JP2896580B2 - アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法 - Google Patents
アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は還元末端を有しカルボキシル基を含まない糖
をペプチドを介してリゾチームと結合してなるハイブリ
ッドとその合成法に関し、その目的はリゾチームの安定
性を増加させることである。又、糖−リゾチームハイブ
リッドを合成するのに必要な還元末端を有し、カルボキ
シル基を含まない糖とペプチドを介してＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドを結合している活性化糖を提供するもの
である。
をペプチドを介してリゾチームと結合してなるハイブリ
ッドとその合成法に関し、その目的はリゾチームの安定
性を増加させることである。又、糖−リゾチームハイブ
リッドを合成するのに必要な還元末端を有し、カルボキ
シル基を含まない糖とペプチドを介してＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドを結合している活性化糖を提供するもの
である。
これら糖−リゾチームハイブリッド、活性化糖および
その製造法に関するものである。
その製造法に関するものである。
［従来の技術］ 蛋白質は20種のアミノ酸の結合による１次構造とそれ
によって規定される立体構造から成っている。蛋白質の
機能が種々あることはすでに知られていることであり、
生体内に於て安定な蛋白質も、生体外で利用すると不安
定となる。
によって規定される立体構造から成っている。蛋白質の
機能が種々あることはすでに知られていることであり、
生体内に於て安定な蛋白質も、生体外で利用すると不安
定となる。
蛋白質のすぐれた機能を種々の用途に応用しようとす
る場合、次の様な欠点が蛋白質にはある。すなわち、
熱、アルカリ、酸に不安定で変成しやすい、有機溶媒
に不溶で活性を失いやすい、抗原性がある、などであ
る。
る場合、次の様な欠点が蛋白質にはある。すなわち、
熱、アルカリ、酸に不安定で変成しやすい、有機溶媒
に不溶で活性を失いやすい、抗原性がある、などであ
る。
これらの欠点を解決するために、蛋白質を化学修飾す
ることがおこなわれてきた。蛋白質を化学修飾して蛋白
質ハイブリッドにすれば、これらの欠点を補うことは可
能となってきた。化学修飾の方法としては種々の方法が
提案されているが、最も良く使用されているのは非免疫
性合成高分子であるポリエチレングリコール（以下PE
G）を修飾剤とする方法である。
ることがおこなわれてきた。蛋白質を化学修飾して蛋白
質ハイブリッドにすれば、これらの欠点を補うことは可
能となってきた。化学修飾の方法としては種々の方法が
提案されているが、最も良く使用されているのは非免疫
性合成高分子であるポリエチレングリコール（以下PE
G）を修飾剤とする方法である。
この方法は次の式に示す様にモノメトキシポリエチレ
ングリコールと塩化シアヌル（2,4,6−トリクロロ−Ｓ
−トリアジン）の合成物（活性化PEG）をつくり、この
活性化PEGと蛋白質と反応させPEG−蛋白質ハイブリッド
を製造する。この蛋白質ハイブリッドを利用して次に示
す様な数多くの応用例が報告されているが、まだ実際に
産業上に利用されている例は少ない様である。
ングリコールと塩化シアヌル（2,4,6−トリクロロ−Ｓ
−トリアジン）の合成物（活性化PEG）をつくり、この
活性化PEGと蛋白質と反応させPEG−蛋白質ハイブリッド
を製造する。この蛋白質ハイブリッドを利用して次に示
す様な数多くの応用例が報告されているが、まだ実際に
産業上に利用されている例は少ない様である。
これは活性化PEGが不安定であり、又、均一な性質の
ものが得られていない、塩化シアヌルの毒性問題、活性
化PEGと蛋白質の反応が定量的にスムーズにいかないな
どの欠点があるためである。
ものが得られていない、塩化シアヌルの毒性問題、活性
化PEGと蛋白質の反応が定量的にスムーズにいかないな
どの欠点があるためである。
PEG−蛋白質−ハイブリッドの応用例を次に示す。
（１）PEG−アスパラギナーゼ（T.Pharmac,Y.Kamisaki
et al;Exp.Therap.216,410） 抗腫瘍酵素であるアスパラギナーゼを血中半減期の延
長、抗原性の低下。
et al;Exp.Therap.216,410） 抗腫瘍酵素であるアスパラギナーゼを血中半減期の延
長、抗原性の低下。
（２）PEG−酵素−ハイブリッドを利用して酵素反応を
有機溶媒の中でも可能にした（Y.Imada et al;Trends i
n Biotechnology４190（1986）、K.Takahasi et al;J.O
rg Chem503414（1985）,K.Takahashi et al;Enzyme3223
5（1984）,K.Takahasi et al;Biochem Biophys Res.Com
mun:125761（1984））。
有機溶媒の中でも可能にした（Y.Imada et al;Trends i
n Biotechnology４190（1986）、K.Takahasi et al;J.O
rg Chem503414（1985）,K.Takahashi et al;Enzyme3223
5（1984）,K.Takahasi et al;Biochem Biophys Res.Com
mun:125761（1984））。
カタラーゼ、リパーゼ、キモトリプシン、ペルオキシ
ダーゼなど。
ダーゼなど。
（３）PEG−アデノシンデアミナーゼ（M.S.Hershfield
at al;N.Engl.J.Mol.316,493（1985）） 遺伝的酵素欠損症の一つにアデノシンアミナーゼ（AD
A）欠損症があるが、このADAを投与する場合PEG−PDAハ
イブリッドにすると血中半減期が著しく延長するなどの
効果が報告されている。
at al;N.Engl.J.Mol.316,493（1985）） 遺伝的酵素欠損症の一つにアデノシンアミナーゼ（AD
A）欠損症があるが、このADAを投与する場合PEG−PDAハ
イブリッドにすると血中半減期が著しく延長するなどの
効果が報告されている。
（４）PEG−インターロイキン２（井本泰治：化学と生
物 VOL27,page426 1989） リンホカインの一種であるインターロイキン２は遺伝
子組換えの技術によって大量に生産されるが糖鎖が欠け
ているため不安定であり、PEG−インタロイキン２のハ
イブリッドとすることで安定化でき抗腫瘍効果も向上で
きた。
物 VOL27,page426 1989） リンホカインの一種であるインターロイキン２は遺伝
子組換えの技術によって大量に生産されるが糖鎖が欠け
ているため不安定であり、PEG−インタロイキン２のハ
イブリッドとすることで安定化でき抗腫瘍効果も向上で
きた。
蛋白質とのハイブリッドをつくるにはPEGの他に糖類
も利用されている。これらの利用方法としては次の
（イ）〜（ニ）の様な方法があるが得られたハイブリッ
ドの効果については前に記述したPEGの場合とほぼ同様
である。
も利用されている。これらの利用方法としては次の
（イ）〜（ニ）の様な方法があるが得られたハイブリッ
ドの効果については前に記述したPEGの場合とほぼ同様
である。
（イ）の方法は過ヨウ素酸による反応が過酷であるの
で糖が分解することもあり、又、蛋白質との結合に還元
剤を使う必要があり、蛋白質の変性の可能性があるなど
の欠点がある。（ロ）の方法は、毒性のある臭化シアン
を使用する。又、蛋白質を結合させる時にpHの調製を厳
密にする必要があるなどの欠点がある。（ハ）の方法
は、塩化シアヌルが毒性があり、塩化シアヌルと糖との
反応がスムーズにいかないなどの欠点がある。（ニ）の
方法はエピクロルヒドリンによって糖同士が架橋する。
などの欠点を有する。（イ）〜（ニ）の方法の共通の欠
点は構成糖の−OHと反応するため、結合する位置が一定
とならないことであり、又、糖のどの−OHとも反応する
ため各々の糖が持つ特有の性質が失われることである。
で糖が分解することもあり、又、蛋白質との結合に還元
剤を使う必要があり、蛋白質の変性の可能性があるなど
の欠点がある。（ロ）の方法は、毒性のある臭化シアン
を使用する。又、蛋白質を結合させる時にpHの調製を厳
密にする必要があるなどの欠点がある。（ハ）の方法
は、塩化シアヌルが毒性があり、塩化シアヌルと糖との
反応がスムーズにいかないなどの欠点がある。（ニ）の
方法はエピクロルヒドリンによって糖同士が架橋する。
などの欠点を有する。（イ）〜（ニ）の方法の共通の欠
点は構成糖の−OHと反応するため、結合する位置が一定
とならないことであり、又、糖のどの−OHとも反応する
ため各々の糖が持つ特有の性質が失われることである。
溶菌酵素であるリゾチームは医業などに広く利用され
ているが、その安定性を増すためには遺伝子工学の技術
により構成しているアミノ酸の組成を変更したり、目的
のアミノ酸の間を架橋するなどの高度な技術を要したり
手間がかかる操作を必要とする（参照：井本泰治：化学
と生物 VOL27,page426,1989）． ［発明が解決しようとする問題点］ 本発明は下記（１）〜（３）の主要目的を有する。
ているが、その安定性を増すためには遺伝子工学の技術
により構成しているアミノ酸の組成を変更したり、目的
のアミノ酸の間を架橋するなどの高度な技術を要したり
手間がかかる操作を必要とする（参照：井本泰治：化学
と生物 VOL27,page426,1989）． ［発明が解決しようとする問題点］ 本発明は下記（１）〜（３）の主要目的を有する。
（１）還元末端を有しカルボキシル基を含まない糖と蛋
白質のアミノ基とを毒性がある試薬を使うこともなく糖
の還元末端のみと反応させて糖本来の性質を失うことな
く、反応をスムースにおこなわせて結合させるための活
性化糖を提供することを目的とする。
白質のアミノ基とを毒性がある試薬を使うこともなく糖
の還元末端のみと反応させて糖本来の性質を失うことな
く、反応をスムースにおこなわせて結合させるための活
性化糖を提供することを目的とする。
（２）又、上の発明を利用してリゾチームの安定性を増
すためにリゾチームと糖のハイブリッドを提供すること
を目的とする。
すためにリゾチームと糖のハイブリッドを提供すること
を目的とする。
（３）これらの活性化糖、糖−リゾチームの製造方法を
目的とする。
目的とする。
その他の目的は、以下の記述から明らかにされる。
［問題点を解決するための手段］ 本発明の構成と効果につき以下に詳述する。
（１）還元末端を有しカルボキシル基を含まない多糖か
ら選ばれたものをグリシルグリシンを介してリゾチーム
と結合してなるハイブリッド。
ら選ばれたものをグリシルグリシンを介してリゾチーム
と結合してなるハイブリッド。
（２）前記第１項記載の糖がアミロースであるハイブリ
ッド。
ッド。
（３）還元末端を有しカルボキシル基を含まない多糖か
ら選ばれたものをグリシルグリシンを介してＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドと結合してなる活性化糖。
ら選ばれたものをグリシルグリシンを介してＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドと結合してなる活性化糖。
（４）還元末端を有し、カルボキシル基を含まない多糖
から選ばれたものをグリシルグリシンと反応させ、つい
で縮合剤の存在下にＮ−ヒドロキシスクシンイミドを結
合させることを特徴とする活性化糖の製造法。
から選ばれたものをグリシルグリシンと反応させ、つい
で縮合剤の存在下にＮ−ヒドロキシスクシンイミドを結
合させることを特徴とする活性化糖の製造法。
A.活性化糖の合成： （１）第１工程： 還元糖を有する糖を緩衝液中あるいはジメチルスルホ
キシドなどの有機溶媒中に溶解させ両端にアミノ基、カ
ルボキシル基を持つペプチドと還元剤を加えて反応させ
て後述の式［Ｉ］の様な化合物をつくる。
キシドなどの有機溶媒中に溶解させ両端にアミノ基、カ
ルボキシル基を持つペプチドと還元剤を加えて反応させ
て後述の式［Ｉ］の様な化合物をつくる。
この場合の緩衝液は特に限定しないがアミノ基を含ま
なくてpH5〜９であれば良い。該糖としては単糖、オリ
ゴ糖、多糖である。ペプチドは特に限定しないが、構成
するアミノ酸は２〜10個が適当である。還元剤として
は、ソディゥムボロハイドライド（以下SBH）、ソディ
ゥムシアノボロハイドライド（NaBH3CN、以下SCBHとす
る）や、ジメチルアミンボラン（(CH3)2NHBH3、以下DMA
Bとする）が良い。反応温度は10〜60℃が好ましい。反
応終了後、未反応のペプチド、還元剤はゲル濾過や限外
濾過膜で分離して除く。
なくてpH5〜９であれば良い。該糖としては単糖、オリ
ゴ糖、多糖である。ペプチドは特に限定しないが、構成
するアミノ酸は２〜10個が適当である。還元剤として
は、ソディゥムボロハイドライド（以下SBH）、ソディ
ゥムシアノボロハイドライド（NaBH3CN、以下SCBHとす
る）や、ジメチルアミンボラン（(CH3)2NHBH3、以下DMA
Bとする）が良い。反応温度は10〜60℃が好ましい。反
応終了後、未反応のペプチド、還元剤はゲル濾過や限外
濾過膜で分離して除く。
（２）第２工程： 前記［Ｉ］を緩衝液、有機溶媒中に溶解させＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド（以下HONSuとする）と縮合剤を
加え［II］を合成する。縮合剤はジシクロヘキシルカル
ボジイミド（以下DCCとする）、１−エトキシカルボニ
ル−２−エトキシ−1,2−ジヒドロキシキノリン（以下E
EDQ）、ジサクシイミドカーボネイト（以下DSCとす
る）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドハイドロクロライド（以下EDCと
する）などが適当である。
ロキシスクシンイミド（以下HONSuとする）と縮合剤を
加え［II］を合成する。縮合剤はジシクロヘキシルカル
ボジイミド（以下DCCとする）、１−エトキシカルボニ
ル−２−エトキシ−1,2−ジヒドロキシキノリン（以下E
EDQ）、ジサクシイミドカーボネイト（以下DSCとす
る）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドハイドロクロライド（以下EDCと
する）などが適当である。
［II］はペプチド糖とHONSuと結合している化合物
で、今まで得られていない新しい化合物であり、蛋白質
のアミノ基と容易に反応できる様なかたちなっており活
性化糖と以下称す。
で、今まで得られていない新しい化合物であり、蛋白質
のアミノ基と容易に反応できる様なかたちなっており活
性化糖と以下称す。
B.リゾチーム−糖ハイブリッドの合成： 活性化糖［II］とリゾチームをアミノ基を含まない緩
衝液中で反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーあ
るいは限外濾過膜で糖−リゾチームハイブリッドと活性
化糖［II］を分離する。
衝液中で反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーあ
るいは限外濾過膜で糖−リゾチームハイブリッドと活性
化糖［II］を分離する。
この反応はほぼ定量的に進むが、未反応のリゾチーム
の存在する場合は、陽イオン交換体のCM−イオン交換体
でリゾチームと糖−リゾチームハイブリドーマを分離し
てリゾチーム−糖ハイブリドーマを得ることができる。
の存在する場合は、陽イオン交換体のCM−イオン交換体
でリゾチームと糖−リゾチームハイブリドーマを分離し
てリゾチーム−糖ハイブリドーマを得ることができる。
この様に本発明によれば比較的簡単に糖の還元末端と
結合したリゾチーム−糖ハイブリッドを得ることができ
画期的である。リゾチーム以外の蛋白質についても糖−
蛋白質ハイブリッドを調製することが可能である。
結合したリゾチーム−糖ハイブリッドを得ることができ
画期的である。リゾチーム以外の蛋白質についても糖−
蛋白質ハイブリッドを調製することが可能である。
C.糖−リゾチームハイブリッドの安定性： 糖−リゾチームハイブリッドがリゾチームに比較して
どの様に安定性が増加したかを調べるために熱に対する
リゾチーム活性を検討した。リゾチーム活性はグルコー
ルキチンを基質として測定した。
どの様に安定性が増加したかを調べるために熱に対する
リゾチーム活性を検討した。リゾチーム活性はグルコー
ルキチンを基質として測定した。
その結果未修飾リゾチームは80℃以上の高温になると
著しく活性が低下するのに対し、糖リゾチームハイブリ
ッドは90〜100℃の高温でも80％の活性が維持できその
安定性の高さは画期的であった。
著しく活性が低下するのに対し、糖リゾチームハイブリ
ッドは90〜100℃の高温でも80％の活性が維持できその
安定性の高さは画期的であった。
糖としては、アミロースをはじめ、アミロペクチン、
キトサン、デキストラン、アガロースなどが応用され
る。
キトサン、デキストラン、アガロースなどが応用され
る。
たゞし、カルボキシル基を有する糖質は蛋白質同志の
分子間架橋が生じるため本法を適用するには望ましくな
い。
分子間架橋が生じるため本法を適用するには望ましくな
い。
［実施例］ 以下、実施例について説明する。
実施例１ アミロース−グリシルグリシンの合成： アミロース（平均重量分子量29,000）1.0gを0.1Mリン
酸緩衝液（pH8.5）10mlに溶解し、グリシル−グリシン
をアミロースの５倍モル比相当量、SCBHを50倍モル比相
当量を加えて80℃で２日間撹拌する。濃塩酸でpH3に調
整し、さらに60℃で５時間攪拌する。N-NaOHでpH7に調
整する。
酸緩衝液（pH8.5）10mlに溶解し、グリシル−グリシン
をアミロースの５倍モル比相当量、SCBHを50倍モル比相
当量を加えて80℃で２日間撹拌する。濃塩酸でpH3に調
整し、さらに60℃で５時間攪拌する。N-NaOHでpH7に調
整する。
この反応液をゲル濾過剤（商品名セルロファインGCL-
25）でゲルクロマトグラフィーをおこない、未反応のグ
リシル−グリシンSCBHを除去する。第１図にゲル濾過の
結果を示すが、始めのピークの部分を分取する。後のピ
ークは、グリシル−グリシンSCBHである。分取した液は
凍結乾燥した。なお、ゲル濾過は（カラム 1.2×60cm,
溶出液：水、 流速:10ml/hr）で行った。
25）でゲルクロマトグラフィーをおこない、未反応のグ
リシル−グリシンSCBHを除去する。第１図にゲル濾過の
結果を示すが、始めのピークの部分を分取する。後のピ
ークは、グリシル−グリシンSCBHである。分取した液は
凍結乾燥した。なお、ゲル濾過は（カラム 1.2×60cm,
溶出液：水、 流速:10ml/hr）で行った。
アミロース−グリシルグリシンは0.9g得られた。
実施例２ 活性化アミロースの合成： 実施例１で得たアミロース−グリシルグリシン0.5gを
ジメチルスルホキサイド2mlに溶解させて、HONSu、DCC
をアミロース−グリシルグリシンの10倍モル比相当量を
加え、室温で１夜攪拌する。
ジメチルスルホキサイド2mlに溶解させて、HONSu、DCC
をアミロース−グリシルグリシンの10倍モル比相当量を
加え、室温で１夜攪拌する。
不溶解物を濾過しアセトン 20mlを加え、3,000回転
で５分間攪拌し析出してくる沈殿を濾取する。減圧下で
乾燥して活性化アミロース0.4gを得た。
で５分間攪拌し析出してくる沈殿を濾取する。減圧下で
乾燥して活性化アミロース0.4gを得た。
実施例３ アミロース−リゾチームハイブリッドの合成： 11mgのリゾチームを0.1Mホウ酸緩衝液（pH8.5）に溶
解させ、17.2mgの実施例２で得た活性化アミロースを加
え室温で１夜攪拌する。
解させ、17.2mgの実施例２で得た活性化アミロースを加
え室温で１夜攪拌する。
0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）＋0.1M NaClに対し、透析
する。不溶解物を濾別し、濾液をゲル濾過剤（セルロフ
ァィン GCL-300）にかけゲルクロマトグラフィーをお
こなう。この結果を第２図に示す、先のピークの部分を
分取する。後のピークの部分は未反応の活性化アミロー
スである。なお、ゲル濾過は（カラム:1.5×64cm、緩衝
液:0.1Mリン酸緩衝液＋0.1％ NaCl、流速:10.2ml/hr）
で行った。
する。不溶解物を濾別し、濾液をゲル濾過剤（セルロフ
ァィン GCL-300）にかけゲルクロマトグラフィーをお
こなう。この結果を第２図に示す、先のピークの部分を
分取する。後のピークの部分は未反応の活性化アミロー
スである。なお、ゲル濾過は（カラム:1.5×64cm、緩衝
液:0.1Mリン酸緩衝液＋0.1％ NaCl、流速:10.2ml/hr）
で行った。
分取した部分を脱塩後凍結乾燥してアミロースリゾチ
ームハイブリッドを8mg得た。
ームハイブリッドを8mg得た。
実施例４ リゾチームの活性測定法： 1mlの0.1％グリコールキチン溶液に0.1mlのリゾチー
ムアミロース−リゾチームハイブリッドを加え40℃で30
分間放置後、2mlの0.05％K3Fe(CN)3を加える。15分間沸
騰させて420mmの吸収を測定する。濃度と吸光度の関係
を第３図に示す。
ムアミロース−リゾチームハイブリッドを加え40℃で30
分間放置後、2mlの0.05％K3Fe(CN)3を加える。15分間沸
騰させて420mmの吸収を測定する。濃度と吸光度の関係
を第３図に示す。
実施例５ アミロースリゾチームハイブリッドの安定性： 500μｌのアミロース−リゾチームハイブリッド、リ
ゾチーム溶液を20℃、80℃、90℃、100℃に30分間静置
する。
ゾチーム溶液を20℃、80℃、90℃、100℃に30分間静置
する。
さらに室温に2.5時間放置後、実施例４の方法にした
がってリゾチーム活性を測定する。
がってリゾチーム活性を測定する。
結果を第４図に示す。アミロースリゾチームハイブリ
ッドはリゾチームの90％の活性を維持していた。100℃3
0分間の処理すると、未修飾リゾチームの活性の低下は
著しいのに対しアミロースリゾチームハイブリッドの活
性は90％維持されて、熱安定性が非常に増加されたこと
がわかる。
ッドはリゾチームの90％の活性を維持していた。100℃3
0分間の処理すると、未修飾リゾチームの活性の低下は
著しいのに対しアミロースリゾチームハイブリッドの活
性は90％維持されて、熱安定性が非常に増加されたこと
がわかる。
第１図〜４図は、本発明の実施例の説明図である。
Claims (4)
- 【請求項１】還元末端を有しカルボキシル基を含まない
多糖から選ばれたものをグリシルグリシンを介してリゾ
チームと結合してなるハイブリッド。 - 【請求項２】請求項第１項記載の糖がアミロースである
ハイブリッド。 - 【請求項３】還元末端を有しカルボキシル基を含まない
多糖から選ばれたものをグリシルグリシンを介してＮ−
ヒドロキシスクシンイミドと結合してなる活性化糖。 - 【請求項４】還元末端を有し、カルボキシル基を含まな
い多糖から選ばれたものをグリシルグリシンと反応さ
せ、ついで縮合剤の存在下にＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドを結合させることを特徴とする活性化糖の製造法。
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