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JP2022535858A - 抗ｂ７－ｈ４抗体－薬物コンジュゲート及びその医薬的使用 - Google Patents

抗ｂ７－ｈ４抗体－薬物コンジュゲート及びその医薬的使用 Download PDF

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JP2022535858A JP2021572039A JP2021572039A JP2022535858A JP 2022535858 A JP2022535858 A JP 2022535858A JP 2021572039 A JP2021572039 A JP 2021572039A JP 2021572039 A JP2021572039 A JP 2021572039A JP 2022535858 A JP2022535858 A JP 2022535858A
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素霞 ▲劉▼
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Abstract

抗B7-H4抗体-薬物コンジュゲート及びその医学的使用を提供する。具体的には、抗B7-H4抗体又はその抗原結合断片、抗B7-H4抗体のCDR領域を含むヒト化抗体、及びこの抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物、並びに前述のこの抗体-薬物コンジュゲート、又は薬学的に許容されるこの塩若しくは溶媒和化合物の医薬組成物と、抗がん薬物としてのその使用、特に、B7-H4を高発現する疾患又は障害を治療するための薬物の調製における使用とを提供する。

Description

本発明は、生物医学の分野に属する。具体的には、本発明は、抗B7-H4抗体-薬物コンジュゲート及びその医薬的使用に関する。
腫瘍免疫療法は、腫瘍療法の分野における研究開発の長期持続的ホットスポットであり、T細胞腫瘍免疫療法は、中心的位置にある。腫瘍逃避は、腫瘍免疫療法に対する巨大な障壁である。殆どの腫瘍は、宿主免疫系により程度の差はあれ認識可能な抗原を発現する。しかし、多くの場合では、エフェクターT細胞の非効率な活性化により、不十分な免疫応答が引き起こされ、このため腫瘍細胞によって、免疫系に対するこれらの阻害効果により腫瘍の増殖が促進される。腫瘍免疫療法は、腫瘍を有する患者におけるキラーT細胞及び/又は他の免疫細胞を十分に活用し、これを動員して腫瘍を殺傷することである。
CD28受容体及びそのリガンドに関する研究は、B7スーパーファミリーと呼ぶ分子の特性決定を導いた。B7ファミリーのメンバーは、免疫グロブリン様Vドメイン(IgV)及び免疫グロブリン様Cドメイン(IgC)を有する免疫グロブリンの一クラスである。そのメンバーは、共刺激因子B7.1(CD80)及びB7.2(CD86)、誘導性共刺激因子リガンド(ICOS-L/B7-H2)、プログラム死1リガンド(PD-L1/B7-H1)、プログラム死2リガンド(PD-L2/B7-DC)、B7-H3並びにB7-H4等を含む。
ヒトB7-H4は、アミノ酸282個からなる1型膜貫通タンパク質である。そのコード遺伝子は、染色体1のp11.1領域に位置する(Choi IHら、J Immunol. 2003 Nov 1; 171(9): 4650～4)。B7-H4は、T細胞の免疫応答に対して負の制御効果を有する。B7-H4は、CD4+とCD8+T細胞の分化及び発生、細胞周期の進行、並びにサイトカイン産生において広範な阻害的役割を果たす(Sica GLら、Immunity. 2003 Jun; 18(6): 849～61)。B7-H4ノックアウトマウスにおいて、免疫細胞障害も自己免疫現象も見出されなかった(Zhu G ら、Blood. 2009 Feb 19; 113(8): 1759～67; Suh WKら、Blood. Mol Cell Biol. 2006 Sep; 26(17): 6403～11)。現在のところ、B7-H4の受容体、及びそのシグナル伝達経路は、未だ不明である。
最近の研究では、B7-H4タンパク質が、様々な腫瘍組織において大量に発現し、これにより体の免疫系による攻撃からの腫瘍細胞逃避が可能となることが見出された。B7-H4分子を腫瘍療法の標的として利用することにより、腫瘍免疫療法のための新たな方法がもたらされる。
ヒトB7-H4は、例えば、乳がん、卵巣がん、肺がん、子宮頸がん、腎臓がん、膀胱がん及び肝臓がんのような、がん細胞上で発現することが現在、知られている。B7-H4mRNAの発現は、脾臓、肺、胸腺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、精巣、及び卵巣において見出される。タンパク質レベルでは、低レベルのB7-H4発現が、乳房(管、及び小葉)、卵管上皮、及び子宮内膜腺等の組織において見出される。また、関連する研究では、B7-H4が、腫瘍関連マクロファージ(TAM)において過剰発現し(Kryczek, I.ら、J. Exp. Med. 2006, 203(4): 871～881)、マクロファージが、腫瘍微小環境の重要な成分を構成し、腫瘍量の50%にも相当し得ることも示された。
がん治療のための一戦略は、抗体を担体として使用して、細胞毒性分子をがん細胞内に送達し、次いで、解離された小分子によりがん細胞を殺傷することである。この戦略において使用する薬物は、抗体-薬物コンジュゲートと呼ばれる。アドセトリス及びカドサイラは、現在、市販されている抗体-薬物コンジュゲートである。現在のところ、多くの多国籍製薬会社が、腫瘍に対する患者自身の免疫系応答を向上させて腫瘍細胞の直接的殺傷の目標を達成する、B7-H4に対するモノクローナル抗体及び/又はその薬物コンジュゲートを開発している。関連する特許は、例えば、国際公開第2013025779号、米国特許出願公開第20140322129号等である。Medimmune社、FivePrime社、及び他の会社の抗B7-H4モノクローナル抗体は、現在も前臨床開発中であり、Genentech社の抗B7-H4抗体-薬物コンジュゲートも前臨床開発段階にある。
国際公開第2013025779号 米国特許出願公開第20140322129号 PCT特許国際公開第2005081711号
Choi IHら、J Immunol. 2003 Nov 1; 171(9): 4650～4 Sica GLら、Immunity. 2003 Jun; 18(6): 849～61 Zhu G ら、Blood. 2009 Feb 19; 113(8): 1759～67 Suh WKら、Blood. Mol Cell Biol. 2006 Sep; 26(17): 6403～11 Kryczek, I.ら、J. Exp. Med. 2006、203(4): 871～881 J. Biol. Chem、243、p3558(1968) AbM定義基準(http://bioinf.org.uk/abs/) Holliger及びHudson (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1126～1136 ImmunoGeneTics(IMGT)ウェブサイトhttp://imgt.cines.fr The Immunoglobulin FactsBook、2001ISBN012441351 Chinese Pharmacopoeia(中国薬局方)
本発明の目的は、以下の技術的解決法により達成する、高親和性、高選択性、高エンドサイトーシス効率、高抗がん活性、高安定性、高安全性、並びに低毒性及び副作用を有する、抗B7-H4抗体-薬物コンジュゲートを提供することである。
一般式(A):
Figure 2022535858000001
(式中、
Dは、細胞毒性薬物であり、
L1及びL2は、リンカーユニットであり、
yは、1～20の数であり、
Abは、B7-H4抗体又はその抗原結合断片であり、これは、抗体軽鎖可変領域及び抗体重鎖可変領域を含み、
抗体重鎖可変領域が、
配列番号3、配列番号4、配列番号5、
配列番号9、配列番号10、配列番号11
からなる群から選択される配列に示す少なくとも1つのHCDRを含み、
抗体軽鎖可変領域が、
配列番号6、配列番号7、配列番号8、
配列番号12、配列番号13、配列番号14
からなる群から選択される配列に示す少なくとも1つのLCDRを含む)
の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
本発明の一実施形態では、抗体重鎖可変領域は、
配列番号3、配列番号4、配列番号5、
配列番号9、配列番号10、配列番号11、
配列番号23、配列番号24、配列番号25、
配列番号29、配列番号30、配列番号31
からなる群から選択される配列に示す少なくとも1つのHCDRも含み得るか、又は
抗体重鎖可変領域は、
配列番号43、配列番号44、配列番号45
からなる群から選択される配列に示す少なくとも1つのHCDRも含み得、
抗体軽鎖可変領域は、
配列番号6、配列番号7、配列番号8、
配列番号12、配列番号13、配列番号14、
配列番号26、配列番号27、配列番号28、
配列番号32、配列番号33、配列番号34
からなる群から選択される配列に示す少なくとも1つのLCDRを含む。
本発明の一実施形態では、抗B7-H4抗体又はその抗原結合断片が、抗体重鎖可変領域を含み、この抗体重鎖可変領域が、
配列番号3に示すHCDR1、配列番号4に示すHCDR2及び配列番号5に示すHCDR3、
又は、
配列番号9に示すHCDR1、配列番号10に示すHCDR2及び配列番号11に示すHCDR3
を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
本発明の一実施形態では、抗B7-H4抗体又はその抗原結合断片が、抗体重鎖可変領域を含み、この抗体重鎖可変領域が、
配列番号23に示すHCDR1、配列番号24に示すHCDR2及び配列番号25に示すHCDR3、
又は、
配列番号29に示すHCDR1、配列番号30に示すHCDR2及び配列番号31に示すHCDR3
を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
本発明の一実施形態では、抗B7-H4抗体又はその抗原結合断片が、抗体重鎖可変領域を含み、この抗体重鎖可変領域が、
配列番号43に示すHCDR1、配列番号44に示すHCDR2及び配列番号25に示すHCDR3、
又は、
配列番号29に示すHCDR1、配列番号45に示すHCDR2及び配列番号31に示すHCDR3
を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
本発明の一実施形態では、Abの抗体重鎖可変領域が、次の(1)～(4):
(1)配列番号3に示すHCDR1、配列番号4に示すHCDR2及び配列番号5に示すHCDR3、
(2)配列番号9に示すHCDR1、配列番号10に示すHCDR2及び配列番号11に示すHCDR3、
(3)配列番号23に示すHCDR1、配列番号24に示すHCDR2及び配列番号25に示すHCDR3、又は、
(4)配列番号29に示すHCDR1、配列番号30に示すHCDR2及び配列番号31に示すHCDR3
からなる群から選択されるいずれか1つのCDRを含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
また、Abの抗体重鎖可変領域は、次の(5)～(6):
(5)配列番号43に示すHCDR1、配列番号44に示すHCDR2及び配列番号25に示すHCDR3、
又は、
(6)配列番号29に示すHCDR1、配列番号45に示すHCDR2及び配列番号31に示すHCDR3
からなる群から選択されるCDRも含み得る。
本発明の一実施形態では、抗B7-H4抗体又はその抗原結合断片が、抗体軽鎖可変領域を含み、この抗体軽鎖可変領域が、
配列番号6、配列番号7及び配列番号8にそれぞれ示すLCDR1、LCDR2及びLCDR3、
又は、配列番号12、配列番号13及び配列番号14にそれぞれ示すLCDR1、LCDR2及びLCDR3
を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
本発明の一部の実施形態では、抗B7-H4抗体又はその抗原結合断片が、抗体軽鎖可変領域を含み、この抗体軽鎖可変領域が、
配列番号26、配列番号27及び配列番号28にそれぞれ示すLCDR1、LCDR2及びLCDR3、
又は、配列番号32、配列番号33及び配列番号34にそれぞれ示すLCDR1、LCDR2及びLCDR3
を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
本発明の一実施形態では、Abの抗体軽鎖可変領域が、次の(1)～(4):
(1)配列番号6に示すLCDR1、配列番号7に示すLCDR2及び配列番号8に示すLCDR3、
(2)配列番号12に示すLCDR1、配列番号13に示すLCDR2及び配列番号14に示すLCDR3、
(3)配列番号26に示すLCDR1、配列番号27に示すLCDR2及び配列番号28に示すLCDR3、又は、
(4)配列番号32に示すLCDR1、配列番号33に示すLCDR2及び配列番号34に示すLCDR3
からなる群から選択されるいずれか1つのCDRを含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
本発明の一実施形態では、抗B7-H4抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖可変領域が、
(1)それぞれ配列番号3に示すHCDR1、配列番号4に示すHCDR2及び配列番号5に示すHCDR3、並びに
配列番号6に示すLCDR1、配列番号7に示すLCDR2及び配列番号8に示すLCDR3、又は
(2)それぞれ配列番号9に示すHCDR1、配列番号10に示すHCDR2及び配列番号11に示すHCDR3、並びに
配列番号12に示すLCDR1、配列番号13に示すLCDR2及び配列番号14に示すLCDR3
を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
本発明の一実施形態では、抗B7-H4抗体又はこの抗原結合断片の重鎖及び軽鎖可変領域が、
(3)配列番号23に示すHCDR1、配列番号24に示すHCDR2及び配列番号25に示すHCDR3、並びに
配列番号26に示すLCDR1、配列番号27に示すLCDR2及び配列番号28に示すLCDR3、又は
(4)配列番号29に示すHCDR1、配列番号30に示すHCDR2及び配列番号31に示すHCDR3、並びに
配列番号32に示すLCDR1、配列番号33に示すLCDR2及び配列番号34に示すLCDR3
を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
本発明の一実施形態では、抗B7-H4抗体又はこの抗原結合断片の重鎖及び軽鎖可変領域が、
(5)それぞれ配列番号43に示すHCDR1、配列番号44に示すHCDR2及び配列番号25に示すHCDR3、並びに
配列番号26に示すLCDR1、配列番号27に示すLCDR2及び配列番号28に示すLCDR3、又は
(6)それぞれ配列番号29に示すHCDR1、配列番号45に示すHCDR2及び配列番号31に示すHCDR3、並びに
配列番号32に示すLCDR1、配列番号33に示すLCDR2及び配列番号34に示すLCDR3
を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
本発明の一実施形態では、Abの抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域が、次の(1)～(4):
(1)配列番号3に示すHCDR1、配列番号4に示すHCDR2及び配列番号5に示すHCDR3、並びに
配列番号6に示すLCDR1、配列番号7に示すLCDR2及び配列番号8に示すLCDR3、
(2)配列番号9に示すHCDR1、配列番号10に示すHCDR2及び配列番号11に示すHCDR3、並びに
配列番号12に示すLCDR1、配列番号13に示すLCDR2及び配列番号14に示すLCDR3、
(3)配列番号23に示すHCDR1、配列番号24に示すHCDR2及び配列番号25に示すHCDR3、並びに
配列番号26に示すLCDR1、配列番号27に示すLCDR2及び配列番号28に示すLCDR3、又は
(4)配列番号29に示すHCDR1、配列番号30に示すHCDR2及び配列番号31に示すHCDR3、並びに
配列番号32に示すLCDR1、配列番号33に示すLCDR2及び配列番号34に示すLCDR3
からなる群から選択されるいずれか1つのCDRを含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
Abの抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域は、次の(5)又は(6):
(5)配列番号43に示すHCDR1、配列番号44に示すHCDR2及び配列番号25に示すHCDR3、並びに
配列番号26に示すLCDR1、配列番号27に示すLCDR2及び配列番号28に示すLCDR3、
(6)配列番号29に示すHCDR1、配列番号45に示すHCDR2及び配列番号31に示すHCDR3、並びに
配列番号32に示すLCDR1、配列番号33に示すLCDR2及び配列番号34に示すLCDR3
からなる群から選択されるCDRも含み得る。
好ましい実施形態では、Abが、マウス抗体又はその断片、キメラ抗体又はその断片、ヒト抗体又はその断片、及びヒト化抗体又はその断片である、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、ヒト生殖系列軽鎖及び重鎖配列又はその変異配列にそれぞれ由来する軽鎖フレームワーク領域及び重鎖フレームワーク領域配列を更に含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、重鎖定常領域を更に含み、この重鎖定常領域が、ヒトIgG1若しくはそのバリアント、IgG2若しくはそのバリアント、IgG3若しくはそのバリアント又はIgG4若しくはそのバリアントに由来する重鎖定常領域、好ましくは、ヒトIgG1、IgG2又はIgG4に由来する重鎖定常領域、より好ましくは、アミノ酸変異後にADCC毒性が増強されたIgGの重鎖定常領域、最も好ましくは、配列番号54に示す重鎖定常領域を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、ヒトκ鎖、λ鎖又はそのバリアントに由来する軽鎖定常領域、好ましくは、ヒトκ鎖に由来する軽鎖定常領域、より好ましくは、配列番号55に示す軽鎖定常領域を更に含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、次の配列:配列番号16又は配列番号18を有する軽鎖可変領域を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、次の配列:配列番号16、配列番号18、配列番号36、配列番号38を有する軽鎖可変領域、又は配列番号16、配列番号18、配列番号36、配列番号38に対する少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%若しくは99%の相同性を有する軽鎖可変領域を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、次の配列:配列番号15又は配列番号17を有する重鎖可変領域を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、次の配列:配列番号15、配列番号17、配列番号35、配列番号37を有する重鎖可変領域、又は配列番号15、配列番号17、配列番号35、配列番号37に対する少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%若しくは99%の相同性を有する重鎖可変領域を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が:
(1)配列番号15に示す重鎖可変領域及び配列番号16に示す軽鎖可変領域、
(2)配列番号17に示す重鎖可変領域及び配列番号18に示す軽鎖可変領域
からなる群から選択されるいずれか1つである、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が:
(1)配列番号15に示す重鎖可変領域及び配列番号16に示す軽鎖可変領域、
(2)配列番号17に示す重鎖可変領域及び配列番号18に示す軽鎖可変領域、
(3)配列番号35に示す重鎖可変領域及び配列番号36に示す軽鎖可変領域、又は、
(4)配列番号37に示す重鎖可変領域及び配列番号38に示す軽鎖可変領域
からなる群から選択されるいずれか1つである、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、次の配列:配列番号20又は配列番号22を有する軽鎖を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、次の配列:配列番号20、配列番号22、配列番号40、配列番号42を有する軽鎖、又は配列番号20、配列番号22、配列番号40、配列番号42に対する少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の相同性を有する完全長軽鎖を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、次の配列:配列番号19又は配列番号21を有する重鎖を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、次の配列:配列番号19、配列番号21、配列番号39、配列番号41を有する重鎖、又は配列番号19、配列番号21、配列番号39、配列番号41に対する少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の相同性を有する完全長重鎖を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、
(1)配列番号20の軽鎖及び配列番号19の重鎖、又は、
(2)配列番号22の軽鎖及び配列番号21の重鎖
を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、Abが、
(1)配列番号20の軽鎖及び配列番号19の重鎖、又は、
(2)配列番号22の軽鎖及び配列番号21の重鎖、又は、
(3)配列番号40の軽鎖及び配列番号39の重鎖、又は、
(4)配列番号42の軽鎖及び配列番号41の重鎖
を含む、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、抗B7-H4抗体の抗原結合断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、2量体化V領域(ダイアボディ)、ジスルフィド結合安定化V領域(dsFv)、及びCDRを含むペプチドの抗原結合断片からなる群から選択される、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、細胞毒性薬物が、毒素、化学療法剤、抗生剤、放射性同位体、及び核酸分解酵素、好ましくは、細胞分裂を阻害するチューブリン阻害剤又はDNAトポイソメラーゼ阻害剤、より好ましくは、DM1、DM3、DM4、SN-38、MMAF又はMMAE、更に好ましくは、チューブリン阻害剤SN-38、MMAE又はMMAFからなる群から選択され、MMAF及びSN-38の構造が、次の式:
Figure 2022535858000002
に示すものである、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、細胞毒性薬物が、カンプトテシン誘導体、好ましくは、エキサテカン:
Figure 2022535858000003
から選択される、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、一般式(I):
Figure 2022535858000004
(式中、
L1及びL2は、リンカーユニットであり、
yは、1～8から選択される数、好ましくは、2～4から選択される数であり、
Abは、上に定義する抗B7-H4抗体又はこの抗原結合断片である)
の化合物又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物である、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、一般式(II):
Figure 2022535858000005
(式中、
L1及びL2は、リンカーユニットであり、
yは、1～8から選択される数、好ましくは、2～4から選択される数であり、
Abは、上に定義する抗B7-H4抗体又はこの抗原結合断片である)
の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物である、一般式(A)の上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、一般式(III):
Figure 2022535858000006
(式中、
L1及びL2は、リンカーユニットであり、
yは、1～10から選択される数、好ましくは、2～8から選択される数、より好ましくは、4～8から選択される数であるか、
又は、yは、好ましくは、2～10から選択される数、更に好ましくは、6～10から選択される数、より好ましくは、7～9の数、及び最も好ましくは、7、8、9の整数であり、
Abは、上に定義する抗B7-H4抗体又はその抗原結合断片である)
の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物である、上記一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、L1が、次の一般式(B):
Figure 2022535858000007
(式中、
M1は、-CR1R2-であり、
R1及びR2は、同一であるか又は異なり、水素、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル及びアミノからなる群から独立的に選択され、
Nは、0～5、好ましくは、1、2又は3の整数である)
に示すものである、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、L2が、次の一般式(C):
Figure 2022535858000008
(式中、
M2は、-CR4R5-であり、
R3は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アルコキシル及びシクロアルキルからなる群から選択され、
R4及びR5は、同一であるか又は異なり、水素、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル及びアミノからなる群から独立的に選択され、
mは、0～5、好ましくは、1、2又は3の整数である)
に示すものである、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、L2が、次の一般式(D):
-K1-K2-K3-K4-
(式中、
K1は、
Figure 2022535858000009
であり、sは、2～8の整数、更に好ましくは、4～8の整数、より好ましくは、4～6の整数であり、
K2は、-NR1(CH2CH2O)pCH2CH2C(O)-、-NR1(CH2CH2O)pCH2C(O)-、-S(CH2)pC(O)-又は単結合であり、pは、1～20、好ましくは、1～6の整数であり、
R1は、水素、重水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、重水素化アルキル及びヒドロキシアルキルからなる群から選択され、
K3は、テトラペプチド残基であり、好ましくは、テトラペプチド残基は、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸の2つ以上からなる群から選択されるアミノ酸により形成されるペプチド残基、より好ましくは、テトラペプチド残基GGFGであり、
K4は、-NR2(CR3R4)t-であり、R2、R3又はR4は、それぞれ独立的に水素、重水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、重水素化アルキル及びヒドロキシアルキルであり、tは、1又は2である)
好ましくは、L2に関しては、
K1は、
Figure 2022535858000010
であり、sは、5であり、
K2は、結合であり、
K3は、テトラペプチド残基GGFGであり、
K4は、-NR2(CR3R4)t-であり、R2、R3又はR4は、それぞれ独立的に水素、重水素、ヒドロキシル、アミノ、C1～6アルキル、ハロゲン、C1～6ハロアルキル、C1～6重水素化アルキル及びC1～6ヒドロキシアルキルであり、tは、1又は2である)
に示すものである、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、リンカーユニット-L2-のK1末端が、Abに結合し、K4末端が、L1に結合している、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、L1が、-O-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-、-O-CR5R6-(CRaRb)m-、-O-CR5R6-、-NH-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-又は-S-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-であり、
Ra及びRbが、水素、重水素、ハロゲン及びアルキルからなる群からそれぞれ独立的に選択され、
R5が、ハロアルキル又はシクロアルキルであり、
R6が、水素、ハロアルキル及びシクロアルキルからなる群から選択されるか、
又は、R5及びR6並びにこれらが結合している炭素原子が、シクロアルキルを形成し、
mが、0、1、2、3又は4である、
上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましくは、L1のO末端が、リンカーユニットL2に結合している。
好ましい実施形態では、L1が、次の一般式(E):
Figure 2022535858000011
(R5が、ハロアルキル又はシクロアルキルであり、
R6が、水素、ハロアルキル及びシクロアルキルからなる群から選択されるか、
又は、R5及びR6並びにこれらが結合している炭素原子が、シクロアルキルを形成し、
好ましくは、
R5が、C1～6ハロアルキル及びC3～6シクロアルキルからなる群から選択され、
R6が、水素、C1～6ハロアルキル及びシクロアルキルからなる群から選択されるか、
又は、R5及びR6並びにこれらが結合している炭素原子が、C3～6シクロアルキルを形成し、
mは、0～4の整数であり、
より好ましくは、一般式(E)は、次の置換基:
Figure 2022535858000012
からなる群から選択される)
に示すものである、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
より好ましい実施形態では、-L2-L1-が、次の構造:
Figure 2022535858000013
(K2は、結合であり、
K3は、テトラペプチド残基GGFGであり、
R5が、ハロアルキル及びC3～6シクロアルキルであり、
R6が、水素、ハロアルキル及びC3～6シクロアルキルからなる群から選択されるか、
又は、R5及びR6並びにこれらが結合している炭素原子が、C3～6シクロアルキルを形成し、
R2、R3又はR4が、それぞれ独立的に水素又はアルキルであり、
sが、2～8の整数であり、好ましくは、sが、4、5又は6であり、
mが、0～4の整数であり、
好ましくは、-L2-L1-が、次の構造:
Figure 2022535858000014
Figure 2022535858000015
からなる群から選択される)
に示すものである、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、一般式(IV):
Figure 2022535858000016
(式中、
Wは、C1～8アルキル、C1～8アルキル-シクロアルキル又は1～8原子の直鎖状ヘテロアルキルからなる群から選択され、ヘテロアルキルが、N、O又はSからなる群から選択される1～3個のヘテロ原子を含み、ここで、C1～8アルキル、シクロアルキル又は直鎖状ヘテロアルキルが、それぞれ独立的に、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、アルキル、クロロアルキル、重水素化アルキル、アルコキシル及びシクロアルキルからなる群から選択される1つ又は複数の置換基により更に置換されており、
K2は、-NR1(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR1(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-又は結合からなる群から選択され、R1は、水素原子、アルキル、ハロアルキル、重水素化アルキル及びヒドロキシアルキルからなる群から選択され、p1は、1～20の整数であり、
K3は、アミノ酸2～7個からなるペプチド残基であり、アミノ酸は、置換又は非置換であってもよく、置換されている場合、置換基は、任意の可能な付着点で置換されてもよく、置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、アルキル、クロロアルキル、重水素化アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルからなる群から独立的に選択される1つ又は複数であり、
R2は、水素原子、アルキル、ハロアルキル、重水素化アルキル及びヒドロキシアルキルからなる群から独立的に選択され、
R3及びR4は、水素原子、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、重水素化アルキル及びヒドロキシアルキルからなる群からそれぞれ独立的に選択され、
R5は、ハロゲン、ハロアルキル、重水素化アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、
R6は、水素原子、ハロゲン、ハロアルキル、重水素化アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択されるか、
又は、R5及びR6並びにこれらが結合している炭素原子は、シクロアルキル若しくはヘテロシクリルを形成し、
mは、0～4の整数であり、
yは、1～10であり、yは、小数又は整数であり、好ましくは、yは、2～10の数であり、より好ましくは、yは、4～10の数、更に好ましくは、6～9の数、及び最も好ましくは、7、8又は9の整数であり、
Abは、抗B7-H4抗体又はこの抗原結合断片である)
の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物である、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
より好ましい実施形態では、一般式(I-A):
Figure 2022535858000017
(yが、1～10であり、yが、小数又は整数である)
の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物である、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
より好ましい実施形態では、一般式(I-B):
Figure 2022535858000018
(yが、1～10であり、yが、小数又は整数である)
の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物である、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
より好ましい実施形態では、一般式(II-A):
Figure 2022535858000019
の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物である、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
より好ましい実施形態では、一般式(II-B):
Figure 2022535858000020
の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物である、
上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
より好ましい実施形態では、一般式(IV-A):
Figure 2022535858000021
(式中、sは、2～8の整数であり、R2～R6、m及びyは、上記一般式(IV)に定義するものであり、
好ましくは、sは、4、5又は6の整数であり、yは、4～10の数、好ましくは、6～9、より好ましくは、7又は8の数である)
の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物である、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
より好ましい実施形態では、次の化合物:
Figure 2022535858000022
Figure 2022535858000023
Figure 2022535858000024
からなる群から選択される、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
最も好ましい実施形態では、次の化合物:
Figure 2022535858000025
Figure 2022535858000026
Figure 2022535858000027
Figure 2022535858000028
Figure 2022535858000029
Figure 2022535858000030
Figure 2022535858000031
Figure 2022535858000032
Figure 2022535858000033
Figure 2022535858000034
Figure 2022535858000035
Figure 2022535858000036
Figure 2022535858000037
Figure 2022535858000038
Figure 2022535858000039
Figure 2022535858000040
Figure 2022535858000041
Figure 2022535858000042
Figure 2022535858000043
Figure 2022535858000044
Figure 2022535858000045
Figure 2022535858000046
Figure 2022535858000047
Figure 2022535858000048
Figure 2022535858000049
Figure 2022535858000050
Figure 2022535858000051
Figure 2022535858000052
Figure 2022535858000053
Figure 2022535858000054
Figure 2022535858000055
Figure 2022535858000056
Figure 2022535858000057
(式中、yは、1～10から選択される数、好ましくは、2～10から選択される数、更に、6～10から選択される数、より好ましくは、7～9の数、最も好ましくは、7、8、9の整数であるか、又はyは、2～10から選択される数、好ましくは、4～8の数、より好ましくは、6～8の数、更に好ましくは、7若しくは8、最も好ましくは、8の数である)
からなる群から選択される、上記抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
好ましい実施形態では、本発明は、次の工程:
Figure 2022535858000058
(式中、
Abが、抗B7-H4抗体又はその抗原結合断片であり、
W、K2、K3、R2～R6、m及びyが、一般式(IV)に定義するものである)
を含み、
Abを還元後、これを一般式(F)とカップリング反応に供して、一般式(IV)の化合物を得る、一般式(IV)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物を調製するための方法に関する。
好ましい実施形態では、一般式(F)は、一般式(F-1):
Figure 2022535858000059
(式中、
K2、K3、R2～R6、s及びmは、上記の-L2-L1-に定義するものである)
の化合物、又はその互変異性体、メソマー、ラセミ化合物、エナンチオマー、ジアステレオマー若しくはこれらの混合形態、或いは薬学的に許容されるこれらの塩である。
好ましい実施形態では、一般式(F)又は一般式(F-1)の化合物は、
Figure 2022535858000060
Figure 2022535858000061
からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、本発明は、本発明のいずれか1つによる抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物、及び1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含む、医薬組成物に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、ヒトB7-H4と関連する疾患を治療するための医薬、好ましくは、B7-H4を高発現するがんを治療するための医薬の調製における、一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物、或いはその医薬組成物の使用に関する。
より好ましい実施形態では、がんは、ヒト脳の星状芽細胞腫、ヒト咽頭がん、副腎腫瘍、AIDS関連がん、胞状軟部肉腫、星状細胞腫、膀胱がん、骨がん、脳及び脊髄のがん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頸がん、軟骨肉腫、脊索腫、腎臓の嫌色素性細胞がん、明細胞がん、結腸がん、結腸直腸がん、結合組織増殖性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症、線維性骨異形成症、胆嚢又は胆管細胞がん、胃がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭頸部がん、肝細胞がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん、白血病、脂肪肉腫/悪性脂肪腫、肝臓がん、リンパ腫、肺がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、乳頭様甲状腺がん、副甲状腺腫、小児がん、末梢性シュワン腫、松果体細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後部ブドウ膜黒色腫、転移性腎臓がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺がん、転移性甲状腺がん並びに子宮がんからなる群から選択される。
抗体-薬物コンジュゲートのin vivoでの有効性を示すグラフである:hu2G6-MC-MMAF及びhu2F7-MC-MMAFは、1.5mg/kg及び3mg/kgの用量においてMX-1異種移植腫瘍に対する阻害及び殺傷効果を示した。 2及び4の薬物負荷をそれぞれ有するhu2F7-MC-MMAFのHPLCスペクトルを示すグラフである。 2及び4の薬物負荷をそれぞれ有するhu2F7-MC-MMAFのin vivoでの抗腫瘍効果を示すグラフである。 2及び4の薬物負荷をそれぞれ有するhu2F7-MC-MMAFのin vivoでの抗腫瘍効果をそれぞれ示す図である。図は、21日目の各群におけるマウスの腫瘍を示す。
1.用語
本発明の容易な理解のために、特定の技術的及び科学的用語を以下に具体的に定義する。本文書の他の箇所で別途明確に定義しない限り、本明細書において使用する全ての他の技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味を有する。
本発明において使用するアミノ酸の3文字表記及び1文字表記は、J. Biol. Chem、243、p3558(1968)に記載されるものである。
本発明において記載する「抗体」の用語は、鎖間ジスルフィド結合により結合する同一の重鎖2つ及び同一の軽鎖2つからなるテトラペプチド鎖構造である免疫グロブリンを指す。免疫グロブリン重鎖定常領域におけるアミノ酸の組成及び順序は異なるため、これらの抗原性も異なる。これによって、免疫グロブリンは、免疫グロブリンのアイソタイプとしても知られる5つの型、すなわち、IgM、IgD、IgG、IgA及びIgEに分類することができ、これらの対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一型のIgは、ヒンジ領域のアミノ酸組成における差異、並びに重鎖ジスルフィド結合の数及び位置に従って種々のサブクラスに分類することができる。例えば、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4に分類することができる。軽鎖は、定常領域における差異に従ってκ鎖、又はλ鎖に分類される。Igの5つの型のそれぞれは、κ鎖又はλ鎖を有し得る。
本発明では、本発明の抗体軽鎖可変領域は、ヒト若しくはマウスκ鎖、λ鎖又はそのバリアントを含む、軽鎖定常領域を更に含み得る。
本発明では、本発明の抗体重鎖可変領域は、ヒト若しくはマウスIgG1、2、3、4又はそのバリアントを含む、重鎖定常領域を更に含み得る。
抗体重鎖及び軽鎖のN末端付近のアミノ酸約110個の配列は、大きく変動し、可変領域(V領域)であり、C末端付近の残存するアミノ酸配列は、相対的に安定しており、定常領域(C領域)である。可変領域は、高頻度可変領域(HVR)3つ及び相対的に保存的な配列を有するフレームワーク領域(FR)4つを含む。高頻度可変領域3つによって抗体の特異性が決定され、これは、相補性決定領域(CDR)としても知られている。各軽鎖可変領域(VL)及び重鎖可変領域(VH)は、CDR領域3つ及びFR領域4つからなり、アミノ末端からカルボキシ末端にFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序で配置される。軽鎖のCDR領域3つを、LCDR1、LCDR2及びLCDR3と称し、重鎖のCDR領域3つを、HCDR1、HCDR2及びHCDR3と称する。本発明の抗体又は抗原結合断片のVL領域及びVH領域のCDRアミノ酸残基の数及び位置は、公知のKabat又はChothiaナンバリング基準、及びKabat又はAbM定義基準(http://bioinf.org.uk/abs/)に従う。
「抗原提示細胞」又は「APC」の用語は、MHCと複合した外来抗原をその表面上に提示する細胞である。T細胞は、T細胞受容体(TCR)を利用して、このような複合体を認識する。APCの例としては、樹状細胞(DC)、末梢血単核細胞(PBMC)、単球、Bリンパ芽球、及び単球由来樹状細胞(DC)が挙げられるが、これらに限定されない。「抗原提示」の用語は、APCが抗原を捕捉するプロセスを指し、例えば、MHC-I/MHC-IIコンジュゲートの成分としてこれらがT細胞によって認識されることを可能にする。
「B7-H4」の用語は、CD276としても知られる、ヒトB7タンパク質ファミリーのメンバーを指し、これは、Ig様細胞外ドメイン4つを有するI型膜貫通タンパク質である。B7-H4は、抗原提示細胞又はがん細胞の表面上に発現する免疫チェックポイントタンパク質のうちの1つであり、T細胞の機能的活性化に対する阻害効果を有する。「B7-H4」の用語は、細胞により天然に発現するB7-H4の任意のバリアント又はアイソフォームを含む。本発明の抗体は、非ヒト種に由来するB7-H4と交差反応し得る。別の選択肢として、抗体はまた、ヒトB7-H4に特異的であってもよく、他の種との交差反応性を示さなくてもよい。B7-H4又はその任意のバリアント若しくはアイソフォームは、これを天然に発現する細胞若しくは組織から単離するか、又は当技術分野において一般に使用する技術及び本明細書に記載の技術を使用する組換え技術により生成することができる。好ましくは、抗B7-H4抗体は、正常なグリコシル化パターンを有するヒトB7-H4を標的とする。
「組換えヒト抗体」の用語は、組換え方法により調製、発現、生成、又は単離したヒト抗体を含み、関与する技術及び方法は、当技術分野において周知である。例えば、(1)ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する遺伝子導入若しくは染色体導入動物(例えば、マウス)から単離した抗体、又はそこから調製したハイブリドーマ、(2)抗体を発現するように形質転換した宿主細胞から単離した抗体、例えば、トランスフェクショノーマ、(3)組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、並びに(4)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライシングする方法及び他の方法により調製、発現、生成、又は単離した抗体が挙げられる。このような組換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によりコードされる特異的ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する可変領域及び定常領域だけでなく、その後に続く再構成及び変異、例えば、抗体成熟の間に生じるものも含む。
本発明における「マウス抗体」の用語は、当技術分野における知識及び技能により調製したヒトB7-H4に対するモノクローナル抗体である。調製において、試験対象には、B7-H4抗原を注射し、次いで、所望の配列又は機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。本発明の好ましい実施形態では、マウスB7-H4抗体又はその抗原結合断片は、マウスκ鎖、λ鎖若しくはそのバリアントの軽鎖定常領域を更に含み得るか、或いはマウスIgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4又はそのバリアントの重鎖定常領域を更に含み得る。
「ヒト抗体」の用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の可変及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、in vitroでのランダム若しくは部位特異的変異誘発又はin vivoでの体細胞変異により導入された変異)を含み得る。しかし、「ヒト抗体」の用語は、別の哺乳動物種(例えば、マウス)の生殖系列に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体(すなわち、「ヒト化抗体」)を含まない。
CDR移植抗体としても知られる「ヒト化抗体」の用語は、マウスCDR配列をヒト抗体可変領域のフレームワークに移植することにより生成した抗体を指す。これにより、大量のマウスタンパク質成分を保有するキメラ抗体により誘導される強力な免疫応答反応が克服され得る。免疫原性の低下により生じる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域は、最小限の復帰変異に供して活性を維持し得る。
「キメラ抗体」の用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合することにより形成される抗体であり、これにより、マウス抗体により誘導される免疫応答を軽減することができる。キメラ抗体の樹立には、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをはじめに樹立し、次いで、マウスハイブリドーマ細胞由来の可変領域遺伝子をクローニングし、次いで、必要次応じて、ヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし、マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子と結合させてキメラ遺伝子を形成し、これをヒト発現ベクターに挿入して、真核生物産業系又は原核生物産業系においてキメラ抗体分子を最終的に発現させることが必要とされる。ヒト抗体定常領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4又はそのバリアントの重鎖定常領域から選択され得、好ましくは、ヒトIgG2若しくはIgG4重鎖定常領域を含むか、又はアミノ酸変異後にADCC(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害)毒性が増強されたIgG1を使用し得る。
「抗原結合断片」の用語は、抗体の抗原結合断片及び抗体類似体を指し、これは通常、親抗体の抗原結合領域又は可変領域(例えば、1つ又は複数のCDR)の少なくとも部分を含む。抗体断片は、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を維持する。一般には、活性をモルに基づいて表す場合、抗体断片は、親の結合活性の少なくとも10%を維持する。好ましくは、抗体断片は、標的に対する親抗体の結合親和性の少なくとも20%、50%、70%、80%、90%、95%又は100%以上を維持する。抗原結合断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv断片、直鎖状抗体、一本鎖抗体、ナノボディ、ドメイン抗体及び多特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。改変抗体バリアントは、Holliger及びHudson (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1126～1136において総説が記載されている。
「Fab断片」は、CH1並びに1つの軽鎖及び1つの重鎖の可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Fc」領域は、抗体のCH1及びCH2ドメインを含む重鎖断片2つを含む。重鎖断片2つは、2つ以上のジスルフィド結合により、及びCH3ドメインの疎水性相互作用を通して結合している。
「Fab'断片」は、軽鎖、並びにVHドメイン、CH1ドメイン、及びCH1とCH2ドメインの間の領域を含む重鎖の一部を含み、その結果、Fab'断片2つの重鎖2つの間に鎖間ジスルフィド結合を形成して、F(ab')2分子を形成することができる。
「F(ab')2断片」は、軽鎖2つ並びにCH1とCH2ドメインの間の定常領域の一部を含む重鎖2つを含み、これにより重鎖2つの間に鎖間ジスルフィド結合を形成する。したがって、F(ab')2断片は、重鎖2つの間のジスルフィド結合により結合するFab'断片2つからなる。
「Fv領域」は、重鎖及び軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠く。
「多特異性抗体」の用語は、その広義において使用し、これは、ポリエピトープ特異性を有する抗体を包含する。これらの多特異性抗体は、重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む抗体であって、VH-VL単位が多重エピトープ特異性を有する抗体、2つ以上のVL及びVH領域を有する抗体であって、各VH-VL単位が異なる標的又はこの標的の異なるエピトープに結合する抗体、2つ以上の単一可変領域を有する抗体であって、各単一可変領域が異なる標的又はこの標的の異なるエピトープに結合する抗体、完全長抗体、抗体断片、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディ、共有結合的又は非共有結合的に結合する抗体断片等を含むが、これらに限定されない。
「一本鎖抗体」の用語は、抗体の重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)をリンカーペプチドを介して結合することによって形成される一本鎖組換えタンパク質である。これは、完全な抗原結合部位を有する最も小型の抗体断片である。
「ドメイン抗体断片」の用語は、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のみを含む、免疫学的機能を有する免疫グロブリン断片である。一部の場合では、2つ以上のVH領域は、ペプチドリンカーに共有結合的に結合して、二価ドメイン抗体断片を形成する。二価ドメイン抗体断片のVH領域2つは、同一か又は異なる抗原を標的とすることができる。
本発明における「B7-H4への結合」の用語は、ヒトB7-H4と相互作用する能力を指す。本発明の「抗原結合部位」の用語は、抗原上に散在し、本発明の抗体又は抗原結合断片により認識される三次元部位を指す。
本発明において使用する「特異的に結合する」及び「選択的に結合する」の用語は、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合することを指す。一般に、組換えヒトB7-H4を分析物として使用し、抗体をリガンドとして使用する場合、装置における表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって測定すると、抗体は、約10-7M未満か又は更にこれより低い平衡解離定数(KD)で所定の抗原に結合し、所定の抗原に対するその結合親和性は、非特異的抗原(所定の抗原又は近縁の抗原以外、例えば、BSA等)に対するその結合親和性の少なくとも2倍である。「～抗原を認識する抗体」の用語は、本明細書において「～に特異的に結合する抗体」の用語と互換的に使用することができる。
「交差反応性」の用語は、種々の種由来のB7-H4に結合する本発明の抗体の能力を指す。例えば、ヒトB7-H4に結合する本発明の抗体は、別の種のB7-H4にも結合することができる。交差反応性は、結合アッセイ(例えば、SPR及びELISA)において精製した抗原との特異的反応性を検出することにより、又はB7-H4を生理学的に発現する細胞と結合させるか若しくは機能的に相互作用させることにより測定する。交差反応性を判定する方法は、本明細書に記載する標準的結合アッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)解析又はフローサイトメトリーを含む。
「阻害」又は「ブロッキング」の用語は、互換的に使用することができ、部分的及び完全な阻害/ブロッキングの両方を包含する。リガンドの阻害/ブロッキングにより、好ましくは、阻害又はブロッキングされることなくリガンド結合が生じる場合に呈される活性の正常レベル若しくは種類が、低下するか又は変更される。また、阻害及びブロッキングは、抗B7-H4抗体と接触している場合のリガンドの結合親和性における、抗B7-H4抗体と接触していないリガンドの結合親和性と比較した、任意の測定可能な低下を含むことも意図する。
「増殖の阻害」(例えば、細胞に言及する場合)の用語は、細胞増殖における任意の測定可能な低下を含むことを意図する。
「免疫応答の誘導」及び「免疫応答の増強」の用語は、互換的に使用することができ、特異的抗原による刺激に対する免疫応答(すなわち、受動性又は適応性)を指し得る。「CDC又はADCCの誘導」の表現において使用する「誘導する」の用語は、特異的な直接的細胞殺傷機構を刺激することを指す。
本発明における「ADCC」、すなわち、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性は、Fc受容体を発現する細胞が、抗体のFcセグメントを認識することにより抗体で覆われた標的細胞を直接殺傷することを意味する。抗体のADCC効果の機能は、IgGのFcセグメントを修飾することにより増強、低下又は除去することができる。修飾は、抗体の重鎖定常領域における変異を指す。
抗体及び抗原結合断片を生成及び精製するための方法は、周知であり、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、chapters 5～8及び15等の先行技術において見出すことができる。例えば、マウスは、ヒトB7-H4又はその断片で免疫化することができ、得られた抗体は、再生及び精製することができ、アミノ酸シーケンシングは、従来の方法を使用することにより実施することができる。また、抗原結合断片は、従来の方法を使用することにより調製することができる。本発明の抗体又は抗原結合断片は、遺伝子改変して、1つ又は複数のヒトFR領域を非ヒトCDR領域上に導入する。ヒトFR生殖系列配列は、ImmunoGeneTics(IMGT)ウェブサイトhttp://imgt.cines.fr又はThe Immunoglobulin FactsBook、2001ISBN012441351から得ることができる。
本発明の改変抗体又は抗原結合断片は、従来の方法により調製及び精製することができる。対応する抗体のcDNA配列は、GS発現ベクターにクローニングする及び組み換えることができる。組換え免疫グロブリン発現ベクターでは、CHO細胞を安定にトランスフェクトすることができる。より推奨される先行技術として、哺乳動物発現系により、抗体のグリコシル化が、特には、Fc領域の高度に保存されたN末端において、引き起こされ得る。安定なクローンは、ヒト抗原に特異的に結合する抗体を発現することにより得られる。陽性クローンは、バイオリアクターの無血清培地において増殖させて、抗体を生成する。抗体を分泌させる培養培地は、従来の技術により精製及び収集することができる。抗体は、従来の方法により濾過及び濃縮することができる。また、可溶性混合物及び多量体は、従来の方法、例えば、分子ふるい及びイオン交換により除去することもできる。生じた生成物は、例えば、-70℃で、直ちに凍結させるか又は凍結乾燥させる必要がある。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体を指す。本発明において記載するモノクローナル抗体(mAb)は、単一のクローン細胞株から得られる抗体を指し、この細胞株は、真核、原核又はファージクローン細胞株に限定されない。モノクローナル抗体又は抗原結合断片は、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術(例えば、CDR移植)又は既存の他の技術を使用する組換えにより得ることができる。
「投与」及び「治療/処置/処理」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器又は生体液に適用する場合、外因性医薬、治療薬、診断薬又は組成物を動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器又は生体液と接触させることを指す。「投与」及び「治療/処置/処理」では、例えば、治療、薬物動態、診断、研究及び実験方法に言及し得る。細胞の処理は、試薬を細胞と接触させること、試薬を液体と接触させることを含み、ここで、液体は、細胞と接触している。また、「投与」及び「治療/処置/処理」は、例えば、細胞を試薬、診断薬、結合組成物、又は別の型の細胞によりin vitro及びex vivoで処理することも意味する。「治療/処置/処理」は、ヒト、獣医学的又は研究的対象に提供する場合、治療的処置、予防的手段、研究的及び診断的適用を指す。
「治療/処置/処理」は、内用又は外用治療薬、例えば、本発明の結合化合物のうちのいずれか1つを含む組成物を、治療薬が治療効果を有することがわかっている1つ又は複数の病徴を有する患者に投与することを指す。一般には、治療薬は、治療対象又は集団における1つ又は複数の病徴を軽減するのに有効な量で与えて、このような徴候の退縮を誘導するか又はこのような徴候の発症を任意の臨床的に測定可能な程度まで阻害する。任意の特異的病徴を軽減するのに有効な治療薬の量(「治療有効量」とも称する)は、様々な因子、例えば、患者の病態、年齢及び体重、並びに患者において所望の治療効果をもたらす薬物の能力に応じて変動し得る。病徴が軽減されているかどうかは、徴候の重症度又は進行を評価するために医師又は他の医療専門家により一般に使用される任意の臨床的試験方法によって評価することができる。本発明の実施形態(例えば、治療方法又は生成物)が、目的の各病徴の軽減において無効であったとしても、当技術分野において公知の任意の統計学的検定方法、例えば、ステューデントt検定、カイ二乗検定、マン及びウィットニーのU検定、クラスカル・ウォリス検定(H検定)、ヨンクヒール・タプストラ検定、並びにウィルコクソン検定により判定する場合、これらによって、統計学的に有意な数の患者における目的の病徴が減少するはずである。
本明細書及び特許請求の範囲を通して使用する「～から本質的になる」の用語又はそのバリアントは、記載する全ての要素又は要素群を含み、任意選択で、所与の投薬レジメン、方法、又は組成物の基本的若しくは新たな特性を著しくは変化させない、記載する要素と性質において類似するか又は異なる他の要素を含むことを意味する。非限定的な例として、言及したアミノ酸配列から本質的になる結合化合物はまた、結合化合物の特性に著しくは影響しない1つ又は複数のアミノ酸も含み得る。
本発明において特定の対象に適用する「天然に存在する」の用語は、対象が天然に見出され得るという事実を指す。例えば、ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列は、それが生物(ウイルスを含む)において存在し、天然供給源から単離可能である場合、天然に存在し、実験室において意図的には人工修飾されていないものであると考える。
「有効量」は、身体疾患の徴候又は症状を回復又は予防するのに十分な量を含む。また、有効量は、診断を可能とするか又は容易とするのに十分な量も指す。特定の患者又は獣医学的対象のための有効量は、次の因子、例えば、治療する症状、患者の一般的健康状態、薬物投与の方法、経路及び用量、並びに副作用の重症度に応じて変動し得る。有効量は、著しい副作用又は毒性作用を回避する、最大用量又は投薬レジメンであり得る。
「外因性」は、バックグラウンドに従って、生物、細胞又は人体の外部で生成される物質を指す。「内因性」は、バックグラウンドに従って、細胞、生物又は人体の内部で生成される物質を指す。
「相同性」は、2つのポリヌクレオチド配列間又は2つのポリペプチド間の配列類似性を指す。アラインメントした2つの配列の位置が、同一の塩基又はアミノ酸単量体サブユニットにより占有される場合、例えば、2つのDNA分子の各位置が、アデニンにより占有されると、分子は、この位置において相同なものであると考える。2つの配列間の相同性のパーセンテージは、2つの配列により共有される適合するか又は相同な位置の数を、アラインメントした位置の数で割り、100%を掛けた関数である。例えば、最適配列アラインメントでは、2つの配列における10のうちの6つの位置が適合するか又は相同である場合、2つの配列は、60%相同である。一般には、アラインメントは、2つの配列をアラインメントして、最大相同性パーセンテージを得る場合に行う。
本明細書において使用する「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」の表現は、互換的に使用することができ、このような全ての名称は、その後代を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」の単語は、継代数にかかわらず、初代試験細胞及びこれに由来する培養物を含む。また、意図的又は意図しない変異のため、全ての子孫が、DNAの内容に関して、全く同一ではあり得ないことが理解されるべきである。オリジナルの形質転換細胞においてスクリーニングしたものと同一の機能又は生物学的活性を有する変異後代を含む。これは、種々の名称に言及する場合、文脈から明白に理解され得る。
「任意選択の」又は「任意選択で」は、「任意選択の」又は「任意選択で」の表現に続く現象又は状況が、生じ得るが、生じなくてもよく、説明が、現象又は状況が生じるか又は生じない場合を含むことを意味する。例えば、「任意選択で、1つ～3つの抗体重鎖可変領域を含む」は、特定の配列の抗体重鎖可変領域が、存在し得るが、存在しなくてもよいことを意味する。
「医薬組成物」は、本明細書に記載する化合物の1つ若しくは複数、又は生理学的/薬学的に許容されるその塩若しくはプロドラッグ、及び他の化学成分、並びに他の成分、例えば、生理学的/薬学的に許容される担体及び賦形剤を含む混合物を意味する。医薬組成物の目的は、生物への薬物投与を促進して、活性成分の吸収を亢進させ、これにより生物学的活性をもたらすことである。従来の医薬組成物の調製は、中国薬局方(Chinese Pharmacopoeia)に記載されている。
「薬学的に許容される塩」は、本発明の抗体-薬物コンジュゲートの塩を指し、これは、哺乳動物における使用に安全かつ有効であり、所望の生物学的活性を有する。本発明の抗体-薬物コンジュゲートは、少なくとも1つのアミノ基を含み、このため酸と反応して塩を生じ得る。薬学的に許容される塩の非限定的な例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、硝酸塩、ソルビン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、サリチル酸塩、クエン酸水素塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩及びp-トルエンスルホン酸塩が挙げられる。
「溶媒和化合物」は、本発明の抗体-薬物コンジュゲート化合物及び1つ又は複数の溶媒分子により形成される薬学的に許容される溶媒和化合物を指す。溶媒分子の非限定的な例としては、水、エタノール、アセトニトリル、イソプロパノール及び酢酸エチルが挙げられる。
「細胞毒性薬物」は、本発明において使用する場合、細胞の機能を阻害し、及び/又は細胞死又は破壊を生じる物質を指す。
「チューブリン阻害剤」は、チューブリンの重合を阻害するか又はチューブリンの凝集を促進することにより細胞有糸分裂のプロセスに干渉し、これによって抗腫瘍効果をもたらす化合物の一クラスを指す。その非限定的な例としては、マイタンシノイド、カリケアマイシン、タキサン、ビンクリスチン、コルヒチン、ドラスタチン/アウリスタチン/モノメチルオーリスタチンE(MMAE)/モノメチルオーリスタチンF(MMAF)が挙げられる。
「リンカー」は、抗体を、薬物の共有結合又は原子鎖に共有結合的に結合させる化学部分を指す。リンカーの非限定的な例としては、アリーレン、ヘテロアリーレン、PEG、ポリメチレンオキシ(polymethyleneoxy)、コハク酸、コハク酸アミド、ジグリコール酸、マロン酸及びカプロン酸アミドが挙げられる。
「薬物負荷」(DAR)は、式(A)において、1抗体あたりの細胞毒性薬物の平均数であるyにより表す。本発明における薬物負荷の範囲は、1抗体あたり1～20の細胞毒性薬物(D)であり得る。一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲートは、特定の範囲(1～20)の細胞毒性薬物にコンジュゲートした抗体の収集物である。カップリング反応による抗体-薬物コンジュゲートの薬物負荷(DAR)は、従来の手段、例えば、質量分析、HPLC及びELISAにより特性決定することができる。これらの手段により、y値に基づく抗体-薬物コンジュゲートの定量的分布を決定することができる。
2.略語
MC=6-マレイミドヘキサノイル
VC=バリン-シトルリン
PAB=p-アミノベンジルオキシカルボニル
MMAE=モノメチルオーリスタチンE(MW718)
MMAF=分子のC末端にフェニルアラニンを有する、モノメチルオーリスタチンEのバリアント(MW731.5)
本発明の更なる説明のために、実施例を以下に組み込むが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定しない。本発明の実施例における、不特定の条件による実験方法は、一般に、従来の条件、例えば、Antibodies: A Laboratory Manual and Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harborに従うか、又は原料若しくは商品の製造者により推奨される条件に従う。不特定の供給源による試薬は、市場で購入される従来の試薬である。
［実施例1：抗原の調製及び安定な細胞系の構築］
hisタグ化ヒトB7-H4(huB7-H4-His)をコードする配列及びFcタグ化ヒトB7-H4(huB7-H4-Fc)をコードする配列を、CROの組込みDNA技術(IDT)により合成し(上記B7-H4組換えタンパク質の鋳型配列は、全て本発明によりデザインした)、pTT5ベクター(Biovector社)にそれぞれクローニングした。組換えB7-H4タンパク質が293T細胞において発現した後、これらを以下の実験方法により精製し、精製したタンパク質を実施例の以下の実験において使用することができた。
huB7-H4-Hisの配列:
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKADYKDDDDKGSHHHHHHHH
配列番号1
huB7-H4-Fcの配列:
FGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKAGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号2
huB7-H4-Hisの精製工程:
HEK293細胞発現上清試料を高速で遠心分離して不純物を除去した。緩衝液をPBSに対して交換し、イミダゾールを加えて最終濃度を5mMとした。ニッケルカラムは、5mMのイミダゾールを含むPBS溶液で平衡化し、2～5倍のカラム容量で洗浄した。交換後に得られた上清試料をカラム上に充填した。A280の読取りがベースラインに低下するまで、カラムを5mMのイミダゾールを含むPBS溶液ですすいだ。次いで、クロマトグラフィーカラムをPBS+10mMのイミダゾールですすいで非特異的結合タンパク質不純物を除去し、流出液を収集した。標的タンパク質を300mMのイミダゾールを含むPBS溶液で溶出し、溶出ピークを収集した。収集した溶出液をイオン交換(SPカラム)により更に精製した。溶液Aの調製:0.01MのPB、pH8.0。溶液Bの調製:溶液A+1MのNaCl。はじめに、溶出した標的タンパク質によるイミダゾールのPBS溶液を、溶液Aに対して交換し、溶液Aを使用することによりSPカラムを平衡化し、試料を充填した。溶液Bの濃度勾配は、0～100%であった。試料を10倍のカラム容量で溶出し、各溶出ピークを収集した。得られたタンパク質が正しいものであることを、電気泳動、ペプチドマップ及び液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)により同定し、次いで、一定分量に分けて使用した。
huB7-H4-Fcの精製工程:
HEK293細胞発現上清試料を高速で遠心分離して不純物を除去した。緩衝液をPBSに対して交換した。プロテインA親和性カラムは、10mMのPBS緩衝液で平衡化し、2～5倍のカラム容量で洗浄した。交換後に得られた上清試料をカラム上に充填した。A280の読取りがベースラインに低下するまで、カラムを25倍のカラム容量の緩衝液で洗浄した。標的タンパク質を0.8%酢酸緩衝液pH3.5で溶出し、溶出ピークを収集した。一定分量に分けた後、1MのTris-Cl緩衝液pH8.0を直ちに加えて中和させた。次いで、溶液をpH6.9のPBSに対して、Millipore社のAmico-15フィルターカラムを使用して交換した。得られたタンパク質は、電気泳動、ペプチドマップ及び液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)により同定し、次いで、一定分量に分けて使用した。
安定なCHO-S細胞プールの構築:
ヒト又はカニクイザルB7-H4タンパク質(huB7-H4又はcyB7-H4)をコードする完全長配列を、組込みDNA技術(IDT)により合成し(上記B7-H4組換えタンパク質の鋳型配列は、全て本発明によりデザインした)、修飾pcDNA3.1ベクターであるpcDNA3.1/puro(Invitrogen社#V79020)にそれぞれクローニングした。CHO-S(ATCC)細胞をCD-CHO培地(Life Technologies社、#10743029)中で培養して0.5×106細胞/mlとした。huB7-H4又はcyB7-H4遺伝子をコードするベクター10μgをLF-LTX(Life Technologies社、#A12621)50μlとOpti-MEM培地(Life Technologies社、#31985088)1ml中で混合した。混合物を室温で20分間インキュベートし、CHO細胞の培養培地中に加えた。細胞を二酸化炭素インキュベーター内に播種して培養した。24時間後、培養培地を新たな培地と交換し、10μg/mlのピューロマイシンを加えた。その後、2～3日毎に培養培地を新たな培地と交換し、選択から10～12日後に安定なCHO-S細胞プールを得た。
［実施例2：マウスハイブリドーマ及び抗体配列の入手］
合計で5匹のBalb/c及び5匹の10週齢雌A/Jマウスをヒト抗原huB7-H4-Fcで免疫化した。Sigma社の完全フロイントアジュバント(CFA)及びSigma社の不完全フロイントアジュバント(IFA)を使用した。免疫原及び免疫アジュバントを完全に混合し、1:1の比率で乳化させて、安定な「油中水」液を作製した。注射用量は、25μg/200μL/マウスであった。
01日目:第1の免疫化、完全フロイントアジュバント
21日目:第2の免疫化、不完全フロイントアジュバント
35日目:第3の免疫化、不完全フロイントアジュバント
42日目:採血及び血清力価試験(3回の免疫化後の血液)
49日目:第4の免疫化、不完全フロイントアジュバント
56日目:採血及び血清力価試験(4回の免疫化後の血液)
間接的ELISA法を使用して、抗体又は血清の親和性を検出した。huB7-H4-Hisタンパク質を希釈してpH7.4のPBSにより1μg/mlの濃度とし、100μl/ウェルで96ウェル高親和性ELISAプレート内に加え、4℃で冷蔵して一晩インキュベートした(16～20時間)。プレートは、PBST(0.05%のTween-20を含むpH7.4のPBS)で4回洗浄した。PBSTで希釈した3%のウシ血清アルブミン(BSA)ブロッキング溶液を150μl/ウェルで加え、室温で1時間インキュベートしてブロッキングした。ブロッキングの完了後、ブロッキング溶液を廃棄し、プレートをPBST緩衝液で4回洗浄した。試験する抗体又は血清を、3%のBSAを含むPBSTで希釈して、1μMから開始して10用量(10倍希釈)の勾配を得、100μl/ウェルでマイクロタイタープレート内に加え、室温で1時間インキュベートした。インキュベーションの完了後、プレートをPBSTで4回洗浄し、3%のBSAを含むPBSTで希釈したHRP標識ヤギ抗ヒト2次抗体(Abcam社、cat#ab97225)を100μl/ウェルで加え、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで4回洗浄し、次いで、TMB発色基質(Cell Signaling Technology社、cat#7004S)を100μl/ウェルで加え、室温で暗所において1分間インキュベートした。停止液(Cell Signaling Technology社、cat#7002S)を100μl/ウェルで加えて、反応を終結させた。吸光度値を450nmで、マイクロプレートリーダー(BioTek社、Synergy H1モデル)により読み取った。データを解析して、ヒトB7-H4抗原に対する抗体又は血清の結合親和性を得た。
血清力価及び免疫化マウス血清の細胞表面抗原に結合する能力を、間接的ELISA法を使用することにより評価した。細胞融合を、力価の検出結果(100,000倍超の希釈)に従って実施した。高い血清力価、親和性及びFACS結合を有する免疫化マウスを選択して1回の最終的免疫化を行い、次いで、犠死させた。脾臓細胞及びSP2/0骨髄腫細胞を融合及び播種してハイブリドーマを得た。標的ハイブリドーマを間接的ELISAによりスクリーニングし、モノクローナル細胞株を、限界希釈法により樹立した。得られた陽性抗体株の中でも、非特異的結合抗体を発現するハイブリドーマ株は、huB7-H4及びcyB7-H4を安定に発現するCHO-S細胞を、ブランクCHO-S細胞と比較することにより、更に除外した。標的ハイブリドーマは、実施例5におけるin vitroでの細胞結合実験の方法と類似する方法を使用することによりスクリーニングし、モノクローナル細胞株として、限界希釈法により樹立した。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集した。RNAをトリゾール(Invitrogen社、15596-018)で抽出し、逆転写に供した(PrimeScript(商標)逆転写酵素、Takara社#2680A)。逆転写により得られたcDNAは、マウスIgプライマーセット(Novagen社、TB326 Rev.B 0503)を用いたPCRにより増幅し、シーケンシングした。最終的に、抗体-薬物コンジュゲートのヒト化及び構築のために、マウス抗体の4つの株の配列を得た。
マウスモノクローナル抗体2G6の重鎖及び軽鎖可変領域配列は、次の通りである。
2G6 HCVR
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPEKRLEWVAGINGGGSYTYYLDTVKGRFTISRDNSRNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCVSQGSNYYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号46
2G6 LCVR
DIRMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQGISSNIGWLQQKPGKSFKALIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPYTFGGGTKLEIK
配列番号47
マウスモノクローナル抗体2G6の重鎖及び軽鎖可変領域は、次のCDR配列を含む。
Figure 2022535858000062
マウスモノクローナル抗体2F7の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、次の通りである。
2F7 HCVR
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNYYMSWVRQTPEKRLEWVAYVSSGGGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKPEDTAMYYCTRESYSQGNYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号48
2F7 LCVR
DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFSLTFGAGTKLELK
配列番号49
マウスモノクローナル抗体2F7の重鎖及び軽鎖可変領域は、次のCDR配列を含む。
Figure 2022535858000063
マウスモノクローナル抗体2F8の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、次の通りである。
2F8 HCVR
QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGYTFTNSWMNWAKLRPGQGLEWIGGIYPNSGNIEYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMDLTSLTSEDSAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSA
配列番号50
2F8 LCVR
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVRTAVAWYQQKPGQSPKLLISSTSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFIISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
配列番号51
マウスモノクローナル抗体2F8の重鎖及び軽鎖可変領域は、次のCDR配列を含む。
Figure 2022535858000064
マウスモノクローナル抗体1C9の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、次の通りである。
1C9 HCVR
QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGDTFTTYWMNWVKQRPGQGLEWIGGIYLNSGSSEYNEKFKGKATLSVDTSSSTAYMDLSSLTSEDSAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSA
配列番号52
1C9 LCVR
DIVMTQSHKFLSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPELLISSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYNTPLTFGAGTQLELK
配列番号53
マウスモノクローナル抗体1C9の重鎖及び軽鎖可変領域は、次のCDR配列を含む。
Figure 2022535858000065
［実施例3：マウス抗体のヒト化実験］
マウス抗ヒトB7-H4モノクローナル抗体のヒト化を、当技術分野において多くの文書に公表されている方法を使用することにより実施した。簡潔には、親(マウス抗体)定常ドメインをヒト定常ドメインと置換した。本発明では、ヒト生殖系列抗体配列は、マウス抗体及びヒト抗体の間の相同性に従って選択し、マウス抗体2G6、2F7、2F8及び1C9をヒト化した。マウス抗体2G6及び2F7のCDR領域を、選択された対応するヒト化鋳型上に移植して、ヒト化可変領域を置換し、次いで、IgG定常領域(好ましくは、重鎖はIgG1、軽鎖はκ)と組み換えた。次いで、マウス抗体の三次元構造に基づいて、包埋した残基、CDR領域と直接相互作用する残基、並びにVL及びVHの立体構造に対して著しい影響を有する残基を逆変異に供し、CDR領域の化学的に不安定なアミノ酸残基を最適化し、ここで、マウスモノクローナル抗体2F8のHCDR1をGYTFTSSWMN(配列番号43)に対して最適化し、HCDR2をGIYPNRGNIEYNEKFKG(配列番号44)に対して最適化し、マウスモノクローナル抗体1C9のHCDR2をYLNRGS(配列番号45)に対して最適化して、軽鎖及び重鎖可変領域配列の次の組合せを含むヒト化抗体のデザインを得た。
ヒト化抗体hu2G6の重鎖及び軽鎖可変領域は、次の通りである。
hu2G6 HCVR
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINGGGSYTYYLDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVSQGSNYYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号15
hu2G6 LCVR
DIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAPKALIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPYTFGGGTKVEIK
配列番号16
ヒト化抗体hu2F7の重鎖及び軽鎖可変領域は、次の通りである。
hu2F7 HCVR
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVAYVSSGGGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCTRESYSQGNYFDYWGQGTTVTVSS
配列番号17
hu2F7 LCVR
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQSPRLLIKFASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFSLTFGQGTKLEIK
配列番号18
ヒト化抗体hu2F8の重鎖及び軽鎖可変領域は、次の通りである。
hu2F8 HCVR
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSSWMNWVRQAPGQRLEWMGGIYPNRGNIEYNEKFKGRVTLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSS
配列番号35
hu2F8 LCVR
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRTAVAWYQQKPGKAPKLLISSTSYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
配列番号36
ヒト化抗体hu1C9の重鎖及び軽鎖可変領域は、次の通りである。
hu1C9 HCVR
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTTYWMNWVRQAPGQRLEWMGGIYLNRGSSEYNEKFKGRVTLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSS
配列番号37
hu1C9 LCVR
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLISSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYNTPLTFGGGTKVEIK
配列番号38;
可変領域は、IgG定常領域(好ましくは、重鎖はIgG1、軽鎖はκ)と組み換えた。例となる重鎖及び軽鎖定常領域配列は、次に示す。
IgG1 C:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号54
IgカッパC:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号55;
例となる次の軽鎖及び重鎖配列からなるヒト化抗体は、結合後に得た。
hu2G6 HC
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINGGGSYTYYLDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVSQGSNYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号19
hu2G6 LC
DIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAPKALIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号20
hu2F7 HC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVAYVSSGGGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCTRESYSQGNYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号21
hu2F7 LC
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQSPRLLIKFASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFSLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号22
hu2F8 HC
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSSWMNWVRQAPGQRLEWMGGIYPNRGNIEYNEKFKGRVTLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号39
hu2F8 LC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRTAVAWYQQKPGKAPKLLISSTSYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号40
hu1C9HC
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTTYWMNWVRQAPGQRLEWMGGIYLNRGSSEYNEKFKGRVTLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号41
hu1C9 LC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLISSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYNTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号42
［実施例4：B7-H4ヒト化抗体の発現］
組換えベクターをヒト化抗体の配列に従ってデザインした。重鎖ベクターは:シグナルペプチド+ヒト化重鎖としてデザインした。軽鎖ベクターは:シグナルペプチド+ヒト化軽鎖としてデザインした。
上記の配列をpCEP4ベクター(ThermoFisher社#V04450)内に挿入した。発現ベクターは、上記のデザインに従って合成した。ベクタープラスミドを入手して大規模に抽出し、シーケンシングに送って検証した。認定されたプラスミドをヒト293F細胞(ThermoFisher社#R79007)内にPEI(ThermoFisher社#BMS1003-A)を用いてトランスフェクトした。293F細胞は、無血清培地(Shanghai OPM Biosciences社、OPM-293 CD03)で、対数増殖期まで持続的に培養し、細胞トランスフェクションに使用した。ヒト化抗体軽鎖プラスミド21.4μg及びヒト化抗体重鎖プラスミド23.6μgをOpti-MEM(登録商標)I Reduced Serum Medium(GIBCO社、31985-070)10mlに溶解して十分混合し、次いで、PEIを200μg加えて十分混合し、RTで15分間インキュベートした。次いで、細胞50mLを加えた。細胞培養条件:5%CO2、37℃、125rpm/分。培養の間、1日目及び3日目に、細胞生存率が70%未満となるまで補助剤を加えた。細胞上清を収集し、遠心分離して濾過した。遠心分離して濾過した細胞培養培地を、抗体精製親和性カラム上に充填した。カラムは、リン酸緩衝液で洗浄した。試料をグリシン塩酸緩衝液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)で溶出し、1MのTris塩酸pH9.0で中和し、リン酸緩衝液に対して透析して精製ヒト化抗体を最終的に得た。これは、各実施例の実験において使用することができた。
［実施例5：ヒト化抗体のin vitroでの結合能力の検出］
デザインしたヒト化抗体を、以下のようにin vitroでの実験において試験した。
1.in vitroでの細胞結合実験:
ヒトB7-H4を発現する培養したMX-1細胞(CLS Cell Lines Service GmbH社#300296)を収集し、細胞濃度をpH7.4のPBSで調整し、細胞を1ウェルあたり1×105細胞でV形底の96ウェルプレート上に播種した。プレートは、2000rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。勾配希釈ヒト化抗体溶液(0.5%のBSAを含むPBSで1μMから開始して10用量の3倍勾配により希釈)100μlを各ウェルに加え、十分混合し、4℃で振盪機上に1時間インキュベートした。プレートは、2000rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を2回PBSで洗浄した。PBS中0.5%のBSAで希釈したFITC標識ヤギ抗ヒト2次抗体(Abcam社、cat#ab97224)100μlを各ウェルに加え、十分混合し、振盪機上30分間4℃でインキュベートした。プレートは、2000rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を2回PBSで洗浄し、次いで、PBS中に再懸濁した。シグナルは、フローサイトメーター(BECKMAN COULTER社、DxFLEXモデル)を使用することにより検出し、濃度曲線をプロットして解析結果を得た。結果は、Table 1(表5)に示すものである。ヒト化抗体hu2G6及びhu2F7はともに、B7-H4を高発現するMX-1細胞に積極的に結合する。
Figure 2022535858000066
2.親和性動態実験:
Biacore法は、タンパク質間の親和性及び動態を客観的に検出するための、一般に認められている方法である。本発明の試験する抗体の親和性及び結合動態を、Biacore T200(GE社)により解析した。本発明の試験する抗B7-H4抗体は、Biacoreにより提供されているキット及びNHS標準アミノカップリング法を使用することにより、CM5(GE社)チップに共有結合させた。次いで、同一の緩衝液中に希釈した50nMのヒトhuB7-H4-Hisタンパク質を10μL/分の流量で注入した。注入後、試料は全て、キット内の再生試薬により再生した。抗原-抗体結合動態を3分間追跡し、解離動態を10分間追跡した。得られたデータを1:1(ラングミュア)の結合モデルで、GE社のBIAevaluationソフトウェアを使用することにより解析した。この方法により算出したヒト化抗体の親和性動態データは、Table 2(表6)に示すものである。ヒト化抗体hu2G6、hu2F7、hu2F8及びhu1C9は全て、ヒトB7-H4抗原タンパク質に対する強力な親和性を示す。
Figure 2022535858000067
［実施例6：抗B7-H4抗体のエンドサイトーシス］
本発明の抗体が、B7-H4への結合後にヒトB7-H4とともにエンドサイトーシスが行われ得るかどうかを試験するために、MX-1細胞を使用して評価した。MX-1細胞は、トリプシン処理し(はじめにPBSにより1回37℃で約2分間洗浄した)、収集して、事前に冷却したFACS緩衝液中に再懸濁した。細胞濃度は、1×106細胞/mLに調整した。細胞懸濁液1mLをEPチューブに加え、1500rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。試験する調製した抗体1mLを加えて、細胞を再懸濁し、抗体の最終濃度は20μg/mlとなった。細胞を4℃の振盪機上で1時間インキュベートし、遠心分離して、上清を廃棄した(4℃、1500rpm×5分)。細胞を2回、FACS緩衝液で洗浄し、上清を除去した。蛍光2次抗体希釈標準溶液100μLを各チューブに加えて、細胞を再懸濁した。細胞を4℃の振盪機上で30分間インキュベートし、遠心分離して、上清を廃棄した(4℃、1500rpm×5分)。細胞を2回、FACS緩衝液で洗浄し、上清を除去した。事前に温めたMX-1細胞完全培地1.0mLを各チューブに加えて、細胞を再懸濁し、混合した。細胞懸濁液を4つのチューブ内に1チューブあたり200μLの一定分量に分け、これらはそれぞれ、0分群、ブランク群、30分群及び2時間群とした。0分及びブランク群は、氷上に置き、一方、他の群は、37℃のインキュベーターに置いて、それぞれ30分及び2時間、エンドサイトーシスさせた。対応する時点では、EPチューブを取り出し、氷上に置いて5分間、事前冷却した。全ての処理群は、遠心分離し、上清を廃棄した(4℃、1500rpm×5分)。細胞を1回FACS緩衝液で洗浄し、上清を除去した。ストリップ緩衝液250μLを、0分群を除く全ての群のEPチューブに加え、8分間、室温でインキュベートした。細胞を遠心分離し、上清を廃棄した(4℃、1500rpm×5分)。細胞を2回、FACS緩衝液で洗浄し、上清を除去した。全ての処理群に、免疫染色固定液100μLを加え、30分を超えて4℃で置き、フローサイトメーターDxFlexにより検出した。B7-H4抗体のエンドサイトーシスのパーセンテージ(%)=(各時点における平均蛍光強度値-ブランク群の平均蛍光強度値)/(ゼロ点における平均蛍光強度値-ブランク群の平均蛍光強度値)×100%。データは、Table 3(表7)に示す。
Figure 2022535858000068
［実施例7：抗体のMC-MMAFへのコンジュゲーション］
本発明の抗体は、細胞親和性活性及びエンドサイトーシス活性を有し、このためこれらは、薬物とカップリングして、B7-H4媒介疾患を治療するための抗体-薬物コンジュゲートを形成するのに適するものとなっている。カップリングのプロセスは、次の方程式に示し、ここで、Abは、hu2G6又はhu2F7を表す。
Figure 2022535858000069
第1の工程では、S-(3-ヒドロキシプロピル)チオ酢酸(0.7mg、5.3mol)をアセトニトリル0.9mLに溶解し、溶液を作製して後に使用した。上記の事前調製した、S-(3-ヒドロキシプロピル)チオ酢酸のアセトニトリル溶液を、pH=4.3の酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液中の抗体に加えた(10.35mg/mL、9.0mL、0.97mol)。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの水溶液(14.1mg、224mol)1.0mLを反応混合物中に滴下して加え、2時間25℃の振盪下で反応させた。反応の完了後、反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラムを使用することにより精製して(溶出相:pH6.5 0.05MのPBS溶液)、生成物1fの溶液を得た。溶液は、10mg/mLに濃縮し、次の反応において直接使用した。
第2の工程では、1f溶液(11.0mL)に2.0Mのカルボキシアミン塩酸塩溶液0.35mLを加え、30分間25℃の振盪下で反応させた。次いで、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラムを使用することにより精製して(溶出相:pH6.5 0.05MのPBS溶液)、生成物2fの溶液を得た(濃度6.17mg/mL、14.7mL)。
第3の工程では、化合物MC-MMAF(1.1mg、1.2mol、PCT特許国際公開第2005081711号に開示の方法により調製)をアセトニトリル0.3mLに溶解して、2f溶液中に加え(濃度6.17mg/mL、3.0mL)、4時間25℃の振盪下で反応させた。次いで、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラムにより精製し(溶出相:pH6.5 0.05MのPBS溶液)、無菌条件下でフィルターにより濾過して、生成物Ab-MC-MMAF抗体-薬物コンジュゲートをPBS緩衝液(3.7mg/mL、4.7mL)中に得、これは4℃で冷蔵した。HIC-HPLCにより決定した生成物hu2G6-MC-MMAFの平均値yは3.8であり、hu2G6-MC-MMAF(y=4)の試料をHIC-HPLC精製により得た。HIC-HPLCにより決定した生成物hu2F7-MC-MMAFの平均値yは3.2であり、hu2F7-MC-MMAF(y=2)及びhu2F7-MC-MMAF(y=4)の試料をHIC-HPLC精製により得た。
［実施例8：抗体のSN-38へのコンジュゲーション］
抗体コンジュゲート薬物を次のカップリングプロセスにより調製した。ここで、Abは、hu2F7を表す。
Figure 2022535858000070
第1の工程では、S-(3-ヒドロキシプロピル)チオ酢酸(0.7mg、5.3mol)をアセトニトリル0.9mLに溶解し、溶液を作製して後に使用した。上記の事前調製した、S-(3-ヒドロキシプロピル)チオ酢酸のアセトニトリル溶液を、pH=4.3の酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液中の抗体に加えた(10.35mg/mL、9.0mL、0.97mol)。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの水溶液(14.1mg、224mol)1.0mLを反応混合物中に滴下して加え、2時間25℃の振盪下で反応させた。反応の完了後、反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラムを使用することにより精製して(溶出相:pH6.5 0.05MのPBS溶液)、生成物1hの溶液を得た。溶液は、10mg/mLに濃縮し、次の反応において直接使用した。
第2の工程では、1h溶液(11.0mL)に2.0Mのカルボキシアミン塩酸塩溶液0.35mLを加え、30分間25℃の振盪下で反応させた。次いで、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラムを使用することにより精製して(溶出相:pH6.5 0.05MのPBS溶液)、生成物2hの溶液を得た(濃度6.2mg/mL、15.0mL)。2h溶液は、約10mg/mLに濃縮し、次の反応において直接使用した。
第3の工程では、化合物MC-VC-PAB-SN-38(1.3mg、1.2mol)をアセトニトリル0.3mLに溶解して、2h溶液中に加え(濃度6.2mg/mL、3.0mL)、4時間25℃の振盪下で反応させた。次いで、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラムにより精製し(溶出相:pH6.5 0.05MのPBS溶液)、無菌条件下でフィルターにより濾過して、生成物hu2F7-SN-38抗体-薬物コンジュゲートをPBS緩衝液(3.7mg/mL、4.7mL)中に得、これは4℃で冷蔵した。平均値yを紫外線法により決定した。コハク酸ナトリウム緩衝液で満たしたキュベットを参照吸光細胞及び試料判定吸光細胞にそれぞれ置き、溶媒ブランクを差し引いた後、試験溶液で満たしたキュベットを試料判定吸光細胞に置いた。吸光度を280nm及び370nmにおいて測定した。
データ処理:
抗体量Cmabは、標準曲線を定めることにより決定して、280nmの波長における吸光を測定した。小分子の量CDrugは、370nmの波長における吸光を測定することにより決定した。
平均薬物負荷y=CDrug/Cmab
生成物hu2F7-SN-38の平均値y=3.7は、上記の方法により決定した。hu2F7-SN-38(y=4)の試料をUV-HPLC精製により得た。
［実施例9：抗体のエキサテカンへのコンジュゲーション］
Figure 2022535858000071
第1の工程では、2a(2g、17.2mmol)をアセトニトリル75mLに溶解し、炭酸カリウム(9.27g、67.2mmol)、臭化ベンジル(20mL、167.2mmol)及びヨウ化テトラブチルアンモニウム(620mg、1.68mmol)を連続的に加えた。反応溶液を室温で48時間撹拌し、珪藻土により濾過した。濾過ケーキを酢酸エチル(20ml)ですすいだ。濾液を貯蔵し、減圧下で濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって溶媒系Cを展開することにより精製して、生成物5aを得た(3.2g、収率:90.1%)。
第2の工程では、5a(181.3mg、0.879mmol)及び4b(270mg、0.733mmol)を反応フラスコ内に加え、テトラヒドロフラン6mLを加え、アルゴンと3回置換した。反応混合物は、氷水浴中で0～5℃に冷却し、カリウムtert-ブトキシド(164mg、1.46mmol)を加え、次いで、氷水浴を除去することにより室温に温め、40分間撹拌した。反応混合物に氷水15mLを加え、酢酸エチル(40mL×2)及びクロロホルム(20mL×5)で抽出した。有機相を貯蔵し、濃縮した。得られた残留物をジオキサン6mLに溶解し、水3mL、炭酸水素ナトリウム(73.8mg、0.879mmol)及びクロロギ酸9-フルオレンメチル(9-fluorene methyl chloroformate、190mg、0.734mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応溶液に水30mLを加え、酢酸エチル(20mL×3)で抽出した。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液(30mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを使用することにより乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下で濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって溶媒系Cを展開することにより精製して、生成物5bであるベンジル10-シクロプロピル-1-(9H-フルオレン-9-イル)-3,6-ジオキソ-2,9-ジオキサ-4,7-ジアザウンデク-11-エートを得た(73mg、収率:19.4%)。
MSm/z(ESI):515.0[M+1]
第3の工程では、5b(30mg、0.058mmol)をテトラヒドロフラン及び酢酸エチルの混合溶媒(V:V=2:1)6.75mLに溶解し、パラジウムを炭素上に加え(18mg、含量10%、無水ベース)、水素と3回置換して、撹拌下に室温で1時間反応させた。反応溶液を珪藻土で濾過した。濾過ケーキを酢酸エチルですすいだ。濾液を濃縮して、粗生成物5cである10-シクロプロピル-1-(9H-フルオレン-9-イル)-3,6-ジオキソ-2,9-ジオキサ-4,7-ジアザウンデク-11-酸(20mg)を得、これは、次の反応において精製せずに直接使用した。
MSm/z(ESI):424.9[M+1]
第4の工程では、1b(15mg、28.2μmol)を反応フラスコ内に加え、N,N-ジメチルホルムアミド1.5mLを加え、アルゴンと3回置換した。反応混合物は、氷水浴中で0～5℃に冷却し、トリエチルアミンの液滴を加え、粗生成物5c(20mg、47.1μmol)を加え、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルクロロモルホリン(25.4mg、86.2μmol)を加えて、氷水浴中撹拌下で40分間反応させた。反応混合物に水15mLを加え、酢酸エチル(20mL×3)で抽出した。有機相を貯蔵した。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液(20mL×2)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを使用することにより乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下で濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーによって溶媒系Bを展開することにより精製して、表題の生成物5dである(9H-フルオレン-9-イル)メチル(2-(((1-シクロプロピル-2-(((1S,9S)-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドロジノ[1,2-b]キノリン-1-イル)アミノ)-2-オキソエトキシ)メチル)アミノ)-2-オキソエチル)カルバミン酸を得た(23.7mg、収率:78.9%)。
MSm/z(ESI):842.1[M+1]
第5の工程では、5d(30mg、35.7μmol)をジクロロメタン3mLに溶解し、ジエチルアミン1.5mLを加えて、室温で2時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、トルエン1.5mLを加え、減圧下で濃縮して、これを2回繰り返した。残留物にn-ヘキサン4.5mLを加えてすり潰した。放置後に上清を流出させて、個体を維持した。固体残留物を減圧下で濃縮し、ポンプで掻干して、粗生成物5eである2-((2-アミノアセトアミド)メトキシ)-2-シクロプロピル-N-((1S,9S)-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13, 15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドロジノ[1,2-b]キノリン-1-イル)アセトアミド(23mg)を得、これは、次の反応において精製せずに直接使用した。
MSm/z(ESI):638.0[M+18]
第6の工程では、粗生成物5e(20mg、32.3μmol)をN,N-ジメチルホルムアミド1mLに溶解し、アルゴンと3回置換した。反応混合物は、氷水浴中で0～5℃に冷却し、4g(31.8mg、76.3μmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液0.5mLを加え、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-yl)-4-メチルクロロモルホリン(27.8mg、94.3μmol)を加え、氷水浴中撹拌下で10分間反応させた。反応混合物は、氷水浴を除去することにより室温に温め、撹拌下で1時間反応させて化合物5を生成した。反応溶液は、高性能液体クロマトグラフィーにより精製した(分離条件:カラム:XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm;移動相:A-水(10mmol NH4OAc):B-アセトニトリル、勾配溶出、流量:18mL/分)。対応する成分を収集し、減圧下で濃縮して生成物5-A及び5-Bを得た(3.6mg、2.6mg)。
MSm/z(ESI):1074.4[M+1]
単一構造化合物5-A(短保持時間)
UPLC解析:保持時間1.14分、純度:85%(カラム:ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm、移動相:A-水(5mmol NH4OAc)、B-アセトニトリル)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ8.60(t、1H)、8.51～8.49(d、1H)、8.32～8.24(m、1H)、8.13～8.02(m、2H)、8.02～7.96(m、1H)、7.82～7.75(m、1H)、7.31(s、1H)、7.26～7.15(m、4H)、6.99(s、1H)、6.55～6.48(m、1H)、5.65～5.54(m、1H)、5.41(s、2H)、5.35～5.15(m、3H)、4.74～4.62(m、2H)、4.54～4.40(m、2H)、3.76～3.64(m、4H)、3.62～3.48(m、2H)、3.20～3.07(m、2H)、3.04～2.94(m、2H)、2.80～2.62(m、2H)、2.45～2.30(m、3H)、2.25～2.15(m、2H)、2.15～2.04(m、2H)、1.93～1.78(m、2H)、1.52～1.39(m、3H)、1.34～1.12(m、5H)、0.87(t、3H)、0.64～0.38(m、4H)
単一構造化合物5-B(長保持時間):
UPLC解析:保持時間1.16分、純度:89%(カラム:ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm、移動相:A-水(5mmol NH4OAc)、B-アセトニトリル)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ8.68～8.60(m、1H)、8.58～8.50(m、1H)、8.32～8.24(m、1H)、8.13～8.02(m、2H)、8.02～7.94(m、1H)、7.82～7.75(m、1H)、7.31(s、1H)、7.26～7.13(m、4H)、6.99(s、1H)、6.55～6.48(m、1H)、5.60～5.50(m、1H)、5.41(s、2H)、5.35～5.15(m、3H)、4.78～4.68(m、1H)、4.60～4.40(m、2H)、3.76～3.58(m、4H)、3.58～3.48(m、1H)、3.20～3.10(m、2H)、3.08～2.97(m、2H)、2.80～2.72(m、2H)、2.45～2.30(m、3H)、2.25～2.13(m、2H)、2.13～2.04(m、2H)、2.03～1.94(m、2H)、1.91～1.78(m、2H)、1.52～1.39(m、3H)、1.34～1.12(m、5H)、0.91～0.79(m、3H)、0.53～0.34(m、4H)
他の中間体の調製方法は、中間体5の方法を参照した。
抗体hu2F7のPBS緩衝水溶液(pH=6.5 0.05M PBS緩衝水溶液;7.3ml、13.8mg/ml、0.681μmol)にトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンの調製した水溶液(10mM、0.347mL、3.47μmol)を37℃で加えた。反応混合物を水浴振盪機内に置き、37℃の振盪下で3時間反応させた。反応を終結させ、反応溶液を水浴中で25℃に冷却し、14.0mlに希釈し、溶液3.3mlを取り出して次の反応を行った。
化合物5-A(3.0mg、3.72μmol)をDMSO 0.15mLに溶解し、上記の溶液3.3ml中に加えた。反応混合物を水浴振盪機に置き、25℃の振盪下で3時間反応させた。反応を終結させた。反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラムを使用することにより精製して(溶出相:pH6.5 0.05MのPBS緩衝水溶液、0.001MのEDTAを含む)、Ab-エキサテカンの例となる生成物hu2F7-エキサテカン(化合物34)をPBS緩衝液(1.35mg/mL、13mL)中に得、これは4℃で保存した。平均値yは、紫外線法により決定した。コハク酸ナトリウム緩衝液で満たしたキュベットを参照吸光細胞及び試料判定吸光細胞にそれぞれ置き、溶媒ブランクを差し引いた後、試験溶液で満たしたキュベットを試料判定吸光細胞に置いた。吸光度を280nm及び370nmにおいて測定した。
データ処理:
抗体量Cmabは、標準曲線を定めることにより決定して、280nmの波長における吸光を測定した。小分子の量CDrugは、370nmの波長における吸光を測定することにより決定した。
平均薬物負荷y=CDrug/Cmab
例となる生成物hu2F7-エキサテカン(化合物34)に関しては、yが7.6であることを上記の方法により決定した。hu2F7-エキサテカン(y=8)の試料をUV-HPLC精製により得た。
他の抗体コンジュゲートの調製方法は、化合物34の方法を参照した。
［実施例10：腫瘍細胞に対する抗体-薬物コンジュゲートの殺傷活性］
腫瘍細胞に対する本発明の抗体-薬物コンジュゲートの殺傷効果を試験するために、MX-1乳がん細胞を使用して評価した。MX-1細胞を収集し、遠心分離して、計数した。細胞濃度を、完全培地で0.44×106細胞/mLに調整し、細胞を白色96ウェルプレートの60ウェル内に1ウェルあたり90μLの細胞数40,000で播種した。残りの周辺のウェルには、PBSを100μL加えた。細胞プレートを37℃、5%CO2のインキュベーター内に置き、一晩培養した。実験の2日目に、抗体-薬物コンジュゲート溶液をPBSで96ウェルV底プレート内に、1000nMの濃度から開始して調製した(3倍希釈及び9種の濃度)。調製の完了後、溶液を白色96ウェルプレートに1ウェルあたり10μLで、2度繰り返して加えた。細胞プレートを37℃、5%CO2のインキュベーター内に置き、培養を72時間持続させた。実験の5日目に、プレートを検出し、読み取った。細胞培養プレートを取り出した。2つの対照ウェルを設定した。40,000細胞を含む培地100μLを各ウェルに加え、室温への平衡化後、CTG溶液(Promega社G7573)50μLを各ウェルに加えた。混合物を振盪及び混合し、暗所に置いて10分間放置し、次いで、マイクロプレートリーダーの発光プログラムを使用することにより検出した。最大殺傷率=(1-1000nMウェルの蛍光値/対照ウェルの蛍光値)%。実験結果は、Table 4(表8)に示すものである。
Figure 2022535858000072
［実施例11：腫瘍細胞の増殖に対する抗体-薬物コンジュゲートの阻害効果］
腫瘍細胞に対する本発明の抗体-薬物コンジュゲートの殺傷効果を試験するために、SK-BR-3(ATCC#HTB30)乳がん細胞を使用して評価した。SK-BR-3細胞を収集し、遠心分離して、計数した。細胞濃度を、完全培地で0.44×106細胞/mLに調整し、細胞を白色96ウェルプレートの60ウェル内に1ウェルあたり90μLの細胞数40,000で播種した。残りの周辺のウェルには、PBSを100μL加えた。細胞プレートを37℃、5%CO2のインキュベーター内に置き、一晩培養した。実験の2日目に、抗体-薬物コンジュゲート溶液をPBSで96ウェルV底プレート内に、1000nMの濃度から開始して調製した(3倍希釈及び9種の濃度)。調製の完了後、溶液を白色96ウェルプレートに1ウェルあたり10μLで、2度繰り返して加えた。他の2つの対照ウェルを設定し、PBS 10μLを各ウェルに加えた。細胞プレートを37℃、5%CO2のインキュベーター内に置き、培養を72時間持続させた。実験の5日目に、プレートを検出し、読み取った。細胞培養プレートを取り出した。室温への平衡化後、CTG溶液(Promega社G7573)50μLを各ウェルに加えた。混合物を振盪及び混合し、暗所に置いて10分間放置し、次いで、マイクロプレートリーダーの発光プログラムを使用することにより検出した。最大阻害率=(1-1000nMウェルの蛍光値/対照ウェルの蛍光値)%。実験結果は、Table 5(表9)に示すものである。
Figure 2022535858000073
［実施例12：MMAFにコンジュゲートした抗体-薬物コンジュゲートのin vivoでの有効性の評価］
マウスにおけるMX-1細胞を用いた移植腫瘍の形成後、本発明の抗体-薬物コンジュゲートの抗腫瘍効果を評価した。MX-1細胞5×106細胞を、免疫不全ヌードマウス(BALB/cNude)の皮下に注射した。2週間後、抗体-薬物コンジュゲートhu2G6-MC-MMAF及びhu2F7-MC-MMAFの静脈内注射を、1回/週の頻度及び1.5mg/kg又は3mg/kgの用量で実施した。ヒトIgGタンパク質を対照として3mg/kgの用量で使用した。対照群又は投与群の各群にマウス5匹が存在した。腫瘍阻害率は、腫瘍体積を測定することにより算出した。腫瘍阻害率=100%-(21日目の投与群の腫瘍体積-0日目の投与群の腫瘍体積)/(21日目の対照群の腫瘍体積-0日目の対照群の腫瘍体積)。実験結果は、図1及びTable 6(表10)に示すものである。hu2G6-MC-MMAF及びhu2F7-MC-MMAFの両方が、用量依存的抗腫瘍効果を示す。hu2G6-MC-MMAF及びhu2F7-MC-MMAFの両方が、3mg/kgの用量において100%を超える腫瘍阻害率を示し、これは、本発明の抗体-薬物コンジュゲートによって、腫瘍増殖が阻害されるだけでなく、既に形成された腫瘍に対する殺傷効果ももたらされ得ることを意味する。
Figure 2022535858000074
［実施例13：種々の薬物負荷を有する抗体-薬物コンジュゲートのin vivoでの有効性の評価］
種々の薬物負荷を有する抗体-薬物コンジュゲートを更に試験するために、抗体-薬物コンジュゲートを実施例7の方法により調製し、HPLCにより精製して、hu2F7-MC-MMAF(y=2)及びhu2F7-MC-MMAF(y=4)を得た(図2)。マウスにおいてMX-1を用いた移植腫瘍の形成後、本発明の抗体-薬物コンジュゲートの抗腫瘍効果を評価した。MX-1細胞5×106細胞を、免疫不全ヌードマウスの皮下に注射した。2週間後、抗体-薬物コンジュゲートhu2F7-MC-MMAF(y=2)及びhu2F7-MC-MMAF(y=4)の静脈内注射を、1回/週の頻度及び3mg/kgの用量で実施した。ヒトIgGタンパク質を対照として3mg/kgの用量で使用した。対照群又は投与群の各群にマウス5匹が存在した。腫瘍阻害率は、腫瘍体積を測定することにより算出した。腫瘍阻害率=100%-(21日目の投与群の腫瘍体積-0日目の投与群の腫瘍体積)/(21日目の対照群の腫瘍体積-0日目の対照群の腫瘍体積)。実験結果は、図3及びTable 7(表11)に示すものである。hu2F7-MC-MMAF(y=2)及びhu2F7-MC-MMAF(y=4)の両方が、抗腫瘍効果を示す。hu2F7-MC-MMAF(y=4)は、3mg/kgの用量においてhu2F7-MC-MMAF(y=2)よりも強力な抗腫瘍効果を有し、これにより100%を超える腫瘍阻害率を示し、これは、hu2F7-MC-MMAF(y=4)によって、腫瘍増殖が阻害されるだけでなく、既に形成された腫瘍に対する殺傷効果ももたらされ得ることを意味する(図4)。
Figure 2022535858000075
［実施例14：エキサテカンにコンジュゲートした抗体-薬物コンジュゲートのin vivoでの有効性の評価］
エキサテカンにコンジュゲートした抗体-薬物コンジュゲートを試験するために、抗体-薬物コンジュゲートを実施例9の方法により調製し、HPLCにより精製して、hu2F7-エキサテカン(化合物34、y=8)を得た。マウスにおいてMX-1を用いた移植腫瘍の形成後、本発明の抗体-薬物コンジュゲートの抗腫瘍効果を評価した。MX-1細胞5×106細胞を、免疫不全ヌードマウスの皮下に注射した。2週間後、抗体-薬物コンジュゲートhu2F7-エキサテカン(y=8)の静脈内注射を、1回/週の頻度並びに5mg/kg及び10mg/kgの用量で実施した。ヒトIgGタンパク質を対照として5mg/kgの用量で使用した。対照群又は投与群の各群にマウス5匹が存在した。腫瘍阻害率は、腫瘍体積を測定することにより算出した。腫瘍阻害率=100%-(18日目の投与群の腫瘍体積-0日目の投与群の腫瘍体積)/(18日目の対照群の腫瘍体積-0日目の対照群の腫瘍体積)。実験結果は、Table 8(表12)に示すものである。hu2F7-エキサテカンは、5mg/kg及び10mg/kgの両用量において100%を超える腫瘍阻害率を示し、これは、hu2F7-エキサテカン(y=8)によって、腫瘍増殖が阻害されるだけでなく、既に形成された腫瘍に対する殺傷効果ももたらされ得ることを意味する。
Figure 2022535858000076
［実施例15：エキサテカンにコンジュゲートした抗体-薬物コンジュゲートのバイスタンダー殺傷活性の実験］
エキサテカンにコンジュゲートした本発明の抗体-薬物コンジュゲートの、B7-H4陰性細胞の殺傷に対する、バイスタンダー効果による効果を試験するために、B7-H4発現陰性の骨髄腫細胞系に対する抗体-薬物コンジュゲートの殺傷活性を、ONE-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ検出キットを使用することにより検出した。MX-1細胞を収集、遠心分離、計数し、完全培地で7.5×106細胞/mLの細胞懸濁液に調整し、白色96ウェルプレート上に播種した。MX-1細胞懸濁液33μLを「混合細胞群」の各ウェルに加え、PBS 33μLを「単一細胞群」の各ウェルに加えた。B7-H4発現陰性のNCI-H929-LUC腫瘍細胞(Cobioer社カタログ番号CBP30061L)を収集した。細胞濃度を1.5×106細胞/mLに調製した。NCI-H929-LUC細胞懸濁液33μLを「混合細胞群」及び「単一細胞群」の各ウェルに加えた。細胞プレートを37℃、5%CO2のインキュベーターに置き、一晩培養した。実験の2日目に、最も高濃度の試験する抗体-薬物コンジュゲートhu2F7-エキサテカン(化合物34、y=8)を3000nMに均一に調整し、希釈して9種の用量の5倍勾配を得た。希釈した抗体-薬物コンジュゲート希釈標準溶液33μLを実験プレートの各ウェルに加え、穏やかに混合した。細胞プレートを37℃、5%CO2のインキュベーターに置き、48時間インキュベートした。細胞培養プレートを取り出し、室温に平衡化した。次いで、ONE-Glo(商標)ルシフェラーゼ試薬(Promega社E6120)100μLを各ウェルに加えた。細胞を浸透し、室温の暗所で10分間溶解させた。細胞溶解物を1000rpm/分で1分間遠心分離し、次いで、透明底の96ウェルプレートに1ウェルあたり180μLで移した。プレートをマイクロプレートリーダー上490nmの波長で読み取った。データは、Graphpad Prismソフトウェアを使用して解析した。実験結果は、Table 9(表13)に示すものである。ONE-Glo(商標)ルシフェラーゼ試薬により、NCI-H929-LUC細胞の生存率を特異的に検出することができる。hu2F7-エキサテカンによって、「混合細胞群」においてNCI-H929-LUC細胞が効率的に殺傷され、これによりB7-H4陽性細胞の存在下で、hu2F7-エキサテカンが、バイスタンダー殺傷効果を有することが示され、またこれによってB7-H4陽性細胞が殺傷され得るだけでなく、非感受性のB7-H4陰性細胞も殺傷され得る(「単一細胞群」において)。
Figure 2022535858000077

Claims (41)

  1. 一般式(A):
    Figure 2022535858000078
     (式中、
    Dは、細胞毒性薬物であり、
    L1及びL2は、リンカーユニットであり、
    yは、1～20の数であり、
    Abは、B7-H4抗体又はその抗原結合断片であり、これは、抗体軽鎖可変領域及び抗体重鎖可変領域を含み、
    抗体重鎖可変領域が、
    配列番号3、配列番号4、配列番号5、
    配列番号9、配列番号10、配列番号11
    配列番号23、配列番号24、配列番号25、
    配列番号29、配列番号30、配列番号31
    からなる群から選択される配列に示す少なくとも1つのHCDRを含み、
    抗体軽鎖可変領域が、
    配列番号6、配列番号7、配列番号8、
    配列番号12、配列番号13、配列番号14
    配列番号26、配列番号27、配列番号28、
    配列番号32、配列番号33、配列番号34
    からなる群から選択される配列に示す少なくとも1つのLCDRを含む)
    の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  2. Abの抗体重鎖可変領域が、次の(1)～(4):
    (1)配列番号3に示すHCDR1、配列番号4に示すHCDR2及び配列番号5に示すHCDR3、
    (2)配列番号9に示すHCDR1、配列番号10に示すHCDR2及び配列番号11に示すHCDR3、
    (3)配列番号23に示すHCDR1、配列番号24に示すHCDR2及び配列番号25に示すHCDR3、又は、
    (4)配列番号29に示すHCDR1、配列番号30に示すHCDR2及び配列番号31に示すHCDR3
    からなる群から選択されるいずれか1つのCDRを含む、請求項1に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  3. Abの抗体軽鎖可変領域が、次の(1)～(4):
    (1)配列番号6に示すLCDR1、配列番号7に示すLCDR2及び配列番号8に示すLCDR3、
    (2)配列番号12に示すLCDR1、配列番号13に示すLCDR2及び配列番号14に示すLCDR3、
    (3)配列番号26に示すLCDR1、配列番号27に示すLCDR2及び配列番号28に示すLCDR3、又は、
    (4)配列番号32に示すLCDR1、配列番号33に示すLCDR2及び配列番号34に示すLCDR3
    からなる群から選択されるいずれか1つのCDRを含む、請求項1に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  4. Abの抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域が、次の(1)～(4):
    (1)配列番号3に示すHCDR1、配列番号4に示すHCDR2及び配列番号5に示すHCDR3、並びに
    配列番号6に示すLCDR1、配列番号7に示すLCDR2及び配列番号8に示すLCDR3、
    (2)配列番号9に示すHCDR1、配列番号10に示すHCDR2及び配列番号11に示すHCDR3、並びに
    配列番号12に示すLCDR1、配列番号13に示すLCDR2及び配列番号14に示すLCDR3、
    (3)配列番号23に示すHCDR1、配列番号24に示すHCDR2及び配列番号25に示すHCDR3、並びに
    配列番号26に示すLCDR1、配列番号27に示すLCDR2及び配列番号28に示すLCDR3、又は、
    (4)配列番号29に示すHCDR1、配列番号30に示すHCDR2及び配列番号31に示すHCDR3、並びに
    配列番号32に示すLCDR1、配列番号33に示すLCDR2及び配列番号34に示すLCDR3
    からなる群から選択されるいずれか1つのCDRを含む、請求項1に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  5. Abが、マウス抗体又はその断片、キメラ抗体又はその断片、ヒト抗体又はその断片、及びヒト化抗体又はその断片である、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  6. Abが、(a)、(b)及び(c):
    (a)ヒト生殖系列軽鎖及び重鎖配列又はその変異配列に由来する軽鎖フレームワーク領域及び重鎖フレームワーク領域、
    (b)ヒトIgG1若しくはそのバリアント、IgG2若しくはそのバリアント、IgG3若しくはそのバリアント又はIgG4若しくはそのバリアントに由来する重鎖定常領域、好ましくは、ヒトIgG1、IgG2又はIgG4に由来する重鎖定常領域、より好ましくは、アミノ酸変異後にADCC毒性が増強されたIgGの重鎖定常領域、最も好ましくは、配列番号54に示す重鎖定常領域、
    (c)ヒトκ鎖、λ鎖又はそのバリアントに由来する軽鎖定常領域、好ましくは、ヒトκ鎖に由来する軽鎖定常領域、より好ましくは、配列番号55に示す軽鎖定常領域
    のいずれか1つ又はこれらの組合せを更に含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  7. Abが、次の配列:配列番号16、配列番号18、配列番号36、配列番号38の軽鎖可変領域、又は配列番号16、配列番号18、配列番号36、配列番号38に対する少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%若しくは99%の相同性を有する軽鎖可変領域を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  8. Abが、次の配列:配列番号15、配列番号17、配列番号35、配列番号37の重鎖可変領域、又は配列番号15、配列番号17、配列番号35、配列番号37に対する少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%若しくは99%の相同性を有する重鎖可変領域を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  9. Abの軽鎖が、次の配列:配列番号20、配列番号22、配列番号40、配列番号42、又は配列番号20、配列番号22、配列番号40、配列番号42に対する少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の相同性を有する完全長軽鎖からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  10. Abの重鎖が、次の配列:配列番号19、配列番号21、配列番号39、配列番号41、又は配列番号19、配列番号21、配列番号39、配列番号41に対する少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の相同性を有する完全長重鎖からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  11. Abの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が:
    (1)配列番号15に示す重鎖可変領域及び配列番号16に示す軽鎖可変領域、
    (2)配列番号17に示す重鎖可変領域及び配列番号18に示す軽鎖可変領域、
    (3)配列番号35に示す重鎖可変領域及び配列番号36に示す軽鎖可変領域、又は、
    (4)配列番号37に示す重鎖可変領域及び配列番号38に示す軽鎖可変領域
    からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  12. Abが:
    (1)配列番号20に示す軽鎖及び配列番号19に示す重鎖、
    (2)配列番号22に示す軽鎖及び配列番号21に示す重鎖、
    (3)配列番号40に示す軽鎖及び配列番号39に示す重鎖、又は、
    (4)配列番号42に示す軽鎖及び配列番号41に示す重鎖
    からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  13. 抗原結合断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体、2量体化V領域、ジスルフィド結合安定化V領域、及びCDRを含むペプチドの抗原結合断片からなる群から選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  14. 細胞毒性薬物が、毒素、化学療法剤、抗生剤、放射性同位体、及び核酸分解酵素からなる群から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  15. 細胞毒性薬物が、細胞分裂を阻害するチューブリン阻害剤又はDNAトポイソメラーゼ阻害剤、好ましくは、DM1、DM3、DM4、SN-38、MMAF又はMMAE、より好ましくは、チューブリン阻害剤SN-38、MMAE又はMMAFからなる群から選択される、請求項1から14のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  16. 細胞毒性薬物が、カンプトテシン誘導体、好ましくは、エキサテカン:
    Figure 2022535858000079
     から選択される、請求項1から14のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  17. 細胞毒性薬物が、
    Figure 2022535858000080
     からなる群から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  18. 抗体-薬物コンジュゲートが、一般式(I):
    Figure 2022535858000081
     (式中、
    L1及びL2が、リンカーユニットであり、
    yが、1～8から選択される数、好ましくは、2～4から選択される数であり、
    Abが、請求項1から12のいずれか一項に記載のB7-H4抗体又はその抗原結合断片である)
    に示すものである、請求項1に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  19. 抗体-薬物コンジュゲートが、一般式(II):
    Figure 2022535858000082
     (式中、
    L1及びL2が、リンカーユニットであり、
    yが、1～8から選択される数、好ましくは、2～4から選択される数であり、
    Abが、請求項1から12のいずれか一項に記載のB7-H4抗体又はその抗原結合断片である)
    に示すものである、請求項1に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  20. 抗体-薬物コンジュゲートが、一般式(III):
    Figure 2022535858000083
     (式中、
    L1及びL2が、リンカーユニットであり、
    yが、1～10から選択される数、好ましくは、2～8から選択される数、より好ましくは、4～8から選択される数、更に好ましくは、6～8の数、最も好ましくは、8であり、
    Abが、請求項1から12のいずれか一項に記載のB7-H4抗体又はその抗原結合断片である)
    に示すものである、請求項1に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  21. L1が、一般式(B):
    Figure 2022535858000084
     (式中、
    M1が、-CR1R2-であり、
    R1及びR2が、同一であるか又は異なり、水素、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル及びアミノからなる群から独立的に選択され、
    nが、0～5、好ましくは、1、2又は3の整数である)
    に示すものである、請求項18から20のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  22. L2が、一般式(C):
    Figure 2022535858000085
     (式中、
    M2が、-CR4R5-であり、
    R3が、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アルコキシル及びシクロアルキルからなる群から選択され、
    R4及びR5が、同一であるか又は異なり、水素、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル及びアミノからなる群から独立的に選択され、
    mが、0～5、好ましくは、1、2又は3の整数である)
    に示すものである、請求項18から20のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  23. L2が、一般式(D):
    -K1-K2-K3-K4-
    (D)
    (式中、
    K1が、
    Figure 2022535858000086
     であり、sが、2～8の整数であり、
    K2が、-NR1(CH2CH2O)pCH2CH2C(O)-、-NR1(CH2CH2O)pCH2C(O)-、-S(CH2)pC(O)-及び単結合からなる群から選択され、pが、1～20、好ましくは、1～6の整数であり、
    R1が、水素、重水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、重水素化アルキル及びヒドロキシアルキルからなる群から選択され、
    K3が、テトラペプチド残基であり、好ましくは、テトラペプチド残基が、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸の2つ以上からなる群から選択されるアミノ酸により形成されるペプチド残基、より好ましくは、テトラペプチド残基GGFGであり、
    K4が、-NR2(CR3R4)t-であり、R2、R3又はR4が、それぞれ独立的に水素、重水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、重水素化アルキル及びヒドロキシアルキルであり、tが、1又は2である)
    に示すものである、請求項18から20のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  24. リンカーユニット-L2-のK1末端が、Abに結合し、K4末端が、L1に結合している、請求項23に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  25. L1が、-O-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-、-O-CR5R6-(CRaRb)m-、-O-CR5R6-、-NH-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-及び-S-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-からなる群から選択され、
    Ra及びRbが、水素、重水素、ハロゲン及びアルキルからなる群からそれぞれ独立的に選択され、
    R5が、ハロアルキル又はシクロアルキルであり、
    R6が、水素、ハロアルキル及びシクロアルキルからなる群から選択されるか、
    又はR5及びR6並びにこれらが結合している炭素原子が、シクロアルキルを形成し、
    mが、0、1、2、3又は4である、
    請求項18から20のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  26. L1のO末端が、リンカーユニットL2に結合している、請求項25に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  27. L1が、一般式(E):
    Figure 2022535858000087
     (R5が、ハロアルキル又はシクロアルキルからなる群から選択され、
    R6が、水素、ハロアルキル及びシクロアルキルからなる群から選択されるか、
    又はR5及びR6並びにこれらが結合している炭素原子が、シクロアルキルを形成し、
    好ましくは、
    R5が、C1～6ハロアルキル及びC3～6シクロアルキルからなる群から選択され、
    R6が、水素、C1～6ハロアルキル及びC3～6シクロアルキルからなる群から選択されるか、
    又はR5及びR6並びにこれらが結合している炭素原子が、C3～6シクロアルキルを形成し、
    mが、0～4の整数であり、
    より好ましくは、一般式(E)は、次の置換基:
    Figure 2022535858000088
     からなる群から選択される)
    に示すものである、請求項25に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  28. -L2-L1-が、次の構造:
    Figure 2022535858000089
     (K2が、結合であり、
    K3が、テトラペプチド残基GGFGであり、
    R5が、ハロアルキル及びC3～6シクロアルキルからなる群から選択され、
    R6が、水素、ハロアルキル及びC3～6シクロアルキルからなる群から選択されるか、
    又はR5及びR6並びにこれらが結合している炭素原子が、C3～6シクロアルキルを形成し、
    R2、R3又はR4が、それぞれ独立的に水素又はアルキルであり、
    sが、2～8の整数であり、
    mが、0～4の整数であり、
    好ましくは、-L2-L1-が、次の構造:
    Figure 2022535858000090
    Figure 2022535858000091
     からなる群から選択される)
    に示すものである、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  29. 抗体-薬物コンジュゲートが、一般式(IV):
    Figure 2022535858000092
     (式中、
    Wが、C1～8アルキル、C1～8アルキル-シクロアルキル及び1～8原子の直鎖状ヘテロアルキルからなる群から選択され、前記ヘテロアルキルが、N、O及びSからなる群から選択される1～3個のヘテロ原子を含み、ここで、前記C1～8アルキル、シクロアルキル及び直鎖状ヘテロアルキルが、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、アルキル、クロロアルキル、重水素化アルキル、アルコキシル及びシクロアルキルからなる群から選択される1つ又は複数の置換基により更に置換されており、
    K2が、-NR1(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR1(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-又は結合からなる群から選択され、R1が、水素原子、アルキル、ハロアルキル、重水素化アルキル及びヒドロキシアルキルからなる群から選択され、p1が、1～20の整数であり、
    K3が、アミノ酸2～7個からなるペプチド残基であり、前記アミノ酸が、置換又は非置換であってもよく、置換されている場合、置換基が、任意の可能な付着点で置換されてもよく、前記置換基が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、アルキル、クロロアルキル、重水素化アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルからなる群から独立的に選択される1つ又は複数であり、
    R2が、水素原子、アルキル、ハロアルキル、重水素化アルキル及びヒドロキシアルキルからなる群から独立的に選択され、
    R3及びR4が、水素原子、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、重水素化アルキル及びヒドロキシアルキルからなる群からそれぞれ独立的に選択され、
    R5が、ハロゲン、ハロアルキル、重水素化アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、
    R6が、水素原子、ハロゲン、ハロアルキル、重水素化アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択されるか、
    又はR5及びR6並びにこれらが結合している炭素原子が、シクロアルキル若しくはヘテロシクリルを形成し、
    mが、0～4の整数であり、
    yが、1～10であり、yが、小数又は整数であり、
    Abが、抗B7-H4抗体又はこの抗原結合断片である)
    に示すものである、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  30. 抗体-薬物コンジュゲートが、一般式(I-A):
    Figure 2022535858000093
     に示すものである、請求項18に記載の一般式(I)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  31. 抗体-薬物コンジュゲートが、一般式(I-B):
    Figure 2022535858000094
     に示すものである、請求項18に記載の一般式(I)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  32. 抗体-薬物コンジュゲートが、一般式(II-A):
    Figure 2022535858000095
     に示すものである、請求項19に記載の一般式(II)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  33. 抗体-薬物コンジュゲートが、一般式(II-B):
    Figure 2022535858000096
     に示すものである、請求項19に記載の一般式(II)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  34. 抗体-薬物コンジュゲートが、一般式(IV-A):
    Figure 2022535858000097
     に示すものであり、好ましくは、抗体-薬物コンジュゲートが:
    Figure 2022535858000098
    Figure 2022535858000099
    Figure 2022535858000100
     に示すものである、請求項29に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  35. 抗体-薬物コンジュゲートが、次の化合物:
    Figure 2022535858000101
    Figure 2022535858000102
    Figure 2022535858000103
    Figure 2022535858000104
    Figure 2022535858000105
    Figure 2022535858000106
    Figure 2022535858000107
    Figure 2022535858000108
    Figure 2022535858000109
    Figure 2022535858000110
    Figure 2022535858000111
    Figure 2022535858000112
    Figure 2022535858000113
    Figure 2022535858000114
    Figure 2022535858000115
    Figure 2022535858000116
    Figure 2022535858000117
    Figure 2022535858000118
    Figure 2022535858000119
    Figure 2022535858000120
    Figure 2022535858000121
    Figure 2022535858000122
    Figure 2022535858000123
    Figure 2022535858000124
    Figure 2022535858000125
    Figure 2022535858000126
    Figure 2022535858000127
    Figure 2022535858000128
    Figure 2022535858000129
    Figure 2022535858000130
    Figure 2022535858000131
    Figure 2022535858000132
    Figure 2022535858000133
     (式中、yが、2～10、好ましくは、4～8、より好ましくは、6～8、更に好ましくは、7若しくは8、最も好ましくは、8から選択される)
    からなる群から選択される、請求項1から34のいずれか一項に記載の一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物。
  36. 次の工程:
    Figure 2022535858000134
     (式中、
    Abが、抗B7-H4抗体又はその抗原結合断片であり、
    W、K2、K3、R2～R6、m及びyが、請求項29に規定するものである)
    を含み、Abを還元後、これを一般式(F)とカップリングさせ、一般式(IV)の化合物を得る、一般式(IV)の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物を調製するための方法。
  37. 一般式(F)が、一般式(F-1):
    Figure 2022535858000135
     (式中、
    K2、K3、R2～R6、s及びmは、請求項28に規定するものである)
    の化合物又はその互変異性体、メソマー、ラセミ化合物、エナンチオマー、ジアステレオマー若しくはこれらの混合形態、或いは薬学的に許容されるこれらの塩である、請求項36に記載の方法。
  38. Figure 2022535858000136
    Figure 2022535858000137
     からなる群から選択される、一般式(F)又は一般式(F-1)の化合物。
  39. 請求項1から35のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物、及び1つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  40. ヒトB7-H4と関連する疾患を治療するための医薬の製造における、請求項1から35のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和化合物、及び請求項39に記載の医薬組成物の使用。
  41. B7-H4を高発現するがんを治療するための医薬の製造のためのものであることを特徴とし、がんが、ヒト脳の星状芽細胞腫、ヒト咽頭がん、副腎腫瘍、AIDS関連がん、胞状軟部肉腫、星状細胞腫、膀胱がん、骨がん、脳及び脊髄のがん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頸がん、軟骨肉腫、脊索腫、腎臓の嫌色素性細胞がん、明細胞がん、結腸がん、結腸直腸がん、結合組織増殖性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症、線維性骨異形成症、胆嚢又は胆管細胞がん、胃がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭頸部がん、肝細胞がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん、白血病、脂肪肉腫/悪性脂肪腫、肝臓がん、リンパ腫、肺がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、乳頭様甲状腺がん、副甲状腺腫、小児がん、末梢性シュワン腫、松果体細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後部ブドウ膜黒色腫、転移性腎臓がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺がん、転移性甲状腺がん並びに子宮がんからなる群から選択される、請求項40に記載の使用。
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