。 本発明のＤＮＡ構築物は標的植物細胞中に導入される。標的植物細胞は全植物 の１部であっても、全植物に再生できる単離細胞または組織の１部であっても良 い。標的植物細胞は単子葉植物または双子葉植物のいずれの種からも選択できる 。好適な植物としては、（トマト、マンゴー、桃、リンゴ、梨、サクランボ、バ ナナ、メロンのような）果実のなる植物のいずれでも良い。特定の植物細胞にお いて、形質転換構築物として用いるＥＲＴ配列は同じ植物種由来のものでも良く 、また（関連するイソ酵素の遺伝子発現を修飾できる程度に十分な配列の相似性 があるような）他の植物種由来のものでも良い。 本発明に係る構築物は適当な形質転換技術を用いて植物を形質転換し、本発明 に係る植物を作るために用いられる。単子葉植物及び双子葉植物の細胞が共に、 当業者に知られる種々の方法で形質転換させることができる。多くの場合、こう した植物細胞（特に双子葉植物細胞の場合）は、遺伝学的に修飾された植物を続 けて生産できるような全植物を再生するように培養される。例えば、トマトやメ ロンのような双子葉植物は、Bevan（1984，Nucleic Acid Research，12:8711-87 21）またはPillattiら（Biotechnology，July 1987，5:726-730）の記載するよ うに、アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔｉプラスミドによって形質転換 させることができる。このように形質転換させた植物は、性的に、あるいは細胞 または組織培養によって再生産させることができる。 形質転換植物及びその子孫は、要求される性質を有する改良植物のラインを生 じさせる標準的な育種計画に用いることができる。例えば、本発明に係るＥＲＴ 構築物を発現する実のなる植物を育種計画に組み入れて果実成熟の性質及び／ま たは果実の品質を変えることができる。こうして変えられた果実は、実質的な育 種計画の後、一連の有利な性質を既に有する優良株（elite lines）から容易に 得ることができる：これらの優良株は１個の標的ＥＲＴタンパク質／酵素の発現 を修飾することによって更に改良され、果実に特定の要求品質を与えることがで きる。 植物を本発明に係るＤＮＡ構築物で形質転換することにより、１種またはそれ 以上のＥＲＴタンパク質の発現レベルの変化した（増加または減少した）植物を 、このようなＥＲＴタンパク質を生成するＲＮＡに相同する、または相補的なセ ンスまたはアンチセンスＲＮＡを生成し得るＤＮＡの植物ゲノム中への存在の結 果として、製造することができる。果実のなる植物において、果実は伝統的な方 法を用いて成長させ、刈り取ることによって得ることができる。種子はこうした 果実から伝統的な方法（例えば、トマトの種子は熟した果実の果肉から選別して 乾燥し、次いで１つまたはそれ以上の季節の間貯蔵させても良い）で得ることが できる。遺伝学的に修飾された果実由来の繁殖力のある種子は、成長して更に同 様に修飾された植物及び果実を生産することができる。 遺伝学的に修飾された植物及びその子孫から得られる果実は、生または料理し てすぐに食するために販売しても、また缶詰にしたり、スープ、ソース、または ペーストにしたりしても良い。同様に、本発明に係る種子を提供するために利用 しても良い。 遺伝学的に修飾された植物（形質転換された植物及びその子孫）では、ＥＲＴ ＤＮＡ構築物について異型接合体であっても良い。このような植物の自己受精 で得られる種子は、ＤＮＡ構築物が１個のメンデルの遺伝子のようにふるまい、 メンデルの法則に従って分布する集団である：例えば、このような植物が構築物 の１個のコピーのみを含有する場合、種子の２５％は構築物の２個のコピーを含 有し、５０％は１個のコピーを含有し、２５％はコピーを全く含有しない。従っ て自己受精した植物の子孫の全てが本発明に係る果実及び種子を作るわけではな く、それら自体が定められた特性について異型接合体または同型接合体である。 ＥＲＴ ＤＮＡ構築物において同型接合体である種子ストックを維持することが 便利である。このような種子ストックの全ての交配により、構築物の少なくとも １個のコピーが含有され、自己受精した子孫は２個のコピーを含有するだろう。 すなわちこの性質において同型接合体である。このような同型接合体の種子スト ックは標識のために異型接合体の種子を作るためのＦ１交配の一方の親として便 利に利用することができる。このような種子、及びこれから得られる果実は、我 々の発明の更に別の面を形成する。我々は更に、少なくとも１個はＥＲＴ ＤＮ Ａ構築物が同型接合体である２種の親株（parent lines）を交配することからな る、ＥＲＴ ＤＮＡ配列を発現するＦ１ハイブリッド植物を作る方法を提供する 。Ｆ１ハイブリッド種子を作成する方法は、ＥＲＴ ＤＮＡ構築物が同型接合体 である遺伝学的に修飾された果実をつけることのできる植物を作成し、そのよう な植物を第２の同型接合体のものと交配し、そしてＦ１ハイブリッド種子を回収 することからなる。本発明により、２種またはそれ以上の果実−成熟−関連ＥＲ Ｔタンパク質の発現の減少につながる２種またはそれ以上の構築物を含有する植 物の種子を得るために、ＥＲＴ ＤＮＡ構築物の異なる２種またはそれ以上の植 物を形質転換し、生じる子孫を交配することができる。 ここでさらに図に関して本発明を説明する： 図１はＣａＭＶ ３５Ｓ ３’末端を持たないＥＲＴ１アンチセンス構築物の 構築を示すダイアグラムである。 図２はＣａＭＶ ３５Ｓ ３’末端を持つＥＲＴ１アンチセンス構築物の構築 を示すダイアグラムである。 図３はＥＲＴ１ｂアンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。 図４はＣａＭＶ ３５Ｓ ３’末端を持たないＥＲＴ１０アンチセンス構築物 の構築を示すダイアグラムである。 図５はＣａＭＶ ３５Ｓ ３’末端を持つＥＲＴ１０アンチセンス構築物の構 築を示すダイアグラムである。 図６はＥＲＴ１３センス構築物の構築を示すダイアグラムである。 図７はＥＲＴ１４アンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。 図８はＥＲＴ１５アンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。 図９はＥＲＴ１６アンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。 図１０はＥＲＴ１７アンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。 図１１はＥＲＴＲ１アンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。 配列表に関しても本発明を説明する： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １はｃＤＮＡクローンＥＲＴ１ｂの塩基配列を示してい る。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２はｃＤＮＡクローンＥＲＴ１０の塩基配列を示してい る。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３はｃＤＮＡクローンＥＲＴ１３の塩基配列を示してい る。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４はｃＤＮＡクローンＥＲＴ１４の塩基配列を示してい る。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５はｃＤＮＡクローンＥＲＴ１５の塩基配列を示してい る。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６はｃＤＮＡクローンＥＲＴ１６ｂの塩基配列を示して いる。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７はｃＤＮＡクローンＥＲＴ１７の塩基配列を示してい る。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８はｃＤＮＡクローンＥＲＴＤ１の塩基配列を示してい る。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９はｃＤＮＡクローンＥＲＴＲ１の塩基配列を示してい る。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０はｃＤＮＡクローンＥＲＴＳ２の塩基配列を示して いる。 以下の実施例は本発明の態様を例示している。 実施例１ トマト野生型成熟果実ｃＤＮＡライブラリーの構築 トマト（リコペルシコン エスキュレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅ ｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ）Ｍｉｌｌ．ｃｖ Ａｌｉｓａ Ｃｒａｉｇ）＋／＋およびｒｉｎ ／ｒｉｎ遺伝子型）を標準条件下で成長させた。開花期に花に付箋を付け 、非常に早期のブレーカー段階（very early-breaker stage）、果実の色素形成 変化が最初に明らかになった時に果実を除去した。この段階は開花期後４３から ４８日に対応する。果皮試料は液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。全ＲＮ Ａは前に記載したようにプールした約４つの果実の果皮から抽出された。ポリ（ Ａ）⁺ｍＲＮＡはＰＯＬＹ（Ａ）ＱＵＩＫ ｍＲＮＡ精製キットを用い、使用説 明書に従ってオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーにより単離された（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）。カラムを２回通過させた後、ＲＮＡを分光 学的に定量した。二本鎖ｃＤＮＡはλＺＡＰ ｃＤＮＡ合成キットを用いて約５ μｇのｍＲＮＡから合成された。ｃＤＮＡはλＵＮＩ−ＺＡＰII内へ結合され、 イン ビトロでエンカプセル化し、使用説明書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ ）に従って大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅで直ちに増幅された。 実施例２ ｐＥＲＴクローンの単離 野生型トマト果実ｃＤＮＡライブラリーは＞１０⁶の一次組換え体を示すこと が推定された。一回の増幅工程後の非組換え体は全組換え体の３％未満と推定さ れた。Ｔ３およびＴ７オリゴヌクレオチドプライマーを用い、無作為に選択され たクローンのＰＣＲ後に得られたクローン化ｃＤＮＡの挿入サイズは約１ｋｂを 中心とし、５００ｂｐおよび２．２ｋｂの間にあると推定された。約５ｘ１０⁵ の一次組換え体の一部を１４ｃｍのペトリ皿上でスクリーニングした。ナイロン 膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ⁺，Ａｍｅｒｓｈａｍ ＰＬＣ，ＵＫ）を用いて各々のプ ラークから得られた２重のプラークリフトが得られた。異なったハイブリッド形 成プローブは、前記のように非常に早期のブレーカー野生型またはｒｉｎ果実か ら単離されたポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡの逆転写により得られた。３０−５００，０ ００ｐｆｕの異なったスクリーニング後、早期ブレーカーｒｉｎ果実果皮での蓄 積が減少した５３の可能性のある陽性クローンが単離され、野生型およびｒｉｎ 両方の早期ブレーカー果実で高レベルの蓄積をしめす２つのクローンが同定され 、およびさらに２８のクローンの群のｒｉｎ果実で蓄積が増加していた。プラー ク精製および続いてのインビボでのクローン化挿入物の切除後、１５のｃＤＮＡ が引き続きｒｉｎ果実での蓄積の減少を示し（ｒｉｎ陰性クローン）、野生型お よびｒｉｎ果実の両方で高レベルの蓄積を示す単一のクローン（早期ブレーカー 、ＥＢ、クローン）が同定され、および早期ブレーカーｒｉｎ果実の果皮中の蓄 積が増加した１４のクローンの群（ｒｉｎ陽性クローン）もまた得られた。この 最後のクローンの群は８つの交差ハイブリッド形成をするｃＤＮＡおよび６つの さらに独特のクローンを含んでいる。 ｒｉｎ陰性クローンとして記載されたクローンの群にはＥＲＴ１ｂ、ＥＲＴ１ ０、ＥＲＴ１３、ＥＲＴ１４およびＥＲＴ１５が含まれる。 ｒｉｎ陽性クローンとして記載されたクローンの群にはＥＲＴ１７、ＥＲＴＤ １、ＥＲＴＲ１およびＥＲＴＳ２が含まれる。 ＥＲＴ１６は成熟の早期段階で野生型およびｒｉｎ突然変異体果実の両方にお いて高レベルの発現を示した。 実施例３ ＥＲＴ ｃＤＮＡクローンの特徴付け ３．１ ＥＲＴ１ｂ ＥＲＴ１と相同の転写体は１．８ｋｂの大きさであり、野生型果実の成熟の間 にのみ発現されることが観察される。トマトの他の器官には観察されない。その 発現は果実成熟の早期段階（例えば、ブレーカープラス３）に最も高い。この後 ＥＲＴ１ ｍＲＮＡのレベルは減少する。このｍＲＮＡの発現レベルはｒｉｎ突 然変異体では低く、成熟ｒｉｎトマトでは制限されている。この遺伝子は傷によ っても活性化されない。ＥＲＴ１と相同のｍＲＮＡのレベルは突然変異体果実の エチレン処理により増加した。 ＥＲＴ１（１５４１塩基対）の最初の配列分析はクローンが完全長ではなかっ たことを示し（得られた転写体のサイズを参考にすることにより）、より長いク ローンを探すためにｃＤＮＡライブラリーが再スクリーニングされた。クローン 、ＥＲＴ１ｂが単離され、配列決定された。ＥＲＴ１ｂはＥＲＴ１と全部相同で あるがより長いものであった（１６６９塩基対）。完全長ＥＲＴ１ ｃＤＮＡの ために、ライブラリーを再スクリーニングするさらなる試みがなされている。 ＥＲＴ１ｂの完全ＤＮＡ配列および演繹されるアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されている。ＥＲＴ１ｂ配列はＥＭＢＬデータベースに登録されて いる（受託番号ｘ７２７２９）。 ＥＲＴ１ｂのＯＲＦはトウモロコシ（６９％の類似性、４０３アミノ酸の領域 に渡って２６．３％の同一性、受託番号Ｐ１６１６５−７）および大麦（６９． ５％の類似性、３５４アミノ酸の領域に渡って２７．１％の同一性、受託番号Ｐ １４７２６）のＵＤＰフラボノール−３−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ（ ＥＣ２．４．１．９１）、およびラット（６４．９％の類似性、２３２アミノ酸 の領域に渡って２５％の同一性、受託番号Ｐ０８４３０）およびヒト（６６．２ ％の類似性、１１４アミノ酸の領域に渡って３０．７％の同一性、受託番号Ｐ１ ９２２４）のＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１ ７）のアミノ酸配列に類似していた。転写されたＡ タリアナ（ｔｈａｌｉａｎ ａ ）配列（クローンＹＡＰ００４Ｔ７）とＤＮＡレベルでの相同性もまた示され 、トウモロコシ フラボノール−３−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ（２７ ９ｂｐのオーバーラップ中５０．１％の同一性、受託番号Ｚ１７５７９）と相同 であった。 ３．２ ＥＲＴ１０ ＥＲＴ１０と相同の転写体は１．３５ｋｂの大きさであり、野生型果実の成熟 の間にのみ発現されることが観察される。トマトの他の器官には観察されない。 その発現は果実成熟の早期段階（例えば、ブレーカープラス３）に最も高い。こ の後ＥＲＴ１０ ｍＲＮＡのレベルは減少する。このｍＲＮＡの発現レベルはｒ ｉｎ 突然変異体では低く、成熟ｒｉｎトマトでは制限されている。この遺伝子は 傷によっても活性化されない。 ＥＲＴ１０の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されている。ＥＲＴ１０配列 はＥＭＢＬデータベースに登録されている（受託番号ｘ７２７３０）。 ＥＲＴ１０のＯＲＦから誘導されるアミノ酸配列は短鎖または”昆虫−型”ア ロコールデヒドロゲナーゼファミリー（触媒活性および／またはいくつかのデヒ ドロゲナーゼのサブユニット結合にチロシン残基が含まれていることが知られて いる）と完全に一致しているが、ただしグルコースデヒドロゲナーゼと相同の付 加的な領域も示している。 ３．３ ＥＲＴ１３ ＥＲＴ１３と相同の転写体は１．１ｋｂの大きさであり、野生型果実の成熟の 間にのみ発現されることが観察される。トマトの他の器官には観察されない。そ の発現は果実の成長過程で増加し、ブレーカー段階あたりで（例えば、ブレーカ ープラス３）に最も高い。この後ＥＲＴ１３ ｍＲＮＡのレベルは減少する。こ のｍＲＮＡの発現レベルはまたｒｉｎ果実の果実発育の早期段階でも高い。ＥＲ Ｔ１３はｒｉｎトマトの葉および傷つけられた葉でも発現される。この遺伝子は 傷によっても活性化されない。ＥＲＴ１３と相同のｍＲＮＡのレベルは突然変異 体果実のエチレン処理により増加した。 ＥＲＴ１３の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に示されている。ＥＲＴ１３配列 はＥＭＢＬデータベースに登録されている（受託番号ｘ７２７３１）。 ＤＮＡ配列データベースの検索により、ＥＲＴ１３ ｃＤＮＡ配列とポテトＴ ＵＢ８ ｃＤＮＡ配列間に相同性が同定された。ＴＵＢ８はソラナム ツベロサ ム （Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からの遺伝子であり、ポテトの異な った器官において塊根形成の早期段階に誘導される（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ ，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０：６４１ −６５１）；コードされている蛋白質の構造的役割が示唆されている（葡匐枝先 端蛋白質であろう）。 ３．４ ＥＲＴ１４ ＥＲＴ１４と相同の転写体は０．８５ｋｂの大きさである。その発現はブレー カー１日後に最高であり、ブレーカーおよび早期果実発育段階でも高レベルの発 現が検出可能である。果実成熟の間、ＥＲＴ１４の発現は減少する。発現はまた 、ｒｉｎ果実の果実発育時および傷つけられたおよび無傷の対照およびｒｉｎ葉 でも検出可能である。ＥＲＴ１４と相同のｍＲＮＡのレベルは突然変異体果実の エチレン処理により増加した。 ＥＲＴ１４の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示されている。ＥＲＴ１４配列 はＥＭＢＬデータベースに登録されている（受託番号ｘ７２７３２）。 ＤＮＡおよび蛋白質配列データベースの検索では相同性は同定できなかった。 ３．５ ＥＲＴ１５ ＥＲＴ１５と相同の転写体は６．０ｋｂの大きさである。その発現はブレーカ ー１日後に最高であり、ブレーカーの間も高レベルの発現が検出可能であったが 、早期果実発育段階ではそうではなかった。果実成熟の間、ＥＲＴ１５は減少す る。ｒｉｎ果実において、発現は黄色段階でのみ検出可能であった。傷つけられ たおよび無傷の対照およびｒｉｎ葉でもＥＲＴ１５発現は検出可能である。 ＥＲＴ１５の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５に示されている。ＥＲＴ１５配列 はＥＭＢＬデータベースに登録されている（受託番号ｘ７２７３４）。 ＤＮＡおよび蛋白質配列データベースの検索では相同性は同定できなかった。 ３．６ ｐＥＲＴ１６ｂ ＥＲＴ１６を用いて、より長いクローンを探すためにｃＤＮＡライブラリーが 再スクリーニングされた。さらなるクローン、ＥＲＴ１６ｂが単離され配列決定 された。ＥＲＴ１６ｂ転写体は約１．０ｋｂと推定された。 ＥＲＴ１６ｂがコードするｍＲＮＡはトマト果実の発育および成熟の間に発現 されることが示されている。ＥＲＴ１６ｂ ｍＲＮＡは未熟な緑の果実でも容易 に検出可能であり、果実発育を通して増加し、ブレーカー５日後からブレーカー ７日後の間に発現のピークに達する。後期成熟段階でもレベルは高いままである 。 ｒｉｎ突然変異体果実において、ＥＲＴ１６ｂの発現は対照トマトの発現と類 似していた。低エチレントマト（例えば、低ＥＦＥトマト）において、ＥＲＴ１ ６ｂ ｍＲＮＡのレベルは調べられた任意の成熟段階において非修飾トマト果実 で観察されたレベルと同じであった。一方、ＥＲＴ１６ｂ ｍＲＮＡはトマトの 葉または傷つけた葉には観察されなかった。 ＥＲＴ１６ｂの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６に示されている。ＥＲＴ１６ｂ 配列はＥＭＢＬデータベースに登録されている（受託番号ｘ７２７３３）。 Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ ＳＥＲＣシステム（ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ）のヌク レオチド配列データベースの検索において、ＥＲＴ１６ｂ配列は成熟トマト果実 果皮に由来するｃＤＮＡの配列と相同であった。付随する転写体は葉での水スト レスおよび果実の成熟により誘導される（ＮＤ Ｌｕｓｅｍ、ＤＭ Ｂａｒｔｈ ｏｌｏｍｅｗ およびＰＡ Ｓｃｏｌｎｉｋにより寄託された配列；受託番号Ｌ ０８２５５，ＴＯＭＡＳＲＩＰ）。相同性は６３２ヌクレオチド（完全長のＥＲ Ｔ１６ｂ配列）に渡って９８．９％である。 ３．７ ＥＲＴ１７ ＥＲＴ１７ ｍＲＮＡは果実発育時に検出され、成熟が始まった後にピークと なる。それは葉に存在し、老化および機械的に傷つけられた葉組織でレベルが増 加する。成熟、傷つけおよび葉老化はすべてエチレン媒介過程であるが、果実の ＥＲＴ１７ ｍＲＮＡ蓄積はエチレン処理により増加せず、従ってそのエチレン 発生との相互関係は偶然のようである。これらの成熟した、老化したおよび傷つ けられた組織の最終的な分化は、植物細胞または器官老化の間に起こる選択的な 蛋白質分解におけるこのＥ２_16.5酵素の潜在的な役割を示唆している。 報告されている３つの他の植物Ｅ２（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ａｎｄ Ｖｉｅｓｔ ｒａ，１９８９，１９９１）はすべてＳ．セレビジエ（ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＤＮＡ修復遺伝子、ＲＡＤ６によりコードされているＥ２と高い相同性を示す。 ＥＲＴ１７配列は酵母クラスＩ ＵＢＣ４／ＵＢＣ５タイプＥ２酵素（特にユビ キチン化および非常に短命な、および異常蛋白質の分解にかかわっている）と最 も高い相同性を示し、高等植物から同定されるべきこの群の最初のＥ２である。 ｃＤＮＡの両方の鎖はＳｅｑｕｅｎａｓｅII（プライマーとして使用された既 知の配列への合成オリゴヌクレオチド）とともに二本鎖ミニプレッププラスミド ＤＮＡシークエンシングにより配列決定された。ＥＲＴ１７の配列はＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ ７に示されている。完全ｃＤＮＡおよび演繹されたアミノ酸配列はＧ ｅｎＢａｎｋ、ＤＤＪＢおよびＥＭＢＬデータベースで比較された。ＥＲＴ１７ 配列はＥＭＢＬデータベースに登録されている（受託番号ｘ７２７１９）。 ｃＤＮＡの特徴が分析された。５’隣接領域は１２ヌクレオチド長である。３ ’非翻訳領域は２１２ヌクレオチド長であり、１８塩基対のポリ（Ａ）鎖が続い ている。明かなポリアデニル化シグナル配列は存在しない。配列はＡ．タリアナ クローンＹＡＰ １６１Ｔ７（Ｚ１７６９２）と３９５ｎｔオーバーラップで７ ７．７％の同一性、酵母ＵＢＣ５遺伝子（Ｐ１５７３２）と４１０ｎｔオーバー ラップで７１．２％の同一性、Ａ．タリアナクローンＴＡＹ０５０（Ｚ１８４７ ３）と２４７ｎｔオーバーラップで７８．５％の同一性および酵母ＵＢＣ４遺伝 子（Ｐ１５７３１）と３９６ｎｔオーバーラップで７０．７％の同一性を持って いる。 演繹された蛋白質の構造特性も分析された。１４８アミノ酸の転写解読枠があ り、予想される蛋白質の分子量は１６．５ｋＤ、ｐＩ７．９５を与えている。Ｆ ＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８ ３：６３−９３）を用いての配列および演繹された蛋白質配列の比較は、酵母Ｕ ＢＣ４（７８％の同一性、９５％の類似性、Ｐ１５７３１）およびＵＢＣ５（７ ５％の同一性、９３％の類似性、Ｐ１５７３２）およびドロソフィラ（Ｄｒｏｓ ｏｐｈｉｌａ ）ＵＢＣ４（７８％の同一性、８９％の類似性、Ｐ２５８６７）と 強い相同性を示した。また、酵母（Ｐ０６１０４、Ｐ２１７３４、Ｐ２３５６６ 、Ｐ１４６８２、Ｐ２８２６３、Ｐ２９３４０）、ドロソフィラ（Ｐ２５１５３ ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（Ｐ２５８６５）、トリチカム （Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（Ｐ２５８６６、Ｐ２５８６８、Ｐ１６５７７）、および 哺乳類（Ｐ２７９２４、Ｐ２３５６７）およびウイルス（Ｐ２７９４９、Ｐ２５ ８６９）源からのさらに１５のユビキチン複合酵素配列と少なくとも３３％の同 一性（または５３％の類似性）がある。演繹されたＥＲＴ１７蛋白質は８５位に ＵＢＣ推定活性システイン残基を含んでいる。 要約すると、クローンＥＲＴ１７は明らかにトマトユビキチン複合酵素をコー ドしている。ＥＲＴ１７はアミノ酸およびＤＮＡレベルの両方でいくつかの発表 されたユビキチン複合酵素と相同である。ユビキチンはすべての真核細胞に見か け上存在する小さくて豊富な蛋白質であり、ＡＴＰ依存性反応により特異的蛋白 質基質に共有結合で連結される。このユビキチン化は続いての細胞性分解のため の標的蛋白質であることが示されている。簡単に記すと、この過程には、ユビキ チン活性化酵素（Ｅ１）により触媒されるユビキチンの活性化、異なった基質特 異性によるユビキチン運搬／複合タンパク質のファミリー（ＵＢＣまたはＥ２） への転移、および最後にＥ２からの直接的転移かまたはユビキチン−蛋白質リガ ーゼ（Ｅ３）を利用する仲介転移によるユビキチン−蛋白質連結が含まれる（Ｈ ｅｒｓｈｋｏ ａｎｄ Ｃｉｅｃｈｎｏｖｅｒ，１９９２，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇ ｅｎｅｔ，２６：１７９−２０７）。 クローンＥＲＴ１７は完全長トマトＵＢＣ ｃＤＮＡ（Ｅ２_16.5）を含んでい る。クローン化ｍＲＮＡは７．９５のｐＩを持つ１６．５ｋＤの誘導１４８アミ ノ酸配列をコードしている。ペプチドは他のＵＢＣまたはＥ２配列で観察された （Ｓｕｌｌｉｖａｎ ａｎｄ Ｖｉｅｓｔｒａ，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：９８６１−９８６５；Ｊｅｎｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，１５：１９５−１９ ８）８５位での推定活性システインを含む保存領域を持ち、ユビキチンとのチオ ールエステル形成に必要とされると考えられている（ｖａｎ Ｎｏｃｋｅｒ ａ ｎｄ Ｖｉｅｒｓｔｒａ，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８８：１０２ ９７−１０３０１）。さらに１０８位に別のシステイン残基が存在している。２ つのシステイン残基の存在および２つのユビキチンチオールエステル種の存在は 小麦およびアラビドプシスＥ２の両方で観察されており、ＵＢＣは同時に１つ以 上のユビキチンと相互作用するであろうことが示唆されている（Ｓｕｌｌｉｖａ ｎ ａｎｄ Ｖｉｅｓｔｒａ，１９９１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６６：２ ３８７８−２３８８５）。 ＥＲＴ１７−関連遺伝子の修飾はユビキチン（ubiquitin）を含む代謝過程（ 蛋白質分解の速度および様式のような）に影響を及ぼし、結果として改変された 表現型を持つ植物を生み出す。 ３．８ ＥＲＴＤ１ ＥＲＴＤ１と相同の転写体は１．８ｋｂの大きさである。 ＥＲＴＤ１と相同の転写体は野生型およびｒｉｎ果実の両方の早期果実発育を 通して観察される。それはまた野生型果実の成熟の早期段階でも観察されるが、 その後消失する。転写体はｒｉｎ果実の全成熟期間を通して検出される。別の言 葉で言えば、転写体は野生型果実の早期成熟の間に消失するが、ｒｉｎ果実の成 熟を通して引き続いて存在する。転写体は野生型またはｒｉｎの両方とも葉また は傷つけられた葉では検出されない。 ＥＲＴＤ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８に示されている。配列はグルタメ ートデカルボキシラーゼと同定された配列を含んでいる。 ３．９ ＥＲＴＲ１ ＥＲＴＲ１と相同の転写体は０．７ｋｂの大きさである。 ＥＲＴＲ１と相同の転写体は野生型およびｒｉｎ果実の両方の早期果実発育を 通して観察される。それはまた野生型果実の成熟の早期段階でも観察されるが、 その後消失する。転写体はｒｉｎ果実の全成熟期間を通して検出される。別の言 葉で言えば、転写体は野生型果実の早期成熟の間に消失するが、ｒｉｎ果実の成 熟を通して引き続いて存在する。転写体は野生型またはｒｉｎの両方とも葉また は傷つけられた葉では検出されない。 ＥＲＴＲ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９に示されている。配列はキチン結 合部位と同定された配列を含んでおり、このクローンは果実特異性キチナーゼで あろうことを示唆している。 ライブラリーの再スクリーニングにより、より長いクローンＥＲＴＲ１Ｂ１お よびＥＲＴＲ１Ｃ１が発見され伸長されたＥＲＴＲ１配列が得られた。配列の始 めの終止コドンは多分、この領域のために得られたシークエンシングゲルの悪い 分解能によるシークエンシングエラーであろう。植物キチナーゼと相同性を示す 推定翻訳生成物の短い領域は塩基番号８９から塩基番号１９１にコードされてお り、一方、共通キチン結合部位を含む領域は塩基番号９５から塩基番号１８０に コードされている。 ３．１０ ＥＲＴＳ１ ＥＲＴＳ１と相同の転写体は４．７ｋｂの大きさであり、ｒｉｎ果実の成熟の 間のみに発現されることが観察されている。野生型果実にも存在するが非常に低 いレベルである。 ＥＲＴＳ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０に示されている；完全長クロー ンではないが、推定された４．５ｋｂの転写体の大きさを持っている。ＤＮＡお よび蛋白質データベースの検索では既知の遺伝子との相同性は不明であった。 実施例４ ゲノムＥＲＴクローンの特徴付け ｃＤＮＡクローンのＥＲＴ系列に対応するゲノムクローンは以下のように同定 された。ゲノムライブラリー（ＣｌｏｎＴｅｃｈ、トマト変種ＶＦＮ８）をプロ ーブとして全ｃＤＮＡ挿入物を用いてＥＲＴでスクリーニングした。各々のクロ ーンは約２００，０００ＰＦＵに対するふるいとして使用された。すべての最初 の丸い陽性物の心を抜いて低密度で再スクリーニングし、必要に応じ、３回目の 再スクリーニングを行って純粋に陽性のプラークを単離した。ゲノムクローンは 以下にリストされ、説明されている。 ４．１ ｇＥＲＴ１ ｇＥＲＴ１はＥＲＴ１ ｃＤＮＡおよび５’ＥＲＴ１ ＰＣＲ断片と相同のゲ ノムクローンである。 遺伝子は果実に高度におよび成熟特異的様式で発現され、傷により誘導されず 、エチレン処理により誘導され、およびｒｉｎトマトには非常に低レベルでのみ 存在した。データはｇＥＲＴ１は単一遺伝子であることを示唆している。それは ＥＲＴ１遺伝子ファミリーの一つであるようであり、ＥＲＴ１ ｍＲＮＡを発現 している遺伝子に密接に関連している。付随するプロモーターは同一の発現パタ ーンを持っているであろう。 ４．２ ｇＥＲＴ１０．１ ｇＥＲＴ１０．１はＥＲＴ１０ ｃＤＮＡおよび５’ＥＲＴ１０ ＰＣＲ断片 と相同のゲノムクローンである。 データ（サザンを含む）はＥＲＴ１０は単一コピーであることを示唆している 。発現は果実で高度であり、および成熟特異的様式で発現され、傷により誘導さ れず、エチレン処理により誘導されず、およびｒｉｎには非常に低レベルで存在 した。 第二のクローン（ｇＥＲＴ１０．２）はＥＲＴ１０ ｃＤＮＡとハイブリッド 形成し、本来５’ＰＣＲ断片で示されるが、それからサブクローンする最初の試 みは成功しなかった。 ４．３ ｇＥＲＴ１３．１ ｇＥＲＴ１３．１はＥＲＴ１３ ｃＤＮＡおよび５’ＥＲＴ１３ ＰＣＲ断片 と相同のゲノムクローンである。 この遺伝子はは単一コピーであるようであり、果実発育を通して発現され、成 熟の間に５０％の上昇を示し、傷によっては誘導されないが、エチレン処理によ り５０％増加した。ｒｉｎにおける蓄積のパターンは成熟の間に上昇を示さなか った。類似のＤＮＡ配列はポテト葡匐枝先端から得られており、同様に根で発現 を示すであろう（制御された様式で）。 第二のクローン、ｇＥＲＴ１３．２、もまた検出された。 ４．４ ｇＥＲＴ１４ ｇＥＲＴ１４はＥＲＴ１４ ｃＤＮＡおよび５’ＥＲＴ１４ ＰＣＲ断片と相 同のゲノムクローンである。 この遺伝子はは単一コピーであるようであり、未熟および成熟果実の両方でお よび葉でもまた有意のレベルで発現される。野生型果実の成熟の間に５０％の上 昇を示すが、ｒｉｎでは示さない。傷では誘導されないが、エチレン処理後は劇 的に増加した。 ４．５ ｇＥＲＴ１５ ｇＥＲＴ１５はＥＲＴ１５ ｃＤＮＡおよび５’ＥＲＴ１５ ＰＣＲ断片と相 同のゲノムクローンである。 この遺伝子はは単一コピーであるようである。その発現は果実で高度であり、 成熟特異的である。葉には低レベルで存在するが、傷またはエチレン処理により 誘導されない。 ４．６ ｇＥＲＴ１６ ｇＥＲＴ１６はＥＲＴ１６ ｃＤＮＡおよび５’ＥＲＴ１６ ＰＣＲ断片と相 同のゲノムクローンである。 この遺伝子はは多遺伝子ファミリーであるようである。果実発育および成熟を 通して遺伝子は活性であるが、葉には存在しない。遺伝子は傷では誘導されない が、エチレンにより誘導される。 実施例５ ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを持つアンチセンスＲＮＡベクターの構築 ｐＥＲＴベクターから得られた制限断片に対応する配列を用い、一致する制限 酵素で切断されているベクターＧＡ６４３（Ａｎ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｐｌ ａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ３：１−１９ ）またはｐＤＨ５１（Ｐｉｅｔｒｚａｋ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４：５８７５−５８６９）内へクローン 化する事によりベクターが構築された。プロモーター、ｐＥＲＴ断片および他の ｐＤＨ５１配列を含むｐＥＲＴ／ｐＤＨ５１クローンからの制限断片はＳＬＪ４ ４０２６ＢまたはＳＬＪ４４０２４Ｂ（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｔ ｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１）またはＢｉｎ１９（Ｂｅｖａｎ， １９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１− ８７２１）内へクローン化され、それによりＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御 下 でのアンチセンスＲＮＡの発現が可能である。 ベクター合成後、配列の構造および向きはＤＮＡ配列分析により確認される。 実施例６ ポリガラクツロナーゼプロモーターを持つアンチセンスＲＮＡの構築 実施例５に記載したｐＥＲＴ ｃＤＮＡの断片はまたベクターｐＪＲ３内へク ローン化される。ｐＪＲ３はＢｉｎ１９に基づいたベクターであり、それにより トマト ポリガラクツロナーゼプロモーターの制御下でのアンチセンスＲＮＡの 発現が可能になる。このベクターは約５ｋｂのプロモーター配列および多クロー ニング部位で分離されたＰＧプロモーターからの１．８ｋｂの３’配列を含んで いる。 合成後、ｐＥＲＴ配列の正しい配向を持つベクターがＤＮＡ配列分析により同 定される。 実施例７ ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを持つ端を切り取ったセンスＲＮＡベクターの構 築 実施例５に記載されたｐＥＲＴ ｃＤＮＡの断片を実施例５に記載したベクタ ー内へセンス配向でクローン化する。 合成後、ｐＥＲＴ配列のセンス配向を持つベクターがＤＮＡ配列分析により同 定される。 実施例８ ポリガラクツロナーゼプロモーターを持つ端を切り取ったセンスＲＮＡベクタ ーの構築 実施例５に記載されたｐＥＲＴ ｃＤＮＡの断片をまたベクターｐＪＲ３内へ センス配向でクローン化する。 合成後、ｐＥＲＴ配列のセンス配向を持つベクターがＤＮＡ配列分析により同 定される。 実施例９ ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いたｐＥＲＴ過剰発現ベクターの構築 ｐＥＲＴ ｃＤＮＡクローンの完全配列を実施例５に記載したベクター内へク ローン化する。 実施例１０ ポリガラクツロナーゼプロモーターを用いたｐＥＲＴ過剰発現ベクターの構築 ｐＥＲＴ ｃＤＮＡクローンの完全配列をｐＪＲ３ベクター内へクローン化す る。 実施例１１ 植物形質転換のために作製された構築物 図１はＣａＭＶ３５Ｓ ３’末端（ターミネーター）を持たないＥＲＴ１アン チセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。ＥＲＴＩはｃＤＮＡクローン であり、ＥＲＴ１ｂより１２８塩基短い。ｐＥＲＴ１をＢａｍＨＩで消化し、生 じた３４０塩基対断片はＢａｍＨＩ切断ｐＤＨ５１内へクローン化した。Ｅｃｏ ＲＩ断片（ＥＲＴ１配列から６０塩基対が除かれたもの）をこのベクターから除 去し、ＥｃｏＲＩ切断ｐＳＬＪ４４０２４Ａ内へ結合させた。 図２はＣａＭＶ３５Ｓ ３’末端を持つＥＲＴ１アンチセンス構築物の構築を 示すダイアグラムである。ｐＥＲＴ１をＢａｍＨＩで消化し、生じた３４０塩基 対断片はＢａｍＨＩ切断ｐＤＨ５１内へクローン化した。ＳａｃＩで消化し、続 いてＥｃｏＲＩで部分消化すると無傷のＣａＭＶ３５Ｓ ３’末端を持つ断片が 得られた。これをＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ切断ｐＳＬＪ４４０２６内へ結合させた 。 図３はＥＲＴ１ｂアンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。ｐＥ ＲＴ１ｂをＢａｍＨＩで消化して５’末端から４９０塩基対断片を放出させ、そ れをＢｇｌＩＩ−切断ｐＧＡ６４３内へ結合させた。 図４はＣａＭＶ３５Ｓ ３’末端（ターミネーター）を持たないＥＲＴ１０ア ンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。ｐＥＲＴ１０をＢａｍＨＩ で消化し、生じた３５０塩基対断片をＢａｍＨＩ切断ｐＤＨ５１内へクローン化 した。ＥｃｏＲＩ断片（ＥＲＴ１０配列から６０塩基対が除かれたもの）をこの ベクターから除去し、ＥｃｏＲＩ切断ｐＳＬＪ４４０２４Ａ内へ結合させた。 図５はＣａＭＶ３５Ｓ ３’末端を持つＥＲＴ１０アンチセンス構築物の構築 を示すダイアグラムである。ｐＥＲＴ１０をＢａｍＨＩで消化し、生じた３５０ 塩基対断片をＢａｍＨＩ切断ｐＤＨ５１内へクローン化した。このベクターをＰ ｖｕＩＩおよびＳａｃＩで消化すると無傷のＣａＭＶ３５Ｓ ３’末端を持つ断 片が得られた。ｐＳＬＪ４４０２６Ｂは最初にＥｃｏＲＩで消化し、クレノー（ Ｋｌｅｎｏｗ）酵素を用いて平滑化された付着末端を得た。ベクターは次にＳａ ｃＩで切断し、ＰｖｕＩＩ／ＳａｃＩ断片をその中に結合させた。 図６はＥＲＴ１３センス構築物の構築を示すダイアグラムである。ｐＥＲＴ１ ３をＳｓｐＩおよびＸｈｏＩで消化して１８０塩基対断片（ポリＡ＋鎖を含んで いる）を放出させた。これをＳｍａＩ／ＳａｌＩ切断ｐＤＨ５１内へ結合させた 。次にＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片をｐＤＨ５１から切断してＥｃｏＲＩ／Ｓａｃ ＩｐＳＬＪ４４０２６Ｂ内へ結合させた。 図７はＥＲＴ１４アンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。ｐＥ ＲＴ１４をＢａｍＨＩおよびＤｒａＩで消化して３００塩基対断片を放出させ、 それをＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ切断ｐＤＨ５１内へ結合させた。ＥｃｏＲＩ／Ｓａ ｃＩ断片をｐＤＨ５１から除去してＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで切断したｐＳＬ Ｊ４４０２６Ｂ内へクローン化した。 図８はＥＲＴ１５アンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。ｐＥ ＲＴ１５をＰｓｔＩで消化して７３０塩基対断片を放出させ、それをＰｓｔＩ切 断ｐＤＨ５１内へクローン化した。次にベクターをＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで 切断し、放出された断片をＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ切断ｐＳＬＪ４４０２６Ｂ内へ 結合させた。 図９はＥＲＴ１６アンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。ｐＥ ＲＴ１６をＸｂａＩおよびＰｖｕＩＩで消化して２５０塩基対断片を放出させ、 それをＸｂａＩ／ＳｍａＩ切断ｐＤＨ５１内へクローン化した。ｐＳＬＪ４４０ ２６Ｂは最初にＥｃｏＲＩで消化し、クレノー酵素を用いて平滑化された付着末 端を得た。このベクターは次にＳａｃＩで切断し、ｐＤＨ５１から切断されたＰ ｖｕＩＩ／ＳａｃＩ断片をその中に結合させた。 図１０はＥＲＴ１７アンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。ｐ ＥＲＴ１７をＰｓｔＩおよびＮｓｉＩで消化して６００塩基対断片を放出させ、 それをＰｓｔＩ切断ｐＤＨ５１内へ結合させた。次にｐＤＨ５１の消化にＥｃｏ ＲＩおよびＳａｃＩを用い、得られた断片をＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ切断ｐＳＬＪ ４４０２６Ｂ内へクローン化した。 図１１はＥＲＴＲ１アンチセンス構築物の構築を示すダイアグラムである。ｐ ＥＲＴＲ１をＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化して４２０塩基対断片を放出させ 、それをＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ切断ｐＧＡ６４３内へ結合させた。 実施例１２ 形質転換した植物の発生 ベクターはアグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４（植物バイオテクノロジー科学 技術者に広く入手可能な微生物）に移され、トマトを形質転換するために使用さ れた。 トマト子葉の形質転換は標準プロトコールに従った（例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１：６ ５１−６６２）。形質転換された植物は抗生物質カナマイシン含有培地でのその 増殖能により同定された。植物を再生し、成熟するまで成長させた。 成熟果実はその成熟特性により分析された。 実施例１３ トランスジェニック植物 表１は実施例１１に記載された種々の構築物を用いて形質転換された多くの植 物を要約したものである。これらの植物およびその果実は現在分析されている。 別の植物も形質転換されている。 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：ゼネカ・リミテッド （ii）発明の名称：ＤＮＡ、ＤＮＡ構築物、細胞およびそれから誘導された植 物 （iii）配列の数：１０ （iv）通信連絡先 （Ａ）連絡先：ＩＣＩグループ特許サービス部 （Ｂ）街：PO BOX 6，SHIRE PARK，BESSEMER ROAD （Ｃ）都市：WELWYN GARDEN CITY （Ｄ）州：HERTFORDSHIRE （Ｅ）国：英国 （Ｆ）ＺＩＰ：ＡＬ７ １ＨＤ （ｖ）コンピューター読み取り形式 （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換 （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：PatentIn Release ＃1.0，バーション＃1.25 （vi）本出願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先の出願のデータ （Ａ）出願番号：ＧＢ ９３０５８６８．３ （Ｂ）出願日：１９９３年３月２２日 （vii）先の出願のデータ （Ａ）出願番号：ＧＢ ９３０５８６９．１ （Ｂ）出願日：１９９３年３月２２日 （vii）先の出願のデータ （Ａ）出願番号：ＧＢ ９３０５８５９．２ （Ｂ）出願日：１９９３年３月２２日 （vii）先の出願のデータ （Ａ）出願番号：ＧＢ ９３０５８６５．９ （Ｂ）出願日：１９９３年３月２２日 （vii）先の出願のデータ （Ａ）出願番号：ＧＢ ９３０５８６６．７ （Ｂ）出願日：１９９３年３月２２日 （vii）先の出願のデータ （Ａ）出願番号：ＧＢ ９３０５８６７．５ （Ｂ）出願日：１９９３年３月２２日 （vii）先の出願のデータ （Ａ）出願番号：ＧＢ ９３０５８６０．０ （Ｂ）出願日：１９９３年３月２２日 （vii）先の出願のデータ （Ａ）出願番号：ＧＢ ９３０５８６２．６ （Ｂ）出願日：１９９３年３月２２日 （vii）先の出願のデータ （Ａ）出願番号：ＧＢ ９３１４３５１．９ （Ｂ）出願日：１９９３年７月１２日 （vii）先の出願のデータ （Ａ）出願番号：ＧＢ ９３２０９８８．０ （Ｂ）出願日：１９９３年１０月１２日 （viii）代理人情報： （Ａ）氏名：ROBERTS，TIMOTHY W （Ｂ）登録番号：（GEN AUTHN）３１４３５ （ix）通信情報： （Ａ）TELEPHONE：（+44）0707 323400 （Ｂ）TELEFAX：（+44）0707 337454 （Ｃ）TELEX：94028500 ICIC G （２）SEQ ID NO:1に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１６６９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vi）起源： （Ａ）生物：ＥＲＴ１Ｂ （xi）配列記載：SEQ ID NO:1： （２）SEQ ID NO:2に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：９４４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vi）起源： （Ａ）生物：ＥＲＴ１０ （xi）配列記載：SEQ ID NO:2： （２）SEQ ID NO:3に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vi）起源： （Ａ）生物：ＥＲＴ１３ （xi）配列記載：SEQ ID NO:3： （２）SEQ ID N0:4に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vi）起源： （Ａ）生物：ＥＲＴ１４ （xi）配列記載：SEQ ID NO:4： （２）SEQ ID NO:5に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７４７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vi）起源： （Ａ）生物：ＥＲＴ１５ （xi）配列記載：SEQ ID N0:5： （２）SEQ ID NO:6に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６４１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vi）起源： （Ａ）生物：ＥＲＴ１６Ｂ （xi）配列記載：SEQ ID NO:6： （２）SEQ ID NO:7に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６８６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vi）起源： （Ａ）生物：ＥＲＴ１７ （xi）配列記載：SEQ ID NO:7： （２）SEQ ID N0:8に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７８３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vi）起源： （Ａ）生物：ＥＲＴＤ１ （xi）配列記載：SEQ ID NO:8： （２）SEQ ID NO:9に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４９７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vi）起源： （Ａ）生物：ＥＲＴＲ１ （xi）配列記載：SEQ ID NO:9： （２）SEQ ID NO:10に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vi）起源： （Ａ）生物：ＥＲＴＳ２ （xi）配列記載：SEQ ID NO:10：

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年３月２７日 【補正内容】差し替え用紙第５７頁〜第５８頁の翻訳文：原翻訳文第４８頁〜第４９頁（請求 の範囲全文）と差し替える。 請求の範囲 １．受託番号ＮＣＩＭＢ４０５４４の下１９９３年３月１８日にザ・ナショナル ・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（Th e National Collections of Industrial and Marine Bacteria）に寄託されたｃ ＤＮＡクローンおよび受託番号ＮＣＩＭＢ４０６０６の下１９９３年１２月２４ 日にザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリ ン・バクテリアに寄託されたゲノムＤＮＡクローンから成る群から選択されるク ローンによってコードされているＤＮＡ配列であるERT1b ＤＮＡ配列を、構築物 が植物細胞においてＲＮＡを生成することができるように植物中で作用する転写 開始領域の調節下において、含む植物形質転換のためのＤＮＡ構築物。 ２．ＤＮＡ配列がSEQ ID NO 1に示される塩基配列を含む請求の範囲第１項に記 載のＤＮＡ構築物。 10．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ構築物による植物の形質転換を含む、対応 する成長段階における未改良の同種の植物と比較した場合に修飾された特性を有 する植物を製造する方法。 11．果実成熟特性を改良するための請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ構築物によ る果実保有植物の形質転換を含む、請求の範囲第１０項に記載の方法。 12．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ構築物で形質転換された植物細胞。 13．請求の範囲第１２項に記載の植物細胞から誘導された植物。 14．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ構築物を含む果実。 15．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ構築物を含む種子。 16．２つのうちの少なくとも１つが請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ構築物に対 してホモである遺伝的に修飾された植物である２つの親株を交配させることを含 む、Ｆ１ハイブリッド植物を製造する方法。 17．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ構築物に対してホモである遺伝的に修飾さ れた植物を製造すること、かかる植物を第２のホモ品種と交配すること、および ＦＩハイブリッド種子を回収することを含むＦ１ハイブリッド種子を製造するた めの方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９３０５８６２．６ (32)優先日 1993年３月22日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３０５８６５．９ (32)優先日 1993年３月22日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３０５８６６．７ (32)優先日 1993年３月22日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３０５８６７．５ (32)優先日 1993年３月22日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３０５８６８．３ (32)優先日 1993年３月22日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３０５８６９．１ (32)優先日 1993年３月22日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３１４３５１．９ (32)優先日 1993年７月12日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３２０９８８．０ (32)優先日 1993年10月12日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バートン，サラ・ルイーズ イギリス国ラクバラ エルイー12 ５アー ルディー，サットン・ボニントン，ユニバ ーシティ・オブ・ノッティンガム，スクー ル・オブ・アグリカルチャー（番地なし) (72)発明者 ガリェゴ−ベイガス，ペドロ・ペー スペイン王国ポンテベドゥラ エー― 36200 ビゴ，ユニバーシティ・オブ・ビ ゴ，ファカルティ・オブ・サイエンシィ ズ，ラボラトリー・フィシオロヒァ・ベヘ タル (72)発明者 グレイ，ジュリー・エリザベス イギリス国シェフィールド エス10 ２ユ ーエイチ，ユニバーシティ・オブ・シェフ ィールド，ディパートメント・オブ・モレ キュラー・バイオロジー・アンド・バイオ テクノロジー，ピー・オー・ボックス 594 (72)発明者 グリエーソン，ドナルド イギリス国ラクバラ エルイー12 ９ビー エス，シェプシェド，アシュビー・ロード 55 (72)発明者 ロウ，アレクサンドラ・ルイーズ イギリス国ラクバラ エルイー12 ５アー ルディー，サットン・ボニントン，ユニバ ーシティ・オブ・ノッティンガム，スクー ル・オブ・アグリカルチャー（番地なし) (72)発明者 ピクトン，スティーヴ イギリス国チェシャー ダブリューエイ３ ７ピービー，ウォーリントン，バーチウ ッド・サイエンス・パーク・ノース，ケル ヴィン・クロース，アプライド・バイオシ ステムズ・リミテッド (72)発明者 ホットン，リー・コリン イギリス国ラクバラ エルイー12 ５アー ルディー，サットン・ボニントン，ユニバ ーシティ・オブ・ノッティンガム，スクー ル・オブ・アグリカルチャー（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＥＲＴ１ｂ、ＥＲＴ１０、ＥＲＴ１３、ＥＲＴ１４、ＥＲＴ１５、ＥＲＴ １６ｂ、ＥＲＴ１７、ＥＲＴＤ１、ＥＲＴＲ１およびＥＲＴＳ２からなる群より 選択されるＥＲＴクローンによりコードされているような、またはハイブリッド 形成プローブとして該クローンを使用して得ることができるようなＤＮＡ配列を 含むＤＮＡ構築物。 ２． 植物においてＤＮＡ構築物がＲＮＡを発生できるように、ＤＮＡ構築物が 植物で作動可能な転写開始領域の調節下にある請求項第１項に記載のＤＮＡ構築 物。 ３． ＤＮＡ配列がｃＤＮＡから誘導される請求項第１項または請求項第２項に 記載のＤＮＡ構築物。 ４． ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡから誘導される請求項第１項または請求項第２ 項に記載のＤＮＡ構築物。 ５． ＤＮＡ配列が合成ＤＮＡである請求項第１項または請求項第２項に記載の ＤＮＡ構築物。 ６． ＤＮＡ構築物がザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリア ル・アンド・マリン・バクテリア（The National Collections of Industrial a nd Marine Bacteria）に寄託され、ＮＣＩＭＢ ４０５４４、ＮＣＩＭＢ ４０ ５４５、ＮＣＩＭＢ ４０５４６、ＮＣＩＭＢ ４０５４７、ＮＣＩＭＢ ４０ ５４８、ＮＣＩＭＢ ４０５４９、ＮＣＩＭＢ ４０５６９、ＮＣＩＭＢ ４０ ５８８、ＮＣＩＭＢ ４０５５０およびＮＣＩＭＢ ４０５５１からなる群より 選択されるｃＤＮＡクローンである請求項第１項に記載のＤＮＡ構築物。 ７． ＤＮＡ構築物がザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリア ル・アンド・マリン・バクテリア（The National Collections of Industrial a nd Marine Bacteria）に寄託され、ＮＣＩＭＢ ４０６０６、ＮＣＩＭＢ ４０ ６０７およびＮＣＩＭＢ ４０６０８からなる群より選択されるゲノムＤＮＡク ローンである請求項第１項に記載のＤＮＡ構築物。 ８． ＥＲＴ１ｂ、ＥＲＴ１０、ＥＲＴ１３、ＥＲＴ１４、ＥＲＴ１５、ＥＲＴ １６ｂ、ＥＲＴ１７、ＥＲＴＤ１、ＥＲＴＲ１およびＥＲＴＳ２からなる群から 選択されるＥＲＴ蛋白質をコードしているゲノムＤＮＡ配列から誘導される転写 開始配列。 ９． ザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マ リン・バクテリア（The National Collections of Industrial and Marine Bact eria）に寄託され、ＮＣＩＭＢ ４０６０６、ＮＣＩＭＢ ４０６０７およびＮ ＣＩＭＢ ４０６０８からなる群より選択されるゲノムＤＮＡクローンから誘導 される請求項第８項に記載の転写開始配列。 10． 請求項第２項に記載されているＤＮＡ構築物での植物の形質転換を含み、 対応する成長段階において類似の非改良植物と比較した場合に改良された特性を 持つ植物の製造法。 11． 果実成熟特性を改良するために請求項第２項に記載されているＤＮＡ構築 物での果実を持つ植物の形質転換を含む請求項第１０項に記載の方法。 12． 請求項第２項に記載されているＤＮＡ構築物を含む植物細胞。 13． 請求項第１２項に記載されている植物細胞から誘導される植物。 14． 請求項第２項に記載されているＤＮＡ構築物を含む果実。 15． 請求項第２項に記載されているＤＮＡ構築物を含む種子。 16． 少なくとも一つが請求項第２項に記載されているＤＮＡ構築物についてホ モ接合であるように遺伝的に修飾された植物である二つの親株を交配させること を含むＦ１ハイブリッド植物を製造する方法。 １７．請求項第２項に記載されているＤＮＡ構築物についてホモ接合であるよう に遺伝的に修飾された植物を製造し、そのような植物と第二のホモ接合性変種を 交配し、およびＦ１ハイブリッド種を回収することを含むＦ１ハイブリッド種子 を製造する方法。