JP2023542924A

JP2023542924A - 治療タンパク質を生産するための方法

Info

Publication number: JP2023542924A
Application number: JP2023518145A
Authority: JP
Inventors: シュー，ジャンリン; ジェン，シュン; エイチダウッド，ゼイナブ
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2021-09-21
Publication date: 2023-10-12
Also published as: EP4217383A1; CN116194570A; US20230357815A1; KR20230073270A; WO2022066595A1

Abstract

本発明は、一般に、細胞培養物にカルボキシペプチダーゼを添加する事による、バイオリアクターで培養した宿主細胞から分泌される目的の治療タンパク質の生産方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年９月２２日に出願された米国仮出願第６３／０８１３８０号、および２０２１年７月２６日に出願された米国仮出願第６３／２２５８３２号の優先権を主張するものであり、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。

発明の技術分野
本発明は、一般に、宿主細胞から分泌される目的の治療タンパク質を生産するための方法に関する。

発明の背景
治療タンパク質は多くのヒト疾患の処置においてより一般的なものとなっている。様々な翻訳後修飾を受けるため、それらは製造過程においてある程度の不均一性を持つ事が知られている。それらの内、電荷変異体種（ｃｈａｒｇｅｖａｒｉａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ）（酸性種、主要ピークおよび酸性種）は非常に一般的に観察され、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）において観察される（Ｈｉｎｔｅｒｓｔｅｉｎｅｒｅｔａｌ．，２０１６）。規制の観点からみれば、Ｃ末端リジンに由来する高塩基性種は、それらは患者への静脈注射後に内因性血清カルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）によって急速に切断され、半減期は１時間程度と推定されるため、あまり懸念されない（Ｂｒｏｒｓｏｎ＆Ｊｉａ，２０１４）。とはいえ、製造の一貫性および製品の同等性（ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ）を確保するためには、電荷変異体を監視する必要がある（Ｃｈｕｎｇｅｔａｌ．，２０１９）。主要ピークは、ｍＡｂ製品のリリース規格（ｒｅｌｅａｓｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に制御される必要がある。製造過程を首尾よく制御することが、治療タンパク質製品の品質、安全性およびロット間の一貫性を確保するために肝心である。

ｍＡｂ重鎖におけるＣ末端リジン変異体は、ｍＡｂ製造過程において残存した０、１または２個のリジンを伴い、内因性カルボキシペプチダーゼによるＣ末端リジン残基の非効率的な切断に起因すると考えられていた（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０１５）。リジンが正に荷電しており、ｍＡｂ分子のＰＩを下げるため、残存したリジンが増えると電荷変異体プロファイル中の塩基性種の割合が増加する（Ｂｒｏｒｓｏｎｅｔａｌ．，２０１４）。製造過程におけるｍＡｂのＣ末端リジンの不均一性を低減するために、１つの解決策は生産段階における宿主細胞の培養期間を短くすることである。しかしながら、この方法ではｍＡｂの生産性が著しく低下する。

したがって、高い力価および低い不均一性を伴う、治療タンパク質の生産性を増加するための改善した細胞培養方法を開発する必要がある。

発明の概要
本発明のある実施形態では、上流の細胞培養過程の終点においてバイオリアクターに直接ＣｐＢ処置を施す事によって、費用対効果の高い酵素処置戦略を開発した。多数の利点によってこの戦略が選択された。第１に、細胞培養条件は通常、温度、ｐＨ、混合等の点で酵素反応条件に相当するため、ＣｐＢの添加後に追加的な条件の調節を必要としない。ＣｐＢは下流の一連の精製工程の前に導入され、および後続の精製過程の間にＣｐＢは容易に取り除くことができる。作用濃度の５０倍の酵素が添加された場合であっても、タンパク質Ａ工程によって、ＥＬＩＳＡアッセイによる検出限界以下まで導入されたＣｐＢを除去できた事が示されている。これにより、適格な治療タンパク質製品の製造という目標を達成しながら、力価の向上を伴いつつ全体の過程を大幅に簡素化する事ができる。

本発明のある実施形態では、本開示は目的の治療タンパク質の製造方法であって、ａ）タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）を添加する工程；ｃ）清澄化バルク（ｃｌａｒｉｆｉｅｄｂｕｌｋ）（ＣＢ）を回収する工程；およびｄ）清澄化バルクを精製過程に供する工程を含む方法を提供する。

本発明のある実施形態では、本開示は、目的の治療タンパク質の生産性を改善する方法であって、ａ）タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）を添加する工程；ｃ）清澄化バルク（ＣＢ）を回収する工程；およびｄ）清澄化バルクを精製過程に供する工程を含む方法を提供する。

本発明のある態様では、バイオリアクターは生産バイオリアクターである。

本発明のある態様では、タンパク質はＣ末端にリジンまたはアルギニン残基を有するタンパク質である。

本発明のある態様では、タンパク質はＦｃ－融合タンパク質または抗体である。

本発明のある態様では、抗体はｍＡｂである。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）、カルボキシペプチダーゼＤ（ＣＰＤ）、カルボキシペプチダーゼＨ（ＣＰＨ）、カルボキシペプチダーゼＥ（ＣＰＥ）、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）、カルボキシペプチダーゼＮ（ＣＰＮ）、カルボキシペプチダーゼＴ（ＣＰＴ）、カルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ）、カルボキシペプチダーゼＭ３２、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ（ＧＣＰ）、プロリルカルボキシペプチダーゼ（ＰＣＰ）、Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニンカルボキシペプチダーゼ（ＡＡＣＰ）またはプロカルボキシペプチダーゼから選択される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼはカルボキシペプチダーゼＢである。

本発明のある態様では、細胞は約１４日間培養される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、培養細胞の生産段階中に添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは収穫の０～２４時間前に培養細胞に添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは収穫の約２時間前に培養細胞に添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは収穫時に培養細胞に添加される。

本発明のある態様では、細胞は灌流、バッチまたはフェドバッチ細胞培養物中である。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼはタンパク質の塩基性種を低減するために十分な量で添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、Ｃｐ：目的のタンパク質比が０．０００１％～１％ｗ／ｗの間の比率で添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは生産バイオリアクターに１回以上添加される。

本発明のある態様では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。

本発明のある態様では、抗体は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＣＸＣＲ４、ＣＤ７３ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＤ１１ａ、組織因子（ＴＦ）、ＰＳＣＡ、ＩＬ－８、ＩＬ－１３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される抗原に結合する。

本発明のある態様では、ｍＡｂはニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）である。

図面の簡単な説明
図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、ラボ用バイオリアクターにおける、ｍＡｂ－１についてのＣＨＯ細胞培養物の生産性能を示す；それぞれ、（図１Ａ）過程Ｂ（富化Ｎ－１シードを使用した強化フェドバッチ生産）（ｎ＝４）、（図１Ｂ）過程Ｃ（灌流Ｎ－１シードを使用した強化フェドバッチ生産）（ｎ＝４）、および（図１Ｃ）過程Ｄ（強化灌流生産）（ｎ＝２、バッチ１およびバッチ２を別々に）について、正規化空間収率（実線、過程Ｂの１０日目力価の平均を１００％として正規化）、および正規化空時収率（破線、期間にわたる正規化力価に基づいて算出）。標準偏差が非常に小さいため、いくつかの時点においてエラーバーは観察されない。

図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃは、ラボ用バイオリアクター（図１Ａ～Ｃと同様）における、ＣｐＢ処置（破線）および未処置コントロール（実線）を用いたｍＡｂ－１についての正規化主要ピークレベル（主要ピークについてのリリース規格（規格（ｓｐｅｃ））を１００％として正規化）を示す：それぞれ（図２Ａ）過程Ｂ（ｎ＝４）、（図２Ｂ）過程Ｃ（ｎ＝４）、および（図２Ｃ）過程Ｄ（ｎ＝２、バッチ１およびバッチ２を別々に）。標準偏差が非常に小さいため、いくつかの時点においてエラーバーは観察されない。

図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、ラボ用バイオリアクター（図１Ａ～Ｃと同様）における、ＣｐＢ処置（破線）および未処置コントロール（実線）を用いたｍＡｂ－１についての正規化塩基性種レベル（主要ピークについてのリリース規格を１００％として正規化）を示す：それぞれ（図３Ａ）過程Ｂ（ｎ＝４）、（図３Ｂ）過程Ｃ（ｎ＝４）、および（図３Ｃ）過程Ｄ（ｎ＝２、バッチ１およびバッチ２を別々に）。標準偏差が非常に小さいため、いくつかの時点においてエラーバーは観察されない。

図４は、ＣｐＢ処置（実線）および未処置コントロール（破線）によるｍＡｂ－１のｉＣＥクロマトグラムの比較を示す。主要ピークおよび塩基性種レベルは、主要ピークについてのｍＡｂ－１リリース規格を１００％として正規化した。

図５は、異なるマトリクスにおいて、３４°Ｃで２時間、異なる酵素濃度でＣｐＢ処置した後のｍＡｂ－１正規化主要ピークレベルおよび塩基性種レベルを示す：ＣｐＢ未処置サンプルをコントロールとして使用し（ｎ＝３）、およびそれぞれ１％、０．０５％、０．０１％（ｗ／ｗ）濃度での全細胞培養物；０．０１％および０．００１％（ｗ／ｗ）濃度での細胞培養上清、および０．０１％および０．００１％（ｗ／ｗ）濃度での、Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．６における５ｍｇ／ｍＬｍＡｂ－１。

図６は、ＣｐＢ未処置サンプルをコントロールとして使用し（ｎ＝３）、過程Ｂから生成した細胞培養上清において、０．０１％（ｗ／ｗ）ＣｐＢ濃度で２時間、異なる温度（例えば、室温（ＲＴ）、３２°Ｃ、３４°Ｃおよび３６°Ｃ）でＣｐＢ処置した後のｍＡｂ－１正規化主要ピークレベルおよび塩基性種レベルを示す。

図７は、ＣｐＢ未処置サンプルをコントロールとして使用し（ｎ＝３）、および精製したｍＡｂ－１を添加し３４°Ｃで２時間、０．０１％（ｗ／ｗ）ＣｐＢ濃度で、異なるｐＨ値、例えばｐＨ５．０（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１２ｍＭ酢酸）；ｐＨ６．１（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１２ｍＭ酢酸）；ｐＨ７．０（２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ）；ｐＨ８．０（２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ）；ｐＨ８．９（２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ）においてＣｐＢ処置した後のｍＡｂ－１正規化主要ピークレベルおよび塩基性種レベルを示す。

図８はｍＡｂ－１製造過程のフローチャートを示す。

図９は、過程Ｂ（ｎ＝２）に続いて０．０５％（ｗ／ｗ）濃度、３４°Ｃで２時間のＣｐＢ処置に使用され、その後ＣｐＢ処置条件および未処置条件の両方について下流過程全体が実行された、５Ｌバイオリアクター中でのｍＡｂ－１細胞培養物の性能プロファイル（例えば、ＶＣＤ、生存率および正規化力価）を示す（表１）。

図１０は、ｉｎｖｉｔｒｏのＣｐＢ処置プロトコルの模式図を示す。

図１１Ａおよび図１１Ｂは、２５０ｍＬ振盪フラスコでのｍＡｂ－８生産について、ＶＣＤ、生存率および正規化力価のフェドバッチ細胞培養物の性能プロファイル（図１１Ａ）およびグルコース、乳酸およびアンモニウムレベルの代謝産物プロファイル（図１１Ｂ）を示す。

図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃは、２５０ｍＬ振盪フラスコでのｍＡｂ－８生産について、全細胞培養物のコントロールおよびＣｐＢ処置条件（ＣｐＢ：ｍＡｂ－８比１：１０，０００（ｗ／ｗ））についての工程内品質特性（正規化塩基性電荷変異体種のレベルおよび正規化主要ピークレベル、図１２Ａ；Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、およびＭａｎ５を含むＮグリカン、図１２Ｂ；高分子量（ＨＭＷ）、低分子量（ＬＭＷ）および単量体を含むＳＥＣ不純物、図１２Ｃ）を示す。

図１３Ａおよび図１３Ｂは、２５０ｍＬ振盪フラスコでのｍＡｂ－３生産の間の、例えばＶＣＤ、生存率および正規化力価のフェドバッチ細胞培養物の性能プロファイル（図１１Ａ）およびグルコース、乳酸およびアンモニウムレベルの代謝産物プロファイル（図１１Ｂ）を示す。

図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃは、２５０ｍＬ振盪フラスコでのｍＡｂ－３生産について、全細胞培養物のコントロールおよびＣｐＢ処置条件（ＣｐＢ：ｍＡｂ－３比１：１０，０００（ｗ／ｗ））についての工程内品質特性（正規化塩基性電荷変異体種のレベルおよび正規化主要ピークレベル、図１４Ａ；Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、およびＭａｎ５を含むＮグリカン、図１２Ｂ；高分子量（ＨＭＷ）、低分子量（ＬＭＷ）および単量体を含むＳＥＣ不純物、図１２Ｃ）を示す。

発明の詳細な記載
本発明は、目的の治療タンパク質の生産方法であって、ａ）タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）を添加する工程；ｃ）清澄化バルクを回収する工程；およびｄ）清澄化バルクを精製過程に供する工程、を含む方法を提供する。

本発明のある実施形態では、本開示は、目的の治療タンパク質の生産性を改善する方法であって、ａ）タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）を添加する工程；ｃ）清澄化バルクを回収する工程；およびｄ）清澄化バルクを精製過程に供する工程、含む方法を提供する。

定義
本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。本願で使用される場合、本明細書で別段の規定が明示的に提供される場合を除き、以下の各用語は以下に記載する意味を有するものとする。さらなる定義は本願を通じて記載される。

不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、任意の記載された、または列記された成分の「１つ以上」を指す事が理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、用語「約」は、当業者によって決定された特定の値または組成物について許容できる誤差範囲内にある値または組成物を指し、これは値または組成物が測定または決定される方法、すなわち測定システムの限界にある部分依存するはずである。例えば、「約」は、記載された参照値のプラスマイナス５０％の範囲、好ましくはプラスマイナス２５％の範囲、またはより好ましくはプラスマイナス１０％の範囲を意味し得る。特定の値または組成物が本願および特許請求の範囲において提供される場合、別段の記載が無い限り、「約」の意味は、当該特定の値または組成物について許容可能な誤差範囲内であると想定されるはずである。

本明細書で使用される用語「および／または」は、２つの特定された特徴または成分の各々について、他方の有無に関わらない具体的な開示であると理解されるものである。よって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などのフレーズにおいて使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（のみ）、および「Ｂ」（のみ）を含む事が意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などのフレーズにおいて使用される用語「および／または」は、以下の態様の各々を包含する事が意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；およびＣ（のみ）。選択肢の使用（例えば「または」）は、選択肢のいずれか１つ、両方またはその任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」は、長さに関わらず、ペプチド結合したアミノ酸鎖を指す。タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基は修飾、例えば、しかし非限定的に、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合の形成を含み得る。用語「タンパク質」は本明細書において「ポリペプチド」と互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、用語「目的のタンパク質」は最も広い意味において使用され、精製が望ましい混合物中に存在する、任意のタンパク質（天然または組み換えのいずれか）を含む。係る目的のタンパク質には、非限定的に、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、免疫グロブリン（例えば、抗体）、および／または任意の融合タンパク質を含む。

本明細書で使用される場合、用語「治療タンパク質」は、疾患または障害の予防、処置または緩和に有用である事が知られている任意のタンパク質を示し、例えば抗体、成長因子、細胞表面受容体、サイトカイン、ホルモン、トキシン、または前述のいずれかの断片および／もしくは融合タンパク質を指す。

本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ－融合タンパク質」は、免疫グロブリン由来部分（すなわちＦｃ部分）および、第２の、非免疫グロブリンタンパク質に由来する部分を含む治療タンパク質を包含する事を意味する。

「抗体」には、非限定的に、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含み、抗原に特異的に結合する糖タンパク質免疫グロブリン（Ｉｇ）、またはその抗原結合部分を含む。

本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」Ａｂは、異なる抗原特異性を有するその他のＡｂを実質的に含まないＡｂを指す。さらに、単離されたＡｂはまた、その他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないように精製されたＡｂを意味し得る。

本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、単一分子組成のＡｂ分子、すなわちその一次配列が実質的に同一であり、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す複数のＡｂ分子の天然には生じない調製物を指す。ｍＡＢは単離されたＡｂの一例である。ｍＡｂは、ハイブリドーマ、組み換え、遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）または当業者に知られたその他の技術によって生産され得る。

本明細書で使用される場合、用語「目的のｍＡｂ」は、精製が望ましい混合物中に存在するｍＡｂを指す。

本明細書で使用される場合、「キメラ」Ａｂは、可変領域がある種に由来し、定常領域が別の種に由来するＡｂ、例えば可変領域がマウスＡｂに由来し、定常領域がヒトＡｂに由来するＡｂを指す。

本明細書で使用される場合、「ヒト」ｍＡｂ（ＨｕＭＡｂ）は、可変領域中のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有するｍＡｂを指す。さらに、Ａｂが定常領域を含む場合、当該定常領域もまたヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒトＡｂは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎｖｉｔｒｏの無作為もしくは部位特異的な変異導入によって、またはｉｎｖｉｖｏの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかし、本明細書で使用される場合、用語「ヒト」Ａｂは、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されたＡｂを含むことは意図されない。用語「ヒト」Ａｂおよび「完全ヒト」Ａｂは同義的に使用される。

本明細書で使用される場合、「ヒト化」ｍＡｂは、非ヒトｍＡｂのＣＤＲドメインの外側のアミノ酸の一部、大部分または全部がヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置き換えられたｍＡｂを指す。Ａｂのヒト化形態の１つの実施形態では、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分、または全部がヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸で置換されているが、１つまたは複数のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分または全部は変更されていない。アミノ酸の小規模な付加、欠失、挿入、置換または修飾は、特定の抗原に結合するＡｂの能力を損なわない限り、許容される。「ヒト化」Ａｂは、元のＡｂと同様の抗原特異性を保持する。

本明細書で使用される場合、「抗－抗原」Ａｂは、抗原に特異的に結合するＡｂを指す。例えば、抗－ＰＤ－１ＡｂはＰＤ－１に特異的に結合するＡｂである。

本明細書で使用される場合、用語「培養物」、「細胞培養物」、および「哺乳類細胞培養物」は、哺乳類細胞集団であって、当該細胞集団の生存および／または増殖に好適な条件下で培地中に懸濁された細胞集団を指す。当業者にとり明らかなように、本明細書で使用される場合、これらの用語は、哺乳類細胞集団および当該集団が懸濁される培地を含む組み合わせを指し得る。

用語「培養」または「細胞培養」は、物理的条件の制御された設定下において、液体培養培地中での哺乳類細胞の維持または増殖を意味する。

本明細書で使用される場合、用語「播種」、「播種された」、「接種」、「接種する」および「接種された」は、細胞培養物をバイオリアクターまたは別の容器に供する過程を指す。細胞は別のバイオリアクターまたは容器中で事前に増殖されていてもよい。あるいは、細胞は冷凍されていて、バイオリアクターまたは容器にそれらを供する直前に解凍されてもよい。この用語は、１つの細胞を含む任意の数の細胞を指す。

本明細書で使用される場合、用語「基本培地」は、増殖中の哺乳類細胞を養うための栄養を含む溶液を指す。典型的には、この溶液は、細胞の最低限の増殖および／または生存のために要求される必須および非必須のアミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質および微量元素を提供する。この溶液はまた、ホルモンおよび成長因子を含む、上記の最低限の速度を超えて増殖および／または生存を促進する成分を含み得る。溶液は、好ましくは細胞の生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度に調製される。細胞の成長に資するための様々な成分が基本培地に添加され得る。培地はまた、血清、加水分解物または組成が不明な成分を含まない「化学的規定培地」であり得る。規定培地は動物由来成分を含まず、且つ全ての成分が既知の化学構造を有する。

本明細書で使用される場合、用語「バッチ」または「バッチ培養」は、細胞自体や基本培地を含む、細胞培養において最終的に使用される全ての成分が培養過程の開始時に供される細胞培養方法を指す。バッチ培養は典型的にはいくつかの時点において停止され、培地中の細胞および／または成分が収穫され、および任意には精製される。

用語「フェドバッチ」または「フェドバッチ培養」は、細胞培養物から初期の基本培地を実質的または顕著に除去することなく、初期の細胞培養物に漸増的または継続的にフィード培地を添加する事を意味する。ある場合では、フィード培地は初期の基本培地と同じである。ある場合では、フィード培地は基本培地を濃縮した形態である。ある場合では、フィード培地は基本培地と異なって、所望の栄養補助剤を含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「灌流」または「灌流過程」とは、細胞をリアクター中に保持したまま、等量の培地（栄養補助剤を含む）をバイオリアクターに同時に添加・除去する細胞培養方法を指す。補充培地に相当する量の細胞および培地は、典型的には連続的または半連続的に除去され、任意には精製される。典型的には、灌流過程を含む細胞培養過程を「灌流培養」を呼ぶ。新鮮な培地は、細胞培養過程における基本培地と同一、類似または異なり得る。

本明細書で使用される場合、用語「Ｎ－１段階」は、生産用接種の直前の最後のシード増殖段階を指す。Ｎ－１段階は、目的のタンパク質の生産のために生産バイオリアクターに播種する前の最後の細胞増殖段階である。本明細書で使用される場合、用語「Ｎ－２段階」および「Ｎ－３段階」は、細胞成長および増殖中の期間であって、典型的にはＮ生産段階の接種の前の期間を指す。Ｎ－３段階は、Ｎ－２段階において使用するための生細胞密度を増加するために使用される細胞増殖段階である。Ｎ－２段階は、Ｎ－１段階において使用するための生細胞密度を増加するために使用され得る細胞増殖段階である。

用語、細胞培養物の「生産段階」または「Ｎ生産段階」は、細胞培養の最終段階を指す。生産段階において、細胞は、目的のタンパク質、例えばｍＡｂを生産することに主眼を置いて培養される。生産段階は、一般的に細胞培養物製造の「Ｎ」または最終段階と呼ばれる。

本明細書で使用される場合、用語「バイオリアクター」は、哺乳類細胞培養物の増殖のために使用される任意の容器を指す。バイオリアクターは、哺乳類細胞の培養においてそれが有用である限り、任意の大きさであり得る。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも１リットルであり、および２、５、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００リットルもしくはそれ以上、またはその間の任意の容量であり得る。バイオリアクターの内部条件はｐＨ、および温度などを含むがこれに限定されず、および典型的には培養期間中制御される。バイオリアクターは、本発明の培養条件下で培地に懸濁された哺乳類細胞培養物を保持するために好適に任意の材料で構成され得、ガラス、プラスチックまたは金属を含む。

本明細書で使用される場合、「生産バイオリアクター」は、目的のタンパク質（例えば、ｍＡＢ）の生産のための細胞培養物の生産段階において使用される最終的なバイオリアクターを指す。大規模細胞培養物生産バイオリアクターの容量は、典型的には少なくとも５００リットル、および１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００リットルもしくはそれ以上、またはその間の任意の容量であり得る。当業者であれば本発明の実施において使用するための好適なバイオリアクターを認識し、選択する事ができるはずである。

本明細書で使用される場合、用語「力価」は、組み換え的に発現される目的のタンパク質、例えば哺乳類細胞培養物によって産生されるｍＡｂの総量を所定の培地容量で除算して得られる値である。力価は典型的には、培地１リットル当たりのポリペプチドまたはタンパク質のグラム、という単位で表される。

用語「収穫」は、タンパク質精製に好適な清澄化バルク（ＣＢ）を得るために細胞および細胞残渣を除去する手順を指す。これは一般に、規模や設備能力に応じて、遠心分離、深層濾過、無菌濾過を含むがこれらに限定されない、任意の好適な技術によって達成される。

本明細書で使用される場合、「清澄化バルク」および「ＣＢ」は互換的に使用され、細胞培養液を清澄化するために使用される遠心分離、深層濾過、または凝集などの一次回収ステップの後に回収される溶液を指す。

用語「精製」は、目的のタンパク質を、細胞培養培地中に存在する１つ以上の他の成分（例えば、哺乳類細胞タンパク質または培養培地タンパク質）から、または哺乳類細胞溶解液中に存在する１つ以上の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のタンパク質）から少なくとも部分的に精製または単離（例えば、重量の少なくともまたは約５％純粋、例えば少なくともまたは約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくともまたは約９５％純粋）する手順を指す。典型的には、組成物から少なくとも１つの不純物を除去（完全に、または部分的に）する事によって目的のタンパク質の純度は増加する。

用語「カルボキシペプチダーゼ」は、タンパク質をＣ末端から切断する多機能酵素を指す。多数の異なる種類のカルボキシペプチダーゼが存在し、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣｐＡ）、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）、カルボキシペプチダーゼＤ（ＣｐＤ）カルボキシペプチダーゼＥ（ＣｐＥ）、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣｐＭ）、カルボキシペプチダーゼＮ（ＣｐＮ）、カルボキシペプチダーゼＴ（ＣｐＴ）、カルボキシペプチダーゼＹ（ＣｐＹ）、カルボキシペプチダーゼＭ３２、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ（ＧＣＰ）、プロリルカルボキシペプチダーゼ（ＰＣＰ）、Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニンカルボキシペプチダーゼ（ＡＡＣＰ）、プロカルボキシペプチダーゼおよび他、を含む。

本発明のある実施形態では、本開示は、目的の治療タンパク質の生産方法であって、ａ）タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼを添加する工程；ｃ）清澄化バルク（ＣＢ）を収穫および回収する工程；およびｄ）清澄化バルクを精製過程に供する工程、を含む方法を提供する。

本発明のある実施形態では、本開示は、目的の治療タンパク質の生産性を改善する方法であって、ａ）タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼを添加する工程；ｃ）清澄化バルク（ＣＢ）を収穫および回収する工程；およびｄ）清澄化バルクを精製過程に供する工程、含む方法を提供する。

用語「カルボキシペプチダーゼＢ」は、タンパク質のＣ末端からアルギニンおよびリジンなどの塩基性アミノ酸を順次切断するカルボキシペプチダーゼを指す。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼはカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）である。

本発明のある実施形態では、本開示は、目的の治療タンパク質の生産方法であって、ａ）タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼＢを添加する工程；ｃ）清澄化バルク（ＣＢ）を収穫および回収する工程；およびｄ）清澄化バルクを精製過程に供する工程、を含む方法を提供する。

本発明のある実施形態では、本開示は目的の治療タンパク質の生産性を改善する方法であって、ａ）タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼＢを添加する工程；ｃ）清澄化バルク（ＣＢ）を収穫および回収する工程；およびｄ）清澄化バルクを精製過程に供する工程、含む方法を提供する。

本開示の種々の態様は、以下の小節においてさらに詳細に記載される。

本発明のある実施形態では、本開示は、目的のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生産性を改善する方法であって、ａ）ｍＡｂを発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）を添加する工程；ｃ）清澄化バルク回収する工程；およびｄ）清澄化バルクを精製過程に供する工程、含む方法を提供する。

本発明のある態様では、タンパク質はＣ末端にリジンまたはアルギニンを有する。

本発明のある態様では、抗体はｍＡｂである。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、バッチ、フェドバッチまたは灌流細胞培養物に収穫の前に添加される。

本発明のある態様では、細胞は生産バイオリアクター中で約１４日間培養される。本発明のある態様では、細胞は生産バイオリアクター中で約１５日間培養される。本発明のある態様では、細胞は生産バイオリアクター中で約１６日間培養される。本発明のある態様では、細胞は生産バイオリアクター中で約１７日間培養される。本発明のある態様では、細胞は生産バイオリアクター中で約１８日間培養される。本発明のある態様では、細胞は生産バイオリアクター中で約１９日間培養される。本発明のある態様では、細胞は生産バイオリアクター中で約２０日間培養される。本発明のある態様では、細胞は生産バイオリアクター中で約２１日間培養される。本発明のある態様では、細胞は生産バイオリアクター中で約２２日間培養される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、培養細胞の生産段階の間に添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、収穫の０～２４時間前に培養細胞に添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは収穫の約０．５時間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または２４時間前に培養細胞に添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼＢは収穫の約２時間前に培養細胞に添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、目的のタンパク質の塩基性種を低減するために十分な量で添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、ＣＰ：目的のタンパク質比が０．０００１％～１％ｗ／ｗの間の比率で添加される。本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、ＣＰ：目的のタンパク質比が約０．００１％、約０．００２％、約０．００５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．５％、または約１％ｗ／ｗの比率で添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、目的のｍＡｂの塩基性種を低減するために十分な量で添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼＢはＣＰ：目的のｍＡｂ比が０．０００１％～１％ｗ／ｗの間の比率で添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼＢは、ＣＰ：目的のｍＡｂ比が、約０．００１％、約０．００２％、約０．００５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．５％、または約１％ｗ／ｗの比率で添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼＢは、約０．０１％、ｗ／ｗのＣＰ：目的のｍＡｂで添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは生産バイオリアクターに複数回添加される。

本発明のある態様では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。

ある態様では、ｍＡｂはニボルマブである。

ｍＡｂ電荷変異体
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、複数の翻訳後修飾および分解事象のために、その生化学的および生物物理学的性質において不均一である。ｍＡｂの電荷の不均一性は、これらの修飾によって正味の電荷または局所的な電荷分布が変化する事により影響をうけ得る。ｍＡｂの電荷変異体は、酸性種、塩基性種および主要種として特定される。本明細書で使用される場合、用語、ｍＡｂの「主要種」、「主要ピーク」または「主要変異体」は、中性の等電点（ＰＩ）を持つ、主要ピークとして溶出されるｍＡｂを指す。本明細書で使用される用語、ｍＡｂの「酸性種」または「酸性変異体」は、主要種よりも低いｐＩを持つ変異体を指す。本明細書で使用される場合、用語、ｍＡｂの「塩基性種」または「塩基性変異体」は、主要種よりも高いｐＩを持つ変異体を指す。ｍＡｂのＣ末端リジン残基は正電荷を付加し、ｍＡｂの塩基性種の増加をもたらす。抗体産生において内在性カルボキシペプチダーゼによるＣ末端リジン残基の切断が非効率的であることが、０、１つまたは２つのＣ末端リジンを持つｍＡｂをもたらす主要な理由の１つである（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０１５）。

電荷変異体は、電荷に基づく分離技術、例えば等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ（ＩＥＦ））ゲル電気泳動法、キャピラリー等電点（ｃＩＥＦ）ゲル電気泳動法、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）法および陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）法を使用する事によって分離され得る。本明細書では、電荷変異体種を、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅｉＣＥ３ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｗｉｔｈａｎＡｌｃｏｔｔ７２０ＮＶａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを使用して、画像キャピラリー等電点（ｉＣＩＥＦ）法によって解析した。サンプルを適切なｐＩマーカー、両性電解質（ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ）および尿素と混合し、そしてフルオロカーボンでコーティングしたキャピラリーカートリッジに注入した。高電圧を印加し、この電圧下でカラム内にｐＨ勾配が形成された。電荷変異体はそれぞれのｐＩに移動した。ＵＶカメラで２８０ｎＭにおける画像を撮影した。主要ピークを特定し、および酸性域および塩基性域に移動したピークを合計、定量し、相対パーセント面積として報告した。

電荷変異体のプロファイルを制御するいくつかの方法には、銅濃度の低い細胞培養培地の使用（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２０１６）、培地中のリジン濃度の調製、温度シフト（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２０１６）、培養期間の延長、リジンのＣ末端の欠失を持つｍＡｂの構築（Ｌｕｏｅｔａｌ．，２０１２；Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，２０１６）を含む。これらの戦略は、細胞培養段階の最中かそれ以前に起こるため、よって複数の経路に総じて影響を及ぼし、および予測できない全体的な細胞培養特性、力価特性、または製品の品質に繋がり得る。米国特許第５，６７２，３４７号は、清澄化バルクにカルボキシペプチダーゼを添加する方法を開示し、これは余分な工程およびインキュベーション時間を伴う。

対照的に、本発明の方法は、これらの細胞培養物に影響を及ぼす不確定要素を避けるために、カルボキシペプチダーゼを細胞培養物製造段階の終点近くで使用する。添加されたカルボキシペプチダーゼは通常の下流の精製過程を経て除去されるため、当初の運転設計を何ら変更する事なく、この導入した新しい実体を除去するための追加的な工程は必要ない。これは手順全体を大きく簡略化する。

電荷変異体プロファイルはｍＡｂ依存的であり、およびあるｍＡｂ（例えばｍＡｂ－１）は、細胞培養中に宿主細胞から分泌された際に、塩基性種の割合が高く、および主要種の割合が低い。例えば、生産バイオリアクターで１０日間培養した後のｍＡｂ－１塩基性種の割合は８パーセント超である。生産時間が長くなればなるほどｍＡｂ塩基性変異体の割合は増加し続けることになる。したがって、これらのｍＡｂについて、高力価であるがｍＡｂ塩基性変異体の割合は低いままで生産期間をより長くする事は不可能かもしれない。本発明では、塩基性変異体の割合が高いという問題をもつこれらのｍＡｂについて、生産バイオリアクター中での細胞培養期間を１０日から１４日に延長し得る。本方法は、同様の電荷変異体プロファイルの問題を有する他の生物製剤に適用し得る。

本発明において、本出願人らは、工業的ＣＨＯ細胞株を使用したｍＡｂ－１生産のための強化細胞培養過程の品質および生産性を改善するための、単純、堅牢および費用対効果の高いＣｐＢ処置方法を開発した。強化過程、例えば非灌流Ｎ－１によって強化された過程Ｂ、灌流Ｎ－１によって強化された過程Ｃ、および生産段階における灌流によって強化された過程Ｄ、は従来のフェドバッチ製造過程Ａに比して非常に高い生産性を達成した。しかし、強化フェドバッチ過程ＢおよびＣではかなり早期に収穫する必要があり、および灌流過程Ｄは主要ピークが低く、リリース規格に適合しなかったため実施できなかった。低い主要ピークは、強化過程に関してＣ末端リジン変異体がより多いために塩基性種が多くなることに主に起因する。ＣｐＢ処置後、Ｃ末端リジンは効果的に除去され、全ての強化過程について、塩基性種の顕著な減少および主要ピークレベルの増加をもたらし、培養期間全体にわたってリリース規格を満たしていた。ＣｐＢ処置後のより長い細胞培養生産ウィンドウにおいて、フェドバッチ過程ＢおよびＣはより高い最終力価を達成した。加えて、下流の過程におけるＣｐＢのクリアランスは、ＣｐＢ処置の有無に依らず、下流工程の収量および工程内品質特性プロファイルが類似する事によって実証された。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、目的のｍＡｂの塩基性種を低減するために十分な量で培養細胞に添加される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、目的のｍＡｂの主要種を増加させるために十分な量で培養細胞に添加される。

宿主細胞
細胞培養物およびタンパク質の発現に感受性のある任意の哺乳類細胞または細胞種が本発明に従って利用され得る。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の非限定的な例には、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣＮｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞±ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒｅｔａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４－６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌由来細胞株（ＨｅｐＧ２）を含む。本発明の１つの実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞株である。

哺乳類細胞培養物の提供
目的のタンパク質を発現する細胞を特定したら、当該細胞を、当分野で当業者に知られた様々な方法のいずれかによって培養物中に増殖させる。目的のタンパク質を発現する細胞を、典型的には細胞の生存、増殖および生存率に資する温度および培地中において成長させる事で増殖させる。初期培養量は任意の規模であり得るが、通常は目的のタンパク質の最終的な製造において使用される生産バイオリアクターの培養量よりも小さく、および生産バイオリアクターへの播種の前に、段階的に容量を増したバイオリアクター中で細胞を何度か継代する事も多い。細胞が特定の生細胞密度に達したら、さらに生存細胞数を増加させるために細胞をバイオリアクター中で成長させる。これらのバイオリアクターはＮ－１、Ｎ－２、Ｎ－３などと呼ばれる。例えば、「Ｎ」は本生産培養バイオリアクターを指し、「Ｎ－１」は本生産培養の前のバイオリアクターを意味する等である。

一般に、Ｎ－１の細胞培養物は、次の生産バイオリアクターへの播種前に所望の密度まで増殖させ得る。播種の前に、細胞の大部分が生存を保っている事が好ましいが、完全や完全に近い生存率は要求されない。

発現タンパク質の生産
生産段階において、細胞は、目的のタンパク質、例えば目的のｍＡｂを生産することに主眼を置いて培養される。生産段階は、一般的に細胞培養物製造の「Ｎ」または最終段階と呼ばれる。一般に、生産バイオリアクターは、目的のタンパク質（例えば、ｍＡＢ）の生産のための細胞培養物の生産段階において使用される最終的なバイオリアクターに適用される。大規模細胞培養物生産バイオリアクターの容量は、典型的には少なくとも５００リットル、および１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００リットルもしくはそれ以上、またはその間の任意の容量であり得る。当業者であれば本発明の実施において使用するための好適なバイオリアクターを認識し、選択する事ができるはずである。

本発明のある態様では、細胞培養物は灌流、バッチ、またはフェドバッチ細胞培養物である。ある好ましい態様では、生産バイオリアクター中の細胞培養物はフェドバッチ細胞培養物である。

細胞株工学、培地の開発およびバイオリアクターの最適化による細胞培養物生産期間の延長はここ何十年かにおけるフェドバッチ過程の力価改善のための主要な戦略の１つである。（Ｄｒｕｚ，Ｓｏｎ，Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ，＆Ｓｈｉｌｏａｃｈ，２０１３；Ｆａｎｅｔａｌ．，２０１５；Ｐｏｗｅｒｓｅｔａｌ．，２０１９；Ｗｕｒｍ，２００４）。細胞培養物生産期間に関わらず、１つの生産バッチではＶＣＤをピークにするための同様の細胞増殖時間、バッチ間のターンアラウンド時間ならびに、シードの増殖、培地の調製およびバイオリアクターの操作を含むバッチのセットアップに同様のコストを要する（Ｃｈｅｎ，ｅｔａｌ．，２０１８；Ｘｕ，ｅｔａｌ．，２０２０）。よって、定常期において細胞培養物生産ウィンドウを延長することによる力価の増加は、製造の生産性を向上し、製造コストを低下させ得る（Ｗｕｒｍ，２００４；Ｘｕｅｔａｌ．，２０１２；Ｘｕ，ｅｔａｌ．，２０２０）。とはいえ、２週間以上の期間にわたるフェドバッチ細胞培養物は、やがて毒性代謝産物の増加、ＶＣＤの低下および細胞生存性の低下を伴う死滅期に入り、製品の品質の低下をもたらし得る（Ａｒｄｅｎ＆Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ，２００４；Ｈｅｎｒｙｅｔａｌ．，２０２０）。ある場合では、品質要件およびリリース規格を満たすために、フェドバッチ細胞培養物を定常期の最中でより早めに収穫する事が要求され得る。

ここでは、１４日目において主要ピークが規格を満たさなかったため、強化過程ＢおよびＣを早期に終了する必要があった（図１Ａ～Ｃ）。しかし、ＣｐＢ処置後では、全ての強化過程についての全期間にわたって主要ピークは規格を満たした（図１Ａ～Ｃ）。過程Ｂは１０日から１４日に延長され、ＣｐＢ処置によって空間収率は３８％向上し、最終原薬１ｇあたりの上流消耗品コストは２２％低下した。同様に、過程Ｃは６日から１４日に延長され、空間収率は１０８％向上し、および上流消耗品コストは４６％低下した（図１Ａ～Ｃ、および表２）。従来の過程Ａと比較して、このＣｐＢ処置工程の追加および以前に記載された過程強化戦略によって、過程Ｂ、ＣおよびＤについて、空時収率はそれぞれ３．７倍、５．４倍および１１倍と大幅に向上した（図１Ａ～Ｃ）。

Ｃ末端リジンレベルに影響する他の緩和戦略、例えば細胞株工学および細胞培養培地および過程の最適化が文献において報告されている。Ｈｕら（Ｈｕｅｔａｌ．，２０１７）は、Ｃ末端リジン欠失ＤＮＡ配列を持つＣＨＯ細胞は実際にＣ末端リジン関連塩基性変異体をより少なく産生するが、しかし野生型ＣＨＯ細胞よりもプロリンのアミド化が多いため、力価の低下および塩基性種全体の増加がもたらされた事を報告している。さらに、Ｃ末端リジンおよびグリシン欠失ＣＨＯ細胞は、野生型ＣＨＯ細胞よりも少ない塩基性種および同等の力価を産生する事が明らかになった。とはいえリジンおよびグリシン欠失ｍＡｂの安全性は、商業的製造に使用する前に患者において試験される必要が依然ある（Ｈｕｅｔａｌ．，２０１７）。また、カルボキシペプチダーゼＤ遺伝子をノックアウトした後、ＣＨＯ細胞は、ｍＡｂ重鎖の末端に１００％Ｃ末端リジンを産生した（Ｈｕｅｔａｌ．，２０１６）。これはＣ末端リジンの不均一性を排除するための別の解決策を提供するが、Ｃ末端リジンを最小限に抑制するという本発明者らの目的とは反対であり、そのため細胞株を変更してより均一な製品を生産する事は選択肢に入らない。一般に、細胞株の変更は、細胞株の生成、リードクローンのスクリーニングおよび新規過程の開発のために必要な時間のために長い時間を必要とするだろう。最も重要なことに、開発の段階によっては、細胞株の変更は、規制当局の厳しい調査が要求される大きな過程変更である。したがって、細胞株の変更は、今回開発した酵素処置を採用するよりも実施が困難であり得る。

Ｃ末端リジンの調節はまた、細胞培養培地を使用したアプローチが行われてきた。銅濃度を低くすることおよび亜鉛濃度を高くする事（Ｌｕｏｅｔａｌ．，２０１２；Ｙｕｋｅｔａｌ．，２０１５）および培地中のリジン濃度を調節する事（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０１５）が、Ｃ末端のレベルを低下させるために使用され得る。過程制御戦略について、低温への温度のシフトが細胞培養物における主要ピークレベルを増加させることがよく研究されている（Ｋｉｓｈｉｓｈｉｔａｅｔａｌ．，２０１５；ＭｃＨｕｇｈ，Ｘｕ，Ａｒｏｎ，Ｂｏｒｙｓ，＆Ｌｉ，２０２０）。しかし、これらの培地および温度シフト戦略は、予想通り細胞株および過程に依存する事となる。

本発明のある実施形態では、バイオリアクター中で目的のタンパク質を産生するため、細胞を規定期間増殖させる。例えば、細胞培養物の開始濃度、細胞増殖温度および細胞固有の増殖速度に応じて、細胞を５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日以上バイオリアクター中で増殖させ得る。本発明の実施者は、ポリペプチドの生産要件および細胞自体の要求に応じて増殖期間を選択できる。本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、生産バイオリアクター中で少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、または少なくとも２２日間細胞を増殖させた後で添加される。

生産バイオリアクターの運転終了時において、細胞培養物ブロスを取り出し、細胞および細胞残渣を除去して収穫し、タンパク質の生成に好適な清澄化バルクを得る。これは一般に、規模および設備能力に応じて、遠心分離、深層濾過および無菌濾過を含むがこれに限定されない、任意の好適な技術によって達成される。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは細胞培養物の生産段階の任意の時点において添加される。本発明のいくつかの態様では、収穫の０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４時間、またはそれ以上、またはその間の任意の時間前、または収穫中に、生産バイオリアクター中で増殖する細胞に添加される。本発明のある好ましい態様では、カルボキシペプチダーゼは収穫の約２時間前に添加される。

本発明のある態様では、生産バイオリアクターにカルボキシペプチダーゼを添加した後で、培養温度はそれ以前の培養条件に使用されたものと同じ温度に維持されるか、または温度はシフトされる。当分野における当業者は、本発明の実施における使用のために好適な温度を認識し、選択することができるはずである。

本発明のある態様では、生産バイオリアクターにカルボキシペプチダーゼを添加した後で、培養ｐＨはそれ以前の培養条件に使用されたものと同じｐＨに維持されるか、またはｐＨはシフトされる。ある態様では、カルボキシペプチダーゼの添加後、ｐＨは７．０よりも高い。当分野における当業者は、本発明の実施における使用のために好適なｐＨを認識し、選択することができるはずである。

本発明において開発されたＣｐＢ処置は、単純、堅牢、柔軟および費用対効果の高い、効率的なＣ末端リジンの除去のための方法を提供し、およびこれは細胞培養物の製造への影響が最小限であると期待される。基礎となるメカニズムの性質上、この酵素処置戦略は同様の品質問題を有する他の過程にも適用し得る。

発現タンパク質の精製
一般に、目的のタンパク質（例えばｍＡｂ）を清澄化バルクから単離および／または精製する事は通常望ましいことである。一般に、清澄化バルクは、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィー）、ウイルス不活化＆深層濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ウイルス濾過、濃縮およびダイアフィルトレーションを含むがこれに限定されない一連の精製工程を経ることとなる。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼはこれらの精製過程のいずれかの間に添加される。

本発明のある実施形態では、本開示は、目的の治療タンパク質の生産性を改善する方法であって、ａ）タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；ｂ）清澄化バルクを回収する工程；ｃ）清澄化バルクを精製過程に供する工程；およびｄ）精製過程にカルボキシペプチダーゼを添加する工程、含む方法を提供する。

本発明のある実施形態では、本開示は、目的の治療タンパク質の生産方法であって、ａ）タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；ｂ）清澄化バルクを回収する工程；ｃ）清澄化バルクを精製過程に供する工程；およびｄ）精製過程にカルボキシペプチダーゼを添加する工程、含む方法を提供する。

組み換え抗体
本発明の方法は任意の抗体の大規模生産のために使用され得る。本発明の範囲内の抗体には、以下を含むがこれに限定されない：Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ^{（登録商標）}）を含む抗－ＨＥＲ２抗体（Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５－４２８９（１９９２）；抗－ＨＥＲ３抗体；抗－ＨＥＲ４抗体；米国特許第５，７２５，８５６号）；抗－ＣＤ２０抗体、例えば米国特許第５，７３６，１３７号におけるキメラ抗－ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」ＲＩＴＵＸＡＮ^{（登録商標）}、米国特許第５，７２１，１０８号における２Ｈ７抗体のキメラまたはヒト化変異体、またはＴｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ（ＢＥＸＸＡＲ^{（登録商標）}）；抗－ＩＬ－８（ＳｔＪｏｈｎｅｔａｌ．，Ｃｈｅｓｔ，１０３：９３２（１９９３），および国際公開第９５／２３８６５号）；ヒト化および／または親和性成熟抗－ＶＥＧＦ抗体、例えばヒト化抗－ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ＡＶＡＳＴＩＮ^{（登録商標）}（Ｋｉｍｅｔａｌ．，ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ，７：５３－６４（１９９２），国際公開第９６／３００４６号，および１９９８年１０月１５日に公開された国際公開第第９８／４５３３１号）を含む抗－ＶＥＧＦ抗体；抗－ＰＳＣＡ抗体（国際公開第０１／４０３０９号）；Ｓ２Ｃ６およびそのヒト化変異体（国際公開第００／７５３４８号）を含む抗－ＣＤ４０抗体；抗－ＣＤ１１ａ（米国特許第５，６２２，７００号，国際公開第９８／２３７６１号，Ｓｔｅｐｐｅｅｔａｌ．，ＴｒａｎｓｐｌａｎｔＩｎｔｌ．４：３－７（１９９１），およびＨｏｕｒｍａｎｔｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ５８：３７７－３８０（１９９４））；抗－ＩｇＥ（Ｐｒｅｓｔａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３－２６３２（１９９３），および国際公開第９５／１９１８１号）；抗－ＣＤ１８（１９９７年４月２２日発行の米国特許第５，６２２，７００号，または１９９７年７月３１日公開の国際公開第９７／２６９１２号）；抗－ＩｇＥ（Ｅ２５，Ｅ２６およびＥ２７を含む；１９９８年２月３日発行の米国特許第５，７１４，３３８号，または１９９２年２月２５日発行の米国特許第５，０９１，３１３号，１９９３年３月４日公開の国際公開第９３／０４１７３号，または１９９８年６月３０日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４１０，米国特許第５，７１４，３３８号）；抗－Ａｐｏ－２受容体抗体（１９９８年１１月１９日公開の国際公開第９８／５１７９３号）；ｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ^{（登録商標）}）、ＣＤＰ５７１およびＭＡＫ－１９５を含む抗－ＴＮＦ－α抗体（１９９７年９月３０日発行の米国特許第５，６７２，３４７号，Ｌｏｒｅｎｚｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１６４６－１６５３（１９９６），およびＤｈａｉｎａｕｔｅｔａｌ．，Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．２３（９）：１４６１－１４６９（１９９５）参照）；抗－組織因子（ＴＦ）（１９９４年１１月９日付与の欧州特許番号第０４２０９３７号）；抗－ヒトα_４β_７インテグリン（１９９８年２月１９日公開の国際公開第９８／０６２４８号）；抗－ＥＧＦＲ（１９９６年１２月１９日公開の国際公開第９６／４０２１０号におけるキメラ化またはヒト化２２５抗体）；抗－ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３（１９８５年５月７日発行の米国特許第４，５１５，８９３号）；抗－ＣＤ２５または抗－ｔａｃ抗体、例えばＣＨＩ－６２１（ＳＩＭＵＬＥＣＴ^{（登録商標）}）および（ＺＥＮＡＰＡＸ^{（登録商標）}）（１９９７年１２月２日発行の米国特許第５，６９３，７６２号参照）；抗－ＣＤ４抗体、例えばｃＭ－７４１２抗体（Ｃｈｏｙｅｔａｌ．，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ３９（１）：５２－５６（１９９６））；抗－ＣＤ５２抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨ－１Ｈ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３３７（１９８８））；抗－Ｆｃ受容体抗体、例えばＧｒａｚｉａｎｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６－５００２（１９９５）におけるＦｃγＲＩに対して指向性のＭ２２抗体；抗－がん胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、例えばｈＭＮ－１４（Ｓｈａｒｋｅｙｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ－５９４５ｓ（１９９５）；ｈｕＢｒＥ－３，ｈｕ－Ｍｃ３およびＣＨＬ６を含む、乳房上皮細胞に対して指向性の抗体（Ｃｅｒｉａｎｉｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５５（２３）：５８５２ｓ－５８５６ｓ（１９９５）；およびＲｉｃｈｍａｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐ）：５９１６ｓ－５９２０ｓ（１９９５））；結腸がん細胞に結合する抗体、例えばＣ２４２（Ｌｉｔｔｏｎｅｔａｌ．，ＥｕｒＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１－９（１９９６））；抗－ＣＤ３８抗体，例えばＡＴ１３／５（Ｅｌｌｉｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：９２５－９３７（１９９５））；抗－ＣＤ３３抗体、例えばＨｕＭ１９５（Ｊｕｒｃｉｃｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ－５９１０ｓ（１９９５）およびＣＭＡ－６７６またはＣＤＰ７７１；抗－ＣＤ２２抗体、例えばＬＬ２またはＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（Ｊｕｗｅｉｄｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５８９９ｓ－５９０７ｓ（１９９５））；抗－ＥｐＣＡＭ抗体、例えば１７－１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ^{（登録商標）}）；抗－ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、例えばａｂｃｉｘｉｍａｂまたはｃ７Ｅ３Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ^{（登録商標）}）；抗－ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ－４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ^{（登録商標）}）；抗－ＣＭＶ抗体、例えばＰＲＯＴＯＶＩＲ^{（登録商標）}；抗－ＨＩＶ抗体、例えばＰＲＯ５４２；抗－肝炎抗体、例えば抗－ＨｅｐＢ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ^{（登録商標）}；抗－ＣＡ１２５抗体ＯｖａＲｅｘ；抗－イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗－αｖβ３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ^{（登録商標）}；抗－ヒト腎細胞癌抗体、例えばｃｈ－Ｇ２５０；ＩＮＧ－１；抗－ヒト１７－１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗－ヒト結腸直腸がん抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対して指向性の抗－ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗－ヒト扁平上皮がん（ＳＦ－２５）；抗－ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、例えばＳｍａｒｔＩＤ１０；抗－ＰＤ－１抗体；抗－ＰＤ－Ｌ１抗体；抗－ＬＡＧ－３抗体；抗－ＧＩＴＲ抗体；抗－ＴＩＧＩＴ抗体；抗－ＣＸＣＲ４抗体；抗－ＣＤ７３抗体；抗－ＩＬ－１３抗体、抗－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体および抗－ＨＬＡＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ－１）。

本発明のある態様では、ｍＡｂはニボルマブである。

本発明のある態様では、本開示は、細胞培養物中の目的のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の不均一性を低減する方法であって、ａ）ｍＡｂを発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、生産バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程であって、ここでｍＡｂ塩基性種の割合は全ｍＡｂの８％よりも高い、工程、ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼを添加する工程；ｃ）清澄化バルクを回収する工程；ｅ）精製過程に供する工程、を含む方法を提供する。

本発明のある態様では、本開示は、細胞培養物中の目的のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の不均一性を低減する方法であって、ａ）ｍＡｂを発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、生産バイオリアクター中で少なくとも１０日間培養する工程であって、ここでｍＡｂ塩基性種の割合は全ｍＡｂの１０％よりも高い、工程、ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼを添加する工程；ｃ）清澄化バルクを回収する工程；ｅ）精製過程に供する工程、を含む方法を提供する。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、ｍＡｂ塩基性種を低減するのに十分なＣＰ：ｍＡｂ比で生産バイオリアクターに添加され、ここで、ＣＰ処置した清澄化バルクにおけるｍＡｂ塩基性種の割合は全ｍＡｂの１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％以下に低下する。

本発明のある態様では、カルボキシペプチダーゼは、ｍＡｂ塩基性種を低減するのに十分なＣＰ：ｍＡｂ比で生産バイオリアクターに添加され、ここで、ＣＰ処置した清澄化バルクにおけるｍＡｂ塩基性種の割合は全ｍＡｂの８％未満に低下する。

本発明のある好ましい態様において、ＣＰ処置した清澄化バルクにおけるｍＡｂ塩基性種の割合は全Ａｂの５％未満に低下する。

前述の記載は、単に代表例であるとして理解されるべきであり、限定する事を意図したものではない。本発明を実施するための代替的な方法および材料、また追加の用途は、当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

実施例１
材料および方法
ｍＡｂ－１についての細胞株、培地および上流の細胞培養過程
本研究におけるｍＡｂ－１（ＩｇＧ４）生産のために、４つの異なる細胞培養過程、過程Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを使用した。内因性グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子を有し、ＧＳを選択マーカーとして使用する事で操作された組み換えＣＨＯ細胞株を、独自の無血清培地を用いて過程Ａに使用した。過程Ｂ、Ｃ、Ｄについては、内因性ＧＳをノックアウトした新しいＣＨＯ細胞株（ＧＳ－／－）を、異なる独自の化学的規定培地で使用することに変更した。

過程Ａは、５日目に３６．５°Ｃから３４°Ｃへの温度シフトを伴う５０００Ｌおよび１５，０００Ｌのバイオリアクター規模での商業的製造に使用される、接種細胞密度０．３×１０^６細胞／ｍＬでの従来的な１４日間のフェドバッチ過程であった。過程Ｂは、富化Ｎ－１シード培養物を伴う強化フェドバッチ過程であり（Ｙｏｎｇｋｙｅｔａｌ．，２０１９）、１４日間のプロセスの６日目に３６．５℃から３４℃への温度シフトを伴い、３Ｌの初期作業量から開始して５Ｌバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中での目標接種細胞密度を３×１０^６細胞／ｍＬとして、開発された。過程Ｃは、灌流Ｎ－１シード培養物を伴う強化フェドバッチ過程であり（Ｊ．Ｘｕ，Ｒｅｈｍａｎｎ，Ｘｕ，ｅｔａｌ．，２０２０）、１４日間のプロセスの４日目に３６．５℃から３４℃への温度シフトを伴い、３Ｌの初期作業量から開始して５Ｌバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中での目標接種細胞密度を１５×１０^６細胞／ｍＬとして、開発された。過程Ｄは、１Ｌの作業量から開始して、３Ｌバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，ＵＳＡ）中での目標接種細胞密度が１０×１０^６細胞／ｍＬであり、全期間にわたって３６．５°Ｃである、灌流生産過程である。０日目から、ＡＴＦ１システム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用した培地交換を行い、５０×１０^６細胞／ｍＬの目標ＶＣＤに到達するまで、２～４バイオリアクター容量あたり培地量／日（ｖｏｌｕｍｅｏｆｍｅｄｉａｐｅｒｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｖｏｌｕｍｅｐｅｒｄａｙ）（ＶＶＤ）にゆっくりと増量した。過程Ｄのバッチ１は、目標ＶＣＤに５日目に到達した。その後バッチ１についての培地交換について「Ｐｕｓｈ－ｔｏ－Ｌｏｗ」（Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖｅｔａｌ．，２００６）戦略を使用し、５日目～１１日目に４ＶＶＤ、１１日目～１８日目に３ＶＶＤ、１８日目～２５日目に２ＶＶＤ、および２６日目～３１日目に１ＶＶＤを用いた。過程Ｄのバッチ２は目標ＶＣＤに６日目に到達し、その後培地交換を２ＶＶＤに変更し、２１日間の運転期間中維持した。

ｍＡｂ－１に関する上流の細胞培養物力価、生産性およびその他の工程内アッセイ
産物濃度または力価（ｇ／Ｌ）をタンパク質ＡＵＰＬＣを使用して測定した。フェドバッチ法と灌流法の生産性を比較するために、本研究では空時収率または全体の容量あたり生産性（ｇ／Ｌ／日）および空間収率（ｇ／Ｌ）を使用した。空時収率は、０日目からｍＡｂ－１濃度を測定した日までの培養期間にわたっての、培養容量１Ｌ当たりの生産された全ｍＡｂ－１と定義される（Ｂａｕｓｃｈｅｔａｌ．２０１９）。空間収率とは、本研究で提示する新しい細胞培養用語であり、培養容量１Ｌ当たりの生産された全ｍＡｂ－１として定義する。フェドバッチ過程の空間収率はバイオリアクター力価に等しく、一方で、産物を含む細胞培養物ブロスがバイオリアクターから除去されつつ新鮮な培地がバイオリアクターへと供給され続けるため、灌流過程の空間収率はバイオリアクター力価よりもかなり大きい。正規化空間収率または力価（正規化重量／Ｌ）は、過程Ｂの１０日目平均力価を１００％として、さらに相対的に正規化した。正規化空時収率（正規化重量／Ｌ／日）は、正規化空間収率（過程Ｂの１０日目平均力価に対する相対値）を培養期間で除算したものに等しい。

その他の工程内細胞培養物アッセイは、以下のように行った。オフラインｐＨ、ｐＣＯ２およびｐＯ２を、ＢｉｏｐｒｏｆｉｌｅｐＨＯｘａｎａｌｙｚｅｒ（ＮｏｖａＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＵＳＡ）を使用して検出した。ＶＣＤおよび細胞生存率をＶｉ－ＣＥＬＬＸＲａｕｔｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｃｏｕｎｔｅｒ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）を使用してオフラインで測定した。グルコース、グルタミン、グルタミン酸、乳酸およびアンモニアを、ＣＥＤＥＸＢｉｏＨＴａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）を使用して計測した。

ＣｐＢ処置方法
完全なＣ末端リジン残基の切断のためのＣｐＢ処置プロトコルは以下である：ＣｐＢ酵素濃度は、２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌおよび１００ｍＭＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．６中に、ＣｐＢ：ｍＡｂ比１％（ｗ／ｗ）であり、３７°Ｃで一晩インキュベートした。この方法を、全細胞培養物または上清を含む様々なマトリクスに適用した。ｍＡｂ－１についてのＣｐＢ処置プロトコルは、０．０１％（ｗ／ｗ）の非常に低濃度のＣｐＢを、３４°Ｃ、２時間で使用し、この場合も同様に完全なＣ末端リジンの切断を達成した。ｍＡｂ－１の全細胞培養物および上清のｐＨ値はｐＨ７．５～８．０の最適範囲内であったため、全細胞培養物および上清のｐＨ調製は行わなかった。バイオリアクターサンプルを１０００ｇで１０分間遠心分離することで上清を得た。ＣｐＢ処置に使用した上清は、新鮮に調製されたもの、または－８０°Ｃで保存した冷凍サンプルを解凍したもののいずれかであった。異なるｐＨおよび温度での研究に関する方法は結果の節に記載する。

異なる供給源に由来する３つの異なるＣｐＢ製品を本研究において使用した：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から製造された組み換えＣｐＢ（ＰｒｏＳｐｅｃ－ＴａｎｙＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅＬｔｄ．，Ｉｓｒａｅｌ）、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓから製造されたＧＭＰグレードの組み換えＣｐＢ（Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）、およびブタの膵臓から抽出されたブタＣｐＢ（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）。

下流過程およびＣｐＢクリアランスの研究
下流過程のための細胞培養物を生成するため、およびＣｐＢクリアランスを評価するために、結果の節に記載するように、２つの過程Ｂの５Ｌバイオリアクターを使用した。１４日目の収穫において、収穫前の１つの５Ｌ全細胞培養物を０．０５％（ｗ／ｗ）ＣｐＢで３４°Ｃで２時間処置し、もう一方の５ＬバイオリアクターはコントロールとしてＣｐＢ処置なしで３４°Ｃで２時間維持した。その後、処置したまたは未処置の５Ｌ全細胞培養物の両者を同一の下流工程を経て処理した。１０００ｇで３０分間遠心分離した後、上清を０．２μｍ無菌濾過によって濾過した。その後、清澄化バルクを、以下：タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによる精製、低ｐＨウイルス不活化および深層濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、限外濾過およびダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）による濃縮、から構成される下流工程を経て処理し、最終的な製剤化ＤＳを生成した。

製品の品質特性
全細胞培養物および上清サンプルの品質特性の評価のためには、品質特性アッセイに供する前にタンパク質Ａクロマトグラフィーによる精製が必要である。タンパク質Ａ工程の後の下流の工程内のサンプル（タンパク質Ａ溶出、ＨＩＣおよびＣＥＸプール等）は直接、品質特性アッセイに供される。

電荷変異体種（主要、酸性および塩基性ピーク）を、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅｉＣＥ３ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｗｉｔｈａｎＡｌｃｏｔｔ７２０ＮＶａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、画像キャピラリー等電点（ｉＣＩＥＦ）法によって解析した。サンプルを適切なｐＩマーカー、両性電解質（ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ）および尿素と混合し、そしてフルオロカーボンでコーティングしたキャピラリーカートリッジに注入した。高電圧を印加すると、電荷変異体はその各々のｐＩに従って移動した。ＵＶカメラで２８０ｎＭにおける画像を撮影した。主要ピークを特定し、および酸性域および塩基性域に移動したピークを合計、定量し、相対パーセント面積として報告した。主要ピークについてのｍＡｂ－１の規格を１００％に正規化した。正規化した主要ピークレベルが１００％以上である場合、ｍＡｂ－１原薬は規格を満たす。正規化した主要ピークレベルが１００％未満である場合、ｍＡｂ－１原薬は規格を満たさない。全ての主要ピークレベルおよび塩基性種レベルを、本研究においてはこのＤＳ規格を１００％として使用して、主要ピーク値に対して正規化した。酸性種のレベルは全ての過程についてＣｐＢ処置に依らず十分に規格内であったため、酸性種のレベルは報告しなかった。

Ｎ－グリカン解析を、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）のＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳｋｉｔを使用して行った。遊離のオリゴ糖を、温度制御オートサンプラーおよび蛍光検出器を備えたＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＨ－Ｃｌａｓｓｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で、ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅ，１３０Å，１．７μｍ，２．１×１０ｍｍｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用したグラジエント溶出により解析した。

不純物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨ２００，４．６ｍｍ×３０ｍｍ，１．７μｍとＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎとを連結し、温度制御オートサンプラーおよびＷａｔｅｒｓ２９９６ＰＤＡｄｅｔｅｃｔｏｒを備えたＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で、２８０ｎｍで監視するアイソクラティックグラジエントを使用して行った。

サンプルを、ＣＥ－ＳＤＳによるタンパク質の純度のために、還元条件および非還元条件の両者において調整した。その後、サンプルを、ＵＶｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＡＢＳｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）および５０μｍｉｎｔｅｒｎａｌｄｉａｍｅｔｅｒｐｒｅ－ｃｕｔｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓを備え、Ｋａｒａｔｓｏｆｔｗａｒｅを使用するＰＡ８００ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ上に注入した。１５ｋＶの定圧を印加して分離を行った。データはＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）のＥｍｐｏｗｅｒ３ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してエクスポートおよび解析した。

ＨＣＰを、過程特異的なサンドイッチ酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量した。サンプルをＶＷＲ（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）のコーティングされたアッセイプレート上にロードし、吸光度をＴｅｃａｎＩｎｃ．（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ，ＵＳＡ）のＭａｇｅｌｌａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００Ｐｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒを使用して測定した。濃度は４－ｐｒａｒａｍｔｅｒｌｏｇｉｓｔｉｃｃｕｒｖｅｆｉｔｔｉｎｇアルゴリズムを使用して逆算した。

残存宿主細胞ＤＮＡを、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）のフォワードおよびリバースプライマー、およびＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＴａｑＭａｎａｎｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔを使用したｑＰＣＲによってアッセイした。サンプルをＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）の７９００ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍを使用して解析し、データは標準曲線を使用して処理した。

残存タンパク質Ａを、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）の市販のＥＬＩＳＡキットを使用してアッセイし、吸光度をＴｅｃａｎＩｎｃ．（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ，ＵＳＡ）のＭａｇｅｌｌａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００Ｐｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒを使用して測定した。濃度は４－ｐｒａｒａｍｔｅｒｌｏｇｉｓｔｉｃｃｕｒｖｅｆｉｔｔｉｎｇアルゴリズムを使用して逆算した。

精製工程を通じて、残存ＣｐＢをＥＬＩＳＡによって測定した。抗ＣｐＢ抗体は社内で生成したが、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．，ＵＳＡから購入した。

上流のコスト分析
上流の消耗品コストは、発明者らの以前の出版物（Ｊ．Ｘｕ，Ｘｕ，ｅｔａｌ．，２０２０）において詳細に記載されるように、最終的な製剤化ＤＳ１ｇあたりのドルとして計算された。本研究において、全ての上流コストは、１０日目に収穫された過程Ｂについてのコストを１００％として正規化した。略述すると、上流の消耗品コストは、培地、フィルター、プローブおよびバッグに焦点を当て、下流の処理（収穫を含む）コストは含めなかった。本研究において記載される強化ラボ過程は、５Ｌのバイオリアクターと同じ力価または空間収率、および同じ原材料消費率で２０００Ｌの使い捨てバイオリアクター規模にスケールアップできると仮定した。ＤＳリリース規格を満たすためにＣｐＢ処置により主要ピークを増加させることが必要とされるため、１４日目の過程Ｂおよび過程Ｃについて、０．０１％（ｗ／ｗ）での追加的なＣｐＢコストを仮定した。ＤＳ１ｇあたりの上流コストを算出するために、ラボスケールでの性能に基づいて下流全体の収率を７０％と仮定した。

結果
ＣｐＢ処置による強化過程の、ｍＡｂ－１の生産性および品質（主要ピーク）の改善
従来的な製造過程ＡからのｍＡｂ－１の生産性を改善するために、本報告において３つの強化過程が開発された。方法の節に記載するように、空間収率（新しい用語であり、本研究においてバイオリアクター培養物１Ｌ当たりの生産されたタンパク質の全グラム数として定義する）および空時収率を、異なるフェドバッチ過程および灌流過程の生産性の比較のために使用した。空時収率は、フェドバッチ過程におけるバイオリアクターの力価に等しいが、灌流によって産物がバイオリアクター外に除去されるために連続過程についてはバイオリアクターの力価よりもかなり大きくなる。目標接種細胞密度０．３×１０^６細胞／ｍＬの過程Ａでは、１４日目において、３７．０±２．４％（正規化重量／Ｌ）の正規化空間収率（または力価）、および２．６±０．２％（正規化重量／Ｌ／日）の正規化空時収率（または全体の容量あたり生産性）が得られた（ｎ＝２９）。目標接種細胞密度３×１０^６細胞／ｍＬのフェドバッチ過程Ｂは、Ｎ－１シードにおいて富化培地を使用する事で強化され、１４日目における正規化空間収率が１３８±５％（正規化重量／Ｌ）および正規化空時収率が９．９±０．９％（正規化重量／Ｌ／日）（ｎ＝４）であった（図１Ａ）、一方で目標接種細胞密度１５×１０^６細胞／ｍＬのフェドバッチ過程ＣはＮ－１シード培養について灌流することで強化され、１４日目における正規化空間収率が１９８±２％（正規化重量／Ｌ）（ｎ＝４）であり、および正規化空時収率が１４．１±０．２％（正規化重量／Ｌ／日）（ｎ＝４）で得られた（図１Ｂ）。灌流過程Ｄは、生産工程における灌流によって強化した。方法の節において記載するように「Ｐｕｓｈ－ｔｏ－Ｌｏｗ」戦略による可変培地交換率を持つ過程Ｄのバッチ１では、３１日目において９９４％（正規化重量／Ｌ）の正規化空間収率を得た（図１Ｃ）。過程Ｄのバッチ１では、１７日目において３０％（正規化重量／Ｌ／日）の正規化空時収率を得て、およびその後１７日から３１日までの間、バッチ１の正規化空時収率は３０～３３％（正規化重量／Ｌ／日）の間で維持された（図１Ｃ）。２ＶＶＤの固定培地交換率を持つ過程Ｄのバッチ２では、２１日目において５９９％（正規化重量／Ｌ）の正規化空間収率を得た（図１Ｃ）。過程Ｄのバッチ２では、１８日目において２８％（正規化重量／Ｌ／日）の正規化空時収率を得て、およびその後１８日から２１日までの間、バッチ２の正規化空時収率は２８～２９％（正規化重量／Ｌ／日）の間で維持された（図１Ｃ）。

上記のように、強化過程の空間収率および空時収率は過程ＢからＣ、およびＤへと顕著に増加し、いずれも過程Ａに比して実質的に改善した。しかしフェドバッチ過程Ｂ（図２Ａ）およびＣ（図２Ｂ）の両者ともに、主要ピークのレベルは、培養期間の増加につれて顕著に減少した。この特定のｍＡｂ－１について、主要ピークのＤＳ規格限界は１００％（正規化値）であり、これは商業的生産における過程Ａに基づいて設定された。細胞培養物の生産性の改善は大きな利点であるが、タンパク質の品質特性はリリース規格を満たす必要がある。したがって、空間収率は１４日の期間全体にわたって増加するが、過程Ｂについては１０日目（図１Ａ）および過程Ｃについては６日目（図１Ｂ）に収穫する必要があった。灌流過程Ｄは、全過程の内最も高い空間収率および空時収率を得たが、過程Ｄの主要ピークレベルは培養期間全体を通じて規格限界以下であったため（図２Ｃ）、過程Ｄは製造において実装できなかった。なお、電荷変異体プロファイルは下流過程の間で変化しなかった事に留意すべきである。その他の品質特性、例えばＳＥＣ不純物およびＮ－グリカンは、本研究において、細胞培養期間にかかわらず、強化工程Ｂ、ＣおよびＤでは問題視されなかった（データは示さず）。

２５～６５％の範囲である強化過程における正規化塩基性種レベル（図３）は、５～１８％である過程Ａによりもかなり高かった（ｎ＝１６４）。強化過程の例として図４に示すように、塩基性種は主にＣ末端リジンによるものであり、これは標準的なＣｐＢ処置アッセイの後の値が実質的に低下する事から実証された。ＣｐＢ処置後、塩基性種の大部分は主要ピークへと変換され、主要ピークは９１．８％から１０７．７％に増加した。９１．８％の主要ピークは規格（すなわち主要ピークが１００％以上）を満たさないが、ＣｐＢ処置後の１０７．７％の主要ピークは規格を満たしている（図４）。なお、酸性種のレベルは、ＣｐＢ処置に関わらず、過程Ｂ、ＣおよびＤからの全てのサンプルについて規格を満たしていた事は留意されるべきである（データは示さず）。したがって、ＣｐＢ処置後の酸性種の変化は問題視されず、本研究においては主要ピークおよび塩基性種についてのみ報告する。

複数の時点における、過程Ｂ、ＣおよびＤから生成された全ての工程内サンプルについて、ＣｐＢ処置を行い、その主要ピークレベルへの影響を評価した。図２に示すように、ＣｐＢ処置後（破線）、全ての強化過程について塩基性種の減少に伴い主要ピークレベルが実質的に増加した（図３）。全ての強化過程について、試験期間の全体にわたって、異なる時点での正規化主要ピークレベルは１００％を超えていた（図２）。したがって、過程Ｂについて細胞培養期間を１０日から１４日に延長する事ができ、最終的な収穫力価は平均で３８％増加した（１０日目の力価との比較、図１Ａ）、および過程Ｃについて細胞培養期間を６日から１４日に延長する事ができ、最終的な収穫力価は平均で１０８％増加した（６日目の力価との比較、図１Ｂ）。過程Ｄについて、ＣｐＢ処置（図２Ｃおよび３Ｃ）は最も顕著な影響を有し、この過程が製造において実行可能な選択肢となり得ることを可能にした。

ｍＡｂ－１についてのＣｐＢ処置の最適化
予備的なラボでの試験の後で（データは示さず）、２時間の反応時間はＣ末端リジンの除去のために十分であり、生物学的製造作業における実装に容易であるため、２時間のＣｐＢ処置を選択した。最初の酵素：ｍＡｂ比１％（ｗ／ｗ）に基づいてＣｐＢ処置方法をさらに最適化した。第１に、異なるマトリクスにおける酵素濃度を、ＣｐＢ処置効率について評価した。全細胞培養物ブロスにおいて、標準的なＣｐＢ処置方法（例えば、１％（ｗ／ｗ）酵素濃度）は期待通り塩基性種の大部分を主要ピークへと変換した（図５）。ＣｐＢ濃度を１００分の１に減らして０．０１％としても、１％（ｗ／ｗ）のＣｐＢでの標準的な処置と同等の効率が得られる事が観察された（図５）。加えて、０．０１％（ｗ／ｗ）ＣｐＢ濃度はまた、細胞培養上清およびＴｒｉｓ緩衝液中においてもよく機能した。とはいえ、図５に示すように、ＣｐＢ濃度を０．００１％（ｗ／ｗ）まで低下させると、細胞培養上清（ｔ検定、ｐ＜０．０００１）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｔ検定、ｐ＜０．０１）の両者において、主要ピークレベルは０．０１％（ｗ／ｗ）での処置に比して顕著に低下した。Ｃ末端リジンの効果的な切り取りを確実にするため、０．０１％（ｗ／ｗ）の濃度を選択し、以降の全ての研究を進めた。

第２に、ＣｐＢ処置の温度を研究した。フェドバッチ細胞培養は３６．５°Ｃで開始し、３４°Ｃの低温へとシフトさせ、一方で、収穫および下流の精製工程は室温で行った。したがって、室温から、３２、３５、および３６．５°Ｃにわたる異なる温度を、０．０１％（ｗ／ｗ）ＣｐＢを２時間で使用して研究した（図６）。室温および３６．５°Ｃ間で、類似の高いＣｐＢ処置効率が観察された（図６）。

第３に、ｐＨの影響を研究した。フェドバッチ過程はｐＨ６．５～８．０で操作され得るが、下流工程は通常さらに広いｐＨ範囲で操作される。したがって、０．０１％（ｗ／ｗ）ＣｐＢを３４°Ｃ、２時間で用いて、ｐＨ５～９の範囲のｐＨの影響を評価した。３４℃という温度は、操作を容易にするために、最終的なＣｐＢ処置工程が細胞培養過程の最後に行うことが好ましいために選択されたものであり、これについては、本研究の後半で詳しく説明する。塩基性種から主要ピークへの変換は、ｐＨ７．２～８．９で同様の高い効率が観察されたが、ｐＨ６．０～７．０では約４％低い効率が観察された（図７）。ｐＨ５．０では、はるかに低い効率が観察された（図７）。

以上より、ＣｐＢ処置は、全細胞培養物、細胞培養上清（または収穫時の清澄化バルク）、およびＴｒｉｓ緩衝液を含む異なるマトリクスにおいて、広範囲のｐＨおよび温度で有効であると考えられる（図５～７）。ＣｐＢ処置は他の緩衝液、例えばクエン酸塩、リン酸塩においても同様に有効であることが分かった（データは示さず）。理論的には、これらの結果は、バイオリアクターの操作から、収穫および異なる下流の精製工程までの生物学的製造過程の複数の工程のいずれかにＣｐＢ処置を導入し得る事を示唆する（図８）。フェドバッチ過程の細胞培養部の終点において２時間のＣｐＢ処置を導入する事に決めた。その主な理由は以下である。濾過による収穫の開始前にバイオリアクターを３４°Ｃから室温まで冷却するが、これは商業用の生物学的製造において２時間よりも長くかかる。３４°Ｃから室温までの温度範囲および冷却時間は有効なＣｐＢ処置のために理想的である（図６）。細胞培養においては無菌操作が要求されるが、冷却段階の短い時間であれば、ＣｐＢを生産バイオリアクターに添加するために無菌操作は不要であった。これは既存の製造過程への影響を最小限にしつつＣｐＢ処置をより容易にする。全細胞培養物のｐＨはｐＨ７．５～８．０の間であり、処置に最適であった（図７）。最終的な原薬中におけるＣｐＢ（新規原料）のクリアランスは完全に実証される必要があるが、製造バイオリアクター工程の完了時にＣｐＢを導入する事で、収穫および下流の精製工程の間でその効果的な除去が可能である。灌流過程Ｄについては、０．２μｍ無菌濾過およびタンパク質Ａ精製工程の前に、ＣｐＢ処置は、サージ容器中に室温で２時間導入する事ができた。

５Ｌ規模でのＣｐＢ実装過程の実証
最終ＤＳ中において、生物学的製造において使用された全ての原料のクリアランスが実証されなければならないため（ＦＤＡ，２０１６；Ｊ．Ｘｕ，Ｒｅｈｍａｎｎ，Ｔｉａｎ，ｅｔａｌ．，２０２０）、過程Ｂを例として使用して、２つの５Ｌフェドバッチバイオリアクターを行った。一方にはＣｐＢ処置を行い、もう一方には行わず、続く収穫および下流の工程を行った。最終ＤＳにおけるＣｐＢの十分な除去を確実にするために、５倍のＣｐＢレベルである０．０５％（ｗ／ｗ）を使用した。細胞培養物の性能パラメーター、例えばＶＣＤ、細胞生存率および正規化力価は、未処置のコントロール過程Ｂのものと類似していた。タンパク質Ａ工程だけでＣｐＢの２ｌｏｇ以上の低下を示した（図９）。タンパク質Ａの溶出中においてＣｐＢは検出限界よりも低く（＜５０μｇ／Ｌ）、下流の工程の残りにおいても検出できないままであった（表１）。電荷変異体プロファイルに関して、ＣｐＢ処置サンプルの主要ピークレベルは、未処置サンプルのものよりも高く、および下流工程を通して各群（ａｒｍ）について同様のレベルを維持していた（表１）。全ての他の品質特性、例えば工程由来不純物（ｐｒｏｃｅｓｓｒｅｌａｔｅｄｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）および製品由来不純物（ｐｒｏｄｕｃｔｒｅｌａｔｅｄｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）は、この２つの条件間で同等であり、同様の工程と全体の下流収率を達成した（表１）。

ｍＡｂ－１についてのＣｐＢ処置コスト分析
ＣｐＢ処置の実装による細胞培養期間の延長によって、平均最終力価はそれぞれ過程Ｂについて３８％、および過程Ｃについて１０８％向上した（図１および表２）。０．０１％（ｗ／ｗ）ＣｐＢ添加は上流のバッチ当たりの全消耗品コストをわずかに増加させ、過程Ｂでは５％、および過程Ｃでは６％の増加であったが、培養期間を１４日に延長することによって顕著な力価の向上が達成されたため、ＤＳ１ｇあたりの上流の消耗品コストはそれぞれ過程Ｂでは２２％、および過程Ｃでは４６％低下した（表２）。

ＣｐＢ処置の他のｍＡｂ製品への潜在的な応用
ｍＡｂ－１に加えて、６つの他のｍＡｂ製品を、１％（ｗ／ｗ）ＣｐＢ濃度を使用した標準的なＣｐＢ処置方法を用いて試験した。ｍＡｂ－２、ｍＡｂ－３およびｍＡｂ－４について、ＣｐＢ処置により塩基性種が実質的に減少し、および主要ピークが増加した（表３）。ｍＡｂ－５についても、塩基性種および主要ピークにおける効果は明らかであったが、その程度は小さかった。しかし、ｍＡｂ－６およびｍＡｂ－７については、変化は観察されなかった（表３）。塩基性種の減少におけるＣｐＢの有効性の違いは、これらのｍＡｂの細胞培養物におけるＣ末端リジンの存在量の違いに起因するものであった。ＣｐＢ処置はＣ末端リジンによる塩基性種のみを変換し得るが、Ｎ末端ピログルタミン酸、アミド化などの他の分子修飾に起因する塩基性種は変換できなかった。これらの結果は、主要ピークを増加させる事によってタンパク質の均一性を改善するためのＣｐＢ処置戦略を、Ｃ末端リジン種を含むｍＡｂ製品に適用し得る事を示唆する。

実施例２
材料および方法
細胞株、培地および細胞培養過程
独自のヒトｍＡｂ－８の発現のためにＣＨＯＧＳ細胞株を使用し、一方で独自のヒトｍＡｂ－３の発現のためにＣＨＯＤＧ４４細胞株を使用した。独自の化学的規定シード培地、基礎培地およびフィード培地を使用した。バイアルの解凍およびシード増殖工程は、ＣＨＯＧＳ細胞株の選択薬剤としてメチオニンスルホキシミンを含むシード培地、およびＣＨＯＤＧ４４細胞株の選択薬剤としてメトトレキサートを含む別のシード培地を含む振盪フラスコ（ＣｏｒｎｉｎｇＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。生産培養の接種の前に、少なくとも２週間、３～４日毎に細胞を継代した。フェドバッチ生産細胞培養の運転は、初期容量８０ｍＬの基礎培地および１．５×１０^６細胞／ｍＬの目標接種生細胞密度（ＶＣＤ）を持つシード培養物を含む２５０ｍＬの振盪フラスコ（ｎ＝３）を使用して行った。独自のフィード培地および３００ｇ／Ｌグルコース溶液をフェドバッチ生産培養物への良好な栄養供給を維持するために使用し、１２日目に収穫した。全てのシード培養物および生産培養物を加湿インキュベーター（Ｃｌｉｍｏ－Ｓｈａｋｅｒ，Ｋｕｈｎｅｒ）内で、最初の５日間は、３６．５°Ｃ、５％ＣＯ_２および１５０ｒｐｍの標準的な条件を使用して培養した。その後、全ての生産細胞培養物について、５日目に温度を３４°Ｃに変更し、１２日目の収穫まで培養した。

Ｉｎ－ｖｉｔｒｏＣｐＢ処置プロトコル
本実験における使用の前に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｒｏｃｈｅ）から産生された２．６ｍｇ／ｍＬのＧＭＰグレード組み換えＣｐＢを－２０°Ｃで凍結保存した。Ｃ末端リジン残基を切断するためのｉｎ－ｖｉｔｒｏＣｐＢ処置プロトコルを図１０に示す。使用の直前に１ｍＬの凍結ＣｐＢアリコートを解凍し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ）で５０倍に希釈した。フェドバッチ生産の終点において、各振盪フラスコから、２０ｍＬの全細胞培養物を２つの５０ｍＬファルコンチューブに分注した。１セットのファルコンチューブ（ｎ＝３）をＣｐＢ無しのコントロールとして保管した。もう一方のセットのファルコンチューブ（ｎ＝３）に、５０倍希釈したＣｐＢを、１：１０，０００（ｗ／ｗ）のＣｐＢ：ｍＡｂ比で添加した。続いて、全てのファルコンチューブを同じ生産細胞培養条件（１５０ｒｐｍ、３４°Ｃおよび５％ＣＯ_２）の加湿インキュベーターに戻した。２時間のインキュベーション後、培養物を１０００×ｇで１０分間遠心分離し、および上清を回収し、品質特性アッセイの前に２～８°Ｃで保存した。

工程内細胞培養物および品質特性アッセイ
各振盪フラスコから細胞培養物ブロスをサンプリングし、細胞数、栄養素および代謝産物について直接解析した。ＶＣＤおよび細胞生存率はＶｉ－ＣＥＬＬＸＲａｕｔｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｃｏｕｎｔｅｒ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用してオフラインで定量した。グルコース、乳酸およびアンモニアはＣＥＤＥＸＢｉｏＨＴａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して定量した。

力価測定について、細胞培養物ブロスを１０００×ｇで１０分間遠心分離し、およびその上清をタンパク質ＡＵＰＬＣ法を使用して解析した。正規化重量／Ｌで表される正規化力価は、発明者らの以前の報告（Ｘｕｅｔａｌ．２０２１ｂ）に記載のように、各時点における真の力価（ｇ／Ｌ）をｍＡｂ－１についての１０日目の力価の平均（ｇ／Ｌ）で除算したものに等しい。正規化重量／Ｌ／日で表される正規化容量あたり生産性は、正規化力価の差を２つの時点間の期間で除算したものとして計算した。

品質特性アッセイについて、－８０°Ｃの、ＣｐＢ処置した上清およびＣｐＢ処置しなかった上清の全ての上清を解凍し、最初にタンパク質Ａクロマトグラフィーで精製した。品質特性アッセイは以前に記載されたように行った（Ｙｏｎｇｋｙｅｔａｌ．２０１９）。電荷変異体種（酸性、主要および塩基性）は画像キャピラリー等電点によって測定した。ｍＡｂ－８およびｍＡｂ－３についての主要ピークおよび塩基性種の両方を、以前の発明者らの報告（Ｘｕｅｔａｌ．２０２１ｂ）に記載のように、主要ピークについてのｍＡｂ－１規格を１００％として正規化した。Ｎグリカンプロファイル（例えばＧ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２ＦおよびＭａｎ５）はＷａｔｅｒｓの市販のＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳＮ－Ｇｌｙｃａｎｋｉｔを使用して測定した。ＳＥＣを使用してＳＥＣ不純物（例えば高分子（ＨＭＷ）、低分子（ＬＭＷ）および単量体）を測定した。

統計解析
別段の記載が無い限り、図中のデータは標準偏差を伴う標本の平均値である。スチューデントのｔ検定分析（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ－ｔｅｓｔａｎａｌｙｓｉｓ）はＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌを使用して行い、有意水準はｐ値＜０．０５に設定した。

結果
工業用ＣＨＯＧＳ細胞株によるｍＡｂ－８についての、ｉｎ－ｖｉｔｒｏＣｐＢ処置前および処置後の細胞培養性能および重要品質特性
工業用ＣＨＯＧＳ細胞株によるｍＡｂ－８生産のために、２５０ｍＬ振盪フラスコ（ｎ＝３）で１２日間のプラットフォームフェドバッチ細胞培養過程を使用した。初期接種ＶＣＤは１．６５±０．１３×１０^６細胞／ｍＬ（図１１Ａ）であった。６日目に２５．８３±０．７１×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＤのピークに到達し、９日目まで約２５×１０^６細胞／ｍＬを維持した。その後９日目から１２日目にかけてＶＣＤは減少し、最終ＶＣＤは１９．８３±０．６５×１０^６細胞／ｍＬであった。初期の細胞生存率は９８．１±０．６５％であり、これは全期間にわたって十分に維持され、最終細胞生存率は９７．０±０．１５％であった（図１１Ａ）。

正規化力価は、６日目の１３．５±０．０％から１０日目の４３．１±０．０％まで直線的に増加し、平均生産性は７．４１％正規化重量／Ｌ／日であった。続いて、力価は徐々に横ばいになり、１２日目における最終的な正規化力価は４８．５±０．０％であり、および１０日目から１２日目の間の平均生産性は２．６９％であった（図１１Ａ）。

ｍＡｂ－８フェドバッチ生産についての代謝産物プロファイルを図１１Ｂに示す。グルコース濃度は全期間にわたって１～６ｇ／Ｌで維持された。予想通り、乳酸は早期細胞増殖期の間増加し、５日目に３．１６±０．０１ｇ／Ｌの乳酸濃度のピークを示し、およびその後乳酸消費期に切り替わり、１０日目から１２日目には１．２～１．４ｇ／Ｌの濃度に減少した（図１１Ｂ）。アンモニウムは、早期細胞増殖期である４日目における３．６０±０．０２ｍＭのアンモニウム濃度のピークまで増加し、７日目に１．１２±０．０４ｍＭの最低レベルまで減少し、および７日目から１２日目まで再度徐々に増加し、最終濃度は２．７０±０．０２ｍＭであった（図１１Ｂ）。細胞培養の早期に増加し、中期には減少し、そして後期には再度増加するというこのアンモニウムのパターンはフェドバッチ細胞培養において通常のものであり、他のＣＨＯ細胞株による異なるｍＡｂ生産についての本発明者らの以前の報告と一致する（Ｘｕｅｔａｌ．２０２０ｂ；Ｘｕｅｔａｌ．２０２０ｃ）。

ｍＡｂ－８生産についてＣｐＢ処置したものおよび処置しなかったものの電荷変異体および他の重要な品質特性を図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃ（ｎ＝３）に示した。ＣｐＢの対象としなかったコントロール条件は４７．６±１．６０％の正規化塩基性種の平均値を示した。注目すべきことに、ＣｐＢ処置条件において正規化塩基性種は２９．０±０．３７％に顕著に減少した（ｐ＜０．０００１）（図１２Ａ）。これに応じて正規化主要ピークの平均値が１０８．８±０．３１％へと増加する事がＣｐＢ処置条件について観察され、コントロールで示された９３．９±１．１２％の正規化主要ピーク値から顕著に増加した（ｐ＜０．０００１）（図１２Ａ）。よって、ＣｐＢ処置によって減少した塩基性種の大部分（１８．６％中の１４．８％）は主要ピークへと変換され、ＣｐＢ処置によって減少した塩基性種の残りの３．８％は酸性種へと変換された。ＣｐＢ処置はｍＡｂ－８の主要ピークを顕著に増加させたが、ＳＥＣ不純物（図１２Ｂ）およびＮグリカン（図１２Ｃ）は処置による影響を受けなかったため、このＣｐＢ処置は他の重要な品質特性に影響することなくｍＡｂの塩基性電荷変異体を減少させる事が示唆された。

工業用ＣＨＯＤＧ４４細胞株によるｍＡｂ－３についての、ｉｎ－ｖｉｔｒｏＣｐＢ処置前および処置後の細胞培養性能および重要品質特性
方法の節における記載のように、ｍＡｂ－８について使用したものとは異なるシード培地および基礎培地を用いて工業用ＣＨＯＤＧ４４細胞株でｍＡｂ－３を生産した事を除いてｍＡｂ－８と同様に、ｍＡｂ－３について、２５０ｍＬ振盪フラスコ（ｎ＝３）での１２日間の同様のプラットフォームフェドバッチ細胞培養過程を使用した。初期接種ＶＣＤは１．５１±０．０８×１０^６細胞／ｍＬであり、および１０日目に２７．４３±１．００×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＤのピークに到達した（図１３Ａ）。ＶＣＤは１０日目から１２日目にかけて減少し、最終ＶＣＤは２４．０３±１．０１×１０^６細胞／ｍＬであった。０日目の細胞生存率は９７．５±０．５３％であり、これは培養期間の大部分にわたって十分に維持され、１０日目の細胞生存率は９４．６±０．６２％であった。しかし、生存率は１０日目から１２日目の収穫にかけて減少し、最終細胞生存率は７７．３±１．５１％であった（図１３Ａ）。

正規化力価は６日目の１３．５±０．０％から８日目の２６．９±０．０％まで増加し、平均生産性は６．７３％正規化重量／Ｌ／日であったが、８日目から１０日目の間で９．４３％の最も高い平均生産性が観察された。平均生産性は１０日目から１２日目の間で横ばいになり５．８４％正規化重量／Ｌ／日であり、並行して最終正規化力価は５７．５± ０．８％であった（図１３Ａ）。

ｍＡｂ－３フェドバッチ生産についての代謝産物プロファイルを図１３Ｂに示す。グルコース濃度は全期間にわたって１～９ｇ／Ｌで維持された。乳酸は期間を通じて増加し、ｍＡｂ－３については１２日目に２．６７±０．０７ｇ／Ｌの乳酸濃度のピークを示した（図１３Ｂ）が、これはｍＡｂ－８についての乳酸のピークである３．１６ｇ／Ｌ（図１１Ｂ）よりも低かった。ｍＡｂ－３については乳酸消費期が無かったにも関わらず、乳酸のピークは２．６７ｇ／Ｌと低く、乳酸自体はフェドバッチ細胞培養の性能に影響しないはずである事を示唆する。アンモニウムは早期細胞増殖期の間、７日目の５．３１±０．０３ｍＭのピーク濃度まで増加した。その後、アンモニウムは後期細胞増殖期の間、１０日目の１．７６±０．０２ｍＭの最低のレベルまで減少したが、１１日目から１２日目に約２．５ｍＭまでわずかに再度増加した（図１３Ｂ）。

ｍＡｂ－８と同様に、全細胞培養物のｉｎｖｉｔｒｏのＣｐＢ処置は他の重要な品質特性に影響を及ぼすことなくｍＡｂ－３の主要ピークを増加させた（図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃ、ｎ＝３）。ＣｐＢ処置条件の正規化塩基性種の平均値は１４．３±０．４４％であり、これは未処置のコントロールの５１．８±０．２５％よりも顕著に低かった（ｐ＜０．０００１）（図１４Ａ）。一方、ＣｐＢ処置条件の正規化主要ピークの平均値は１１４．６±０．３７％で、これはコントロールの９２．１±０．５１％よりも顕著に高かった（ｐ＜０．００１）（図１４Ａ）。これは、ＣｐＢ処置の後で、３７．５％の塩基性種の内の２２．５％が主要ピークへと変換され、塩基性種の残りの１５％が酸性種へと変換された事を意味する。重要なことに、ＣｐＢ処置はｍＡｂ－３の主要ピークを未処置のコントロールに比べて顕著に増加させたものの、ＳＥＣ不純物（図１４Ｂ）やＮ－グリコシル化（図１４Ｃ）を含む他の重要な品質特性はＣｐＢ処置によって影響を受けなかった。

Claims

目的の治療タンパク質の生産方法であって、
ａ）該タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；
ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）を添加する工程；
ｃ）清澄化バルク（ｃｌａｒｉｆｉｅｄｂｕｌｋ）を回収する工程；および
ｄ）清澄化バルクを精製過程に供する工程、
を含む、方法。
目的の治療タンパク質の生産性を改善する方法であって、
ａ）該タンパク質を発現する宿主細胞を、最適化された培養条件下で、バイオリアクター中で少なくとも６日間培養する工程；
ｂ）培養細胞にカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）を添加する工程；
ｃ）清澄化バルク（ｃｌａｒｉｆｉｅｄｂｕｌｋ）を回収する工程；および
ｄ）清澄化バルクを精製過程に供する工程、
を含む、方法。
カルボキシペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）、カルボキシペプチダーゼＤ（ＣＰＤ）、カルボキシペプチダーゼＨ（ＣＰＨ）、カルボキシペプチダーゼＥ（ＣＰＥ）、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）、カルボキシペプチダーゼＮ（ＣＰＮ）、カルボキシペプチダーゼＴ（ＣＰＴ）、カルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ）、カルボキシペプチダーゼＭ３２、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ（ＧＣＰ）、プロリルカルボキシペプチダーゼ（ＰＣＰ）、Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニンカルボキシペプチダーゼ（ＡＡＣＰ）またはプロカルボキシペプチダーゼ、から選択される、請求項１～２に記載の方法。
カルボキシペプチダーゼがカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）である、請求項３に記載の方法。
バイオリアクターが生産バイオリアクターである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
細胞が約１４日間培養される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
カルボキシペプチダーゼが、収穫の０～２４時間前に培養細胞に添加される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
カルボキシペプチダーゼが収穫の約２時間前に培養細胞に添加される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
細胞が、灌流、バッチまたはフェドバッチ細胞培養物中である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
カルボキシペプチダーゼが、ＣＰ：目的のタンパク質比が０．０００１％～１％ｗ／ｗの間の比率で添加される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
タンパク質が、Ｃ末端にリジンまたはアルギニン残基を有する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
タンパク質が、Ｆｃ－融合タンパク質または抗体である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
抗体がモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、請求項１２に記載の方法。
カルボキシペプチダーゼが、目的のｍＡｂの塩基性種を低減するために十分な量で添加される、請求項１３に記載の方法。
カルボキシペプチダーゼが、目的のｍＡｂの主要種を増加させるために十分な量で添加される、請求項１３に記載の方法。
宿主細胞が、ＣＨＯ細胞である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
抗体が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＣＸＣＲ４、ＣＤ７３ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＤ１１ａ、組織因子（ＴＦ）、ＰＳＣＡ、ＩＬ－８、ＩＬ－１３、ＥＧＦＲ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される抗原に結合する、請求項１２に記載の方法。