JP2023549851A - 葉酸受容体アルファに結合する重鎖抗体 - Google Patents

Abstract

抗葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）重鎖抗体（例えばＵｎｉＡｂｓ（商標））が、このような抗体を作製する方法、このような抗体を含む医薬組成物を含む組成物、及び葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）の発現を特徴とする障害を処置するためのそれらの使用とともに開示される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／１１５，４３６号明細書の出願日の優先権の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１１月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、名称が６０７９２＿０００４３ＷＯ０１＿（ＴＮＯ－００２６－ＷＯ）＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが１５２，１３０バイトである。

本発明は、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）に結合するヒト重鎖抗体（例えばＵｎｉＡｂｓ（商標））に関する。本発明はさらに、そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む医薬組成物を含む組成物及びＦＯＬＲ１の発現を特徴とする障害を処置するためのそれらの使用に関する。

葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）
ＦＲα（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１５３２８；ＨＧＮＣ ＩＤ ３７９１）としても知られるＦＯＬＲ１は、葉酸及び還元葉酸誘導体に結合し、５－メチルテトラヒドロ葉酸の細胞内送達に介在する、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合膜タンパク質である。ＦＯＬＲ１は、中性のｐＨで葉酸への親和性が高い２１０アミノ酸の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有する。内部移行時に、酸性ｐＨによって、ＦＯＬＲ１が立体構造の変化を受け、これにより葉酸に対するＦＯＬＲ１の親和性が低下し、葉酸の放出を媒介し、続いて細胞表面へのＦＯＬＲ１のリサイクルが起こる。Ｗｉｂｏｗｏ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１３ Ｓｅｐ １７；１１０（３８）：１５１８０－８。ＦＯＬＲ１は、卵巣癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、結直腸癌及び脳癌を含む多くの固形腫瘍タイプで過剰発現され、また腎臓、肺、網膜及び脳などの正常で健康な組織でのＦＯＬＲ１発現は、上皮の頂端膜側に限定され、それにより循環中のＦＯＬＲ１を標的とする物質へのそれらの曝露が減少し、ＦＯＬＲ１が魅力的な治療標的になる。Ｃｈｅｕｎｇ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ａｕｇ ９；７（３２）：５２５５３－５２５７４。ＦＯＬＲ１はまた、ＦＯＬＲ１陽性腫瘍のイメージング及び診断にも適切であり得、さらに、可溶性ＦＯＬＲ１は、卵巣癌がある患者において増加することが報告されている。Ｋｕｒｏｓａｋｉ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１６ Ａｐｒ １５；１３８（８）：１９９４－２００２。ＦＯＬＲ１に特異的ないくつかのモノクローナル抗体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）及び葉酸薬物複合体が記載されている。Ｃｈｅｕｎｇ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ａｕｇ ９；７（３２）：５２５５３－５２５７４。さらに、抗ＦＯＬＲ１キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、卵巣癌の処置について治験中である。Ｋｅｒｓｈａｗ ＭＨ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ｏｃｔ；１２：６１０６－１５；Ｓｏｎｇ ＤＧ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ｊｕｌ １；７１（１３）：４６１７－２７。

重鎖抗体
従来のＩｇＧ抗体では、重鎖と軽鎖との会合は、一部には、軽鎖定常領域と重鎖のＣＨ１定常ドメインとの間の疎水性相互作用に起因する。重鎖のフレームワーク２（ＦＲ２）及びフレームワーク４（ＦＲ４）の領域には、この重鎖と軽鎖との間の疎水性相互作用にも寄与するさらなる残基が存在する。

しかしながら、ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダ及びラマを含むタイロポダ（Ｔｙｌｏｐｏｄａ）亜目）の血清には、対になったＨ鎖のみから構成される主要なタイプの抗体（重鎖抗体又はＵｎｉＡｂ（商標））が含有されることが知られている。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）（キャメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、キャメルス・バクトリアヌス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）、ラマ・グラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、ラマ・グアナコ（Ｌａｍａ ｇｕａｎａｃｏ）、ラマ・アルパカ（Ｌａｍａ ａｌｐａｃａ）及びラマ・ビクーニャ（Ｌａｍａ ｖｉｃｕｇｎａ））のＵｎｉＡｂ（商標）は、単一可変ドメイン（ＶＨＨ）、ヒンジ領域及び古典的な抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと相同性の高い２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる独特の構造を有する。これらのＵｎｉＡｂ（商標）は、ゲノム中に存在するが、ｍＲＮＡプロセシング中にスプライスアウトされる定常領域の第１のドメイン（ＣＨ１）を欠いている。ＣＨ１ドメインの非存在は、このドメインが軽鎖の定常ドメインのアンカー位置であるため、ＵｎｉＡｂ（商標）における軽鎖の非存在を説明する。このようなＵｎｉＡｂ（商標）は、従来の抗体又はその断片からの３つのＣＤＲによる抗原結合特異性及び高親和性を付与するように自然に進化した（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１；Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７４：２７７－３０２；Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：１１１－１２４）。サメなどの軟骨魚類も、軽鎖ポリペプチドを欠き、完全に重鎖によって構成される、ＩｇＮＡＲと称される特有のタイプの免疫グロブリンを進化させた。ＩｇＮＡＲ分子は、分子工学によって操作して、単一重鎖ポリペプチドの可変ドメイン（ｖＮＡＲ）を作製し得る（Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４（２００３）；Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７－１９７（２００４）；Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５－３３（２００３））。

軽鎖を欠く重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が抗原に結合する能力は、１９６０年代に確立された（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５－４１９５）。軽鎖から物理的に分離された重鎖免疫グロブリンは、四量体抗体の８０％の抗原結合活性を保持した。Ｓｉｔｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１－７９０は、再編成されたマウスμ遺伝子からのＣＨ１ドメインの除去が、哺乳動物細胞培養において、軽鎖を欠く重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の産生をもたらすことを示した。産生された抗体は、ＶＨ結合特異性及びエフェクター機能を保持した。

高い特異性及び親和性を有する重鎖抗体は、免疫付与を通じて様々な抗原に対して生成され得（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７－４６（１９９９））、ＶＨＨ部分を容易にクローニングし、酵母で発現させ得る（Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１－２１（２０００））。それらの発現、溶解性及び安定性のレベルは、古典的なＦ（ａｂ）断片又はＦｖ断片より顕著に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ Ａ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，５２１－５２６（１９９７））。

λ（ラムダ）軽鎖（Ｌ）遺伝子座及び／又はλ及びκ（カッパ）Ｌ鎖遺伝子座が機能的にサイレンシングされたマウス及びそのようなマウスによって産生される抗体は、米国特許第７，５４１，５１３号明細書及び同第８，３６７，８８８号明細書に記載されている。マウス及びラットにおける重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の組み換え産生は、例えば、国際公開第２００６００８５４８号パンフレット、米国特許出願公開第２０１００１２２３５８号明細書、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３－１０１；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７－９０；及びＺｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；２０４（１３）：３２７１－３２８３において報告されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼの胚マイクロインジェクションによるノックアウトラットの作製は、Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３に記載されている。このような抗体を産生する異種重鎖遺伝子座を含む可溶性重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）及びトランスジェニック齧歯類は、米国特許第８，８８３，１５０号明細書及び同第９，３６５，６５５号明細書に記載されている。結合（標的化）ドメインとして単一ドメイン抗体を含むＣＡＲ－Ｔ構造は、例えば、Ｉｒｉ－Ｓｏｆｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１７：２６３０－２６４１及びＪａｍｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８４０：３７８－３８６に記載されている。

米国特許第７，５４１，５１３号明細書 米国特許第８，３６７，８８８号明細書 国際公開第２００６００８５４８号パンフレット 米国特許出願公開第２０１００１２２３５８号明細書 米国特許第８，８８３，１５０号明細書 米国特許第９，３６５，６５５号明細書

Ｗｉｂｏｗｏ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ １７；１１０（３８）：１５１８０－８ Ｃｈｅｕｎｇ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ａｕｇ ９；７（３２）：５２５５３－５２５７４ Ｋｕｒｏｓａｋｉ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１６ Ａｐｒ １５；１３８（８）：１９９４－２００２ Ｋｅｒｓｈａｗ ＭＨ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ｏｃｔ；１２：６１０６－１５ Ｓｏｎｇ ＤＧ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ｊｕｌ １；７１（１３）：４６１７－２７ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１；Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７４：２７７－３０２ Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：１１１－１２４ Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４（２００３） Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７－１９７（２００４） Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５－３３（２００３） Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５－４１９５ Ｓｉｔｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１－７９０ ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７－４６（１９９９） Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１－２１（２０００） Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，５２１－５２６（１９９７） Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３－１０１ Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７－９０； Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；２０４（１３）：３２７１－３２８３ Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３ Ｉｒｉ－Ｓｏｆｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１７：２６３０－２６４１ Ｊａｍｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８４０：３７８－３８６

本発明の態様は、ＦＯＬＲ１に対する結合親和性があるＵｎｉＡｂｓ（商標）を含むが限定されない重鎖抗体に関する。本発明のさらなる態様は、そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む組成物及びＦＯＬＲ１の発現を特徴とする障害の処置におけるそれらの使用に関する。

本発明の態様は、（ａ）配列番号１～５のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ１；及び／又は（ｂ）配列番号６～１７のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ２；及び／又は（ｃ）配列番号１８～２２のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ３を含む、第１の重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体を含む。

いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１～５のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ１；及び／又は（ｂ）配列番号６～１７のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ２；及び／又は（ｃ）配列番号１８～２２のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ３を含む、第２の重鎖可変領域をさらに含む。

いくつかの実施形態では、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、ヒトフレームワークに存在する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＨ１配列の非存在下で重鎖定常領域配列をさらに含む。

いくつかの実施形態では、第１の重鎖可変領域は、（ａ）配列番号１～５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列；及び／又は（ｂ）配列番号６～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列；及び／又は（ｃ）配列番号１８～２２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２の重鎖可変領域は、（ａ）配列番号１～５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列；及び／又は（ｂ）配列番号６～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列；及び／又は（ｃ）配列番号１８～２２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１の重鎖可変領域は、（ａ）配列番号１～５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列；及び（ｂ）配列番号６～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列；及び（ｃ）配列番号１８～２２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２の重鎖可変領域は、（ａ）配列番号１～５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列；及び（ｂ）配列番号６～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列；及び（ｃ）配列番号１８～２２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列及び配列番号１９のＣＤＲ３配列；又は（ｂ）配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１６のＣＤＲ２配列及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２３～７４の配列の何れか１つに対する少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２３～７４からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域配列は、配列番号２６、配列番号４９、配列番号６１及び配列番号７２からなる群から選択される。

本発明の態様は、１価又は２価形式の、（ａ）式：Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｘ２ Ｓ Ｘ３ Ｘ４（配列番号７５）（式中、Ｘ１は、Ｎ、Ｔ、Ｉ又はＳであり；Ｘ２は、Ｒ又はＳであり；Ｘ３は、Ｆ又はＹであり；及びＸ４は、Ｇ、Ｓ又はＴである）のＣＤＲ１配列；及び（ｂ）式：Ｉ Ｓ Ｓ Ｘ１ Ｓ Ｘ２ Ｘ３ Ｉ（配列番号７６）（式中、Ｘ１は、Ｇ又はＳであり；Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；Ｘ３は、Ｙ、Ｄ、Ｔ又はＳである）のＣＤＲ２配列；及び（ｃ）式：Ａ Ｒ Ｄ Ｖ Ｔ Ｓ Ｇ Ｉ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｘ１ Ａ Ｆ Ｎ Ｉ（配列番号７７）（式中、Ｘ１は、Ａ又はＳである）のＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体を含む。

本発明の態様は、１価又は２価形式の、（ａ）式：Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｓ Ｓ Ｙ Ｓ（配列番号７８）（式中、Ｘ１は、Ｓ又はＴである）のＣＤＲ１配列、（ｂ）式：Ｉ Ｘ１ Ｘ２ Ｓ Ｓ Ｘ３ Ｘ４ Ｉ（配列番号７９）（式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｔ又はＤであり；Ｘ２は、Ｓ、Ｒ又はＧであり；Ｘ３は、Ｄ又はＳであり；Ｘ４は、Ｔ又はＩである）のＣＤＲ２配列及び（ｃ）式：Ａ Ｘ１ Ｖ Ｇ Ｌ Ｘ２ Ｆ Ｄ Ｙ（配列番号８０）（式中、Ｘ１は、Ｓ又はＴであり；Ｘ２は、Ｄ又はＥである）のＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体を含む。

本発明の態様は、（ａ）式：Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｘ２ Ｓ Ｘ３ Ｘ４（配列番号７５）（式中、Ｘ１は、Ｎ、Ｔ、Ｉ又はＳであり；Ｘ２は、Ｒ又はＳであり；Ｘ３は、Ｆ又はＹであり；Ｘ４は、Ｇ、Ｓ又はＴである）のＣＤＲ１配列；及び（ｂ）式：Ｉ Ｓ Ｓ Ｘ１ Ｓ Ｘ２ Ｘ３ Ｉ（配列番号７６）（式中、Ｘ１は、Ｇ又はＳであり；Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；Ｘ３は、Ｙ、Ｄ、Ｔ又はＳである）のＣＤＲ２配列；及び（ｃ）式：Ａ Ｒ Ｄ Ｖ Ｔ Ｓ Ｇ Ｉ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｘ１ Ａ Ｆ Ｎ Ｉ（配列番号７７）（式中、Ｘ１は、Ａ又はＳである）のＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と；（ａ）式：Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｓ Ｓ Ｙ Ｓ（配列番号７８）（式中、Ｘ１は、Ｓ又はＴである）のＣＤＲ１配列；及び（ｂ）式：Ｉ Ｘ１ Ｘ２ Ｓ Ｓ Ｘ３ Ｘ４ Ｉ（配列番号７９）（式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｔ又はＤであり；Ｘ２は、Ｓ、Ｒ又はＧであり；Ｘ３は、Ｄ又はＳであり；Ｘ４は、Ｔ又はＩである）のＣＤＲ２配列；及び（ｃ）式：Ａ Ｘ１ Ｖ Ｇ Ｌ Ｘ２ Ｆ Ｄ Ｙ（配列番号８０）（式中、Ｘ１は、Ｓ又はＴであり；Ｘ２は、Ｄ又はＥである）のＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、を含むＦＯＬＲ１に結合する抗体を含む。

いくつかの実施形態では、第１の重鎖可変領域は、第２の重鎖可変領域と比較してＮ末端に対してより近くに置かれる。いくつかの実施形態では、第１の重鎖可変領域は、第２の重鎖可変領域と比較してＣ末端に対してより近くに置かれる。

本発明の態様は、ヒトＶＨフレームワークにおいてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体を含み、ここで、ＣＤＲ配列は、配列番号１～２２からなる群から選択されるＣＤＲ配列において２つ以下の置換を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＶＨフレームワークにおいてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、ここでＣＤＲ配列は、配列番号１～２２からなる群から選択される。

本発明の態様は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列と、配列番号６のＣＤＲ２配列と、配列番号１９のＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体を含む。

本発明の態様は、１価又は２価配置の、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列と、配列番号６のＣＤＲ２配列と、配列番号１９のＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体を含む。

本発明の態様は、ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号４のＣＤＲ１配列と、配列番号１６のＣＤＲ２配列と、配列番号２０のＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体を含む。

本発明の態様は、１価又は２価配置の、ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号４のＣＤＲ１配列と、配列番号１６のＣＤＲ２配列と、配列番号２０のＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体を含む。

本発明の態様は、ヒト（ｈｕｍｎ）ＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列及び配列番号１９のＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と；ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１６のＣＤＲ２配列及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、を含むＦＯＬＲ１に結合する抗体を含む。

いくつかの実施形態では、第１の重鎖可変領域は、第２の重鎖可変領域と比較してＮ末端に対してより近くに置かれる。いくつかの実施形態では、第１の重鎖可変領域は、第２の重鎖可変領域と比較してＣ末端に対してより近くに置かれる。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体は、多特異性である。いくつかの実施形態では、抗体は、二特異性である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ３タンパク質及びＦＯＬＲ１タンパク質に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、同じＦＯＬＲ１タンパク質上の２つの異なるエピトープに対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、エフェクター細胞に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ細胞抗原に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ３に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＡＲ－Ｔ方式である。

本発明の態様は、（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号８３のＣＤＲ１配列、配列番号８４のＣＤＲ２配列及び配列番号８５のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する重鎖可変領域と；（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて配列番号８６のＣＤＲ１配列、配列番号８７のＣＤＲ２配列及び配列番号８８のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域と；（ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列及び配列番号１９のＣＤＲ３配列を含む、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインと、を含む二特異性抗体を含む。

本発明の態様は、（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号８３のＣＤＲ１配列、配列番号８４のＣＤＲ２配列及び配列番号８５のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する重鎖可変領域と；（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて配列番号８６のＣＤＲ１配列、配列番号８７のＣＤＲ２配列及び配列番号８８のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域と；（ｉｉｉ）１価又は２価配置の、ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列及び配列番号１９のＣＤＲ３配列を含む、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインと、を含む二特異性抗体を含む。

本発明の態様は、（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号８３のＣＤＲ１配列、配列番号８４のＣＤＲ２配列及び配列番号８５のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する重鎖可変領域と；（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて配列番号８６のＣＤＲ１配列、配列番号８７のＣＤＲ２配列及び配列番号８８のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域と；（ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１６のＣＤＲ２配列及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインと、を含む二特異性抗体を含む。

本発明の態様は、（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号８３のＣＤＲ１配列、配列番号８４のＣＤＲ２配列及び配列番号８５のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する重鎖可変領域と；（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて配列番号８６のＣＤＲ１配列、配列番号８７のＣＤＲ２配列及び配列番号８８のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域と；（ｉｉｉ）１価又は２価配置の、ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１６のＣＤＲ２配列及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインと、を含む二特異性抗体を含む。

本発明の態様は、（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号８３のＣＤＲ１配列、配列番号８４のＣＤＲ２配列及び配列番号８５のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する重鎖可変領域と；（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて配列番号８６のＣＤＲ１配列、配列番号８７のＣＤＲ２配列及び配列番号８８のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域と；（ｉｉｉ）抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインと、を含む多特異性抗体を含み、ここでこの抗原結合ドメインは、２価配置で第１及び第２の抗原結合領域を含み、この第１の抗原結合領域は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列と、配列番号６のＣＤＲ２配列と、配列番号１９のＣＤＲ３配列と、を含み、；第２の抗原結合領域は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号４のＣＤＲ１配列と、配列番号１６のＣＤＲ２配列と、配列番号２０のＣＤＲ３配列と、を含む。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、第２の抗原結合領域と比較してＮ末端に対してより近くに置かれる。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、第２の抗原結合領域と比較してＣ末端に対してより近くに置かれる。いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインの第１及び第２の抗原結合領域は、ポリペプチドリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーはＧＳリンカーである。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、配列番号８１又は配列番号８２の配列からなる。

本発明の態様は、本明細書中に記載のような抗体を含む医薬組成物を含む。

本発明の態様は、ＦＯＬＲ１の発現を特徴とする障害の処置のための方法を含み、前記障害を有する対象に、本明細書中に記載のような抗体又は医薬組成物を投与することを含む。

本発明の態様は、ＦＯＬＲ１の発現を特徴とする障害の処置用の薬物の調製における、本明細書中に記載のような抗体の使用を含む。

本発明の態様は、ＦＯＬＲ１の発現を特徴とする障害の処置での使用のための本明細書中に記載のような抗体を含む。

いくつかの実施形態では、障害は、卵巣癌、子宮癌、肺癌、腎臓癌、結直腸癌、乳癌及び脳癌からなる群から選択される。

本発明の態様は、本明細書中に記載のような抗体をコードするポリヌクレオチド、このようなポリペプチドを含むベクター及びこのようなベクターを含む細胞を含む。

本発明の態様は、本明細書中に記載のような細胞を、抗体の発現を許容する条件下で増殖させることと、細胞から抗体を単離することと、を含む、本明細書中に記載のような抗体を作製する方法を含む。

本発明の態様は、ＵｎｉＲａｔ動物にＦＯＬＲ１タンパク質で免疫付与することと、ＦＯＬＲ１結合抗体配列を同定することと、を含む、本明細書中に記載のような抗体を作製する方法を含む。

本発明の態様は、必要とする個体に、本明細書中に記載のような抗体又は本明細書中に記載のような医薬組成物の有効用量を投与することを含む、処置の方法を含む。

これらの態様及びさらなる態様は、実施例を含む本開示の残りの部分でさらに説明される。

パネルＡ～Ｅは、ＦＯＬＲ１陽性細胞株への抗ＦＯＬＲ１ ＨＣＡｂ結合からの結果を示す一連のグラフを提供する。 パネルＡ～Ｂは、ＦＯＬＲ２及びＩＺＵＭＯ１Ｒ陽性細胞株への抗ＦＯＬＲ１ ＨＣＡｂ結合からの結果を示す一連のグラフを提供する。 パネルＡ～Ｃは、休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた１価二特異性抗体が介在するＳＫＯＶ－３ヒト腫瘍細胞の死滅からの結果を示す一連のグラフを提供する。パネルＡは、特異的な腫瘍細胞溶解のレベルを示し、パネルＢはＩＬ－２放出を示し、パネルＣはＩＦＮγ放出を示す。パネルＤは、１価二特異性抗体の例示である。 パネルＡ～Ｃは、休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた１価二特異性抗体が介在するＳＫＯＶ－３ヒト腫瘍細胞の死滅からの結果を示す一連のグラフを提供する。パネルＡは、特異的な腫瘍細胞溶解のレベルを示し、パネルＢは、ＩＬ－２放出を示し、パネルＣは、ＩＦＮγ放出を示す。パネルＤは、１価二特異性抗体の例示である。 パネルＡ～Ｃは、休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた２価二特異性抗体が介在するＳＫＯＶ－３ヒト腫瘍細胞の死滅からの結果を示す一連のグラフを提供する。パネルＡは、特異的な腫瘍細胞溶解のレベルを示し、パネルＢは、ＩＬ－２放出を示し、パネルＣは、ＩＦＮγ放出を示す。パネルＤは、２価二特異性抗体の例示である。 パネルＡ～Ｃは、休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた２価二特異性抗体が介在するＳＫＯＶ－３ヒト腫瘍細胞の死滅からの結果を示す一連のグラフを提供する。パネルＡは、特異的な腫瘍細胞溶解のレベルを示し、パネルＢは、ＩＬ－２放出を示し、パネルＣは、ＩＦＮγ放出を示す。パネルＤは、２価二特異性抗体の例示である。 パネルＡ～Ｃは、休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた２価二特異性抗体が介在するＨＴ－２９ヒト腫瘍細胞の死滅からの結果を示す一連のグラフを提供する。パネルＡは、特異的な腫瘍細胞溶解のレベルを示し、パネルＢは、ＩＬ－２放出を示し、パネルＣは、ＩＦＮγ放出を示す。パネルＤは、２価二特異性抗体の例示である。 パネルＡは、様々なエフェクターと標的との比率での、休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた２価二特異性抗体が介在するＳＫＯＶ－３ヒト腫瘍細胞の死滅からの結果を示すグラフである。パネルＢは、２価二特異性抗体の例示である。 単回投与マウス薬物動態試験の結果を示すグラフである。 パネルＡは、ヒト化ＩＧＲＯＶ－１細胞を利用するマウス異種移植モデルを示す模式図である。パネルＢは、指示される２価二特異性抗体処置又はビヒクル対照に応答する腫瘍体積測定を示すグラフである。 正常及び悪性細胞上でのＦＯＬＲ１（ＦＲα）発現密度を示す表である。 パネルＡは、ＦＯＬＲ１及びＣＤ３に結合する二特異性抗体であるＴＮＢ－９２８Ｂの模式図である。パネルＢは、ＦＯＬＲ１を発現するＩＧＲＯＶ－１細胞において測定された、抗体濃度の関数としての結合されたＴＮＢ－９２８Ｂを示すグラフである。パネルＣは、指示される抗体コンストラクトに対する抗体濃度の関数としての細胞溶解（％）を示すグラフである。 パネルＡは、抗体濃度の関数としてのＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示す２つのグラフを提供する。パネルＢは、抗体濃度の関数としてのＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す２つのグラフを提供する。パネルＣは、指示される抗体コンストラクトでの処置後に誘導されるＴｒｅｇ細胞のパーセンテージを示すグラフである。 パネルＡ～Ｂは、指示される抗体コンストラクトでの処置の関数としての細胞溶解（％）を示すグラフである。 ３名の異なるドナーに対する細胞溶解（％）、ＩＦＮγ産生及びＩＬ－２産生を示す一連のグラフを提供する。 パネルＡ～Ｆは、細胞溶解（％）（パネルＡ及びＣ）；レスポンダー及び非レスポンダーに対するＦＯＬＲ１（ＦＲα）抗原密度（パネルＢ）；サイトカイン産生（パネルＤ及びＥ）；及びＴｒｅｇ（パネルＦ）を示す一連のグラフである。 パネルＡ～Ｃは、ＮＣＧマウス異種移植モデルからのデータをまとめる一連のグラフである。パネルＡは、時間（試験日）の関数としての腫瘍体積を示し；パネルＢは、腫瘍からの免疫組織化学（ＩＨＣ）データをまとめ；パネルＣは、非腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける時間の関数としてのＴＮＢ－９２８Ｂの血清濃度を示す。 ＴＮＢ－９２８Ｂの生物物理学的特徴をまとめた表である。 本明細書中で記載のような細胞傷害性アッセイから得られた、列挙される抗体コンストラクトのＥＣ５０値をまとめた表である。 ＴＮＢ－９２８Ｂで処理された新鮮な患者由来のエクスビボ卵巣腫瘍試料の臨床及び分子的特徴をまとめた表である。 １カ月間の４℃及び３７℃での温置後に得られたＴＮＢ－９２８Ｂの２つのＳＥＣ－ＵＰＬＣクロマトグラムを提供する。 パネルＡは、様々なＥ：Ｔ比での、指示される細胞型の腫瘍細胞溶解を示す一連のグラフである。パネルＢは、ＴＮＢ－９２８Ｂ濃度の関数としての細胞溶解を示すグラフである。パネルＣは、ＥＬＩＳＡにより測定された、同時培養上清中のｓＦＲαの濃度を示すグラフである。 パネルＡは、外来ＰＢＭＣを添加せずに温置された新たに分離された卵巣癌腫組織から得られたＴＮＢ－９２８Ｂ濃度の関数としてのパーフォリン（ｐｅｆｏｒｉｎ）濃度を示すグラフである。パネルＢは、外来ＰＢＭＣを添加せずに温置された新たに分離された卵巣癌腫組織から得られたＴＮＢ－９２８Ｂ濃度の関数としてのグランザイムＢ濃度を示すグラフである。

本発明の実施は、特に明記しない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用し、これらは、当技術分野の技術の範囲内である。そのような技術は、文献、例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）；Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）；及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）で十分に説明されている。

値の範囲が提供される場合、この範囲の上限と下限との間の各介在値（別途文脈が明確に示す場合を除き、下限の単位の１０分の１まで）及びこの述べられる範囲のあらゆる他の指定の又は介在する値が本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれ得、またこの指定された範囲で具体的に排除された何れかの制限を条件として本発明内に包含される。指定された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、含まれているこれらの限界の一方又は両方を除く範囲も本発明中に含まれる。

別段の指示がない限り、本明細書中の抗体残基は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に従い番号付けされる。

以下の説明では、本発明のより詳細な理解を提供するために、多くの具体的な詳細を記載する。しかしながら、本発明は、これらの具体的な詳細の１つ又は複数がなくても実施され得ることが当業者にとって明らかであろう。他の例では、周知の特徴及び当業者にとって周知の手順は、本発明を不明瞭にすることを避けるために説明していない。

特許出願及び刊行物を含む、本開示全体を通して引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Ｉ．定義
「含む」とは、列挙された要素は、組成物／方法／キットにおいて必要であるが、他の要素は特許請求の範囲内の組成物／方法／キットなどを形成するために含まれ得ることを意味する。

「基本的に～からなる」とは、記載された組成物又は方法の範囲を、主題発明の基本的且つ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない特定の材料又は段階に限定することを意味する。

「～からなる」とは、特許請求の範囲において特定されていない要素、段階又は成分を、組成物、方法又はキットから排除することを意味する。

本明細書中の抗体残基は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム及びＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされる。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは一般に、可変ドメインの残基（重鎖のおよそ１～１１３の残基）を指す場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵナンバリングシステム」又は「ＥＵインデックス」は一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域の残基を指す場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前出、において報告されるＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基の番号付けを指す。本明細書中で別段の記載がない限り、抗体の可変ドメイン中の残基番号への言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる残基番号付けを意味する。本明細書において別段の記載がない限り、抗体の定常ドメイン中の残基番号への言及は、ＥＵナンバリングシステムによる残基番号付けを意味する。

免疫グロブリンとも呼ばれる抗体は従来、少なくとも１本の重鎖及び１本の軽鎖を含み、重鎖及び軽鎖のアミノ末端ドメインの配列は可変であり、従って一般に可変領域ドメイン又は可変重鎖（ＶＨ）若しくは可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと呼ばれる。２つのドメインは従来、会合して特異的結合領域を形成するが、本明細書で論じるように、特異的結合は、重鎖のみの可変配列を用いても得ることができ、抗体の様々な非天然構造が知られており、当技術分野で使用されている。

「機能的」又は「生物学的に活性である」抗体又は抗原結合分子（本明細書に記載の重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）及び多重特異性（例えば二特異性）３本鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含む）は、構造的、調節的、生化学的又は生物物理学的事象においてその天然の活性の１つ以上を発揮することが可能なものである。例えば、機能的抗体又は他の結合分子、例えばＴＣＡは、抗原に特異的に結合する能力を有し得、結合は次に、シグナル伝達又は酵素活性などの細胞又は分子事象を誘発又は変更し得る。機能的抗体又は他の結合分子、例えばＴＣＡはまた、受容体のリガンド活性化を遮断し得るか又はアゴニスト若しくはアンタゴニストとして作用し得る。抗体又は他の結合分子、例えばＴＣＡがその天然の活性の１つ以上を発揮する能力は、ポリペプチド鎖の適切なフォールディング及びアセンブリを含むいくつかの因子に依存する。

本明細書中の「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単量体、二量体、多量体、多特異性抗体（例えば二特異性抗体）、重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、３本鎖抗体、ＴＣＡ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ナノボディなどを包含し、抗体断片も、それらが所望の生物学的活性を示す限り含まれる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：４８５４－４８６１）。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は他の種由来であり得る。

抗体という用語は、完全長重鎖、完全長軽鎖、インタクトな免疫グロブリン分子又はこれらのポリペプチドサブユニットの何れかの免疫学的に活性な部分、即ち関心対象の標的の抗原又はその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチドを指し得、そのような標的としては、癌細胞又は自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞が挙げられるが限定されない。本明細書中で開示される免疫グロブリンは、何れかのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はエフェクター細胞活性を低減若しくは増強させる改変Ｆｃ部分を有する改変サブクラスを含む免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。本抗体の軽鎖は、カッパ軽鎖（Ｖカッパ）又はラムダ軽鎖（Ｖラムダ）であり得る。免疫グロブリンは、何れかの種に由来し得る。一態様では、免疫グロブリンは主にヒト起源のものである。

本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は、僅かに存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、単一の抗原部位を対象とする。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得、組み換えタンパク質作製法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）によっても作製され得る。

「可変」という用語は、抗体に関連して使用される場合、抗体可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で大きく異なり、その特定の部分が各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において用いられるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均等に分布しているわけではない。それは軽鎖及び重鎖の可変ドメインにおける何れも超可変領域と呼ばれる三つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保存される部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ大部分がβシート構造をとり、ループ接続を形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する、３つの超可変領域によって接続された４つのＦＲを含む。各鎖の超可変領域は、ＦＲによりごく近接して一体に保持され、他方の鎖由来の超可変領域と一緒になって抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関わらないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。

「超可変領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」若しくは「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（例えば、重鎖可変ドメインの残基３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））及び／又は「超可変ループ」に由来するアミノ酸残基（例えば、重鎖可変ドメインの２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含む。いくつかの実施形態では、「ＣＤＲ」は、Ｌｅｆｒａｎｃ，ＭＰ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：２０９－２１２（１９９９）において定義されているような抗体の相補性決定領域を意味する。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるような超可変領域／ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

例示的なＣＤＲの名称を本明細書中で示すが、当業者は、Ｋａｂａｔの定義（“Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ａ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４７：６９４－７００を参照）（これは、配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている）を含む、ＣＤＲのいくつかの定義が一般に使用されていることを理解するであろう。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づく（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７－８８３）。関心対象の代替的なＣＤＲの定義としては、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，“Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ．”Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６５７－６７０； Ｏｆｒａｎ ｅｔ ａｌ．“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ （ＣＤＲｓ） ｒｅｖｅａｌｓ ｐｅｃｕｌｉａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＣＤＲｓ ａｎｄ Ｂ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８１：６２３０－６２３５；Ａｌｍａｇｒｏ“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．”Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００４；１７：１３２－１４３；ａｎｄ Ｐａｄｌａｎｅｔ ａｌ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｆａｓｅｂ Ｊ．１９９５；９：１３３－１３９に開示されているものが挙げられるが限定されない（これらの各文献は、参照により本明細書に明確に組み込まれる）。

「重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、広義で、抗体又は抗体の１つ以上の部分、例えば従来の抗体の軽鎖を欠く抗体の１つ以上のアームを指す。この用語には、具体的には、ＣＨ１ドメインの非存在下でＶＨ抗原結合ドメインとＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインとを含むホモ二量体抗体；このような抗体の機能的（抗原結合）バリアント、可溶性ＶＨバリアント、１つの可変ドメイン（Ｖ－ＮＡＲ）及び５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ－ＮＡＲ）のホモ二量体を含むＩｇ－ＮＡＲ及びその機能的断片；並びに可溶性単一ドメイン抗体（ｓＵｎｉＤａｂｓ（商標））が含まれるが限定されない。一実施形態では、重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、フレームワーク１、ＣＤＲ１、フレームワーク２、ＣＤＲ２、フレームワーク３、ＣＤＲ３及びフレームワーク４から構成される可変領域抗原結合ドメインから構成される。別の実施形態では、重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部及びＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される。別の実施形態では、重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部及びＣＨ２ドメインから構成される。さらなる実施形態では、重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部及びＣＨ３ドメインから構成される。ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインがトランケートされている重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）も本明細書中に含まれる。さらなる実施形態では、重鎖は、抗原結合ドメイン及び少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４）ドメインから構成されるが、ヒンジ領域は含まれない。重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、２つの重鎖が互いとジスルフィド結合されているか、又はさもなければ互いに共有結合的若しくは非共有結合的に結合されている、二量体の形態であり得る。重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ＩｇＧサブクラスに属し得るが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体も本明細書中に含まれる。特定の実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプである。一実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ４サブタイプであり、ＣＨドメインの１つ以上が抗体のエフェクター機能を変化させるように修飾される。一実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプであり、ＣＨドメインの１つ以上が抗体のエフェクター機能を変化させるように修飾される。エフェクター機能を変化させるＣＨドメインの修飾は、本明細書中でさらに記載される。重鎖抗体の非限定例は、例えば、国際公開第２０１８／０３９１８０号パンフレットに記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書中の重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の結合（標的化）ドメインとして使用される。この定義には、具体的に、ＵｎｉＡｂ（商標）と呼ばれる、ヒト免疫グロブリントランスジェニックラット（ＵｎｉＲａｔ（商標））によって産生されるヒト重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が含まれる。ＵｎｉＡｂ（商標）の可変領域（ＶＨ）は、ＵｎｉＤａｂｓ（商標）と呼ばれ、多重特異性、効力の上昇及び半減期の延長を伴う新規治療薬の開発のために、Ｆｃ領域又は血清アルブミンに連結され得る多用途の構成要素である。ホモ二量体ＵｎｉＡｂｓ（商標）は、軽鎖及び、従ってＶＬドメインを欠くため、抗原は、１つの単一ドメイン、即ち重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン（ＶＨ又はＶＨＨ）によって認識される。

本明細書中で使用される場合、「インタクトな抗体鎖」は、完全長可変領域及び完全長定常領域（Ｆｃ）を含む抗体鎖である。インタクトな「従来の」抗体は、分泌されたＩｇＧでは、インタクトな軽鎖及びインタクトな重鎖並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＩｇＭ又はＩｇＡなどの他のアイソタイプは、異なるＣＨドメインを有し得る。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えば、ヒトネイティブ配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列バリアントであり得る。インタクトな抗体は、抗体のＦｃ定常領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指す１つ以上の「エフェクター機能」を有し得る。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；及び細胞表面受容体の下方制御が挙げられる。定常領域バリアントには、エフェクタープロファイル、Ｆｃ受容体への結合などを変化させるものが含まれる。

重鎖のＦｃ（定常ドメイン）のアミノ酸配列に応じて、抗体及び種々の抗原結合タンパク質を様々な「クラス」に割り当て得る。重鎖Ｆｃ領域には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのうちいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２にさらに分けられ得る。様々なクラスの抗体に対応するＦｃ定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれ得る。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構造は、周知である。Ｉｇ形態には、ヒンジ修飾又はヒンジレス形態が含まれる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３－４０９０；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２４６－７２５６；米国特許出願公開第２００５／００４８５７２号明細書；米国特許出願公開第２００４／０２２９３１０号明細書）。何れかの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ばれる２つのタイプの１つに割り当てられ得る。本発明の実施形態による抗体は、カッパ軽鎖配列又はラムダ軽鎖配列を含み得る。

「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。エフェクター機能の非限定例としては、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；ＡＤＣＰ；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は一般に、受容体、例えば、ＦｃγＲＩ；ＦｃγＲＩＩＡ；ＦｃγＲＩＩＢ１；ＦｃγＲＩＩＢ２；ＦｃγＲＩＩＩＡ；ＦｃγＲＩＩＩＢ受容体及び低親和性ＦｃＲｎ受容体と相互作用するためのＦｃ領域を必要とし、当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価され得る。「死滅した」又は「サイレンシングされた」Ｆｃは、例えば、血清半減期の延長に関して活性を保持するように突然変異されているが、高親和性Ｆｃ受容体を活性化しないか、又はＦｃ受容体に対する親和性が低下しているものである。

「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。ネイティブ配列ヒトＦｃ領域としては、例えば、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、ネイティブ配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ネイティブ配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域及びネイティブ配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域並びにそれらの天然のバリアントが挙げられる。

「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸の修飾、好ましくは１つ以上のアミノ酸の置換により、ネイティブ配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、約１～約１０個のアミノ酸置換、好ましくは天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域における約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％のそれとの相同性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％のそれとの相同性を有する。

バリアントＦｃ配列は、ＥＵインデックス位置２３４、２３５及び２３７でＦｃγＲＩ結合を低減するためにＣＨ２領域に３つのアミノ酸置換を含み得る（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３を参照）。ＥＵインデックス位置３３０及び３３１における補体Ｃ１ｑ結合部位における２つのアミノ酸置換は、補体結合を減少させる（Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：６６１（１９９３）及びＣａｎｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３（１９９１）を参照）。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２残基の２３３～２３６位での置換並びにＩｇＧ４残基の３２７、３３０及び３３１位での置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低下させる（例えば、Ａｒｍｏｕｒ ＫＬ．ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３－２４；及びＳｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６０４を参照）。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ０１８６１）を配列番号９２として本明細書で提供する。サイレンシングされたＩｇＧ１は、例えばＢｏｅｓｃｈ，Ａ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ Ｆｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”ＭＡｂｓ，２０１４．６（４）：ｐ．９１５－２７に記載されており、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ジスルフィド結合を形成することが可能な領域が欠失されているか、又は特定のアミノ酸残基がネイティブＦｃのＮ末端で除去されているか、又はメチオニン残基が付加されているものを含むが限定されない、他のＦｃバリアントが可能である。従って、いくつかの実施形態では、抗体の１つ以上のＦｃ部分が、ジスルフィド結合を排除するために、ヒンジ領域に１つ以上の変異を含み得る。また別の実施形態では、Ｆｃのヒンジ領域を完全に除去し得る。さらに別の実施形態では、抗体は、Ｆｃバリアントを含み得る。

さらに、Ｆｃバリアントは、補体結合又はＦｃ受容体結合をもたらすためにアミノ酸残基を置換（突然変異）、欠失又は付加することにより、エフェクター機能を除去するか又は実質的に低下させるように構築され得る。例えば、限定されないが、欠失は、Ｃ１ｑ結合部位などの補体結合部位において生じ得る。免疫グロブリンＦｃ断片のこのような配列誘導体を調製するための技術は、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び国際公開第９６／３２４７８号パンフレットで開示されている。さらに、Ｆｃドメインは、リン酸化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などによって修飾され得る。

いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含むバリアントヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン配列を含み、これは、本明細書中では、任意選択的にＩｇＧ４ ＣＨ３ノブ配列と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ３６６Ｓ突然変異、Ｌ３６８Ａ突然変異及びＹ４０７Ｖ突然変異を含むバリアントヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン配列を含み、これは、本明細書中では、任意選択的にＩｇＧ４ ＣＨ３ホール配列と呼ばれ得る。本明細書中に記載のＩｇＧ４ ＣＨ３変異は、抗体二量体中の第１の単量体の第１の重鎖定常領域に「ノブ」を置き、抗体二量体中の第２の単量体の第２の重鎖定常領域に「ホール」を置き、それによって抗体中の重鎖ポリペプチドサブユニットの所望の対の適切な対合（ヘテロ二量体化）を促進するために、何れかの好適な方法で利用され得る。

いくつかの実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ突然変異、Ｆ２３４Ａ突然変異、Ｌ２３５Ａ突然変異及びＴ３６６Ｗ突然変異（ノブ）を含むバリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む重鎖ポリペプチドサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ突然変異、Ｆ２３４Ａ突然変異、Ｌ２３５Ａ突然変異、Ｔ３６６Ｓ突然変異、Ｌ３６８Ａ突然変異及びＹ４０７Ｖ突然変異（ホール）を含むバリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む重鎖ポリペプチドサブユニットを含む。

「Ｆｃ領域含有抗体」という用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の精製中又は抗体をコードする核酸の組み換え操作によって除去され得る。従って、本発明によるＦｃ領域を有する抗体は、Ｋ４４７を有する抗体又はＫ４４７のない抗体を含み得る。

本発明の態様には、１価又は２価構造の重鎖のみの可変領域を含む抗体を含む。本明細書で使用される場合、重鎖のみの可変領域ドメインに関して使用される場合、「１価構造」という用語は、重鎖のみの可変領域ドメインが１つのみ存在し、単一の結合部位を有することを意味する（図３、パネルＤ、抗体の左アームを参照）。一方、重鎖のみの可変領域ドメインに関して使用される「２価構造」という用語は、重鎖のみの可変領域ドメインが２つ存在し（それぞれが単一の結合部位を有する）、リンカー配列によって連結されることを意味する（図５、パネルＤ、抗体の左アームを参照）。リンカー配列の非限定例は、本明細書中でさらに論じられ、様々な長さのＧＳリンカー配列が含まれるが限定されない。重鎖のみの可変領域が２価構造である場合、重鎖のみの２つの可変領域ドメインのそれぞれは、同じ抗原又は異なる抗原（例えば、同じタンパク質上の異なるエピトープに；２つの異なるタンパク質になど）に対して結合親和性を有し得る。しかしながら、特に断らない限り、「２価構造」であると示される重鎖のみの可変領域は、リンカー配列によって連結された２つの同一の重鎖のみの可変領域ドメインを含有すると理解され、２つの同一の重鎖のみの可変領域ドメインの各々は、同じ標的抗原に対して結合親和性を有する。

本発明の態様は、二特異性、三特異性などを含むが限定されない、多特異性構造を有する抗体を含む。多種多様な方法及びタンパク質構成が知られており、二特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三特異性抗体などにおいて使用されている。

２つ以上の抗体の可変ドメインを組み換え融合することにより、多価の人工抗体を作製するための様々な方法が開発されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド上の第１及び第２の抗原結合ドメインは、ポリペプチドリンカーによって連結されている。このようなポリペプチドリンカーの１つの非限定例は、４つのグリシン残基のアミノ酸配列、続いて１つのセリン残基を有するＧＳリンカーであり、配列はｎ回反復され、ここで、ｎは、１～約１０の範囲の整数、例えば２、３、４、５、６、７、８又は９である（配列番号１１０）。このようなリンカーの非限定例としては、ＧＧＧＧＳ（配列番号８１）（ｎ＝１）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８２）（ｎ＝２）が挙げられる。他の好適なリンカーも使用され得、例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５；６５（１０）：１３５７－６９に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

「３本鎖抗体様分子」又は「ＴＣＡ」という用語は、本明細書では、３つのポリペプチドサブユニットを含むか、基本的にそれらからなるか又はそれらからなり、そのうちの２つが、モノクローナル抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖又は抗原結合領域及び少なくとも１つのＣＨドメインを含むそのような抗体鎖の機能的抗原結合断片を含むか、基本的にそれらからなるか又はそれらからなる抗体様分子を指すために使用される。この重鎖／軽鎖対は、第１の抗原に対する結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインの非存在下でＣＨ２、及び／又はＣＨ３、及び／又はＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分と、第２の抗原のエピトープ又は第１の抗原の異なるエピトープに結合する１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、２つの抗原結合ドメイン）と、を含み、そのような結合ドメインが抗体重鎖又は軽鎖の可変領域に由来するか又はそれと配列同一性を有する重鎖抗体を、含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる。そのような可変領域の一部は、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪ_Ｈ遺伝子セグメント又はＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。可変領域は、再編成されたＶ_ＨＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＬＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＨＪ_Ｌ又はＶ_ＬＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。

ＴＣＡ結合化合物は、「重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「重鎖－抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「重鎖ポリペプチド」を使用し、本明細書で使用される場合、重鎖定常領域ＣＨ２及び／又はＣＨ３及び／又はＣＨ４を含むが、ＣＨ１ドメインを含まない単鎖抗体を意味する。一実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部並びにＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される。別の実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部及びＣＨ２ドメインから構成される。さらなる実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部及びＣＨ３ドメインから構成される。ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインがトランケートされている重鎖抗体も本明細書中に含まれる。さらなる実施形態では、重鎖は、抗原結合ドメイン及び少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４）ドメインから構成され、ヒンジ領域は含まれない。重鎖抗体は、２つの重鎖がジスルフィド結合しているか、又は他の方法で互いに共有結合若しくは非共有結合している二量体の形態であり得、任意選択的に、ポリペプチド鎖間の適切な対合を促進するために、ＣＨドメインの１つ以上の間の非対称的な界面を含み得る。重鎖抗体は、ＩｇＧサブクラスに属し得るが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体も本明細書中に含まれる。特定の実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１サブタイプ又はＩｇＧ４サブタイプのものである。ＴＣＡ結合化合物の非限定例は、例えば、国際公開第２０１７／２２３１１１号パンフレット及び国際公開第２０１８／０５２５０３号パンフレットに記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

重鎖抗体は、ラクダ科動物、例えばラクダ及びラマによって産生されるＩｇＧ抗体の約４分の１を構成する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．３６３，４４６－４４８（１９９３））。これらの抗体は、２つの重鎖によって形成されるが、軽鎖を欠いている。結果として、可変抗原結合部分はＶＨＨドメインと称され、天然に存在する最小のインタクトな抗原結合部位を表し、長さは僅か約１２０アミノ酸である（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２６２８５－２６２９０（２００１））。高い特異性及び親和性を有する重鎖抗体は、免疫化によって様々な抗原に対して生成され得る（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７－４６（１９９９））、ＶＨＨ部分を容易にクローニングし、酵母で発現させ得る（Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１－２１（２０００））。それらの発現、溶解性及び安定性のレベルは、古典的なＦ（ａｂ）断片又はＦｖ断片より大幅に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，５２１－５２６（１９９７））。サメは、その抗体中にＶＮＡＲと呼ばれる単一のＶＨ様ドメインを有することも示されている。（Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４（２００３）；Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７－１９７（２００４）；Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５－３３（２００３））。

「ＦＯＬＲ１」という用語（ＦＲａ又はＦＲαとも呼ばれる）は、本明細書中で使用される場合、葉酸及び還元葉酸誘導体に結合するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）に連結される膜タンパク質を指し、５－メチルテトラヒドロ葉酸の細胞内送達に介在する。「ＦＯＬＲ１」という用語は、あらゆるヒト及び非ヒト動物種のＦＯＬＲ１タンパク質を含み、具体的には、ヒトＦＯＬＲ１並びに非ヒト哺乳動物のＦＯＬＲ１を含む。

「ヒトＦＯＬＲ１」という用語は、本明細書中で使用される場合、その供給源又は調製方式にかかわらず、ヒトＦＯＬＲ１（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１５３２８；ＨＧＮＣ ＩＤ ３７９１）の何れかのバリアント、アイソフォーム及び種相同体を含む。従って、「ヒトＦＯＬＲ１」は、細胞によって天然に発現されるヒトＦＯＬＲ１及びヒトＦＯＬＲ１遺伝子を遺伝子移入した細胞で発現されるＦＯＬＲ１を含む。

「抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「ＦＯＬＲ１重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「ＦＯＬＲ１重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、本明細書中、上で定義したとおりのヒトＦＯＬＲ１を含む、ＦＯＬＲ１に免疫特異的に結合する、本明細書中、上で定義したとおりの重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を指す。この定義には、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば、上で定義されたようなヒト抗ＦＯＬＲ１ ＵｎｉＡｂ（商標）を産生するＵｎｉＲａｔ（商標）抗体など、トランスジェニック動物によって産生されたヒト重鎖抗体が含まれるが限定されない。

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインさせ、必要であれば、最大の配列同一性％を達成するためにギャップを導入した後の、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当業者の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な何れかのアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定し得る。しかしながら、本明細書の目的のためには、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。

「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離され及び／又は回収されたものである。その天然環境の混入成分は、抗体の診断的又は治療的使用を妨害し得る物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法による決定で抗体が９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を十分に得られる程度まで、又は（３）クマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を用いて、還元条件下又は非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質になるまで精製される。単離された抗体には、その抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないため、組み換え細胞内にインサイチュで存在する抗体が含まれる。しかし、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製段階によって調製される。

本発明の抗体としては、多重特異性抗体が挙げられる。多重特異性抗体は、複数の結合特異性を有する。「多特異性」という用語には、具体的には、「二特異性」及び「三特異性」並びにより高次のポリエピトープ特異性などのより高次の独立した特異的結合親和性並びに４価抗体及び抗体断片が含まれる。「多特異性抗体」、「多特異性重鎖抗体（ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「多特異性重鎖抗体（ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「多特異性ＵｎｉＡｂ（商標）」という用語は、本明細書中では、最も広い意味で使用され、複数の結合特異性を有する全ての抗体を包含する。本発明の多特異性抗重鎖抗ＦＯＬＲ１抗体は、具体的には、ヒトＦＯＬＲ１などのＦＯＬＲ１タンパク質上の２つ以上の非重複エピトープに免疫特異的に結合する抗体を含む（即ち２価及びバイパラトピック）。本発明の多特異性重鎖抗ＦＯＬＲ１抗体は、具体的には、ヒトＦＯＬＲ１などのＦＯＬＲ１タンパク質上のエピトープ及び、例えばＣＤ３タンパク質、例えばヒトＣＤ３タンパク質などの異なるタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体も含む（即ち、二特異性及びバイパラトピック）。本発明の多特異性重鎖抗ＦＯＬＲ１抗体は、具体的には、ヒトＦＯＬＲ１タンパク質などのＦＯＬＲ１タンパク質上の２つ以上の、重複しないか又は部分的に重複するエピトープ及び、例えばＣＤ３タンパク質、例えばヒトＣＤ３タンパク質などの異なるタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体も含む（即ち３価及びバイパラトピック）。

本発明の抗体は、１つの結合特異性を有する単一特異性抗体を含む。単一特異性抗体は、具体的には、単一結合特異性を含む抗体並びに同じ結合特異性を有する複数の結合ユニットを含む抗体を含む。「単一特異性抗体」、「単一特異性重鎖抗体（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「単一特異性重鎖抗体（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「単一特異性ＵｎｉＡｂ（商標）」という用語は、本明細書では、最も広い意味で使用され、１つの結合特異性を有する全ての抗体を包含する。本発明の単一特異性重鎖抗ＦＯＬＲ１抗体は、具体的には、ヒトＦＯＬＲ１などのＦＯＬＲ１タンパク質上の１つのエピトープに免疫特異的に結合する抗体（１価及び単一特異性）を含む。本発明の単一特異性重鎖抗ＦＯＬＲ１抗体はまた、具体的には、ヒトＦＯＬＲ１などのＦＯＬＲ１タンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する複数の結合ユニットを有する抗体（例えば多価抗体）も含む。例えば、本発明の実施形態による単一特異性抗体は、各抗原結合ドメインがＦＯＬＲ１タンパク質上の同じエピトープに結合する２つの抗原結合ドメインを含む重鎖可変領域を含み得る（即ち２価及び単一特異性）。

「エピトープ」は、単一の抗体分子が結合する抗原分子の表面上の部位である。一般に、抗原は、数個又は多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。この用語には、具体的には、線状エピトープ及び立体構造エピトープが含まれる。

「エピトープマッピング」は、抗体の標的抗原上の、抗体の結合部位又はエピトープを同定する過程である。抗体エピトープは、線状エピトープ又は立体構造エピトープであり得る。線状エピトープは、タンパク質中のアミノ酸の連続配列によって形成される。立体構造エピトープは、タンパク質配列中の不連続であるが、タンパク質が三次元構造に折り畳まれると１つにまとまるアミノ酸から形成される。

「ポリエピトープ特異性」は、同じ又は異なる標的上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。上記のように、本発明は、特に、ポリエピトープ特異性を有する抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体、即ちヒトＦＯＬＲ１などのＦＯＬＲ１タンパク質上の１つ以上の非重複エピトープに結合する抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体；及びＦＯＬＲ１タンパク質上の１つ以上のエピトープ及び例えばＣＤ３タンパク質などの異なるタンパク質上のエピトープに結合する抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体を含む。抗原の「非重複エピトープ」又は「非競合エピトープ」という用語は、本明細書中では、一対の抗原特異的抗体の一方のメンバーによって認識されるが、他方のメンバーによっては認識されないエピトープを意味すると定義される。非重複エピトープを認識する、多特異性抗体上の同じ抗原を標的とする抗体の対又は抗原結合領域は、その抗原への結合について競合せず、その抗原に同時に結合することが可能である。

抗体は、２つの抗体が同一又は立体的に重複するエピトープを認識する場合、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一又は立体的に重複するエピトープに結合するか否かを決定するための迅速で最も広く使用されている方法は、標識抗原又は標識抗体の何れかを使用して、あらゆる数の異なる形式で構成され得る競合アッセイである。通常、抗原を９６ウェルプレート上に固定化し、標識抗体の結合を遮断する非標識抗体の能力を、放射性標識又は酵素標識を用いて測定する。

本明細書中で使用される場合の「価」という用語は、抗体分子中の結合部位の特定の数を指す。

「１価」抗体は、１つの結合部位を有する。従って、１価抗体は単一特異性でもある。

「多価」抗体は、２つ以上の結合部位を有する。従って、「２価」、「３価」及び「４価」という用語は、それぞれ２つの結合部位、３つの結合部位及び４つの結合部位が存在することを指す。従って、本発明による二特異性抗体は、少なくとも２価であり、３価、４価又は他の多価であり得る。本発明の実施形態による２価抗体は、同じエピトープ（即ち２価、モノパラトピック）又は２つの異なるエピトープ（即ち２価、バイパラトピック）への２つの結合部位を有し得る。

二特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三特異性抗体などを調製するための多種多様な方法及びタンパク質構造が知られており、使用されている。

「３本鎖抗体様分子」又は「ＴＣＡ」という用語は、本明細書では、３つのポリペプチドサブユニットを含むか、基本的にそれらからなるか又はそれらからなり、そのうちの２つが、モノクローナル抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖又は抗原結合領域及び少なくとも１つのＣＨドメインを含むそのような抗体鎖の機能的抗原結合断片を含むか、基本的にそれらからなるか又はそれらからなる抗体様分子を指すために使用される。この重鎖／軽鎖対は、第１の抗原に対する結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインの非存在下でＣＨ２及び／又はＣＨ３及び／又はＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分と、第２の抗原のエピトープ又は第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインとを含み、そのような結合ドメインは、抗体重鎖又は軽鎖の可変領域に由来するか又はそれと配列同一性を有する、重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含むか、基本的にそれからなるか又はそれからなる。そのような可変領域の一部は、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪ_Ｈ遺伝子セグメント又はＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。可変領域は、再編成されたＶ_ＨＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＬＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＨＪ_Ｌ又はＶ_ＬＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。ＴＣＡタンパク質は、本明細書中の上で定義した重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を利用する。

「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、本明細書中で、最も広い意味で使用され、所望の結合特異性（例えば、モノクローナル抗体又は他のリガンドの抗原結合領域）を膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに移植する、改変された受容体を指す。典型的には、この受容体を用いて、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製する。（Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，２０１５；１０８（７）：ｄｖｊ４３９；及びＪａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６；１３：３７０－３８３）。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、免疫療法での使用のための人工Ｔ細胞受容体を生成させるように遺伝子操作されたＴ細胞である。一実施形態では、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞質ドメインから最小限構成される１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする導入遺伝子を発現する治療用Ｔ細胞を意味する。

「ヒト抗体」という用語は、本明細書では、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むために使用される。本明細書中のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発により導入される突然変異又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異を含み得る。「ヒト抗体」という用語には、具体的には、トランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックラット又はマウスによって産生される、ヒト重鎖可変領域配列を有する重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、特に上で定義されるＵｎｉＲａｔ（商標）によって産生されるＵｎｉＡｂ（商標）が含まれる。

「キメラ抗体」又は「キメラ免疫グロブリン」とは、少なくとも２つの異なるＩｇ遺伝子座に由来するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン分子、例えば、ヒトＩｇ遺伝子座によってコードされる部分及びラットＩｇ遺伝子座によってコードされる部分を含むトランスジェニック抗体を意味する。キメラ抗体は、非ヒトＦｃ領域又は人工Ｆｃ領域を有するトランスジェニック抗体及びヒトイディオタイプを含む。そのような免疫グロブリンは、そのようなキメラ抗体を産生するように操作された本発明の動物から単離され得る。

本明細書中で使用される場合、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識相及び活性化相とは対照的に、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を指す。いくつかのエフェクター細胞は、特異的Ｆｃ受容体を発現し、特異的免疫機能を実行する。いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することが可能である。例えば、ＦｃＲを発現する単球及びマクロファージは、標的細胞の特異的死滅及び免疫系の他の成分への抗原の提示又は抗原を提示する細胞への結合に関与する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食し得る。

「ヒトエフェクター細胞」は、Ｔ細胞受容体又はＦｃＲなどの受容体を発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣに介在するヒト白血球の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が挙げられ、ＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然供給源、例えば本明細書中に記載されるような血液又はＰＢＭＣから単離され得る。

「免疫細胞」という用語は、本明細書中で、最も広い意味で使用され、骨髄又はリンパ起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば、好中球、顆粒球、肥満細胞及び好塩基球を含むが限定されない。

抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。

「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣに介在するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４頁、表３に要約される。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば、米国特許第５，５００，３６２号明細書又は同第５，８２１，３３７号明細書に記載されているもの、を実施し得る。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代わりに又はさらに、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価され得る。

「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下で分子が標的を溶解する能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の、同族抗原と複合化した分子（例えば抗体）への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを実施し得る。

「結合親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書中で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向がある一方、高親和性抗体は一般に、より速く抗原に結合し、結合したままである傾向がある。

本明細書中で使用される場合、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、動力学モードでＯｃｔｅｔ ＱＫ３８４機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して、バイオレイヤー干渉法によって決定される解離定数を指す。例えば、抗マウスＦｃセンサーにマウスＦｃ融合抗原を載せ、次いで、抗体含有ウェルに浸漬して、濃度依存性結合速度（ｋｏｎ）を測定する。抗体解離速度（ｋｏｆｆ）を最終段階で測定し、ここで、センサーを緩衝液のみを含有するウェルに浸漬する。Ｋｄは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比である。（さらに詳しくは、Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ，１２（８），７９１－８００，２００９を参照）。

「処置」、「処置する」などの用語は、本明細書では、一般に所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患若しくはその症状を完全若しくは部分的に防ぐ点で予防的であり得、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用に対する部分的若しくは完全な治癒の点で治療的であり得る。本明細書中で使用される場合、「処置」は、哺乳動物における疾患のあらゆる処置を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患が生じるのを防止すること；（ｂ）疾患を阻止すること、即ちその発症を阻止すること；又は（ｃ）疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を引き起こすことを含む。治療薬は、疾患又は傷害の発症前、発症中又は発症後に投与され得る。処置が患者の望ましくない臨床症状を安定化又は軽減する、進行中の疾患の処置は、特に興味深い。そのような処置は、罹患組織における機能の完全な喪失前に実施されることが望ましい。対象の治療は、疾患の症候性段階中、場合により疾患の症候性段階後に投与され得る。

「治療的有効量」は、対象に治療的利益を与えるのに必要な活性薬剤の量を意図する。例えば、「治療的有効量」は、疾患に関連する病理学的症状、疾患の進行若しくは生理学的状態の改善を誘導するか、改良するか若しくは引き起こすか、又は障害に対する抵抗性を改善する量である。

「ＦＯＬＲ１の発現を特徴とする」という用語は、広義にはＦＯＬＲ１発現が疾患又は障害に特徴的な１つ以上の病理学的過程に関連するか又は関与する何れかの疾患又は障害を指す。このような障害としては、癌腫、例えば卵巣及び子宮癌（例えば、高悪性度漿液性癌腫、類子宮内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ）、低悪性度漿液性癌腫、明細胞癌腫、粘液性癌腫及び子宮内膜癌）、肺癌、腎臓癌、結直腸癌、乳癌並びに脳癌（例えば神経膠腫、神経膠芽腫）が挙げられるが限定されない。

「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、処置について評価され及び／又は処置されている哺乳動物を指す。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、癌を有する個体、自己免疫疾患を有する個体、病原体感染を有する個体などを包含するが限定されない。対象はヒトであり得るが、他の哺乳動物、特にヒト疾患のための実験モデルとして有用な哺乳動物、例えばマウス、ラットなども含む。

「医薬製剤」という用語は、有効成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加成分を含有しない製剤を指す。このような製剤は無菌である。「薬学的に許容可能な」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、使用される有効成分の有効用量を提供するために対象哺乳動物に合理的に投与され得るものである。

「無菌」製剤は、無菌であるか、又は全ての生きている微生物及びそれらの胞子を含まないか若しくは基本的に含まない。「凍結」製剤は、０℃未満の温度のものである。

「安定な」製剤は、その中のタンパク質が貯蔵時にその物理的安定性、及び／又は化学的安定性、及び／又は生物学的活性を基本的に保持するものである。好ましくは、製剤は、貯蔵時、その物理的及び化学的安定性並びにその生物学的活性を基本的に保持する。貯蔵期間は、一般に、製剤の意図された有効期間に基づいて選択される。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当技術分野で利用可能であり、例えばＰｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１．Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１） ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ．Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０）（１９９３）で概説されている。安定性は、選択された温度で、選択された期間、測定され得る。安定性は、凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて濁度を測定することにより、及び／又は目視検査によって）；陽イオン交換クロマトグラフィー、画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）又はキャピラリーゾーン電気泳動を用いて電荷不均一性を評価することによって；アミノ末端又はカルボキシ末端配列の分析；質量分光分析；還元されたインタクトな抗体を比較するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えば、トリプシン又はＬＹＳ－Ｃ）分析；抗体の生物学的活性又は抗原結合機能の評価などを含む様々な異なる方法で定性的及び／又は定量的に評価され得る。不安定性には、以下の何れかの１つ以上が含まれ得る：凝集、脱アミド化（例えばＡｓｎ脱アミド化）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化）、異性化（例えばＡｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えばヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化の相違など。

ＩＩ．詳細な説明
抗ＦＯＬＲ１抗体
本発明は、ヒトＦＯＬＲ１に結合する密接に関連する抗体のファミリーを提供する。これらのファミリーの抗体は、本明細書中で定義され、表１～３で示されるような一連のＣＤＲ配列を含み、表５、６、８及び９で示される配列番号２３～７４の提供される重鎖可変領域（ＶＨ）配列により例示される。これらの抗体のファミリーは、臨床的治療薬としての有用性に寄与する多くの利益を提供する。抗体はある範囲の結合親和性を有するメンバーを含み、所望の結合親和性を有する特定の配列の選択が可能となる。

適切な抗体は、例えば図３、パネルＤ又は図５、パネルＤで示されるような二特異性抗体として又はＣＡＲ－Ｔ構造の一部としての使用を含むが限定されない、開発及び治療又は他の用途のために本明細書中で提供されるものから選択され得る。図３、パネルＤは、抗ＣＤ３ ｘ 抗ＦＯＬＲ１多特異性抗体の例示を提供し、ここで抗ＦＯＬＲ１ドメインは１価及び単一特異性である。抗ＣＤ３ドメインは、ＣＨ１ドメインを含有し、軽鎖と対形成し、その一方で抗ＦＯＬＲ１ドメインは、重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）に由来し、ＣＨ１ドメインを含有しないか又は軽鎖と相互作用しない。いくつかの実施形態では、例えばノブ－イントゥ－ホール技術を使用して、２本の重鎖を対形成させる。図５、パネルＤは、抗ＣＤ３ ｘ 抗ＦＯＬＲ１多特異性抗体の例示を提供し、ここで抗ＦＯＬＲ１ドメインは２価であり、単一特異性である。抗ＣＤ３ドメインは、ＣＨ１ドメインを含有し、軽鎖と対形成し、一方で抗ＦＯＬＲ１ドメインは重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）由来であり、ＣＨ１ドメインを含有しないか又は軽鎖と相互作用しない。いくつかの実施形態では、例えばノブ－イントゥ－ホール技術を使用して、２本の重鎖を対形成させる。

図３、パネルＤで示される抗体は抗ＣＤ３ ｘ 抗ＦＯＬＲ１二特異性抗体であり、ここで抗ＦＯＬＲ１結合アームは１価及び単一特異性であり、抗ＦＯＬＲ１アームの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが１つしか存在しないことを意味する１価配置である。図５、パネルＤで示される抗体は、抗ＣＤ３ ｘ 抗ＦＯＬＲ１二特異性抗体であり、ここで抗ＦＯＬＲ１結合アームは２価及び単一特異性であり、抗ＦＯＬＲ１アームの抗原結合ドメインが２価配置であり、これは、２つの同一である抗原結合ドメインがタンデムに置かれることを意味する。いくつかの実施形態では、抗体は、２価及びバイパラトピックであり得、これは、２つの抗原結合ドメインがその抗体の抗ＦＯＬＲ１アーム上に存在し、これらの抗原結合ドメインのそれぞれが、異なる配列に結合し含有し（ｂｉｎｄｓ ｃｏｎｔａｉｎｓ）、ＦＯＬＲ１タンパク質上の異なるエピトープに結合することを意味する。

候補タンパク質に対する親和性の決定は、Ｂｉａｃｏｒｅ測定などの当技術分野で知られた方法を使用して行い得る。抗体ファミリーの^－メンバーは、約１０^－６～約１０^－１０前後；約１０^－６～１０^－９前後；約１０^－６～約１０^－８前後；約１０^－８～約１０^－１１前後；約１０^－８～約１０^－１０前後；約１０^－８～約１０^－９前後；約１０^－９～約１０^－１１前後；約１０^－９～約１０^－１０前後；又はこれらの範囲内の何れかの値を含むが限定されない、約１０－６～約１０－１１前後のＫｄのＦＯＬＲ１に対する親和性を有し得る。親和性選択は、インビトロアッセイ、前臨床モデル及び臨床治験並びに潜在的な毒性の評価を含む、ＦＯＬＲ１の生物学的活性の調整、例えば遮断についての生物学的評価によって確認され得る。

本明細書中の抗体ファミリーのメンバーは、シノモルグス・マカク（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）のＦＯＬＲ１タンパク質と交差反応性があるが、必要に応じて、シノモルグス・マカク（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）のＦＯＬＲ１タンパク質との、又は何れかの他の動物種のＦＯＬＲ１との交差反応性を除去するために改変され得る。本発明の実施形態に従ういくつかの抗体配列は、マウスＦＯＬＲ１タンパク質との交差反応性があるが、マウスＦＯＬＲ１タンパク質との交差反応性を除去するために改変され得る。逆に、本発明の実施形態によるいくつかの抗体配列は、マウスＦＯＬＲ１との交差反応性がないが、マウスＦＯＬＲ１との交差反応性を生じさせるために改変され得る。

本明細書中のＦＯＬＲ１特異的抗体のファミリーは、ヒトＶＨフレームワークにおいてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むＶＨドメインを含む。ＣＤＲ配列は、一例として、配列番号２３～７４で示される、提供される代表的な可変領域配列の、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に対する、アミノ酸残基２６～３３；５１～５８；及び９７～１１６の前後の領域に位置し得る。異なるフレームワーク配列が選択される場合、ＣＤＲ配列は異なる位置にあり得るが、一般に配列の順序は同じままであることが当業者により理解されよう。

本発明の抗ＦＯＬＲ１抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、次の構造式により包含され得、式中、Ｘは、可変性のアミノ酸を示し、これは、以下で指示されるように特定のアミノ酸であり得る：
ＣＤＲ１
Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｘ２ Ｓ Ｘ３ Ｘ４（配列番号７５）
（式中、Ｘ１は、Ｎ、Ｔ、Ｉ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｒ又はＳであり；
Ｘ３は、Ｆ又はＹであり；
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ又はＴである）；
ＣＤＲ２
Ｉ Ｓ Ｓ Ｘ１ Ｓ Ｘ２ Ｘ３ Ｉ（配列番号７６）
（式中、Ｘ１は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ３は、Ｙ、Ｄ、Ｔ又はＳである）；
ＣＤＲ３
Ａ Ｒ Ｄ Ｖ Ｔ Ｓ Ｇ Ｉ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｘ１ Ａ Ｆ Ｎ Ｉ（配列番号７７）
（式中、Ｘ１はＡ又はＳである）。

本発明の抗ＦＯＬＲ１抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、次の構造式により包含され得、式中、Ｘは、可変性のアミノ酸を示し、これは、以下で指示されるような特定のアミノ酸であり得る：
ＣＤＲ１
Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｓ Ｓ Ｙ Ｓ（配列番号７８）
（式中、Ｘ１は、Ｓ又はＴである）；
ＣＤＲ２
Ｉ Ｘ１ Ｘ２ Ｓ Ｓ Ｘ３ Ｘ４ Ｉ（配列番号７９）
（式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｔ又はＤであり；
Ｘ２は、Ｓ、Ｒ又はＧであり；
Ｘ３は、Ｄ又はＳであり；
Ｘ４は、Ｔ又はＩである）；
ＣＤＲ３
Ａ Ｘ１ Ｖ Ｇ Ｌ Ｘ２ Ｆ Ｄ Ｙ（配列番号８０）
（式中、Ｘ１は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ２は、Ｄ又はＥである）。

代表的なＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、表１、２、３、４及び７で示される。

いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号１～５の何れか１つのＣＤＲ１配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号２又は４の何れか１つのＣＤＲ１配列を含む。特定の実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号２のＣＤＲ１配列を含む。特定の実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号４のＣＤＲ１配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号６～１７の何れか１つのＣＤＲ２配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号６～１１の何れか１つのＣＤＲ２配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号１０及び１２～１７の何れか１つのＣＤＲ２配列を含む。特定の実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号６のＣＤＲ２配列を含む。特定の実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号１６のＣＤＲ２配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号１８～２２の何れか１つのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号１８～１９の何れか１つのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号２０～２２の何れか１つのＣＤＲ３配列を含む。特定の実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号１９のＣＤＲ３配列を含む。特定の実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む。

さらなる実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号２の配列を含むＣＤＲ１配列と；配列番号６の配列を含むＣＤＲ２配列と；配列番号１９の配列を含むＣＤＲ３配列と、を含む。

さらなる実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号４の配列を含むＣＤＲ１配列と；配列番号１６の配列を含むＣＤＲ２配列と；配列番号２０の配列を含むＣＤＲ３配列と、を含む。

さらなる実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号２３～４９（表５）の重鎖可変領域アミノ酸配列の何れかを含む。

またさらなる実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号２６の重鎖可変領域配列を含む。またさらなる実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号４９の重鎖可変領域配列を含む。

さらなる実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号５２～７２の重鎖可変領域アミノ酸配列の何れかを含む（表８）。

またさらなる実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域配列を含む。またさらなる実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号７２の重鎖可変領域配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＦＯＬＲ１抗体におけるＣＤＲ配列は、配列番号１～２２の何れか１つにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列のセットと比較して、１つ又は２つのアミノ酸置換を含む（表１）。

いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、好ましくは、ＣＤＲ３配列が、表１、２、３、４又は７でＣＤＲ３配列が提供される抗体の何れか１つのＣＤＲ３配列に対してアミノ酸レベルで８０％以上、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、ＦＯＬＲ１に結合する。

いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、好ましくは、ＣＤＲ１、２及び３（合わせて）のフルセットが、表１、２、３、４又は７でＣＤＲ配列が提供される抗体のＣＤＲ１、２及び３（合わせて）に対してアミノ酸レベルで８５パーセント（８５％）以上の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、ＦＯＬＲ１に結合する。

いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号２３～４９（表５で示される）の重鎖可変領域配列の何れかに対して少なくとも約８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％の同一性がある重鎖可変領域配列を含み、ＦＯＬＲ１に結合する。

いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、配列番号５２～７２（表８で示される）の重鎖可変領域配列の何れかに対して少なくとも約８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％の同一性がある重鎖可変領域配列を含み、ＦＯＬＲ１に結合する。

いくつかの実施形態では、二特異性３本鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含むが限定されない本明細書中で論じられる配置の何れかを有し得る二特異性又は多特異性抗体が提供される。いくつかの実施形態では、多特異性抗体は、ＦＯＬＲ１に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域と、ＦＯＬＲ１以外のタンパク質に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域と、を含み得る。いくつかの実施形態では、多特異性抗体は、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む重鎖可変領域を含み得、ここで抗原結合ドメインのそれぞれは、ＦＯＬＲ１に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、多特異性抗体は、第１の抗原（例えばＣＤ３）に対する結合特異性を有する重鎖／軽鎖対及び重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）由来の重鎖を含み得る。特定の実施形態では、重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）由来の重鎖は、ＣＨ１ドメインの非存在下でＣＨ２及び／又はＣＨ３及び／又はＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分を含む。特定の一実施形態では、二特異性抗体は、エフェクター細胞上の抗原（例えばＴ細胞上のＣＤ３タンパク質）に対する結合特異性を有する重鎖／軽鎖対及びＦＯＬＲ１に対する結合特異性を有する抗原結合ドメインを含む重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）由来の重鎖を含む。

いくつかの実施形態では、多特異性抗体は、軽鎖可変ドメインと対形成するＣＤ３結合ＶＨドメインを含む。特定の一実施形態では、軽鎖は、固定された軽鎖である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ＶＨドメインは、ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号８３のＣＤＲ１配列と、配列番号８４のＣＤＲ２配列と、配列番号８５のＣＤＲ３配列と、を含む。いくつかの実施形態では、固定された軽鎖は、ヒトＶＬフレームワークにおいて配列番号８６のＣＤＲ１配列と、配列番号８７のＣＤＲ２配列と、配列番号８８のＣＤＲ３配列と、を含む。まとめると、ＣＤ３結合ＶＨドメイン及び軽鎖可変ドメインは、ＣＤ３に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３－結合ＶＨドメインは、配列番号８９の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ＶＨドメインは、配列番号８９の重鎖可変領域配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％パーセントの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、固定された軽鎖は、配列番号９０の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、固定された軽鎖は、配列番号９０の重鎖可変領域配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％のパーセントの同一性を有する配列を含む。

上記のＣＤ３－結合ＶＨドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む多特異性抗体は、例えば、その開示がその全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１８／０５２５０３号パンフレットに記載のような有利な特性を有する。ＦＯＬＲ１に対する結合親和性を有する本明細書中に記載の多特異性抗体及び抗原結合ドメインの何れも、１つ以上のＦＯＬＲ１エピトープ並びにＣＤ３に対する結合親和性を有する多特異性抗体を作製するために、本明細書中（例えば、表１０及び表１１を参照）及びその開示がその全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１８／０５２５０３号パンフレットに記載されるＣＤ３結合ドメイン及び固定された軽鎖ドメインの何れか並びに表１２及び表１３で提供されるものなどのさらなる配列と組み合わせられ得る。

いくつかの実施形態では、二特異性３本鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含むが限定されない本明細書中で論じられる配置の何れかを有し得る二特異性又は多特異性抗体が提供される。いくつかの実施形態では、二特異性抗体は、ＦＯＬＲ１に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域及びＦＯＬＲ１以外のタンパク質に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域を含み得る。いくつかの実施形態では、二特異性抗体は、第１の抗原に対する結合特異性を有する重鎖／軽鎖対と、ＣＨ１ドメインの非存在下でＣＨ２及び／又はＣＨ３及び／又はＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分を含む重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）由来の重鎖と、第２の抗原のエピトープ又は第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインと、を含み得る。特定の一実施形態では、二特異性抗体は、エフェクター細胞上の抗原（例えばＴ細胞上のＣＤ３タンパク質）に対する結合特異性を有する重鎖／軽鎖対と、ＦＯＬＲ１に対する結合特異性を有する抗原結合ドメインを含む重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）由来の重鎖と、を含む。

本発明の抗体が二特異性抗体であるいくつかの実施形態では、抗体の１つのアーム（１つの結合部分又は１つの結合単位）は、ヒトＦＯＬＲ１に特異的であり、その一方で、他のアームが、標的細胞、腫瘍関連抗原、標的化抗原、例えばインテグリンなど、病原体抗原、チェックポイントタンパク質などに特異的であり得る。標的細胞は具体的に、例えば癌腫、例えば卵巣及び子宮癌（例えば、高悪性度漿液性癌腫、類子宮内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ）、低悪性度漿液性癌腫、明細胞癌腫、粘液性の癌腫及び子宮内膜癌）、肺癌、腎臓癌、結直腸癌、乳癌並びに脳癌（例えば神経膠腫、神経膠芽腫）などの固形腫瘍からの細胞を含むが限定されない癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、抗体の１つのアーム（１つの結合部分又は１つの結合単位）がＦＯＬＲ１に特異的であり、一方で他のアームはＣＤ３に特異的である。

いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９５の配列に連結される配列番号９０の配列を含む抗ＣＤ３軽鎖ポリペプチドと、配列番号９６、９７、９８、９９及び１０３の何れか１つの配列を含む抗ＣＤ３重鎖ポリペプチドと、配列番号９６、９７、９８、９９、１００又は１０１の何れか１つの配列に連結される、１価又は２価配置の、配列番号２３～４８又は５２～７１の何れか１つの配列を含む抗ＦＯＬＲ１重鎖ポリペプチドと、を含む。これらの配列は、所望のＩｇＧサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ４、サイレンシングされたＩｇＧ１、サイレンシングされたＩｇＧ４の二特異性抗体を作製するために様々な方法で組み合わせられ得る。好ましい一実施形態では、抗体は、配列番号１０２を含む第１のポリペプチドと、配列番号１０３を含む第２のポリペプチドと、配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９を含む第３のポリペプチドと、を含むＴＣＡである。好ましい一実施形態では、抗体は、配列番号１０２からなる第１のポリペプチドと、配列番号１０３からなる第２のポリペプチドと、配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９からなる第３のポリペプチドと、からなるＴＣＡである。

本発明の態様は、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する抗原特異性を提供する１つ以上の結合ドメインとしての使用のための、ＣＡＲ－Ｔ形式である、本明細書中で記載のような１つ以上の抗体配列を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号１～５の何れか１つを含むＣＤＲ１配列と、配列番号６～１７の何れか１つを含むＣＤＲ２配列と、配列番号１８～２２の何れか１つを含むＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域を含む、細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号２を含むＣＤＲ１配列と、配列番号６を含むＣＤＲ２配列と、配列番号１９を含むＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域を含む細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号４を含むＣＤＲ１配列と、配列番号１６を含むＣＤＲ２配列と、配列番号２０を含むＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域を含む細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号２３～７４の何れか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域を含む、細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号２３～７４の何れか１つを含む重鎖可変領域を含む、細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号２６、配列番号４９、配列番号６１及び配列番号７２からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む、細胞外抗原結合ドメインを含む。本発明の態様は、本明細書中に記載のようなＣＡＲ－Ｔ細胞を含む医薬組成物並びに治療的有効量の本明細書中に記載のようなＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することを含む処置の方法を含む。

多特異性抗体の様々な形式は本発明の範囲内にあり、例えば、１本鎖ポリペプチド、２本鎖ポリペプチド、３本鎖ポリペプチド、４本鎖ポリペプチド及びそれらの複合を含むが限定されない。本明細書中で多特異性抗体は具体的に、ＦＯＬＲ１及びＣＤ３に結合するＴ細胞多特異性（例えば二特異性）抗体（抗ＦＯＬＲ１ ｘ 抗ＣＤ３抗体）を含む。このような抗体は、強力なＴ細胞介在性のＦＯＬＲ１発現細胞の死滅を誘導する。

抗ＦＯＬＲ１抗体の調製
本発明の抗体は、当技術分野で公知の方法によって調製され得る。好ましい実施形態では、本明細書中の抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子がノックアウトされるか又は無効にされているトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウス及びラット、好ましくはラットによって産生される。好ましい実施形態では、本明細書中の重鎖抗体は、ＵｎｉＲａｔ（商標）において作製される。ＵｎｉＲａｔ（商標）の内因性免疫グロブリン遺伝子をサイレンシングし、ヒト免疫グロブリン重鎖トランス遺伝子座を使用して、完全ヒトＨＣＡｂの多様な天然に最適化されたレパートリーを発現させる。ラットの内因性免疫グロブリン遺伝子座は様々な技術を使用してノックアウト又はサイレンシングし得るが、ＵｎｉＲａｔ（商標）では、ジンクフィンガー（エンド）ヌクレアーゼ（ＺＮＦ）技術を使用して、内因性ラット重鎖Ｊ遺伝子座、軽鎖Ｃκ遺伝子座及び軽鎖Ｃλ遺伝子座を不活性化した。卵母細胞へのマイクロインジェクションのためのＺＮＦコンストラクトは、ＩｇＨ及びＩｇＬノックアウト（ＫＯ）株を産生させ得る。詳しくは、例えば、Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５：４３３を参照。Ｉｇ重鎖ノックアウトラットの特性は、Ｍｅｎｏｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：２９３２－２９４１により報告されている。ＺＮＦ技術の利点は、数ｋｂまでの欠失によって遺伝子又は遺伝子座をサイレンシングするために連結する非相同末端が、相同組込みのための標的部位を提供することもできることである（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：６４－６７）。ＵｎｉＲａｔ（商標）で産生されるヒト重鎖抗体は、ＵｎｉＡｂ（商標）と呼ばれ、従来の抗体で攻撃することができないエピトープに結合し得る。それらの高い特異性、親和性及び小さいサイズのために、それらは、単一特異性及び多特異性用途に理想的である。

ＵｎｉＡｂ（商標）に加えて、ラクダ科動物のＶＨＨフレームワーク及び突然変異を欠く重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）並びにそれらの機能的ＶＨ領域が、本明細書中に具体的に含まれる。このような重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、例えば、国際公開第２００６／００８５４８号パンフレットに記載されているように、完全ヒト重鎖単独遺伝子座を含むトランスジェニックラット又はマウスにおいて産生され得るが、ウサギ、モルモット、ラットなどの他のトランスジェニック哺乳動物も使用され得、ラット及びマウスが好ましい。重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（それらのＶＨＨ又はＶＨ機能性断片を含む）は、組み換えＤＮＡ技術、例えば哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は酵母を含む好適な真核又は原核宿主中でのコード核酸の発現によっても産生され得る。

重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）のドメインは、抗体及び低分子薬の利点を兼ね備え、１価又は多価であり得、毒性が低く、製造するための費用効率が高い。それらのサイズが小さいため、これらのドメインは経口又は局所投与を含む投与が容易であり、胃腸における安定性を含む高い安定性を特徴とし、それらの半減期は、所望の使用又は適応に合わせ得るさらに、ＨＣＡｂのＶＨ及びＶＨＨドメインは、費用効率の高い方法で製造され得る。

特定の実施形態では、ＵｎｉＡｂ（商標）を含む本発明の重鎖抗体は、ＦＲ４領域の第１の位置（Ｋａｂａｔナンバリングシステムによるアミノ酸位置１０１）に、別のアミノ酸残基によって置換されたネイティブアミノ酸残基を有し、このアミノ酸残基はその位置においてネイティブアミノ酸残基を含むか又は天然アミノ酸残基と結合している表面露出疎水性パッチを破壊することが可能である。このような疎水性パッチは通常、抗体軽鎖定常領域との界面に埋め込まれるが、ＨＣＡｂでは表面露出され、少なくとも部分的に、ＨＣＡｂの望ましくない凝集及び軽鎖結合のためである。置換されたアミノ酸残基は好ましくは荷電しており、より好ましくは正に荷電しており、例えば、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、好ましくはアルギニン（Ｒ）である。好ましい実施形態では、トランスジェニック動物由来の重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、１０１位にＴｒｐからＡｒｇへの突然変異を含有する。得られるＨＣＡｂは、好ましくは、高い抗原結合親和性及び凝集なしの生理学的条件下での溶解性を有する。

本発明の一部として、ＥＬＩＳＡタンパク質及び細胞結合アッセイにおいて、ヒトＦＯＬＲ１に結合する、ＵｎｉＲａｔ（商標）動物由来の特有の配列を有するヒトＩｇＧ抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体（ＵｎｉＡｂ（商標））を同定した。同定された重鎖可変領域（ＶＨ）配列は、ヒトＦＯＬＲ１タンパク質結合に対して及び／又はＦＯＬＲ１＋細胞に対する結合について陽性であり、ＦＯＬＲ１を発現しない細胞への結合について全て陰性である。例えば表１４を参照。

ＦＯＬＲ１タンパク質上の非重複エピトープに結合する重鎖抗体、例えばＵｎｉＡｂｓ（商標）は、競合結合アッセイ、例えば酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡアッセイ）又はフローサイトメトリー競合結合アッセイなどによって同定され得る。例えば、標的抗原に結合する既知の抗体と関心対象の抗体との間の競合を使用し得る。このアプローチを使用することにより、抗体のセットを、参照抗体と競合するものと競合しないものとに分け得る。非競合抗体は、参照抗体が結合するエピトープと重複しない別個のエピトープへの結合として同定される。多くの場合、１つの抗体を固定化し、抗原を結合させ、第２の標識した（例えばビオチン化した）抗体を、捕捉された抗原に結合する能力についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験する。これは、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ）、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００及びＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＭＸ９６ ＳＰＲイメージャ（Ｉｂｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ．Ｖ．）を含む表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）プラットフォームを使用することにより、並びにＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４及びＯｃｔｅｔ ＨＴＸ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ Ｉｎｃ）などのバイオレイヤー干渉プラットフォーム上でも行われ得る。さらなる詳細については、本明細書中の実施例を参照。

典型的には、抗体は、標準的な技術、例えば上記の競合結合アッセイによって決定されるように、標的抗原に対する参照抗体の結合の約１５～１００％の減少を引き起こす場合、参照抗体と「競合する」。種々の実施形態では、相対阻害率は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％以上である。

医薬組成物、使用及び処置の方法
本発明の別の態様は、本発明の１つ以上の抗体を好適な薬学的に許容可能な担体と混合して含む医薬組成物を提供することである。本明細書中で使用されるような薬学的に許容可能な担体としては、アジュバント、固体担体、水、緩衝液若しくは治療成分を保持するために当技術分野で使用されている他の担体又はこれらの組み合わせが例示されるが限定されない。

一実施形態では、医薬組成物は、ＦＯＬＲ１に結合する重鎖抗体（例えばＵｎｉＡｂ（商標））を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、ＦＯＬＲ１タンパク質上の２つ以上の非重複エピトープに対する結合特異性がある多特異性（二特異的性を含む）重鎖抗体（例えばＵｎｉＡｂ（商標））を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ＦＯＬＲ１への結合特異性及びエフェクター細胞上の結合標的への結合特異性（例えばＴ細胞上の結合標的、例えばＴ細胞上のＣＤ３タンパク質）がある多特異性（二特異性及びＴＣＡを含む）重鎖抗体（例えばＵｎｉＡｂ（商標））を含む。

本開示に従って使用される抗体の医薬組成物は、保管のために、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態などで、所望の純度を有するタンパク質を任意選択的な薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合することによって調製される（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照）。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して毒性がなく、それらには、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類及び、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎタンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは、無菌で且つ実質的に等張であり、適正製造基準（ＧＭＰ）条件下で製造される。医薬組成物は単位剤形（即ち単回投与のための剤形）で提供され得る。製剤は、選択される投与経路に依存する。本明細書中の抗体は、静脈内注射若しくは注入により又は皮下に投与され得る。注射投与のために、本明細書中の抗体は、水溶液中で、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化されて、注射部位の不快感を軽減し得る。溶液は、上で論じられるように、担体、賦形剤又は安定剤を含有し得る。代わりに、抗体は、使用前に好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水、での構成のために、凍結乾燥された形態であり得る。

例えば米国特許第９，０３４，３２４号明細書において抗体製剤が開示される。本発明の、ＵｎｉＡｂｓ（商標）を含む、重鎖抗体に対して、同様の製剤が使用され得る。皮下抗体製剤は、例えば、米国特許出願公開第２０１６０３５５５９１号明細書及び米国特許出願公開第２０１６０１６６６８９号明細書に記載されている。

使用方法
本明細書中に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体及び医薬組成物は、本明細書中でさらに記載される状態及び疾患を含むが限定されないＦＯＬＲ１の発現を特徴とする疾患及び状態の処置のために使用され得る。

ＦＲα（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１５３２８；ＨＧＮＣ ＩＤ ３７９１）としても知られるＦＯＬＲ１は、葉酸及び還元葉酸誘導体に結合し、５－メチルテトラヒドロ葉酸の細胞内送達に介在するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合膜タンパク質である。ＦＯＬＲ１は、中性ｐＨで葉酸に高い親和性がある２１０アミノ酸の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有する。内部移行時、酸性ｐＨにより、ＦＯＬＲ１が、ＦＯＬＲ１の葉酸に対する親和性を低下させる立体構造変化を受けるようになるが、これは葉酸の放出に介在し、続いて細胞表面へＦＯＬＲ１を再循環させる。Ｗｉｂｏｗｏ ＡＳ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ １７；１１０（３８）：１５１８０－８。ＦＯＬＲ１は、卵巣、乳房、肺、腎臓、結直腸及び脳を含む多くの固形腫瘍タイプで過剰発現され、また腎臓、肺、網膜及び脳などの正常で健康な組織上でのＦＯＬＲ１発現は、上皮の頂端膜側に制限され、循環中のＦＯＬＲ１標的物質へのそれらの曝露が少なくなり、それによりＦＯＬＲ１は魅力的な治療標的となる。Ｃｈｅｕｎｇ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ａｕｇ ９；７（３２）：５２５５３－５２５７４。ＦＯＬＲ１は、ＦＯＬＲ１陽性腫瘍の画像及び診断にも適切であり得、さらに可溶性ＦＯＬＲ１は、卵巣癌がある患者において上昇していることが報告されている。Ｋｕｒｏｓａｋｉ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１６ Ａｐｒ １５；１３８（８）：１９９４－２００２。ＦＯＬＲ１に特異的ないくつかのモノクローナル抗体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）及び葉酸薬物複合体が記載されている。Ｃｈｅｕｎｇ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ａｕｇ ９；７（３２）：５２５５３－５２５７４。さらに、抗ＦＯＬＲ１キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、卵巣癌の処置に対して治験中である。Ｋｅｒｓｈａｗ ＭＨ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ｏｃｔ；１２：６１０６－１５；Ｓｏｎｇ ＤＧ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ｊｕｌ １；７１（１３）：４６１７－２７。

一態様では、本明細書中の抗ＦＯＬＲ１抗体（例えばＵｎｉＡｂｓ（商標））及び医薬組成物は、固形腫瘍、例えば卵巣及び子宮癌（例えば、高悪性度漿液性癌腫、類子宮内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ）、低悪性度漿液性癌腫、明細胞癌腫、粘液性の癌腫及び子宮内膜癌）、肺癌、腎臓癌、結直腸癌、乳癌並びに脳癌（例えば神経膠腫、神経膠芽腫）などの癌腫を含むが限定されないＦＯＬＲ１の発現を特徴とする障害を処置するために使用され得る。

疾患の処置のための本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、他の薬剤の投与及び処置が予防的であるか又は治療的であるかを含む多くの異なる因子に依存して変動する。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどのコンパニオン動物、ウサギ、マウス、ラットなどの実験用哺乳動物も処置され得る。処置投与量は、安全性及び有効性を最適化するために用量設定され得る。

投与量レベルは通常の技術を有する臨床医によって容易に決定され得、必要に応じて、例えば、治療に対する対象の応答を変更するために必要に応じて変更し得る。単一の剤形を生成させるために担体材料と組み合わせられ得る有効成分の量は、処置される宿主及び特定の投与方式に応じて変動する。単位剤形は、一般に、約１ｍｇ～約５００ｍｇの有効成分を含有する。

いくつかの実施形態では、薬剤の治療投与量は宿主体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重若しくは１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な処置レジメンは、２週間ごと又は１カ月に１回若しくは３～６カ月ごとの投与を伴う。本発明の治療物質は、通常、複数回投与される。単回投与間の間隔は、毎週、毎月又は毎年であり得る。間隔は、患者における治療物質の血中レベルを測定することによって示されるように不規則でもあり得る。代わりに、本発明の治療物質は、徐放性製剤として投与され得、その場合、投与頻度をより少なくする必要がある。投与量及び頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期に応じて変動する。

典型的には、組成物は溶液又は懸濁液の何れかとしての注射剤として調製され、注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に適した固体形態を調製することもできる。本明細書中の医薬組成物は、直接の又は固体（例えば凍結乾燥）組成物の再構成後の静脈内又は皮下投与に好適である。調製物は、上述のように、アジュバント効果を高めるために、ポリラクチド、ポリグリコリド又はコポリマーなどのリポソーム又は微粒子中に乳化又はカプセル化することもできる。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７，１９９０及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７－１１９，１９９７。本発明の薬剤は、有効成分の持続放出又はパルス放出を可能にするような方式で製剤化され得るデポ注射又はインプラント製剤の形態で投与され得る。本医薬組成物は、一般に、無菌であり、実質的に等張であり、米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規則を完全に遵守して製剤化される。

本明細書中に記載の抗体及び抗体構造体の毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬的手順により、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）又はＬＤ１００（集団の１００％に致死的な用量）を決定することにより決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数である。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトでの使用に対して毒性ではない投与量範囲を処方する際に使用し得る。本明細書中に記載の抗体の投与量は、毒性が殆どないか又は全くない有効用量を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路及び投与量は、個々の医師により、患者の状態を考慮して選択され得る。

投与のための組成物は一般に、薬学的に許容可能な担体、好ましくは水性担体中で溶解された抗体又は他のアブラティブ剤を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などを使用し得る。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。本組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤などの生理学的条件に近似するために必要とされる薬学的に許容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は広く変動し得、選択された特定の投与方式及び患者の必要性に従い、主に流体体積、粘度、体重などに基づいて選択される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ ｅｄ．，１９８０）及びＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｌｍａｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９６））。

本発明の活性物質及びその処方物及び使用説明書を含むキットも本発明の範囲内にある。本キットは、少なくとも１つのさらなる薬剤、例えば化学療法薬などをさらに含有し得る。キットは、典型的には、キットの内容物の意図される使用を示すラベルを含む。「ラベル」という用語は、本明細書中で使用される場合、キット上で又はキットとともに供給されるか、又はそうでなければキットに添付される、何らかの書面又は記録素材を含む。

ここで、本発明を十分に説明するが、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、様々な変更形態及び修正形態がなされ得ることは当業者にとって明らかであろう。

実施例１：抗ＦＯＬＲ１ ＵｎｉＡｂｓ（商標）によるＦＯＬＲ１陽性及び陰性細胞に対する結合のフローサイトメトリー分析
表１４は、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体（ＨＣＡｂ）の標的結合活性をまとめる。カラム１は、ＨＣＡｂのクローンＩＤを示す。カラム２は、バックグラウンドＭＦＩシグナルに対する倍率として測定される、ＦＯＬＲ１陽性ＩＧＲＯＶ－１細胞への結合を示す。カラム３は、バックグラウンドＭＦＩシグナルに対する倍率として測定される、ヒトＦＯＬＲ１を安定して発現するＣＨＯ細胞への結合を示す。カラム４は、バックグラウンドＭＦＩシグナルに対する倍率として測定される、ｃｙｎｏ ＦＯＬＲ１を安定して発現するＣＨＯ細胞への結合を示す。カラム５は、バックグラウンドＭＦＩシグナルに対する倍率として測定される、ＦＯＬＲ１タンパク質を発現しないＣＨＯ細胞への結合を示す。

実施例２：ＦＯＬＲ１陽性細胞株への抗ＦＯＬＲ１ ＨＣＡｂの結合
指示される抗体の量を漸増させて、ＩＧＲＯＶ－１細胞、ＯＶＣＡＲ－３細胞、ヒトＦＯＬＲ１を安定して発現するＣＨＯ細胞、ｃｙｎｏ ＦＯＬＲ１を安定して発現するＣＨＯ細胞及びマウスＦＯＬＲ１を安定して発現するＣＨＯ細胞を温置し、結合の特徴を分析した。データは、バックグラウンドに対するＭＦＩ倍率として図１、パネルＡ～Ｅで示す。

実施例３：抗ＦＯＬＲ１ ＨＣＡｂの標的細胞結合
表１５は、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体（ＨＣＡｂ）の標的細胞結合ＥＣ５０値をまとめる。カラム１は、ＨＣＡｂのクローンＩＤを示す。カラム２は、ＩＧＲＯＶ－１細胞に対するｎＭ単位での細胞結合ＥＣ５０値を示す。カラム３は、ＯＶＣＡＲ－３ 細胞に対するｎＭ単位での細胞結合ＥＣ５０値を示す。カラム４は、ヒトＦＯＬＲ１を安定して発現するＣＨＯ細胞に対するｎＭ単位での細胞結合ＥＣ５０値を示す。カラム５は、ｃｙｎｏ ＦＯＬＲ１を安定して発現するＣＨＯ細胞に対するｎＭ単位での細胞結合ＥＣ５０値を示す。カラム６は、マウスＦＯＬＲ１を安定して発現するＣＨＯ細胞に対するｎＭ単位での細胞結合ＥＣ５０値を示す。

実施例４：ＦＯＬＲ２及びＩＺＵＭＯ１Ｒ陽性細胞株への抗ＦＯＬＲ１ ＨＣＡｂの結合
ヒトＦＯＬＲ２（葉酸受容体ベータ、ＦＲβとしても知られる）を安定して発現するＣＨＯ細胞及びヒトＩＺＵＭＯ１Ｒ（葉酸受容体デルタ、ＦＯＬＲ４、ＦＲδ、ＪＵＮＯとしても知られる）を安定して発現するＣＨＯ細胞への抗ＦＯＬＲ１ ＨＣＡｂ結合をいくつかの異なるクローンについて分析した。データは、バックグラウンドに対するＭＦＩ倍率として図２、パネルＡ～Ｂで示す。挿入図は、薄灰色の個々のアイソタイプ対照と比較した、濃灰色のそれぞれ陽性対照抗ＦＯＬＲ２及び抗ＩＺＵＭＯ１Ｒ抗体の結合を示す。

実施例５：抗ＦＯＬＲ１ ＨＣＡｂ結合分析
表１６は、ＦＯＬＲ３（葉酸受容体γ、ＦＲγとしても知られる）に対する抗ＦＯＬＲ１ ＨＣＡｂのＢＬＩ（Ｏｃｔｅｔ）結合実験をまとめる。抗ＦＯＬＲ３抗体をＢＬＩ応答に対する陽性対照として含めた。

実施例６：抗ＦＯＬＲ１ ＨＣＡｂに対する結合親和性及びエピトープビニングの分析
表１７は、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体（ＨＣＡｂ）に対する親和性及びエピトープビン情報をまとめる。カラム１は、ＨＣＡｂのクローンＩＤを示す。カラム２は、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ－３８４を使用してバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により測定される場合の組み換えヒトＦＯＬＲ１へのＨＣＡｂの親和性を示す。カラム３は、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ－３８４を使用した競合ＢＬＩ結合実験により決定される場合のＨＣＡｂのエピトープビンを示す。

実施例７：休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた１価二特異性抗体が介在するＳＫＯＶ－３ヒト腫瘍細胞の死滅
休止期のヒトＴ細胞の存在下で二特異性抗体の量を漸増させてＦＯＬＲ１－陽性腫瘍細胞株ＳＫＯＶ－３を温置し、その結果、特異的な腫瘍細胞溶解及びＩＬ－２及びＩＦＮγのサイトカイン放出が起こった。結果をそれぞれ図３、パネルＡ、Ｂ及びＣで提供する。二特異性抗体は、図３、パネルＤにおいて示される抗ＦＯＬＲ１ ＶＨ結合ドメインと対形成する抗ＣＤ３結合アームから構成された（クローンＩＤ：３６１０２７）。同じ形式で同じ抗ＦＯＬＲ１ ＶＨを有するＦＯＬＲ１ ｘ ＣＤ３＿ＯＫＴ３二特異性抗体を陽性対照として含めた。ＦＯＬＲ１に結合しないＶＨ結合ドメインを含む陰性対照抗体は、特異的な溶解を呈さなかった（データは示さない）。ＦＯＬＲ１陰性ＣＨＯ細胞は特異的な溶解を呈さなかった（データは示さない）。

実施例８：休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた１価二特異性抗体が介在するＳＫＯＶ－３ヒト腫瘍細胞の死滅
休止期のヒトＴ細胞の存在下で二特異性抗体の量を漸増させて、ＦＯＬＲ１－陽性腫瘍細胞株ＳＫＯＶ－３を温置し、その結果、特異的な腫瘍細胞溶解及びＩＬ－２及びＩＦＮγのサイトカイン放出が起こった。この結果を図４、パネルＡ、Ｂ及びＣでそれぞれ提供する。二特異性抗体は、図４、パネルＤで示される抗ＦＯＬＲ１ ＶＨ結合ドメインと対形成される抗ＣＤ３結合アームから構成された（クローンＩＤ：３６１０２９）。同じ方式で同じ抗ＦＯＬＲ１ ＶＨを有するＦＯＬＲ１ ｘ ＣＤ３＿ＯＫＴ３二特異性抗体を陽性対照として含めた。

実施例９：休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた２価二特異性抗体が介在するＳＫＯＶ－３ヒト腫瘍細胞の死滅
休止期のヒトＴ細胞の存在下で２価二特異性抗体の量を漸増させてＦＯＬＲ１－陽性腫瘍細胞株ＳＫＯＶ－３を温置し、その結果、特異的な腫瘍細胞溶解及びＩＬ－２及びＩＦＮγのサイトカイン放出が起こった。その結果を図５、パネルＡ、Ｂ及びＣでそれぞれ示す。２価二特異性抗体は、図５、パネルＤで指示される抗ＦＯＬＲ１ ＶＨ 結合ドメインと対形成する抗ＣＤ３結合アームから構成された（クローンＩＤ：３８０３２３）。同じ形式で同じ抗ＦＯＬＲ１ ＶＨを有する２価ＦＯＬＲ１ ｘ ＣＤ３＿ＯＫＴ３二特異性抗体を陽性対照として含めた。

実施例１０：休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた２価二特異性抗体が介在するＳＫＯＶ－３ヒト腫瘍細胞の死滅
休止期のヒトＴ細胞の存在下で２価二特異性抗体の量を漸増させてＦＯＬＲ１－陽性腫瘍細胞株ＳＫＯＶ－３を温置し、その結果、特異的な腫瘍細胞溶解及びＩＬ－２及びＩＦＮγのサイトカイン放出が起こった。その結果をそれぞれ図６、パネルＡ、Ｂ及びＣで示す。２価二特異性抗体は、図６、パネルＤで示される抗ＦＯＬＲ１ ＶＨ結合ドメインと対形成される抗ＣＤ３結合アームから構成された（クローンＩＤ：３８０３２７）。同じ形式で同じ抗ＦＯＬＲ１ ＶＨを有する２価ＦＯＬＲ１ ｘ ＣＤ３＿ＯＫＴ３二特異性抗体を陽性対照として含めた。

実施例１１：休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた２価二特異性抗体が介在するＨＴ－２９ヒト腫瘍細胞の死滅
休止期のヒトＴ細胞の存在下で２価二特異性抗体の量を漸増させて低ＦＯＬＲ１－陽性腫瘍細胞ＨＴ－２９を温置し、その結果、ＩＬ－２及びＩＦＮγの特異的な腫瘍細胞溶解及びサイトカイン放出が起こった。その結果をそれぞれ図７、パネルＡ、Ｂ及びＣで示す。２価二特異性抗体は、図７、パネルＤで指示される抗ＦＯＬＲ１ ＶＨ結合ドメインと対形成される抗ＣＤ３結合アームから構成された（クローンＩＤ：３８０３２７）。同じ形式で同じ抗ＦＯＬＲ１ ＶＨを有する２価ＦＯＬＲ１ ｘ ＣＤ３＿ＯＫＴ３二特異性抗体を陽性対照として含めた。

実施例１２：様々なエフェクターと標的との比率での、休止期Ｔ細胞のリダイレクトを通じた２価二特異性抗体が介在するＳＫＯＶ－３ヒト腫瘍細胞の死滅
休止期のヒトＴ細胞（エフェクター）と腫瘍細胞（標的）との様々な比率の存在下で、２価二特異性抗体の量を漸増させて、ＦＯＬＲ１－陽性腫瘍細胞株ＳＫＯＶ－３を温置し、その結果、特異的な腫瘍細胞溶解が起こった。その結果を図８、パネルＡで示す。２価二特異性抗体は、図８、パネルＢで指示される抗ＦＯＬＲ１ ＶＨ結合ドメインと対形成される抗ＣＤ３結合アームから構成された（クローンＩＤ：３８０３２７）。

実施例１３：１価及び２価二特異性抗体のマウスでの薬物動態
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける１価二特異性抗体（クローンＩＤ：３６１０２７及び３６１０２９）及び２価二特異性抗体（クローンＩＤ：３８０３２７及び３８０３３３）の単回投与（１ｍｇ／ｋｇ）薬物動態。データは、指定の時間点の血清濃度として図９で示す。

実施例１４：ＩＧＲＯＶ－１腫瘍モデルにおける２価二特異性抗体のインビボでの有効性
ヒト化マウス異種移植モデルにおいて２価二特異性抗体の抗腫瘍効果を評価した。図１０パネルＡは、マウスモデルの概略図を示す。皮下注射を介して５ ｘ １０^６個のＩＧＲＯＶ－１細胞を、及び腹腔内注射を介して１０ ｘ １０^６個の活性化ヒトＰＢＭＣを雌ＮＣＧマウスに移植した。抗ＦＯＬＲ１ ＶＨ結合ドメインと対形成された抗ＣＤ３結合アームから構成される２００μｇの２価二特異性抗体（クローンＩＤ：３８０３２７）又は陽性対照として含まれた１００μｇの抗ＦＯＬＲ１ ＶＨを伴う１価ＦＯＬＲ１ ｘ ＣＤ３＿ＯＫＴ３二特異性抗体（クローンＩＤ：３６１０２７）の何れかの静脈内注射によってマウスを３日ごとに処置した。データは、腫瘍体積測定としてパネルＢで示す。

実施例１５：正常及び悪性細胞におけるＦＯＬＲ１発現
ＦＯＬＲ１（ＦＲα）は、肺及び腎臓を含む正常で健康な組織で発現され、Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）でＦＯＬＲ１を標的とした結果、オンターゲット、オフ腫瘍毒性が起こり得る。様々な卵巣及び他の固形腫瘍細胞株並びに正常初代細胞上でのＦＯＬＲ１の細胞表面発現を定量した。ＦＯＬＲ１陽性腫瘍細胞株の細胞表面上のＦＯＬＲ１分子の数（抗原密度）をフローサイトメトリーによって定量した。卵巣腫瘍細胞株ＯＶＣＡＲ－３、ＳＫＯＶ－３及びＩＧＲＯＶ－１上でのＦＯＬＲ１抗原密度は、４４ ｘ １０^３～１，８７１ ｘ １０^３の範囲であり（図１１）、再発卵巣癌患者の臨床試料中で観察された範囲を再現した。対して、正常初代肺胞及び気管支上皮肺細胞は、それぞれ０．１ ｘ １０^３及び０．８ ｘ １０^３ＦＯＬＲ１／細胞を発現し、腎臓皮質上皮細胞は、６．７ ｘ １０の^３ＦＯＬＲ１／細胞を発現する（図１１）。ＦＯＬＲ１発現は、脈絡叢及び網膜上皮細胞上でも報告されている（Ｓｍｉｔｈ ＳＢ，Ｋｅｋｕｄａ Ｒ，Ｇｕ Ｘ，Ｃｈａｎｃｙ Ｃ，Ｃｏｎｗａｙ ＳＪ，Ｇａｎａｐａｔｈｙ Ｖ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｒｅｔｉｎｏｌ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ａｎｄ ｒｅｔｉｎａ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ １９９９；４０（５）：８４０－８；Ｗｅｉｔｍａｎ ＳＤ，Ｌａｒｋ ＲＨ，Ｃｏｎｅｙ ＬＲ，Ｆｏｒｔ ＤＷ，Ｆｒａｓｃａ Ｖ，Ｚｕｒａｗｓｋｉ ＶＲ，Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＧＰ３８ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９２；５２（１２）：３３９６－４０１）。しかし、ここで、測定されるＦＯＬＲ１抗原密度は、それぞれ０．７ ｘ １０^３及び１．３ ｘ １０^３の範囲であった。ＦＯＬＲ１を発現することが報告される正常組織上での発現の上限は、７ ｘ １０^３の範囲であるので、ＦＯＬＲ１抗原密度が８ ｘ １０^３である結直腸腫瘍細胞株ＨＴ－２９が、その値以下でＴＣＥ依存性の細胞傷害性がないことが望まれるＦＯＬＲ１発現閾値を表す細胞株として選択された。２～５回の独立した実験の平均及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）として図１１で値を報告する。

実施例１６：細胞表面親和性及び腫瘍細胞溶解
ＴＮＢ－９２８Ｂと呼ばれる、ＦＯＬＲ１（ＦＲα）及びＣＤ３に結合する完全ヒト二特異性抗体を、その細胞表面結合の特徴及びＦＯＬＲ１＋腫瘍細胞の溶解能について評価した。図１２、パネルＡは、ノブ－イントゥ－ホール技術を使用して構築されたＴＮＢ－９２８Ｂの概略図を提供する。この概略図は、抗体の形式を示す。図１２、パネルＢは、ＩＧＲＯＶ－１細胞上で発現されるＦＯＬＲ１（ＦＲα）に対するＴＮＢ－９２８Ｂの細胞表面親和性を示す（スキャッチャード分析により決定される場合）。図１２、パネルＣは、４８時間後のＩＧＲＯＶ－１腫瘍細胞の細胞溶解を示す、Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ比１０：１）を用いた同時培養細胞傷害アッセイの結果を示す。

実施例１７：優先的なエフェクターＴ細胞活性化及び増殖
エフェクターＴ細胞を優先的に活性化し、それらの増殖を推進するためのその可能性についてＴＮＢ－９２８Ｂを評価した。図１３、パネルＡは、Ｅ：Ｔ比５：１での健康なドナーからのＴ細胞及びＳＫＯＶ－３腫瘍細胞の同時培養の４８時間後の、活性化マーカーＣＤ６９のフローサイトメトリー測定により測定される場合の、ＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化の結果を示す。図１３、パネルＢは、５：１のＥ：Ｔ比でのＩＧＲＯＶ－１腫瘍細胞との同時培養の７２時間後の、Ｋｉ６７のフローサイトメトリー測定により測定された場合の、ＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋細胞の増殖の結果を示す。図１３、パネルＣは、それぞれ８又は１６ｎＭのＰＣ又はＴＮＢ－９２８Ｂ処置から７２時間後に誘導されたＴｒｅｇ細胞のパーセンテージを評価するためにＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋発現でさらにゲーティングされたＣＤ４^＋Ｔ細胞を示す。＊ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意性なし。

実施例１８：高ＦＯＬＲ１発現腫瘍細胞の選択的溶解
低ＦＯＬＲ１発現細胞を残しながら高ＦＯＬＲ１（ＦＲα）発現腫瘍細胞の選択的溶解を誘導するためのその可能性について、ＴＮＢ－９２８Ｂを評価した。健康なドナー由来のＴ細胞との同時培養細胞傷害アッセイ（Ｅ：Ｔ比１０：１）を行った。結果を図１４で示す。パネルＡは、４８時間後のＳＫＯＶ－３腫瘍細胞（高ＦＯＬＲ１発現）の細胞溶解を示す。パネルＢは、４８時間後のＨＴ－２９細胞（低ＦＯＬＲ１発現）の細胞溶解を示す。結果は、ＴＮＢ－９２８Ｂが低ＦＯＬＲ１発現細胞を残しながら高ＦＯＬＲ１（ＦＲα）発現腫瘍細胞の選択的溶解を誘導したことを示す。

実施例１９：低サイトカイン放出を付随する腫瘍細胞溶解
高レベルのサイトカイン放出を誘導せずに腫瘍細胞溶解を誘導するためのその可能性についてＴＮＢ－９２８Ｂを評価した。３種類の健康なドナー由来のＴ細胞との同時培養細胞傷害アッセイ（Ｅ：Ｔ比５：１）を行った。細胞傷害アッセイから細胞培養上清のアリコートを回収し、ＩＬ－２及びＩＦＮγサイトカイン放出について分析した。ＩＧＲＯＶ－１及びＳＫＯＶ－３のロバストな溶解に介在するＴＮＢ－９２８Ｂの濃度で、ＩＬ－２及びＩＦＮγのレベルは、ドナーに関係なく、ＯＫＴ３含有ＰＣにより誘導されるものよりも低かった（図１５）。さらに、ＴＮＢ－９２８Ｂは、ＦＯＬＲ１（ＦＲα）陰性ＬＮＣａＰ細胞株に対して試験した場合、細胞傷害もＩＬ－２又はＩＦＮγ放出も示さなかった（図１５）。

実施例２０：患者由来卵巣腫瘍における腫瘍細胞溶解及びＴ細胞活性の媒介
患者由来卵巣腫瘍細胞において腫瘍細胞溶解及びＴ細胞活性を媒介するためのその可能性についてＴＮＢ－９２８Ｂを評価した。新たに分離された卵巣癌腫組織にＴＮＢ－９２８Ｂ、ＰＣ又はＮＣを添加し、４８～７２時間にわたり外来ＰＢＭＣを添加せずに温置した。結果を図１６で提供する。パネルＡは、１０ｎＭ ＰＣ、１００ｎＭ ＴＮＢ－９２８Ｂ又は１００ｎＭ ＮＣで処置した５名の異なる応答患者からの卵巣癌腫組織由来の細胞の最大細胞傷害性を示す。パネルＢは、レスポンダーのＦＯＬＲ１（Ｆｒα）の発現が非レスポンダーよりも高いことを示す。パネルＣは、ＬＤＨ放出により測定した場合の細胞傷害性の代表的な用量曲線を示し、パネルＤは、ＩＦＮγ放出を示し、パネルＥは、ＭＳＤにより測定した場合のＩＬ－２放出を示す。パネルＦは、Ｅ：Ｔ比１：１で患者適合ＰＢＭＣと７２時間温置した後にフローサイトメトリーにより測定した場合の、ＣＤ６９^＋Ｔｒｅｇを示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意性なし。

実施例２１：ＮＣＧマウス異種移植モデルにおける用量依存性の腫瘍退縮
ＮＣＧマウス異種移植モデルにおいて用量依存的に腫瘍退縮を誘導するためのその可能性についてＴＮＢ－９２８Ｂを評価した。モデル及び結果の詳細は図１７で提供する。ＮＣＧマウス（ｎ＝３匹／群）に、５ ｘ １０^６個のＩＧＲＯＶ－１細胞をｓ．ｃ．注射し、１０ ｘ １０^６個の休止期ｈＰＢＭＣをｉ．ｐ．注射した。移植後（ｐｉ）第３日に開始して、全部で９回の投与のために３日ごとに個々の用量でＴＮＢ－９２８Ｂをｉ．ｖ．注射した（下向き矢印で示す）。この試験の模式図をパネルＡで提供する。第３０日に腫瘍を回収し、抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ４５及び抗ヒトＦＲαを用いてＩＨＣにより染色した。陽性染色された細胞を定量し、結果をパネルＢで示す。１及び１０ｍｇ／ｋｇの単回尾静脈注射後にＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＴＮＢ－９２８ＢのＰＫを評価した。ＴＮＢ－９２８Ｂクリアランス（ＣＬ）は、７．９～１０．３ｍＬ／日／ｋｇの範囲であった。半減期（ｔ_１／２）は、ＴＮＢ－９２８Ｂに対して３．９～８日の範囲であった（図１７、パネルＣ）。ＴＮＢ－９２８Ｂのどちらのアームもげっ歯類種におけるＦＯＬＲ１（ＦＲα）又はＣＤ３とは交差反応しないので、観察される線形的なＰＫが予想され、これは非特異的クリアランス機序と一致する。これらの結果から、都合の良いＰＫで、及び従来の抗体と同様の半減期で、ＴＮＢ－９２８Ｂがインビボで安定であることが示唆される。

実施例２２：熱ストレス及び安定性の特徴
ＴＮＢ－９２８Ｂの生物物理学的特徴を評価し、結果を図１８及び図２１でまとめる。２０ｍＭクエン酸塩及び０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．２中で全ての抗体を処方した。３７℃での１カ月にわたる温度ストレスの前（Ｔ_０）及び後（Ｔ_３０）にＳＥＣ－ＵＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ ＨＰＬＣ）により高分子量種（ＨＭＷ）を測定した。パーセント低分子量（％ＬＭＷ）及び高分子量（％ＨＭＷ）を図１８においてＴ＝０及びＴ＝３０日で示す。４℃及び３７℃で１カ月の温置後にＴＮＢ－９２８Ｂ安定性を評価した。ＳＥＣ－ＵＰＬＣクロマトグラムを図２１で示す。

実施例２３：ＦＯＬＲ１価の効果
細胞傷害性アッセイにおけるＦＯＬＲ１ ｘ ＣＤ３ ＴＣＥのインビトロの機能活性に対するＦＯＬＲ１（ＦＲα）価の効果を調べるために、ＦＯＬＲ１ ＴＣＥと一緒に４８時間にわたり初代ヒト汎Ｔ細胞とともにＩＧＲＯＶ－１（高ＦＲα抗原密度）細胞を同時培養した。ＴＮＢ－９２８ＢがＩＧＲＯＶ－１の溶解に介在する能力を、ＦＯＬＲ１について１価である同じＶＨを含有する対応する二特異性抗体と比較した。ＩＧＲＯＶ－１腫瘍細胞の存在下で、ＴＮＢ－９２８Ｂ及び２価ＰＣ抗体の両方が、個々の１価抗体と比較して、より低いＥＣ_５０値で観察される結合活性効果を示した（効力の向上）（図１９）。重要なこととして、ＴＮＢ－９２８Ｂは、ＩＧＲＯＶ－１の～７５％が溶解する飽和用量でＰＣと比較して同様の最大腫瘍細胞溶解を示した。まとめると、これらのデータから、ＴＮＢ－９２８Ｂの２価形式が高ＦＯＬＲ１発現腫瘍細胞を死滅させるための強い結合活性効果を示し、ＴＮＢ－９２８ＢがＰＣと匹敵する最大活性を達成することが示される。

実施例２４：エクスビボ卵巣腫瘍試料の臨床的及び分子的特徴
新鮮患者由来エクスビボ卵巣腫瘍試料の臨床的及び分子的な特徴を評価し、その結果を図２０で提供する。「ＴＮＢ－９２８Ｂ％最大溶解」というタイトルのカラムは、４８～７２時間にわたる１００ｎＭ ＴＮＢ－９２８Ｂで処理された試料からのデータを表す。略語：ＨＧＳＣ、高悪性度漿液性癌腫；ＨＧＣ、高悪性度癌腫；ＬＧＥＳＳ、低悪性度子宮内膜間質肉腫；ＬＧＳＣ、低悪性度漿液性癌腫；ｎｄ、判定せず。

実施例２５：低いＥ：Ｔ比及びｓＦＯＬＲ１の存在下での活性
他のＧＰＩアンカードタンパク質のように、細胞表面からＦＯＬＲ１が切断される。卵巣癌患者の血清中で及び初期及び進行性の卵巣癌患者の両方で可溶性ＦＯＬＲ１タンパク質（ｓＦＯＬＲ１；ｓＦＲα）が上昇し、高ｓＦＯＬＲ１は、より短いＰＦＳと関連する（Ｋｕｒｏｓａｋｉ Ａ，Ｈａｓｅｇａｗａ Ｋ，Ｋａｔｏ Ｔ，Ａｂｅ Ｋ，Ｈａｎａｏｋａ Ｔ，Ｍｉｙａｒａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｒｕｍ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ａｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｉｔｓ ｌｏｃａｌ ｔｕｍｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１６；１３８（８）：１９９４－２００２；Ｌｅｕｎｇ Ｆ，Ｄｉｍｉｔｒｏｍａｎｏｌａｋｉｓ Ａ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｈ，Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ，Ｋｕｌａｓｉｎｇａｍ Ｖ．Ｆｏｌａｔｅ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＦＯＬＲ１） ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０１３；４６（１５）：１４６２－８）。さらに、腫瘍細胞上でのＦＯＬＲ１の発現は、ｓＦＯＬＲ１レベルと強く相関する。ＴＮＢ－９２８Ｂが介在する腫瘍細胞溶解におけるｓＦＯＬＲ１の影響を決定するために、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ及び１，０００ｎｇ／ｍＬで外因的に添加された可溶性組み換えＦＯＬＲ１の存在下で、Ｔ細胞及びＳＫＯＶ－３細胞を用いて細胞傷害性アッセイを行った。ＥＯＣ患者の血清中で測定されるｓＦＯＬＲ１よりもおよそ１００倍高い最大１，０００ｎｇ／ｍＬのｓＦＯＬＲ１の存在下で、ＴＮＢ－９２８Ｂ介在性ＳＫＯＶ－３腫瘍細胞溶解の効力の軽微な低下が検出されたが（Ｋｕｒｏｓａｋｉ Ａ，Ｈａｓｅｇａｗａ Ｋ，Ｋａｔｏ Ｔ，Ａｂｅ Ｋ，Ｈａｎａｏｋａ Ｔ，Ｍｉｙａｒａ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｓｅｒｕｍ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ａｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｉｔｓ ｌｏｃａｌ ｔｕｍｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１６；１３８（８）：１９９４－２００２；Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ ＤＪ，Ｓｏｍｅｒｓ ＥＢ，Ｐａｌｍｅｒ ＬＭ，Ｔｈｉｅｌ ＲＰ，Ｏｂｅｒｏｉ Ｐ，Ｈｅａｔｈ Ｒ， ｅｔ ａｌ．Ｓｅｒｕｍ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ，ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ａｎｄ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ： ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｇｒａｄｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ＣＡ１２５ ａｎｄ ＨＥ４．Ｊ Ｏｖａｒｉａｎ Ｒｅｓ ２０１３；６（１）：２９）、最大細胞溶解は変化しなかった（図２２、パネルＢ）。細胞傷害性アッセイの持続時間にわたり外因性ｓＦＯＬＲ１が安定であるか否かを判定するために、４８時間後、代表的なウェルの細胞培養上清中のｓＦＯＬＲ１レベルをＥＬＩＳＡにより定量した。４８時間後のｓＦＯＬＲ１の測定レベルは、外因性ｓＦＯＬＲ１の量と同等であった（図２２、パネルＣ）。これらのデータから、ＴＮＢ－９２８Ｂの細胞傷害性活性が、卵巣癌患者の血清中で検出される生理学的レベルと匹敵するｓＦＯＬＲ１レベルにより影響されないことが示唆される。

実施例２６：細胞傷害性顆粒の産生
外科手術により切除された新鮮な卵巣腫瘍生検を得ることによって、患者由来の試料においてＴＮＢ－９２８Ｂが介在する細胞傷害性を評価した。ＴＮＢ－９２８Ｂ、ＰＣ又はＮＣとともに４８～７２時間、エクスビボ卵巣腫瘍試料を温置した。５～８名の異なる患者からの解離卵巣腫瘍試料中の、ＰＣと同等であるＴＮＢ－９２８Ｂ介在性の実質的なエクスビボ腫瘍細胞溶解（図１６及び２０）。重要なこととして、これらの試料に対して外来のＴ細胞が添加されておらず、このことから、腫瘍において存在する内在性Ｔ細胞が腫瘍細胞の細胞傷害性を媒介するために十分であったことが示される。８検体の患者試料のうち６検体においてＦＯＬＲ１抗原密度を測定し、＜１０％（非レスポンダー）腫瘍溶解を示す試料と＞１０％（レスポンダー）腫瘍溶解を示す試料との間で、ある傾向が見つかった（図１６、パネルＢ）。非レスポンダーの２名のＦＯＬＲ１抗原密度は＜１ ｘ １０^３であり（図２０）、従って、発明者らのインビトロの結果に基づいて活性を示さないと予想された。代表的な解離卵巣腫瘍試料において、ＴＮＢ－９２８ＢのＥＣ５０は、４５．２ｐＭであり、インビトロの結果と一致した（図１６、パネルＣ）。インビトロの細胞傷害性の結果とも一致し、ＴＮＢ－９２８Ｂは、ＰＣと比較して、ＩＦＮγ及びＩＬ－２によって測定した場合、サイトカイン放出レベルの低下を誘導した（図１６、パネルＤ及びＥ）。さらに、ＴＮＢ－９２８Ｂが介在する腫瘍細胞溶解には細胞傷害性顆粒の放出が伴い、上清中のパーフォリン及びグランザイムＢのレベルがＰＣと同等であった（図２３、パネルＡ及びＢ）。重要なこととして、解離卵巣腫瘍試料を患者に合致するＰＢＭＣとＥ：Ｔ比１：１で温置した場合、ＴＮＢ－９２８Ｂが誘導したＴｒｅｇ細胞の活性化は、ＰＣと比較しておよそ２．５分の１であった（図１６、パネルＦ）。これらのデータから、ＴＮＢ－９２８Ｂが、高レベルのＦＲαを発現する初代患者腫瘍試料のロバストな卵巣腫瘍細胞死滅に介在し、サイトカイン放出から細胞傷害性を切り離し、Ｔｒｅｇ細胞よりも優先的にエフェクターＴ細胞を活性化することが示唆される。

本発明の好ましい実施形態を本明細書中で示し、記載してきたが、このような実施形態が単なる例として提供されることは当業者にとって明らかであろう。ここで、当業者は、本発明から逸脱することなく、多くの様々な変化及び置き換えに気付くであろう。本明細書中に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物が本発明の実施において使用され得ることを理解すべきである。次の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造及びそれらの同等物がそれにより包含されるものとする。

Claims (56)

1. （ａ）配列番号１～５のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ１配列；及び／又は
   （ｂ）配列番号６～１７のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ２配列；及び／又は
   （ｃ）配列番号１８～２２のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ３配列
   を含む第１の重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体。
2. （ａ）配列番号１～５のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ１配列；及び／又は
   （ｂ）配列番号６～１７のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ２配列；及び／又は
   （ｃ）配列番号１８～２２のアミノ酸配列の何れかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ３配列
   を含む第２の重鎖可変領域をさらに含む、請求項１に記載の抗体。
3. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列が、ヒトフレームワークにおいて存在する、請求項１又は２の何れか１項に記載の抗体。
4. ＣＨ１配列の非存在下で重鎖定常領域配列をさらに含む、請求項１～３の何れか１項に記載の抗体。
5. 前記第１の重鎖可変領域が、
   （ａ）配列番号１～５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列；及び／又は
   （ｂ）配列番号６～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列；及び／又は
   （ｃ）配列番号１８～２２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列
   を含む、請求項１～４の何れか１項に記載の抗体。
6. 前記第２の重鎖可変領域が、
   （ａ）配列番号１～５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列；及び／又は
   （ｂ）配列番号６～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列；及び／又は
   （ｃ）配列番号１８～２２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列
   を含む、請求項２～５の何れか１項に記載の抗体。
7. （ａ）配列番号１～５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列と；
   （ｂ）配列番号６～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列と；
   （ｃ）配列番号１８～２２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列と、
   を含む、請求項５～６の何れか１項に記載の抗体。
8. 前記第２の重鎖可変領域が、
   （ａ）配列番号１～５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列と；
   （ｂ）配列番号６～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列と；
   （ｃ）配列番号１８～２２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列と、
   を含む、請求項５～７の何れか１項に記載の抗体。
9. （ａ）配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列及び配列番号１９のＣＤＲ３配列；又は
   （ｂ）配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１６のＣＤＲ２配列及び配列番号２０のＣＤＲ３配列
   を含む、請求項１～８の何れか１項に記載の抗体。
10. 配列番号２３～７４の配列の何れか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列を含む、請求項１～９の何れか１項に記載の抗体。
11. 配列番号２３～７４からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、請求項１～１０の何れか１項に記載の抗体。
12. 前記重鎖可変領域配列が、配列番号２６、配列番号４９、配列番号６１及び配列番号７２からなる群から選択される、請求項１１に記載の抗体。
13. １価又は２価形式の、
    （ａ）式：
    Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｘ２ Ｓ Ｘ３ Ｘ４（配列番号７５）
    （式中、Ｘ１は、Ｎ、Ｔ、Ｉ又はＳであり；
    Ｘ２は、Ｒ又はＳであり；
    Ｘ３は、Ｆ又はＹであり；
    Ｘ４は、Ｇ、Ｓ又はＴである）のＣＤＲ１配列と、
    （ｂ）式：
    Ｉ Ｓ Ｓ Ｘ１ Ｓ Ｘ２ Ｘ３ Ｉ （配列番号７６）
    （式中、Ｘ１は、Ｇ又はＳであり；
    Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
    Ｘ３は、Ｙ、Ｄ、Ｔ又はＳである）のＣＤＲ２配列と、
    （ｃ）式：
    Ａ Ｒ Ｄ Ｖ Ｔ Ｓ Ｇ Ｉ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｘ１ Ａ Ｆ Ｎ Ｉ（配列番号７７）
    （式中、Ｘ１は、Ａ又はＳである）のＣＤＲ３配列と、
    を含む第１の重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体。
14. １価又は２価形式の、
    （ａ）式：
    Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｓ Ｓ Ｙ Ｓ （配列番号７８）
    （式中、Ｘ１は、Ｓ又はＴである）のＣＤＲ１配列と；
    （ｂ）式：
    Ｉ Ｘ１ Ｘ２ Ｓ Ｓ Ｘ３ Ｘ４ Ｉ （配列番号７９）
    （式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｔ又はＤであり；
    Ｘ２は、Ｓ、Ｒ又はＧであり；
    Ｘ３は、Ｄ又はＳであり；
    Ｘ４は、Ｔ又はＩである）のＣＤＲ２配列と；
    （ｃ）式：
    Ａ Ｘ１ Ｖ Ｇ Ｌ Ｘ２ Ｆ Ｄ Ｙ（配列番号８０）
    （式中、Ｘ１は、Ｓ又はＴであり；
    Ｘ２は、Ｄ又はＥである）のＣＤＲ３配列と、
    を含む第１の重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体。
15. （ａ）式：
    Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｘ２ Ｓ Ｘ３ Ｘ４（配列番号７５）
    （式中、Ｘ１は、Ｎ、Ｔ、Ｉ又はＳであり；
    Ｘ２は、Ｒ又はＳであり；
    Ｘ３は、Ｆ又はＹであり；
    Ｘ４は、Ｇ、Ｓ又はＴである）のＣＤＲ１配列、
    （ｂ）式：
    Ｉ Ｓ Ｓ Ｘ１ Ｓ Ｘ２ Ｘ３ Ｉ（配列番号７６）
    （式中、Ｘ１は、Ｇ又はＳであり；
    Ｘ２は、Ｓ又はＴであり；
    Ｘ３は、Ｙ、Ｄ、Ｔ又はＳである）のＣＤＲ２配列及び
    （ｃ）式：
    Ａ Ｒ Ｄ Ｖ Ｔ Ｓ Ｇ Ｉ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｘ１ Ａ Ｆ Ｎ Ｉ （配列番号７７）
    （式中、Ｘ１は、Ａ又はＳである）のＣＤＲ３配列
    を含む第１の重鎖可変領域と；
    （ａ）式：
    Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｓ Ｓ Ｙ Ｓ （配列番号７８）
    （式中、Ｘ１は、Ｓ又はＴである）のＣＤＲ１配列、
    （ｂ）式：
    Ｉ Ｘ１ Ｘ２ Ｓ Ｓ Ｘ３ Ｘ４ Ｉ（配列番号７９）
    （式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｔ又はＤであり；
    Ｘ２は、Ｓ、Ｒ又はＧであり；
    Ｘ３は、Ｄ又はＳであり；
    Ｘ４は、Ｔ又はＩである）のＣＤＲ２配列及び
    （ｃ）式：
    Ａ Ｘ１ Ｖ Ｇ Ｌ Ｘ２ Ｆ Ｄ Ｙ（配列番号８０）
    （式中、Ｘ１は、Ｓ又はＴであり；
    Ｘ２は、Ｄ又はＥである）のＣＤＲ３配列
    を含む第２の重鎖可変領域と、
    を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体。
16. 前記第１の重鎖可変領域が、前記第２の重鎖可変領域と比較して、Ｎ末端に対してより近くに置かれる、請求項１５に記載の抗体。
17. 前記第１の重鎖可変領域が、前記第２の重鎖可変領域と比較して、Ｃ末端に対してより近く置かれる、請求項１５に記載の抗体。
18. ヒトＶＨフレームワークにおいてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号１～２２からなる群から選択されるＣＤＲ配列において２つ以下の置換を有する配列を含む、抗体。
19. ヒトＶＨフレームワークにおいてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１８に記載の抗体であって、前記ＣＤＲ配列が配列番号１～２２からなる群から選択される、抗体。
20. ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列と、配列番号６のＣＤＲ２配列と、配列番号１９のＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体。
21. １価又は２価配置の、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列と、配列番号６のＣＤＲ２配列と、配列番号１９のＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域
    を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体。
22. ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号４のＣＤＲ１配列と、配列番号１６のＣＤＲ２配列と、配列番号２０のＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体。
23. １価又は２価配置の、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号４のＣＤＲ１配列と、配列番号１６のＣＤＲ２配列と、配列番号２０のＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域
    を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体。
24. ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列及び配列番号１９のＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、
    ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１６のＣＤＲ２配列及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、
    を含む、ＦＯＬＲ１に結合する抗体。
25. 前記第１の重鎖可変領域が、前記第２の重鎖可変領域と比較して、Ｎ末端に対してより近くに置かれる、請求項２４に記載の抗体。
26. 前記第１の重鎖可変領域が、前記第２の重鎖可変領域と比較して、Ｃ末端に対してより近く置かれる、請求項２４に記載の抗体。
27. 単一特異性である、請求項１～１４及び１８～２３の何れか１項に記載の抗体。
28. 多特異性である、請求項１～２６の何れか１項に記載の抗体。
29. 二特異性である、請求項２８に記載の抗体。
30. ＣＤ３タンパク質及びＦＯＬＲ１タンパク質に対する結合親和性を有する、請求項２８又は２９に記載の抗体。
31. 同じＦＯＬＲ１タンパク質上の２つの異なるエピトープに対する結合親和性を有する、請求項２８又は２９に記載の抗体。
32. エフェクター細胞に対する結合親和性を有する、請求項２８又は２９に記載の抗体。
33. Ｔ細胞抗原に対する結合親和性を有する、請求項３２に記載の抗体。
34. ＣＤ３に対する結合親和性を有する、請求項３３に記載の抗体。
35. ＣＡＲ－Ｔ形式である、請求項１～３４の何れか１項に記載の抗体。
36. （ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号８３のＣＤＲ１配列、配列番号８４のＣＤＲ２配列及び配列番号８５のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する重鎖可変領域と；
    （ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて配列番号８６のＣＤＲ１配列、配列番号８７のＣＤＲ２配列及び配列番号８８のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域と；
    （ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列及び配列番号１９のＣＤＲ３配列を含む、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインと、
    を含む、二特異性抗体。
37. （ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号８３のＣＤＲ１配列、配列番号８４のＣＤＲ２配列及び配列番号８５のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する重鎖可変領域と；
    （ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて配列番号８６のＣＤＲ１配列、配列番号８７のＣＤＲ２配列及び配列番号８８のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と；
    （ｉｉｉ）１価又は２価配置の、ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列及び配列番号１９のＣＤＲ３配列を含む、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインと、
    を含む二特異性抗体。
38. （ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号８３のＣＤＲ１配列、配列番号８４のＣＤＲ２配列及び配列番号８５のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する重鎖可変領域と；
    （ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて配列番号８６のＣＤＲ１配列、配列番号８７のＣＤＲ２配列及び配列番号８８のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と；
    （ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１６のＣＤＲ２配列及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインと、
    を含む二特異性抗体。
39. （ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号８３のＣＤＲ１配列、配列番号８４のＣＤＲ２配列及び配列番号８５のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する重鎖可変領域と；
    （ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて配列番号８６のＣＤＲ１配列、配列番号８７のＣＤＲ２配列及び配列番号８８のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域と；
    （ｉｉｉ）１価又は２価配置の、ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１６のＣＤＲ２配列及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインと、
    を含む二特異性抗体。
40. （ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて配列番号８３のＣＤＲ１配列、配列番号８４のＣＤＲ２配列及び配列番号８５のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する重鎖可変領域と；
    （ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて配列番号８６のＣＤＲ１配列、配列番号８７のＣＤＲ２配列及び配列番号８８のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域と；
    （ｉｉｉ）２価配置の、第１及び第２の抗原結合領域を含む、抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインと、
    を含む多特異性抗体であって、
    前記第１の抗原結合領域が、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列と、配列番号６のＣＤＲ２配列と、配列番号１９のＣＤＲ３配列と、を含み；
    前記第２の抗原結合領域が、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号４のＣＤＲ１配列と、配列番号１６のＣＤＲ２配列と、配列番号２０のＣＤＲ３配列と、を含む、
    多特異性抗体。
41. 前記第１の抗原結合領域が、前記第２の抗原結合領域と比較してＮ末端のより近くに置かれる、請求項４０に記載の多特異性抗体。
42. 前記第１の抗原結合領域が、前記第２の抗原結合領域と比較してＣ末端のより近くに置かれる、請求項４０に記載の多特異性抗体。
43. 前記抗ＦＯＬＲ１重鎖抗体の抗原結合ドメインの第１及び第２の抗原結合領域がポリペプチドリンカーによって連結される、請求項３６～４２の何れか１項に記載の多特異性又は二特異性抗体。
44. 前記ポリペプチドリンカーがＧＳリンカーである、請求項４３に記載の多特異性又は二特異性抗体。
45. 前記ＧＳリンカーが、配列番号８１又は配列番号８２の配列からなる、請求項４４に記載の多特異性又は二特異性抗体。
46. 請求項１～４５の何れか１項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
47. ＦＯＬＲ１の発現を特徴とする障害の処置のための方法であって、請求項１～４５の何れか１項に記載の抗体又は請求項４６に記載の医薬組成物を前記障害がある対象に投与することを含む、方法。
48. ＦＯＬＲ１の発現を特徴とする障害の処置のための薬剤の調製における、請求項１～４５の何れか１項に記載の抗体の使用。
49. ＦＯＬＲ１の発現を特徴とする障害の処置での使用のための、請求項１～４５の何れか１項に記載の抗体。
50. 前記障害が、卵巣癌、子宮癌、肺癌、腎臓癌、結直腸癌、乳癌及び脳癌からなる群から選択される、請求項４７～４９の何れか１項に記載の方法、使用又は抗体。
51. 請求項１～４５の何れか１項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
52. 請求項５１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
53. 請求項５２に記載のベクターを含む細胞。
54. 請求項１～４５の何れか１項に記載の抗体を作製する方法であって、前記抗体の発現を許容する条件下で請求項５３に記載の細胞を増殖させることと、前記細胞から前記抗体を単離することと、を含む方法。
55. ＵｎｉＲａｔ動物をＦＯＬＲ１タンパク質で免疫付与することと、ＦＯＬＲ１－結合抗体配列を同定することと、を含む、請求項１～４５の何れか１項に記載の抗体を作製する方法。
56. それを必要とする個体に、有効用量の、請求項１～４５の何れか１項に記載の抗体又は請求項４６に記載の医薬組成物を投与することを含む、処置の方法。

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