JP2024522129A - 低温電子顕微鏡用の試料支持体 - Google Patents

Abstract

【要約】低温電子顕微鏡（低温ＥＭ）システムのための試料支持箔およびグリッド、開示される低温ＥＭ箔、グリッド、装置、および／またはシステムを作製／使用するための方法、ならびに開示される箔、グリッド、および／または装置を装備した低温ＥＭシステムが提示される。試料支持グリッドアセンブリは、対向する第１および第２のグリッド表面を有するグリッド本体と、第１のグリッド表面から第２のグリッド表面までグリッド本体を貫通して延在する複数のグリッド孔とを含んでもよい。箔シートは、第１の表面に対して着座され、グリッド本体のグリッド孔の少なくともサブセットを覆う。箔シートは、箔穴で充填され、複数の細長いスロットによって互いに分離された複数の箔領域を含む。これらの細長いスロットは、グリッドアセンブリが負荷を受けているときに、箔領域が互いに対して移動することを可能にする。スロットは、オーゼティックパターンで配置されてもよい。

Description

関連出願の優先権主張および相互参照
本出願は、２０２１年６月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１９７０７７号に対する優先権の利益を主張する。

政府支援の承認
この研究は、米国国立衛生研究所、一般医科学によって、賞番号Ｒ４３－ＧＭ１３７７２０－０１の下で支援されている。

本開示は、概して、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本開示の態様は、低温電子顕微鏡法用の試料支持体および試料冷却システムに関する。

単一粒子低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）は、大きな生体分子複合体、膜タンパク質、ならびに科学的、薬学的、および生物工学的に重要な他の標的の原子分解能に近い構造を得るための強力なアプローチである。高効率で高フレームレートの直接電子検出器、電子ビームによって誘発される運動に対して取得された「動画」を補正するためのアルゴリズム、および１０^５～１０^６の分子画像を分類し平均化するための計算ツールの開発によって、達成可能な解像度およびスループットが劇的に増加した。新しい低温ＥＭ設備への莫大な投資および使いやすいソフトウェアの開発は、特に非専門家へのアクセスを大きく拡大した。Ｘ線結晶学とは異なり、低温ＥＭは、溶液中に分散された少量の生体分子サンプルのみを必要とする。それは、結晶化に対して扱いにくい系の構造研究を可能にし、構造決定における初期の試みのための前進方法になりつつある。

Ｘ線低温結晶解析の場合と同様に、単一粒子低温ＥＭにおける重要な課題は、試料の調製および取り扱いに関連する。現在使用されている基本原理および方法は１９８０年代に開発され、最近の試料調製技術開発は、その当時に開発された考えおよび方法にしっかりと根付いている。歴史的に、生体分子試料は、発現され、単離され、精製される。約０．３ ｍｇ／ｍＬの目的の生体分子を含む凍結保護物質を含まない緩衝液を、グロー放電で清浄にし、そして荷電した、１０～５０ ｎｍ厚の炭素または金属（しばしば金）上に分配する。２００～４００メッシュ、１０～２５メッシュで支持された「ホイル」。mｍ厚さ、３ ｍｍ直径の金属（通常、銅または金）グリッド。過剰なサンプルは、生体分子の数倍の厚さ、すなわち約１０～５０ ｎｍを目標として、吸い取りおよび蒸発によって除去され、界面との相互反応によって優先的に配向される生体分子の割合を制限しながら、画質を最大化する。最良の画像化のために緩衝液をガラス化するために、試料を含有するホイル＋グリッドを、Ｔ約９０ Ｋの液体エタン（液体窒素冷却カップ中でガスを冷却することによって生成される）中に１～２ ｍ／秒で投入する。サンプルをエタンから液体窒素（ＬＮ２）に移し、グリッドボックスに入れ、追加の容器に移し、次いで貯蔵デュワーに移す。試料は、貯蔵デュワー瓶およびグリッドボックスから取り出され、次いで、低温顕微鏡ステージに装填されるか、または「クリップ」され、低温試料カセットに装填され、次いで、ステージまたはカセットは、顕微鏡に装填される。

これらの複雑な手順は困難を伴う。グリッド、特に箔は、多くの手作業の各工程で、日常的に曲げられ、引き裂かれ、その他の損傷を受ける。試料の分注、ブロッティング、および蒸発は不正確である。最終試料の膜厚は、制御が不十分である。生体分子は、優先的な配向を有するか、または変性を受ける可能性がある界面に蓄積する。プランジ冷却された試料は、しばしば、かなりの結晶氷を発生し、エタン、窒素、および水分にさらされた他の低温表面上に形成される氷によって汚染される。画像化中に電子ビームによって最初に照射されると、ガラス化された試料は、画像をぼやけさせ、情報の大きな損失を引き起こす急速な動きを受ける。

本開示の態様は、低温電子顕微鏡法のための試料支持体および試料冷却装置を使用するシステム、方法および装置に関する。本明細書に記載されるのは、例えば、試料支持体設計および試料冷却装置における革新である。これらの革新は、低温ＥＭにおいて達成可能な分解能を制限する重要な要因である電子ビーム誘起試料運動を低減し、達成可能な試料冷却速度を増加させるのに役立つはずである。開示された特徴はまた、より制御された試料調製および冷却、ならびにグリッドボックス内でのプランジ冷却後のグリッドの自動保管を容易にするのに役立つ。

低温ＥＭのための開示された試料支持体の少なくともいくつかは、約２．５～約３．５ ｍｍ、またはいくつかの構成では約３．０５ ｍｍの直径、約１０マイクロメートル（μｍ）～約２５μｍの厚さを有する金属グリッドからなり、炭素または金属の著しく薄い（例えば、約１０～約５０ナノメートル）試料支持体フィルム／箔によって上面を覆うことができる。少なくともいくつかの構成では、グリッドは、約５０～１５０μｍ、または少なくともいくつかの実装では、約６２～１２５μｍのピッチ／反復周期に対応する約２００～４００メッシュと、約２０～１３０μｍ、または少なくともいくつかの実装では、約３７～１０６μｍの直径／幅を伴う貫通孔を有するメッシュパターンを有してもよい。グリッドは、また開口のない中実の外側エッジ領域を有してもよい。箔は、典型的には約０．２～約２マイクロメートルの、はるかに小さい貫通孔のパターンを有してもよい。従来の設計は、尖った先端を有する金属ピンセットで取り扱われ、その取り扱い中にしばしば損傷を受ける。

本明細書に記載されるのは、機能性及び有用なスループットを改善するのに役立つグリッド及び箔に対する一連の革新である。

開示される概念の態様によれば、試料支持フィルムの下のグリッドは、鉗子を使用して単一の点ではなく、グリッドを両側で安全に把持することができる領域を提供するために、それが中実またはほぼ中実である２つの直径方向に対向する側に、グリッド領域の少なくとも１０％および５０％未満を一緒に含む実質的な領域を有してもよい。

開示される概念の態様によれば、試料支持フィルムまたは箔は、中実である把持部分を両側に有するグリッドの構成の中実である把持部分に実質的に重ならないようにサイズ決定および成形されてもよく、それにより、グリッドは、箔に接触することも箔を損傷することもなく中実領域上で把持され得る。

開示される概念の態様によれば、グリッドは、例えば、冷却中の内部領域と周囲領域との収縮の差による内部領域の応力および変形を低減するために、周囲のグリッド領域から機械的に隔離され得る１つまたは複数の内部領域を有してもよく、これらの収縮の差は、冷却中の温度の差から生じ得る。

開示される概念の態様によれば、グリッドの少なくとも１つの内部領域において、グリッドバーの幅および／または厚さが低減され、および／またはグリッド開口面積率が増加されて、例えば、グリッドの単位面積当たりの総熱質量を低減し、その冷却速度を増加させる。

開示される概念の態様によれば、グリッドの少なくとも１つの内部領域は、内部領域の周囲に接し、かつそれらの端部でのみ周囲領域に接続されるバーによって周囲領域に接続されてもよく、それにより、例えば、内部領域および周囲領域が異なる温度にあり、異なる量だけ収縮したときに、これらのバーは、内部領域へのそれらの接触点で横方向に偏向する。

開示される概念の態様によれば、グリッドの内部領域は、バーの軸に対して垂直に延びる小さなタブを介して各接線バーに接続されてもよい。

開示される概念の態様によれば、グリッドの内部領域は、例えば、グリッドが応力下に置かれたときに内部領域および周囲領域に対して変形を受けるジグザグまたは波状のばね形状の金属部材を介して周囲領域に接続されてもよい。

本開示の態様は、さらに、グリッド上に存在する箔、および、例えば、ビーム誘起試料運動を低減するための、それらの箔に対する改善に関する。

開示される概念の態様によれば、箔は、グリッド上に載置されてもよく、例えば、外側領域が取り付けられるグリッドバーが内側領域の箔よりもゆっくりと冷却するときに生じ得るように、外側領域が応力下にあるときに内部領域の応力および変形を低減するために、周囲のグリッド領域から機械的に隔離される１つまたは複数の内部領域を有してもよい。

開示される概念の態様によれば、１つまたは複数の箔内部領域は、内部領域の周囲に接し、かつその端部のみで周囲領域に接続されるバーによって周囲領域に接続されてもよく、それにより、例えば、内部領域および周囲領域が異なる温度にあり、異なる量だけ収縮したときに、これらのバーは、内部領域へのその接触点で横に偏向する。

開示される概念の態様によれば、内部領域は、バーの軸に対して垂直に延びる小さなタブを介して各接線バーに接続されてもよい。

開示される概念の態様によれば、箔の内部領域は、グリッドが応力下に置かれたときに内部領域および周囲領域に対して優先的に変形を受けるジグザグまたは波形のばね形状の金属タブを介して周囲領域に接続される。

開示される概念の態様によれば、グリッド上に載置される箔は、例えば、箔が引張応力下に置かれたときに応力の解放を可能にするスリットまたは開口のパターンを有する内部領域を有してもよく、その結果、これらの内部領域内の箔のいくつかの領域は、ほぼ応力がないままであるが、応力は他の領域に集中する。

開示される概念の態様によれば、箔上のスリットは、矩形領域を画定するパターンで配置されてもよく、これらのスリットは、箔が引張応力下に置かれたときに開き、スリットによって境界を定められた内部領域における応力を低減するように設計されてもよい。

開示される概念の態様によれば、箔上のスリットは、矩形領域を画定するパターンで配置されてもよい。箔が引張応力下に置かれると、スリットは開き、その開口パターンは、矩形領域が回転するが、ほぼ応力がない状態を維持し、スリット間の「ヒンジ」領域に応力集中が生じるようなものである。

開示される概念の態様によれば、箔のスリットは、回転平行四辺形、異なるサイズの回転正方形、および回転三角形を含む他のオーゼティックパターンを画定するように配置されてもよく、これらの各々は、ほぼ応力のない要素の回転および要素間のリンクにおける応力集中を伴うように、引張応力下に置かれたときに膨張することができる。

開示される概念の態様によれば、応力緩和特徴部を有する箔の領域は、グリッドの領域にわたってチェッカーボード状のパターンを形成してもよく、それにより、箔のいくつかの領域は、標準的な穴パターンを有し、完全な機械的強度を保持し、一方、他の領域は、応力緩和特徴部を有し、それにより、取り扱いおよびグリッドの組み立て中に箔をより堅牢にする。

開示される概念の態様によれば、グリッドを覆う箔は、少なくとも２つの異なる厚さを有する領域を有してもよく、これらの領域のうちの１つまたは複数は、貫通孔のアレイを有してもよい。

開示される概念の態様によれば、２つの異なる厚さのこれらの領域は、金属をマスター上に蒸着し、次いで、狭いサイズ範囲の粒子をその上に散布し、次いで、再び蒸着し、次いで、粒子を除去することによって生成され得る。粒子は、穴間隔よりもはるかに大きいが、数個のグリッド正方形よりも小さい。

本開示の態様は、プランジ冷却装置内に低温ＥＭグリッドを保持するための、鉗子などのツールの設計をさらに開示する。

開示される概念の態様によれば、ツールは、一端にプッシュボタンアクチュエータを有するワンドと、他端にプッシュボタンによって作動される一対のグリッド把持ジョーとを含むか、又は本質的にそれらから構成されてもよい。開示される概念の態様によれば、ジョーは、試料の堆積および吸い取りのためにアクセス可能なグリッドの大部分を残しながら、グリッドの対向する縁部を把持するために一緒に圧搾する突起を有してもよい。

開示される概念の態様によれば、ツールのジョーは、グリッドの上方および下方に、グリッパによって妨げられない大きな自由領域を残して、吸い取りを容易にすることができる。

開示される概念の態様によれば、ジョーは、ステンレス鋼のような低熱伝導率材料又はテフロン（登録商標）のようなポリマーからなってもよい。一例では、ジョーは、グリッドと接触する総熱質量を最小限に抑えるために、可能な限り薄くかつ狭く作られる。開示される概念の態様によれば、ジョーは、グリッドとの直接接触の面積を最小限にし、グリッド把持を改善するために、テクスチャ加工された表面を有してもよい。

本開示の態様はまた、グリッドボックス内でのプランジ冷却後に低温ＥＭグリッドを自動的に捕捉して格納するためのシステム、装置、および手段を提示する。一例では、主液体窒素チャンバ内のモータ駆動式機械ステージは、標準的な低温ＥＭ試料ホルダ保管箱／カセットを受け入れ、それらを垂直並進ステージによって画定される試料プランジ経路と一致するように自動的に位置決めし、例えば、その結果、各低温試料は、垂直並進ステージの垂直方向のみの動きと、試料ホルダ保管箱が配置される機械ステージの水平方向のみの直線または円運動との組み合わせによって、各ホルダ内の別個の区画内に堆積され得る。

開示される概念の態様によれば、代表的なシステム、装置、または手段は、１～１０ ｍ／ｓの速度で液体窒素中に試料を押し込み、次いで、それを同じ軸に沿って下方に並進させることができる垂直線形試料並進ステージを備えることができる。グリッド把持機構がこのステージに取り付けられ、低温ＥＭグリッドを把持し、その平面を液体窒素の表面に対して正確に垂直に保持することができ、冷却後にグリッドを解放することができる。さらに、液体窒素などの低温流体を収容するためにデュワーまたは断熱容器が使用される。並進または回転のいずれかであり得る１自由度を有するステージは、断熱容器内の液体寒剤中で動作する。プラットフォームは、このステージに取り付けられ、１つ以上のグリッドボックスを明確に定義された配向で保持し得る。モータおよび制御システムは、ステージを自動的に並進／回転させて、各グリッドボックス内の連続するグリッドスロットを垂直並進ステージの軸と位置合わせし、その結果、グリッドがその中に解放され得る。

開示される概念の態様によれば、漏斗装置は、液体窒素内の垂直並進ステージのプランジ経路の端部に、かつグリッドボックスプラットフォームの頂部のすぐ上に位置決めされて、グリッドをグリッドボックス内に案内することができる。

開示される概念の態様によれば、把持機構は、グリッドがプランジ冷却された後に、低温ＥＭグリッドを保管容器内に自動的に解放することができる。

上記の概要は、本開示のすべての実施形態またはすべての態様を表すものではない。むしろ、前述の概要は、本明細書に記載された新規の概念および特徴のいくつかの例示を提供するに過ぎない。本開示の上記の特徴および利点、ならびに他の特徴および付随する利点は、添付の図面および添付の特許請求の範囲と関連して考慮される場合、本開示を実施するための例示される実施例および代表的な形態の以下の詳細な説明から容易に明らかになる。さらに、本開示は、上記および下記に提示される要素および特徴の任意のおよびすべての組み合わせおよび部分的組み合わせを明示的に含む。

開示される概念の態様による、把持のためにその両側に中実無孔領域を有する代表的な低温ＥＭグリッドの上面図である。 開示される概念の態様による、内部領域を周囲領域から機械的に分離する代表的なグリッド設計を示す。 開示される概念の態様による、内部領域を周囲領域から機械的に分離する代表的なグリッド設計を示す。 開示される概念の態様による、内部領域を周囲領域から機械的に分離する代表的なグリッド設計を示す。 開示される概念の態様による、内部領域を周囲領域から機械的に分離する代表的なグリッド設計を示す。 開示される概念の態様による、周囲領域から機械的に隔離された内部領域を有するグリッド開口部内の代表的な箔の領域を示す。 開示される概念の態様による、スリットによって境界を定められた領域がほぼ応力のない状態を保つように、引張応力の解放を可能にするスリットのパターンを有する代表的な箔の領域を示す。 開示される概念の態様による、スリットによって境界を定められた領域がほぼ応力のない状態を保つように、引張応力の解放を可能にするスリットのパターンを有する代表的な箔の領域を示す。 図４（Ｂ）の代表的な箔設計が、箔が引張応力下に置かれたときにどのように応答するかを示す。 図４（Ｂ）の代表的な箔設計が、箔が引張応力下に置かれたときにどのように応答するかを示す。 図４（Ｂ）のような矩形グリッド上にスリットのパターンを有する代表的な箔の領域の別のレンダリングを示し、これは、スリットによって境界を定められた矩形領域がほぼ応力のないままであるように、引張応力の解放を可能にする。 図４（Ｂ）のような矩形グリッド上にスリットのパターンを有する代表的な箔の領域の別のレンダリングを示し、これは、スリットによって境界を定められた矩形領域がほぼ応力のないままであるように、引張応力の解放を可能にする。 開示される概念の態様に従って、スリットによって境界を定められた三角形領域がほぼ応力のない状態を保つように、引張応力の解放を可能にする三角形グリッドのスリットのパターンを有する別の代表的な箔を示す。 開示される概念の態様に従って、スリットによって境界を定められた三角形領域がほぼ応力のない状態を保つように、引張応力の解放を可能にする三角形グリッドのスリットのパターンを有する別の代表的な箔を示す。 開示される概念の態様に従って、低温ＥＭグリッドの上の「スリットのない」箔領域によって囲まれた応力緩和スリットの領域を有する代表的な箔を示す。 開示される概念の態様による、グリッドを把持し、プランジ冷却器の垂直並進ステージ内に保持するための側面把持鉗子を有する代表的なワンドを示す。 開示される概念の態様による、グリッドを把持し、プランジ冷却器の垂直並進ステージ内に保持するための側面把持鉗子を有する代表的なワンドを示す。 開示される概念の態様による、グリッドを把持し、プランジ冷却器の垂直並進ステージ内に保持するための側面把持鉗子を有する代表的なワンドを示す。 開示される概念の態様による、プランジ冷却後に水平ステージに取り付けられた試料ホルダプラットフォーム内の一連のスロット内にグリッドを配置することを可能にする、代表的な垂直並進ステージ、グリッド案内部材または漏斗プレート、および水平ステージを示す。 開示される概念の態様による、プランジ冷却後に水平ステージに取り付けられた試料ホルダプラットフォーム内の一連のスロット内にグリッドを配置することを可能にする、代表的な垂直並進ステージ、グリッド案内部材または漏斗プレート、および水平ステージを示す。 開示される概念の態様による、プランジ冷却後に水平ステージに取り付けられた試料ホルダプラットフォーム内の一連のスロット内にグリッドを配置することを可能にする、代表的な垂直並進ステージ、グリッド案内部材または漏斗プレート、および水平ステージを示す。 開示された概念の態様に従って、グリッドボックスを受け入れ、プランジ冷却後にグリッドを堆積させるために所望の向きにグリッドボックスを保持する代替の試料ホルダプラットフォームを示す。 開示された概念の態様に従って２つの異なるスタイルのグリッド上に配置された、図３に示されたパターンを有する代表的な箔を示す。図１２（Ａ）および図１２（Ｂ）の挿入図は、一般に、説明されたような図３の作用の箔特徴を示す概念実証顕微鏡写真を示す。 開示された概念の態様に従って２つの異なるスタイルのグリッド上に配置された、図３に示されたパターンを有する代表的な箔を示す。図１２（Ａ）および図１２（Ｂ）の挿入図は、一般に、説明されたような図３の作用の箔特徴を示す概念実証顕微鏡写真を示す。 開示される概念の態様による、２つの異なるスタイルのグリッド上に配置された、図４（Ｂ）に示される穴およびスリットのパターンを有する代表的な箔を示す。 開示される概念の態様による、２つの異なるスタイルのグリッド上に配置された、図４（Ｂ）に示される穴およびスリットのパターンを有する代表的な箔を示す。

本開示は、様々な修正形態および代替形態に適しており、いくつかの代表的な実施形態が、図面において例として示され、本明細書において詳細に説明される。しかしながら、本開示の新規な態様は、上記に列挙された図面に示された特定の形態に限定されないことを理解されたい。むしろ、本開示は、例えば、添付の特許請求の範囲によって包含されるような本開示の範囲内に入る全ての修正、均等物、組み合わせ、部分組み合わせ、置換、グループ化、および代替を網羅する。

本開示は、多くの異なる形態の実施形態を受け入れることができる。本開示の代表的な実施形態が図面に示され、これらの実施形態が、本開示の広範な態様の限定ではなく、開示された原理の例示として提供されるという理解の下で、本明細書において詳細に説明される。その点で、例えば、要約、導入、要約、および詳細な説明の項に記載されているが、特許請求の範囲に明示的に記載されていない要素および限定は、含意、推論、またはその他によって、単独でまたは集合的に特許請求の範囲に組み込まれるべきではない。

本発明の詳細な説明の目的のために、特に断らない限り、単数は複数を含み、逆もまた同様であり、「および」および「または」という単語は、接続的および離接的の両方であり、「任意の」および「すべての」という単語は、「任意のおよびすべての」を意味し、「含む」、「含有する」、「含むこと」、「有する」などの単語は、それぞれ「限定されないが含む」を意味する。さらに、「約」、「ほぼ」、「実質的に」、「概して」、「およそ」などの近似の語は、それぞれ、本明細書において、例えば、「～で、～付近で、～でほぼ」、または「～の０～５％以内」、または「許容可能な製造公差内」、またはそれらの任意の論理的組み合わせの意味で使用され得る。

開示される概念の少なくともいくつかの目標は、いくつかの非限定的な例として、低温ＥＭ試料の確実なガラス化を可能にし、グリッドおよび箔の損傷率を低減し、自動化された試料追跡を容易にする、試料支持体、試料取扱いツール、および冷却機器を含むツールを開発することを含む。

科学的動機付け
現在の世代の低温ＥＭ試料支持体および冷却装置は、１９８０年代に開発された研究および原理に大部分が基づいている。本開示によって対処されるいくつかの重要な問題が以下に説明される。

プランジ冷却中にグリッドを保持する方法は不十分である。グリッドは、典型的には、グリッドの上部中央を把持する鉗子を使用して保持され、決して背面から支持されない。液体の付着および吸い取りの間、グリッドは容易に偏向し、正確な吸い取りをより困難にし、永久的に曲がるようになる可能性がある。グリッドが液体寒剤中に高速で突入されるとき、垂直からのわずかなずれは、グリッドが液体寒剤に入り、液体寒剤を通って移動するときに、グリッドを劇的に屈曲させることがある。これは、グリッド冷却に悪影響を及ぼし、箔およびグリッドの損傷をもたらす可能性がある。

ビーム誘起運動は、単一粒子低温ＥＭにおいて達成可能な分解能を制限する重要な要因であり、冷却中のグリッドバーと試料＋箔との間の大きな温度差から生じる可能性が最も高い。照射中の試料の動きは、単一粒子低温ＥＭにおける分解能を制限する主な要因である。動きは、低線量の照射中でさえも起こり、放射線損傷が控えめであり、最高解像度の構造情報が利用可能である照射の開始時に（線量ベースで）最も速い。十分な信号対雑音比が利用可能である場合、試料の「動画」を分析して、この動きを補正し、最終解像度を改善することができる。裸の試料箔は、箔およびグリッド材料の冷却中の収縮差に関連する応力および座屈のために、実質的なビーム誘起運動（ＢＩＭ）を受け、この運動は、両方に同じ材料（例えば、Ａｕ）を使用することによって最小限に抑えられる。箔の孔内の生体分子含有試料について、粒子追跡実験は、運動の一次モードが試料フィルムの「ドーミング」（ドラムヘッドのような）に対応することを示唆する。１．２ mｍの直径の孔の場合、箔の平面箔に垂直な試料の放射線誘起変位は、約１５０Åであり、曲率半径は２５μｍであった。このドーミング運動は、孔内の試料が実質的な圧縮応力下にあることを示す。

電子線量の増加に伴う試料運動の観察された減衰は、運動が、試料応力によって駆動される放射線誘起クリープから主に生じることを示し、クリープが進行するにつれて、駆動応力が解放され、したがってクリープ速度が低下する。最近の実験では、試料を、拡散水運動が試料応力を解放することを可能にする失透温度より高い約１５０～１７０ Ｋまで短時間温めた場合、ＢＩＭが４分の１に減少することが見出された。しかし、初期試料応力はどこから来るのか？

試料応力は、冷却中の試料と箔支持体との収縮差によって発生させることができる。室温と水のガラス遷移温度Ｔｇ～１３６ Ｋとの間で、試料は、～８％の正味の容積膨張を受けるが、試料は液体のままであるので（結晶化しないと仮定する）、この膨張は、支持箔の収縮から本質的に切り離される（参考文献３７の請求項とは対照的に）。Ｔｇ未満では、ガラス化した水は正の熱膨張係数（六方晶氷の熱膨張係数に匹敵する）を有するが、試料の収縮は、支持箔の収縮と強く結合している。冷却により誘発される試料応力は、Ｔｇと最終保存温度である７７ Ｋとの間でガラス質氷と箔の膨張係数を一致させることによって低減することができる。アモルファスカーボン、Ｃｕ、およびＡｕ箔はすべて、この温度範囲ではガラス質氷よりも収縮が少ない（Ａｕが最もよく適合する）。全てが、試料中に引張応力を生成する可能性が高い。しかしながら、引張試料応力の存在下での放射線誘起クリープは、観察されるドーミングを引き起こさない。

放射線誘起試料運動を駆動する応力の主な原因は、冷却中に発生するグリッドバーと試料＋箔との間の実質的な過渡的温度差に関連することが示されている。箔はグリッドバーよりもはるかに薄く、機械的に剛性が低いので、その長さ（および面積）の収縮は、グリッドバーの収縮によって主に決定される。グリッドバーは冷却され、従って、それらの間の箔よりもゆっくりと収縮するので、箔は、（たとえグリッドバーと同じ材料であっても）過渡的な張力を発生する。次いで、試料は、この引張応力を受けた箔上でガラス化する（そして、この箔に堅く付着する）。グリッドバーが箔＋試料の最終温度に向かって冷却されるにつれて、それらの分離は減少し、箔の張力は解放される。しかし、これは、ここでは、試料を圧縮応力下に置く。試料がその弛緩状態で箔によって拘束されていない箔の穴では、照射によって誘発されたクリープが、この応力を解放するための「ドーミング」を発生させる。計算によれば、１．２mｍの箔穴内に高さ～１５０Åの観察された「ドーミング」が、２０ Ｋほどの試料ガラス化時のグリッドバーと箔との間の温度差によって生成され得ることが示された。最近の実験は、ＢＩＭが箔穴の直径に対して線形に比例するという予測を確認している。１５０～１７０ Ｋに温める際に生じる分子拡散および失透はこの応力を解放し、７７ Ｋに再冷却しても、試料は大部分が中実であるままであり、箔とグリッドとの間の過渡的な温度および熱収縮の差の大きさははるかに小さいので、応力は回復しない。

グリッドに関連する試料応力の他の２つの原因は、ビーム誘起試料運動の非ドーミング成分に寄与する。第１に、損傷した、または不適切に「ピンセットで掴んだ」グリッド／箔は、エタンに入ると、著しい曲げを受けることがあり、曲げ半径が十分に小さい場合、ガラス化された試料膜に応力を発生させる。第２に、約１０^５ Ｋ／ｓ～１０^６ Ｋ／ｓの冷却速度および２ ｍ／ｓの突入速度では、グリッドおよび箔の冷却は、それらが液体寒剤に入るときに、突入方向に沿って、それぞれ約３または０．３ ｍｍの帯で生じる。この帯域内では、グリッド及び箔は、大きな過渡温度勾配を有し、グリッド間隔に過渡勾配を生じさせ、箔に過渡応力を生じさせる。試料がガラス化した後のこれらの過渡的なグリッド変形の緩和は、箔＋試料に方向性応力を生成する

示された例の説明
図１は、例えば、平行な「ジョー」で把持するために、その対向する左側および右側に２つの中実の開口のない把持領域（２０）を有する低温ＥＭグリッド（１０）を示す。このように把持されたグリッドは、例えば、試料の堆積および吸い取りの間は剛性であり、プランジ冷却の間は曲がったりしなったりしない。把持領域は、半径方向に約２００～約６００マイクロメートル、少なくともいくつかの実装形態では約４００マイクロメートルの幅を有し得る。一般的に言えば、把持領域は、十分な把持のために十分に広くてもよいが、グリッドの残りの部分へのアクセスを妨げ、グリッドの残りの部分の冷却を過度に低減するほど広くなくてもよい。図１の代表的な設計はまた、グリッド（１）の左側と右側を接続するその側部に沿って、第３の中実の開口部のない把持領域（３０）を有する。この第３の把持領域（３０）は、プランジクーラーの鉗子を使用して把持するために使用されてもよい。マークされたパターン（４０）は、各グリッドを一意に識別することができ、薄いグラフェンまたはグラファイト箔（５０）は、顕微鏡較正のためにマークされたパターンのうちの１つまたは複数を覆うことができる。

図２は、グリッドの内部領域（例えば、円形または正方形の半径方向中心領域）を周囲領域（例えば、環状の半径方向外側領域）から機械的および熱的に隔離するのに役立ついくつかのグリッド設計を示す。内部領域は、周囲領域よりも薄くてもよく、周囲領域よりも狭いグリッドバー、周囲領域とは異なるグリッドバー間隔などを有してもよい。図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃの設計は、内側領域に接して延び、その端部で外側領域に接続される「接線梁」バーとともに示されている。例えば、内側領域が周囲領域よりも低温である場合、内側領域は、周囲領域よりも収縮する可能性が高い。「接線梁」は、その軸に垂直な曲げに対して限られた剛性を有し、したがって、この収縮が起こることを可能にし、同時に、そうでなければ内側領域に発生する応力を低減する。プランジ冷却中に内側領域が周囲領域よりも速く冷却される場合、これは、発生する過渡的な応力を低減し、関連するビーム誘起運動を低減する。

図２（Ａ）では、バー／梁（６０）は、円形の内側領域（７０）の外周に接し、直接付着する直線構造である。図２（Ａ）のバー（６０）は、内側領域（７０）の周りに連続的に延在し、内側領域（７０）を取り囲む一体構造を形成してもよく、図示のように、六角形構造を形成する。図２（Ｂ）において、梁（８０）は、同様に、矩形の内側領域（９０）に接線方向に接続し、それを囲むことができる。これらの梁（８０）は、例えば、板ばねのように波形に曲げられてもよく、梁（８０）が屈曲するときに、内側領域（９０）がグリッド（１０）の直径中心に対して横方向および軸方向に移動することができるように、内側領域（９０）に取り付けられてもよい。

図２（Ｃ）では、梁（１００）は、円形の内側領域の外周に接しているが、それから離間しており、内側領域と外側領域との間で半径方向に延在する短いタブ（１１０）を介して内側領域に取り付けられている。これらのタブ（１１０）は、内側領域との接触面積を低減するのに役立ち得る。タブ（１１０）の幅および／または長さは、例えば、冷却中にタブに付与される応力下でタブが破損しないことを確実にするように調整されてもよい。図２（Ｄ）では、内側領域は、複数（４つ）の別個の梁（１２０）を使用して外側領域から隔離され、そのそれぞれは、圧縮－伸張タイプのジグザグばね部材のように成形されてもよい。各梁（１２０）は、その隣接する梁から円周方向に離間されてもよく、内側領域と外側領域との間で半径方向に延在し、外側領域の最内周縁を内側領域の最外周縁に接合する。少なくともいくつかの構成では、グリッドの全ての構成要素は、電鋳などの方法を使用して、同じ材料で製作される。各グリッドは、単一の単一片構造として形成されてもよい。あるいは、グリッドは、構成部品が物理的に結合されたマルチピース（例えば、二部品または三部品）構造として形成されてもよい。

他の利用可能な選択肢は、グリッドの内側領域（７０）上の貫通孔の構成が、外側領域上の貫通孔の構成とは異なる（例えば、形状、サイズ、配置などにおいて）か、または実質的に同一であり得ることを含む。例えば、図２（Ａ）では、内側領域と外側領域の両方が、行と列の正方形アレイに配置された正方形の貫通孔を含む。しかしながら、内側領域（７０）の貫通孔は、外側領域の貫通孔の２倍～３倍のサイズ（例えば、面積、幅、直径など）である。そのために、一方または両方の領域は、図４の円形の穴に示されるように、他の形状を有する貫通穴を含んでもよく、格子構造、六角形構造、または千鳥状分散などの類似または異なるパターンで配置されてもよい。外側領域の内側および外側の周囲は、例えば、図２（Ａ）の外側周囲（１３）に見られるように、それぞれの穴のない剛性フレームによってそれぞれ画定されてもよい。図２（Ａ）と図２（Ｂ）を比較すると、外側領域の外周（および／または内側領域の外周）のみが、穴のない剛性フレームによって囲まれ得ることが分かる。

例えば、グリッドの内側領域をそのグリッドの外側領域から機械的に分離するための、図２に示される同じ特徴およびオプションが、穴が充填された箔の内側部分を箔の外側部分から分離するために使用されてもよい。例えば、図３は、正方形または他の多角形の平面プロファイルを有し得る「穴あき」箔（２００）の小部分を示す。箔（２００）の内側部分（２２０）は、複数（３つ）の接線方向梁（２３０）および複数（３つ）の半径方向タブ（２４０）を介して外側部分から隔離される。内側部分（２２０）および付随する支持梁（２３０）の合計サイズは、下にあるグリッドの開口部の合計サイズよりも小さいことが望ましい場合がある（例えば、８５マイクロメートルの繰り返しおよび２５マイクロメートルのグリッドバーを有する３００メッシュグリッドでは、およそ６０マイクロメートル）。冷却中、グリッドバー開口部の中心付近の箔は、グリッドバーよりもはるかに速く冷却し、これにより、箔はグリッドバーに堅く取り付けられているので、グリッドバー間の箔に張力がかかる。図３に示される構造は、内側領域において結果として生じる張力を低減するのに役立ち得る。グリッドが最終的に箔及び液体寒剤の最終温度に到達すると、箔内の引張応力が解放され、引張応力が最小化された内側領域を除いてビーム誘起運動を生じさせる。

図４は、例えば、グリッドバー間の箔における過渡的な引張応力を低減するために使用され得る２つの代表的な構成を示す。図４（Ａ）では、例えば、細長いスリット（２５０）の正方形アレイが、互いに平行な列に対して垂直な互いに平行な行で箔（２００）に配置されている。単一の貫通孔が、４つの交差するスリット（２５０）の間の各ノード接合部に位置してもよい。箔（２００）が引張応力下に置かれると、これらのスリット（２５０）は拡張し、そうすることで、箔（２００）内の応力を低減する。図４（Ｂ）では、スリット（２６０）のパターンは、オーゼティック構成をとり、スリットによって境界を定められた領域における引張応力をより効果的に低減するように調整され得る。これらのスリット（２６０）もまた、行および列に配置されるが、図４（Ａ）とは異なり、図４（Ｂ）では、スリット（２６０）は、各スリット（２６０）の対向する端部が、隣接するスリット（２６０）の最も中心のセクションにおいて、対向し、間隔を空けた関係で終端するように、互い違いに配置され得る。

図５（Ａ）は、グリッドバー（２８０）によって画定された単一のグリッド開口内に配置された代表的な箔（２７０）の一部を示す。図４（Ｂ）のようなスリット（２９０）のパターンは、その各々が（例えば、図４（Ａ）および４（Ｂ）のような）連続スロットであってもよく、またはスリットの構造的側面を接続する（示されるような）壊れやすい「弱い」リンクとして作用する一連の直線的に整列したミニスロットであってもよく、オーゼティックパターンで配置される。図５（Ｂ）は、試料撮像に使用される箔（２７０）の貫通孔をより良く見るために、箔（２１０）の選択されたセクションの拡大図を示す挿入図である。図５（Ｃ）は、図４（Ａ）のスリットパターンを有する図５（Ａ）の箔（２７０）が、周囲のグリッドバーよりも低温であり、したがって箔を引き伸ばすように作用する引張応力下にあるときに、どのように応答することができるかを示す。スリット（２９０）は開き、スリットによって画定された矩形領域（３００）は回転し、そうすることで、矩形領域（３００）はほぼ応力がない状態のままであり、応力は「ヒンジ」領域（３１０）に集中する。各グリッド開口内の（拡張され回転された）箔によって充填される総面積は、箔の実際の中実面積が熱収縮によって減少しても、グリッドの開口の面積に等しいままであることができる。冷却中、これにより、各グリッド開口部内で箔を引き伸ばすように作用する応力を生じるグリッドと箔との間の大きな温度差が存在し得る場合であっても、矩形領域（３００）内で応力のない状態を維持する箔（２７０）上で試料をガラス化することが可能になる。実際の過渡歪みは、＜０．１％または＜０．１mｍであり得る。グリッド開口内の微小な「開口」と、ＴＥＭにおけるステップアンドリピート撮像に影響を与えない回転のみが必要とされ得る。これらのパターンは、グリッドアセンブリ中に箔の堅牢性を保つために、箔のＴＥＭアクセス可能領域に限定され得る。あるいは、パターンは、例えば、リフトオフおよびグリッド上への組み立て中に箔の堅牢性を保つために、スリットのない箔領域を有する「チェッカーボード」パターンに配置され得る、数個から数個のグリッド正方形を包含するより小さい領域に限定され得る。より小さい領域は、単一のグリッド正方形（３００メッシュグリッドに対して８５マイクロメートル）に匹敵するか、またはそれよりも幾分小さいことがあり、あるいは、それらは、いくつかのグリッド正方形を包含することができる。

図６は、図４（Ｂ）および図５のものと同様のスリット（２９０）の配置を有する別の代表的な箔設計の別のレンダリングであり、スリット（２９０）の開口および矩形領域（３００）の回転を介して、箔がどのように引張応力に応答し得るかを示す。

オーゼティックの理論（例えば、Ｇｒｉｍａ ａｎｄ Ｅｖａｎｓ， Ｊ． Ｍａｔ． Ｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． １９， １５６３－１５６４（２０００）を参照）によれば、ほぼ応力のない要素の回転および小さな接続領域における応力集中を可能にすることによって、平面フィルムにおける応力を解放するために、多数の他のスリットパターンを実装することができることが想定される。これらのいずれも、低温ＥＭ箔（または、異なる厚さ、グリッドバー幅、および／またはグリッドバー密度の領域を有する低温ＥＭグリッド）における応力解放のために使用され得る。これらは、平行四辺形、２つの異なるサイズの正方形、三角形などを画定するスリットパターンを含む。

図７は、箔の少なくとも一部がスリット（３２０）の三角形パターンを有する代替的な箔設計を示す。この場合、スリット（３２０）によって画定される三角形領域（３３０）は、引張応力が箔に加えられると回転し、ほぼ応力がない状態を維持し、応力は、隣接する領域（３３０）を相互接続するヒンジ領域（３４０）に再び集中する。

図８は、（破線の正方形によって示される）箔（３５０）のスリット／応力緩和部分が、標準的な３．０５ ｍｍの低温ＥＭグリッド（３７０）に使用される箔（３６０）の領域にわたってどのようにレイアウトされ得るかの例を示す。図８は、グリッド－箔アセンブリのグリッド側から見た図である。スリットの存在は、箔を弱くし、マスターからのリフトオフ中、グリッド上への浮上中、及びプランジ冷却中に箔が裂けやすくなる可能性がある。完全な単一粒子低温ＥＭデータセットを得るためにはグリッド／箔の小さな領域しか必要とされないので、応力緩和パターンは、いくつかのグリッド正方形を包含する小さな領域に限定され、例えば箔の全体的な堅牢性を高めるために、「スリットのない」箔（すなわち、スリット、貫通孔、空洞などがない箔構造）によって囲まれ得る。

可変厚さの箔：箔の厚さは、箔の穴のサイズと共に、最終的な試料フィルムの厚さ、したがって、撮像が実現可能であるかどうかを決定する際のグリッド＋箔の重要な幾何学的パラメータである。理想的には、吸い取りおよび蒸発は、孔内の液体を除いてほぼ全ての液体を除去する。本明細書では、ＴＥＭアクセス可能なグリッド領域にわたって可変の厚さを有する箔の実現可能性および性能を調査する。少なくともいくつかの実装形態では、最も単純な手法は、ベース箔層を蒸発させ、次いで、第２の蒸発ステップ中に、全体的な箔の機械的特性を損なわないように十分に小さい箔の部分を隠すために、（たとえば、Ｎｉまたはポリイミドシートから作製された）機械的マスクを使用することである。

グリッドを覆う箔は、２つ以上の異なる厚さを有する領域を有するように製造することができ、これらの領域のうちの１つまたは複数は、貫通孔のアレイを有する。穴の厚さは、試料が適切にブロットされたときの氷の厚さを決定することができる。同じ箔上に２つの厚さを有することは、撮像のための最適な試料厚さを得る機会を増加させるのに役立ち得る。箔の外周は、グリッド上での箔の取り扱いおよび配置を簡単にするために、残りの部分よりも実質的に厚くすることができる。半径が増加するにつれて段階的に増加する厚さを有する箔は、金属または炭素の連続的な堆積中に半径が増加するディスク形状のシャドーマスクを使用することによって製造することができる。この場合、最も内側の箔領域が最も薄く、外周が最も厚い。シャドーマスクは、例えば、１ミル厚のＣｕ箔から、またはＳＵ－８またはポリイミドのような光暴露可能なポリマーから、標準的なフォトリソグラフィおよびエッチングプロセスを使用して製造され得る。箔アレイのディスクは、細線によって接続されてもよい。これらの線によるシャドーイングは、連続するマスク上の異なる線位置を使用することによって、またはマスクをほぼ接触させて配置し、ある角度から金属または炭素を堆積させることによって低減することができる。

グリッドを取り扱うためのツール： 図９は、プランジ冷却中にグリッド（４２０）を把持し、垂直並進ステージに保持するための押しボタン作動（４１０）を有する試料ワンド（４００）の例を示す。図９（Ａ）は、グリッドをその縁部で保持する把持ジョー（４３０）を示す。２つのジョーの角度は、図では誇張されており、ジョーが液体寒剤に入るときのジョーの衝撃断面を最小限にするために、小さく、好ましくは約１５度未満であるべきである。グリッドと接触するジョーの表面は、グリッドとの物理的および熱的接触の面積を低減するように、テクスチャ加工されることができる。ジョーは、ステンレス鋼を含む任意の剛性材料からなることができる。図９（Ｂ）および図９（Ｃ）は、試料ワンドの図を示す。ジョーは、下方に移動してジョーを押し離すロッドを介して、押しボタンを使用して開かれる。

プランジ冷却後のグリッドの自動保管。全てのプランジ冷却器は、グリッドを液体寒剤内に並進させる垂直並進ステージ（駆動または重力落下）を有する。図１０は、プランジ後にコールドグリッドを自動的に格納するシステムを含むプランジクーラーの設計の一部を示す。グリッドは、垂直移動ステージに取り付けられた図９のようなワンドによって保持され、最初に液体寒剤内に高速で、次いでグリッド解放点までゆっくりと下方に移動される。グリッドは、ワンドの押しボタンを押す機構によって解放され、グリッド捕捉システム内に落下する。液体窒素または他の液体寒剤（図示せず）の断熱容器内に存在するグリッド捕捉システムは、グリッドを格納スロット内に案内するのを助ける固定「漏斗」（５００）と、グリッドが配置される格納プラットフォーム（５１０）と、プラットフォームが載置され、プラットフォームを単一の自由度で回転または並進させて、漏斗の下に連続するグリッド格納スロットを位置決めする電動ステージ（５２０）とからなる。図１０において、ステージの回転は、モータに接続されたシャフト５３０によって駆動される。図１０（Ａ）は、グリッドを捕捉するための位置にあるプラットフォームおよびステージを示し、図１０（Ｂ）は、グリッドを含むプラットフォームの除去および格納を可能にするために回転されたプラットフォームおよびステージを示す。図１０（Ｃ）は、漏斗、グリッドスロットを有するプラットフォーム、および電動ステージの拡大図を示す。

図１１は、標準フォーマットの低温ＥＭグリッドボックス（５５０）を受け入れる代替のプラットフォーム（５４０）を示し、そのレセプタクル（５６０）は、単一の自由度ステージを有する自動化されたグリッドストレージを可能にするようにグリッドボックスを位置決めし、方向付ける。グリッドボックスのフォームファクタは、業界で標準化されているが、ボックス内のグリッドスロット（５７０）の向きは、製造業者間で異なり、単一の自由度での装填を容易にするために、図示のように適合させることができる。

図３～図８に示されるものを含む、本明細書に記載される応力低減箔は、それぞれ、金（Ａｕ）、クロム（Ｃｒ）、ならびにそれらの組合せおよび合金から単一片の箔シートとして製造されてもよく、それぞれ、約２０～約６０ ｎｍの厚さを有してもよい。これらの箔シートは、剥離層で覆われたマスター上での蒸着によって製造されてもよい。次いで、剥離層を溶解することによって箔をマスターから浮かせ、次いで、正方形および六角形のグリッドパターンを有する２００～３００メッシュのＣｕまたはＡｕ低温ＥＭグリッド上に浮かせることができる。箔は、約０．３～約２．０マイクロメートルの穴サイズを有し、応力緩和特徴部で覆われた箔領域の約２０％を構成する選択された領域を有する。

所定の箔領域に図３の応力緩和特徴部を有する箔は、ＡｕまたはＡｕ／Ｃｒ合金から製造され、３００メッシュのＣｕまたはＡｕグリッド上に配置されてもよい。例えば、図１２は、図３のパターンを採用するグリッドを有する箔（２００）の光学顕微鏡写真を示す。分離領域（２２０）の直径は、領域の一部が、幅が約５５～６５マイクロメートルの単一のグリッド開口部内に完全に含まれることを確実にするように選択された。図１２（Ａ）では、箔（２００）は、電鋳の間にマスターを充填し、過剰充填することによって作成された「マッシュルーム」プロファイルグリッドバーを有する３００メッシュ正方形グリッド上に配置された。箔（２００）は、その下のグリッドバー（２８０）の周りに目に見える変形を示し、これは、グリッドバーの位置をより明確に見えるようにすることができる。これは、市販のグリッド上の箔の特徴的な変形パターンである。

各グリッド正方形内では、箔は歪んでいないように見える。しかしながら、箔（２００）が図３に示される構造を有するグリッド開口部については、隔離領域（２２０）を周囲の箔に接続する接線バー（２３０）は変形され得、グリッドバー間の箔が引張応力下にある／あったことを示す。接線バーの変形はまた、隔離領域（２２０）がその応力から少なくとも部分的に切り離されていることを示し得る。接線バーの変形量は、箔にわたって変化してもよく、箔内の応力分布の直接的な光学的読み出しを提供する。この箔応力の直接光学測定を用いて、グリッド上への箔配置のプロセスを最適化した。図１２（Ｂ）に示すように、この最適化は、グリッド上に箔を製造することを可能にし、ここで、箔は本質的に応力を含まなかった。

図４Ｂおよび図６に示されるような、所定の箔領域に「オーゼティック」応力緩和特徴部を有する箔はまた、ＡｕまたはＡｕ／Ｃｒ合金から製造され、３００メッシュのＣｕまたはＡｕグリッド上に配置されてもよい。例えば、図１３は、グリッド上に直角に配置されたスリット（２６０）からなる、図４（Ｂ）および図６に示されるような「オーゼティック」パターンを有する箔（２００）の光学顕微鏡写真を示す。この例では、スリット領域によって覆われる面積は、単一のグリッド開口のサイズよりも大きくてもよいが、隣接するスリットによって画定される正方形領域（３００）は、グリッド開口よりも小さくてもよい。スリット幅は約２～約５マイクロメートルであってもよく、スリット長さは約２０～約２５マイクロメートルであってもよい。スリット間のヒンジ領域は、約１～約５マイクロメートルの長さを有してもよく、隣接するスリットによって境界を定められた正方形領域は、約１２～約２５マイクロメートルの寸法を有してもよい。この例では、正方形領域の幅は、領域の一部が約５５～約６５マイクロメートルの幅の単一グリッド開口部内に完全に含まれることを確実にするように選択された。

図１３（Ａ）では、選択されたオーゼティックパターンを有する領域を有する箔が、「マッシュルーム」形状のグリッドバーを有する３００メッシュの正方形グリッド上に配置され得る。箔は、その下のグリッドバーの周りに目に見える変形を示すことができ、これはグリッドバーの位置をより明確に目に見えるようにする。これは、市販のグリッド上の箔の特徴的な変形パターンである。箔内の大きな残留応力は、スリットの開口部と、スリット間の正方形の回転とによって明らかになる。平坦な上部形状を有するグリッドを使用することによって、および箔がグリッド上に配置されるプロセスを改善することによって、正方形の回転およびスリットの開口の欠如によって示されるように、本質的に応力のない箔を得ることができる（図１３（Ｂ））。冷却中、このオーゼティック箔パターンは、グリッドが箔よりもはるかにゆっくりと冷却し収縮することができる場合であっても、応力のない状態を維持する箔上で試料がガラス化することを可能にするはずである。図８のように通常の箔によって囲まれたオーゼティック領域を有する箔をタイリングすることは、解放および配置の間、箔の堅牢性を保つ。

室温および極低温での箔応力の画像化：箔の応力及び変形は、粒子撮像性能に影響を及ぼし得る重要な測定基準である。図１２（Ｂ）および図１３（Ｂ）のように、完全に平坦で応力のない箔から始めることによって、冷却によるその後の箔の変形を、平面鏡反射からの偏差によって光学的に検出することができる。箔が図４（Ｂ）のオーゼティックパターンを有する場合、箔の応力状態のさらにより高感度の可視化が可能である。オーゼティック／スリット領域の全体の歪み（箔の膨張）e＝DＬ／Ｌと正方形の回転角qとの関係は、q＝２ ａｒｃｃｏｓ（１／（１＋e））である。１０^－５、１０^－４、１０^－３、および１０^－２の歪みについて、回転角は０．５°，１．６°，５．１°および１６．１° である。０．５°程度の小さな回転を検出するのは簡単である。箔が最初に引張応力下にあるか（図１３（Ａ））、または応力がないか（図１３（Ｂ））によって、観察することができる圧縮および引張歪みの範囲が決まる。これらの歪みは、箔の基礎をなす応力に関連し得る。したがって、図３（Ｂ）および図４の箔パターンは、箔の領域がほぼ応力のない状態を保つように箔の領域の機械的な分離を可能にするだけでなく、箔内の応力を光学的に可視化し、定量化するための高感度の方法も提供する。

本開示の特徴は、図示された例を参照して詳細に説明されたが、当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく、多くの修正がそれに対してなされ得ることを認識するであろう。本開示は、本明細書に開示される正確な構成および組成に限定されず、前述の説明から明らかな任意のおよび全ての修正、変更、および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲内である。さらに、本概念は、前述の要素および特徴の任意のおよびすべての組み合わせおよびサブコンビネーションを明示的に含む。

追加の特徴およびオプションは、以下の条項によって定義され得る。

条項１：単一粒子低温電子顕微鏡法で使用するための金属低温ＥＭグリッドであって、約３．０５ ｍｍの直径および約１０～２５マイクロメートルの厚さを有し、その上面が約１０～５０ ｎｍの厚さを有する箔によって覆われ、金属または炭素の一形態でできており、約０．２～２マイクロメートルのサイズの貫通孔のアレイを有してよい、金属低温ＥＭグリッド。

条項２：１つ以上の内部領域であって、機械的にそれらの領域を取り囲み領域から離間し、それらの内部領域における箔の応力を、箔＋グリッドの組み立て／製造の間に作られる取り囲み領域内に存在し得て、低温への冷却の間に箔とグリッドの収縮の差のために、より具体的には、箔よりゆっくりのグリッドの冷却のために、生じ得る応力より下に低減させるように構造化された、１つ以上の内部領域、を有する、条項１に記載の箔。

条項３：箔の内部領域の１つ以上は、バー／ストリップ／梁であって、内部領域の周囲に接し、それらの端部にてのみ取り囲み領域に接続されている、バー／ストリップ／梁、によって取り囲み領域に接続され、その結果、これらのバーは、箔が引張応力下にあるときに内部領域との接触点において横に偏向する、条項１または２に記載の箔。

条項４：内部領域は、バーの軸に垂直に延びる小さいタブを介して各接線バーに接続される、条項１から３のいずれか１つに記載の箔。

条項５：接線方向のバー／梁によって境界を定められた箔の内部領域は、下にある金属グリッドの開口領域よりも小さい、条項１から４のいずれか１つに記載の箔。

条項６：箔の内部領域は、約６０マイクロメートルより小さい幅および長さ寸法を有する、条項１から５のいずれか１つに記載の箔。

条項７：接線方向の梁の各々は、その幅よりも少なくとも１０倍大きい（例えば、１４倍大きい）長さを有する、条項１から６のいずれか１つに記載の箔。

条項８：箔が、箔が引張応力下に置かれたときに応力の解放を可能にするスリットまたは開口のパターンを有する内部領域を箔が有し、その結果、これらの内部領域内の箔のいくつかの領域は、ほぼ応力がないままである一方で、応力は他の領域に集中され得る、条項１から７のいずれか１つに記載の箔。

条項９：スリットの各々は、その幅よりも少なくとも１０倍大きい（例えば、１７倍大きい）長さを有する、条項１から８のいずれか１つに記載の箔。

条項１０：隣接するスリットによって囲まれた箔領域は、試料撮像のための少なくとも１６個の穴を含む、条項１から９のいずれか１つに記載の箔。

条項１１：箔のスリットは、矩形領域を画定するパターンで配置され、これらのスリットは、箔が引張応力下に置かれたときに開き、スリットによって境界を定められた内部領域の応力を低減する、条項１から１０のいずれか１つに記載の箔。

条項１２：箔のスリットは、それらの長軸が箔の平面内の２つの直交軸のうちの１つに沿って位置するように配置され、各スリットの各端部は、それらの端部においてのみ他のスリットに最も近接しており、隣接する平行なスリットは同一線上にある、条項１から１１のいずれか１つに記載の箔。

条項１３：箔のスリットは、それらの長軸が箔の平面内の２つの直交軸のうちの１つに沿って位置するように配置され、スリットは、最も近い点で直角に配向され、所与のスリットは、その中間点で２つの同一線上の直交配向されたスリットに隣接し、それにより、箔が引張応力下に置かれると、スリットが開き、スリットによって境界を定められた矩形領域が、ほぼ応力がないまま回転し、応力が、各矩形領域を周囲の箔に接続するヒンジ領域に集中する、条項１から１２のいずれか１つに記載の箔。

条項１４：箔のスリットのパターンは、回転する三角形および平行四辺形を画定するスリットパターンを含む、パターン化された領域内の箔の大部分を応力のない状態にしながら、引張応力下に置かれたときに箔が拡張することを可能にする他のオーゼティックパターンを画定する、条項１から１３のいずれか１つに記載の箔。

条項１５：スリットにより境界を定められた正方形または長方形の箔の内部領域は、下にある金属グリッドの開口領域よりも小さい、条項１から１４のいずれか１つに記載の箔。

条項１６：箔の内部領域が、それぞれ６０マイクロメートルより小さい幅寸法および長さ寸法を有する、条項１から１５までのいずれか１つに記載の箔。

条項１７：箔内の応力緩和特徴部のパターニングは、箔の全領域のうちの１未満の割合を形成する箔の特定の領域のみに限定され、それにより、箔のいくつかの領域は、取り扱い、グリッド組み立て、及び使用中に箔をより堅牢にするように完全な機械的強度を保持する、条項１から１６のいずれか１つに記載の箔。

条項１８：プランジ冷却後にグリッドボックス内の低温ＥＭグリッドを自動的に捕捉して格納するためのシステム又は装置であって、液体寒剤を収容する容器と、グリッドを液体寒剤に、次いで液体寒剤内の放出点に並進させるグリッド並進ステージと、グリッドを把持してその平面を液体寒剤の表面に対して垂直に保持し、次いで冷却後に液体寒剤内の放出点でグリッドを放出する、このステージに取り付けられたグリッド把持機構と、液体寒剤内に、その上部開口が放出点と垂直に位置合わせされて配置された漏斗装置と、グリッドを格納するための一連のレセプタクルを有するグリッドボックスであって、グリッドが液体寒剤内に押し込まれ、液体寒剤内の放出点に並進され、放出されると、グリッドが重力の影響下で漏斗内に落下して通過し、次いでグリッドボックス内のレセプタクルに入るように、そのレセプタクルの１つが漏斗装置の下部開口と垂直に位置合わせされて配置された、グリッドボックスと、を備える、システム又は装置。

条項１９：液体寒剤内のステージであって、プランジ経路の端部で鉛直線に対して垂直な平面内の運動を可能にする少なくとも１つの自由度を有する、ステージと、プラットフォームが並進または回転されて、各グリッドレセプタクルを漏斗装置の底部出口の真下に配置し得るように、グリッドのためのレセプタクルを有するステージ上に載置されるプラットフォームと、をさらに備える、条項１８に記載のシステム／装置。

条項２０：プラットフォームは、グリッドボックスを保持するレセプタクルを有し、ステージは、漏斗装置の底部出口の真下の各グリッドボックス内に各レセプタクルを位置決めすることを可能にする、条項１８または１９に記載のシステム／装置。

条項２１：薄膜内の応力を光学的に測定するためのシステムまたは装置であって、薄膜と、薄膜が引張応力下に置かれたときにスリット領域がオーゼティック挙動を示すことを可能にする、薄膜の一部分内のスリットのパターンであって、スリットのパターンが、スリットの長軸が箔の平面内の２つの直交軸のうちの１つに沿って位置するように配置され、スリットは、最たる近接点において直角に配向され、所与のスリットは、その中間点において２つの同一線上の直交配向されたスリットに隣接する、スリットのパターンと、薄膜を撮像するための他の手段としての光学顕微鏡と、を備え、スリットによって境界付けられた隣接する正方形領域の互いに対する回転角は、周囲の薄膜内の応力によって決定され、その応力を直接推定するために使用することができる、システムまたは装置。

条項２２：薄膜の応力を測定する方法であって、その領域のある部分にスリットのオーゼティックパターンを有する薄膜を作製することと、顕微鏡を使用して膜を観察することと、スリットによって境界を定められた隣接する正方形の主軸の相対的な回転角を測定することと、を含む、方法。

条項２３：本明細書に記載の箔、グリッド、グリッド＋箔のアセンブリ、及び／又は低温ＥＭシステムのいずれかを製造及び／又は使用するための命令を記憶する方法またはコンピュータ可読媒体。

条項２４：本明細書に記載の箔、グリッド、および／またはグリッド＋箔のアセンブリのいずれかを含む低温ＥＭシステムまたは低温ＥＭ装置。

条項２５：対向する第１および第２のグリッド面と、第１のグリッド面から第２のグリッド面までグリッド本体を貫通して延在する複数のグリッド穴とを有するグリッド本体と、第１の面に対して着座し、グリッド本体のグリッド穴のサブセットを覆う箔シートであって、複数の箔穴を有し、複数の細長いスロットによって分離された複数の箔領域を含み、細長いスロットは、箔領域が互いに対して拡張および／または移動することを可能にするように構成されている、箔シートと、を備える、低温電子顕微鏡システムのための試料支持用のグリッドアセンブリ。

条項２６：グリッド本体は、約２．５ミリメートル（ｍｍ）から約３．５ｍｍの直径または幅を有する、条項２５に記載のグリッドアセンブリ。

条項２７：グリッド本体は、約１０マイクロメートル（μｍ）から約２５μｍの厚さを有する、条項２５に記載のグリッドアセンブリ。

条項２８：グリッド本体は、実質的に平坦な単一片構造である、条項２５に記載のグリッドアセンブリ。

条項２９：グリッド本体は、剛性の金属材料から形成される、条項２５に記載のグリッドアセンブリ。

条項３０：グリッド本体内のグリッド孔の各々は、約２０マイクロメートル（μｍ）から約１３０μｍの幅または直径を有する、条項２５に記載のグリッドアセンブリ。

条項３１：箔シートは、約１０ナノメートル（ｎｍ）から約５０ｎｍの厚さを有する、条項２５に記載のグリッドアセンブリ。

条項３２：箔シートは、実質的に平坦な単一片構造である、条項２５に記載のグリッドアセンブリ。

条項３３：箔シートは、可撓性であり、金属材料または炭素材料から形成される、条項２５に記載のグリッドアセンブリ。

条項３４：箔シート内の箔穴の各々は、約０．２マイクロメートル（μｍ）から約２．０μｍの幅または直径を有する、条項２５に記載のグリッドアセンブリ。

条項３５：箔シートの箔領域は、内側箔領域と、内側箔領域を囲む外側箔領域とを含み、細長いスロットは、内側箔領域と外側箔領域との間に介在し、内側箔領域から外側箔領域を分離する、条項２５に記載のグリッドアセンブリ。

条項３６：箔シートは、内側箔領域を外側箔領域に接続する複数の梁をさらに含む、条項３５に記載のグリッドアセンブリ。

条項３７：梁は、内側箔領域の外周に対して接線方向である、条項３６に記載のグリッドアセンブリ。

条項３８：内側箔領域は、円形または多角形の平面視プロファイルを有する、条項３７に記載のグリッドアセンブリ。

条項３９：梁は、内側箔領域から離間され、複数の半径方向に細長いタブによって内側箔領域に接続される、条項３７に記載のグリッドアセンブリ。

条項４０：梁の各々は、その両端部において外側箔領域に接合され、その中央部において内側箔領域に接合される、条項３７に記載のグリッドアセンブリ。

条項４１：梁の各々は、梁の幅よりも約７から１０倍大きい梁の幅と梁の長さとを有する、条項３７に記載のグリッドアセンブリ。

条項４２：梁の各々は、直線形状または波形形状を有する、条項３７に記載のグリッドアセンブリ。

条項４３：箔シートの箔領域は、多角形の箔領域のグリッドを含み、細長いスロットは、多角形の箔領域のうち隣接するものの間に介在し、それらを分離する、直線スロットの複数の行および列を含む、条項２５に記載のグリッドアセンブリ。

条項４４：直線スロットの行は、互いに平行であり、直線スロットの列は、互いに平行であり、行は、列と直交する、条項４３に記載のグリッドアセンブリ。

条項４５：直線スロットの各々の対向する端部は、直線スロットのうちの複数の隣接するスロットの隣接する対向する端部で終端する、条項４３に記載のグリッドアセンブリ。

条項４６：直線スロットの各々の対向する端部は、直線スロットのうちの隣接する１つの中央領域に隣接して終端する、条項４３に記載のグリッドアセンブリ。

条項４７：多角形の箔領域の各々は、正方形の平面視形状を有し、箔穴のアレイを含む、条項４３に記載のグリッドアセンブリ。

条項４８：直線スロットの各々は、一連の直線状に整列したスリットまたは単一の連続スリットを含む、条項４３に記載のグリッドアセンブリ。

条項４９：直線スロットの各々は、スロット幅と、スロット幅よりも約７から１０倍大きいスロット長とを有する、条項４３に記載のグリッドアセンブリ。

Claims (25)

1. 低温電子顕微鏡システム用の試料支持のためのグリッドアセンブリであって、
   グリッド本体であって、対向する第１及び第２のグリッド表面と、前記第１のグリッド表面から前記第２のグリッド表面まで前記グリッド本体を貫通して延在する複数のグリッド孔と、を有するグリッド本体と、
   前記第１のグリッド表面に対して着座され、前記グリッド本体の前記グリッド孔のサブセットを覆う箔シートであって、前記箔シートは、複数の箔穴を有し、複数の細長いスロットによって分離された複数の箔領域を含み、前記細長いスロットは、前記箔領域が互いに対して膨張および／または移動することを可能にするように構成されている、箔シートと、を含む、グリッドアセンブリ。
2. 前記グリッド本体は、約２．５ミリメートル（ｍｍ）から約３．５ ｍｍの直径または幅を有する、請求項１に記載のグリッドアセンブリ。
3. 前記グリッド本体は、約１０マイクロメートル（μｍ）から約２５μｍの厚さを有する、請求項１に記載のグリッドアセンブリ。
4. 前記グリッド本体は、実質的に平坦な単一片構造である、請求項１に記載のグリッドアセンブリ。
5. 前記グリッド本体は、剛性金属材料から形成される、請求項１に記載のグリッドアセンブリ。
6. 前記グリッド本体の前記グリッド孔の各々は、約３０マイクロメートル（μｍ）から約１１０μｍの幅または直径を有する、請求項１に記載のグリッドアセンブリ。
7. 前記箔シートは、約１０ナノメートル（ｎｍ）から約５０ ｎｍの厚さを有する、請求項１に記載のグリッドアセンブリ。
8. 前記箔シートは、実質的に平坦な単一片構造である、請求項１に記載のグリッドアセンブリ。
9. 前記箔シートは、可撓性であり、金属材料または炭素材料から形成される、請求項１に記載のグリッドアセンブリ。
10. 前記箔シートの前記箔穴の各々は、約０．２マイクロメートル（μｍ）から約２．０μｍの幅または直径を有する、請求項１に記載のグリッドアセンブリ。
11. 前記箔シートの前記箔領域は、内側箔領域と、前記内側箔領域を囲む外側箔領域とを含み、前記細長いスロットは、前記内側箔領域から前記外側箔領域の間に介在し、前記外側箔領域を前記内側箔領域から分離する、請求項１に記載のグリッドアセンブリ。
12. 前記箔シートは、前記内側箔領域を前記外側箔領域に接続する複数の梁をさらに含む、請求項１１に記載のグリッドアセンブリ。
13. 前記梁は、前記内側箔領域の外周に対して接線方向にある、請求項１２に記載のグリッドアセンブリ。
14. 前記内側箔領域は、円形または多角形の平面プロファイルを有する、請求項１３に記載のグリッドアセンブリ。
15. 前記梁は、前記内側箔領域から離間され、複数の半径方向に細長いタブによって前記内側箔領域に接続される、請求項１３に記載のグリッドアセンブリ。
16. 前記梁の各々は、その対向する端部において前記外側箔領域に接合され、その中央部において前記内側箔領域に接合される、請求項１３に記載のグリッドアセンブリ。
17. 前記梁の各々は、梁幅と、前記梁幅より約７から１０倍長い梁長とを有する、請求項１３に記載のグリッドアセンブリ。
18. 前記梁は、直線形状または波形形状を有する、請求項１３に記載のグリッドアセンブリ。
19. 前記箔シートの前記箔領域は、多角形箔領域のグリッドを含み、前記細長いスロットは、隣接する前記多角形箔領域の間に介在し、それらを分離する直線スロットの複数の行および列を含む、請求項１に記載のグリッドアセンブリ。
20. 前記直線スロットの前記行は互いに平行であり、前記直線スロットの前記列は互いに平行であり、前記行は前記列に直交する、請求項１９に記載のグリッドアセンブリ。
21. 前記直線スロットの各々の対向する端部は、前記直線スロットのうちの複数の隣接するスロットの隣接する対向する端部で終端する、請求項１９に記載のグリッドアセンブリ。
22. 前記直線スロットの各々の対向する端部は、前記直線スロットのうちの隣接するスロットの中央領域に隣接して終端する、請求項１９に記載のグリッドアセンブリ。
23. 前記多角形箔領域の各々は、正方形状の平面プロファイルを有し、前記箔穴のアレイを含む、請求項１９に記載のグリッドアセンブリ。
24. 前記直線スロットの各々は、一連の直線的に整列したスリット又は単一の連続スリットを含む、請求項１９に記載のグリッドアセンブリ。
25. 前記直線スロットの各々は、スロット幅と、前記スロット幅より約７から１０倍長いスロット長とを有する、請求項１９に記載のグリッドアセンブリ。
    
    

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