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JP2024012394A - 抗ヒトｔｌｒ７抗体 - Google Patents

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JP2024012394A
JP2024012394A JP2023184388A JP2023184388A JP2024012394A JP 2024012394 A JP2024012394 A JP 2024012394A JP 2023184388 A JP2023184388 A JP 2023184388A JP 2023184388 A JP2023184388 A JP 2023184388A JP 2024012394 A JP2024012394 A JP 2024012394A
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Kensuke Miyake
祐輔 村上
Yusuke Murakami
祐二 本井
Yuji Motoi
敦夫 菅野
Atsuo Sugano
敏之 清水
Toshiyuki Shimizu
梅治 大戸
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隆一 下里
Ryuichi Shimozato
篤 萬野
Atsushi Manno
隆志 明松
Takashi Akematsu
純 石黒
Jun Ishiguro
健介 中村
Kensuke Nakamura
崇 磯部
Takashi Isobe
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Daiichi Sankyo Co Ltd
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Abstract

【課題】免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症、がんの治療及び／又は予防剤を提供する。【解決手段】ヒトＴＬＲ７又はサルＴＬＲ７に特異的に結合し、且つマウスＴＬＲ７又はラットＴＬＲ７に結合せず、ヒトＴＬＲ７又はサルＴＬＲ７の機能を阻害する活性を有する抗体を含む医薬組成物等が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は障害及び疾患を治療するための、抗ヒトＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）７抗体に関する。
パターン認識分子であるＴＬＲは、ヒトにおいては１０種類存在することが知られており一つのファミリーを形成している。そのうち、ＴＬＲ７（バリアント１）は１０４９個のアミノ酸からなる一回膜貫通型タンパク質であり、一本鎖ＲＮＡを感知しＩ型インターフェロンやサイトカイン産生等を介して生体防御反応を担う一方で、様々な炎症性疾患や自己免疫疾患の病態形成において重要な役割を果たしている可能性が示唆されている（非特許文献１）。また、ＴＬＲ７（バリアント２）には１０４９個のアミノ酸からなる一回膜貫通型タンパク質であるバリアントも知られており、上記ＴＬＲ７（バリアント１）と同じ機能を有していることが知られている（非特許文献２）。特に乾癬や全身性エリテマトーデスなどの疾患においてはＴＬＲ７の関与を示唆する報告が多く、ＴＬＲ７の機能阻害による疾患治療が期待されている（非特許文献３）。
また、ＴＬＲ７欠損が疾患モデルにおいて症状の軽減に作用する一方で、ＴＬＲ９欠損が疾患の増悪に関与することを示唆する報告から、ＴＬＲ７を特異的に阻害できる薬剤が炎症性疾患等の治療において有望であると考えられる（非特許文献４）。
これまで、ヒトＴＬＲ７阻害を目指した核酸や低分子化合物等の研究開発が試みられてきたものの、核酸や低分子化合物でヒトＴＬＲ７特異的阻害を達成するのは困難であり、またＴＬＲ７抗体としてはマウス抗マウスＴＬＲ７抗体が知られているが（特許文献１）、新たなヒトＴＬＲ７特異的阻害剤の研究開発が求められている。
ＷＯ２０１４／１７４７０４
Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｏ, Ａｋｉｒａ Ｓ. Ｃｅｌｌ. ２０１０ Ｍａｒ １９;１４０(６):８０５－２ Ｃｈｕａｎｇ ＴＨ, Ｕｌｅｖｉｔｃｈ ＲＪ, Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ. ２０００ Ｓｅｐ;１１(３):３７２－８ Ｌｙｎ－Ｃｏｏｋ ＢＤ, Ｘｉｅ Ｃ, Ｏａｔｅｓ Ｊ, Ｔｒｅａｄｗｅｌｌ Ｅ, Ｗｏｒｄ Ｂ, Ｈａｍｍｏｎｓ Ｇ, Ｗｉｌｅｙ Ｋ. Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２０１４ Ｓｅｐ;６１(１):３８－４３. Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＳＲ, Ｓｈｕｐｅ Ｊ, Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ Ｋ, Ｋａｓｈｇａｒｉａｎ Ｍ, Ｆｌａｖｅｌｌ ＲＡ, Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ ＭＪ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ. ２００６ Ｓｅｐ;２５(３):４１７－２８.
本発明の目的は、免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症、がんの治療及び／又は予防剤を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために、免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症、がんの治療及び／又は予防効果を有する物質を探索し、マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体を取得した。得られたマウス抗ヒトＴＬＲ７抗体をヒト化し、さらに当該ヒト化抗体のＣＤＲ、フレームワーク及び可変領域を改変して本発明を完成させた。
即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の特性を有することを特徴とする抗体又は当該抗体の抗原結合性断片：
（ａ）ヒトＴＬＲ７又はサルＴＬＲ７に特異的に結合し、且つマウスＴＬＲ７又はラットＴＬＲ７に結合しない；及び
（ｂ）ヒトＴＬＲ７又はサルＴＬＲ７の機能を阻害する。
（２）ヒトＴＬＲ７が配列番号２若しくは配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる分子であるか、サルＴＬＲ７が配列番号８５に記載のアミノ酸配列からなる分子であるか、マウスＴＬＲ７が配列番号８３に記載のアミノ酸配列からなる分子であるか、又はラットＴＬＲ７が配列番号８４に記載のアミノ酸配列からなる分子である上記（１）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（３）ヒトＴＬＲ７への結合において、
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽鎖を有する抗体、
配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽鎖を有する抗体、又は
配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体
と競合阻害活性を有する上記（１）又は（２）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（４）（ａ）重鎖における相補性決定領域として配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、並びに
軽鎖における相補性決定領域として配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
（ｂ）重鎖における相補性決定領域として配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、並びに
軽鎖における相補性決定領域として配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、又は
（ｃ）重鎖における相補性決定領域として配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、並びに
軽鎖における相補性決定領域として配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
を有する上記（１）乃至（３）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（５）重鎖における相補性決定領域として配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、並びに
軽鎖における相補性決定領域として配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、
を有する上記（４）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（６）（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、又は
（ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
を有する上記（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（７）定常領域がヒト由来定常領域である上記（１）乃至（６）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（８）（ａ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３６記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｂ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列における２０番目から４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
（ｃ）配列番号３９に記載のアミノ酸配列における２０番目から４７０番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４０に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３４番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
を有する上記（７）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（９）ヒト化されている上記（１）乃至（８）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（１０）（Ｉ）（ａ）配列番号４１に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）の配列において1ないし10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加
されたアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、並びに
（ｅ）配列番号４３に記載のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列、
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
（ｈ)（ｅ）又は（ｆ）の配列において１乃至１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加
されたアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、又は
（ＩＩ）（ａ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
（ｃ）（ａ）の配列において１乃至１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、並びに
（ｄ）配列番号５１に記載のアミノ酸配列、
（ｅ）（ｄ）の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
（ｆ)（ｄ）の配列において１乃至１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミ
ノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
を有する上記（９）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（１１）（ａ）配列番号４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｂ）配列番号４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｃ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｄ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、又は
（ｅ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号５１に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
を有する上記（１０）に記載の抗体又は抗体の抗原結合性断片。
（１２）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域
を有する上記（１１）に記載の抗体又は抗体の抗原結合性断片。
（１３）（ａ）配列番号４５に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｂ）配列番号４５に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｃ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｄ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｅ）配列番号４７に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６２番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｆ）配列番号４７に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６２番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｇ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列における２０番目から４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５３に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
（ｈ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６８番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５３に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
を有する上記（１１）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（１４）配列番号４６に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する上記（１３）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（１５）以下の特性を有することを特徴とする抗体又は当該抗体の抗原結合性断片：
（ａ）ヒトＴＬＲ７に特異的に結合する、
（ｂ）ヒトＴＬＲ７の機能を阻害する、及び
（ｃ）（１）重鎖における相補性決定領域として配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、並びに軽鎖における相補性決定領域として配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２１に記載のアミノ
酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、（２）重鎖における相補性決定領域として配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、並びに軽鎖における相補性決定領域として配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３、又は
（３）重鎖における相補性決定領域として配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、並びに軽鎖における相補性決定領域として配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３
を有する。
（１６）重鎖における相補性決定領域として配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、並びに
軽鎖における相補性決定領域として配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３
を有する上記（１５）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（１７）（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、又は
（ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域
を有する上記（１５）又は（１６）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（１８）定常領域がヒト由来定常領域である上記（１５）乃至（１７）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（１９）（ａ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３６記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｂ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列における２０番目から４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
（ｃ）配列番号３９に記載のアミノ酸配列における２０番目から４７０番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４０に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３４番目のアミノ酸配列からなる軽鎖
を有する上記（１８）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（２０）ヒト化されている上記（１５）乃至（１９）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（２１）（Ｉ）
（ａ）配列番号４１に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）の配列において１乃至１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、
並びに
（ｅ）配列番号４３に記載のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列、
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
（ｈ)（ｅ）又は（ｆ）の配列において１乃至１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加さ
れたアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、又は
（ＩＩ）
（ａ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（ｃ）（ａ）の配列において１乃至１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、
並びに
（ｄ）配列番号５１に記載のアミノ酸配列、
（ｅ）（ｄ）の配列に対して少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び（ｆ)（ｄ）の配列において１乃至１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ
酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
を有する上記（２０）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（２２）（ａ）配列番号４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｂ）配列番号４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｃ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
（ｄ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、又は
（ｅ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号５１に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域
を有する上記（２１）に記載の抗体又は抗体の抗原結合性断片。
（２３）配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域を有する上記（２２）に記載の抗体又は抗体の抗原結合性断片。
（２４）（ａ）配列番号４５に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｂ）配列番号４５に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｃ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｄ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｅ）配列番号４７に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６２番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｆ）配列番号４７に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６２番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目
のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｇ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列における２０番目から４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５３に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
（ｈ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６８番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５３に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖
を有する上記（２２）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（２５）配列番号４６に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する上記（２４）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（２６）配列番号４５に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（２７）配列番号４６に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（２８）配列番号４６に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（２９）配列番号４７に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６２番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（３０）配列番号５２に記載のアミノ酸配列における２０番目から４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５３に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（３１）配列番号５４に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６８番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５３に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（３２）（ａ）ヒトＴＬＲ７に特異的に結合し、及び（ｂ）ヒトＴＬＲ７の機能を阻害する特性を有する上記（２６）乃至（３１）のいずれか１項に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（３３）抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ)２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択され上記（１）乃至（３２）のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合性断片。
（３４）上記（１）乃至（３３）のいずれか1項に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性
断片をコードするポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
（３５）（１）配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３をコードするポリヌクレオチド配列、
（２）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１をコードするポリヌクレオチド配
列、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３をコードするポリヌクレオチド配列、又は
（３）配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨを１コードするポリヌクレオチド配列、配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３をコードするポリヌクレオチド配列、
を有する上記（３４）に記載のポリヌクレオチド。
（３６）（Ｉ）
（ａ）配列番号７７に記載の重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号７８に記載の重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するポリヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列、並びに
（ｄ）配列番号７９に記載の軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号８０に記載の軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、及び
（ｆ）（ｄ）又は（ｅ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するポリヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列、又は
（ＩＩ）
（ａ）配列番号８１に記載の重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、及び
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するポリヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列、並びに
（ｃ）配列番号８２に記載の軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、及び
（ｄ）（ｃ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するポリヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列、
を有する上記（３５）に記載のポリヌクレオチド。
（３７）（ａ）配列番号７７に記載の重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号７９に記載の軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号７７に記載の重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号８０に記載の軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号７８に記載の重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号７９に記載の軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号７８に記載の重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号８０に記載の軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、又は
（ｅ）配列番号８１に記載の重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号８２に記載の軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、
を有する上記（３６）に記載のポリヌクレオチド。
（３８）上記（３４）乃至（３７）のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含有する
発現ベクター。
（３９）上記（３８）に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
（４０）宿主細胞が真核細胞である上記（３９）に記載の宿主細胞。
（４１）上記（３９）又は（４０）に記載の宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体又は当該断片の製造方法。
（４２）上記（４１）の製造方法により得られることを特徴とする抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
（４３）Ｎ－結合への糖鎖付加、Ｏ－結合への糖鎖付加、Ｎ末端のプロセッシング、Ｃ末端のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末端へのメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化及び重鎖のカルボキシル末端における１つ又は２つのアミノ酸の欠失からなる群より選択される１又は２以上の修飾を含む上記（１）乃至（３２）のいずれか１項に記載の抗体。
（４４）２本の重鎖が、完全長及びカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸が欠失している欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種又はいずれか二種の組み合わせからなる重鎖である上記（４３）に記載の抗体。
（４５）２本の重鎖の双方でカルボキシル末端において１つのアミノ酸が欠失している上記（４４）に記載の抗体。
（４６）重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている上記（４３）乃至（４５）のいずれか1項に記載の抗体。
（４７）上記（１）乃至（３３）及び（４２）乃至（４６）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片の少なくとも一つ又は上記（３８）に記載の発現ベクターを有効成分として含有することを特徴とする疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
（４８）ヒトＴＬＲ７の機能に起因する疾患の治療用である上記（４７）に記載の医薬組成物。
（４９）ヒトＴＬＲ７の機能に起因する疾患が、免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症、又はがんである上記（４８）に記載の医薬組成物。
（５０）免疫炎症関連疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、成人スチル病、強直性脊椎炎、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、骨関節炎、混合性結合組織病又は筋ジストロフィーである上記（４９）に記載の医薬組成物。
（５１）免疫炎症関連疾患が、全身性エリテマトーデスである上記（４９）又は（５０）に記載の医薬組成物。
（５２）免疫抑制剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗感染症剤、又は抗がん剤と併用するための上記（４７）乃至（５１）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（５３）上記（１）乃至（３３）及び（４２）乃至（４６）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片の少なくとも一つを個体に投与することを特徴とするヒトＴＬＲ７の機能に起因する疾患の治療方法。
（５４）上記（１）乃至（３３）及び（４２）乃至（４６）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片の少なくとも一つ、及び免疫抑制剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗感染症剤、又は抗がん剤を、同時に、別々に又は連続して個体に投与することを特徴とするヒトＴＬＲ７の機能に起因する疾患の治療方法。
（５５）ヒトＴＬＲ７の機能に起因する疾患が、免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症、又はがんである上記（５３）又は（５４）に記載の治療方法。
（５６）免疫炎症関連疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、成人スチル病、強直性脊椎炎、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、骨関節炎、混合性結合組織病又は筋ジストロフィーである上記（５５）に記載の治療方法。
（５７）免疫炎症関連疾患が、全身性エリテマトーデスである上記（５５）又は（５６）に記載の治療方法。
（５８）ヒトＴＬＲ７の機能に起因する疾患の治療又は予防における使用のための、上記
（１）乃至（３３）及び（４２）乃至（４６）のいずれか一項に記載の抗体若しくは当該抗体の抗原結合性断片又は上記（３８）に記載の発現ベクター。
（５９）ヒトＴＬＲ７の機能に起因する疾患が、免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症、又はがんである上記（５８）に記載の抗体若しくは当該抗体の抗原結合性断片又は発現ベクター。
（６０）免疫炎症関連疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、成人スチル病、強直性脊椎炎、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、骨関節炎、混合性結合組織病又は筋ジストロフィーである上記（５９）に記載の抗体若しくは当該抗体の抗原結合性断片又は発現ベクター。
（６１）免疫炎症関連疾患が、全身性エリテマトーデスである上記（５９）又は（６０）に記載の抗体若しくは当該抗体の抗原結合性断片又は発現ベクター。
（６２）免疫抑制剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗感染症剤、又は抗がん剤と併用するための、上記（５８）乃至（６１）のいずれか１項に記載の抗体若しくは当該抗体の抗原結合性断片又は発現ベクター。
（６３）ヒトＴＬＲ７の機能に起因する疾患の治療剤又は予防剤の製造のための、上記（１）乃至（３３）及び（４２）乃至（４６）のいずれか一項に記載の抗体若しくは当該抗体の抗原結合性断片又は上記（３８）に記載の発現ベクターの使用。
（６４）ヒトＴＬＲ７の機能に起因する疾患が、免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症、又はがんである上記（６３）に記載の使用。
（６５）免疫炎症関連疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、成人スチル病、強直性脊椎炎、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、骨関節炎、混合性結合組織病又は筋ジストロフィーである、上記（６４）に記載の使用。
（６６）免疫炎症関連疾患が、全身性エリテマトーデスである、上記（６４）又は（６５）に記載の使用。
（６７）治療剤又は予防剤が、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗感染症剤、又は抗がん剤と併用される、上記（６３）乃至（６６）のいずれか１項に記載の使用。
本発明によれば、ＴＬＲ７の機能阻害を作用機序とする、免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症、がんの治療及び／又は予防剤を得ることができる。
図１は、ヒトＴＬＲ７（バリアント１）のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。 図２は、ヒトＴＬＲ７（バリアント２）のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。 図３は、マウスＴＬＲ７のアミノ酸配列（配列番号８３）を示す図である。 図４は、ラットＴＬＲ７のアミノ酸配列（配列番号８４）を示す図である。 図５は、サルＴＬＲ７のアミノ酸配列（配列番号８５）を示す図である。 図６は、ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体、及びＦＡＮ２抗体がＣＬ－２６４を処理したヒト末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣ）からのＩＬ－６の産生を添加濃度依存的に抑制することを示す図である。 図７は、ｃＡＴ０１抗体のシグナル配列を含む重鎖のアミノ酸配列（配列番号３５）及びシグナル配列を含む軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３６）を示す図である。重鎖アミノ酸配列において１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１３５番目のアミノ酸配列が重鎖可変領域であり、１３６番目から４６５番目のアミノ酸配列が重鎖定常領域である。軽鎖アミノ酸配列において１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１２６番目のアミノ酸配列が軽鎖可変領域であり、１２７番目から２３３番目のアミノ酸配列が軽鎖定常領域である。 図８は、ｃＮＢ７抗体のシグナル配列を含む重鎖のアミノ酸配列（配列番号３７）及びシグナル配列を含む軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３８）を示す図である。重鎖アミノ酸配列において１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１４１番目のアミノ酸配列が重鎖可変領域であり、１４２番目から４７１番目のアミノ酸配列が重鎖定常領域である。軽鎖アミノ酸配列において１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１２６番目のアミノ酸配列が軽鎖可変領域であり、１２７番目から２３３番目のアミノ酸配列が軽鎖定常領域である。 図９は、ｃＦＡＮ２抗体のシグナル配列を含む重鎖のアミノ酸配列（配列番号３９）及びシグナル配列を含む軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４０）を示す図である。重鎖アミノ酸配列において１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１４０番目のアミノ酸配列が重鎖可変領域であり、１４１番目から４７０番目のアミノ酸配列が重鎖定常領域である。軽鎖アミノ酸配列において１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１２７番目のアミノ酸配列が軽鎖可変領域であり、１２８番目から２３４番目のアミノ酸配列が軽鎖定常領域である。 図１０は、キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体であるｃＡＴ０１、ｃＮＢ７、ｃＦＡＮ２がＣＬ－２６４を処理したヒトＰＢＭＣからのＩＬ－６の産生を添加濃度依存的に抑制することを示す図である。 図１１は、ヒト化した重鎖であるｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡのシグナル配列を含む重鎖のアミノ酸配列（配列番号４５）を示す図である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１３５番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１３６番目から４６５番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、４５番目から５４番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、６９番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１８番目から１２４番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。 図１２は、ヒト化した重鎖であるｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡのシグナル配列を含む重鎖のアミノ酸配列（配列番号４６）を示す図である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１３５番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１３６番目から４６５番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、４５番目から５４番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、６９番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１８番目から１２４番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。 図１３は、ヒト化した重鎖であるｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏのシグナル配列を含む重鎖のアミノ酸配列（配列番号４７）を示す図である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１３５番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１３６番目から４６２番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、４５番目から５４番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、６９番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１８番目から１２４番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。 図１４は、キメラ化抗体ｃＡＴ０１の重鎖であるｃＡＴ０１＿Ｈの可変領域のアミノ酸配列（配列番号５）（以下、ｃＡＴ０１＿Ｈ）、並びにヒト化抗体重鎖ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡの可変領域のアミノ酸配列（配列番号４１）（以下、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１）及びｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡの可変領域のアミノ酸配列（配列番号４２）（以下、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３）の比較を示す図である。ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１及びｈｕＡＴ０１＿Ｈ３の配列における「・」はｃＡＴ０１＿Ｈと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。 図１５は、ヒト化した軽鎖であるｈｕＡＴ０１＿Ｌ１のシグナル配列を含む軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４８）を示す図である。当該配列において、１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１２６番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１２７番目から２３３番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４４番から５４番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号７０番から７６番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号１０９番から１１６番はＣＤＲＬ３である。 図１６は、ヒト化した軽鎖であるｈｕＡＴ０１＿Ｌ２のシグナル配列を含む軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４９）を示す図である。当該配列において、１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１２６番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１２７番目から２３３番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４４番から５４番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号７０番から７６番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号１０９番から１１６番はＣＤＲＬ３である。 図１７は、キメラ化抗体ｃＡＴ０１の軽鎖であるｃＡＴ０１＿Ｌの可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１）（以下、ｃＡＴ０１＿Ｌ）、並びにヒト化抗体軽鎖ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１の可変領域のアミノ酸配列（配列番号４３）（以下、ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１）及びｈｕＡＴ０１＿Ｌ２の可変領域のアミノ酸配列（配列番号４４）（以下、ｈｕＡＴ０１＿Ｌ２）の比較を示す図である。ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１及びｈｕＡＴ０１＿Ｌ２の配列における「・」はｃＡＴ０１＿Ｌと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。 図１８は、ヒト化した重鎖であるｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡのシグナル配列を含む重鎖のアミノ酸配列（配列番号５２）を示す図である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１４１番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１４２番目から４７１番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４５番から５５番はＣＤＲＨ1であり、アミノ酸番号７０番から７８番はＣＤＲＨ２であり、アミノ酸番号１１８番から１３０番はＣＤＲＨ３である。 図１９は、ヒト化した重鎖であるｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏのシグナル配列を含む重鎖のアミノ酸配列（配列番号５４）を示す図である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１４１番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１４２番目から４６８番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４５番から５５番はＣＤＲＨ1であり、アミノ酸番号７０番から７８番はＣＤＲＨ２であり、アミノ酸番号１１８番から１３０番はＣＤＲＨ３である。 図２０は、キメラ化抗体ｃＮＢ７の重鎖であるｃＮＢ７＿Ｈの可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）（以下、ｃＮＢ７＿Ｈ）及びヒト化抗体重鎖ｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡの可変領域のアミノ酸配列（配列番号５０）（以下、ｈｕＮＢ７＿Ｈ３）の比較を示す図である。ｈｕＮＢ７＿Ｈ３における「・」はｃＮＢ７＿Ｈと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。 図２１は、ヒト化した軽鎖であるｈｕＮＢ７＿Ｌ３のシグナル配列を含む軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５３）を示す図である。当該配列において、１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１２６番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１２７番目から２３３番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４４番から５４番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号７０番から７６番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号１０９番から１１６番はＣＤＲＬ３である。 図２２は、キメラ化抗体ｃＮＢ７の軽鎖であるｃＮＢ７＿Ｌの可変領域のアミノ酸配列（配列番号１３）（以下、ｃＮＢ７＿Ｌ）及びヒト化抗体軽鎖ｈｕＮＢ７＿Ｌ３の可変領域のアミノ酸配列（配列番号５１）（以下、ｈｕＮＢ７＿Ｌ３）の比較を示す図である。ｈｕＮＢ７＿Ｌ３における「・」はｃＮＢ７＿Ｌと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。 図２３は、ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ、ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ）がＣＬ－２６４を処理したヒトＰＢＭＣからのＩＬ－６の産生を添加濃度依存的に抑制することを示す図である。 図２４－１は、ＡＴ０１抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号１８）及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号１９）、並びにＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号２０）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号２１）及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号２２）を示し、 図２４－２は、ＮＢ７抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号２３）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号２４）及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号２５）、並びにＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号２６）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号２７）及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号２８）を示し、 図２４－３は、ＦＡＮ２抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号２９）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号３０）及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号３１）、並びにＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号３２）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号３３）及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号３４）を示す図である。 図２５は、ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ）の抗原（ヒトＴＬＲ７：バリアント１）への結合に係るフローサイトメトリー解析結果であり、当該抗原に特異的に結合することを示す図である。 図２６は、ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ）の抗原（ヒトＴＬＲ７：バリアント２）への結合に係るフローサイトメトリー解析結果であり、当該抗原に特異的に結合することを示す図である。 図２７は、ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ）の抗原（サルＴＬＲ７）への結合に係るフローサイトメトリー解析結果であり、当該抗原に特異的に結合することを示す図である。 図２８は、ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ）の抗原（マウスＴＬＲ７）への結合に係るフローサイトメトリー解析結果であり、当該抗原には結合しないことを示す図である。 図２９は、ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ）の抗原（ラットＴＬＲ７）への結合に係るフローサイトメトリー解析結果であり、当該抗原に結合しないことを示す図である。
本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含まれるものとする。
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。
本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。
本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
本明細書中において、「ＴＬＲ７」は、ＴＬＲ７蛋白質と同じ意味で用いている。
本明細書中における「抗体の抗原結合性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の抗原結合性断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの抗原結合性断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生さ
れた蛋白質も含まれる。
抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。また、各CDRのアミノ鎖配列は、AbMの定義 (Martin, A. C. R., Cheetham, J. C. and Rees, A. R. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86,9268-9272)に基づき記載されている。
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）中、６８℃でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７－１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１－２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１５ ｍＭ クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
１．ＴＬＲ７
本発明で用いるヒトＴＬＲ７は、ヒトのＢ細胞あるいは樹状細胞から直接精製して使用するか、又は上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、ヒトＴＬＲ７をｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、又は遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、ヒトＴＬＲ７ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってヒトＴＬＲ７を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
同様に、サルＴＬＲ７、マウスＴＬＲ７、及びラットＴＬＲ７は、それぞれサル、マウス、及びラットのＴＬＲ７発現細胞から直接精製して使用するか、又は上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、サルＴＬＲ７、マウスＴＬＲ７、及びラットＴＬＲ７をｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、又は遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
ヒトＴＬＲ７(バリアント１)及びヒトＴＬＲ７(バリアント２)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は各々配列表の配列番号１又は配列番号３に記載されており、ヒトＴＬＲ７(バリアント１)及びヒトＴＬＲ７(バリアント２)のアミノ酸配列は各々配列表の配列番号２又は配列番号４に記載されている。
ヒトＴＬＲ７のｃＤＮＡは例えば、ヒトＴＬＲ７のｍＲＮＡを発現している臓器のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ヒトＴＬＲ７のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ． Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８）２３９，４８７－４９）を行なう、所謂ＰＣＲ法により取得することができる。
なお、ヒトＴＬＲ７をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ヒトＴＬＲ７と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもヒトＴＬＲ７のｃＤＮＡに含まれる。更に、ヒトＴＬＲ７遺伝子座から転写されるスプライシングバリアント又はこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ、ヒトＴＬＲ７と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもヒトＴＬＲ７のｃＤＮＡに含まれる。
また、ヒトＴＬＲ７のアミノ酸配列、又はこれらの配列からシグナル配列が除かれたアミノ酸配列において、１個、２若しくは３個又は４若しくは５個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、ヒトＴＬＲ７と同等の生物活性を有する蛋白質もヒトＴＬＲ７に含まれる。更に、ヒトＴＬＲ７遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１個、２若しくは３個又は４若しくは５個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＴＬＲ７と同等の生物活性を有する蛋白質もヒトＴＬＲ７に含まれる。
サルＴＬＲ７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列表の配列番号５８に記載されており、サルＴＬＲ７のアミノ酸配列は配列表の配列番号８５に記載されている。
サルＴＬＲ７のｃＤＮＡは例えば、サルＴＬＲ７のｍＲＮＡを発現している臓器のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、サルＴＬＲ７のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いて行うＰＣＲ法により取得することができる。
なお、サルＴＬＲ７をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、サルＴＬＲ７と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもサルＴＬＲ７のｃＤＮＡに含まれる。更に、サルＴＬＲ７遺伝子座から転写されるスプライシングバリアント又はこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ、サルＴＬＲ７と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもサルＴＬＲ７のｃＤＮＡに含まれる。
また、サルＴＬＲ７のアミノ酸配列、又はこれらの配列からシグナル配列が除かれたアミノ酸配列において、１個、２若しくは３個又は４若しくは５個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、サルＴＬＲ７と同等の生物活性を有する蛋白質もサルＴＬＲ７に含まれる。更に、サルＴＬＲ７遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１個、２若しくは３個又は４若しくは５個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、サルＴＬＲ７と同等の生物活性を有する蛋白質もサルＴＬＲ７に含まれる。
サルＴＬＲ７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列表の配列番号５８に記載されており、サルＴＬＲ７のアミノ酸配列は配列表の配列番号８５に記載されている。
サルＴＬＲ７のｃＤＮＡは例えば、サルＴＬＲ７のｍＲＮＡを発現している臓器のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、サルＴＬＲ７のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いて行うＰＣＲ法により取得することができる。
マウスＴＬＲ７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列表の配列番号５６に記載されており、マウスＴＬＲ７のアミノ酸配列は配列表の配列番号８３に記載さ
れている。
マウスＴＬＲ７のｃＤＮＡは例えば、マウスＴＬＲ７のｍＲＮＡを発現している臓器のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、マウスＴＬＲ７のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いて行うＰＣＲ法により取得することができる。
ラットＴＬＲ７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列表の配列番号５７に記載されており、ラットＴＬＲ７のアミノ酸配列は配列表の配列番号８４に記載されている。
ラットＴＬＲ７のｃＤＮＡは例えば、ラットＴＬＲ７のｍＲＮＡを発現している臓器のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ラットＴＬＲ７のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いて行うＰＣＲ法により取得することができる。
２．抗ＴＬＲ７抗体及びその製造
本発明は、以下の特性を有することを特徴とする抗体又は当該抗体の抗原結合性断片を提供する：
（ａ）ヒトＴＬＲ７又はサルＴＬＲ７に特異的に結合し、且つマウスＴＬＲ７又はラットＴＬＲ７に結合しない；及び
（ｂ）ヒトＴＬＲ７又はサルＴＬＲ７の機能を阻害する。
本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトＴＬＲ７又はサルＴＬＲ７に特異的に結合し、その機能を阻害する。
抗体又はその抗原結合性断片のＴＬＲ７に対する結合活性は、定法に従い、フローサイトメトリーで解析することにより評価される。
また本明細書中、ＴＬＲ７の機能を阻害するとは、ＴＬＲ７発現細胞によるＩＬ－６及び／又はＩ型インターフェロンの産生を抑制することをいう。ＴＬＲ７の機能を阻害する活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴＬＲ７発現細胞（例えばＰＢＭＣ）を抗体又はその抗原結合性断片の存在下でインキュベートし、培養上清中のＩＬ－６又はＩ型インターフェロンの濃度を測定することにより評価される。
本発明の一実施形態において、ヒトＴＬＲ７は配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる分子であるか、サルＴＬＲ７は配列番号８５に記載のアミノ酸配列からなる分子であるか、マウスＴＬＲ７は配列番号８３に記載のアミノ酸配列からなる分子であるか、又はラットＴＬＲ７が配列番号８４に記載のアミノ酸配列からなる分子である。例えば、本発明において、ヒトＴＬＲ７は配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる分子であり、サルＴＬＲ７は配列番号８５に記載のアミノ酸配列からなる分子であり、マウスＴＬＲ７は配列番号８３に記載のアミノ酸配列からなる分子であり、且つラットＴＬＲ７は配列番号８４に記載のアミノ酸配列からなる分子であり得る。
例えば、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトＴＬＲ７に対する抗体又はその抗原結合性断片であり得、以下の特性：
（ａ）ヒトＴＬＲ７に特異的に結合し、且つマウスＴＬＲ７及び／又はラットＴＬＲ７に結合しない；及び
（ｂ）ヒトＴＬＲ７の機能を阻害する、
を有し、ここでヒトＴＬＲ７は配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる分子であり、マウスＴＬＲ７は配列番号８３に記載のアミノ酸配列からなる分子であり、且つラットＴＬＲ７は配列番号８４に記載のアミノ酸配列からなる分子である。
例えば、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、サルＴＬＲ７に対する抗体又はその抗原結合性断片であり得、以下の特性：
（ａ）サルＴＬＲ７に特異的に結合し、且つマウスＴＬＲ７及び／又はラットＴＬＲ７に結合しない；及び
（ｂ）サルＴＬＲ７の機能を阻害する、
を有し、ここでサルＴＬＲ７は配列番号８５に記載のアミノ酸配列からなる分子であり、マウスＴＬＲ７は配列番号８３に記載のアミノ酸配列からなる分子であり、且つラットＴＬＲ７は配列番号８４に記載のアミノ酸配列からなる分子である。
以下、抗ヒトＴＬＲ７抗体の場合を例として、本発明の抗ＴＬＲ７抗体及びその製造方法を説明する。抗サルＴＬＲ７抗体についても抗ヒトＴＬＲ７抗体と同様に製造することができる。
本発明のヒトＴＬＲ７に対する抗体は、常法を用いて、ヒトＴＬＲ７又はヒトＴＬＲ７のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。
なお、抗原となるヒトＴＬＲ７はヒトＴＬＲ７遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、ＴＬＲ７遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したＴＬＲ７を精製すればよい。
本発明のヒトＴＬＲ７に対する抗体は、ＤＮＡ免疫法を使用して得ることもできる。ＤＮＡ免疫法とは、抗原発現プラスミドをマウスやラットなどの動物個体に遺伝子導入し、抗原を個体内で発現させることによって、抗原に対する免疫を誘導する手法である。
遺伝子導入の手法には、直接プラスミドを筋肉に注射する方法や、プラスミドとリポソームやポリエチレンイミンなどの複合体を静脈注射する方法、ウイルスベクターを用いる手法、プラスミドを付着させた金粒子をＧｅｎｅ Ｇｕｎにより射ち込む手法、急速に大量のプラスミド溶液を静脈注射するＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ法などが存在する。
発現プラスミドの筋注による遺伝子導入法に関して、発現量を向上させる手法として、プラスミドを筋注後、同部位にエレクトロポレーションを加えるｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎという技術が知られている（Ａｉｈａｒａ Ｈ， Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９８ Ｓｅｐ；１６（９）：８６７－７０又はＭｉｒ ＬＭ， Ｂｕｒｅａｕ ＭＦ， Ｇｅｈｌ Ｊ， Ｒａｎｇａｒａ
Ｒ， Ｒｏｕｙ Ｄ， Ｃａｉｌｌａｕｄ ＪＭ， Ｄｅｌａｅｒｅ Ｐ， Ｂｒａｎｅｌｌｅｃ Ｄ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ， Ｓｃｈｅｒｍａｎ Ｄ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９９ Ａｐｒ １３；９６（８）：４２６２－７．）。本手法はプラスミドの筋注前にヒアルロニダーゼで筋肉を処理することにより、さらに発現量が向上する（ＭｃＭａｈｏｎ ＪＭ１， Ｓｉｇｎｏｒｉ Ｅ， Ｗｅｌｌｓ ＫＥ， Ｆａｚｉｏ ＶＭ， Ｗｅｌｌｓ ＤＪ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００１ Ａｕｇ；８（１６）：１２６４－７０）。
また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ
（１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、ＴＬＲ７に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得る
こともできる。このような方法の具体的な例は、国際公開第ＷＯ０９／４８０７２号パンフレット（２００９年４月１６日公開）及び第ＷＯ１０／１１７０１１号（２０１０年１０月１４日公開）パンフレットに記載されている。
このようにして樹立されたマウス抗ヒトＴＬＲ７抗体の実例としては、ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体、及びＦＡＮ２抗体を挙げることができる。
ＡＴ０１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号５に、及び当該配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列表の配列番号６に、ＮＢ７抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号７に、及び当該配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列表の配列番号８に、並びにＦＡＮ２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号９に、及び当該配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０に、各々示されている。
また、ＡＴ０１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１１に、及び当該配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列表の配列番号１２に、ＮＢ７抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１３に、及び当該配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列表の配列番号１４に、並びにＦＡＮ２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１５に、及び当該配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列表の配列番号１６に、各々示されている。
ＡＴ０１抗体の重鎖可変領域は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列（ＧＹＴＦＴＮＮＷＬＨ）からなるＣＤＲＨ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列（ＤＩＹＰＳＮＧＲＴＮ）からなるＣＤＲＨ２及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列（ＥＲＧＹＦＤＹ）からなるＣＤＲＨ３を有している。また、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列（ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＡ）からなるＣＤＲＬ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列（ＹＴＳＴＬＱＰ）からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列（ＬＱＹＤＹＬＬＴ）からなるＣＤＲＬ３を有している。なお、上記のＣＤＲのアミノ酸配列は、図２４－１にも記載されている。
ＮＢ７抗体の重鎖可変領域は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列（ＧＹＳＩＴＳＤＹＡＷＮ）からなるＣＤＲＨ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列（ＨＩＳＹＲＧＮＴＮ）からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列（ＷＮＹＹＧＹＶＤＹＡＭＤＹ）からなるＣＤＲＨ３を有している。また、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列（ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ）からなるＣＤＲＬ１、配列番号２７に示されるアミノ酸配列（ＹＴＳＲＬＨＳ）からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列（ＱＱＧＤＴＦＰＴ）からなるＣＤＲＬ３を有している。なお、上記のＣＤＲのアミノ酸配列は、図２４－２にも記載されている。
ＦＡＮ２抗体の重鎖可変領域は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列（ＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮ）からなるＣＤＲＨ１、配列番号３０に示されるアミノ酸配列（ＭＩＷＧＤＧＳＴＤ）からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３１に示されるアミノ酸配列（ＤＫＧＹＤＧＹＹＹＡＭＤＹ）からなるＣＤＲＨ３を有している。また、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列（ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ）からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３に示されるアミノ酸配列（ＤＡＫＴＬＡＥ）からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列（ＱＨＨＹＧＩＰＹＴ）からなるＣＤＲＬ３を有している。なお、上記のＣＤＲのアミノ酸配列は、図２４－３にも記載されている。
一実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトＴＬＲ７への結合おいて、ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体、又はＦＡＮ２抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域
のアミノ酸配列を有する抗体と競合阻害活性を有し得る。
別の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、重鎖における相補性決定領域としてＡＴ０１抗体のＣＤＲＨ１～３及び軽鎖における相補性決定領域としてＡＴ０１抗体のＣＤＲＬ１～３を有する抗体又はその抗原結合性断片、重鎖における相補性決定領域としてＮＢ７抗体のＣＤＲＨ１～３及び軽鎖における相補性決定領域としてＮＢ７抗体のＣＤＲＬ１～３を有する抗体又はその抗原結合性断片、又は重鎖における相補性決定領域としてＦＡＮ２抗体のＣＤＲＨ１～３及び軽鎖における相補性決定領域としてＦＡＮ２抗体のＣＤＲＬ１～３を有する抗体又はその抗原結合性断片であり得る。好ましい態様において、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、重鎖における相補性決定領域としてＡＴ０１抗体のＣＤＲＨ１～３及び軽鎖における相補性決定領域としてＡＴ０１抗体のＣＤＲＬ１～３を有する抗体又はその抗原結合性断片であり得る。
また別の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体、又はＦＡＮ２抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列を有する抗体であり得る。
本発明の抗体には、ヒトＴＬＲ７に対する上記のモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１－６８５５，（１９８４）参照）。マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体（ＡＴ０１抗体）由来のキメラ抗体としては、配列番号５のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。このようなＡＴ０１抗体由来のキメラ抗体の一例としては、配列番号３５における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３６における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体を挙げることができる。本明細書においては、前記の抗体を「ｃＡＴ０１」あるいは「ｃＡＴ０１抗体」と呼称する。
また、マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体（ＮＢ７抗体）由来のキメラ抗体としては、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖及び配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。このようなＮＢ７抗体由来のキメラ抗体の一例としては、配列番号３７における２０番目から４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３８における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体を挙げることができる。本明細書においては、前記の抗体を「ｃＮＢ７」あるいは「ｃＮＢ７抗体」と呼称する。
更に、マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体（ＦＡＮ２抗体）由来のキメラ抗体としては、配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する重鎖、及び配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。このようなＦＡＮ２抗体由来のキメラ抗体の一例としては、配列番号３９における２０番目から４７０番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４０における２１番目から２３４番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体を挙げることができる。本明細書においては、前記の抗体を「ｃＦＡＮ２」あるいは「ｃＦＡＮ２抗体」と呼称する。
上記のヒトＴＬＲ７に対するキメラ抗体の配列を、ヒトに対する異種抗原性を低下させ
ること等を目的として人為的に改変して、遺伝子組換え型抗体であるヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を作製することができる。また、本発明の抗体には、前記ヒト化抗体のＣＤＲを改変した抗体が含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
ヒト化抗体としては、ＣＤＲのみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５参照）、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号パンフレット）を挙げることができる。
例えば、ｃＡＴ０１抗体及びｃＮＢ７抗体由来のヒト化抗体は、ｃＡＴ０１又はｃＮＢ７に由来する６種全てのＣＤＲ配列を保持し、ヒトＴＬＲ７の機能を阻害する活性を有している。
上記のヒト化抗体の好適な事例としては、ｃＡＴ０１抗体由来のヒト化抗体（ｈｕＡＴ０１抗体）として、
配列番号４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、
を挙げることができる。
また上記のｈｕＡＴ０１抗体の各重鎖可変領域のアミノ酸配列及び各軽鎖可変領域のアミノ酸配列と高い相同性を示す配列を組み合わせることによって、当該抗体と同等の活性を有する抗体を選択することが可能である。このような相同性は、一般的には８０％以上の相同性であり、好ましくは９０％以上の相同性であり、より好ましくは９５％以上の相同性であり、最も好ましくは９９％以上の相同性である(但し、各ＣＤＲは上記の各抗体
と同一である)。また、上記重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列（但し、各Ｃ
ＤＲの部位を除く)に１乃至数個（例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、
９個又は１０個）のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の活性を有する抗体を選択することが可能である。
さらに好適な事例としては、
配列番号４５に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、
配列番号４５に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、
配列番号４６に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、
配列番号４６に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、
配列番号４７に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６２番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、又は
配列番号４７に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６２番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、
を挙げることができる。
また、ｃＮＢ７抗体由来のヒト化抗体（ｈｕＮＢ７抗体）として、配列番号５０のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号５１のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
また上記のｈｕＮＢ７抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列と高い相同性を示す配列を組み合わせることによって、当該抗体と同等の活性を有する抗体を選択することが可能である。このような相同性は、一般的には８０％以上の相同性であり、好ましくは９０％以上の相同性であり、より好ましくは９５％以上の相同性であり、最も好ましくは９９％以上の相同性である(但し、各ＣＤＲは上記の各抗体と同一
である)。また、上記重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列（但し、各ＣＤＲの
部位を除く)に１乃至数個（例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又
は１０個）のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の抗体と同等の活性を有する抗体を選択することが可能である。
さらに好適な事例としては、
配列番号５２に記載のアミノ酸配列における２０番目から４７１番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５３に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、又は
配列番号５４に記載のアミノ酸配列における２０番目から４６８番目のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５３に記載のアミノ酸配列における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、
を挙げることができる。
本発明の抗体は、上記のヒト化抗体にさらに変異を導入して、ヒトＴＬＲ７に対する結合能を変更させたものであっても良い。このような手法はアフィニティマチュレーションと呼ばれるが、具体的な方法としてリボゾームディスプレイ法を挙げることができる。リボゾームディスプレイ法は、蛋白質とその遺伝子情報であるｍＲＮＡがリボソームを介して結合した三者複合体を用い、標的分子と結合する蛋白質の遺伝子配列を単離する方法である（Ｓｔａｆｆｏｒｄ ＲＬ． ｅｔ． ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ． ２０１４（４）：９７－１０９．）。
正常のヒトＴＬＲ７発現細胞への細胞傷害を回避するために、抗体のエフェクター活性は低いことが望ましい。エフェクター活性は抗体のサブクラスによって異なることが知られている。ＩｇＧ４はＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性が低く、ＩｇＧ２はＣＤＣ活性を有するが、ＡＤＣＣ活性は低い、などの特徴が見られる。この特徴より、ＩｇＧ１の定常領域をＩｇＧ２又はＩｇＧ４の定常領域に置換することによってＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を低減させた抗体を作製することが可能である。また、ＩｇＧ１の定常領域の一部の配列をＩｇＧ２又はＩｇＧ４を参考にして置換することにより、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を低減させたＩｇＧ１抗体を作製することが可能である。一例として、Ｍａｒｊａｎ Ｈｅｚａｒｅｈ ｅｔ． ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７５（２４）：１２１６１－１２１６８（２００１）によれば、ＩｇＧ１の２３４番目、２３５番目のロイシン残基（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックス）をそれぞれアラニン残基に置換すると、Ａ
ＤＣＣ、ＣＤＣ活性が低下することが示されている。
本発明には抗体又は当該抗体の抗原結合性断片の修飾体も含まれる。当該修飾体とは、本発明の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ－結合又はＯ－結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ－結合又はＯ－結合への糖鎖付加、Ｎ末端又はＣ末端のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりＮ末端にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような本発明の抗体の又は当該抗体の抗原結合性断片の修飾物は、元の本発明の抗体の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リシンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。
しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など）には影響を及ぼさない。
従って、本発明の抗体及び当該抗体の抗原結合性断片の修飾体としては、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等を挙げることができる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。
本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種の組み合わせからなるものであっても良いし、いずれか二種の組み合わせからなるものであっても良い。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。即ち、配列表に記載の配列番号３５において２０番目から４６５番目のアミノ酸配列、配列番号３７において２０番目から４７１番目のアミノ酸配列、配列番号３９において２０番目から４７０番目のアミノ酸配列、配列番号４５において２０番目から４６５番目のアミノ酸配列、配列番号４６において２０番目から４６５番目のアミノ酸配列、配列番号４７において２０番目から４６２番目のアミノ酸配列、配列番号５２において２０番目から４７１番目のアミノ酸配列及び配列番号５４において２０番目から４６８番目のアミノ酸配列に示される各重鎖配列のカルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなる重鎖も本発明の抗体に使用することができる。
以上の方法によって得られた抗体は、抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる方法であ
る。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Ｌｏｒｉ Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ． ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５－２７３）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方法も知られている（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１－７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１－４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６－８）。上記の抗体は、本発明における抗体の抗原結合性断片の一種と解釈することも可能である。
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節することによって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０、ＷＯ２００７／１３３８５５、ＷＯ２０１３／１２００６６等が知られているが、これらに限定されるものではない。
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子及び軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。より具体的には、抗体遺伝子としては、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、本発明の抗体又はその抗原結合性断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの組み合わせなどが挙げられる。抗体遺伝子を構成する重鎖配列遺伝子には、重鎖可変領域をコードする上記ポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含まれる。また抗体遺伝子を構成する軽鎖配列遺伝子には、軽鎖可変領域をコードする上記ポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含まれる。
宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベク
ターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５－１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６－４２２０）を挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。
本発明の抗体のアイソタイプとしての制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４を挙げることができる。
また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合性断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の抗原結合性断片と呼ぶことができる。
抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞傷害活性、補体依存性細胞傷害活性及び補体依存性細胞性細胞傷害活性を挙げることができる。本発明における抗体の抗原結合性断片が保持する機能は、ヒトＴＬＲ７に対する結合活性であり、好ましくはヒトＴＬＲ７の機能を阻害する活性であり、より好ましくはＴＬＲ７発現細胞によるＩＬ－６及び／又はＩ型インターフェロンの産生を抑制する活性である。
例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の断片に含まれる。
更に、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は２種類の抗原に結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、又はそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作
製することができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７－５３９）。
本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９－３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６－１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖ断片を二重特異性抗体として使用することもできる。
一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９－５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２～１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び当該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン‐へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ヒトＴＬＲ７抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４号参照）。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７－１１４６）。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（ファルマシア）等を挙げることができる。また、抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
３．抗ヒトＴＬＲ７抗体を含有する医薬
上述の「２．抗ＴＬＲ７抗体及びその製造」の項に記載された方法で得られる抗ヒトＴＬＲ７抗体の中から、ヒトＴＬＲ７の機能を阻害する抗体を得ることができる。これらヒトＴＬＲ７の機能を阻害する抗体は、生体内でのヒトＴＬＲ７の生物活性、即ち、血球細胞に代表されるヒトＴＬＲ７発現細胞のヒトＴＬＲ７リガンドによる活性化を阻害できることから、医薬として、これらのヒトＴＬＲ７の機能に起因する疾患に対する治療及び／又は予防剤として用いることができる。
ヒトＴＬＲ７の機能に起因する疾患や状態には、免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症又はがんなどが含まれる。
免疫炎症関連疾患の例としては、結合組織や筋骨格系（全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、成人スチル病、強直性脊椎炎、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、骨関節炎、混合性結合組織病、筋ジストロフィーなど）、血液系（自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病など）、消化器管系（クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎など）、肝胆膵及び内分泌系（自己免疫性肝炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、シェーグレン症候群、１型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、バセドウ病、橋本病など）、呼吸器系（慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、間質性肺炎など）、脳神経系（多発性硬化症、重症筋無力症、髄膜炎、脳脊髄炎、自己免疫性脳炎など）、視覚系（ブドウ膜炎、トラコーマ、眼内炎など）、心血管系（血管炎症候群、多発血管炎性肉芽腫症ヴェゲナー肉芽腫症、心筋炎、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症など）、皮膚表皮系（乾癬、天疱瘡、白斑、接触性皮膚炎、湿疹など）、腎系（糸球体腎炎、糖尿
病性腎症、ＩｇＡ腎症、紫斑病性腎炎、ネフローゼ、間質性膀胱炎など）、内分泌系（１型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、バセドウ病、橋本病など）、全身性炎症（ベーチェット病、抗リン脂質抗体症候群、ＩｇＧ４関連疾患、敗血症、出血、過敏症、移植拒絶、がん化学療法などに起因するショック症状など）などが挙げられる。
アレルギー性疾患の例としては、アトピー性皮膚炎、喘息、アナフィラキシー、アナフィラキシー様反応、食物アレルギー、鼻炎、中耳炎、薬物反応、昆虫刺傷反応、植物反応、ラテックスアレルギー、結膜炎、蕁麻疹などが挙げられる。
感染症の例としては、ウイルス（１本鎖ＲＮＡウイルス、２本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＤＮＡウイルス、２本鎖ＤＮＡウイルス等）、細菌（グラム陰性菌、グラム陽性菌、抗酸菌、放線菌、スピロヘータ、らせん菌、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ等）、真菌（白癬菌、カンジダ、クリプトコッカス、アスペルギルス、ニューモシスチス、マラセチア等）、寄生虫（フィラリア、吸虫、条虫、ジストマ、エキノコックス、赤痢アメーバ、ノミ、シラミ、ダニ、回虫、蟯虫等）等の感染に起因する疾患が挙げられる。
がん治療の例としてはリンパ腫、白血病、乳がん、肺がん、皮膚がん、等が挙げられる。
上記の医薬としての抗ヒトＴＬＲ７抗体の例として、ＡＴ０１抗体及び／又はＮＢ７抗体から作製されたキメラ抗体、ヒト化抗体及びこれのＣＤＲ改変体を挙げることができる。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗ヒトＴＬＲ７抗体によるヒトＴＬＲ７の機能阻害活性は、例えばヒトＴＬＲ７を発現している血球細胞の活性化抑制活性で測定することができる。例えば、ヒトＰＢＭＣに種々の濃度で抗ヒトＴＬＲ７抗体を添加することで、ＣＬ２６４刺激によるヒトＰＢＭＣからのＩＬ－６放出に対する抑制活性を測定することができる。
全身性エリテマトーデスをはじめとする各種免疫炎症関連疾患においてヒトＴＬＲ７のリガンド濃度が上昇している、ヒトＴＬＲ７発現が亢進している、あるいはヒトＴＬＲ７刺激が入っていることは、実験的に証明された事実であり、広く認識されている。ヒトＴＬＲ７リガンドがヒトＴＬＲ７発現細胞に作用し産生されるインターロイキン６（ＩＬ－６）等の炎症性サイトカイン類による炎症反応や抗体産生増強、活性化によるＩ型インターフェロンの放出によって、全身性の免疫炎症反応を生じさせ、全身性エリテマトーデス等の自己免疫が発症・増悪する。従って、これらのヒトＴＬＲ７刺激に依存したサイトカイン類の産生を抑制することは、全身性エリテマトーデス等の予防や治療に繋がるとともに、その抑制活性を指標とすることで、ヒトＴＬＲ７抗体の治療薬としての有用性を判断することが出来る。
本発明における好適な抗体として、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列を有するヒトＴＬＲ７に特異的に結合し、ＣＬ２６４処理されたヒトＰＢＭＣが放出するＩＬ－６量を添加濃度依存的に抑制することを特徴とする、抗体又は当該抗体の抗原結合性断片を挙げることができる。
さらに抗ヒトＴＬＲ７抗体の各種疾患に対する治療又は予防効果は、抗ヒトＴＬＲ７抗体と交差性を有するサルへの当該抗体投与によるｉｎ ｖｉｖｏ評価系若しくはｅｘ ｖｉｖｏ評価系、又はヒトＴＬＲ７トランスジェニック且つマウスＴＬＲ７ノックアウトマウスへの抗ヒトＴＬＲ７抗体投与による、以下のｉｎ ｖｉｖｏ評価系によっても確認できる。
炎症性サイトカイン産生に対する効果は、マウスの腹腔内や静脈内にＴＬＲ７リガンドを投与することで惹起した炎症において、末梢血中のサイトカイン産生能を抗ＴＬＲ７抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
アトピー性皮膚炎に対する効果は、ダニ抗原クリームを耳介又は背部に３日～２週間ごとに３～６回繰り返し塗布する、あるいはハプテン類を耳介や腹部や背部に連日～週１回塗布する、掻痒誘発物質を耳介皮内や背部皮下やくも膜下腔内に投与する、あるいは自然発症アトピーマウスであるＮＣ／Ｎｇａマウスを用いるなどの方法で惹起ないし自然発症させたアトピー性皮膚炎に起因する行動を、マウスの両足甲に装着したマグネットと掻痒行動測定装置による掻痒回数の測定や、皮膚・末梢血・脊髄組織の病理的特徴を検査することで定量化し、抗ヒトＴＬＲ７抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
乾癬に対する効果は、ＩｍｉｑｕｉｍｏｄやＲ８４８を耳介及び剃毛済み背部に塗布する、ＩＬ－２３などのサイトカインをマウス耳介皮内に投与するなどの方法で誘導した乾癬様皮膚炎を、炎症部位の重量、厚み、その部位に浸潤した好中球のミエロペルオキシダーゼ活性、浸潤した細胞のフローサイトメトリー解析、遺伝子解析、サイトカイン濃度などの測定により定量化し、抗ヒトＴＬＲ７抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
関節炎に対する効果は、ウシＩＩ型コラーゲン溶液とフロイントの完全アジュバントを混合し乳化したものをマウスの尾根部皮内に投与し、２～３週間後にウシＩＩ型コラーゲン溶液とフロイントの不完全アジュバントを混合し乳化したものを投与するか、あるいは抗ウシＩＩ型コラーゲン抗体とＴＬＲリガンドを投与するなどの方法で誘導した関節炎を、その後の関節腫脹のスコア化、足蹠の厚み測定、血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、末梢血・脾臓・リンパ節・骨髄・関節部位から得た細胞の増殖活性・サイトカイン産生能・表面抗原などを、抗ヒトＴＬＲ７抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
大腸炎に対する効果は、トリニトロベンゼンスルホン酸を２４時間絶食下のマウス腸管内に投与する、１－１０％のデキストラン硫酸ナトリウム水溶液を給水瓶より４日から２週間自由飲水させる、ヒトＴＬＲ７トランスジェニックマウスのリンパ節と脾臓から採取し精製したＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ４５ＲＢｈｉ Ｔ細胞をＲａｇ２欠損マウスの腹腔内に移入するなどの方法で大腸炎を誘導し、観察期間中の体重、試験終了後の剖検による腸管の肥厚度・ポリープの個数と大きさ・病理組織学的特徴、血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、腸管・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄・パイエル板から得た細胞の増殖活性・サイトカイン産生能・表面抗原などを、抗ヒトＴＬＲ７抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
全身性エリテマトーデスに対する効果は、自然発症モデルであるＮＺＢ／ＷＦ１マウス、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス、ＢＸＳＢマウスから経時的に採取した血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、尿中の抗体価やバイオマーカー濃度、試験終了後に採取した脾臓・リンパ節などの臓器から細胞を調製して無処置のマウスに移入することで惹起させた症状などを、抗ヒトＴＬＲ７抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
肝炎に対する効果は、Ｄ‐ガラクトサミンを単独又はリポポリサッカライドとの組み合わせでマウスの腹腔内に投与する、コンカナバリンＡを単独で尾静脈内に投与するなどの方法で肝炎を誘導し、起炎物質投与の１時間～１週間後に採取した血液中のＡＳＴ及びＡＬＴ濃度、サイトカイン濃度、肝病変の組織病理学的状態を抗ヒトＴＬＲ７抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
このようにして得られたヒトＴＬＲ７の生物活性を阻害する抗体は、医薬として、特に全身性エリテマトーデスをはじめとする免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症、又はがんなどを予防又は治療するための抗体として有用である。
抗ヒトＴＬＲ７抗体は、一つの例としては、免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症、又はがんの治療又は予防に対しては該抗体単独で、あるいは少なくとも一つの他の治療剤と併用して投与することができる。抗ヒトＴＬＲ７抗体と併用して投与できる他の治療剤としては、副腎皮質ステロイド剤、非ステロイド性抗炎症薬、核酸代謝拮抗剤、核酸合成阻害剤、葉酸代謝拮抗剤、カルシニューリン阻害剤、抗マラリア薬、抗胸腺細胞グロブリン剤、細胞表面抗原を標的とする生物製剤、又はサイトカイン・インターフェロンもしくはサイトカイン・インターフェロン受容体を標的とする生物製剤等を挙げることができるがこれらに限定されない。
上記の治療剤の具体例としては、副腎皮質ステロイド剤としてはＭｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、非ステロイド性抗炎症薬としてはＬｏｘｏｐｒｏｆｅｎ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｄｒａｔｅ、Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ ｓｏｄｉｕｍ、Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ、Ａｃｅｔｙl ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ、核酸代謝拮抗剤としてはＭｙｃｏｐｈ
ｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ、核酸合成阻害剤としてはＣｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、カルシニューリン阻害剤としてはＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ、Ｔａｃｌｏｒｉｍｓ、抗マラリア薬としてはＨｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ、葉酸代謝拮抗剤としてはＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、抗胸腺細胞グロブリン剤としてはＺｅｔｂｕｌｉｎ、Ｌｙｍｐｈｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、細胞表面抗原を標的とする生物製剤としてはＡｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ａｂａｔａｃｅｐｔ、サイトカイン・インターフェロンあるいはサイトカイン・インターフェロン受容体を標的とする生物製剤としてはＩｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ、Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ、Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂなどを挙げることができる。
免疫炎症関連疾患、アレルギー性疾患、感染症、又はがんの状態やどの程度の治療及び／又は予防を目指すかによって、２、３あるいはそれ以上の種類の他の治療剤を投与することもできるし、それらの他の治療剤は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することができる。他の治療剤と抗ヒトＴＬＲ７抗体は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することもできる。また、抗ヒトＴＬＲ７抗体と他の治療剤を別々の製剤に封入して同時に投与することもできる。さらに、他の治療剤と抗ヒトＴＬＲ７抗体を相前後して別々に投与することもできる。すなわち、他の治療剤を投与した後に抗ヒトＴＬＲ７抗体又は該抗体の抗原結合性断片を有効成分として含有する治療剤を投与するか、あるいは抗ヒトＴＬＲ７抗体又は該抗体の抗原結合性断片を有効成分として含有する治療剤を投与した後に他の治療剤を投与しても良い。遺伝子治療において投与する場合には、蛋白質性の治療剤の遺伝子と抗ヒトＴＬＲ７抗体の遺伝子は、別々のあるいは同じプロモーター領域の下流に挿入することができ、別々のあるいは、同じベクターに導入することができる。
抗ヒトＴＬＲ７抗体、又はそのフラグメントに対し治療剤を結合させることにより、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，（２００１）５３，１７１－２１６記載の標的型薬物複合体を製造することができる。この目的には、抗体分子のほか、Ｔ細胞の認識性を完全消失していない限り、いずれの抗体フラグメントも適用可能であるが、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等のフラグメントを例として挙げることができ、本発明においても同様に、
抗体及び該フラグメントを使用することができる。抗ヒトＴＬＲ７抗体又は該抗体のフラグメントと治療剤との結合様式は、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， （２００１）５３，１７１－２１６、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ ａｎｄ Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３等に記載される種々の形態があり得る。すなわち、抗ヒトＴＬＲ７抗体と治療剤が化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在して結合される様式や、適当な薬物担体を介在して結合される様式を挙げることができる。薬物担体の例としては、リポソームや水溶性高分子を挙げることができる。これら薬物担体が介在される様式としては、より具体的には、抗体と治療剤とがリポソームに包含され、該リポソームと抗体とが結合した様式、及び、治療剤が水溶性高分子（分子量１０００乃至１０万程度の化合物）に化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在させて結合され、該水溶性高分子に抗体が結合した様式、を例として挙げることができる。抗体（又は該フラグメント）と治療剤、リポソーム及び水溶性高分子等の薬物担体との結合は、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ ａｎｄ Ｊ． Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９５）１２２， ５５－１２３に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。治療剤のリポソームへの包含は、Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９３）等に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。治療剤の水溶性高分子への結合は、Ｄ．Ｐｕｔｎａｍ ａｎｄ
Ｊ Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３記載の方法等の当業者周知の方法により、実施することができる。抗体（又は該フラグメント）と蛋白質性の治療剤（又は該フラグメント）との複合体は、上記の方法のほか、遺伝子工学的に、当業者周知の方法により作製することができる。
本発明は、疾患の治療及び／又は予防に有効な量の抗ヒトＴＬＲ７抗体若しくは当該抗体の抗原結合性断片の少なくとも一つ又はそれらをコードするポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分として含有し、並びに薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。
本発明は、疾患の治療及び／又は予防に有効な量の抗ヒトＴＬＲ７抗体若しくは当該抗体の抗原結合性断片の少なくとも一つ又はそれらをコードするポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、疾患の治療及び／又は予防に有効な量の少なくとも一つの治療剤、並びに薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。
治療剤としては、先に述べた葉酸代謝拮抗剤、カルシニューリン阻害剤、副腎皮質ステロイド剤、抗胸腺細胞グロブリン剤、核酸代謝拮抗剤、核酸合成阻害剤、細胞表面抗原を標的とする生物製剤、又はサイトカインもしくはサイトカイン受容体を標的とする生物製剤等を挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
本発明の医薬組成物は、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない：グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス－塩酸（Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β－シクロデキストリンやヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、ポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗ヒトＴＬＲ７抗体の重量に対して０．０１～１００倍、特に０．１～１０倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはｐＨ７．０－８．５のＴｒｉｓバッファー、ｐＨ４．０－５．５の酢酸バッファー、ｐＨ３．０－６．２のクエン酸バッファーを含むことができる。また、これらのバッファーにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物には抗ヒトＴＬＲ７抗体を含む医薬組成物並びに、抗ヒトＴＬＲ７抗体及び少なくとも一つの治療剤を含む医薬組成物を挙げることができ、本発明の医薬組成物は選択された組成と必要な純度を持つ薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。抗ヒトＴＬＲ７抗体を含む医薬組成物並びに、抗ヒトＴＬＲ７抗体及び少なくとも一つの骨代謝異常治療薬剤を含む医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。
本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、抗ヒトＴＬＲ７抗体のヒトＴＬＲ７に対する親和性、即ち、ヒトＴＬＲ７に対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なくしても薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。本発明における投与量は、抗ヒトＴＬＲ７抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇを１～１８０日間に１回投与すればよい。
本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。
承認されている抗体製剤のほとんどは静脈内投与であるが、多くの医療現場では皮下投与がより好まれる。その場合には容量が１．０～１．５ｍＬに制限されるため、投与量によっては高濃度の抗体溶液が要求される。しかし、高濃度化すると薬液の粘性が増加するために、常用される注射針の太さでは、その高い粘性のために注射できないという事態が生じうる。つまり、医薬組成物の形態としては、注射剤を選ぶ場合、粘度が低いという性質は優先されるべき重要な意味があり、粘度を指標に好適な抗体を選択することができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
［実施例１］マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体の作製
１）－１ 免疫
１）－１－１ ヒトＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６／ヒトＵｎｃ９３Ｂ１－ＨＡ×２強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株の樹立
遺伝子のＣ末端側にＦｌａｇ－Ｈｉｓ×６が付加するレトロウイルスベクターｐＭＸｓ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）に、ヒトＴＬＲ７（バリアント２）遺伝子（配列番号３）をＩｎ Ｆｕｓｉｏｎ(登録商標)酵素（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて組み込んだ。当該レトロウイルスベクターを、ＨＥＫ２９３細胞由来のパッケージング細胞株Ｐｌａｔ－Ｅ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）に、トランスフェクション試薬であるＦｕｇｅｎｅ(登録商標)６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、遺伝子導入した。２４時間後、培養上清を回収し、ウイルス懸濁液とした。当該ウイルス懸濁液をトランスフェクション試薬であるＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）と混和して、Ｂａ／Ｆ３細胞株（ＲＩＫＥＮ， ＢＲＣ）に加え、２０００ｒｐｍ、１時間、高速遠心を行い、ヒトＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６発現Ｂａ／Ｆ３細胞株を樹立した。
ヒトＴＬＲ７（バリアント２）遺伝子（配列番号３）がコードするヒトＴＬＲ７は配列番号４のアミノ酸配列を有する。当該配列を図２に示す。
遺伝子のＣ末端側にＨＡ×２が付加するレトロウイルスベクターｐＭＸｓ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）に、ヒトＵｎｃ９３Ｂ１遺伝子（配列番号５５）をＩｎ Ｆｕｓｉｏｎ(登録商標)酵素（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて組み込んだ。当該レトロウイルスベクターを、ＨＥＫ２９３細胞由来のパッケージング細胞株Ｐｌａｔ－Ｅ（Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）に、トランスフェクション試薬であるＦｕｇｅｎｅ (登録商標)６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、遺伝子導入した。２４時間後、培養上清を回収し、
ウイルス懸濁液とした。当該ウイルス懸濁液をトランスフェクション試薬であるＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）と混和して、上記で樹立したヒトＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６発現Ｂａ／Ｆ３細胞株に加え、２０００ｒｐｍ、１時間、高速遠心を行い、ヒトＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６／ヒトＵｎｃ９３Ｂ１－ＨＡ×２強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株を樹立した。
１）－１－２ マウス免疫
１）－１－１で樹立したヒトＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６／ヒトＵｎｃ９３Ｂ１－ＨＡ×２強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株をアジュバントであるＴｉｔｅｒＭＡＸ(登録商標) Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ ＵＳＡ社製）と混合し、東京大学医科学研究所で作製したＢＡＬＢ／ｃ背景のＴＬＲ９欠損マウスに、抗原として１週間ごとに合計３回、足底部、尾根部、腹腔内に投与した。
４回目に、１×ＰＢＳで懸濁したヒトＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６／ヒトＵｎｃ９３Ｂ１－ＨＡ×２強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株を腹腔内に投与した。
最終免疫日から５日目に脾臓を摘出して、ハイブリドーマの作製に用いた。
１）－２ ハイブリドーマ作製
免疫後の脾臓細胞とＳｐ２／ｏ細胞株（ＡＴＣＣ）を混合し、ＨＶＪ－Ｅ細胞融合キット（石原産業）を用いて細胞融合を行った。細胞融合操作の翌日から、ハイブリドーマを選択するために、ＨＡＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有培養液（１０％ ＦＢＳ、５０ μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０ μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養し、出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。
１）－３ フローサイトメトリー解析によるヒトＴＬＲ７結合抗体スクリーニング
顕微鏡下でコロニーを形成しているハイブリドーマから培養上清を採取してスクリーニングに用いた。Ｓａｐｏｎｉｎ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ） ０．１％で細胞膜透過処理を行ったｈＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６／ｈＵｎｃ９３Ｂ１－ＨＡ×２強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株と、何も発現させていないＢａ／Ｆ３細胞を、培養上清でそれぞれ染色し、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭＸ－２０，日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）で解析して抗ｈＴＬＲ７抗体を産生するハイブリドーマを選別した。
１）－４ フローサイトメトリーによるヒトＴＬＲ７機能阻害抗体スクリーニング
Ｂａ／Ｆ３細胞株（ＲＩＫＥＮ， ＢＲＣ）に、ヒトＴＬＲ７（バリアント２）遺伝子（配列番号３）及びヒトＵｎｃ９３Ｂ１ Ｄ３４Ａ ｍｕｔａｎｔ－ＨＡ×２遺伝子（配列番号８６）をレトロウイルスを用いて導入した。更に、当該細胞にＮＦ－κＢ－緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）レポータープラスミド（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）をエレクトロポレーション法によって遺伝子導入し、ＮＦ－κＢの活性化を解析できるｈＴＬＲ７／ｈＵｎｃ９３Ｂ１ Ｄ３４Ａ ｍｕｔａｎｔ－ＨＡ×２強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株を確立し、当該細胞株にハイブリドーマの培養上清を添加した。４時間後、ＴＬＲ７リガンドであるＲ８４８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）２５ｎｇ／ｍｌで刺激した。２４時間後、フローサイトメトリーを用いて、ＧＦＰの蛍光度を測定してヒトＴＬＲ７応答の阻害効果を解析した結果、３つのマウス抗ヒトＴＬＲ７抗体産生ハイブリドーマを選抜し、各々ＡＴ０１、ＮＢ７及びＦＡＮ２と命名した。
本願明細書において、ハイブリドーマＡＴ０１、ＮＢ７及びＦＡＮ２が産生する抗体を、各々ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体及びＦＡＮ２抗体と称する。
１）－５ 抗体のアイソタイプ決定
１）－４で取得された各マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体産生ハイブリドーマ（ＡＴ０１、ＮＢ７及びＦＡＮ２）が産生する抗体のアイソタイプを、ＩｓｏＳｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて決定した。その結果、ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体及びＦＡＮ２抗体のアイソタイプは、各々ＩｇＧ１／κ鎖であることが示された。
１）－６ マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体の調製
マウス抗ヒトＴＬＲ７モノクローナル抗体は、プリスタン（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ、現Ｍｅｒｃｋ）を前処置したＩＣＲ－ＣＤ１－Ｆｏｘｎ１ヌードマウス（ＩＣＲ－ｎｕ、日本チャールズ・リバー）にハイブリドーマを腹腔内投与して、約１０日後、回収した腹水から精製した。
まず、プリスタンをＩＣＲ－ｎｕに腹腔内投与をして７日間以上、飼育した。次に、ＡＴ０１、ＮＢ７、ＦＡＮ２産生ハイブリドーマを１０％ ＦＢＳ、５０ μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０ Ｕ／ｍＬ
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０ μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養し、十分量まで増殖させた後、１×ＰＢＳに懸濁してＩＣＲ－ｎｕに腹腔内投与した。
１０日後、腹水を回収して、高速遠心機で血球を沈降させ、上清を回収した。１×ＰＢＳで腹水を１０倍に希釈した後、０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通した。
抗体は、上記の腹水からＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアジャパン）を用いて、ｐｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン）で精製した。
続いて、ＰＤ－１０（ＧＥヘルスケアジャパン）で、生理食塩水へのバッファー置換を行うとともに濃縮を行い、抗体濃度を１．０ ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。
最後にＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ ０．２２ μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で滅菌し、精製サンプルとした。
［実施例２］マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
２）－１ マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体の結合選択能評価
２）－１－１ マウスＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株の樹立
遺伝子のＣ末端側にＦｌａｇ－Ｈｉｓ×６が付加するレトロウイルスベクターｐＭＸｓ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）に、マウスＴＬＲ７遺伝子（配列番号５６）をＩｎ Ｆｕｓｉｏｎ(登録商標)酵素（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて組み込んだ。当該レトロウイルスベクターを、ＨＥＫ２９３細胞由来のパッケージング細胞株Ｐｌａｔ－Ｅ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）に、トランスフェクション試薬であるＦｕｇｅｎｅ(登録商標)６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、遺伝子導入した。２４時間後、培養上清を回収し、ウイルス懸濁液とした。当該ウイルス懸濁液をトランスフェクション試薬であるＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）と混和して、Ｂａ／Ｆ３細胞株（ＲＩＫＥＮ， ＢＲＣ）に加え、２０００ｒｐｍ、１時間、高速遠心を行い、マウスＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株を樹立した。
マウスＴＬＲ７遺伝子（配列番号５６）がコードするマウスＴＬＲ７は配列番号８３のアミノ酸配列を有する。当該配列を図３に示す。
２）－１－２ ラットＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株の樹
立
遺伝子のＣ末端側にＦｌａｇ－Ｈｉｓ×６が付加するレトロウイルスベクターｐＭＸｓ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）に、ラットＴＬＲ７遺伝子（配列番号５７）をＩｎ Ｆｕｓｉｏｎ(登録商標)酵素（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて組み込んだ。当該レトロウイルスベクターを、ＨＥＫ２９３細胞由来のパッケージング細胞株Ｐｌａｔ－Ｅ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）に、トランスフェクション試薬であるＦｕｇｅｎｅ(登録商標)６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、遺伝子導入した。２４時間後、培養上清を回収し、ウイルス懸濁液とした。当該ウイルス懸濁液をトランスフェクション試薬であるＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）と混和して、Ｂａ／Ｆ３細胞株（ＲＩＫＥＮ， ＢＲＣ）に加え、２０００ｒｐｍ、１時間、高速遠心を行い、ラットＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株を樹立した。
ラットＴＬＲ７遺伝子（配列番号５７）がコードするラットＴＬＲ７は配列番号８４のアミノ酸配列を有する。当該配列を図４に示す。
２）－１－３ サルＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株の樹立
遺伝子のＣ末端側にＦｌａｇ－Ｈｉｓ×６が付加するレトロウイルスベクターｐＭＸｓ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）に、サルＴＬＲ７遺伝子（配列番号５８）をＩｎ Ｆｕｓｉｏｎ(登録商標)酵素（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて組み込んだ。当該レトロウイルスベクターを、ＨＥＫ２９３細胞由来のパッケージング細胞株Ｐｌａｔ－Ｅ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）に、トランスフェクション試薬であるＦｕｇｅｎｅ(登録商標)６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、遺伝子導入した。２４時間後、培養上清を回収し、ウイルス懸濁液とした。当該ウイルス懸濁液をトランスフェクション試薬であるＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）と混和して、Ｂａ／Ｆ３細胞株（ＲＩＫＥＮ， ＢＲＣ）に加え、２０００ｒｐｍ、１時間、高速遠心を行い、サルＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株を構築した。
サルＴＬＲ７遺伝子（配列番号５８）がコードするサルＴＬＲ７は配列番号８５のアミノ酸配列を有する。当該配列を図５に示す。
２）－１－４ フローサイトメトリーによるマウス抗ヒトＴＬＲ７抗体の結合選択能評価
１）－１－１で樹立したヒトＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６／ヒトＵｎｃ９３Ｂ１－ＨＡ×２強制発現したＢａ／Ｆ３細胞株、２）－１－１で樹立したマウスＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株、２）－１－２で樹立したラットＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６×２強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株、及び２）－１－３で樹立したサルＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６強制発現Ｂａ／Ｆ３細胞株を、０．１％ Ｓａｐｏｎｉｎで細胞膜透過処理を行い、ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体及びＦＡＮ２抗体と二次抗体であるＧｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）－ＰＥ （ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色した。各抗体の結合選択能の評価は、フローサイトメトリーで解析して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を比較した。
その結果、ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体及びＦＡＮ２抗体は、ヒトＴＬＲ７又はサルＴＬＲ７に特異的に結合し、マウスＴＬＲ７又はラットＴＬＲ７に結合しなかった。
２）－２ マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体の結合能評価
１）－１－１で樹立したヒトＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６／ヒトＵｎｃ９３Ｂ１－ＨＡ×２強制発現したＢａ／Ｆ３細胞株を、０．１％ Ｓａｐｏｎｉｎで細胞膜透過処理を行い、ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体及びＦＡＮ２抗体の希釈系列と二次抗体であるＧｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）－ＰＥ （ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い
て染色した。各抗体の結合活性の評価は、フローサイトメトリーで解析して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を比較した。
その結果、結合活性が強いものから、ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体、ＦＡＮ２抗体の順であった。
２）－３ マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体のサイトカイン産生抑制作用
ヒトＰＢＭＣはＣｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から凍結品として購入し、指示書に従って解凍して使用した。
１０％ ＦＢＳ、１ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ社）、０．１ ｍＭ ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、５０ μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、５０ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０ μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で２．５ｘ１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製したＰＢＭＣを９６－ｗｅｌｌｓ細胞培養プレートに１００ μＬずつ播種し、マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体であるＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体、ＦＡＮ２抗体、又はマウスＩｇＧコントロール抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を８０ μＬ／ｗｅｌｌ添加して３７℃インキュベーター内で４時間前処置した。
その後、１ ｍｇ／ｍＬ ＣＬ－２６４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を２０ μＬ／ｗｅｌｌ添加し、よく攪拌した後、約２０時間３７℃、５％ ＣＯ2下で培養した。プレート
をよく攪拌した後、１５００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清に含まれるインターロイキン－６（ＩＬ－６）濃度をＦＲＥＴ法（Ｃｉｓｂｉｏ社）で測定した 。
結果を図６に示す。マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体がＣＬ－２６４を処理したヒトＰＢＭＣからのＩＬ－６の産生を添加濃度依存的に抑制した。ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体及びＦＡＮ２抗体はヒトＰＢＭＣからのＩＬ－６の産生を添加濃度依存的に阻害した。ＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体及びＦＡＮ２抗体の半数阻害濃度（ＩＣ50）は５０％阻害活性を挟んだ二点間の濃度と、その濃度を添加した際の阻害活性から算出し、各々１９２ ｎｇ／ｍＬ、７７１ ｎｇ／ｍＬ、８３８９ ｎｇ／ｍＬであった。
一方、マウスＩｇＧコントロール抗体では１０ μｇ／ｍＬの濃度においても阻害は観察されなかった。
［実施例３］マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の決定
３）－１ ｃＤＮＡ合成
ＡＴ０１、ＮＢ７、ＦＡＮ２のハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。続いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてｃＤＮＡを合成した。
３）－２ マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子断片の増幅及び配列決定
合成したｃＤＮＡに含まれる抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列は、ＧＥＮＥＳＣＲＩＰＴ社にて解読された。
３）－２－１ マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体（ＡＴ０１）
決定されたＡＴ０１抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示した。
決定されたＡＴ０１抗体の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１１に示した。
３）－２－２ マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体（ＮＢ７）
決定されたＮＢ７抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号７に示した。
決定されたＮＢ７抗体の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１３に示した。
３）－２－３ マウス抗ヒトＴＬＲ７抗体（ＦＡＮ２）
決定されたＦＡＮ２抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号９に示した。
決定されたＦＡＮ２抗体の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１５に示した。
［実施例４］キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体の作製
４）－１ キメラ化抗ＴＬＲ７抗体の発現ベクターの構築
４）－１－１ キメラ化軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトカッパ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（配列番号５９）をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫからネオマイシン発現ユニットを除去することによりｐＣＭＡ－ＬＫを構築した。
４）－１－２ キメラ化ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１の構築
ｐＣＭＡ－ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトカッパ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、ヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（配列番号６０）をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐＣＭＡ－Ｇ１を構築した。
４)－１－３ ＡＴ０１キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体発現ベクターの構築
配列番号６１に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４２２に示されるｃＡＴ０１抗体重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に合成したＤＮＡ断片を挿入することによりｃＡＴ０１抗体重鎖発現ベクターを構築した。ｃＡＴ０１抗体の重鎖はシグナル配列を含め配列番号３５のアミノ酸配列を有する。当該配列を図７に示す。
ｃＡＴ０１抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（配列番号６２）を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）－１－１で作製したｐＣＭＡ－ＬＫを用いて、上記と同様の方法でｃＡＴ０１抗体軽鎖発現ベクターを構築した。ｃＡＴ０１抗体の軽鎖はシグナル配列を含め配列番号３６のアミノ酸配列を有する 当該配列を図７に示す。
４)－１－４ ＮＢ７キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体発現ベクターの構築
配列番号６３に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４４０に示されるｃＮＢ７抗体重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）－１－３と同様の方法でｃＮＢ７重鎖発現ベクターを構築した。ｃＮＢ７抗体の重鎖はシグナル配列を含め配列番号３７のアミノ酸配列を有する。当該配列を図８に示す。
ｃＮＢ７軽鎖をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（配列番号６４）を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）－１－１で作製したｐＣＭＡ－ＬＫを用いて、実施例４)－１－３と同様の方法でｃＮＢ７軽鎖発現ベクターを構築した。ｃＮＢ７抗体の軽鎖は
シグナル配列を含め配列番号３８のアミノ酸配列を有する。当該配列を図８に示す。
４）－１－５ ＦＡＮ２キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体発現ベクターの構築
配列番号６５に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７ に示される
ｃＦＡＮ２抗体重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）－１－３と同様の方法でｃＦＡＮ２重鎖発現ベクターを構築した。ｃＦＡＮ２抗体の重鎖はシグナル配列を含め配列番号３９のアミノ酸配列を有する。当該配列を図９に示す。
ｃＦＡＮ２軽鎖をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（配列番号６６）を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）－１－１で作製したｐＣＭＡ－ＬＫを用いて、実施例４)－１－３と同様の方法でｃＦＡＮ２軽鎖発現ベクターを構築した。ｃＦＡＮ２抗体の
軽鎖はシグナル配列を含め配列番号４０のアミノ酸配列を有する。当該配列を図９に示す。
４）－２ キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体の製造
４）－２－１ キメラ化ＡＴ０１抗体の製造
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０9個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３
Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ Ｆｅｒｎｂａｃｈ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して２．０×１０6細胞／ｍＬ
に調製した。４０ｍＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に０．２４ｍｇの上記４)－１－３で構築した重鎖発現ベクターと０．３６ｍｇの上記４)－１－３で構築した軽鎖発現ベクターと１．８ｍｇのＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）を加えて穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ2インキュベー
ターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に６００ｍｌのＥＸ－ＣＥＬＬ ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び３０ｍＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ2インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培
養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃａｐｓｕｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ （Ａｄｖａｎｔｅｃ ＃ＣＣＳ－０４５－Ｅ１Ｈ）でろ過して、キメラ化ＡＴ０１抗体を製造した。
４）－２－２ キメラ化ＮＢ７抗体の製造
上記４)－１－４で構築した重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターを用いて、上記４
）－２－１の方法によりキメラ化ＮＢ７抗体を製造した。
４）－２－３ キメラ化ＦＡＮ２抗体の製造
上記４)－１－５で構築した重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターを用いて、上記４
）－２－１の方法によりキメラ化ＦＡＮ２抗体を製造した。
４）－３ キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体の精製
実施例４）－２で得られた各培養上清から目的の抗体をｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの１段階工程で精製した。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅが充填されたカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライしたのちに、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍ アルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳ（－）へのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）で抗体を濃縮し、ＩｇＧ濃度を１０ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
［実施例５］キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
５）－１ フローサイトメトリーによるキメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体の抗原結合活性
ヒトＴＬＲ７－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ×６／ｈＵｎｃ９３Ｂ１－ＨＡ×２強制発現したＢａ／Ｆ３細胞株を、０．１％ Ｓａｐｏｎｉｎで細胞膜透過処理を行い、実施例４で得られたキメラ化したＡＴ０１抗体、ＮＢ７抗体、及びＦＡＮ２抗体の抗体濃度の希釈系列と二次抗体であるＧｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ （ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色した。抗体の結合活性の評価は、フローサイトメトリーで解析して、ＭＦＩを比較した。その結果、結合活性が強いものから、キメラ化ＡＴ０１抗体（ｃＡＴ０１）、キメラ化ＮＢ７抗体（ｃＮＢ７）、キメラ化ＦＡＮ２抗体（ｃＦＡＮ２）の順であった。
５）－２ キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体のサイトカイン産生抑制作用
ヒトＰＢＭＣはＣｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から凍結品として購入し、指示書に従って解凍して使用した。１０％ ＦＢＳ、１ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕ
ｖａｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、０．１ ｍＭ ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、５０ μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、５０ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０ μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で２．５ｘ１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製したＰＢＭＣを９６－ｗｅｌｌｓ細胞培養プレートに１００ μＬずつ播種し、キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体であるｃＡＴ０１、ｃＮＢ７、ｃＦＡＮ２、又はヒトＩｇＧコントロール抗体（ＥＵＲＥＫＡ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）を８０ μＬ／ｗｅｌｌ添加して
３７℃インキュベーター内で４時間前処置した。その後、１ ｍｇ／ｍＬ ＣＬ－２６４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を２０ μＬ／ｗｅｌｌ添加し、よく攪拌した後、約２０時間３７℃、５％ ＣＯ2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、１５００ｒｐｍにて５
分間遠心し、上清に含まれるＩＬ－６濃度をＦＲＥＴ法（Ｃｉｓｂｉｏ社）で測定した。
図１０はキメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体がＣＬ－２６４を処理したヒトＰＢＭＣからのＩＬ－６の産生を添加濃度依存的に抑制することを示す。ｃＡＴ０１、ｃＮＢ７、ｃＦＡＮ２はヒトＰＢＭＣからのＩＬ－６の産生を添加濃度依存的に阻害した。ｃＡＴ０１、ｃＮＢ７、ｃＦＡＮ２の半数阻害濃度（ＩＣ50）は５０％阻害活性を挟んだ二点間の濃度と、その濃度を添加した際の阻害活性から算出し、各々３５ ｎｇ／ｍＬ、１９６ ｎｇ／ｍＬ、１００００ ｎｇ／ｍＬ以上であった。
一方、ヒトＩｇＧコントロール抗体では１０ μｇ／ｍＬの濃度においても阻害は観察されなかった。
［実施例６］ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体の製造
６）－１ 抗ヒトＴＬＲ７抗体のヒト化体デザイン
６)－１－１ 抗体可変領域の分子モデリング
可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))を利用し、市販のタンパク質立体構造解析プログラムBioLuminate(Schrodinger社製)を用いて行った。鋳型は、重鎖と軽鎖の可変領域に対して高い配列同一性を有するProtein Data Bank(Nuc. Acid Res.35,D301-D303(2007))に登録され
ている構造を用いた。
６)－１－２ ヒト化アミノ酸配列の設計
ヒト化はＣＤＲグラフティング（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033(1989)) として知られる手法を利用した。Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))において既定されるコンセンサス配列やIMGT(THE INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM(登録商標), http://www.imgt.org)に登録されているヒ
トgermline配列から同一性の高いアクセプターを選択し、アクセプター上に移入すべきドナー残基は、Queen et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033(1989)) によ
って与えられる基準などを参考に三次元モデルを分析することで選択された。
６)－１－３ ＡＴ０１抗体のヒト化アミノ酸配列の設計
ヒトのガンマ鎖サブグループ１及びカッパ鎖サブグループ１のコンセンサス配列がｃＡＴ０１のフレームワーク領域に対して高い同一性を有することから、ｃＡＴ０１のアクセプターとして選択された。可変領域の分子モデリングでは、既知構造（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｅ４Ｗ）を鋳型とした。
６）－１－３－１ ＡＴ０１抗体重鎖のヒト化
（１）設計された重鎖をｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡと命名した。ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡは重鎖全長アミノ酸配列としてシグナル配列を含め配列番号４５に記載するアミノ酸配列を有する。当該配列を図１１に示す。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１３５番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１３６番目から４６５番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、４５番目から５４番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、６９番目から７８
番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１８番目から１２４番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。
配列番号４５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号６７に記載する配列を有する。また、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号７７に記載する配列を有する。
（２）設計された重鎖をｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡと命名した。ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡは重鎖全長アミノ酸配列としてシグナル配列を含め配列番号４６に記載するアミノ酸配列を有する。当該配列を図１２に示す。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１３５番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１３６番目から４６５番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、４５番目から５４番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、６９番目から７８
番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１８番目から１２４番目のアミノ酸配列がＣ
ＤＲＨ３である。
配列番号４６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号６８に記載する配列を有する。また、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号７８に記載する配列を有する。
（３）設計された重鎖をｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏと命名した。ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏは重鎖全長アミノ酸配列としてシグナル配列を含め配列番号４７に記載するアミノ酸配列を有する。当該配列を図１３に示す。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１３５番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１３６番目から４６２番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、４５番目から５４番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、６９番目から７８番目
のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１８番目から１２４番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。
配列番号４７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号６９に記載する配列を有する。また、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号７８に記載する配列を有する。
キメラ化抗体ｃＡＴ０１の重鎖であるｃＡＴ０１＿Ｈの可変領域のアミノ酸配列（配列番号５）（以下、ｃＡＴ０１＿Ｈ）、並びにヒト化抗体重鎖ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡの可変領域のアミノ酸配列（配列番号４１）（以下、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１）及びｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡの可変領域のアミノ酸配列（配列番号４２）（以下、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３）の比較を図１４に示す。ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１及びｈｕＡＴ０１＿Ｈ３の配列における「・」はｃＡＴ０１＿Ｈと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。
６）－１－３－２ ＡＴ０１抗体軽鎖のヒト化
設計された軽鎖をｈｕＡＴ０１＿Ｌ１と命名した。ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１は軽鎖全長アミノ酸配列としてシグナル配列を含む配列番号４８に記載するアミノ酸配列を有する。当該配列を図１５に示す。当該配列において、１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１２６番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１２７番目から２３３番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４４番から５４番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号７０番から７６番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号１０
９番から１１６番はＣＤＲＬ３である。
配列番号４８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号７０に記載する配列を有する。また、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号７９に記載する配列を有する。
設計された軽鎖をｈｕＡＴ０１＿Ｌ２と命名した。ｈｕＡＴ０１＿Ｌ２は軽鎖全長アミノ酸配列としてシグナル配列を含む配列番号４９に記載するアミノ酸配列を有する。当該配列を図１６に示す。当該配列において、１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１２６番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１２７番目から２３３番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４４番から５４番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号７０番から７６番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号１０
９番から１１６番はＣＤＲＬ３である。
配列番号４９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号７１に記載する。また、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号８０に記載する配列を有
する。
キメラ化抗体ｃＡＴ０１の軽鎖であるｃＡＴ０１＿Ｌの可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１）（以下、ｃＡＴ０１＿Ｌ）、並びにヒト化抗体軽鎖ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１の可変領域のアミノ酸配列（配列番号４３）（以下、ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１）及びｈｕＡＴ０１＿Ｌ２の可変領域のアミノ酸配列（配列番号４４）（以下、ｈｕＡＴ０１＿Ｌ２）の比較を図１７に示す。ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１及びｈｕＡＴ０１＿Ｌ２の配列における「・」はｃＡＴ０１＿Ｌと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。
６）－１－４ ＮＢ７のヒト化アミノ酸配列の設計
ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列のＩＧＨＶ４－３０－４＊０２とＩＧＨＪ６＊０１がｃＮＢ７のフレームワーク領域に対して高い同一性を有することから、ｃＮＢ７のアクセプターとして選択された。可変領域の分子モデリングでは、既知構造(ＰＤＢ ＩＤ:３ＣＤＦ)を鋳型とした。
６）－１－４－１ ＮＢ７抗体重鎖のヒト化
（１）設計された重鎖をｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡと命名した。ｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡは重鎖全長アミノ酸配列としてシグナル配列を含む配列番号５２に記載するアミノ酸配列を有する。当該配列を図１８に示す。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１４１番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１４２番目から４７１番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４５番から５５番はＣＤＲＨ1であり、アミノ酸番号７０番から７８
番はＣＤＲＨ２であり、アミノ酸番号１１８番から１３０番はＣＤＲＨ３である。
配列番号５２のアミの酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号７２に記載する。また、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号８１に記載する配列を有する。
（２）設計された重鎖をｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏと命名した。ｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏは重鎖全長アミノ酸配列としてシグナル配列含む配列番号５４に記載するアミノ酸配列を有する。当該配列を図１９に示す。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１４１番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１４２番目から４６８番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４５番から５５番はＣＤＲＨ1であり、アミノ酸番号７０番から７８番はＣ
ＤＲＨ２であり、アミノ酸番号１１８番から１３０番はＣＤＲＨ３である。
配列番号５４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号７３に記載する。また、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号８１に記載する配列を有する。
キメラ化抗体ｃＮＢ７の重鎖であるｃＮＢ７＿Ｈの可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）（以下、ｃＮＢ７＿Ｈ）及びヒト化抗体重鎖ｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡの可変領域のアミノ酸配列（配列番号５０）（以下、ｈｕＮＢ７＿Ｈ３）の比較を図２０に示す。ｈｕＮＢ７＿Ｈ３における「・」はｃＮＢ７＿Ｈと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。
６）－１－４－２ ＮＢ７抗体軽鎖のヒト化
設計された軽鎖をｈｕＮＢ７＿Ｌ３と命名した。ｈｕＮＢ７＿Ｌ３は軽鎖全長アミノ酸配列としてシグナル配列を含む配列番号５３に記載するアミノ酸配列を有する。当該配列
を図２１に示す。当該配列において、１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１２６番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１２７番目から２３３番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４４番から５４番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号７０番から７６番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号１０９番
から１１６番はＣＤＲＬ３である。
配列番号５３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号７４に記載する。また、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号８２に記載する配列を有する。
キメラ化抗体ｃＮＢ７の軽鎖であるｃＮＢ７＿Ｌの可変領域のアミノ酸配列（配列番号１３）（以下、ｃＮＢ７＿Ｌ）及びヒト化抗体軽鎖ｈｕＮＢ７＿Ｌ３の可変領域のアミノ酸配列（配列番号５１）（以下、ｈｕＮＢ７＿Ｌ３）の比較を図２２に示す。ｈｕＮＢ７＿Ｌ３における「・」はｃＮＢ７＿Ｌと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。
６）－２ 重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化抗体の設計
６）－２－１ ヒト化ＡＴ０１抗ＴＬＲ７抗体の設計
（１）重鎖として配列番号４５における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなるｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ及び軽鎖として配列番号４８における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなるｈｕＡＴ０１＿Ｌ１を有する抗体を「ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ抗体」又は「ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ」と命名した。
（２）重鎖として配列番号４６における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなるｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ及び軽鎖として配列番号４８における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなるｈｕＡＴ０１＿Ｌ１を有する抗体を「ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ抗体」又は「ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ」と命名した。
（３）重鎖として配列番号４６における２０番目から４６５番目のアミノ酸配列からなるｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ及び軽鎖として配列番号４９における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなるｈｕＡＴ０１＿Ｌ２を有する抗体を「ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ抗体」又は「ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ」と命名した。
（４）重鎖として配列番号４７における２０番目から４６２番目のアミノ酸配列からなるｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ及び軽鎖として配列番号４９における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなるｈｕＡＴ０１＿Ｌ２を有する抗体を「ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ抗体」又は「ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ」と命名した。
６）－２－２ ヒト化ＮＢ７抗ＴＬＲ７抗体の設計
（１）重鎖として配列番号５２における２０番目から４７１番目のアミノ酸配列からなるｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ及び軽鎖として配列番号５３における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなるｈｕＮＢ７＿Ｌ３からなる抗体を「ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ抗体」又は「ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ」と命名した。
（２）重鎖として配列番号５４ における２０番目から４６８番目のアミノ酸配列から
なるｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ及び軽鎖として配列番号５３における２１番目から２３３番目のアミノ酸配列からなるｈｕＮＢ７＿Ｌ３からなる抗体を「ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ抗体」又は「ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ」と命名した。
６）－３ ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体の作製
６）－３－１ ヒト化ＩｇＧ１ＬＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１ＬＡＬ
Ａの構築
ヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１ＬＡＬＡ定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（配列番号７５）を用いて、実施例４）－１－２と同様の方法でｐＣＭＡ－Ｇ１ＬＡＬＡを構築した。
６）－３－２ ヒト化ＩｇＧ４Ｐｒｏタイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ４Ｐｒｏの
構築
ヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ４Ｐｒｏ定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（配列番号７６）を用いて、実施例４）－１－２と同様の方法でｐＣＭＡ－Ｇ４Ｐｒｏを構築した。
６）－３－３ ＡＴ０１ヒト化重鎖発現ベクターの構築
６）－３－３－１ ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ発現ベクターの構築
配列番号４６に示すｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡのヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６番目乃至４２２番目に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐＣＭＡ－Ｇ１ＬＡＬＡを制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に合成したＤＮＡ断片を挿入することによりｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ発現ベクターを構築した。
６)－３－３－２ ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ発現ベクターの構築
配列番号６８に示すｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡのヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６番目乃至４２２番目に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例６）－３－３－１と同様の方法でｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ発現ベクターを構築した。
６)－３－３－３ ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ発現ベクターの構築
配列番号６９に示すｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏのヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６番目乃至４２２番目に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐＣＭＡ－Ｇ４Ｐｒｏを制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に合成したＤＮＡ断片を挿入することによりｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ発現ベクターを構築した。
６）－３－４ ＡＴ０１ヒト化軽鎖発現ベクターの構築
６）－３－４－１ ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１発現ベクターの構築
配列番号７０に示すｈｕＡＴ０１＿Ｌ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７番目乃至３９９番目に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所に合成したＤＮＡ断片を挿入することによりｈｕＡＴ０１＿Ｌ１発現ベクターを構築した。
６）－３－４－２ ｈｕＡＴ０１＿Ｌ２発現ベクターの構築
配列番号７１に示すｈｕＡＴ０１＿Ｌ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７番
目乃至３９９番目に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、実施例６）－３－４－１と同様の方法でｈｕＡＴ０１＿Ｌ１発現ベクターを構築した。
６）－３－５ ＮＢ７ヒト化重鎖発現ベクターの構築
６）－３－５－１ ｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ発現ベクターの構築
配列番号７２に示すｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡのヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６番目乃至４４０番目に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例６）－３－３－１と同様の方法でｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ発現ベクターを構築した。
６）－３－５－２ ｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ発現ベクターの構築
配列番号７３に示すｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏのヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６番目乃至４４０番目に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例６）－３－３－３と同様の方法でｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ発現ベクターを構築した。
６）－３－６ ＮＢ７ヒト化軽鎖発現ベクターの構築
６）－３－６－１ ｈｕＮＢ７＿Ｌ３発現ベクターの構築
配列番号７４に示すｈｕＮＢ７＿Ｌ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７番目乃至３９９番目に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、実施例６）－３－４－１と同様の方法でｈｕＮＢ７＿Ｌ３発現ベクターを構築した。
６）－３－７ ヒト化抗体の調製
６）－３－７－１ ヒト化抗体の製造
実施例６）－２で設計した重鎖と軽鎖の組み合わせにより、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ、ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、及びｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏについて、実施例６）－３－１から６）－３－６で構築した各発現ベクターを用いて、実施例４）－２と同様の方法で各ヒト化抗体を製造した。
６）－３－７－２ ヒト化抗体の精製
実施例６）－３－７－１で得られた培養上清をｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーとセラミックハイドロキシアパタイトの２段階工程で精製した。
培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅが充填されたカラム（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライした後に、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍ アルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で抗体を溶出した。
抗体の含まれる画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳへのバッファー置換を行い、５ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＭＥＳ／ｐＨ７．０のバッファーで５倍希釈した後に、５ｍＭ ＮａＰｉ／５０ｍＭ ＭＥＳ／３０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．０のバッファーで平衡化したセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ Ｔｙｐｅ―１ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。
塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％
ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）にて抗体を濃縮し、ＩｇＧ濃度を５０ｍｇ／ｍＬに調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
［実施例７］ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
７）－１ ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体のサイトカイン産生抑制作用
ヒトＰＢＭＣはＣｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から凍結品として購入し、指示書に従って解凍して使用した。
１０％ ＦＢＳ、１ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ社）、０．１ ｍＭ ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、５０ μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、５０ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０ μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で２．５ｘ１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製したＰＢＭＣを９６－ｗｅｌｌｓ細胞培養プレートに１００ μＬずつ播種し、ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体であるｈｕＡＴ０１＿Ｈ１Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ、ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ又はヒトＩｇＧコントロール抗体（ＥＵＲＥＫＡ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）を８０μＬ／ｗ
ｅｌｌ添加して３７℃インキュベーター内で４時間前処置した。
その後、１ ｍｇ／ｍＬ ＣＬ－２６４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を２０ μＬ／ｗｅｌｌ添加し、よく攪拌した後、約２０時間３７℃、５％ ＣＯ2下で培養した。
プレートをよく攪拌した後、１５００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清に含まれるＩＬ－６濃度をＦＲＥＴ法（Ｃｉｓｂｉｏ社）で測定した 。
図２３はヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体がＣＬ－２６４を処理したヒトＰＢＭＣからのＩＬ－６の産生を添加濃度依存的に抑制することを示す。
ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ、ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ４ＰｒｏはヒトＰＢＭＣからのＩＬ－６の産生を添加濃度依存的に阻害した。
ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ４Ｐｒｏ、ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｈｕＮＢ７＿Ｈ３Ｌ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏの半数阻害濃度（ＩＣ50）は５０％阻害活性を挟んだ二点間の濃度と、その濃度を添加した際の阻害活性から算出し、各々７４ ｎｇ／ｍＬ、１３８ ｎｇ／ｍＬ、３８ ｎｇ／ｍＬ、２４ ｎｇ／ｍＬ、３０７ ｎｇ／ｍＬ、３１ ｎｇ／ｍＬであった。
［実施例８］ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体の抗原結合確認
８）－１ ヒトＴＬＲ７（バリアント１）－Ｆｌａｇ強制発現ＨＥＫ２９３細胞の調製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ(登録商標) ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を４．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋの濃度で７５ｃｍ２ｆｌａｓｋ（住友ベークライト社製）に播種し、１０％ＦＢＳ及び５０ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０ μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を含むＤＭＥＭ培地（富士フィルム和光純薬社製）中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。
翌日、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社で作製したｐｃＤＮＡ３．１－ヒトＴＬＲ７（バリアント１）－Ｆｌａｇ発現プラスミドをＬｅｎｔｉ－Ｘ(登録商標) ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に、トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(登
録商標) ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、遺伝子導入
し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。
翌日、発現プラスミド導入細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で処理し、処理後の細胞をＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で洗浄した後、
Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
ｐｃＤＮＡ３．１－ヒトＴＬＲ７（バリアント１）－Ｆｌａｇ発現プラスミド導入細胞にヒトＴＬＲ７が発現していることを抗Ｆｌａｇ－ＰＥ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）又はネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いてフローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社）で検出することにより確認した。
ヒトＴＬＲ７（バリアント１）のアミノ酸配列及びそれをコードするポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列表の配列番号２および１に記載されている。
８）－２ ヒトＴＬＲ７（バリアント２）－Ｆｌａｇ強制発現ＨＥＫ２９３細胞の調製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ(登録商標) ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を４．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋの濃度で７５ｃｍ２ｆｌａｓｋ（住友ベークライト社製）に播種し、１０％ＦＢＳ及び５０ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０ μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を含むＤＭＥＭ培地（富士フィルム和光純薬社製）中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。
翌日、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社で作製したｐｃＤＮＡ３．１－ヒトＴＬＲ７（バリアント２）－Ｆｌａｇ発現プラスミドをＬｅｎｔｉ－Ｘ(登録商標) ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に、トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(登
録商標) ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、遺伝子導入
し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。
翌日、発現ベクター導入細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で処理し、処理後の細胞をＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で洗浄した後、Ｆ
ｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
ｐｃＤＮＡ３．１－ヒトＴＬＲ７（バリアント２）－Ｆｌａｇ発現プラスミド導入細胞にヒトＴＬＲ７が発現していることを抗Ｆｌａｇ－ＰＥ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）又はネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いてフローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社）で検出することにより確認した。
８）－３ サルＴＬＲ７－Ｆｌａｇ強制発現ＨＥＫ２９３細胞の調製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ(登録商標) ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を４．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋの濃度で７５ｃｍ２ｆｌａｓｋ（住友ベークライト社製）に播種し、１０％ＦＢＳ及び５０ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０ μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を含むＤＭＥＭ培地（富士フィルム和光純薬社製）中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。
翌日、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社で作製したｐｃＤＮＡ３．１－サルＴＬＲ７－Ｆｌａｇ発現プラスミドをＬｅｎｔｉ－Ｘ(登録商標) ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に、トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(登録商標) ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、遺伝子導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。
翌日、発現ベクター導入細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で処理し、処理後の細胞をＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で洗浄した後、Ｆ
ｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
ｐｃＤＮＡ３．１－サルＴＬＲ７－Ｆｌａｇ発現プラスミド導入細胞にサルＴＬＲ７が発現していることを抗Ｆｌａｇ－ＰＥ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）又はネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いてフローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社）で検出することにより確認した。
８）－４ マウスＴＬＲ７－Ｆｌａｇ強制発現ＨＥＫ２９３細胞の調製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ(登録商標) ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を４．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋの濃度で７５ｃｍ２ｆｌａｓｋ（住友ベークライト社製）に播種し、１０％ＦＢＳ及び５０ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０ μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を含むＤＭＥＭ培地（富士フィルム和光純薬社製）中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。
翌日、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社で作製したｐｃＤＮＡ３．１－マウスＴＬＲ７－Ｆｌａｇ発現プラスミドをＬｅｎｔｉ－Ｘ(登録商標) ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に、トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(登録商標) ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、遺伝子導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。
翌日、発現ベクター導入細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で処理し、処理後の細胞をＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で洗浄した後、Ｆ
ｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
ｐｃＤＮＡ３．１－マウスＴＬＲ７－Ｆｌａｇ発現プラスミド導入細胞にマウスＴＬＲ７が発現していることを抗Ｆｌａｇ－ＰＥ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）又はネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いてフローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社）で検出することにより確認した。
８）－５ ラットＴＬＲ７－Ｆｌａｇ強制発現ＨＥＫ２９３細胞の調製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ(登録商標) ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を４．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋの濃度で７５ｃｍ２ｆｌａｓｋ（住友ベークライト社製）に播種し、１０％ＦＢＳ及び５０ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０ μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を含むＤＭＥＭ培地（富士フィルム和光純薬社製）中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。
翌日、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社で作製したｐｃＤＮＡ３．１－ラットＴＬＲ７－Ｆｌａｇ発現プラスミドをＬｅｎｔｉ－Ｘ(登録商標) ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に、トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(登録商標) ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、遺伝子導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。
翌日、発現ベクター導入細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で処理し、処理後の細胞をＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で洗浄した後、Ｆ
ｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
ｐｃＤＮＡ３．１－ラットＴＬＲ７－Ｆｌａｇ発現プラスミド導入細胞にラットＴＬＲ７が発現していることを抗Ｆｌａｇ－ＰＥ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）又はネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いてフローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社）で検出することにより確認した。
８）－６ フローサイトメトリーによるヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体の結合選択能評価
８）－１で調製したヒトＴＬＲ７（バリアント１）－Ｆｌａｇ強制発現ＨＥＫ２９３細胞、８）－２で調製したヒトＴＬＲ７（バリアント２）－Ｆｌａｇ強制発現ＨＥＫ２９３細胞、８）－３で調製したサルＴＬＲ７－Ｆｌａｇ強制発現ＨＥＫ２９３細胞、８）－４で調製したマウスＴＬＲ７－Ｆｌａｇ強制発現ＨＥＫ２９３細胞、及び８）－５で調製したラットＴＬＲ７－Ｆｌａｇ強制発現ＨＥＫ２９３細胞を、Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ベクトン・ディッキンソン社製）で固定／細胞膜透過処理を行った後、ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体の一つであるｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ及び二次抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商
標) ６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＋ ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社製）を用いて染色した。
ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体のヒトＴＬＲ７に対する結合は、フローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社）で検出し、フローサイトメトリーのデータを解析するソフトウェ
アであるＦｌｏｗｊｏを用いてデータを解析した。
その結果、ヒト化抗ヒトＴＬＲ７抗体の一つであるｈｕＡＴ０１＿Ｈ３Ｌ２＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡは、ヒトＴＬＲ７（バリアント１）、ヒトＴＬＲ７（バリアント２）、又はサルＴＬＲ７に特異的に結合し、マウスＴＬＲ７又はラットＴＬＲ７に結合しなかった。結果を図２５～２９に示す。
本発明のヒト化抗ＴＬＲ７抗体は、ヒトＴＬＲ７機能阻害活性抑制作用を有しており、免疫炎症関連疾患等の治療又は予防剤となり得る。
配列番号１：ヒトＴＬＲ７（バリアント１）をコードするヌクレオチド配列
配列番号２：ヒトＴＬＲ７（バリアント１）のアミノ酸配列
配列番号３：ヒトＴＬＲ７（バリアント２）をコードするヌクレオチド配列
配列番号４：ヒトＴＬＲ７（バリアント２）のアミノ酸配列
配列番号５：ＡＴ０１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号６：ｃＡＴ０１抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号７：ＮＢ７抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８：ｃＮＢ７抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号９：ＦＡＮ２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０：ｃＦＡＮ２抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号１１：ＡＴ０１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１２：ｃＡＴ０１抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号１３：ＮＢ７抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１４：ｃＮＢ７抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号１５：ＦＡＮ２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１６：ｃＦＡＮ２抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号１７：ＡＴ０１抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号１８：ＡＴ０１抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号１９：ＡＴ０１抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号２０：ＡＴ０１抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号２１：ＡＴ０１抗体のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号２２：ＡＴ０１抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号２３：ＮＢ７抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号２４：ＮＢ７抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号２５：ＮＢ７抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号２６：ＮＢ７抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号２７：ＮＢ７抗体のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号２８：ＮＢ７抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号２９：ＦＡＮ２抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号３０：ＦＡＮ２抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号３１：ＦＡＮ２抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号３２：ＦＡＮ２抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号３３：ＦＡＮ２抗体のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号３４：ＦＡＮ２抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号３５：ＡＴ０１キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｃＡＴ０１）の重鎖のアミノ酸配列
配列番号３６：ＡＴ０１キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｃＡＴ０１）の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３７：ＮＢ７キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｃＮＢ７）の重鎖のアミノ酸配列
配列番号３８：ＮＢ７キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｃＮＢ７）の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３９：ＦＡＮ２キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｃＦＡＮ２）の重鎖のアミノ酸配列
配列番号４０：ＦＡＮ２キメラ化抗ヒトＴＬＲ７抗体（ｃＦＡＮ２）の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号４１：ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡの重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４２：ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡの重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４３：ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４４：ｈｕＡＴ０１＿Ｌ２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４５：ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡのアミノ酸配列
配列番号４６：ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡのアミノ酸配列
配列番号４７：ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏのアミノ酸配列
配列番号４８：ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号４９：ｈｕＡＴ０１＿Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号５０：ｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡの重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号５１：ｈｕＮＢ７＿Ｌ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号５２：ｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡのアミノ酸配列
配列番号５３：ｈｕＮＢ７＿Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号５４：ｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏのアミノ酸配列
配列番号５５：ヒトＵｎｃ９３Ｂ１遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号５６：マウスＴＬＲ７遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号５７：ラットＴＬＲ７遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号５８：サルＴＬＲ７遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号５９：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトカッパ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号６０：ヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号６１：ｃＡＴ０１抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号６２：ｃＡＴ０１抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号６３：ｃＮＢ７抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号６４：ｃＮＢ７抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号６５：ｃＦＡＮ２抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号６６：ｃＦＡＮ２抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号６７：ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡをコードするヌクレオチド配列
配列番号６８：ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡをコードするヌクレオチド配列
配列番号６９：ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏをコードするヌクレオチド配列
配列番号７０：ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１をコードするヌクレオチド配列
配列番号７１：ｈｕＡＴ０１＿Ｌ２をコードするヌクレオチド配列
配列番号７２：ｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡをコードするヌクレオチド配列
配列番号７３：ｈｕＮＢ７＿Ｈ３＿ＩｇＧ４Ｐｒｏをコードするヌクレオチド配列
配列番号７４：ｈｕＮＢ７＿Ｌ３をコードするヌクレオチド配列
配列番号７５：ヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１ＬＡＬＡ定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号７６：ヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ４Ｐｒｏ定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号７７：ｈｕＡＴ０１＿Ｈ１の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号７８：ｈｕＡＴ０１＿Ｈ３の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号７９：ｈｕＡＴ０１＿Ｌ１の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号８０：ｈｕＡＴ０１＿Ｌ２の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号８１：ｈｕＮＢ７＿Ｈ３の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号８２：ｈｕＮＢ７＿Ｌ３の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号８３：マウスＴＬＲ７のアミノ酸配列
配列番号８４：ラットＴＬＲ７のアミノ酸配列
配列番号８５：サルＴＬＲ７のアミノ酸配列
配列番号８６：ヒトＵｎｃ９３Ｂ１ Ｄ３４Ａ ｍｕｔａｎｔ－ＨＡ×２遺伝子のヌクレオチド配列

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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