JP2022520574A - テンプレートなしの酵素によるポリヌクレオチド合成における効率的生成物切断 - Google Patents

Abstract

本発明は、エンドヌクレアーゼＶ活性および３’－最後から２番目のデオキシイノシンを有する開始剤を使用して、上記ポリヌクレオチド生成物をその開始剤から効率的に切断する工程を含むかまたは可能にする、テンプレートなしの酵素によるポリヌクレオチド合成のための方法およびキットに関する。５’末端によって支持体に付着され、かつ３’－最後から２番目のデオキシイノシンおよび遊離３’－ヒドロキシルを有する３’－末端ヌクレオチドを有する開始剤を含むポリヌクレオチドを酵素により合成するためのキット。

Description

背景
ポリヌクレオチド合成の酵素によるアプローチにおける関心事は、多くの分野（例えば、合成生物学、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９適用、ハイスループットシーケンシングなど）において合成ポリヌクレオチドの需要の増大およびポリヌクレオチド合成の化学的アプローチの制限の両方が原因で、近年増大している。Ｊｅｎｓｅｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５７： １８２１－１８３２ （２０１８）。現在、大部分の酵素によるアプローチは、テンプレートなしのポリメラーゼを使用して、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシド三リン酸を、支持体に付着した１本鎖開始剤または伸長した鎖に繰り返し付加し、続いて、所望の配列のポリヌクレオチドが得られるまで脱ブロックする。このような酵素による合成の実際的な実行を考案するという難題の中には、所望のポリヌクレオチド生成物を、開始剤配列および支持体から切断する、費用効果的かつ効率的方法を見出すことがある。

上記に鑑みると、酵素によるポリヌクレオチド合成は、方法が、ポリヌクレオチド生成物の、それらの１本鎖開始剤からの高効率切断に利用可能であるならば、進歩すると思われる。

Ｊｅｎｓｅｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５７： １８２１－１８３２ （２０１８）

発明の要旨
本発明は、エンドヌクレアーゼＶ活性を使用して、ポリヌクレオチド生成物をその開始剤から効率的に切断する工程を含むかまたは可能にするテンプレートなしの酵素によるポリヌクレオチド合成のための方法およびキットに関する。

１つの局面において、本発明の方法は、以下の工程を有する、所定の配列のポリヌクレオチドを合成する方法を含む：ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する３’－末端ヌクレオチドに対して最後から２番目のデオキシイノシンを有する開始剤を提供する工程；ｂ）（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する上記開始剤または伸長したフラグメントと、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシド三リン酸およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼとを接触させて、その結果、前記開始剤または伸長したフラグメントは、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシド三リン酸の取り込みによって伸長されて、３’－Ｏ－ブロックされ伸長したフラグメントを形成する工程、ならびに（ｉｉ）上記伸長したフラグメントを脱ブロックして、上記ポリヌクレオチドが形成されるまで、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長したフラグメントを形成する工程、のサイクルを反復する工程；ならびにｃ）上記ポリヌクレオチドをエンドヌクレアーゼＶ活性で処理して、上記ポリヌクレオチドを上記開始剤から切断する工程。

本発明は、有利なことには、その３’末端の最後から二番目の位置にデオキシイノシンを有する開始剤を提供することによって、酵素によるポリヌクレオチド合成の分野にある上記の問題を克服する。これは、その末端ヌクレオチドにおいて１本鎖開始剤の効率的切断を可能にし、５’－モノホスフェートを有するポリヌクレオチド生成物を放出する。

図１は、本発明の切断効率を示すための実験設定を図示する。 図２は、ＵＳＥＲ／デオキシウリジン切断およびＥｎｄｏ Ｖ／イノシン切断の効率を比較するデータを示す。

発明の詳細な説明
本発明の一般原理は、特に例示（例えば、図面に示され、詳細に記載されるもの）によって、本明細書でより詳細に開示される。しかし、本発明が、発明を記載される特定の実施形態に限定するべきではないことは理解されるべきである。本発明は、種々の改変および代替の形態を受け入れる余地がある。その具体的なものは、いくつかの実施形態に関して示される。この意図は、本発明の原理および範囲の中に入る全ての改変、等価物、および選択肢を網羅することである。

本発明の実施は、別段示されなければ、当該分野の技術範囲内である、従来技術、ならびに有機化学、分子生物学（組み換え技術を含む）、細胞生物学、および生化学の説明を使用し得る。このような従来技術としては、合成ペプチド、合成ポリヌクレオチド、モノクローナル抗体、核酸クローニング、増幅、配列決定および分析、ならびに関連技術の調製および使用が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの従来技術のプロトコールは、製造業者の製品文献、ならびに標準実験マニュアル（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ （Ｖｏｌｓ． Ｉ－ＩＶ）； ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓから）； Ｌｕｔｚ ａｎｄ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ， 編者， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ， ２００９）； Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， 第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００８）；および同様の参考文献）に見出され得る。

本発明は、一部は、他の切断可能なヌクレオチド（例えば、デオキシウリジン）と比較して、エンドヌクレアーゼＶ活性および開始剤の３’末端ヌクレオチドに対して最後から２番目のデオキシイノシンを使用して、ポリヌクレオチド生成物を開始剤から切断する効率の認識および理解に基づく。１つの局面において、最後から２番目のデオキシイノシンを有する開始剤上での末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）による合成開始は、他の切断可能なヌクレオチド構成上での開始より遙かに効率的であると考えられる。

図１は、最後から２番目のデオキシイノシンを有する開始剤を使用する、テンプレートなしの酵素による合成法のダイアグラムを提供する。この描写において、開始剤（１００）がそれらの５’末端によって固体支持体（１０５）に付着されていることが示される。各開始剤（１０２）は、遊離３’ヒドロキシルを有する３’－末端ヌクレオチド（１０６）の次に、３’－最後から２番目のデオキシイノシン（１０４）を有する。酵素による取り込みおよび脱ブロッキングの所定のサイクル数のあとに、ポリヌクレオチド生成物が生成され、これは、開始剤（１０２）によって固体支持体（１０５）に付着されている。上記ポリヌクレオチド生成物は、その付着した生成物を、デオキシイノシンの存在を認識しかつ開始剤の末端ヌクレオチド（１０６）の３’側（１１２）にある鎖を切断するエンドヌクレアーゼＶ活性で処理することによって、開始剤（１０２）および支持体（１０５）から切断される。いくつかの実施形態において、上記エンドヌクレアーゼＶ活性は、原核生物エンドヌクレアーゼＶを使用することによって提供される。さらに他の実施形態において、上記エンドヌクレアーゼＶは、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶである。本明細書で使用される場合、用語「エンドヌクレアーゼＶ活性（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、１本鎖ＤＮＡにおける以下の切断反応：５’ …ＮＮＩＮＮＮＮ …－３’ → ５’－… ＮＮＩＮ ＋ ５’－ＰＯ_４－ＮＮＮＮ … －３’（ここでＮは、任意のヌクレオチドであり、Ｉは、デオキシイノシンである）を触媒する酵素活性を意味する。エンドヌクレアーゼＶ活性によるポリヌクレオチド（１１６）の切断（１１４）は、上記ポリヌクレオチド上の５’－モノホスフェートを残し、これは、必要に応じて、それらを５’－ホスファターゼで処理することによって除去され得る。

エンドヌクレアーゼＶ活性を有する酵素は、商業的な酵素供給業者、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）、ＮｚｙＴｅｃｈ（Ｌｉｓｂｏｎ， Ｐｏｒｔｕｇａｌ）から入手可能である。このような酵素は、その供給業者の推奨される切断緩衝液（例えば、５０ｍＭ Ｋ－Ａｃ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ａｃ、１０ｍＭ Ｍｇ－Ａｃ、１ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ７．９））とともに使用され得る。代表的な切断条件は、以下のとおりである： 樹脂上で５００ｐｍｏｌ合成スケールに対して３７℃において、５０μｌのＮｚｙｔｅｃｈ緩衝液中の７０ＵのＥｎｄｏ Ｖ。代表的な切断時間は、５～６０分間、または１０～３０分間である。必要に応じて、上記の酵素のエンドヌクレアーゼ活性は、６５℃またはこれより高い温度において２０分間インキュベートすることによって熱不活性化され得る。必要に応じて、ＮｚｙｔｅｃｈエンドヌクレアーゼＶは、最終生成物の調製において反応混合物から酵素の簡便な除去を可能にするＨｉｓタグを含む。

テンプレートなしの酵素による合成
テンプレートなしの酵素によるポリヌクレオチド合成は、テンプレートなしのポリメラーゼ（例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ））（３’－Ｏ－ブロックされたデオキシヌクレオシド三リン酸（３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰ）により効率的に適応するように操作されたその改変体を含む）を使用する種々の公知のプロトコールによって行われ得る。例えば、Ｙｂｅｒｔら， 国際特許公開ＷＯ／２０１５／１５９０２３； Ｙｂｅｒｔら， 国際特許公開ＷＯ／２０１７／２１６４７２； Ｈｙｍａｎ， 米国特許第５４３６１４３号； Ｈｉａｔｔら， 米国特許第５７６３５９４号； Ｊｅｎｓｅｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５７： １８２１－１８３２ （２０１８）； Ｍａｔｈｅｗｓら， Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ＤＯＩ： ０．１０３９／ｃ６ｏｂ０１３７１ｆ （２０１６）； Ｓｃｈｍｉｔｚら， Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．， １（１１）： １７２９－１７３１ （１９９９）。

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドの指示された配列は、各合成工程において３’－Ｏ－可逆的にブロックされたｄＮＴＰの存在下で、ＴｄＴを使用して開始剤核酸にカップリングされる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを合成する上記方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する開始剤を提供する工程；（ｂ）伸長条件下で、上記開始剤または遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長中間体と、ＴｄＴとを、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシド三リン酸の存在下で反応させて、３’－Ｏ－ブロックされた伸長中間体を生成する工程；（ｃ）上記伸長中間体を脱ブロックして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長中間体を生成する工程；ならびに（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を、上記ポリヌクレオチドが合成されるまで反復する工程を包含する（ときおり、「伸長中間体（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）」は、「伸長フラグメント（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」ともいわれる）。いくつかの実施形態において、開始剤は、固体支持体に、例えば、その５’末端によって付着されるオリゴヌクレオチドとして提供される。上記の方法はまた、反応工程、または伸長工程の後、および脱ブロックする工程の後に、洗浄工程を含み得る。例えば、反応させる工程は、組み込まれていないヌクレオシド三リン酸を、例えば、所定のインキュベーション期間、または版の時間の後に、洗浄する工程によって除去する部分工程を含み得る。このような所定のインキュベーション期間または反応時間は、数秒（例えば、３０秒間）から数分間（例えば、３０分間）であり得る。

上記の方法はまた、反応工程、または伸長工程の後、および脱ブロックする工程の後に、洗浄工程と同様にキャップ形成する工程を含み得る。上述のように、いくつかの実施形態において、キャップ形成する工程が含まれてもよく、この工程において、伸長されていない遊離３’－ヒドロキシルは、キャップ形成された鎖の任意のさらなる伸長を防止する化合物と反応される。いくつかの実施形態において、このような化合物は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。他の実施形態において、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長されていない鎖は、それらを、３’－エキソヌクレアーゼ活性（例えば、Ｅｘｏ Ｉ）で処理することによって分解され得る。例えば、Ｈｙｍａｎ，米国特許第５４３６１４３号を参照のこと。同様に、いくつかの実施形態において、脱ブロックされていない鎖は、処理されて、鎖を除去するかまたはそれをさらなる伸長に対して不活性にするかのいずれかであり得る。

オリゴヌクレオチドの連続的合成を含むいくつかの実施形態において、キャップ形成する工程は、望ましくないこともある。なぜならキャップ形成する工程は、等モル量の複数のオリゴヌクレオチドの生成を防止し得るからである。キャップ形成をしない場合、配列は、欠失エラーの一様な分布を有するが、複数のオリゴヌクレオチドの各々は、等モル量で存在する。これは、伸長されていないフラグメントがキャップ形成される場合ではない。

いくつかの実施形態において、伸長工程（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｒ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ）の反応条件は、以下を含み得る： ２．０μＭ 精製ＴｄＴ；１２５～６００μＭ ３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰ（例えば、３’－Ｏ－ＮＨ_２－ブロックされたｄＮＴＰ）；約１０～約５００ｍＭ カコジル酸カリウム緩衝液（６．５～７．５の間のｐＨ）および約０．０１～約１０ｍＭの二価カチオン（例えば、ＣｏＣ１_２またはＭｎＣ１_２）。ここで上記伸長反応は、５０μＬ 反応容積において、室温～４５℃の範囲内の温度で、３分間行われ得る。３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰが３’－Ｏ－ＮＨ_２－ブロックされたｄＮＴＰである実施形態において、脱ブロックする工程の反応条件は、以下を含み得る： ７００ｍＭ ＮａＮＯ_２； １Ｍ 酢酸ナトリウム（酢酸で４．８～６．５の範囲のｐＨに調節される）。ここで上記脱ブロック反応は、５０μＬ容積において、室温～４５℃の範囲内の温度で、３０秒間から数分間行われ得る。

特定の適用に依存して、脱ブロックするおよび／または切断する工程は、種々の化学的条件または物理的条件（例えば、光、熱、ｐＨ、特定された化学的結合を切断し得る特定の試薬（例えば、酵素）の存在）を含み得る。３’－Ｏ－ブロッキング基および相当する脱ブロックする条件を選択するにあたってのガイダンスは、参考として援用される以下の文献に見出され得る： 米国特許第５８０８０４５号；同第８８０８９８８号；国際特許公開ＷＯ９１／０６６７８；および以下で引用される参考文献。いくつかの実施形態において、切断剤（ときおり、脱ブロッキング試薬または脱ブロッキング薬剤ともいわれる）は、化学的切断剤（例えば、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ））である。代替の実施形態において、切断剤は、酵素による切断剤（例えば、３’－ホスフェートブロッキング基を切断し得るホスファターゼのような）であり得る。脱ブロッキング剤の選択が、使用される３’－ヌクレオチドブロッキング基のタイプ、１個または多数のブロッキング基が使用されているか否か、開始剤が温和な処理を必要とする、生きている細胞もしくは生物に、または固体支持体などに付着されているのか否かに依存することは、当業者によって理解される。例えば、ホスフィン（例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））は、３’Ｏ－アジドメチル基を切断するために使用され得る、パラジウム錯体は、３’Ｏ－アリル基を切断するために使用され得る、または亜硝酸ナトリウムは、３’Ｏ－アミノ基を切断するために使用され得る。特定の実施形態において、上記切断反応は、ＴＣＥＰ、パラジウム錯体または亜硝酸ナトリウムを要する。

上記で注記されるように、いくつかの実施形態において、直交する脱ブロッキング条件を使用して除去され得る２またはこれより多くのブロッキング基を使用することが望ましい。ブロッキング基の以下の例示的な対は、並行合成実施形態（例えば、上記で記載されるもの）において使用され得る。他のブロッキング基の対、または２より多くを含む基が、本発明のこれらの実施形態における使用に利用可能であり得ることは、理解される。

生きている細胞上でのオリゴヌクレオチドの合成は、温和な脱ブロッキング条件、または脱保護条件、すなわち、細胞膜を破壊しない、タンパク質を変性させない、重要な細胞機能に干渉しないなどの条件を必要とする。いくつかの実施形態において、脱保護条件は、細胞生存と適合性の生理学的な条件の範囲内である。このような実施形態において、酵素による脱保護は、生理学的な条件下で行われ得ることから望ましい。いくつかの実施形態において、特異的な酵素によって除去可能なブロッキング基は、それらの除去のための特異的酵素と関連付けられる。例えば、エステルベースまたはアシルベースのブロッキング基は、エステラーゼ（例えば、アセチルエステラーゼなどの酵素）で除去され得、ホスフェートブロッキング基は、３’ホスファターゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）で除去され得る。例示すると、３’－Ｏ－ホスフェートは、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ６．５）、１０ｍＭ ＭｇＣ１_２、５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、および１Ｕ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの溶液での処理によって除去され得る。上記反応は、３７℃の温度において１分間進められる。

「３－ホスフェートがブロックされた（３’－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｌｏｃｋｅｄ）」または「３’－ホスフェート保護された（３’－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）」ヌクレオチドとは、３’－位におけるヒドロキシル基が、ホスフェート含有部分の存在によってブロックされているヌクレオチドをいう。本発明に従う３’－ホスフェート－ブロックされたヌクレオチドの例は、ヌクレオチジル－３’－ホスフェートものエステル／ヌクレオチジル－２’，３’－環式ホスフェート、ヌクレオチジル－２’－ホスフェートモノエステルおよびヌクレオチジル－２’または３’－アルキルホスフェートジエステル、ならびにヌクレオチジル－２’または３’－ピロホスフェートである。このような化合物のチオホスフェートまたは他のアナログはまた、置換が、ホスファターゼによって遊離３’－ＯＨを生じる脱リン酸化を防止しないことを条件として、使用され得る。

３’－Ｏ－エステル－保護ｄＮＴＰまたは３’－Ｏ－ホスフェート－保護ｄＮＴＰの合成および酵素による脱保護のさらなる例は、以下の参考文献に記載される： Ｃａｎａｒｄら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９２：１０８５９－１０８６３ （１９９５）； Ｃａｎａｒｄら， Ｇｅｎｅ， １４８： １－６ （１９９４）； Ｃａｍｅｒｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １６（２３）： ５１２０－５１２６ （１９７７）； Ｒａｓｏｌｏｎｊａｔｏｖｏら， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １８（４＆５）： １０２１－１０２２ （１９９９）； Ｆｅｒｒｅｒｏら， Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆｕｒ Ｃｈｅｍｉｅ， １３１： ５８５－６１６ （２０００）； Ｔａｕｎｔｏｎ－Ｒｉｇｂｙら， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ３８（５）： ９７７－９８５ （１９７３）； Ｕｅｍｕｒａら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３０（２９）： ３８１９－３８２０ （１９８９）； Ｂｅｃｋｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４２（５）： ９３６－９５０ （１９６７）； Ｔｓｉｅｎ， 国際特許公開ＷＯ１９９１／００６６７８。

本明細書で使用される場合、「開始剤（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）」（または等価な用語、例えば、「開始フラグメント（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」、「開始剤核酸（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、「開始剤オリゴヌクレオチド（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」など）は、テンプレートなしのポリメラーゼ（例えば、ＴｄＴ）によってさらに伸長され得る、遊離３’末端を有する短いオリゴヌクレオチド配列をいう。１つの実施形態において、上記開始フラグメントは、ＤＮＡ開始フラグメントである。代替の実施形態において、上記開始フラグメントは、ＲＮＡ開始フラグメントである。１つの実施形態において、上記開始フラグメントは、３～１００個の間のヌクレオチド、特に、３～２０個の間のヌクレオチドを有する。１つの実施形態において、上記開始フラグメントは、１本鎖である。代替の実施形態において、上記開始フラグメントは、２本鎖で有る。特定の実施形態において、５’－一級アミンで合成された開始剤オリゴヌクレオチドは、製造業者のプロトコールを使用して、磁性ビーズに共有結合的に連結され得る。同様に、３’－一級アミンで合成された開始剤オリゴヌクレオチドは、製造業者のプロトコールを使用して、磁性ビーズに共有結合的に連結され得る。本発明の実施形態に伴う使用を受け入れる余地がある種々の他の付着化学現象は、当該分野で周知である（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｂｒｏｃｈｕｒｅ， “Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｔｔａｃｈｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，” ｖ．６ （２０１４）； Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， 第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００８）；および同様の参考文献）。

本発明において使用される３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰのうちの多くは、商業的販売者から購入され得るか、または公開された技術（例えば、米国特許第７０５７０２６号；国際特許公開ＷＯ２００４／００５６６７、ＷＯ９１／０６６７８； Ｃａｎａｒｄら， Ｇｅｎｅ（上記で引用）； Ｍｅｔｚｋｅｒら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２２： ４２５９－４２６７ （１９９４）； Ｍｅｎｇら， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １４： ３２４８－３２５２ （３００６）；米国特許公開２００５／０３７９９１）を使用して合成され得る。いくつかの実施形態において、上記改変されたヌクレオチドは、プリンまたはピリミジン塩基およびこれに共有結合的に付着された、除去可能な３’－ＯＨブロッキング基を有するリボースまたはデオキシリボース糖部分を含む改変されたヌクレオチドまたはヌクレオシド分子を含み、その結果、３’炭素原子は、以下の構造の付着された基を有する：
－Ｏ－Ｚ
ここで－Ｚは、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｏ－Ｒ”、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｎ（Ｒ”）_２、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｎ（Ｈ）Ｒ”、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｓ－Ｒ”および－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｆであり、ここで各Ｒ”は、除去可能な保護基であるかまたはその一部であり；各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換されたアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環式、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、あるいは連結基を通じて付着された検出可能な標識であり；ただし、いくつかの実施形態において、このような置換基は、１０個までの炭素原子および／または５個までの酸素もしくは窒素ヘテロ原子を有するか；または（Ｒ’）_２は、式 ＝Ｃ（Ｒ”’）_２の基を表し、ここで各Ｒ”’は、同じであってもことなっていてもよく、水素原子およびハロゲン原子を含む基並びにアルキル基から選択され、ただしいくつかの実施形態において、各Ｒ’”のアルキルは、１～３個の炭素原子を有し；ここで上記分子は、各Ｒ”がＨの代わりに交換される中間体を生じるように反応され得るか、またはＺが－（Ｒ’）_２－Ｆである場合、Ｆは、ＯＨ、ＳＨもしくはＮＨ_２（好ましくはＯＨ）の代わりに交換され、その中間体は、遊離３’－ＯＨを有する分子を得るために水性条件下で解離し；ただしＺが－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｓ－Ｒ”である場合、両方のＲ’基は、Ｈではない。ある特定の実施形態において、改変されたヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’は、アルキルまたは置換されたアルキルであるが、ただしこのようなアルキルまたは置換されたアルキルは、１～１０個の炭素原子および０～４個の酸素もしくは窒素ヘテロ原子を有する。ある特定の実施形態において、改変されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの－Ｚは、式 －Ｃ（Ｒ’）_２－Ｎ３のものである。ある特定の実施形態において、Ｚは、アジドメチル基である。

いくつかの実施形態において、Ｚは、２００またはこれより小さい分子量を有する、ヘテロ原子ありまたはなしの切断可能な有機部分である。他の実施形態において、Ｚは、１００またはこれより小さい分子量を有する、ヘテロ原子ありまたはなしの切断可能な有機部分である。他の実施形態において、Ｚは、５０またはこれより小さい分子量を有する、ヘテロ原子ありまたはなしの切断可能な有機部分である。いくつかの実施形態において、Ｚは、２００またはこれより小さい分子量を有する、ヘテロ原子ありまたはなしの酵素により切断可能な有機部分である。他の実施形態において、Ｚは、１００またはこれより小さい分子量を有する、ヘテロ原子ありまたはなしの酵素により切断可能な有機部分である。他の実施形態において、Ｚは、５０またはこれより小さい分子量を有する、ヘテロ原子ありまたはなしの酵素により切断可能な有機部分である。他の実施形態において、Ｚは、２００またはこれより小さい分子量を有する、酵素により切断可能なエステル基である。他の実施形態において、Ｚは、３’－ホスファターゼによって切断可能なホスフェート基である。いくつかの実施形態において、以下の３’－ホスファターゼのうちの１または複数は、製造業者の推奨されるプロトコールとともに使用され得る： Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、組換えエビアルカリホスファターゼ（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡから入手可能）。

さらなる特定の実施形態において、上記３’－ブロックされたヌクレオチド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ＮＨ_２または３’－Ｏ－アリル基のいずれかによってブロックされる。

さらに他の実施形態において、本発明の３’－Ｏ－ブロッキング基としては、３’－Ｏ－メチル、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アミン、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブトキシエトキシ、３’－Ｏ－（２－シアノエチル）、および３’－Ｏ－プロパルギルが挙げられる。

いくつかの実施形態において、３’－Ｏ－保護基は、電気化学的に不安定な基である。すなわち、脱保護または保護基の切断は、切断を生じる保護基の近くで電気化学的条件を変化させることによって達成される。電気化学的条件におけるこのような変化は、物理的な量（例えば、補助的な種（これは、次に、保護基の部位において電気化学的条件における変化（例えば、ｐＨの増大または低下）を引き起こす）を活性化させる、電位差または光）を変化させるかまたは適用することによってもたらされ得る。いくつかの実施形態において、電気化学的に不安定な基は、例えば、ｐＨを所定の値へと変化させれば常に切断されるｐＨ感受性の保護基を含む。他の実施形態において、電気化学的に不安定な基は、還元条件または参加条件を変化させれば常に、例えば、保護基の部位において電位差を増大または減少させることによって、直接的に切断される保護基を含む。

いくつかの実施形態において、酵素による合成法は、３’－Ｏ－改変されたヌクレオシド三リン酸に関して増大した取り込み活性を示すＴｄＴ改変体を使用する。例えば、このようなＴｄＴ改変体は、Ｃｈａｍｐｉｏｎら， 米国特許第１０４３５６７６号（これは、本明細書に参考として援用される）に記載される技術を使用して生成され得る。いくつかの実施形態において、ＴｄＴ改変体が使用され、それは、配列番号２と少なくとも６０％同一の、ならびに位置２０７にある第１のアルギニンにおける置換および位置３２５にある第２のアルギニンにおける置換、またはその機能的に等価な残基を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）改変体が使用され、これは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％同一の、配列番号２、３、４、６、７、９、１２および１３に関して位置２０７にある、配列番号５に関して位置２０６にある、配列番号８および１０に関して位置２０８にある、配列番号１１に関して位置２０５にある、配列番号１４に関して位置２１６にある、ならびに配列番号１５に関して位置２１０にあるアルギニン（第１のアルギニン）の置換；ならびに配列番号２、９および１３に関して位置３２５にある、配列番号３および４に関して位置３２４にある、配列番号３２０に関して位置３２０にある、配列番号６および８に関して位置３３１にある、配列番号１１に関して位置３２３にある、配列番号１２および１５に関して位置３２８にある、ならびに配列番号１４に関して位置３３８にあるアルギニン（「第２のアルギニン」）の置換；またはその機能的に等価な残基を有するアミノ酸配列を有する；ここで上記ＴｄＴ改変体は、（ｉ）テンプレートなしで核酸フラグメントを合成し得る、および（ｉｉ）核酸フラグメントの遊離３’－ヒドロキシル上に３’－Ｏ－改変されたヌクレオチドを取り込み得る。いくつかの実施形態において、上記の％同一性の値は、示された配列番号と少なくとも８０％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性の値は、示された配列番号と少なくとも９０％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性の値は、示された配列番号と少なくとも９５％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性の値は、少なくとも９７％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性の値は、少なくとも少なくとも９８％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性の値は、少なくとも少なくとも９９％同一性である。本明細書で使用される場合、参照配列と改変体配列とを比較するために使用される上記の％同一性の値は、上記改変体配列の置換を含む明示的に特定されたアミノ酸位置を含まない；すなわち、％同一性の関係性は、参照タンパク質の配列と、改変体において置換を含む明示的に特定された位置以外の改変体タンパク質の配列との間にある。従って、例えば、参照配列および改変体配列が各々、１００アミノ酸から構成され、上記改変体配列が位置２５および８１において変異を有するとすれば、その％相同性は、１～２４、２６～８０および８２～１００の配列に関するものである。

（ｉｉ）に関して、このような３’－Ｏ－改変されたヌクレオチドは、３’－Ｏ－ＮＨ２－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシド三リン酸、３’Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ヌクレオシド三リン酸、または３’－Ｏ－プロパルギル－ヌクレオシド三リン酸を含み得る。

いくつかの実施形態において、本発明において使用されるＴｄＴ改変体は、表１または他のＴｄＴにおける機能的に等価な残基位置に示される置換を有する。

上記で記載されるとおりの本発明のＴｄＴ改変体は各々、示された置換の存在を条件として、特定された配列番号との％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、このようにして記載される本発明のＴｄＴ改変体と特定される配列番号との間の配列差の数およびタイプは、置換、欠失および／または挿入に起因し得、その置換、欠失および／または挿入されたアミノ酸は、任意のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、このような欠失、置換および／または挿入は、天然に存在するアミノ酸のみを含む。いくつかの実施形態において、置換は、Ｇｒａｎｔｈａｍ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １８５： ８６２－８６４ （１９７４）に記載されるように、保存的、または同義のアミノ酸変化のみを含む。すなわち、アミノ酸の置換は、その同義のアミノ酸のセットのメンバーの中でのみ起こり得る。いくつかの実施形態において、使用され得る同義のアミノ酸のセットは、表２Ａに示される。

いくつかの実施形態において、使用され得る同義のアミノ酸のセットは、表２Ｂに示される。

キット
本発明は、本発明の方法を行うためのキットを含む。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、５’末端によって支持体に付着され、３’末端に対して最後から２番目のデオキシイノシンおよび遊離３’－ヒドロキシルを有する開始剤を含む。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、上記開始剤の末端ヌクレオチドの３’側で開始剤－ポリヌクレオチド結合体を切断し得るエンドヌクレアーゼＶをさらに含む。いくつかのこのようなキットにおいて、上記エンドヌクレアーゼＶは、反応混合物からの除去を可能にする捕捉部分を有する。いくつかのキットにおいて、このような捕捉部分は、Ｈｉｓタグである。いくつかの実施形態において、キットの開始剤は、５’－ｄＩ－ｄＴ－３’の３’末端配列を有する。いくつかの実施形態において、キットの開始剤は、５’－ｄＩ－ｄＧ－３’の３’末端配列を有する。いくつかの実施形態において、キットの開始剤は、５’－ｄＩ－ｄＡ－３’の３’末端配列を有する。いくつかの実施形態において、キットの開始剤は、５’－ｄＩ－ｄＴ－３’、５’－ｄＩ－ｄＧ－３’、または５’－ｄＩ－ｄＡ－３’の３’末端配列を有する。いくつかの実施形態において、このような支持体は、固体支持体である。このような固体支持体は、ビーズ（例えば、磁性ビーズ）、平らな固体（例えば、ガラススライド）、または膜などを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、テンプレートなしのポリメラーゼ、ならびにデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジンおよびデオキシシチジンのうちの１または複数の３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシド三リン酸をさらに含み得る。いくつかのキットにおいて、このようなテンプレートなしのポリメラーゼは、ＴｄＴであり得る。いくつかの実施形態において、このようなＴｄＴは、本明細書で記載されるＴｄＴ改変体であり得る。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、３’ブロッキング基を、組み込まれた、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドから除去し得る脱ブロッキング剤をさらに含み得る。

この実施例において、デオキシイノシン／Ｅｎｄｏ Ｖ切断を使用するということの効率は、デオキシウリジン／ＵＳＥＲ切断と比較され、ｄＩに隣接するヌクレオチドの切断に対する効果が評価される。ｄＩを含む５’－アミノ－ポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドを、従来の反応において、ＥＤＣを使用して磁性ビーズのカルボキシル基にカップリングした。全ての実験において、開始剤は、（１）５’－１０マーポリＴセグメント、続いて、デオキシイノシンおよび３’末端ｄＴ、または（２）５’－１０マーポリＴセグメント、続いて、末端デオキシウリジン、のいずれかを含んだ。いくつかの実験では、開始剤を、２０マーポリＴセグメント、続いて、Ｃｙ５色素で標識した最後のｄＡによって伸長し、全て、ＴｄＴ酵素および３’－Ｏ－ＮＨ_２－ブロックされたヌクレオシド三リン酸を使用した（標識された末端ｄＡを除く）。他の実験では、上記開始剤を、示されたジヌクレオチド配列、続いて、１８マーポリ（ｄＴ）およびＣｙ５色素で標識した最後のｄＡによって伸長し、全て、ＴｄＴ酵素および３’－Ｏ－ＮＨ_２－ブロックされたヌクレオシド三リン酸を使用した（標識された末端ｄＡを除く）。示されるとおりの（ＵＳＥＲまたはＥｎｄｏ Ｖ）切断後に、その切断した標識ポリヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。

図２は、末端デオキシウリジンを有する開始剤の合成生成物と、最後から２番目のデオキシイノシンを有する開始剤の合成生成物とを比較する電気泳動データを示す。デオキシウリジン開始剤に相当するゲルの左側にある４個のラダーのバンドは、最も右側の１０個のラダーにおいて、デオキシイノシン開始剤の相当するバンドより有意に強い失敗配列を示す。これは、最後から２番目のデオキシイノシンを有する開始剤が、末端デオキシウリジンを有する開始剤より効率的な合成を生じることを示す。

定義
本明細書中で特段具体的に定義されなければ、本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、当該分野の標準的な決まりごとおよび教科書のもの（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， 第２版（Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２）； Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第２版（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７５）； Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ， Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， 第２版（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９））に従う。

２またはこれより多くの異なるＴｄＴにおけるアミノ酸位置を参照して「機能的に等価な（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」とは、（ｉ）それぞれの位置におけるアミノ酸が、ＴｄＴの活性において同じ機能的役割を果たす、および（ｉｉ）アミノ酸が、それぞれのＴｄＴのアミノ酸配列における相同なアミノ酸位置に存在することを意味する。２またはこれより多くの異なるＴｄＴのアミノ酸配列における位置的に等価なまたは相同なアミノ酸残基を、配列アラインメントおよび／または分子モデリングに基づいて同定することは可能である。いくつかの実施形態において、機能的に等価なアミノ酸位置は、進化的に関連する種、例えば、属、科などのＴｄＴのアミノ酸配列の中で保存されている配列モチーフに属する。このような保存された配列モチーフの例は、Ｍｏｔｅａら， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １８０４（５）： １１５１－１１６６ （２０１０）； Ｄｅｌａｒｕｅら， ＥＭＢＯ Ｊ．， ２１： ４２７－４３９ （２００２）；および同様の参考文献に記載される。

「キット」とは、本発明の方法を行うための材料または試薬を送達ための任意の送達システムに言及する。反応アッセイの文脈において、このような送達システムは、１つの場所から別の場所まで、反応試薬（例えば、適切な容器中の、互いにクエンチする蛍光標識のような蛍光標識、蛍光標識連結薬剤、酵素、クエンチする薬剤など）および／もしくは支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを行うための書面による説明書など）の貯蔵、輸送、または送達を可能にする、システムおよび／または化合物（例えば、希釈剤、界面活性剤、キャリアなど）を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含む１または複数の封入容器（例えば、箱）を含む。このような内容物は、意図された受取人に、一緒にまたは別個に送達され得る。例えば、第１の容器は、アッセイにおいて使用するための酵素を含み得る一方で、第２のまたはこれより多くの容器は、互いにクエンチする蛍光標識および／またはクエンチする薬剤を含む。

「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」または「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、交換可能に使用され、本明細書で記載される天然または参照ＴｄＴポリペプチドに由来し、１または複数の位置において改変または変更（すなわち、置換、挿入、および／または欠失）を含むポリペプチドに言及する。改変体は、当該分野で周知の種々の技術によって得られ得る。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を変更するための技術の例としては、部位指向性変異誘発、ランダム変異誘発、配列シャフリングおよび合成オリゴヌクレオチド構築が挙げられるが、これらに限定されない。変異誘発活性は、タンパク質の、または本発明の場合では、ポリメラーゼの配列において１または数個のアミノ酸を欠失、挿入または置換することにある。

「ポリヌクレオチド(ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ)」または「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、交換可能に使用され、各々、ヌクレオチドモノマーまたはそのアナログの直線状のポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、モノマー－対－モノマー相互作用の正常のパターン（例えば、ワトソン－クリックタイプの塩基対合、塩基スタッキング、フーグスティーンまたは逆フーグスティーンタイプの塩基対合など）によって天然のポリヌクレオチドに特異的に結合し得る。このようなモノマーおよびそれらのヌクレオシド間連結は、天然に存在していてもよいし、そのアナログであってもよい（例えば、天然に存在するアナログまたは天然に存在しないアナログ）。天然に存在しないアナログは、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、標識（例えば、発蛍光団、またはハプテンなど）の結合を可能にする連結基を含む塩基を含み得る。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が酵素によるプロセシング（例えば、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーションなど）を必要とする場合は常に、当業者は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、それらの場合に、任意のまたはいくつかの位置において、ヌクレオシド間連結、糖部分、または塩基のある特定のアナログを含まないことを理解する。ポリヌクレオチドは、代表的に、それらが通常は「オリゴヌクレオチド」といわれる場合の数個のモノマー単位（例えば、５～４０）から、数千ものモノマー単位までのサイズの範囲に及ぶ。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが文字配列（大文字または小文字）によって表される（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）場合は常に、別段示されなければ、または文脈から明らかでなければ、そのヌクレオチドは、左から右に５’→３’の順序にあること、および「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｉ」はデオキシイノシンを示し、「Ｕ」はウリジンを示すことを理解する。別段注記されなければ、用語法および原子番号付けの慣習は、Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ， Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９）に開示されるものに従う。通常は、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４種の天然のヌクレオシド（例えば、ＤＮＡについてはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはＲＮＡについてはそれらのリボース対応物）を含む；しかし、それらはまた、非天然のヌクレオチドアナログ（例えば、改変された塩基、糖、またはヌクレオシド間連結を含む）を含み得る。酵素が活性のために特異的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件を有する（例えば、１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖など）を有する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質の適切な組成の選択が、特に、決まりごとからのガイダンス（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）、および同様の参考文献）とともに、当業者の知識の十分に範囲内であることは、当業者に明らかである。同様に、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、１本鎖形態または２本鎖形態（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの二重鎖およびそのそれぞれの相補体）のいずれかに言及し得る。どの形態が、または両方の形態がその用語使用の文脈から意図されるのかは、当業者に明らかである。

「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」とは、ポリヌクレオチドテンプレートとともに二重鎖を形成する際に、核酸合成の開始点として作用し、その３’末端からテンプレートに沿って伸長され、その結果、伸長した二重鎖を形成することができる、天然または合成いずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は通常、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ）とともに行われる。伸長プロセスにおいて付加されるヌクレオチドの配列は、そのテンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、１４～４０ヌクレオチドの範囲の、または１８～３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、種々の核酸増幅反応（例えば、単一のプライマーを使用する線形増幅反応、または２もしくはこれより多くのプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応）において使用される。特定の適用のためのプライマーの長さおよび配列を選択するためのガイダンスは、参考として援用される以下の参考文献によって証明されるように、当業者に周知である： Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ， 編， ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００３）。

「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、２つの配列（例えば、２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列）間のマッチ（例えば、同一のアミノ酸残基）の数（または割合。通常はパーセンテージとして表される）に言及する。配列同一性は、配列ギャップを最小限にしながら、重なり合いおよび同一性を最大化するように整列される場合に、配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、その２つの配列の長さに依存して、多くの数学的な全体のまたは局所のアラインメントアルゴリズムのうちのいずれかを使用して決定され得る。類似の長さの配列は、好ましくは、全体のアラインメントアルゴリズム（例えば、全体の長さにわたって配列を最適に整列させるＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０）を使用して整列される一方で、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、局所のアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， １９８１）またはＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７； Ａｌｔｓｃｈｕｌら， ２００５））を使用して整列される。％アミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当該分野の技術範囲内である種々の方法において、例えば、インターネットウェブサイト（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ または ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／）上で入手可能な、公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成され得る。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大限のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。本明細書中の目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して２つの配列の最適な全体のアラインメントを作製するペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成される値に言及し、ここで全ての検索パラメーターは、デフォルト値に設定される（すなわち、スコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、末端ギャップペナルティー＝仮（ｆａｌｓｅ）、末端ギャップオープン＝１０および末端ギャップ伸長＝０．５）。

「置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）とは、１つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置き換えられることを意味する。好ましくは、用語「置換」とは、１つのアミノ酸残基を、天然に存在する標準の２０アミノ酸残基、希な天然に存在するアミノ酸残基（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６－Ｎ－メチルリジン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）、および天然に存在しないアミノ酸残基から選択され、しばしば、合成して作製される（例えば、シクロヘキシル－アラニン）別の残基によって置き換えることに言及する。好ましくは、用語「置換」は、１つのアミノ酸残基を、天然に存在する標準の２０アミノ酸残基から選択される別のアミノ酸残基によって置き換えることに言及する。記号「＋」は、置換の組み合わせを示す。アミノ酸は、本明細書において、以下の命名法に従うそれらの１文字コードまたは３文字コードによって表される： Ａ：アラニン（Ａｌａ）； Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）； Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）； Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）； Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）； Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）； Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）； Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）； Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）； Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）； Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）； Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）； Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）； Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）； Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）； Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）； Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）； Ｖ：バリン（Ｖａｌ）； Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）およびＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。本文書において、以下の用語法が置換を指定するために使用される： Ｌ２３８Ａは、親配列の位置２３８のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）が、アラニン（Ａ）に変更されていることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の位置１３２のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が、以下のアミノ酸のうちの１つによって置換されていることを示す： バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、またはメチオニン（Ｍ）。上記置換は、保存的または非保存的な置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギンおよびスレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システインおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および小さいアミノ酸（グリシン、アラニンおよびセリン）のグループ内のものである。

本開示は、示される特定の形態の範囲に限定されることは意図されないが、本明細書で記載されるバリエーションの選択肢、改変、および均等物を網羅することが意図される。さらに、開示の範囲は、本開示に鑑みて、当業者に自明になり得る他のバリエーションを完全に含む。本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ限定される。

Claims (16)

1. 所定の配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、前記方法は、
   ａ）３’－最後から２番目のデオキシイノシンおよび遊離３’－ヒドロキシルを有する３’－末端ヌクレオチドを有する開始剤を提供する工程；
   ｂ）（ｉ）伸長条件下で、前記開始剤または遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する伸長したフラグメントと、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシド三リン酸およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼとを接触させ、その結果、前記開始剤または伸長したフラグメントは、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシド三リン酸の取り込みによって伸長されて、３’－Ｏ－ブロックされ伸長したフラグメントを形成する工程、ならびに（ｉｉ）前記伸長したフラグメントを脱ブロックして、前記ポリヌクレオチドが形成されるまで、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長したフラグメントを形成する工程、のサイクルを反復する工程；
   ｃ）前記ポリヌクレオチドをエンドヌクレアーゼＶ活性で処理して、前記ポリヌクレオチドを前記開始剤から切断する工程、
   を包含する方法。
2. 前記エンドヌクレアーゼＶ活性は、原核生物エンドヌクレアーゼＶによって提供される、請求項１に記載の方法。
3. 前記原核生物エンドヌクレアーゼＶは、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶである、請求項２に記載の方法。
4. 前記原核生物エンドヌクレアーゼＶを前記切断されたポリヌクレオチドから除去する工程をさらに包含する、請求項２または３に記載の方法。
5. 前記テンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記開始剤は、５’末端によって支持体に付着される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記支持体は、固体支持体である、請求項６に記載の方法。
8. 前記開始剤は、５’－ｄＩ－ｄＴ－３’の３’－末端配列を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記開始剤から切断された前記ポリヌクレオチドは、５’－モノホスフェートを有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. ５’末端によって支持体に付着され、かつ３’－最後から２番目のデオキシイノシンおよび遊離３’－ヒドロキシルを有する３’－末端ヌクレオチドを有する開始剤を含むポリヌクレオチドを酵素により合成するためのキット。
11. 開始剤－ポリヌクレオチド結合体を、前記開始剤の末端ヌクレオチドの３’側で切断し得るエンドヌクレアーゼＶをさらに含む、請求項１０に記載のキット。
12. ５’－ｄＩ－ｄＴ－３’の３’－末端配列を有する前記開始剤をさらに含む、請求項１０または１１に記載のキット。
13. 前記支持体は、固体支持体である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のキット。
14. テンプレートなしのポリメラーゼ、ならびにデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジンおよびデオキシシチジンのうちの１または複数に関する３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシド三リン酸をさらに含む、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のキット。
15. 脱ブロッキング剤をさらに含む、請求項１０～１４のいずれか１項に記載のキット。
16. 前記３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－ＮＨ_２－ヌクレオシド三リン酸である、請求項１４に記載のキット。

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