JP2742886B2 - 好中球コラゲナーゼの免疫学的定量法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医学生理学的分野に用
いられる好中球コラゲナーゼ（潜在型及び活性型ＭＭＰ
−８）の免疫学的定量法に関する。さらに詳しく言え
ば、本発明は精製ＭＭＰ−８に対し特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を用いて、潜在型及び活性型ＭＭＰ−
８を免疫学的に定量する方法に関する。

【０００２】

【背景技術】細胞外マトリックスは、コラーゲン、プロ
テオグリカン、エラスチン、フィブロネクチン及びラミ
ニンなどの接着性糖タンパク質から構成されている（Ｍ
ａｒｔｉｎｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４８，６５６−６７７，１９
８３）。これらマトリックス成分の分解にはマトリック
スメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）が重要な役割を果
たしている。その中の一つである好中球コラゲナーゼ
（ＭＭＰ−８）は、Ｉ型、II型、及びIII 型コラーゲン
を基質とする分子量約８５ｋＤａ（キロダルトン）の糖
タンパク質であり、好中球の成熟にともない合成され、
細胞内の特殊顆粒に蓄積される（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１６２，１９５−１９
７，１９７７）。なお、ＭＭＰ−８は糖タンパク質であ
ることから、結合する糖鎖によりその測定分子量はある
程度の幅で報告されている。線維芽細胞などの組織細胞
で産生される間質型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）は、細
胞内で合成された後、貯蔵されることなく持続的に分泌
されるが（Ｎａｇａｓｅ ｅｌ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．，２１４，２８１−２８８，１９８３）、ＭＭ
Ｐ−８は炎症の起こった時、その炎症局所において潜在
型ＭＭＰ−８として分泌され（Ｈａｓｔｙ ｅｌ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，５６４５−
５６５０，１９８６）、細胞外で活性化され、コラーゲ
ンの分解を行う。

【０００３】炎症は多くの疾患にみられる生体反応で、
慢性関節リウマチなどのような炎症性疾患だけでなく、
腫瘍性疾患においても腫瘍の伸展とともに炎症反応がよ
くみられる。ＭＭＰ−８は、この炎症反応において重要
な働きをしており、その働きも炎症の種類や病状により
異なっていると考えられ、各種疾患との関わりを解析す
るうえで血中のＭＭＰ−８量の正確な定量法の確立が求
められてきた。体液中、例えば血中、関節液中などには
ＭＭＰｓのインヒビターであるティシュ・インヒビター
・オブ・メタロプロテアーゼ類（ＴＩＭＰｓ）が存在し
ており、そのためＭＭＰｓの活性測定からＭＭＰｓの定
量をすることは困難である。また、ＭＭＰｓの各々の基
質特異性が幅広いこともＭＭＰｓの分別定量を困難にし
ている。そこで、体液中のＭＭＰｓを測定するために、
ＭＭＰｓに特異的に結合することのできる抗体を用いた
免疫学的手法が用いられる。

【０００４】

【解決すべき課題】Ｂｅｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，２７，３５１−３５９，１９８９）は、ヒト好中
球から精製したヒトＭＭＰ−８に対するウサギポリクロ
ーナル抗体を用いて、２ステップサンドイッチＥＩＡ法
によりヒト血漿中のヒトＭＭＰ−８量を定量している。
この方法では、ウサギポリクローナル抗体を固相に吸着
させ、その抗体に検体を加え、検体中の抗原と反応させ
る。次に固相抗体に結合した抗原をペルオキシダーゼ標
識ウサギポリクローナル抗体と反応させ、そのペルオキ
シダーゼ活性を測定することにより、ヒトＭＭＰ−８を
定量している。しかしながら、この方法ではポリクロー
ナル抗体を使用しているため精度の点で極めて劣り、２
ステップ反応であるため反応時間も７時間と長く、また
定量操作も繁雑となり、得られた感度も低いものであっ
た。さらに、ヒトＭＭＰ−８は生体内で潜在型、活性
型、活性型とＴＩＭＰｓとの複合体などの形態で存在
し、それら互いのバランスが各種疾患、症状、病気など
と密接な関連を持つとも予測されるにも拘らず、そうし
た各種形態のヒトＭＭＰ−８をそれぞれ区別して測定す
ることはできない。

【０００５】

【課題の解決】本発明の目的は、ＭＭＰ−８に対し特異
的に結合するモノクローナル抗体を用いて被検試料中の
潜在型ＭＭＰ−８あるいは潜在型及び活性型ＭＭＰ−８
の両方、そして活性型ＭＭＰ−８とＴＩＭＰｓとの複合
体を測定することによる活性型ＭＭＰ−８をそれぞれ感
度ならびに精度良く、また迅速に定量し得る方法を提供
することにある。こうした方法に用いる試薬キットを提
供することも本発明の特徴の一つである。本発明は、Ｍ
ＭＰ−８に対し特異的に結合するところの少なくとも二
種類のモノクローナル抗体を測定試薬として用いて、免
疫学的に潜在型ＭＭＰ−８の測定を行ったり、潜在型、
活性型ＭＭＰ−８両方の測定を行うことを特徴とするＭ
ＭＰ−８の定量法を提供するものである。該二種類のモ
ノクローナル抗体としては、それぞれ好中球コラゲナー
ゼの実質的に異なる領域に対し特異的に結合するモノク
ローナル抗体であることが特に好ましい。本発明の測定
法では、サンドイッチ法における固相抗体に結合させる
抗体として一方の好中球コラゲナーゼに対し特異的に結
合するモノクローナル抗体を用い、そして標識物を付与
する抗体として他方の好中球コラゲナーゼに対し特異的
に結合するモノクローナル抗体を用いて、その免疫学的
測定を行うことが好ましい。さらにＭＭＰ−８に対し特
異的に結合するモノクローナル抗体とＴＩＭＰｓに対し
特異的に結合するモノクローナル抗体を測定試薬として
用いて複合体からの活性型ＭＭＰ−８の測定を行うこと
を特徴とするＭＭＰ−８の定量法を提供するものであ
る。本発明の方法は、固相担体に結合させる抗体あるい
は標識物を付与する抗体として、それぞれ、ＭＭＰ−８
の実質的に異なる抗原決定基に対し特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を使用することをも特徴とするもので
ある。

【０００６】本発明で使用されるモノクローナル抗体
は、ケラー及びミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４
９５，１９７５）などにより開示されたミエローマ細胞
を用いての細胞融合技術を利用して得られたモノクロー
ナル抗体であってもよいことはいうまでもない。本発明
で使用されるモノクローナル抗体は、次のような工程で
作製できる。 １．免疫原性抗原の調製 ２．免疫原性抗原による動物の免疫 ３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 ５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化 ６．モノクローナル抗体の製造

【０００７】１．免疫原性抗原の調製 抗原としては、例えばＫｎａｕｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ．，３
７１，２９５−３０４，１９９０に記載の方法により調
製したヒトＭＭＰ−８を用いることができる。こうして
得られたヒトＭＭＰ−８は、さらに免疫原性コンジュゲ
ートなどにしてもよいが、そのまま適当なアジュバント
と混合して動物を免疫するのに使用できる。さらにヒト
ＭＭＰ−８は、それを断片化したものを適当な縮合剤を
介して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテン−
タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートとし、これを
用いて特定の配列のみを認識できるモノクローナル抗体
をデザインするのに用いることもできる。担体タンパク
質類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はま
ず活性化されることができる。こうした活性化にあたり
活性化結合基を導入することが挙げられる。

【０００８】活性化結合基としては、（１）活性化エス
テルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニトロフェ
ニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、
１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スクシンイミ
ドエステル基など、（２）活性化ジチオ基、例えば２−
ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク質類
としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ），牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミ
ン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、細
菌菌体成分、例えばＢＣＧなどが挙げられる。

【０００９】２．免疫原性抗原による動物の免疫 動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学 III、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバン
トとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ
（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、
リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ
などが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどの
マウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の
投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動
物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後
１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔
内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０
回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ
／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウス
とのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応
じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫
の程度を確認できる。

【００１０】３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）と
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−
１）（Eur. J. Immunology, 6, 511〜519, 1976)、ＳＰ
２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２）（Nature, 276, 269〜270,
1978 ) 、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン
由来のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）(Curre
nt topicsin Microbiology and Immunology, 81, 1 〜
7, 1978 ）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Natur
e, 256, 495〜497, 1975 ) 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．
６５３(J. Immunology, 123, 1548〜1550, 1979) など
を用いることができる。８−アザグアニン耐性のマウス
ミエローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培
地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例え
ばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清
（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例え
ば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、
細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細
胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結
保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６
４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で
培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよ
い。

【００１１】４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、脾細胞
懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を
得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうし
て得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に従い得られ
たミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培
地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細
胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリ
コールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当
該分野で知られたものを用いることができ、この様なも
のとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ
Ｊａｐａｎ）などが挙げられる。好ましくは、例えば３
０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ
加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００の
ポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分
子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコー
ルがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチ
レングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるよ
うにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチル
スルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもで
きる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ
細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが
挙げられるが、より好ましくは４：１〜７：１とするこ
とができる。融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応処
理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心な
どにより細胞を分離した後選択用培地に移す。

【００１２】５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及
びモノクローン化 選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙
げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレ
ートに分注した容量と当容量を翌日加え、その後１〜３
日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというようにす
ることができるが、適宜これに変更を加えて行うことも
できる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリン
を除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をす
ることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺
細胞を使用することもでき、それが好ましい場合があ
る。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養
上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析
（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定
系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）など
で、ヒトＭＭＰ−８あるいはその断片ペプチドを抗原と
して用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的
抗体を測定するなどして、スクリーニングしたり分離す
る。目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニ
ングする。クローニングには、寒天培地中でコロニーを
ピック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなさ
れうる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。
クローニングは複数回行うことが好ましい。

【００１３】６．モノクローナル抗体の製造 得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培
養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得
ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリ
ドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエロ
ーマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に
各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、例えばヌー
ド・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖さ
せ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を
回収して得ることが出来る。ハイブリドーマの移植に先
立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、ハイ
ブリドーマを増殖させ、腹水を採取すればよい。腹水液
はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アン
モニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによる
ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳
動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラ
フィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精
製してモノクローナル抗体として用いることができる。
好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫
安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオ
ン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ
ーカラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好まし
くは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗
原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識す
る部位など）を固定化したアフィニティー・クロマトグ
ラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティー・
クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【００１４】こうして得られたモノクローナル抗体は、
市販のアイソタイプ特異的抗マウスＩｇ抗体、例えばア
イソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体などを用いて
その抗体構成鎖の重鎖及び軽鎖のタイプについて調べる
ことができる。ヒトＭＭＰ−８標品中の種々の形態の分
子、すなわち潜在型ヒトＭＭＰ−８、活性型ヒトＭＭＰ
−８、さらには活性型ＭＭＰ−８の分解切断により生成
すると考えられる分子量４５ｋＤａと２５ｋＤａ断片な
どとの反応性を検討すると、潜在型ＭＭＰ−８を特異的
に認識できるモノクローナル抗体、活性型ＭＭＰ−８を
特異的に認識できるモノクローナル抗体、活性型ＭＭＰ
−８の分解切断により生成すると考えられる分子量４５
ｋＤａ断片を特異的に認識できるモノクローナル抗体、
活性型ＭＭＰ−８の分解切断により生成すると考えられ
る分子量２５ｋＤａ断片を特異的に認識できるモノクロ
ーナル抗体などが得られることが確認できる。例えば、
潜在型ＭＭＰ−８を特異的に認識できるモノクローナル
抗体としては、重鎖のタイプとしてγ鎖、特にはγ１鎖
を持つもの、μ鎖を持つものが挙げられ、軽鎖のタイプ
としてκ鎖を持つものが挙げられる。活性型ＭＭＰ−８
を特異的に認識できるモノクローナル抗体としては、重
鎖のタイプとしてγ鎖、特にはγ1 、γ2b鎖を持つも
の、μ鎖を持つものが挙げられ、軽鎖のタイプとしてκ
鎖を持つものが挙げられる。分子量４５ｋＤａ断片を特
異的に認識できるモノクローナル抗体あるいは分子量２
５ｋＤａ断片を特異的に認識できるモノクローナル抗体
としては、重鎖のタイプとしてγ鎖、特にはγ１鎖を持
つものが挙げられ、軽鎖のタイプとしてκ鎖を持つもの
が挙げられる。

【００１５】またこうして大量に得られた抗体の配列を
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）₂ といった抗体フラグメントにして使用して
もよい。標識物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、
更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆ
ａｂ’を用いることができる。これらの場合の標識物の
例としては、下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼなど）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元
素などがある。

【００１６】本発明では、こうして得られたＭＭＰ−８
に対し特異的に結合するモノクローナル抗体を用いて検
体試料中のＭＭＰ−８を免疫学的に定量する方法が提供
される。特にＭＭＰ−８の潜在型を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体、ＭＭＰ−８の中央領域を特異的に認
識するモノクローナル抗体、ＭＭＰ−８のカルボキシル
末端領域を認識するモノクローナル抗体、及びＭＭＰ−
８のアミノ末端領域を認識するモノクローナル抗体から
成る群から選ばれたものであり、それぞれＭＭＰ−８の
うちの実質的に異なる領域に特異性を有するモノクロー
ナル抗体の少なくとも二つを組み合わせ、ＭＭＰ−８の
潜在型やＭＭＰ−８の活性型を免疫学的に定量する方法
が提供される。さらに本発明では、こうして得られたＭ
ＭＰ−８に対し特異的に結合するモノクローナル抗体と
ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテアーゼに
特異的に結合する抗体とを用いて、検体試料中の活性型
ＭＭＰ−８とＴＩＭＰｓ複合体を免疫学的に定量する方
法も提供される。特にティシュ・インヒビター・オブ・
メタロプロテアーゼ−１を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体をＭＭＰ−８に対し特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体と組み合わせる測定方法が好ましく提供され
る。また、ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロ
テアーゼ−２のアミノ末端領域を認識するモノクローナ
ル抗体もＭＭＰ−８に対し特異的に結合するモノクロー
ナル抗体と組み合わせて測定に使用できる。ヒトＭＭＰ
−８は、糖タンパク質であるため結合する糖鎖などによ
り分子量にバラツキを生ずるなどし、研究者により報告
される測定分子量も異なるが、例えばＫｎａｕｐｅｒ，
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９１，８４７
−８５４，１９９３では潜在型は８５ｋＤａ、活性型は
６４ｋＤａ、活性型から生ずる断片を４０ｋＤａ断片及
び２７ｋＤａ断片としているし、Ｈａｓｔｙ，ｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，５６４５−
５６５０，１９８６では潜在型は７５ｋＤａ、活性型は
５７ｋＤａ、活性型から生ずる断片を２２ｋＤａ断片と
しているし、Ｍａｃａｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３０，７１−７８，１９
８３では潜在型は９１ｋＤａ、活性型は６４ｋＤａ、活
性型から生ずる断片を２４ｋＤａ断片としている。した
がって本発明では実質的にヒトＭＭＰ−８の潜在型、活
性型を測定するものであればとくにその分子量は限定さ
れるものでない。ヒトＭＭＰ−８は、大きく分けてプロ
ペプチド（ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）、触媒活性ドメイン
（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ）、ヒンジ領域
（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）及びペキシン様ドメイン
（ｐｅｘｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）の４つの領域
に分けられ、プロペプチド領域（８０番目アミノ酸付近
まで）をアミノ末端領域、ペキシン様ドメイン領域（約
２６０番目アミノ酸付近から最後まで）をカルボキシル
末端領域とされ、その間の触媒活性ドメイン及びヒンジ
領域を中央領域とされるのが一般的である。

【００１７】本発明の検体試料中のＭＭＰ−８を免疫学
的に定量する方法においては、プロテアーゼ・インヒビ
ター、例えば塩酸ベンズアミジンなどの存在下に処理を
行うことができる。さらにトリプシン様セリンプロテア
ーゼに対するインヒビター、例えばアミノベンズアミジ
ン、β−ナフトアミジン、ｍ−トルアミジン、ｐ−トル
アミジン、シクロヘキシルカルボキサミジン、フェニル
グアニジン、Ｎ−ベンゾイルアルギニン、１−プロリル
グアニジン、ｎ−ブチルアミン、ベンジルアミン、チオ
ニン、プロフラビンなどを用いても所期の目的を達成す
るかぎり可能である。こうしたプロテアーゼ・インヒビ
ターは、試料中のＭＭＰ−８などの抗原量の回収を増加
させる目的であってもよいし、あるいはＭＭＰ−８の分
解を防ぐ目的であることもできる。また見かけの測定の
感度を高めたり、測定可能とするためであることもでき
る。したがって、こうした目的を達成するための方法で
あればすべて本発明の測定方法で行うことができる。次
に、本発明の測定方法では、検体試料中のＭＭＰ−８を
活性化処理する工程が含まれていても良い。活性化処理
は物理的な方法であることもできるが、好ましくは有機
水銀化合物のような活性化剤、例えば４−アミノフェニ
ル酢酸第二水銀（４−ＡＰＭＡ）などを用いる方法が挙
げられる。こうした活性化処理する工程は、潜在型ヒト
ＭＭＰ−８から活性型ヒトＭＭＰ−８に変換される量を
免疫学的に定量する目的でなされることができるし、あ
るいは活性型ヒトＭＭＰ−８の抗原量の回収を増加させ
る目的であってもよいし、また測定の感度を高めたり、
測定可能とするためであることもできる。したがって、
こうした目的を達成するための方法であればすべて本発
明の測定方法で行うことができる。

【００１８】さらに本発明の検体試料中の活性型ヒトＭ
ＭＰ−８を免疫学的に定量する方法においては、好中球
コラゲナーゼ・インヒビター、例えばＴＩＭＰ−１、Ｔ
ＩＭＰ−２などの存在下に処理を行うことができる。こ
うしたインヒビターは、試料中の活性型ヒトＭＭＰ−８
−好中球コラゲナーゼ・インヒビター複合体を測定する
目的であることもできる。さらに検体試料中の好中球コ
ラゲナーゼ・インヒビターの影響を測定するためである
こともできる。また測定の感度を高めたり、測定可能と
するためであることもできる。したがって、こうした目
的を達成するための方法であればすべて本発明の測定方
法で行うことができる。さらにこうした本発明の検体試
料中の活性型ヒトＭＭＰ−８を免疫学的に定量する方法
においては、好中球コラゲナーゼ・インヒビターに対す
るモノクローナル抗体、例えば抗ウシＴＩＭＰ−１モノ
クローナル抗体、例えばクローンＮｏ．７−６Ｃ１（Ｋ
ｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅ
ｌ．Ｒｅｓ．，７，３４１−３５０，１９８７）など、
抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体、例えばクロー
ンＮｏ．６８−６Ｈ４，，６７−４Ｈ１１（Ｆｕｊｉｍ
ｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ
ａ，２２０，３１−４５，１９９３）などとを組合わせ
た測定系であることができる。さらにこの場合、ヒトＭ
ＭＰ−８を認識するモノクローナル抗体としては、ヒト
ＭＭＰ−８のカルボキシル末端領域を特異的に認識でき
るモノクローナル抗体、あるいは分子量２５ｋＤａ断片
を特異的に認識できるモノクローナル抗体を、抗ＴＩＭ
Ｐ−１モノクローナル抗体あるいは抗ＴＩＭＰ−２モノ
クローナル抗体と組合わせて用い、活性型ヒトＭＭＰ−
８を免疫学的に定量することができる。

【００１９】本発明の測定は、イムノアッセイ、例えば
競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで
行うことができ、ラジオイムノメトリックアッセイ、Ｅ
ＬＩＳＡなどを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行って
もあるいは行わないでその測定を行うことができる。好
ましくは酵素免疫測定法であり、さらにサンドイッチ型
アッセイが挙げられる。例えばサンドイッチ型アッセイ
では、ＭＭＰ−８に対する抗体の一方を検出可能に標識
化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化
する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順
次反応させるためインキュベーション処理し、ここで非
結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識
の量は抗原、すなわちＭＭＰ−８の量と比例する。この
アッセイでは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序
に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（fo
rward)サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ
型アッセイなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹拌、震盪、
ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状況のもとで
それら測定工程の中で適宜採用される。特定の試薬、緩
衝液等の濃度、温度あるいはインキュベーション処理時
間などのその他の測定条件は、検体中の抗原の濃度、検
体試料の性質等の要素に従い変えることができる。当業
者は通常の実験法を用いながら各測定に対して有効な最
適の条件を適宜選定して測定を行うことが出来る。

【００２０】抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担
体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用
いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに
使用されるものが種々知られており、本発明においても
勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特
に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例え
ば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−
アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材
料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリ
レート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合
体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ス
チレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタ
クリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタ
クリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲ
ン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロ
ース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または
変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポ
リアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機
高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたも
の、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリ
ング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられ
る。さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試
験管、タイタープレート、タイターウェル、ガラスセ
ル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラ
ス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは
細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは
偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質
（物体）の表面などが挙げられる。これら担体へは、抗
体を結合させることができ、好ましくは本発明で得られ
るＭＭＰ−８に対し特異的に結合するモノクローナル抗
体を結合させることができる。担体とこれら抗原抗体反
応に関与するものとの結合は、吸着などの物理的な手
法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたもの
などを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学
的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来
る。

【００２１】標識としては、酵素、酵素基質、酵素イン
ヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵
素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、
発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コ
ロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵
素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸
化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル
基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転
移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテ
ル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵
素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げるこ
とができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に
利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利
用することもできる。

【００２２】代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ
−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラー
ゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリ
ホスファターゼなどのアルカリ・フォスファターゼなど
が挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、
４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウン
ベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなど
のリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素
的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン
誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光
などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ
系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた
場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その
酸素を電極などで検知することもできる。電極としては
ガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電
極、高分子膜電極などであることもできる。酵素標識
は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトア
ビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数
の異なった種類の標識を使用することもできる。こうし
た場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、
そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすること
もできる。

【００２３】本発明においては、信号の形成に４−ヒド
ロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テ
トラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニル
ガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の
組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾ
キノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合
物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェ
ノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働き
で形成しうるものが使用できる。

【００２４】蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合
物としては、フルオレセインイソチオシアネート、例え
ばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネートなどのローダミン誘導体、ダ
ンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミ
ン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフ
ェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノー
ル、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート
化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。標識するに
は、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスル
フィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基
の反応などを利用して行うことができ、公知の方法ある
いは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらには
それらを修飾した方法の中から適宜選択して適用でき
る。また上記免疫原性複合体作製に使用されることので
きる縮合剤、担体との結合に使用されることのできる縮
合剤などを用いることができる。

【００２５】縮合剤としては、例えばグルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレン
ジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミ
ド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネー
ト、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミ
ジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓ
ＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト、Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチル）ア
ミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（１−
マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミ
ドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ），イ
ミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水
物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオン
イミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデー
ト、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ
−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテー
トなどが挙げられる。

【００２６】本発明の測定法によれば、測定すべき物質
を酵素などで標識したモノクローナル抗体試薬と、担体
に結合された抗体とを順次反応させることができるし、
同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選
ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチッ
クなどのビーズを用いた場合には、酵素などで標識した
モノクローナル抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試
料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後該感
作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより
測定を行うことができる。本発明の定量法においては、
免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相担体とし
ては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン
製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポ
リビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、
微粒子あるいは試験管などの種々の材料および形態を任
意に選択し、使用することができる。測定にあたっては
至適ｐＨ、例えばｐＨ約４〜９に保つように適当な緩衝
液系中で行うことができる。特に適切な緩衝剤として
は、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォ
スフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミ
ン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩
衝剤、トリス−塩酸緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は
互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗体
抗原反応は約０℃〜６０℃の間の温度で行うことが好ま
しい。

【００２７】酵素などで標識されたモノクローナル抗体
試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、さらには測
定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達す
るまで行うことができるが、抗体抗原反応の平衡が達成
されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離して
限定されたインキュベーション処理の後に反応を止める
ことができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素など
の標識の存在の程度を測ることができる。測定操作は、
自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、
ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなど
を使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シ
グナルを検知して測定することもできる。抗体抗原反応
においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物
質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗体抗原
反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることが
できる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働
く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したり
するため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレ
ート化剤などをインキュベーション溶液中に加えること
もできる。キレート化剤としては、エチレンジアミン四
酢酸塩（ＥＤＴＡ）がより好ましい。当該分野で普通に
採用されていたりあるいは当業者に知られた非特異的結
合反応を防ぐためのブロッキング処理を施してもよく、
例えば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、アルブミ
ン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチン
などで処理することができる。非特異的結合反応を防ぐ
目的である限り、それらの方法は特に限定されず用いる
ことが出来る。本発明の測定方法で測定される試料とし
ては、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液などが使用し
うるが、好ましくは生物由来の流体試料、例えば血液、
血漿、、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、その他の
体液、細胞培養液、組織培養液などが挙げられる。特に
好ましくは血漿、血清、関節液などが挙げられる。キレ
ート化剤、例えばＥＤＴＡなどで処理された血漿、血清
などは好適に用いられる。

【００２８】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明は実施例に限定されること無く様々な態
様が含まれることは理解されるべきである。 実施例１ 抗ＭＭＰ−８モノクローナル抗体の作製 ａ）抗体産生細胞の調製 Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ．，３
７１，２９５−３０４，１９９０に記載のＫｎａｕｐｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．の方法により調製したヒトＭＭＰ−８
１２４μｇを完全フロイントアジュバントと共に６週
令ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス２匹にそれぞれ腹腔内投与し、
初回免疫した。１９日後に０．９％塩化ナトリウム水溶
液に溶解したヒトＭＭＰ−８ １６２μｇを初回免疫し
たそれぞれのマウスに腹腔内投与し追加免疫した。更
に、３１日後に追加免疫時と同様にヒトＭＭＰ−８ ５
０μｇを静脈内および６０μｇを腹腔内投与し、最終免
疫とした。その３日後に脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液と
した。

【００２９】ｂ）細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いた。 ＲＰＭＩ−１６４０培地：ＲＰＭＩ−１６４０（Ｆｌｏ
ｗ Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピル
ビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム
（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２
μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌ろ過した。 ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に除菌ろ過
したＦＣＳ（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を１５
％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加えた。 ＰＥＧ４０００溶液：ＲＰＭＩ−１６４０培地にポリエ
チレングリコール４０００（ＰＥＧ ４０００，Ｍｅｒ
ｋ ＆ Ｃｏ．）を５０％（ｗ／ｗ）になるように加
え、無血清溶液を調製した。 ８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ２（ＳＰ−２
／０−Ａｇ１４）との融合は、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，ｅｄｓ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓ．
Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ，３５１−３７２，１９８０に記載のＯ
ｉ ａｎｄ Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．の方
法を若干改変して行った。

【００３０】（２）前記ａ）で調製した有核脾細胞（生
細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１００
％）とを５：１の割合で融合した。脾臓細胞とミエロー
マ細胞とを別に前記のＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄
し、次に同じ培地で懸濁し、融合させるため上記の割合
で混合した。容量２５０ｍｌのポリプロピレン製遠沈管
（岩城硝子）を用い、２５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培
地中４００×ｇ，１０分間遠心し、上清を完全に吸出し
た。沈殿細胞に３７℃加温ＰＥＧ ４０００溶液４．３
ｍｌを１分間で滴下し、さらに１分間撹拌し細胞を再懸
濁、分散させた。次に３７℃加温ＲＰＭＩ−１６４０培
地４．３ｍｌを１分間で滴下した。この操作をさらに１
回繰り返した後、同培地２９．２ｍｌを２〜３分間で常
に撹拌しながら滴下し細胞を分散させた。これを４００
×ｇ，７分間遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。
次にこの沈殿細胞に３７℃加温、ＮＳ−１培地４２．７
ｍｌを速やかに加え、細胞の大きい塊を１０ｍｌのピペ
ットを用いて注意深くピペッティングして分散した。更
に同培地８５．３ｍｌを加えて希釈し、ポリスチレン製
９６穴マイクロウェル（岩城硝子）にウェル当り６．０
×１０⁵ 個／０．１ｍｌの細胞を加えた。細胞を加えた
上記のマイクロウェルを７％炭酸ガス／９３％空気中で
温度３７℃、湿度１００％下に培養に付した。

【００３１】ｃ）選択培地によるハイブリドーマの選択
的増殖 （１）使用する培地は以下の通りである。 ＨＡＴ培地：前記ｂ）で述べたＮＳ−１培地に更にヒポ
キサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μ
Ｍ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。 （２）前記ｂ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞にパ
スツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍｌ）を
加えた。２、３、５、８、１１日目に培地の半分（０．
１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換えた。ハイブリド
ーマ生育全ウェルについて次項ｄ）記載のＥＬＩＳＡに
より陽性ウェルをチェックした。次にフィーダーとして
１０⁷ 個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌをポリ
スチレン製２４穴セルウェル（岩城硝子）に加えたもの
を用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの全内
容物を移した。これを前記ｂ）と同様に７％炭酸ガス存
在下、３７℃で約１週間培養に付した。その間１〜２回
各ウェルの上清０．５ｍｌを新しいＨＴ培地０．５ｍｌ
と交換した。ハイブリドーマの充分生育した時点でＥＬ
ＩＳＡ法により陽性を再確認し、それぞれについて次項
ｅ）記載の限界希釈法によるクローニングを行った。な
お、クローニングに使用後の残液をポリスチレン製２５
ｃｍ² 組織培養フラスコ（岩城硝子）に移し、凍結保存
用試料を調製した。

【００３２】ｄ）ＥＬＩＳＡ法による抗ＭＭＰ−８抗体
産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，２０５，１９８
０に記載のＲｅｎｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．の方法を若干
改変した方法を用いた。この方法は、ハイブリドーマ抗
体の検出に適している。９６穴ミクロタイトレーション
プレート（Ｆｌｏｗ Ｌａｂ．）を１００ｎｇのヒトＭ
ＭＰ−８でコートし、次に、未コート部分を１％ＢＳＡ
でブロックした。これに前記ｃ）で得られたハイブリド
ーマ生育ウェルの上清の一部を加えて室温で約１時間イ
ンキュベートした。２次抗体として西洋わさびペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン
（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．）を加え、更に室温で約１時
間インキュベートした。次に基質である過酸化水素とｏ
−フェニレンジアミンを加え生成した褐色の程度をマイ
クロプレートリーダー（ＭＲＰ−Ａ４、東ソー）を用い
て４９２ｎｍの吸光度を測定し判定した。

【００３３】ｅ）クローニング 前記ｃ）の操作後、各ウェル中には、２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地 １ｍｌ当りフ
ィーダーとして１０⁷ 個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６穴マイクロウェルの３６ウェ
ル、３６ウェル及び２４ウェル当り５個、１個及び０．
５個のハイブリドーマを加えた。５日目、１２日目に全
ウェルに各０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加した。クロ
ーニング開始後１４〜１５日で充分なハイブリドーマの
生育が認められ、コロニー形成陰性ウェルが５０％以上
である群についてＥＬＩＳＡ法を行った。テストした全
ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル中のコロニー
数を確認し、ウェル中に１コロニーが確認されたウェル
を４〜６個選び再クローニングする。最終的に表１に示
したようにヒトＭＭＰ−８に対するモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマを得た。

【００３４】ｆ）モノクローナル抗体の生体外増殖及び
生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な培
養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から１０〜
１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得るこ
とができた。一方、大量に抗体を得るために、脾細胞と
ミエローマ細胞の由来動物と同系のマウス（ＢＡＬＢ／
ｃ）に１匹当り０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤プリスタン
（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を腹腔内投与し
た。１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×１０⁷ 個を
同じく腹腔内投与し、更にその１〜２週間後に生体内で
産生された１〜４ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含
む腹水を得ることができた。

【００３５】ｇ）モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、ヒトＭＭＰ−８をコー
トしたミクロタイトレーションプレートに前記ｅ）で得
られた各モノクローンの培養上清を加えた。次にＰＢＳ
により洗浄した後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウス
Ｉｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．）を加えた。ＰＢＳに
よる洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
抗体を加え、基質として過酸化水素及び２，２′−アジ
ノージ（３−エチルベンゾチアゾリン硫酸）を用いてそ
れぞれの重鎖及び軽鎖を判定した。その結果をまとめて
後掲の表１に示した。 ｈ）モノクローナル抗体の精製 前記ｆ）で得られた各腹水を４０％飽和硫酸アンモニウ
ムで分画した後、ＩｇＧ１クラスの抗体について０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝
液（ｐＨ８．９）で平衡化したアフィゲル プロテイン
Ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）カラム（φ２．５×１
１ｃｍ）に吸着させ、上記緩衝液で洗浄後、０．１Ｍク
エン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出した。溶出液４ｍｌ
／フラクションに分画したところ、例えばクローンＮ
ｏ．１１５−１Ｆ９（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
４３００）ではフラクション３６〜４３に、クローンＮ
ｏ．１１５−９Ｄ９（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
４３０２）ではフラクション３６〜５０に、クローンＮ
ｏ．１１５−１１Ｂ２（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４３０１）ではフラクション３６〜４５に溶出され精
製できた。

【００３６】実施例２ イムノブロッティング ａ）免疫染色 実施例１、ａ）でＫｎａｕｐｅｒ ｅｔ ａｌ．の方法
により調製したヒトＭＭＰ−８をドデシル硫酸ナトリウ
ムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）に供した後、細胞工学，１８２，１０６１−１
０６８，１９８３に記載の田部の方法に従ってウエスタ
ンブロッティングを行い、各モノクローンの培養上清と
反応後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａ
ｐｐｅｌＬａｂ．）を用い、間接法により免疫染色を行
った。ＭＭＰ−８には潜在型ＭＭＰ−８と活性型ＭＭＰ
−８があることが知られており、分子量はそれぞれ８５
ｋＤａと６４ｋＤａであるとされているが、分子量は分
子中に含まれる糖鎖の種類、長さ、分解の程度などによ
り幾分異なって測定される場合もあると考えられてい
る。活性型ＭＭＰ−８は、潜在型ＭＭＰ−８のアミノ末
端側が欠失することにより生成すると考えられる。更に
活性型ＭＭＰ−８は自己分解により切断されると考えら
れており、結果として分子量４５ｋＤａ断片と分子量２
５ｋＤａ断片になると考えられている。活性型ＭＭＰ−
８から生ずる二つの断片のうち分子量２５ｋＤａ断片は
カルボキシル末端側領域と考えられる。表１に掲げたモ
ノクローナル抗体のうち１６クローンが陽性として認め
られ、そのうち１１５−５Ｄ１０、１１５−６Ｂ２、１
１５−９Ｄ９（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３０
２）、１１５−１４Ｂ６、１１５−１５Ｃ５の５クロー
ンが潜在型ＭＭＰ−８のみを認識することからＭＭＰ−
８のアミノ末端領域を認識する抗体であることが示され
た。１１５−１Ｆ９（生工研受託番号ＦＥＲＭＰ−１４
３００）、１１５−４Ｅ３、１１５−７Ｆ７、１１５−
１２Ａ１，，１１５−１３Ｄ２、１１５−１８Ｃ４、１
１５−２１Ｂ８、１１５−２６Ａ１、１１５−３０Ｆ６
の９クローンが潜在型、活性型ＭＭＰ−８の両方を認識
することから、ＭＭＰ−８のアミノ末端領域以外の領域
を認識することが示された。また、１１５−２Ｈ５は、
潜在型、活性型に加え４５ｋＤａ断片も認識することか
らＭＭＰ−８の中央領域を認識し、１１５−１１Ｂ２
（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３０１）は、潜在
型、活性型に加え２５ｋＤａ断片を認識し、この抗体は
ＭＭＰ−８のカルボキシル末端領域を認識することが示
された（表１）。

【００３７】ｂ）特異性 間質型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）：ヒト皮膚線維芽細
胞ＣＣＤ−４１ＳＫ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １５０
５）より、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，１
−１４，１９９３に記載のＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．の
方法に従い精製した。 ７２ｋＤａゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）：ヒト新生児皮
膚線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢ（ＲＣＢ ２２２）よりＣｌ
ｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２１，９１−１０３，１
９９３に記載のＦｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．の方法
に従い精製した。 ストロムライシン−１（ＭＭＰ−３）：上記ＮＢ１ＲＧ
ＢよりＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１１，５９−
７２，１９９２に記載のＯｂａｔａ ｅｔａｌ．の方法
に従い精製した。 ９２ｋＤａゼラチナーゼ（ＭＭＰ−９）：ヒト線維肉腫
細胞ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ １２１）
よりＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１７１２−
２１７１９，１９９２に記載のＯｋａｄａ ｅｔ ａ
ｌ．の方法に従い精製した。 前記ａ）の免疫染色で陽性となった抗ヒトＭＭＰ−８モ
ノクローナル抗体１６クローンのうち、１１５−１Ｆ
９、１１５−９Ｄ９、１１５−１１Ｂ２、１１５−１３
Ｄ２の４クローンについて、上記の各ＭＭＰｓを用いて
イムノブロッティングを行ったところ、いずれのモノク
ローナル抗体もヒトＭＭＰ−１、ヒトＭＭＰ−２、ヒト
ＭＭＰ−３、ヒトＭＭＰ−９とは交差反応せず、ヒトＭ
ＭＰ−８に対して特異的に反応することが示された。

【００３８】実施例３ 酵素標識抗体（ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体）の調製 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，４，２０９−３２７，１
９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．の方法
に従って、マウス抗ヒトＭＭＰ−８ ＩｇＧ−ＨＲＰ複
合体を調製した。 ａ）ＳＨ基標識ＩｇＧの調製 ヒトＭＭＰ−８に対し、反応性が認められたモノクロー
ナル抗体（ＩｇＧ：クローンＮｏ．１１５−１１Ｂ２：
生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３０１）を０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し透析し、その溶液に
含有されるＩｇＧに対して１００倍モルのＳ−アセチル
メルカプト無水コハク酸をジメチルホルムアミド溶液と
して加え、３０℃、３０分間インキュベーションした。
次に、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を総
容量の１／５量、０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６．
０）を総容量の１／５０量、１Ｍヒドロキシルアミン溶
液（ｐＨ７．０）を総容量の１／５量加え、３０℃、５
分間静置後、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５
でゲルろ過し、ＳＨ基標識マウス抗ヒトＭＭＰ−８ Ｉ
ｇＧを得た。

【００３９】ｂ）マレイミド標識ＨＲＰの調製 ＨＲＰを１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、そのＨＲＰ量に対
して２５倍モル量のＥＭＣＳをジメチルホルムアミド溶
液として加え、３０℃、３０分間反応させた。この反応
液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した
セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過し、マレイミ
ド標識ＨＲＰ画分を分取した。 ｃ）ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体の調製 上記ａ）で調製したＳＨ基標識ＩｇＧ １モルに、上記
ｂ）で得られたマレイミド標識ＨＲＰ約５モルを加え、
４℃、２０時間静置した。この混合液を０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したウルトロゲル Ａｃ
Ａ４４カラム（Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ−ｌａ−Ｇａｒｅ
ｎｎｅ，フランス）でゲルろ過し、マウス抗ヒトＭＭＰ
−８ ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体画分を分取した。ＢＳＡ及
びクロルヘキシジンを各々０．１％及び０．００２％に
なるように添加し、４℃で保存した。

【００４０】実施例４ ＭＭＰ−８標準品の調製 ヒト胎盤を細切し、５ｍＭ塩化カルシウム、２０ｍＭ塩
酸ベンズアミジン、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフ
ルオリド（ＰＭＳＦ）、０．０５％Ｂｒｉｊ３５含有２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、ス
パチュラで充分に混和し、遠心分離（４０００ｒｐｍ，
４℃，４０分間）して得られた上清を抗ヒトＭＭＰ−８
モノクローナル抗体（クローンＮｏ．１１５−１３Ｄ
２）結合セファロース４Ｂカラムに供し、その吸着タン
パク質を０．１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ３．０）で溶出
した。その溶出液を５ｍＭ塩化カルシウム、２０ｍＭ塩
酸ベンズアミジン含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に対し透析し、ＤＥＡＥ−セファセル（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）に供した。その素通り画分を採取し、
更にアフィゲル プロテインＡ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａ
ｂ．）に供した。その素通り画分を採取しヒトＭＭＰ−
８を得た。精製により得られたヒトＭＭＰ−８は、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８０，５７９−５９９，１９７３
に記載のＬａｅｍｍｌｉ ｅｔ ａｌ．の方法に従いＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ分子量８５ｋＤａに単一
バンドを示した。このヒト胎盤より精製して得られたヒ
トＭＭＰ−８標品と好中球から精製して得られたヒトＭ
ＭＰ−８標品とを比較したところ、両者は同一との結果
を得た。

【００４１】実施例５ ＭＭＰ−８の定量 ａ）モノクローナル抗体結合固相担体の調製 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，４，２０９−３２７，１
９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．の方法
に従ってマウス抗ヒトＭＭＰ−８ ＩｇＧ（測定系Ａ：
クローンＮｏ．１１５−１Ｆ９：生工研受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４３００、測定系Ｂ：クローンＮｏ．１１５
−９Ｄ９：生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３０２）
を各々０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、
１００μｇ／ｍｌの濃度に調整した。そのモノクローナ
ル抗体溶液を９６穴マイクロプレートにウェル当り１０
０μｌずつ加え、４℃、２４時間静置した。次にモノク
ローナル抗体溶液を除去し、各々生理食塩液で３回洗浄
後、１％ ＢＳＡ，０．１Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，
緩衝液Ａ）に浸漬し、４℃で保存した。

【００４２】ｂ）１ステップサンドイッチＥＩＡ法 実施例４で得たヒトＭＭＰ−８を免疫反応用緩衝液で希
釈した標準ＭＭＰ−８あるいはヒトＭＭＰ−８を含む検
体を９６穴ビニルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に各々２０
μｌ加えた。次に実施例３で調製した酵素標識抗体を１
μｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ａで希釈し、上記ビニル
プレートに各々１００μｌずつ加え混和した。この混合
液を前項ａ）で調製した抗体結合プレートに１００μｌ
加え、室温で１時間反応させ、生理食塩液で３回洗浄し
た。次に０．０２％過酸化水素含有０．１Ｍクエン酸−
リン酸緩衝液（ｐＨ４．９）に溶解した２ｍｇ／ｍｌ
ｏ−フェニレンジアミンをウェル当り１００μｌ加え、
室温で３０分間反応後、２Ｎ硫酸１００μｌ添加し、反
応を停止させた。この反応混液のＡ₄₉₂ をマイクロプレ
ートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４，東ソー）を用いて測定
し、検量線より検体中のＭＭＰ−８量を求めた（図
１）。標準抗原０ｎｇ／ｍｌの吸光度を８回測定したと
きの平均（Ｍ）と標準偏差（ＳＤ）を算出し、Ｍ＋２Ｓ
Ｄに相当する標準抗原濃度を感度とするとき、その感度
は、測定系Ａ（固相用クローンＮｏ．１１５−１Ｆ９，
酵素標識用クローンＮｏ．１１５−１１Ｂ２）で０．４
８ｎｇ／ｍｌ（８．０ｐｇ／ａｓｓａｙ）、測定系Ｂ
（固相用クローンＮｏ．１１５−９Ｄ９，酵素標識用ク
ローンＮｏ．１１５−１１Ｂ２）で０．３４ｎｇ／ｍｌ
（５．７ｐｇ／ａｓｓａｙ）であった。なお、両測定系
の定量範囲はいずれも０．５〜５００ｎｇ／ｍｌ（８．
３〜８３００ｐｇ／ａｓｓａｙ）であった。

【００４３】ｃ）検体及び緩衝液 免疫反応用緩衝液（１％ＢＳＡ，０．１Ｍ塩化ナトリウ
ム及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液，
ｐＨ７．０）を使用し、前記ｂ）項記載の測定系Ａ及び
測定系Ｂの方法に従って体液中のＭＭＰ−８を測定し
た。ヒト血中ＭＭＰ−８を測定する場合、検体として血
清を用いると、採血から血清分離までの時間に依存して
ＭＭＰ−８量が増加した。一方、ＥＤＴＡ血漿では、血
清のようなＭＭＰ−８量の増加は認められなかった。検
体として関節液を用いる場合で、原液そのものでは粘度
が大きく正確な測定値を得ることが困難な場合には上記
緩衝液Ａで希釈することが好ましい。関節液を１〜１２
８倍希釈して測定を行ったところ、４倍以上の希釈で安
定した測定値が得られる。関節液を５倍希釈したものは
十分に測定用検体として用いることができる。

【００４４】ｄ）希釈試験 前記ｂ）、ｃ）に記載した方法に従い、希釈試験を行っ
た。緩衝液Ａで希釈した標準抗原あるいは１／１〜１／
５倍に倍数希釈した４種類の検体（健常人血漿及び５倍
希釈関節液）を９６穴ビニルプレートに２０μｌ加え
た。以下の操作は前記ｂ）に記載した操作と同様に行
い、各々希釈血漿及び関節液を測定した（表２及び表
３）。測定系Ａ及び測定系Ｂにおいて希釈試験に用いた
いずれの血漿及び関節液も充分な直線を示し（γ＞０．
９９１）、回帰直線もほぼ０点を通った。 ｅ）同時再現性試験 前記ｂ）、ｃ）に記載した方法に従い、標準抗原及び検
体（健常人血漿及び５倍希釈関節液）について測定系Ａ
及び測定系Ｂの同時再現性試験を行った（表４）。両者
の標準抗原液、血漿及び関節液の各測定値のいずれのＣ
Ｖ値も１０％以下であった。

【００４５】ｆ）添加回収試験 健常人血漿２０μｌに標準抗原液（０、１６、３１ｎｇ
／ｍｌ）、各２０μｌを添加したものを検体とし、８０
μｌの酵素標識抗体液（１２５０ｎｇ／ｍｌ）を加え
た。以下の操作は、前記ｂ）、ｃ）に記載した操作法と
同様に行い、ヒトＭＭＰ−８量を測定し、回収された標
準抗原量を算出した（表５）。血漿中の標準抗原量の平
均回収率は測定系Ａで９７％、測定系Ｂで７９％であっ
た。測定系Ａでは充分な回収率が得られたが、測定系Ｂ
での回収率は低かった。そこで測定系Ｂについて緩衝液
の検討を行った。緩衝液Ａにプロテアーゼインヒビター
である塩酸ベンズアミジンを最終濃度２０ｍＭになるよ
うに加えたところ（緩衝液Ｂ）、平均回収率８５％にな
った。このことより測定系Ｂの回収率の低下は、血中プ
ロテアーゼによるＭＭＰ−８の分解が原因であると考え
られる。また、関節液中での標準抗原量の平均回収率
は、測定系Ａで１０６％、測定系Ｂで９８％でいずれも
充分な回収率が得られた。 ｇ）血漿中ＭＭＰ−８量の測定 前記ｂ）、ｃ）に記載した１ステップサンドイッチＥＩ
Ａ法により検体として健常人血漿（ｎ＝１３）を用い測
定した。その結果、測定系Ａでは６．２±４．７ｎｇ／
ｍｌ（Ｍ±ＳＤ）、測定系Ｂでは７．０±５．０ｎｇ／
ｍｌであった。また同様な操作により、慢性関節リウマ
チ（ＲＡ）患者及び変形性関節症（ＯＡ）患者の関節液
を検体とし測定を行った。その結果、ＲＡ患者関節液
（ｎ＝３８）を用いた時、測定系Ａで４３９±５４５ｎ
ｇ／ｍｌ、測定系Ｂで４５４±６０４ｎｇ／ｍｌであ
り、ＯＡ患者関節液（ｎ＝３６）を用いた時、測定系
Ａ、測定系Ｂともに測定感度以下であった。

【００４６】実施例６ １ステップサンドイッチＥＩＡ法による検出ＭＭＰ−８
の分子サイズ ａ）潜在型ＭＭＰ−８の活性化 実施例４で得られたヒト潜在型ＭＭＰ−８に最終濃度１
ｍＭになるように４−ＡＰＭＡを加え、３７℃で活性化
を行い、０、３０、６０、９０分後に最終濃度１０ｍＭ
になるようにＥＤＴＡを加え、反応を停止した。潜在型
ＭＭＰ−８の活性化は、抗ＭＭＰ−８モノクローナル抗
体クローンＮｏ．１１５−１Ｆ９を用いイムノブロッテ
ィングにより確認した（図２）。３０分後に６４ｋＤａ
の活性型が認められ、９０分後には完全に潜在型は活性
型に変換された。

【００４７】ｂ）潜在型又は活性型ＭＭＰ−８の検出 実施例６、ａ）で調製したヒト活性型ＭＭＰ−８を実施
例５、ｂ）、ｃ）に記載した同操作で測定した（図
３）。測定系Ａでは、ＭＭＰ−８の活性化が起こっても
測定値（Ａ₄₉₂ 値）の低下はみられなかったが、測定系
Ｂでは、活性化が進むにつれ測定値（Ａ₄₉₂ 値）の低下
がみられた。従って、測定系Ａは、潜在型、活性型ＭＭ
Ｐ−８の両方を検出し、測定系Ｂは潜在型ＭＭＰ−８の
みを特異的に検出することが示された。

【００４８】実施例７ ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２添加効果及び活性型ＭＭＰ
−８の測定 測定系Ａは活性型ＭＭＰ−８も認識することができる。
活性型ＭＭＰ−８は、そのインヒビターであるＴＩＭＰ
−１あるいはＴＩＭＰ−２と複合体を形成する。そこ
で、一定量の活性型ＭＭＰ−８に種々の濃度のＴＩＭＰ
−１あるいはＴＩＭＰ−２を加えたものを検体とし、測
定系Ａに対する影響を調べた。 ａ）ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２の精製 ＴＩＭＰ−１は、ヒト胎盤より、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２７，１０３−１０８，１９９０に
記載のＫｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．の方法に従い精製し
た。ＴＩＭＰ−２は、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，
２２０，３１−４５，１９９３に記載のＦｕｊｉｍｏｔ
ｏ ｅｔ ａｌ．の方法に従い精製した。

【００４９】ｂ）ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２の添加
効果及び活性型ＭＭＰ−８の測定 実施例６、ａ）に記載した操作により得た活性型ＭＭＰ
−８を用いて以下の操作を行った。ヒト活性型ＭＭＰ−
８量を一定とし、ＴＩＭＰ−１あるいはＴＩＭＰ−２を
モル比（ＴＩＭＰ−１あるいはＴＩＭＰ−２／ヒト活性
型ＭＭＰ−８）が０、０．０４、０．２、１、５、及び
２５となるように加えた。反応後、実施例５、ｂ）、
ｃ）に記載した測定系ＡでＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−
２の添加効果を調べた（図４、図５）。その結果、ＴＩ
ＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２の添加量の増加とともに測定
値（Ａ₄₉₂ 値）の低下がみられた。

【００５０】更にＫｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌ
ｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，７，３４１−３５０，
１９８７に記載の抗ウシＴＩＭＰ−１モノクローナル抗
体（クローンＮｏ．７−６Ｃ１：微工研受託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３４６８）、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−
４５，１９９３に記載の抗ＴＩＭＰ−２モノクローナル
抗体（クローンＮｏ．６８−６Ｈ４：微工研受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２６９１、６７−４Ｈ１１：微工研受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９０）を用いＭＭＰ−８−Ｔ
ＩＭＰ−１複合体及びＭＭＰ−８−ＴＩＭＰ−２複合体
の検出を試みた（図４、図５）。その結果、ＭＭＰ−８
−ＴＩＭＰ−１複合体測定系として固相抗体にクローン
Ｎｏ．１１５−１１Ｂ２、酵素標識抗体にクローンＮ
ｏ．７−６Ｃ１を用いたとき（測定系Ｃ）、ＴＩＭＰ−
１の添加量の増加とともに測定値（Ａ₄₉₂ ）の上昇がみ
られ、モル比が１：１のところで平衡に達した。すなわ
ち、ＭＭＰ−８−ＴＩＭＰ−１複合体を上記二種類のモ
ノクローナル抗体を用いて測定することにより、活性型
ＭＭＰ−８を測定できることが示された。一方、固相抗
体にクローンＮｏ．１１５−１Ｆ９、酵素標識抗体にク
ローンＮｏ．７−６Ｃ１を用いたとき（測定系Ｄ）、Ｔ
ＩＭＰ−１の増加にもかかわらず、測定値（Ａ₄₉₂ 値）
は感度以下であり、複合体を測定することはできなかっ
た（図４）。

【００５１】次に、ＭＭＰ−８−ＴＩＭＰ−２複合体測
定系として固相抗体にＴＩＭＰ−２アミノ末端領域認識
クローンＮｏ．６８−６Ｈ４、酵素標識抗体にクローン
Ｎｏ．１１５−１１Ｂ２を用いたとき（測定系Ｅ）、Ｔ
ＩＭＰ−２の添加量の増加とともに測定値（Ａ₄₉₂ 値）
の上昇がみられ、モル比１：１のところで平衡に達し
た。すなわち、ＭＭＰ−８−ＴＩＭＰ−２複合体を上記
二種類のモノクローナル抗体を用いて測定することによ
り、活性型ＭＭＰ−８を測定できることが示された。ま
た、固相抗体にクローンＮｏ．１１５−１Ｆ９、酵素標
識抗体にＴＩＭＰ−２カルボキシル末端領域認識クロー
ンＮｏ．６７−４Ｈ１１を用いたとき（測定系Ｆ）、Ｔ
ＩＭＰ−２の増加にもかかわらず測定値（Ａ₄₉₂ 値）は
感度以下であり、複合体を測定することはできなかった
（図５）。

【００５２】以上の結果より、クローンＮｏ．１１５−
１１Ｂ２は、ＴＩＭＰｓと複合体を形成した活性型ＭＭ
Ｐ−８を認識できるが、クローンＮｏ．１１５−１Ｆ９
は認識できず、この１１５−１Ｆ９抗体は、活性型ＭＭ
Ｐ−８がＴＩＭＰｓに結合する領域を認識すると考えら
れる。すなわちＫｎａｕｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．，２９１，８４７−８５４，１９９３）
は、ＴＩＭＰｓがＭＭＰ−８のカルボキシル末端領域と
は結合せず、触媒領域（中央領域）と結合すると報告し
ていることより、１１５−１Ｆ９抗体はＭＭＰ−８の中
央領域を認識する抗体であることが示唆された。従っ
て、測定系Ａは、潜在型ＭＭＰ−８とフリーの活性型Ｍ
ＭＰ−８を検出することはできるが、ＴＩＭＰｓとの複
合体を形成した活性型ＭＭＰ−８は検出できないという
ことが判明した。また、ＭＭＰ−８のカルボキシル末端
領域を認識するモノクローナル抗体（クローンＮｏ．１
１５−１１Ｂ２）及びＴＩＭＰ−１に対するモノクロー
ナル抗体（クローンＮｏ．７−６Ｃ１）あるいはＴＩＭ
Ｐ−２のアミノ末端領域に対するモノクローナル抗体
（クローンＮｏ．６８−６Ｈ４）を使用することによ
り、活性型ＭＭＰ−８の測定が可能であることが示され
た。

【００５３】

【発明の効果】本発明では、ＭＭＰ−８の各種領域を特
異的に認識することができるモノクローナル抗体を用い
ることによりＭＭＰ−８の免疫学的測定を達成できる。
特に二種類の該モノクローナル抗体を用いることによ
り、被検試料中の潜在型ＭＭＰ−８あるいは潜在型及び
活性型ＭＭＰ−８の両方、そして活性型ＭＭＰ−８とＴ
ＩＭＰｓとの複合体を測定することができ、その結果活
性型ＭＭＰ−８を感度ならびに精度良く、また迅速に定
量し得る。そしてこうしてＭＭＰ−８の免疫学的測定を
達成できることにより、慢性関節リウマチなどのような
炎症性疾患だけでなく、腫瘍性疾患においても腫瘍の伸
展とともに炎症反応がよくみられるが、この炎症反応に
おいて重要な働きをしていると考えられるＭＭＰ−８を
精度良く且つ迅速に定量できるので、これら炎症反応の
診断の道を開き、さらには慢性関節リウマチなどのよう
な炎症性疾患、腫瘍性疾患などの診断剤として有用であ
る。

【００５４】

【表１】

【００５５】

【表２】

【００５６】

【表３】

【００５７】

【表４】

【００５８】

【表５】

【図面の簡単な説明】

【図１】１ステップサンドイッチＥＩＡ法により得られ
たヒトＭＭＰ−８の標準曲線を示すグラフである。

【図２】潜在型ＭＭＰ−８の活性化処理における活性化
ＭＭＰ−８のイムノブロッティングの結果を表す図であ
る。

【図３】ＭＭＰ−８の活性化に供なう測定系Ａ、測定系
Ｂそれぞれでの１ステップサンドイッチＥＩＡ法による
測定値の変化を示すグラフである。

【図４】測定系Ａ、Ｃ及びＤにおけるＴＩＭＰ−１の添
加の影響を示すグラフである。

【図５】測定系Ａ、Ｅ及びＦにおけるＴＩＭＰ−２の添
加の影響を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品 工業株式会社内 (72)発明者 早川 太郎 愛知県名古屋市天白区天白町平針大堤下 1355番地 (72)発明者 岡田 保典 石川県松任市若宮２丁目32番地 (56)参考文献 特開 平６−300757（ＪＰ，Ａ) ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩ ＭＥＮＴＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ 159 （1984）Ｐ．1455−1463 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧ ＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ 261〜 12！（1986）Ｐ．5645−5650

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 好中球コラゲナーゼに対し特異的に結合
   するモノクローナル抗体のうち好中球コラゲナーゼの実
   質的に異なる領域に対し特異的に結合するモノクローナ
   ル抗体であってかつそれらモノクローナル抗体のうちの
   少なくとも二種類を測定試薬として用いて免疫学的に測
   定を行うことを特徴とする好中球コラゲナーゼの免疫学
   的定量法。
2. 【請求項２】 使用する二種類のモノクローナル抗体の
   うち、一方に好中球コラゲナーゼの潜在型を特異的に認
   識するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする請
   求項１記載の定量法。
3. 【請求項３】 使用する二種類のモノクローナル抗体の
   一方に、好中球コラゲナーゼの中央領域を特異的に認識
   するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする請求
   項１記載の定量法。
4. 【請求項４】 使用する二種類のモノクローナル抗体の
   うち、少なくとも一方に好中球コラゲナーゼのカルボキ
   シル末端領域を認識するモノクローナル抗体を用いるこ
   とを特徴とする請求項１記載の定量法。
5. 【請求項５】 使用する二種類の抗体が、各々好中球コ
   ラゲナーゼのアミノ末端領域及びカルボキシル末端領域
   を認識するモノクローナル抗体を用い、潜在型好中球コ
   ラゲナーゼを測定することを特徴とする請求項１記載の
   定量法。
6. 【請求項６】 使用する二種類のモノクローナル抗体が
   各々好中球コラゲナーゼの中央領域及びカルボキシル末
   端領域を認識するモノクローナル抗体を用い、潜在型及
   び活性型好中球コラゲナーゼを測定することを特徴とす
   る請求項１記載の定量法。
7. 【請求項７】 好中球コラゲナーゼの中央領域を認識す
   るモノクローナル抗体のうち、ティシュ・インヒビター
   ・オブ・メタロプロテアーゼ結合好中球コラゲナーゼを
   認識しないモノクローナル抗体。
8. 【請求項８】 好中球コラゲナーゼの中央領域を認識す
   るモノクローナル抗体のうち、ティシュ・インヒビター
   ・オブ・メタロプロテアーゼ結合好中球コラゲナーゼを
   認識しないモノクローナル抗体を用い、潜在型及び活性
   型の遊離好中球コラゲナーゼを測定することを特徴とす
   る請求項６記載の定量法。
9. 【請求項９】 使用する二種類のモノクローナル抗体の
   うち一方を固相担体に結合させる抗体として用い、他方
   を標識物を付与する抗体として用いて、サンドイッチ法
   により免疫学的に測定を行うことを特徴とする請求項１
   〜６及び８のいずれか一記載の定量法。
10. 【請求項１０】 好中球コラゲナーゼのカルボキシル末
    端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体とティシ
    ュ・インヒビター・オブ・メタロプロテアーゼ類に特異
    的に結合する抗体を用い、免疫学的に活性型ＭＭＰ−８
    とＴＩＭＰｓ複合体の測定を行うことを特徴とする活性
    型好中球コラゲナーゼの免疫学的定量法。
11. 【請求項１１】 好中球コラゲナーゼのカルボキシル末
    端領域を認識する抗体とティシュ・インヒビター・オブ
    ・メタロプロテアーゼ−１を特異的に認識するモノクロ
    ーナル抗体を用い、サンドイッチ法により測定を行うこ
    とを特徴とする請求項１０記載の定量法。
12. 【請求項１２】 好中球コラゲナーゼのカルボキシル末
    端領域を認識するモノクローナル抗体とティシュ・イン
    ヒビター・オブ・メタロプロテアーゼ−２のアミノ末端
    領域を認識するモノクローナル抗体を用い、サンドイッ
    チ法により測定を行うことを特徴とする請求項１０記載
    の定量法。
13. 【請求項１３】 免疫学的反応にキレート化剤を含む緩
    衝液を用いることを特徴とする請求項１〜６及び８〜１
    ２のいずれか一記載の定量法。
14. 【請求項１４】 キレート化剤にエチレンジアミン四酢
    酸塩を用いることを特徴とする請求項１３記載の定量
    法。
15. 【請求項１５】 ヒト血漿又は関節液を検体として用い
    ることを特徴とする請求項１〜６及び８〜１４記載の定
    量法。
16. 【請求項１６】 エチレンジアミン四酢酸塩処理による
    ヒト血漿を検体として用いることを特徴とする請求項１
    ５記載の定量法。