JP2647882B2

JP2647882B2 - 鮫組織から単離した有効成分

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Publication number: JP2647882B2
Application number: JP62505103A
Authority: JP
Inventors: 芳規小菅; 卓夫小菅; 邦郎辻; 均司石田
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-08-21
Filing date: 1987-08-21
Publication date: 1997-08-27
Anticipated expiration: 2012-08-27
Also published as: DE3787971D1; US5632997A; PT85573A; DK218388D0; GR871312B; NZ221527A; US5026883A; DK218388A; EP0329656A4; JPH02503554A; DK168742B1; EP0329656A1; ZA876171B; DE3787971T2; CA1296322C; EP0329656B1; HK149394A; US5470574A; PT85573B; ES2007401A6

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、天然組織から抽出による有効成分の同定、
単離および調製に関し、さらに詳しくは、鮫の特定組織
からの抽出によるかかる有効成分の同定、単離および調
製に関する。

日本においては、「深海鮫肝油」として公知の調製物
は民間治療薬として長い間用いられてきた。それは鮫の
肝臓から調製された油であり、通常カプセル化してソフ
トカプセルとされる。肝油は多くの種類の病気、特に、
肝炎、腎炎および糖尿病等のごとき肝臓に関係する病気
の治療において効果的であると言われている。その上、
外用で用いた場合、肝油は、熱傷、火傷または他のタイ
プの皮膚障害の治療に有効であり、また、化粧品の成分
としても理想的であると広く認識されている。

本発明者らはこの物質について長年研究し、最近、油
溶成分よりもむしろ鮫肝臓の水性成分に活性物質が存在
するという予期せぬ事実を見い出した。この事実は、肝
油と、水の蒸発によって肝臓の水性成分から精製した粉
末を実際に使用した比較から認められた。１日当たり肝
油900mgの用量と１日当たり粉末60mgの用量との比較テ
ストにおいて、後者は前者よりも良好な臨床結果を与え
た。さらに、肝油を水で十分に洗浄した場合、得られる
油はほとんど効果を示さなかった。これらの事実は深海
鮫の肝臓の活性物質は以前信じられていたように油溶性
ではなくて、水溶性であることを示す。

本発明により、鮫の肝臓および／または胆嚢の水性抽
出物から単離した有効成分が提供される。

本発明の第一の態様により、Ａがナトリウム、カリウ
ム、カルシウムまたはアンモニウムのごときカチオン、
あるいは有機アミンである、実質的に純粋形態の一般式
Ｉの化合物が提供される。

他の態様において、本発明は、実質的に純粋形態の一
般式Ｉの化合物の調製法、と共にかかる化合物よりなる
医薬用、規定食用または化粧品用組成物を提供する。

以下に詳細に記載する活性アッセイを用いることによ
って、有効成分は水溶性であり、鮫肝臓の油溶性成分中
には存在しないことが示された。これらのアッセイは有
効成分が肝臓のみに存在するか否かを確認するために一
連のテストで用いた。骨、肉、胆嚢、卵巣、消化管のご
とき鮫の体のすべての部分を調べ、アッセイにおいて、
胆嚢が肝臓と同様の活性を示すことが判明した。この結
果は、有効成分が肝臓と胆嚢のみに存在することを示
す。

一般に、本明細書中で言い、有効成分源を同定するの
に用い、および抽出物の純度を評価するのに用いる２つ
のバイオアッセイは物質の特徴的な薬理活性を同定する
ように設計した。特に、（Ａ）および（Ｂ）と称するバ
イアッセイは以下の活性に基づくものである。

（Ａ）有効成分は四塩化炭素によって引き起こされるマ
ウスの肝臓障害を防止する。

（Ｂ）有効成分はニコチンのごとき毒性物質を投与した
マウスにおいて呼吸数を増加させる。

また、本発明は鮫の肝臓および／または胆嚢の水性抽
出物を調製し、次いで該水性調製物から有効成分を単離
する工程からなる、前記したごとき有効成分の調製法を
提供するものである。

以下の記載は、極性有機溶媒での抽出、適当な吸着剤
への吸着および／またはクロマトグラフィー技術を含
む、鮫の肝臓および／または胆嚢の水性抽出物からの有
効成分の一般的単離手順を説明する。

有効成分がメタノール、エタノール、アセトン等のご
とき極性有機溶媒に可溶性か否かを測定するために、鮫
胆汁の凍結乾燥によって得た粉末を極性有機溶媒で抽出
し、次いで、（Ａ）および（Ｂ）アッセイを可溶部分お
よび不溶部分の双方に適用した。活性は可溶部分につい
てのアッセイのみで見られ、かくして有効成分は極性有
機溶媒に可溶であることが確認される。

有効成分が吸着剤を用いて単離できるか否かを測定す
るテストにおいて、多くの吸着剤を調べ、有効成分は塩
基性アニオン交換タイプのイオン交換樹脂、またはXA
D、HP−20、Sep−pak C18等のごとき合成吸着剤、ある
いは木炭によって吸着されることが判明した。この吸着
テストは鮫の肝臓および／または胆嚢を水で抽出するこ
とによって行った。テストにおける各吸着剤を抽出物に
添加し、一晩放置した。次いで、混合物を濾過し、各濾
液を（Ａ）および（Ｂ）アッセイによって活性について
テストした。結果は、活性物質が前記したそれらの吸着
剤によって吸着されることを示した。有効成分は酸、ア
ルカリまたは塩での抽出により吸着剤樹脂より、および
極性有機溶媒での抽出により合成吸着剤および木炭から
回収できる。

有効成分のさらなる精製はクロマトグラフィー、例え
ば、シリカカラム、セファデックス LH−20カラムによ
って、あるいは調製TLC（薄層クロマトグラフィー）ま
たはHPLC（高速液体クロマトグラフィー）等によって達
成される。各方法は満足する結果を与えたが、PHLCが一
番良い精製を与えた。HPLCによって単離した有効成分は
非常にシャープな単一のピークを与え、またTLCで0.36
の概略代表Rf値の単一スポットを与えるのでかなり純粋
であった。その精製された形態の有効成分は融点140℃
の白色粉末である。

バニリン硫酸による精製有効成分のテストは紫色を与
え、それがその構造中に胆汁酸または胆汁アルコールを
含有することを示す。鮫の胆汁がスキムノールと指称さ
れる胆汁アルコールを含有することはすでに判明してい
る。無水酢酸での有効成分の部分アセチル化、続いての
数日間の乾燥ジオキサン−トリクロロ酢酸での粗製生成
物の処理の後、スキムノールを反応混合物から同定し
た。結果は、有効成分がスキムノール誘導体であること
を示した。有効成分としては、それが鮫の胆汁に含有さ
れる純粋なスキムノール誘導体の最初の単離であっ
た。。

（胆嚢のホモジネート化および凍結乾燥によって得ら
れた）リゾプリノドン・アクタス（Rhizoprinodon acut
us）の凍結乾燥胆汁からの有効成分の単離の好ましい手
順を以下のチャートに示す：リゾプリノドン・アクタス（Rhizoprinodon acutus）
の凍結乾燥胆汁 1.n−ヘキサン（100mlx3） 2.MeOH（100mlx3）で抽出画分Ｉ（MeOH−抽出物） 1.H₂Oに溶解 2.アンバーライト XAD−２クロマトグラフィー i.H₂O（400ml） ii.MeOH（400ml）で溶出画分II（MeOH−溶出物） 1.CHCl₃−MeOH（1:1）に溶解 2.セファデックス LH−20 クロマトグラフィー i.CHCl₃−MeOH（1:1）（300ml） ii.MeOH（500ml）で溶出画分III HPLC:YMC−Pack Ａ−324（ODS）無色粉末（化合物Ｉ）前記したごとく、この手順において、凍結乾燥した物
質をｎ−ヘキサンでガスきし、次いで、メタノールで抽
出した。かくして得られた濃縮物を、バッチ式にて、溶
離剤としてH₂O、およびエタノールを用いるアンバーラ
イト XAD−２カラムに付した。エタノール溶出物は
（発色試薬によって測定した）有効成分を含有するの
で、この画分を続いてクロロホルム−メタノールおよび
メタノールを用いるセファデックス LH−20上のゲル濾
過に付した。有効成分はメタノール溶出物中に多く含有
されていたので、続いての逆相カラムを用いるHPLCの適
用によってその最終精製を行った。

スキムノールはサルフェートエステルの形態であるこ
とが示唆されてきたが、スキムノールはサルフェートエ
ステル基が結合する可能性のある６つのヒドロキシル基
を有するので、サルフェートエステルの結合の位置につ
いて明確な情報が公表されたことはない。本スキムノー
ル誘導体が純粋な物質として単離されたことはない。HP
LCによって精製した活性粉末を元素分析に付した。結果
は:C₂₇H₅₁O₉NSとして、計算値C;57.34、H;9.02、N;2.4
7、S;5.66 実測値C;57.23、H;8.92、N;2.45、S;5.30。
これらの結果は、活性化合物は構造中にアンモニウムサ
ルフェートエステルを有することを示唆した。活性粉末
の核磁気共鳴スペクトロスコピーは以下の特性を示し
た。¹ H−NMR（d₄−MeOH中）δ（ppm） 4.22（dd,1H,J＝4.5および10.0Hz）、 4.11（dd,1H,J＝10.0および16.7Hz）、 4.00（bs,1H）、3.80（d,1H,J＝1.2Hz）、 3.60−3.80（m,4H）、3.30−3.45（m,1HH）、0.72（s,3
H）¹³ C−NMR（d₄−MeOH中）δ（ppm）:74.1（ｄ）、72.9
（ｄ）、71.3（ｄ）、69.1（ｄ）、66.7（ｔ）、48.4
（ｄ）、47.8（ｄ）、47.5（ｓ）、43.1（ｄ）、43.0
（ｄ）、41.0（ｄ）、40.4（ｔ）、37.0（ｄ）、36.5
（ｔ）、35.9（ｓ）、35.8（ｔ）33.3（ｔ）、32.1
（ｔ）、31.2（ｔ）、29.6（ｔ）、28.8（ｔ）、27.9
（ｄ）、24.3（ｔ）、23.2（ｑ）、18.1（ｑ）、13.1
（ｑ） ¹³C−NMRスペクトルは、活性化合物が３つのメチル、
11のメチレン、11のメチレンおよび２つの第三級炭素よ
りなる27個までの炭素原子を有することを示す。¹H−NM
Rスペクトウにおける低磁場（0.72−2.35）におけるシ
グナルは、それがコプロスタン誘導体であるようにみえ
ることを示唆する。¹³C−NMRスペクトルにおける高磁場
において、74.1（ｄ）、72.9（ｄ）、71.3（ｄ）および
69.1（ｄ）におけるシグナルはヒドロキシル基を有する
メチン炭素に帰属させることができる。そして、66.7
（ｔ）および61.2（ｔ）における２つのシグナルはＯ−
置換メチレン炭素に帰属させることができる。DD0COSY0
NMRスペクトルとＣ−Ｈ−シフト−COSYとの関係は、こ
れらの２つの炭素がメチン炭素に結合し、低化学シフト
（66.7）を有するそれらのうちの１つが¹H−NMRスペク
トウにおいて4.22（ｄ）および4.14（dd）ppmにて２つ
の非同等なプロトンを有することを示し、これは活性化
合物が分子中にHOCH₂−CH−CH₂ORの部位を有することを
示す。元素分析の結果より、Ｒは−SO₃NH₄である。

これらのNMRスペクトルおよび元素分析より、該粉末
は３α,7α,12α,24ξ,26−ペンタヒドロキシプロスタ
ン−27−アンモニウムサルフェートエステルと同定され
る。構造中のアンモニウムイオンは、恐らく、ナトリウ
ムイオンの置換による、HPLCの移動相として用いた硫酸
アンモニウム緩衝液に由来したものでだろう。この点を
秋らあにするために、XAD−２、次いで、セファデッス
ク LH−20上のカラムクロマトグラフィーによって精製
した活性粉末をナトリウムについての原子吸光スペクト
ロメトリーおよび窒素についての元素分析に付した。結
果は、元素分析C₂₇H₄₇O₉SNaとして、計算値 Na;4.03、
N;0.00、実測値 Na;3.57、N;0.02であった。構造にお
けるＣ−24位の立体化学はスキムノールのＸ線決勝解析
によって24Rと測定され、ナトリウムスキムノールサル
フェートの比旋光度は正であった。従って、鮫から単離
された有効成分は24R−（＋）−３α,7α,12α,24,26−
ペンタヒヒドロキシコプロスタン−27−ナトリウムサル
フェートエステルである。

サルフェートエステルにおけるナトリウムまたはアン
モニウムイオンはカリウム等のごとき他の金属イオンに
よって、またはアミノ酸等のごとき有機アミンカチオン
によって、あるいはよく知られた手順によって容易に置
換される。

以下の表は本発明の水性抽出物の活性を示す。

前記記載に言う標準的なバイオアッセイは以下のとお
りで行った：バイオアッセイ（Ａ）マウスにおける四塩化炭素（CCl₄）−誘発肝臓障害に体
する保護活性についての生物学的テスト雄Std:dd7マウス（体重30−35g）を動物５匹の群で用
いた。テスト物質の試料を適当な毎日の用量で７日間経
口投与し、最後の試料投与の24時間後にオリーブ油中の
５％CCl₄の0.1mlを経口投与した。CCl₄投与の24時間後
に眼窩洞から血液を採取した。遠心（3000rpm、10分）
によって血清を採取し、レイトマン−フランケル−モモ
ース（Reitman−Frankel−Momose）法によってグルタミ
ン酸ピルビン酸トランスアミネーゼ（CPT）活性を測定
した。活性を試料投与群と対称間のPT値の比較によって
表す。

バイオアッセイ（Ｂ）ニコチン投与マウスにおける呼吸に対する影響雄Std:ddyマウス（体重20−22g）を動物５匹の群で用
いた。ニコチン酒石酸塩（3mg）を皮下注射した。テス
ト物質の試料をニコチン投与の３時間前に経口投与し
た。ニコチン投与の後、30回呼吸の時間を５分間計数し
た。活性は、試料投与群と対称との間の計数した時間の
比較として表す。

また、本発明は、医薬上許容される担体または賦形剤
と共に、前記した活性物質よりなる医薬組成物を提供す
るものである。例えば、活性物質は公知の担体またはバ
ルク化剤と共に粉末として混合した後、安定な錠剤とし
て処方できる。別法として、活性物質は局所適用のため
のローションまたはクリーム中に一体化することができ
る。さらに別法として、鮫肝油と混合した後、所望によ
り、活性物質をソフトゼラチンカプセルに充填すること
もできる。かかる医薬組成物は、例えば、肝炎、腎炎、
糖尿病等のごとき肝臓を冒す病気または疾患の治療にお
いて肝臓の保護または肝臓機能の活性化に用いることが
できる。また、かかる組成物は、例えば、皮膚炎、外
傷、アクネの治療において、皮膚組織の再生の活性化に
用いることもできる。

活性物質を含有する組成物を用いて行った臨床テスト
は、肝臓機能の回復および脂漏の治療において特異的に
その活性が証明された。

本発明なさらなる態様において、１もしくはそれ以上
の適当な基剤または担体物質と共に、本明細書中に記載
する有効成分よりなる規定食または健康食組成物が提供
される。かかる組成物は、例えば、二日酔いの治療に有
用である。

もう１つの態様において、本発明は、化粧品基剤物質
と共に、前記した有効成分よりなる化粧品組成物を提供
するものである。

本発明の組成物は公知の薬剤または他の活性成分、例
えば、抗生物質または他の抗菌物質と一体化することも
できる。

本発明のさらなる詳細は以下の実施例から明らかであ
ろうが、それは何等本発明を限定するものではない。

実施例１−粗製有効成分鮫4kgから単離した肝臓および胆嚢の混合物280gを水3
00ml中でモホジネートし、混合物を12000rpmで30分間遠
心清澄な水性層を得た。塩基性アニオン交換タイプのイ
オン交換樹脂50gを該水性層に添加し、一晩放置した。
濾過によって該樹脂を取り出し、水で洗浄した。次い
で、樹脂を0.5％塩化ナトリウム溶液200mlで抽出した。
抽出溶液にXAD2の100gを添加した。濾過によってXAD2を
取り出し、水で洗浄した。エタノール200mlでXAD2を抽
出した。抽出物から、蒸留によってエタノールを除去し
て粗製の活性粉末45mgを得た。

実施例２−シリカゲルカラムクロマトグラフィー XAD−２カラム上への吸着によって得た粗製活性化合
物100gを、溶媒としてMeOH−CHCl₃−H₂O（30:70:6）を
用いるシリカゲルカラム上のクロマトグラフィーに付し
て白色粉末（40g）を得た。

実施例３−薄層クロマトグラフィー（TLC）粗製の活性化合物を、ｎ−BuOH（85）−AcOH（10）−
H₂O（５）およびMeOH（40）−CHCl₃（60）−H₂O（10）
を用いるプレコートしたシリカゲル60薄層プレート（Me
rk）上のTLCに付した。TLC上の単一スポットとして示さ
れる有効成分はバニリン硫酸試薬を噴霧することによっ
て可視化された。

実施例４−高速液体クロマトグラフィー（HPLC）逆相カラム付きの調製HPLの連続適用によって、粗製
の活性粉末の最終精製を行った。XAD−２精製試料か
ら、白色粉末形態の活性化合物、融点140℃、31gを得
た。活性化合物の概略の代表的保持時間は16分であっ
た。HPLCの条件は以下のとおりであった：カラム:YMC−
Pack Ａ−324（ODS）；液速:20ml/分；移動相:CH₃CN−
0.02Nリン酸アンモニウム緩衝液（pH7.45）（8:2）；検
出：屈折率実施例５−セファデックス LH−20上のカラムクロマト
グラフィー XAD−２カラム上への吸着によって得た粗製活性当号
物（100g）を、溶離液としてMeOH−CHCl₃（1:1）および
次いで、MeOHを用いるセファデックス LH−20カラム上
のゲル濾過に付してMeOH画分から白色粉末（45g）を得
た。同一カラム上での再クロマトグラフィーにより、ほ
とんど純粋の白色粉末30gを得た。

実施例６リゾプリノドン・アクタス（Rhizoprinodon acutus）
種（約8kg体重）の鮫５頭から得た胆嚢（65g）をホモジ
ネートし、次いで凍結乾燥した。この物質（10.25g）
を、有効成分、ナトリウムスキムノールサレフェート、
の源として用いた。ｎ−ヘキサン（100mlx3）を還流し
て該物質を脱脂した後、１時間の還流下、エタノール
（100mlx3）で抽出した。濃縮物（3.67g）をH₂O（80m
l）に溶解し、アンバーライトXAD−２カラム（3.0cmx1
6.0cm）に付した。カラムをH₂O（400ml）、次いでエタ
ノール（400ml）で溶出した。次いで、エタノール溶出
物（1.95g）をセファデックス LH−200カラム（3.0x3
2.0cm）、クロロホルムおよびメタノール（1:1）に付し
た。クロロホルムおよびメタノール（200ml）での溶出
後、カラムをメタノールで50mlづつ展開した。ナトリウ
ム塩を含有するメタノール溶出物の濃縮により、白色ガ
ム状物（1.06g）を得た。HPLCによりこの物質（120mg）
を精製して、ナトリムスキムノールサルフェート85.6mg
を白色粉末として得た。HPLCの条件は以下のとおりであ
った：カラム、YMC−Pack Ａ−324（ODS）10x300mm;液
速、2ml/分；移動相,35％CH₃CN−0.1Nリン酸ナトリウム
緩衝液（pH6.43）；検出、屈折率、ナトリウムスキムノ
ールサルフェートは以下の物理学的データを有する：白
色粉末；▲［α］²⁵ _D▼＝21.75（0.5c、MeOH中）；元素
分析:C₂₇H₄₇O₉SNaとして：計算値C;56.82 H;8.30 S;
5.62 Na;4.03 実測値:C;56.99 H;8.79 S;5.62 Na;
4.23 NIMS 質量（m/e）:654［C₂₇H₄₇SO₉・NH（C₂H
₆O）］、 3420、2950、1470、1380、1230、1070、980、910、810
¹H−NMR（CD₃OD中）；δ（ppm）:4.22（1H,dd,J＝4.
5,10.0Hz）、4.11（1H,dd,J＝6.6,10.0Hz）、4.00（1H,
ブロード）、3.80（1H,m）、3.80−3.62（3H,m）、3.45
−3.30（1H,）、2.35−2.15（2H,m）、2.05−1.02（23
H,m）、1.02（3H,d,J＝6.2Hz）、0.92（3H,s）、0.72
（3H,s） ¹³C−NMR（CD₃OD中）；δ（ppm）： 74.1（ｓ）、72.9（ｄ）、71.4（ｄ）、69.1（ｄ）、6
6.7（ｔ）、61.2（ｔ）、48.3（ｄ）、47.8（ｄ）、47.
5（ｓ）、43.1（ｄ）、43.0（ｄ）、41.0（ｄ）、40.3
（ｄ）、37.0（ｄ）、36.5（ｔ）、35.9（ｓ）、35.8
（ｔ）、33.3（ｔ）、32.1（ｔ）、31.2（ｔ）、29.5
（ｔ）、28.8（ｔ）、27.9（ｄ）、24.3（ｔ）、23.2
（ｑ）、18.1（ｑ）、13.1（ｑ）実施例７長期にわたった年数（72）定着した顔面脂漏過多症に
罹った40人の男性および女性患者に局所適用する抗脂漏
症ローションにおいて、本発明の有効成分を用いて試行
を行った。該試行は、20人の患者にプラシーボを適用
し、20の患者に有効成分を含有するローションを適用す
る二重盲検法として行った。

これらの試行において、20日間にわたって、毎日３回
（朝、昼、および晩）処置を適用し、第０日、（処理
前）、10および21日、（処置の最後）に脂漏（脂漏指
標）の評価を行った。

結果は、有効成分を含有するローションを用いた患者
では、プラシーボを用いた患者よりも脂漏が大きく改善
されたことを示した。また、この改善は男性および女性
双方の患者で観察された。

実施例８−組成物 1.コールドクリーム鯨ろう 6.0 g 蜜ろう 6.0 g カルボポル（Carbopol）934 10.0 g 炭酸ナトリウム 4.75g バラ水 5.0 ml バラ油 0.02ml 扁桃油 56.0 g 有効成分 0.05g 蒸留水 20.0 g 2.強壮剤エタノール 30ml 有効成分 20mg フレーバー q.s. 蒸留水十分量にて全量100ml

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 31/575 ＡＤＡＡ６１Ｋ 31/575 ＡＤＡ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】実質的に純粋形態である一般式I: ［式中、Ａはカチオンを意味する］の化合物。
【請求項２】該カチオンがナトリウム、カリウム、カル
シウムもしくはアンモニウムイオン、または有機アミン
である請求項１記載の化合物。
【請求項３】鮫の肝臓および／または胆嚢の水性抽出物
を調製し、次いで該水性抽出物から、実質的に純粋形態
である一般式I: ［式中、Ａはカチオンを意味する］の化合物を単離する工程よりなることを特徴とする一般
式Ｉの化合物の調製方法。
【請求項４】水性抽出物からの単離の該工程が溶媒抽
出、吸着およびクロマトグラフィーから選択される少な
くとも１つの工程である請求項３記載の方法。
【請求項５】実質的に実質的形態である一般式I: ［式中、Ａはカチオンを意味する］の化合物と、医薬上許容される担体または賦形剤とから
なることを特徴とする、肝臓を冒す病気または疾患の治
療において肝臓を保護するか、または肝臓機能を活性化
するための医薬組成物。
【請求項６】錠剤、カプセル剤、ローションまたはクリ
ームの形態である請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】実質的に実質的形態である一般式I: ［式中、Ａはカチオンを意味する］の化合物と、局所投与的に許容される担体または賦形剤
とからなることを特徴とする皮膚治療用組成物。
【請求項８】さらに抗生物質または他の抗菌物質よりな
る請求項７記載の組成物。
【請求項９】実質的に実質的形態である一般式I: ［式中、Ａはカチオンを意味する］の化合物と、化粧品基剤物質とからなることをを特徴と
する化粧品組成物。