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TW202405175A - 用於靶向pcsk9的組合物及方法 - Google Patents

用於靶向pcsk9的組合物及方法 Download PDF

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TW202405175A
TW202405175A TW112121065A TW112121065A TW202405175A TW 202405175 A TW202405175 A TW 202405175A TW 112121065 A TW112121065 A TW 112121065A TW 112121065 A TW112121065 A TW 112121065A TW 202405175 A TW202405175 A TW 202405175A
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cells
seq
grna
protein
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TW112121065A
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傑森 費爾南德斯
尚恩 希金斯
莎拉 丹妮
羅斯 懷特
埃梅里克 珍 馬里烏斯 查爾斯
艾迪生 賴特
本傑明 德瑪利
曼紐爾 莫爾
周文淵
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美商斯奎柏治療公司
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Abstract

本文提供包含融合蛋白及引導核酸(gRNA)之基因抑制子系統，該融合蛋白為諸如包含DNA結合域之融合蛋白，該DNA結合域為諸如TALE、鋅指或催化失活CRISPR蛋白，該基因抑制子系統適用於抑制前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型( proprotein convertase subtilisin/kexin Type 9 ， PCSK9)基因。亦提供使用此類系統抑制 PCSK9轉錄之方法。

Description

用於靶向PCSK9的組合物及方法
在哺乳動物中，膽固醇經由乳化在脂蛋白內輸送。脂蛋白顆粒係基於其密度分類：低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)及乳糜微粒。表面LDL受體在膽固醇吸收期間內化。具有充足膽固醇之細胞將阻斷其LDL受體合成，以防止LDL顆粒中之新穎膽固醇吸收。相反地，當細胞缺乏膽固醇時，促成LDL受體合成。當過程不受調控時，過量LDL顆粒將在血液中傳播而不經LDL受體攝取。血液中之LDL顆粒經氧化且由巨噬細胞吸收，巨噬細胞隨後充血且形成泡沫細胞。此等泡沫細胞可截留在血管壁中且造成動脈粥樣硬化斑塊形成，此係心臟病發作、中風及其他嚴重醫學問題之主要原因之一。
肝蛋白前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin Type 9，PCSK9)係一種分泌型、球狀、自活化絲胺酸蛋白酶，其在LDL顆粒之內吞作用期間結合於低密度脂蛋白受體(LDL-R)，阻止LDL-R再循環至細胞表面且導致LDL-膽固醇清除降低。PCSK9結合至LDL-R (經由EGF-A域)，阻止受體-配位體複合物之構形變化，取而代之將LDL-R重新引導至溶酶體。因為低密度脂蛋白顆粒(LDL)之受體通常在細胞外流體內每顆粒傳輸數千個脂肪分子(包括膽固醇)，所以阻斷或抑制PCSK9之功能以增強LDL-R介導的LDL膽固醇之清除可降低LDL顆粒濃度。PCSK9主要在肝臟、腸、腎臟及中樞神經系統中表現，但亦在動脈壁中，諸如內皮、平滑肌細胞及巨噬細胞中高度表現，具有可調節血管穩態及動脈粥樣硬化之局部效應。
PCSK9為前蛋白轉化酶(PC)家族之成員，且其基因在約2%至3%的具有家族性高膽固醇血症(FH)之個體中發生突變(Sepideh Mikaeeli, S.等人, Functional analysis of natural PCSK9 mutants in modern and archaic humans. FEBS J. 2019年8月6日. doi: 10.1111/febs.15036)。研究人員已鑑別出引起遺傳性高膽固醇(高膽固醇血症)的若干PCSK9突變。此等突變改變PCSK9蛋白中之單一胺基酸。研究者將造成高膽固醇血症之突變描述為「功能獲得型(gain-of-function)」，因為其似乎增強PCSK9蛋白之活性或給予蛋白質一種新穎的非典型功能(Blesa, S.等人, A New PCSK9 Gene Promoter Variant Affects Gene Expression and Causes Autosomal Dominant Hypercholesterolemia. J. Clin. Endocrinol. & Metab. 93:3577(2008))。過度活化的PCSK9蛋白實質上減少肝細胞表面上低密度脂蛋白受體的數目。由於自血液中清除低密度脂蛋白的受體減少，PCSK9基因中具有功能獲得型突變的人之血液中具有極高的膽固醇水平。常染色體顯性高膽固醇血症(ADH)係一種以增加的低密度脂蛋白(LDL)-膽固醇水平為特徵之遺傳病症，導致過早罹患心血管疾病之高風險。在不同群體中，已鑑別出PCSK9中約10種突變為疾病之病因。PCSK9中導致高膽固醇血症之所有已知突變均導致此蛋白酶之酶活性增加(Bleasa, S., 2008)。此外，PCSK9中之突變可能導致常染色體顯性家族性低-β-脂蛋白血症，其可能導致肝脂肪變性、肝硬化及其他病症。
CRISPR/Cas系統之出現及此等極小系統之可程式化性質有助於其用作用於基因體操縱及工程改造之通用技術。然而，歸因於需要修飾大量細胞以調節膽固醇水平，當前在活體內產生PCSK9保護變異體及功能喪失型突變體之方法已經無效。其他問題涉及可能由基因體編輯引起之脫靶效應、基因體不穩定性或致癌修飾，以及缺乏用於基因抑制系統之安全遞送模式。另外，在某些疾病適應症中，基因沉默或抑制優於基因編輯。使CRISPR核酸酶(諸如Cas9及CasX無催化活性)之能力已得到證實(WO2020247882A1及US20200087641A1，以引用的方式併入本文中)，其使得此等系統成為產生具有能夠沉默基因的抑制子域的融合蛋白的有吸引力的平台。儘管已描述某些抑制子系統，但仍需要額外的基因抑制子系統，該等基因抑制子系統已最佳化及/或提供優於早期產生之基因抑制子系統的改良，例如基於Cas9的用於各種治療、診斷及研究應用中之彼等改良。因此，仍需要經改良的用於調節PCSK9之組合物及方法。
本發明提供包含或編碼抑制子融合蛋白之系統，該等抑制子融合蛋白包含用於抑制及/或表觀遺傳修飾前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)基因目標核酸序列的DNA結合及連接之抑制子域。在一些情況下，抑制子融合蛋白包含與 PCSK9基因目標核酸序列互補之DNA結合蛋白(其包含鋅指(ZF)或轉錄活化子樣效應子(TALE)蛋白)及一或多個連接之抑制子域。在一些情況下，抑制子融合蛋白包含有包含催化失活CRISPR蛋白的DNA結合蛋白及一或多個連接之抑制子域，且引導核酸包含與 PCSK9基因目標核酸序列互補之靶向序列。蛋白質及引導核酸可經修飾以被動進入目標細胞且適用於多種用於抑制PCSK9之方法，亦提供該等方法。本發明亦提供編碼或囊封抑制子融合蛋白及引導核酸組分之載體及脂質奈米顆粒(LNP)，以將系統遞送至細胞用於轉錄抑制PCSK9目標核酸序列。
本發明提供包含本文所描述之系統、核酸、LNP及載體之醫藥組合物。
本發明亦提供用於治療患有PCSK9相關疾病之個體的方法。在一些實施例中，組合物及方法在患有代謝病症之個體中具有效用，該代謝病症諸如(但不限於)家族性高膽固醇血症、家族性低-β-脂蛋白血症或膽固醇水平升高。
在另一態樣中，本文提供包含PCRK9抑制子系統之系統，或包含或編碼PCSK9抑制子系統之載體，其用於製造供治療有需要之個體之PCSK9相關疾病用之藥物。
本發明提供用於治療患有PCSK9相關疾病之個體之方法中的組合物。在一些實施例中，組合物包含抑制子融合蛋白，該抑制子融合蛋白包含催化失活CRISPR蛋白及一或多個連接之抑制子域，及引導核酸，該引導核酸包含與PCSK9基因目標核酸序列互補之靶向序列，以用於轉錄抑制個體中之 PCSK9基因目標核酸序列。在一些實施例中，組合物包含本文所描述之系統、核酸、LNP、載體及/或醫藥組合物。
在一些實施例中， PCSK9基因包含一或多個突變，例如選自由以下組成之群的胺基酸取代：相對於SEQ ID NO: 1823之序列的S127R、D129G、F216L、D374H及D374Y。
本發明提供抑制PCSK9基因在細胞群中之轉錄的方法，該方法包含將本文所描述之系統、核酸、LNP、載體及/或醫藥組合物引入至群體之細胞中。
在一些實施例中，用於PCSK9抑制子系統之催化失活CRISPR蛋白及引導核酸包含如本文所描述之催化失活CasX變異體蛋白及/或CasX變異體引導核酸。
本發明之某些實施例之其他特徵及優勢將在實施例及其圖式之以下描述中以及根據申請專利範圍而變得更加顯而易見。
相關申請案之交互參考
本申請案主張2022年6月7日申請之美國臨時申請案第63/349,981號、2023年3月29日申請之美國臨時申請案第63/492,923號及2023年6月2日申請之美國臨時申請案第63/505,823號之優先及權益，該等臨時申請案中之各者之內容全部以全文引用之方式併入本文中。 電子序列表之引用
電子序列表(SCRB_055_01WO_SeqList_ST26.xml；大小：4,317,702位元組；及創建日期：2023年6月2日)之內容以全文引用之方式併入本文中。 具體實施方式
雖然本文中已經顯示及描述例示性實施例，熟習此項技術者將顯而易知此等實施例僅藉助於實例提供。熟習此項技術者可在不背離本文中所主張之發明之情況下想到許多變化形式、改變及取代。應理解，本文所描述之實施例之各種替代例可用於實踐本發明之實施例。申請專利範圍意欲限定本發明之範疇，且由此涵蓋此申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬之技術者通常所理解相同之意義。儘管類似或等效於本文所描述之彼等方法及材料的方法及材料可用於實踐或測試本發明實施例，但在下文描述適合之方法及材料。在有衝突之情況下，將以專利說明書(包括定義)為準。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。熟習此項技術者可在不背離本發明之情況下想到許多變化形式、改變及取代。 定義
「可雜交」或「互補」可互換使用，意謂核酸(例如RNA、DNA)包含使其能夠在溫度及溶液離子強度之適當活體外及/或活體內條件下以序列特異性、反向平行方式(亦即，核酸特異性結合於互補核酸)與另一核酸非共價結合(亦即形成沃森-克里克(Watson-Crick)鹼基對及/或G/U鹼基對)、「黏接」或「雜交」的核苷酸序列。應理解，聚核苷酸之序列不必與待特異性雜交之目標核酸100%互補；其可具有至少約70%、至少約80%、或至少約90%、或至少約95%序列一致性且仍與目標核酸雜交。此外，聚核苷酸可在一或多個區段上雜交以使得中間或鄰近區段不參與雜交事件(例如環結構或髮夾結構、『凸起』、『泡』及其類似物)。因此，熟習此項技術者應瞭解，雖然序列內之個別鹼基可不與另一序列互補，但序列整體仍視為互補的。
出於本發明之目的，「基因」包括編碼基因產物(例如蛋白質、RNA)之DNA區域，以及調節基因產物生產之所有DNA區域，無論此類調節序列是否鄰近編碼序列及/或轉錄序列。因此，基因可包括輔助元件序列，其包括但未必限於啟動子序列、終止子、轉譯調節序列(諸如核糖體結合部位及內部核糖體進入部位)、強化子、沉默子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質附著部位及基因座控制區。編碼序列編碼轉錄或轉錄及轉譯後之基因產物；本發明之編碼序列可包含片段且無需含有全長開放閱讀框。基因可以包括經轉錄之股以及含有反密碼子之互補股兩者。
術語「下游」係指位於參考核苷酸序列之3'處之核苷酸序列。在某些實施例中，下游核苷酸序列係關於轉錄起始點之後的序列。舉例而言，基因之轉譯起始密碼子位於轉錄起始部位下游。
術語「上游」係指位於參考核苷酸序列之5'端之核苷酸序列。在某些實施例中，上游核苷酸序列係關於位於編碼區或轉錄起始點之5'側上之序列。舉例而言，大部分啟動子位於轉錄起始部位上游。
關於聚核苷酸或胺基酸序列之術語「鄰近」係指聚核苷酸或多肽中相互緊靠或鄰接的序列。熟練技術人員應瞭解，兩個序列可視為彼此鄰近且仍涵蓋有限量之插入序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸或胺基酸。
術語「調節元件」在本文中可與術語「調節序列」互換使用，且意欲包括啟動子、強化子及其他表現調節元件。應理解，適當調節元件之選擇將取決於待表現之經編碼組分(例如蛋白質或RNA)或核酸是否包含多個需要不同聚合酶或不意欲表現為融合蛋白之組分。
術語「輔助元件」在本文中可與術語「輔助序列」互換使用且意欲尤其包括聚腺苷酸化信號(聚(A)信號)、強化子元件、內含子、轉錄後調節元件(PTRE)、核定位信號(NLS)、去胺酶、DNA醣苷酶抑制劑、額外啟動子、刺激CRISPR介導之同源定向修復(例如以順式或反式)之因子、自裂解序列及融合域，例如與CRISPR蛋白融合之融合域。應理解，適當的一或多種輔助元件之選擇將視待表現之編碼組分(例如蛋白質或RNA)而定或核酸是否包含需要不同聚合酶或不意欲表現為融合蛋白之多個組分。
術語「啟動子」係指含有轉錄起始部位及促進聚合酶結合及轉錄之額外序列的DNA序列。例示性真核啟動子包括諸如TATA盒之元件及/或B識別元件(BRE)，且幫助或促進相關可轉錄聚核苷酸序列及/或基因(或轉殖基因)之轉錄及表現。啟動子可以合成方式產生或可衍生自已知或天然存在之啟動子序列或另一啟動子序列。啟動子亦可包含嵌合啟動子，其包括兩個或更多個異源序列之組合以賦予某些特性。本發明之啟動子可包括與本文已知或提供之其他啟動子序列在組成上類似，但與其不相同的啟動子序列之變異體。啟動子可根據與相關編碼或轉錄序列或可操作地連接於啟動子之基因(諸如組成性、發育性、組織特異性、誘導型等)之表現模式相關的準則分類。啟動子亦可根據其強度分類。如啟動子之上下文中所用，「強度」係指藉由啟動子控制之基因的轉錄速率。「強」啟動子意謂轉錄速率較高，而「弱」啟動子意謂轉錄速率相對較低。
本發明之啟動子可為聚合酶II (Pol II)啟動子。聚合酶II轉錄所有蛋白質編碼及許多非編碼基因。代表性Pol II啟動子包括核心啟動子，該核心啟動子為圍繞轉錄起始部位約100個鹼基對之序列，且充當Pol II聚合酶及相關通用轉錄因子之結合平台。啟動子可含有一或多個核心啟動子元件，諸如TATA盒、BRE、引發劑(INR)、模體十元件(MTE)、下游核心啟動子元件(DPE)、下游核心元件(DCE)，儘管缺乏此等元件之核心啟動子為此項技術中已知的。所有Pol II啟動子均設想在本發明之範疇內。
本發明之啟動子可為聚合酶III (Pol III)啟動子。Pol III轉錄DNA以合成小核糖體RNA，諸如5S rRNA、tRNA及其他小RNA。代表性Pol III啟動子使用內部控制序列(基因之轉錄片段內的序列)來支援轉錄，但有時亦使用諸如TATA盒之上游元件。所有Pol III啟動子均設想在本發明之範疇內。
術語「強化子」係指當與稱為轉錄因子之特異性蛋白質結合時，調節相關基因之表現的調節DNA序列。強化子可位於基因之內含子中，或基因編碼序列之5'或3'中。強化子可在基因近端(亦即，在啟動子之數十或數百個鹼基對(bp)內)，或可位於基因遠端(亦即，與啟動子相距數千個bp、數十萬個bp或甚至數百萬個bp)。單一基因可藉由超過一種強化子調控，設想該等超過一種強化子均在本發明之範疇內。
如本文所用，「轉錄後調節元件(PTRE或TRE)」，諸如肝炎PTRE，係指當轉錄時產生能夠展現轉錄後活性以增強或促進與其可操作地連接之相關基因表現的三級結構的DNA序列。
在本發明之上下文中且就基因而言，「抑制(repress)」、「抑制(repression)」、「抑制(repressing)」、「基因表現之抑制(inhibition of gene expression)」、「下調(downregulation)」及「沉默(silencing)」在本文中可互換使用，指代基因或其部分之轉錄的抑制或阻斷。因此，基因之抑制可使得基因產物之產生減少。減少轉錄之基因抑制過程之實例包括(但不限於)抑制轉錄起始複合物之形成的過程、降低轉錄起始速率的過程、降低轉錄延伸速率的過程、降低轉錄持續力的過程及拮抗轉錄活化(例如藉由阻斷轉錄活化蛋白之結合)的過程。基因抑制可構成例如活化防止以及低於現有量之表現抑制。轉錄抑制包括基因轉錄之可逆及不可逆失活兩者；後者可由基因之表觀遺傳修飾產生。
「抑制子」或「抑制子域」可互換使用以指代多肽因子，其充當阻止、抑制或阻斷DNA轉錄，引起基因表現之抑制的DNA上之調節元件。在本發明之上下文中，抑制子域與DNA結合蛋白之連接可在結合於目標核酸時阻止自啟動子轉錄或以其他方式抑制基因表現。不希望受理論所束縛，認為轉錄抑制子可藉由多種機制起作用，包括藉由位阻以物理方式阻斷RNA聚合酶通路、改變聚合酶之轉譯後修飾狀態、修改新生RNA之表觀遺傳狀態、經由甲基化改變DNA之表觀遺傳狀態、經由組蛋白去乙醯化或調節核小體重塑改變DNA之表觀遺傳狀態或防止強化子-啟動子相互作用，從而引起基因沉默或基因表現量降低。
「長期抑制子蛋白」或「LTRP」在本文中可與「抑制子融合蛋白」互換地使用且係指包含與一或多個域融合之DNA結合蛋白(或蛋白之DNA結合域)的融合蛋白，其能夠抑制目標核酸序列之轉錄。視情況，本發明之抑制子融合蛋白可含有額外元件，諸如融合蛋白之域中之任一者之間的連接子、核定位信號、核輸出信號以及賦予抑制子融合蛋白額外活性之額外蛋白域。
如本文所用，「抑制子融合蛋白:gRNA系統」為用於轉錄抑制之系統且包含抑制子融合蛋白，其包含催化失活CRISPR蛋白及一或多個連接之抑制子域；及結合至催化失活CRISPR蛋白的引導核酸(gRNA)。為了清楚起見，系統亦包括可用於產生系統之抑制子融合蛋白及gRNA組分的任何編碼DNA、RNA或載體及其類似物。
如本文所用，DNA結合蛋白係指能夠結合至DNA之蛋白質或蛋白質域。例示性DNA結合蛋白包括鋅指(ZF)蛋白、TALE及CRISPR蛋白。熟習此項技術者應瞭解，在能夠結合DNA及進行另一活性(諸如DNA裂解)之多功能蛋白(諸如CRISPR蛋白)中，DNA結合功能可與蛋白質之其他功能分離，從而產生催化失活DNA結合蛋白。
如本文所用，「催化失活CRISPR蛋白」係指缺乏核酸內切酶活性的CRISPR蛋白。熟習此項技術者應瞭解，CRISPR蛋白可為催化失活的，且仍能夠執行額外蛋白質功能，諸如DNA結合。類似地「催化失活CasX」係指缺乏核酸內切酶活性但仍能夠執行額外蛋白質功能(諸如DNA結合)的CasX蛋白。
如本文所用，「重組(Recombinant)」意謂特定核酸(DNA或RNA)為選殖、限制及/或連接步驟之各種組合的產物，產生具有與天然系統中發現之內源核酸可區分之結構性編碼或非編碼序列的構築體。一般而言，編碼結構性編碼序列之DNA序列可自cDNA片段及短寡核苷酸連接子或自一系列合成寡核苷酸組裝，以提供能夠自細胞中或無細胞轉錄及轉譯系統中所含之重組轉錄單元表現的合成核酸。此類序列可呈未被內部非轉譯序列或內含子(其通常存在於真核基因中)間斷之開放閱讀框形式提供。包含相關序列之基因體DNA亦可用於形成重組基因或轉錄單元。非轉譯DNA之序列可存在於開放閱讀框之5'或3'，其中此類序列不干擾編碼區之操縱或表現，且可實際上用於藉由各種機制調節所需產物之生產(參見上文之「強化子」及「啟動子」)。
術語「重組聚核苷酸」或「重組核酸」係指一種非天然存在，例如藉由經由人工干預將序列之兩個其他分離區段人工組合而製得。此人工組合通常藉由化學合成手段或藉由人工操縱核酸之分離區段，例如藉由基因工程改造技術來實現。通常進行此類操作以用編碼密碼子或保守胺基酸，同時典型地引入或移除序列識別部位之冗餘密碼子來替代密碼子。或者，進行該操作以將具有所需功能之核酸區段連接在一起以產生功能之所需組合。此人工組合通常藉由化學合成手段或藉由人工操縱核酸之分離區段，例如藉由基因工程改造技術來實現。
類似地，術語「重組多肽」或「重組蛋白」係指並非天然存在之多肽或蛋白質，例如藉由經由人工干預將胺基序列之兩個其他分離區段人工組合而製得。因此，例如包含異源胺基酸序列之蛋白質為重組的。
如本文所用，「脂蛋白」(諸如VLDL、LDL及HDL)係指於血清、血漿及淋巴中發現且對於脂質輸送至關重要的一組蛋白質。各脂蛋白之化學組成不同，例如因為HDL具有較高比例之蛋白質比脂質，而VLDL具有較低比例之蛋白質比脂質。
如本文所用，「動脈粥樣硬化」意謂影響大型及中型動脈之動脈硬化且以脂肪沈積物之存在為特徵。脂肪沈積物稱為「動脈粥瘤」或「斑塊」，其主要由膽固醇及其他脂肪、鈣及瘢痕組織組成，且破壞動脈內膜。
如本文所用，「冠狀動脈心臟病(CHD)」意謂向心臟供應血液及氧氣之小血管變窄，其通常為動脈粥樣硬化之結果。
如本文所用，「血脂異常」係指脂質及/或脂蛋白代謝病症，包括脂質及/或脂蛋白過度產生或缺乏。血脂異常可體現為脂質(諸如乳糜微粒、膽固醇及三酸甘油酯)以及脂蛋白(諸如低密度脂蛋白(LDL)膽固醇)的升高。
如本文所用，「高密度脂蛋白-C」或「HDL-C」意謂與高密度脂蛋白顆粒相關之膽固醇。血清(或血漿)中HDL-C之濃度通常以mg/dL或nmol/L定量。「血清HDL-C」及「血漿HDL-C」分別意謂血清及血漿中之HDL-C。
如本文所用，「低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)」意謂低密度脂蛋白顆粒中攜帶的膽固醇。血清(或血漿)中LDL-C之濃度通常以mg/dL或nmol/L定量。「血清LDL-C」及「血漿LDL-C」分別意謂血清及血漿中之LDL-C。
如本文中所使用，「高膽固醇血症」意謂以膽固醇或循環(血漿)膽固醇、LDL-膽固醇及VLDL-膽固醇升高為特徵之病狀，符合國家膽固醇教育計劃(NCEP)專家組報導中關於治療成人高膽固醇的偵測、評估的指導方針(參見，Arch. Int. Med. 148: 36 (1988))。
如本文所用，「高血脂病(hyperlipidemia)」或「高血脂病(hyperlipemia)」為以升高之血清脂質或循環(血漿)脂質為特徵之病狀。此病狀表現出異常高濃度之脂肪。循環血液中之脂質部分為膽固醇、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、乳糜微粒及三酸甘油酯。高血脂病之弗雷德里克森(Fredrickson)分類法係基於藉由電泳或超速離心所量測的TG及富含膽固醇之脂蛋白顆粒之圖案來劃分，且常用於表徵高血脂病(諸如高三酸甘油酯血症)之主要病因。
如本文所用，「三酸甘油酯」或「TG」意謂由甘油與三種脂肪酸分子組合組成之脂質或中性脂肪。
如本文所用，「高三酸甘油酯血症」意謂以三酸甘油酯水平升高為特徵之病狀。其病因包括主要(亦即遺傳病因)及次要(其他潛在病因，諸如糖尿病、代謝症候群/胰島素抗性、肥胖、缺乏運動、吸菸、過量飲酒及碳水化合物極高的飲食)因素，或最常見為兩者之組合。
如本文所用，「糖尿病(diabetes mellitus)」或「糖尿病(diabetes)」係以無序代謝及異常高血糖(高血糖症)為特徵之症候群，其由胰島素水平不足或胰島素敏感性降低引起。特徵症狀為歸因於高血糖水平而導致過量的尿液產生(多尿)；為彌補排尿增加而導致過度口渴以及液體攝入量增加(多飲)；由於高血糖對眼睛光學的影響而導致視力模糊；不明原因的體重減輕；以及嗜睡。
如本文所用，「糖尿病血脂異常」或「2型糖尿病合併血脂異常」意謂以2型糖尿病、HDLC降低、三酸甘油酯(TG)升高及較小密集LDL顆粒升高為特徵之病狀。
如本文所用，「脂質奈米顆粒」係指具有至少一個奈米尺寸(例如1-1,000 nm)的顆粒，其包含一或多種脂質(例如陽離子脂質、非陽離子脂質及經PEG修飾之脂質)。在一些實施例中，脂質奈米顆粒包括在調配物中，該調配物可用於將活性劑或治療劑，諸如核酸(例如mRNA)遞送至所關注之目標部位(例如細胞、組織、器官、腫瘤及其類似者)。在一些實施例中，本發明之脂質奈米顆粒包含核酸。此類脂質奈米顆粒通常包含中性脂質、帶電脂質、類固醇及聚合物結合脂質。在一些實施例中，活性劑或治療劑(諸如核酸)可囊封於脂質奈米顆粒之脂質部分或由脂質奈米顆粒之一些或全部脂質部分包封的水性空間中，從而保護其免於酶降解或由宿主生物體或細胞之機制誘導之其他不合需要的作用，例如不良免疫反應。
如本文所用，「脂質囊封」係指提供活性劑或治療劑(諸如核酸(例如mRNA))的具有完全囊封、部分囊封或兩者兼具之脂質奈米顆粒。在一實施例中，核酸(例如mRNA)完全囊封於脂質奈米顆粒中。
如本文所用，術語「接觸(contacting)」意謂在兩個或更多個實體之間建立實體連接。舉例而言，使目標核酸與引導核酸接觸意謂使目標核酸及引導核酸共用實體連接；例如若序列共用序列相似性，則可雜交。
「解離常數」或「K d」可互換使用且意謂配位體「L」與蛋白質「P」之間的親和力；亦即配位體與特定蛋白質結合之緊密程度。其可使用式K d=[L][P]/[LP]計算，其中[P]、[L]及[LP]分別表示蛋白質、配位體及複合物之莫耳濃度。
本發明提供適用於修飾目標核酸之組合物及方法。如本文所用，「編輯」可與「修飾(modifying)」以及「修飾(modification)」互換使用，且包括但不限於裂解、切割、編輯、缺失、基因敲入、基因剔除及其類似者。修飾亦可涵蓋對核酸或含有核酸之染色質之表觀遺傳修飾，諸如(但不限於) DNA甲基化之變化及組蛋白甲基化及乙醯化。
「裂解」，其意謂目標核酸分子(例如RNA、DNA)之共價主鏈的斷裂。裂解可藉由多種方法，包括但不限於磷酸二酯鍵之酶或化學水解引發。單股裂解及雙股裂解均為可能的，且雙股裂解可由於兩個獨特單股裂解事件而發生。
如本文所用，術語「基因減量」係指基因或其基因產物之表現減少。由於基因減量，蛋白質活性或功能可減弱或蛋白質水平可降低或消除。
聚核苷酸或多肽與另一聚核苷酸或多肽具有一定百分比「序列相似性」或「序列一致性」，意謂當比對時，當比較兩個序列時，該等百分比之鹼基或胺基酸相同且在相同相對位置。序列類似性(有時稱為類似性百分比、一致性百分比或同源性)可以多種不同方式確定。為確定序列類似性，可使用此項技術中已知之方法及電腦程式比對序列，該等方法及電腦程式包括BLAST，其可在全球資訊網內在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST處獲得。核酸內之核酸序列之特定伸長段之間的互補性百分比可使用任何便利方法確定。例示性方法包括BLAST程式(基本局部比對檢索工具)及PowerBLAST程式(Altschul等人, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410；Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656)或藉由使用Gap程式(威斯康星序列分析封裝，Unix之版本8，遺傳學電腦組，大學研究園，Madison Wis)，例如使用預設應用程式，其使用史密斯及德曼之算法(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)。
術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，且係指任何長度之胺基酸之聚合形式，其可包括編碼及非編碼胺基酸、化學或生物化學修飾或衍生之胺基酸及具有經修飾之肽主鏈之多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源胺基酸序列之融合蛋白。
「載體」或「表現載體」為複製子，諸如質體、噬菌體、病毒或黏質體，其上可連接另一DNA區段(亦即表現卡匣)以便引起所連接區段在細胞中之複製或表現。
應用於核酸、多肽、細胞或生物體的如本文所用之術語「天然存在之」或「未修飾」或「野生型」係指自然界中發現之核酸、多肽、細胞或生物體。
如本文所用，相比於野生型或參考胺基酸序列或野生型或參考核苷酸序列，「突變」係指一或多個胺基酸或核苷酸的插入、缺失、取代、複製或反轉。
如本文所用，術語「經分離」意欲描述處於與聚核苷酸、多肽或細胞天然存在之環境不同的環境中的聚核苷酸、多肽或細胞。經分離之遺傳修飾宿主細胞可存在於遺傳修飾宿主細胞之混合群體中。
如本文所用之「宿主細胞」表示真核細胞、原核細胞或作為單細胞實體培養之多細胞生物體(例如細胞株)的細胞，該等真核細胞或原核細胞用作核酸(例如AAV載體)之接受者，且包括已由核酸遺傳修飾之原始細胞之子代。應理解，單一細胞之後代可歸因於天然、意外或有意突變而不一定與原始親本細胞具有完全相同之形態或基因體或總DNA補體。「重組宿主細胞」(亦稱為「經基因修飾之宿主細胞」)為已引入異源核酸(例如AAV載體)的宿主細胞。
術語「保守胺基酸取代(conservative amino acid substitution)」係指具有類似側鏈之胺基酸殘基之蛋白質之互換性。舉例而言，具有脂族側鏈之胺基酸之群由甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸組成；具有脂族羥基側鏈之胺基酸之群由絲胺酸及蘇胺酸組成；具有含醯胺側鏈之胺基酸之群由天冬醯胺及麩醯胺酸組成；具有芳族側鏈之胺基酸之群由苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸組成；具有鹼性側鏈之胺基酸之群由離胺酸、精胺酸及組胺酸組成；且具有含硫側鏈之胺基酸之群由半胱胺酸及甲硫胺酸組成。例示性保守胺基酸取代群組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。
如本文所用，「治療(treatment)」或「治療(treating)」在本文中可互換使用，且係指獲得有益或所需結果，包括但不限於治療益處及/或預防益處之方法。治療益處意謂根除或改善所治療之潛在病症或疾病。治療效益亦可藉由根除或減輕症狀中之一或多者或改善與潛在疾病相關之一或多個臨床參數，使得儘管個體仍可能罹患潛在病症，但在個體中觀測到改善來實現。
如本文所用，術語「治療有效量」及「治療有效劑量」係指當以一個或重複劑量向個體(諸如人類或實驗動物)投與時能夠對任何症狀、態樣、所量測之疾病狀態或病狀之參數或特徵具有任何可偵測、有益作用的單獨或作為組合物之一部分的藥物或生物製劑之量。該作用不需要絕對有益。
如本文所用，投與下表意謂向個體給予一定劑量之化合物(例如本發明之組合物)或組合物(例如醫藥組合物)的方法。
「個體」係哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物、非人類靈長類動物、人類、狗、兔、小鼠、大鼠及其他嚙齒動物。
術語「低密度脂蛋白(LDL)」係指密集最小(重量體積比顆粒較小)至密集最大(重量體積比顆粒較大)之五大類脂蛋白之一：乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、中等密度脂蛋白(IDL)及高密度脂蛋白(HDL)。脂蛋白在細胞外流體中將脂質(脂肪)轉移至身體周圍，從而促進脂肪經由受體介導之內吞作用轉移至細胞體。LDL顆粒之直徑為約220至275埃。
「低密度脂蛋白(LDL)受體」係指介導富含膽固醇之LDL顆粒的內吞作用的839個胺基酸之受體蛋白(移除21-胺基酸信號肽之後)。其係一種細胞表面受體，可識別在乳糜微粒殘餘物及VLDL殘餘物(IDL)中發現之去輔基蛋白B100及apoE蛋白，從而引起LDL-膽固醇之結合及內吞作用。此過程發生於所有有核細胞中，但主要在肝臟中，其自循環移除大致70%之LDL。人類LDLR基因在NCBI資料庫(ncbi.nlm.nih.gov)中經部分描述為參考序列NG_009060.1，其以引用之方式併入本文中。
本說明書中所提及之所有出版物、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度就如同特定且個別地指示各個出版物、專利或專利申請案以引用的方式併入一般。2020年6月5日申請之WO 2020/247882、2020年6月5日申請之WO 2020/247883、2020年9月9日申請之WO 2021/050593、2021年9月9日申請之WO 2021/050601、2021年1月8日申請之WO 2021/142342、2020年12月4日申請之WO 2021/113763、2020年12月4日申請之WO 2021/113769、2020年12月4日申請之WO 2021/113772、2020年12月4日申請之WO 2021/188729、2021年12月2日申請之WO 2022/120095、2021年12月2日申請之WO 2022/120094、2021年12月9日申請之WO 2022/125843、2021年12月2日申請之WO 2022/120089、2022年6月7日申請之WO 2022/261150、2022年9月21日申請之WO 2023/049742及2022年6月7日申請之WO 2022/261149之內容(其揭示CasX變異體及gRNA變異體)及其遞送方法以全文引用之方式併入本文中。 I.            一般方法
除非另外規定，否則本發明之實踐採用免疫學、生物化學、化學、分子生物學、微生物學、細胞生物學、基因體學及重組DNA之習知技術，其可見於諸如以下之標準教科書：Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版(Sambrook等人, Harbor Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology，第4版(Ausubel等人編, John Wiley & Sons 1999)；Protein Methods (Bollag等人, John Wiley & Sons 1996)；Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner等人編, Academic Press 1999)；Viral Vectors (Kaplift及Loewy編, Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual (I. Lefkovits編, Academic Press 1997)；及Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle及Griffiths, John Wiley & Sons 1998)，該等文獻之揭示內容以引用的方式併入本文中。
在提供值範圍時，應理解包括端點且涵蓋彼範圍之上限與下限之間的各中介值(除非上下文另有明確指示，否則至下限單位之十分之一)及彼所陳述範圍內之任何其他所陳述值或中介值。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍中，且亦被涵蓋，在所陳述範圍內受到任何特定排他性限制。在所陳述範圍包括限制中之一或兩者之情況下，亦包括排除彼等所包括之限制之任一者或兩者的範圍。
除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之普通技術人員通常所理解的相同的含義。本文所提及之全部公開案均以引用之方式併入本文中，以揭示及描述與所引用之公開案相關的方法及/或材料。
必須注意，除非上下文另有明確規定，否則如在本文中及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。
應瞭解，為了清楚起見而在獨立實施例之上下文中描述的本發明之某些特徵亦可組合地提供於單一實施例中。在其他情況下，為簡潔起見而在單個實施例之上下文中描述的本發明之各種特徵亦可分開地或以任何適合之子組合提供。希望關於本發明的實施例之所有組合特別地由本發明涵蓋且在本文中揭示，如同個別地且明確地揭示每一組合一般。另外，各種實施例及其要素之所有子組合亦由本發明特定涵蓋且在本文中揭示，如同單獨且明確地在本文中揭示每一此類子組合一般。 II.          用於PCSK9基因之表觀遺傳修飾及抑制之系統
在第一態樣中，本發明提供包含或編碼融合蛋白之系統，該融合蛋白(統稱為長期抑制子蛋白，在本文中稱為「LTRP」或「LTRP融合蛋白」或「抑制子融合蛋白」；反映對目標基因可達成的長期抑制效果)包含能夠結合所靶向之 PCSK9基因之目標核酸序列的DNA結合蛋白及連接之抑制子域，用於轉錄抑制、沉默及/或表觀遺傳修飾。如本文所用，「系統」可與「組合物」互換使用。本發明亦提供編碼本文所提供之系統的核酸。本文亦提供製造該等系統之方法，以及使用該等系統之方法，包括基因抑制及/或表觀遺傳修飾之方法及治療PCSK9相關疾病之方法。
在一些實施例中，DNA結合蛋白包含鋅指(ZF)或TALE(轉錄活化子樣效應子)蛋白，或其DNA結合域，在本文中亦被稱作DNA結合蛋白，其結合但不裂解目標核酸。TALE之DNA結合域包含33-34個胺基酸(aa)長的定製單體之串聯陣列，其理論上可按照一個重複序列結合一個鹼基對的識別程式碼組裝以識別任何基因序列(Jain, S.等人, TALE outperforms Cas9 in editing heterochromatin target sites. Nat. Commun. 12:606 (2021))。TALE結合DNA之特異性係由兩個多晶型胺基酸引起，所謂的重複序列可變雙殘基(repeat variable diresidue，RVD)位於重複單元之位置12及13處。藉由重新排列重複序列，可任意改變TALE的DNA結合特異性。鋅指蛋白為轉錄因子，其中各鋅指識別DNA之3至4個鹼基。藉由混合及匹配此等鋅指模組，ZF可針對待靶向之序列進行定製。能夠結合 PCSK9基因之例示性ZF描述於WO2018049009A2中。
在一些實施例中，DNA結合蛋白為催化失活1類或2類CRISPR蛋白。催化失活CRISPR蛋白在此項技術中亦稱為「無催化活性」CRISPR蛋白。在一些實施例中，2類II型蛋白為催化失活Cas9。在其他實施例中，2類CRISPR蛋白係選自由II型、V型或VI型蛋白組成之群。在一個實施例中，2類V型蛋白係選自由以下組成之群：Cas12a (Cpf1)、Cas12b (C2c1)、Cas12c (C2c3)、Cas12d (CasY)、Cas12e (CasX)、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j、Cas12k、Cas14及/或CasΦ，在各情況下如本文所描述藉由特異性突變使其呈現催化失活。在一些實施例中，CasX蛋白為催化失活CasX變異體(dCasX)，其中dCasX包含選自由SEQ ID NO: 4-29組成之群的序列，或與其具有至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性的序列，其中包含dCasX之融合蛋白保留與gRNA形成RNP的能力。在一些實施例中，dCasX包含選自由SEQ ID NO: 4-29組成之群的序列。在一些實施例中，dCasX包含選自由SEQ ID NO: 3281-3441組成之群的序列，其包含RuvC域，該RuvC域具有一或多個使RuvC域之裂解活性不活化之突變，由此使得CasX蛋白催化失活。在一特定實施例中，dCasX包含SEQ ID NO: 4之序列。
基於CRISPR之系統進一步包含引導核酸(gNA)，例如具有與基因之目標序列互補之靶向序列的引導核糖核酸(gRNA)。在目標序列藉由基於CRISPR之系統(CRISPR蛋白及連接之抑制子域)及gRNA結合後，即刻抑制基因轉錄。
本發明提供用於轉錄抑制 PCSK9基因之系統。在一些實施例中，系統包含抑制子融合蛋白，其包含催化失活CasX蛋白及連接之抑制子域；及引導核糖核酸(gRNA)，其包含與所靶向之用於抑制、沉默或下調之 PCSK9基因之目標核酸序列互補的靶向序列(抑制子融合蛋白:gRNA系統)。在一些實施例中，系統包含編碼抑制子融合蛋白(例如dCasX及連接之抑制子域)及gRNA之核酸。在一些實施例中，該系統包含抑制子融合蛋白及gRNA作為能夠在真核細胞中形成核糖核蛋白(RNP)複合物且結合 PCSK9目標核酸之基因抑制子對。在其他情況下，本發明提供編碼抑制子融合蛋白及gRNA之核酸，或gRNA及編碼抑制子融合蛋白之mRNA之系統，其用於本文所描述之某些顆粒調配物(例如LNP)中。
本文亦提供製造抑制子融合蛋白及gRNA之方法，以及使用抑制子融合蛋白:gRNA系統之方法，包括基因抑制及/或表觀遺傳修飾之方法，及治療方法。下文更充分地描述系統之DNA結合蛋白(例如dCasX)及連接之抑制子域及gRNA組分及其特徵，以及遞送模式及使用用於 PCSK9基因之抑制、下調或沉默之系統的方法。
本發明提供系統，其經特定設計以抑制或沉默 PCSK9基因之轉錄。在一些情況下，系統經設計以抑制具有功能獲得型突變之真核細胞中 PCSK9基因之轉錄。在一些情況下，系統經設計以抑制真核細胞中之野生型 PCSK9基因的轉錄。在替代方案中，系統經設計以抑制真核細胞中 PCSK9基因之突變型對偶基因之轉錄。一般而言， PCSK9基因之任何部分均可使用本文所提供之可程式化系統及方法靶向，本文對此進行更全面的描述。
PCSK9基因編碼前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(「PCSK9」)，其為一種結合於低密度脂蛋白顆粒(LDL)之受體以將LDL輸送至細胞中的蛋白質。 PCSK9基因涵蓋橫跨人類基因體(GRCh38/hg38)之chr1:55,039,476-55,064,853的序列(符號係指1號染色體(chr1))，自1號染色體上的55,039,476 bp起始至55,064,853 bp (Homo sapiens Updated Annotation Release 109.20190905, GRCh38.p13) (NCBI)。人類 PCSK9基因在NCBI資料庫(ncbi.nlm.nih.gov)中經部分描述為參考序列NG_009061.1，其以引用之方式併入本文中。 PCSK9基因座具有12個外顯子，其產生編碼692-胺基酸蛋白質之3636 bp的mRNA，該蛋白質在其合成之後經歷自催化裂解反應，該反應剪切前域，從而產生具有540個胺基酸之活化蛋白質。前域仍連接至催化及抵抗素樣域，此可能係因為前域充當伴隨蛋白且促進摺疊及分泌(Seidah, NG等人, Proc Natl Acad Sci USA 100(3):928 (2003))。分泌性前蛋白轉化酶神經細胞凋亡調節之轉化酶1(NARC-1)：肝臟再生及神經元分化(The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC-1): liver regeneration and neuronal differentiation，Seidah NG等人)。此蛋白質，亦稱為神經細胞凋亡調節之轉化酶，係一種屬於枯草桿菌酶(subtilase)之蛋白酶K亞家族的絲胺酸蛋白酶。
人類PCSK9基因(HGNC:20001)編碼具有以下序列之蛋白質(Q8NBP7)： 。 III.        用於抑制子系統之催化失活蛋白
在一些實施例中，用於本發明之融合蛋白、系統及方法之DNA結合蛋白為可結合但不裂解 PCSK9目標核酸之鋅指(ZF)或TALE (轉錄活化子樣效應子)蛋白。
在一些實施例中，DNA結合蛋白為催化失活1類或2類CRISPR蛋白。在一個實施例中，2類II型蛋白為催化失活Cas9。在另一實施例中，2類CRISPR蛋白係選自由II型、V型或VI型蛋白組成之群。在一個實施例中，2類CRISPR V型蛋白係選自由以下組成之群：Cas12a (Cpf1)、Cas12b (C2c1)、Cas12c (C2c3)、Cas12d (CasY)、Cas12e (CasX)、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j、Cas12k、Cas14及/或CasΦ，在各情況下如本文所描述藉由特異性突變使其呈現催化失活。在一些實施例中，CasX蛋白為催化失活CasX變異體(dCasX)。
如本文所用，術語「CasX蛋白」係指一個蛋白質家族，且涵蓋所有天然存在之CasX蛋白(「參考CasX」)，以及具有多個序列修飾之經工程改造之CasX蛋白(除了顯現CasX催化失活(dCasX)之彼等蛋白質之外)，其相對於參考CasX蛋白具有一或多個經改良特徵，下文將對此進行更全面的描述。本發明之CasX蛋白包含以下域：非目標股結合(NTSB)域、目標股負載(TSL)域、螺旋形I域、螺旋形II域、寡核苷酸結合域(OBD)及RuvC域，且在一些情況下，域可進一步分成亞域，如表1中所列。
在本發明之上下文中，抑制子融合蛋白、系統及方法中使用之CasX為催化失活的(dCasX)；藉由在RuvC序列中之選擇位置引入突變來實現，如下所描述。 a.參考CasX蛋白
本發明提供天然存在之CasX蛋白(在本文中稱為「參考CasX蛋白」)，其隨後經修飾以產生本發明之經工程改造之dCasX。舉例而言，參考CasX蛋白可與天然存在之原核生物分離，諸如δ變形菌綱 (Deltaproteobacteria)、浮黴菌門( Planctomycetes)或宋氏菌暫定種( Candidatus Sungbacteriaspecies)。參考CasX蛋白(在本文中可互換地稱為參考CasX多肽)為2類V型CRISPR/Cas核酸內切酶，其屬於能夠與引導RNA相互作用以形成核糖核蛋白(RNP)複合物之蛋白質之CasX (可互換地稱為Cas12e)家族。
在一些情況下，參考CasX蛋白分離或衍生自具有以下序列之δ變形菌綱： 。
在一些情況下，參考CasX蛋白分離或衍生自具有以下序列之浮黴菌門： 。
在一些情況下，參考CasX蛋白係自具有以下序列之宋氏菌暫定種分離或衍生： 。 b. 催化失活 CasX 變異體蛋白
在本發明之抑制子融合蛋白及包含其之系統中，CasX蛋白為催化失活的(dCasX)，因為其不能裂解DNA，但在與引導RNA (gRNA)複合時保留結合目標核酸之能力。本發明提供催化失活變異體(在本文中可互換稱為「dCasX變異體」或「dCasX變異體蛋白」)，其中催化失活CasX變異體包含相對於SEQ ID NO: 1-3之序列之催化失活型式(參見上文所描述)選擇域中之多個修飾。例示性催化失活CasX蛋白包含CasX蛋白之RuvC域之活性部位中的一或多個突變。在一些實施例中，催化失活參考CasX蛋白包含參考SEQ ID NO: 1在殘基672、769及/或935處的取代。在一些實施例中，催化失活參考CasX蛋白包含參考SEQ ID NO: 1之D672A、E769A及/或D935A取代。在其他實施例中，催化失活參考CasX蛋白包含參考SEQ ID NO: 2在胺基酸659、756及/或922處的取代。在一些實施例中，催化失活參考CasX蛋白包含參考SEQ ID NO: 2之D659A、E756A及/或D922A取代。本發明之dCasX之例示性RuvC域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸661-824及935-986，或SEQ ID NO: 2之胺基酸648-812及922-978，相對於該RuvC裂解域序列具有一或多個胺基酸修飾，其中與參考dCasX相比，dCasX變異體展現一或多個改良特徵。在其他實施例中，催化失活CasX變異體蛋白包含參考CasX蛋白之全部或部分RuvC域之缺失。應理解，相同前述取代或缺失可類似地引入此項技術中已知之CasX變異體中，產生dCasX變異體(關於例示性序列，參見例如WO2022120095A1以及US11,560,555，其以引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，連接有抑制子域之dCasX變異體展現出與具有以類似方式組態之連接有抑制子域之參考dCasX蛋白相比至少一個改良之特徵。設想與本文所描述之連接有抑制子域之參考dCasX蛋白相比，改良連接有抑制子域之dCasX變異體蛋白之一或多個功能或特徵的所有dCasX變異體屬於本發明之範疇內。在一些實施例中，修飾為參考dCasX之一或多個胺基酸之突變(除使得dCasX催化失活之彼等胺基酸以外)。舉例而言，相對於參考dCasX蛋白序列，dCasX變異體可包含一或多個胺基酸取代、插入、缺失或交換域，或其任何組合。任何胺基酸可在本文所描述之取代中取代任何其他胺基酸。取代可為保守取代(例如鹼性胺基酸取代另一鹼性胺基酸)。取代可為非保守取代(例如鹼性胺基酸經酸性胺基酸取代或反之亦然)。舉例而言，參考dCasX蛋白中之脯胺酸可經以下中之任一者取代以產生本發明之dCasX變異體蛋白：精胺酸、組胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸。在一些實施例中，dCasX變異體展現相比於參考dCasX改良之特徵。dCasX變異體實施例之例示性改良之特徵包括但不限於改良之變異體摺疊、增加之對gRNA的結合親和力、增加之對目標核酸的結合親和力、提高之在抑制及/或結合目標核酸中利用較大範圍PAM序列之能力、改良之目標DNA展開、增加之目標股負載、增加之DNA之非目標股結合、增加之蛋白質穩定性、增加之與gRNA複合的能力、以及連接有抑制子域且複合作為RNP時具有增加之蛋白質:gRNA (RNP)複合物穩定性、增加之抑制子活性、改良之對目標核酸的抑制子特異性、減少之脫靶抑制、增加之可被有效抑制及/或表觀遺傳修飾之真核基因體的百分比。在一些實施例中，dCasX變異體之改良之特徵相對於參考dCasX蛋白改良至少約1.1至約100,000倍。在一些實施例中，dCasX變異體之改良之特徵相比參考dCasX蛋白改良至少約1.1至約10,000倍、改良至少約1.1至約1,000倍、改良至少約1.1至約500倍、改良至少約1.1至約400倍、改良至少約1.1至約300倍、改良至少約1.1至約200倍、改良至少約1.1至約100倍、改良至少約1.1至約50倍、改良至少約1.1至約40倍、改良至少約1.1至約30倍、改良至少約1.1至約20倍、改良至少約1.1至約10倍、改良至少約1.1至約9倍、改良至少約1.1至約8倍、改良至少約1.1至約7倍、改良至少約1.1至約6倍、改良至少約1.1至約5倍、改良至少約1.1至約4倍、改良至少約1.1至約3倍、改良至少約1.1至約2倍、改良至少約1.1至約1.5倍、改良至少約1.5至約3倍、改良至少約1.5至約4倍、改良至少約1.5至約5倍、改良至少約1.5至約10倍、改良至少約5至約10倍、改良至少約10至約20倍、改良至少10至約30倍、改良至少10至約50倍或改良至少10至約100倍。在一些實施例中，dCasX變異體之改良之特徵相對於參考dCasX蛋白改良至少約10至約1000倍。關於改良之特徵之額外揭示內容描述於下文中。
在其他實施例中，修飾為參考dCasX之一或多個域經來自不同CasX之一或多個域取代。在一些實施例中，插入包括插入來自不同CasX蛋白之部分或所有域。突變可置於在dCasX變異體之任何一或多個域中，且可包括例如一或多個域之部分或全部的缺失，或任何域中之一或多個胺基酸取代、缺失或插入。dCasX蛋白之域包括非目標股結合(NTSB)域、目標股負載(TSL)域、螺旋形I域、螺旋形II域、寡核苷酸結合域(OBD)及RuvC DNA裂解域，其可進一步包含下文所描述之子域。
適用於產生本發明之dCasX變異體蛋白之突變誘發方法可包括例如深度突變進化(DME)、深度突變掃描(DMS)、易錯PCR、卡匣突變誘發、隨機突變誘發、交錯延伸PCR、基因改組或域交換。在一些實施例中，例如藉由選擇參考dCasX中之一或多個所需突變來設計dCasX變異體。在某些實施例中，參考dCasX蛋白之活性用作比較一或多個dCasX變異體之活性的基準，藉此量測dCasX變異體之功能的改良。
在一些實施例中，dCasX變異體蛋白包含700至1200個胺基酸、800至1100個胺基酸或900至1000個胺基酸。
在可比分析系統中，與參考dCasX蛋白與參考gRNA之RNP相比，本發明之dCasX及連接之抑制子域在與gRNA複合作為RNP時利用PAM TC模體(包括選自TTC、ATC、GTC或CTC之PAM序列)有效結合目標核酸之能力增強。在前述內容中，PAM序列位於與gRNA之靶向序列具有一致性之原間隔子之非目標股5'側至少1個核苷酸處。
在一些實施例中，在20 pM或更小之濃度下，包含本發明之連接有抑制子域之dCasX變異體蛋白及gRNA的RNP能夠以至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之效率結合雙股DNA目標。在一個實施例中，在可比分析系統中，與包含連接有抑制子域之參考dCasX蛋白及參考gRNA的RNP相比，連接有抑制子域之dCasX變異體及gRNA變異體的RNP展現目標核酸中目標序列之更多結合，其中目標核酸的PAM序列為TTC。在另一實施例中，在可比分析系統中，與包含連接有抑制子域之參考dCasX蛋白及參考gRNA的RNP相比，連接有抑制子域之dCasX變異體及gRNA變異體的RNP展現目標核酸中目標序列之更大的結合親和力，其中目標核酸的PAM序列為ATC。在另一實施例中，在可比分析系統中，與包含連接有抑制子域之參考dCasX蛋白及參考gRNA的RNP相比，連接有抑制子域之dCasX變異體及gRNA變異體的RNP展現目標核酸中目標序列之更大的結合親和力，其中目標核酸的PAM序列為CTC。在另一實施例中，在可比分析系統中，與包含連接有抑制子域之參考dCasX蛋白及參考gRNA的RNP相比，連接有抑制子域之dCasX變異體及gRNA變異體的RNP展現目標核酸中目標序列之更大的結合親和力，其中目標核酸的PAM序列為GTC。在前述實施例中，與連接有抑制子域之參考dCasX蛋白(自SEQ ID NO: 1-3修飾)中之任一者及表6之SEQ ID NO: 1731-1743的gRNA的RNP對一或多個PAM序列之結合親和力相比，對該等PAM序列之增加的結合親和力大至少1.5倍或更多。 c.具有來自多個來源蛋白質之域的dCasX變異體蛋白
嵌合dCasX蛋白亦涵蓋在本發明之範疇內。如本文所用，「嵌合dCasX」蛋白係指含有至少兩個來自不同來源之域的dCasX蛋白以及含有至少一個本身為嵌合之域的dCasX蛋白。因此，在一些實施例中，嵌合dCasX蛋白為包括至少兩個自不同來源，諸如自兩個不同天然存在之CasX蛋白(例如兩個不同CasX參考蛋白質)或自兩個不同經工程改造之CasX蛋白分離或衍生之域的蛋白質。在一些實施例中，來源於SEQ ID NO: 2之dCasX變異體之螺旋形I-I域及NTSB域經來自SEQ ID NO: 1之對應螺旋形I-I及NTSB序列置換，得到嵌合dCasX蛋白。作為前述內容之另一實例，嵌合RuvC域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸660至823及SEQ ID NO: 2之胺基酸921至978。作為前述之替代實例，嵌合RuvC域包含SEQ ID NO: 2之胺基酸647至810及SEQ ID NO: 1之胺基酸934至986。
在其他實施例中，嵌合dCasX蛋白為含有至少一個為嵌合域之域的蛋白，例如在一些實施例中，一部分域包含來自不同CasX蛋白(來自參考CasX蛋白或另一經工程改造之CasX蛋白)之取代。在一些實施例中，至少一個嵌合域可為如本文所描述之NTSB、TSL、螺旋形I、螺旋形II、OBD或RuvC域中之任一者。在一些實施例中，來源於SEQ ID NO: 2之dCasX變異體之螺旋形I-I域(有時稱為螺旋形I-a)經來自SEQ ID NO: 1之相應螺旋形I-I序列置換，得到嵌合dCasX蛋白。
具有來自SEQ ID NO: 1之NTSB域及螺旋形I-II域以及來自SEQ ID NO: 2螺旋形I-I域之表2的序列包括dCasX 491、515、516、518-520、522-527、532、593、676 (在NTSB域中具有L169K取代)及812 (關於SEQ ID NO參見表2)。參考SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之參考CasX蛋白中之CasX域之座標提供於下表1中。熟習此項技術者應理解，以下表1中指示之域邊界為近似的，且其邊界與下表中給出之邊界相差1、2或3個胺基酸的蛋白質片段可具有與下文所描述之域相同的活性。在一些實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 3281-3441或3444-3446之CasX蛋白，其具有來自SEQ ID NO: 1之NTSB域及螺旋形I-II域及來自SEQ ID NO: 2之螺旋形I-I域，其中CasX在所選位置相對於參考CasX之域具有額外胺基酸變化(亦即1、2、3、4或5個錯配)，且其藉由引入使RuvC域之裂解活性不活化的一或多個突變來呈現催化失活。 表 1 ：參考 CasX 蛋白中之域座標
域名稱 SEQ ID NO: 1 中之座標* SEQ ID NO: 2 中之座標*
OBD-I 1-55 1-57
螺旋形I-I 56-99 58-101
NTSB 100-190 102-191
螺旋形I-II 191-331 192-332
螺旋形II 332-508 333-500
OBD-II 509-659 501-646
RuvC-I 660-823 647-810
TSL 824-933 811-920
RuvC-II 934-986 921-978
*胺基酸位置
在一些實施例中，用於本發明之融合蛋白中之dCasX變異體蛋白包含如表2中所闡述之序列SEQ ID NO: 4-29。在其他實施例中，用於本發明之融合蛋白中之dCasX變異體蛋白包含與如表2中所闡述之SEQ ID NO: 4-29之序列至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致的序列。在一特定實施例中，用於本發明之基因抑制子系統之融合蛋白中之dCasX變異體蛋白包含SEQ ID NO: 4之序列(dCasX 491)。在另一特定實施例中，用於本發明之基因抑制子系統之融合蛋白中之dCasX變異體蛋白包含SEQ ID NO: 6之序列(dCasX 515)。在另一特定實施例中，用於本發明之基因抑制子系統之融合蛋白中之dCasX變異體蛋白包含SEQ ID NO: 29之序列(dCasX 812)。 表 2 ： dCasX 變異體序列
SEQ ID NO dCasX 胺基酸序列
4 dCasX491 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
5 dCasX514 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTIHTSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
6 dCasX515 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEAD7KDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
7 dCasX516 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNHNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
8 dCasX517 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGAPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
9 dCasX518 RQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
10 dCasX519 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHIQLRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
11 dCasX520 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTTQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
12 dCasX522 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKRSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
13 dCasX523 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTYPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
14 dCasX524 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTIHSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
15 dCasX525 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAATQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
16 dCasX526 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAAKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
17 dCasX527 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
18 dCasX528 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASYPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
19 dCasX529 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASNPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
20 dCasX530 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGWGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
21 dCasX531 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGYGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
22 dCasX532 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
23 dCasX533 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASYPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
24 dCasX535 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASSPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
25 dCasX593 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRWWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
26 dCasX668 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASSPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
27 dCasX672 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLIKLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASSPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
28 dCasX676 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLIKLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASSPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
29 dCasX812 QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKKFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
在一些實施例中，dCasX包含選自由SEQ ID NO: 4-29組成之群的序列，或與其具有至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%序列或至少約99%序列一致性的序列。在一些實施例中，dCasX包含選自由SEQ ID NO: 4-29組成之群的序列。在一些實施例中，dCasX包含選自由SEQ ID NO: 3281-3441及3444-3446組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%序列或至少約99%序列一致性的序列，其中該序列進一步包含RuvC域中之一或多個突變，使得dCasX能夠結合DNA，但在其他情況下催化失活。在一些實施例中，一或多種突變在RuvC域中且致使RuvC無催化活性(亦即不能夠裂解DNA)。在一些實施例中，一或多個突變包含對應於序列SEQ ID NO: 2之D659A、E756A及/或D922A取代。包含dCasX之抑制子融合蛋白質保留與gRNA形成RNP之能力。在一些實施例中，包含dCasX之抑制子融合蛋白保留CasX蛋白之一或多種功能，包括(但不限於)針對gRNA之親和力、結合至目標核酸、針對目標核酸之特異性、目標核酸之展開、目標股裝載負載或其任何組合。 d.對gRNA之親和力
在一些實施例中，連接有抑制子域之dCasX對gRNA之親和力相對於參考dCasX蛋白有所改良，從而形成核糖核蛋白複合物。抑制子融合蛋白對gRNA之親和力增加可例如導致產生RNP複合物之較低K d，其在一些情況下可導致更穩定的核糖核蛋白複合物形成。在一些實施例中，相對於參考dCasX蛋白及連接之抑制子域，抑制子融合蛋白對gRNA的K d增加了至少約1.1、至少約1.2、至少約1.3、至少約1.4、至少約1.5、至少約1.6、至少約1.7、至少約1.8、至少約1.9、至少約2、至少約3、至少約4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90或至少約100倍。在一些實施例中，與SEQ ID NO: 2之參考CasX蛋白之催化失活變異體相比，dCasX變異體對gRNA之結合親和力提高約1.1至約10倍。
在一些實施例中，連接有抑制子域之dCasX對gRNA之親和力提高使得核糖核蛋白複合物在遞送至哺乳動物細胞(包括活體內遞送至個體)時之穩定性提高。在遞送至個體時，此增加之穩定性可影響複合物在個體細胞中之功能及效用，以及使得血液中之藥物動力學特性有所改良。在一些實施例中，抑制子融合蛋白之親和力增加及核糖核蛋白複合物之穩定性增加允許較低劑量之抑制子融合蛋白遞送至個體或細胞，同時仍具有所需活性；例如活體內或活體外基因抑制及/或表觀遺傳修飾。可使用本領域中已知之活體外分析來評估形成RNP且使其保持穩定形式之能力的提高。
在一些實施例中，當dCasX變異體蛋白及gRNA均保留RNP複合物中時，dCasX變異體蛋白及連接子抑制子域對gRNA之較高親和力(更緊密結合)允許更大量之抑制及/或表觀遺傳修飾事件。可使用本文所描述之分析來評估抑制事件之增加。
量測抑制子融合蛋白對gRNA之結合親和力的方法包括使用經純化抑制子融合蛋白及gRNA的活體外方法。若gRNA或抑制子融合蛋白經螢光團標識，則可藉由螢光偏振量測抑制子融合蛋白之結合親和力。或者或另外，結合親和力可藉由生物層干涉量測法、電泳遷移率變動分析(EMSA)或過濾結合量測。定量RNA結合蛋白，諸如本發明之參考dCasX及變異體蛋白對特定gRNA，諸如參考gRNA及其變異體之絕對親和力的額外標準技術包括但不限於等溫量熱法(ITC)及表面電漿子共振(SPR)。 e.對目標核酸序列之改良特異性
在一些實施例中，包含連接有抑制子域之dCasX變異體蛋白之抑制子融合蛋白相對於連接有抑制子域之參考dCasX蛋白具有改良的對目標核酸序列的特異性，該目標核酸序列與gRNA之靶向序列互補。如本文所用，「特異性」有時稱為「目標特異性」，係指CRISPR/Cas系統核糖核蛋白複合物結合與該目標核酸序列類似但與其不相同之脫靶序列的程度；例如相對於連接有抑制子域之參考dCasX之RNP，具有較高特異性程度之抑制子融合蛋白RNP將展現序列之減少的脫靶甲基化。抑制子融合蛋白之特異性及潛在有害脫靶效應之減少可為極其重要的，以便達成用於哺乳動物個體之可接受治療指數。
不希望受理論所束縛，可增加抑制子融合蛋白對目標核酸股之特異性的螺旋形I及II域中之胺基酸變化總體上可增加抑制子融合蛋白對目標核酸之特異性。在一些實施例中，增加抑制子融合蛋白對於目標核酸之特異性的胺基酸改變亦可引起抑制子融合蛋白對於DNA之親和力降低，但組合物之總體益處及安全性增強。 f.具有其他異源蛋白質之抑制子融合蛋白
包含一或多種與抑制子融合蛋白質融合之異源蛋白質的抑制子融合蛋白質亦涵蓋在本發明之範疇內。此包括抑制子融合蛋白，其包含與異源蛋白質或其域之N端或C端融合。在一些實施例中，抑制子融合蛋白質融合至一或多種具有不同相關活性之蛋白質或其域。
在一些情況下，供與抑制子融合蛋白一起使用之異源多肽(融合搭配物)提供次細胞定位，亦即異源多肽含有次細胞定位序列(例如用於靶向至細胞核之核定位信號(NLS)；保持融合蛋白在細胞核之外的序列，例如核輸出序列(NES)；保持融合蛋白留存於細胞質中之序列；用於靶向至粒線體之粒線體定位信號；用於靶向至葉綠體之葉綠體定位信號；ER保留信號；及其類似物)。
在一些情況下，抑制子融合蛋白包括核定位信號(NLS) (與該核定位信號融合)。在一些情況下，抑制子融合蛋白質融合至2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、或5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個NLS。在一些情況下，一或多個NLS (2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個或5個或更多個NLS)定位於抑制子融合蛋白之N端及/或C端處或附近(例如50個胺基酸內)。在一些情況下，一或多個NLS (2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個或5個或更多個NLS)定位於抑制子融合蛋白之N端處或附近(例如50個胺基酸內)。在一些情況下，一或多個NLS (2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個或5個或更多個NLS)定位於抑制子融合蛋白之C端處或附近(例如50個胺基酸內)。在一些情況下，一或多個NLS (3個或更多個、4個或更多個或5個或更多個NLS)定位於抑制子融合蛋白之N端及C端處或附近(例如50個胺基酸內)。在一些情況下，單個NLS定位於抑制子融合蛋白之N端且單個NLS定位於C端。一般技術者應瞭解，蛋白質N端或C端處或其附近之NLS可在N端或C端之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸內。在一些實施例中，連接至dCasX或抑制子融合蛋白之N端之NLS與連接至C端之NLS相同。在其他實施例中，連接至dCasX或抑制子融合蛋白之N端的NLS與連接至C端的NLS不同。抑制子融合蛋白與NLS之代表性組態展示於圖1及圖2中。在一些實施例中，適合用於本發明之系統中之抑制子融合蛋白的NLS包含與衍生自以下之序列具有至少約85%、至少約90%或至少約95%一致性或與其相同之序列：猿猴病毒40 (SV40)病毒大T抗原的NLS，具有胺基酸序列PKKKRKV (SEQ ID NO:30)；來自核質蛋白的NLS (例如具有序列KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO:31)的核質蛋白二分NLS；具有胺基酸序列PAAKRVKLD (SEQ ID NO:32)或RQRRNELKRSP (SEQ ID NO: 33)的c-MYC NLS。在一些實施例中，連接至抑制子融合蛋白之N端之NLS係選自由如表3中所闡述之N端序列組成之群。在一些實施例中，連接至抑制子融合蛋白之C端的NLS係選自由如表4中所闡述之C端序列組成之群。在一些實施例中，適用於本發明之系統中之抑制子融合蛋白的NLS包括與表3或表4之一或多個序列具有至少約80%、至少約90%或至少約95%一致性或與其相同的序列。熟習此項技術者應理解，表3及表4將NLS序列呈現為例示性實施例之N端或C端。表3或表4中之NLS中之任一者可融合至本文所描述之抑制子融合蛋白之N端或C端。 表 3 ： N 端 NLS 胺基酸序列
NLS 胺基酸序列* SEQ ID NO
PKKKRKVSR 34
PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVSR 35
PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVSR 36
PAAKRVKLDSR 37
PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDSR 38
PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDSR 39
PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDSR 40
KRPAATKKAGQAKKKKSR 41
KRPAATKKAGQAKKKKGGS KRPAATKKAGQAKKKKSR 42
PAAKRVKLDGGS PKKKRKVSR 43
PAAKKKKLDGGS PKKKRKVSR 44
PAAKKKKLDSR 45
PAAKKKKLDGGS PAAKKKKLDGGS PAAKKKKLDSR 46
PAAKKKKLDGGS PAAKKKKLDGGS PAAKKKKLDGGS PAAKKKKLDSR 47
PAKRARRGYKCSR 48
PAKRARRGYKCGS PAKRARRGYKCSR 49
PRRKREESR 50
PYRGRKESR 51
PLRKRPRRSR 52
PLRKRPRRGS PLRKRPRRSR 53
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVGGS 54
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVPPPPG 55
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVGIHGVPAAPG 56
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVGGGSGGGSPG 57
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVPGGGSGGGSPG 58
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVAEAAAKEAAAKEAAAKAPG 59
PAAKRVKLDGGS PKKKRKVGGS 60
PAAKRVKLDPPP PKKKRKVPG 61
PAAKRVKLDPG 62
PAAKRVKLDGGGSGGGSGGGS 63
PAAKRVKLDPPP 64
PAAKRVKLDGGGSGGGSGGGSPPP 65
PKKKRKVPPP 66
PKKKRKVGGS 67
* 粗體的殘基為NLS殘基，而非粗體的殘基為連接子。 表 4 ： C 端 NLS 胺基酸序列
NLS 胺基酸序列 SEQ ID NO
GS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKV 68
GS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKV 69
GS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLD 70
GS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLD 71
GS KRPAATKKAGQAKKKK 72
KRPAATKKAGQAKKKKGGS KRPAATKKAGQAKKKK 73
GS KLGPRKATGRWGS 74
GS KRKGSPERGERKRHWGS 75
GS PKKKRKVGSGS KRPAATKKAGQAKKKKLE 76
GP KRTADSQHSTPPKTKRKVEFE PKKKRKV 77
GGGSGGGS KRTADSQHSTPPKTKRKVEFE PKKKRKV 78
AEAAAKEAAAKEAAAKA KRTADSQHSTPPKTKRKVEFE PKKKRKV 79
GPPKKKRKVGGS KRTADSQHSTPPKTKRKVEFE PKKKRKV 80
GPAEAAAKEAAAKEAAAKA PAAKRVKLD 81
GPGGGSGGGSGGGS PAAKRVKLD 82
GP PAAKRVKLD 83
VGS KRPAATKKAGQAKKKK 84
TGGGPGGGAAAGSGS PKKKRKVGSGS KRPAATKKAGQAKKKKLE 85
TGGGPGGGAAAGSGS PKKKRKVGSGS 86
PPP PKKKRKVPPP 87
GGS PKKKRKVPPP 88
PPP PKKKRKV 89
GGS PKKKRKV 90
GGS PKKKRKVGGSGGSGGS 91
GGS PKKKRKVGGSPKKKRKV 92
GGSGGSGGS PKKKRKVGGS PKKKRKV 93
VGGGSGGGSGGGS PAAKRVKLD 94
VPPP PAAKRVKLD 95
VPPPGGGSGGGSGGGS PAAKRVKLD 96
VGS PAAKRVKLD 97
在一些實施例中，一或多個NLS用連接子肽連接至抑制子融合蛋白或相鄰NLS，其中連接子肽係選自由以下組成之群：SR、GS、GP、VGS、GGS、(G)n (SEQ ID NO: 98)、(GS)n (SEQ ID NO: 99)、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 100)、(GGSGGS)n (SEQ ID NO: 101)、(GGGS)n (SEQ ID NO: 102)、GGSG (SEQ ID NO: 103)、GGSGG (SEQ ID NO: 104)、GSGSG (SEQ ID NO: 105)、GSGGG (SEQ ID NO: 106)、GGGSG (SEQ ID NO: 107)、GSSSG (SEQ ID NO: 108)、GPGP (SEQ ID NO: 109)、GGP、PPP、VPPP、PPAPPA (SEQ ID NO: 110)、PPPG (SEQ ID NO: 111)、PPPGPPP (SEQ ID NO: 112)、PPP(GGGS)n (SEQ ID NO: 113)、(GGGS)nPPP (SEQ ID NO: 114)、AEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 115)、VPPPGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 116)、TGGGPGGGAA AGSGS (SEQ ID NO: 117)、GGGSGGGSGGGSPPP (SEQ ID NO: 118)、TPPKTKRKVEFE (SEQ ID NO: 119)、GGSGGGS (SEQ ID NO: 120)、GSGSGGG (SEQ ID NO: 121)、SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH (SEQ ID NO: 122)、GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE (SEQ ID NO: 123)及GGSGGG (SEQ ID NO: 124)，其中n為1至5。
一般而言，NLS (或多個NLS)具有足以驅動LTRP融合蛋白在真核細胞之細胞核中之積聚的強度。可藉由任何適合之技術進行細胞核中之積聚的偵測。舉例而言，可偵測標記物可與LTRP融合蛋白融合，使得可觀測到細胞內之位置。亦可自細胞分離細胞核，可隨後藉由任何適合用於偵測蛋白質之方法，諸如免疫組織化學、西方墨點法或酶活性分析來分析其內容物。亦可間接地確定細胞核中之積聚。 IV.        抑制子域
在一些實施例中，本發明提供抑制子融合蛋白及包含其之系統，該等抑制子融合蛋白包含連接至多個抑制子域之DNA結合蛋白(抑制子融合蛋白)，其中該系統能夠結合至 PCSK9之目標核酸且抑制PCSK9目標核酸之轉錄，包括藉由表觀遺傳修飾目標核酸。用於抑制子融合蛋白之例示性DNA結合蛋白包括鋅指(ZF)、TALE (轉錄活化子樣效應子)蛋白及DNA結合蛋白，諸如催化失活CRISPR蛋白。
在一些實施例中，本發明提供抑制子融合蛋白，其包含與 PCSK9之目標核酸序列互補之靶向序列的引導核糖核酸(gRNA)複合時連接至多個抑制子域的催化失活CRISPR蛋白(諸如dCasX)，其中該系統能夠結合至 PCSK9之目標核酸且抑制 PCSK9目標核酸之轉錄及/或表觀遺傳修飾。減少轉錄之基因抑制過程之實例包括(但不限於)抑制轉錄起始複合物之形成的過程、降低轉錄起始速率的過程、降低轉錄延伸速率的過程、降低轉錄持續力的過程及拮抗轉錄活化(例如藉由阻斷轉錄活化蛋白之結合)的過程。基因抑制可構成例如活化防止以及低於現有量之表現抑制。轉錄抑制包括基因轉錄之可逆及不可逆失活兩者；後者可由目標核酸之表觀遺傳修飾產生。
在能夠抑制基因或使基因沉默的抑制子域當中，Krüppel相關盒(KRAB)抑制子域在人類基因體系統中最為有效(Alerasool, N.等人, An efficient KRAB domain for CRISPRi applications. Nat. Methods 17:1093 (2020))。KRAB域存在於大約400個基於人類鋅指蛋白在轉錄因子中，其能夠在連接之dCasX與目標核酸結合時募集額外的抑制子域，諸如但不限於Trim28 (亦稱為Kap1或Tif1-β)，該等抑制子域繼而與諸如CBX5/HP1α及SETDB1之染色質調控因子組裝蛋白質複合物，誘導基因轉錄抑制，但該抑制亦有時間限制的。適用於本發明之系統的KRAB域之代表性非限制性實例包括ZIM3 (SEQ ID NO: 128)及ZNF10 (SEQ ID NO: 129)。本發明提供來自人類及非人類來源之其他抑制子域，當併入本文所描述之抑制子融合蛋白中時，該等抑制子域已發現與ZIM3及ZNF10相比產生增強的活性。
在一些實施例中，本發明提供系統，其中藉由使用抑制子融合蛋白:gRNA系統賦予之修飾為表觀遺傳的，且因此PCSK9基因之沉默可藉由除複製已經編輯之目標核酸以外的機制遺傳。如本文所用，「表觀遺傳修飾」意謂對DNA或與DNA相關之組蛋白之修飾，而非DNA序列本身之變化(例如取代、缺失或重排)，其中修飾為藉由系統之組分直接修飾或藉由募集一或多種額外細胞組分間接修飾，但其中DNA目標核酸序列本身未經編輯以改變序列。舉例而言，DNA甲基轉移酶3A (DNMT3A) (或其催化域)直接藉由甲基化DNA而修飾DNA，而KRAB募集充當強效轉錄抑制子之KAP-1/TIF1β輔抑制子複合物且可進一步募集與DNA甲基化及抑制染色質形成相關的因子，諸如異染色質蛋白1 (HP1)、組蛋白去乙醯酶及組蛋白甲基轉移酶(Ying, Y.等人, The Krüppel-associated box repressor domain induces reversible and irreversible regulation of endogenous mouse genes by mediating different chromatin states. Nucleic Acids Res. 43(3): 1549 (2015))。此外，無催化活性DNMT3L輔因子連同細胞之內源性DNMT1幫助在DNA複製之後建立可遺傳甲基化模式。已知DNMT3A之ATRX-DNMT3-DNMT3L域(ADD)具有兩個關鍵功能：1)其藉由充當甲基轉移酶自身抑制域來異位調節DNMT3A之催化活性；及2)其與離胺酸(K) 4處未甲基化之組蛋白H3尾部特異性相互作用，導致與K4處未甲基化之染色質H3尾部結合的DNA優先甲基化(Zhang, Y.等人, Chromatin methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3a/3L is guided by interaction of the ADD domain with the histone H3 tail. Nucleic Acids Research 38:4246 (2010))。
在一些實施例中，抑制子融合蛋白(或編碼抑制子融合蛋白之mRNA)包含連接至第一、第二、第三及第四抑制子域之DNA結合蛋白，其中抑制子域中之各者不同。在一些實施例中，DNA結合蛋白為可結合目標核酸但不裂解目標核酸之TALE。在一些實施例中，DNA結合蛋白為可結合目標核酸但不裂解目標核酸之鋅指蛋白。在一些實施例中，DNA結合蛋白為可以結合目標核酸但不裂解目標核酸之催化失活CRISPR蛋白。在一些實施例中，抑制子融合蛋白(或編碼抑制子之mRNA)包含催化失活CasX序列、第一抑制子域(下文中稱為「RD1」)、作為第二域的DNMT3A催化域(下文中稱為「DNMT3A」)、作為第三域的DNMT3L相互作用域(下文中稱為「DNMT3L」)以及作為第四域的ATRX-DNMT3-DNMT3L域(下文中稱為「ADD」)。在一些實施例中，ADD融合至DNMT3A之N端。在一些實施例中，抑制子融合蛋白質包含本文所描述之第一及第二NLS及一或多個連接子肽，且融合蛋白能夠與結合至目標核酸之系統的gRNA形成RNP。
已發現，當在抑制子融合蛋白中相對於dCasX以所選方向組態前述域時，當與具有與 PCSK9基因之規定區域互補的靶向序列的gRNA複合時，前述域的使用導致 PCSK9目標核酸的明顯表觀遺傳修飾，且抑制子域的組合會同步發揮作用，從而視組態而定，對目標基因的轉錄沉默產生累加或協同作用。在前述一個實施例中，抑制子融合蛋白之dCasX包含選自由SEQ ID NO: 4-29組成之群的序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性的序列。在前述另一實施例中，抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含選自由SEQ ID NO: 128-1726組成之群的序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性的序列。在前述另一實施例中，抑制子融合蛋白之RD1包含選自由SEQ ID NO: 130-224組成之群的序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性的序列。在前述另一實施例中，抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含選自由SEQ ID NO: 130-138組成之群的序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性的序列。在前述另一實施例中，抑制子融合蛋白之RD1包含選自由SEQ ID NO: 135組成之群的序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性的序列。在前述另一實施例中，抑制子融合蛋白之RD1包含選自由SEQ ID NO: 131組成之群的序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性的序列。在前述另一實施例中，抑制子融合蛋白之第二抑制子域為DNMT3A，其包含SEQ ID NO: 126之序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性的序列。在前述另一實施例中，抑制子融合蛋白之第三抑制子域為DNMT3L，其包含SEQ ID NO: 127之序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性的序列。在前述另一實施例中，抑制子融合蛋白之第四抑制子域為ADD，其包含SEQ ID NO: 125之序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性的序列。在出人意料的發現中，已發現與缺乏ADD之抑制子融合蛋白相比，將ADD添加至包含RD1、DNMT3A及DNMT3L之抑制子融合蛋白中可大大增強或增加目標核酸之長期抑制及/或表觀遺傳修飾，以及抑制之特異性。包含ADD之抑制子融合蛋白之經改良抑制及特異性的例示性資料呈現於實例中。包含ADD之抑制子融合蛋白之例示性組態呈現於圖2中。
在一些實施例中，本發明提供一種抑制子融合蛋白之系統，其包含可操作地連接至dCasX的第一、第二、第三及第四抑制子域，該dCasX包含SEQ ID NO: 4之序列，或與其具有至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列，其中RD1包含一或多種選自由以下組成之群的模體：a) PX 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 EX 7 ，其中X 1為A、D、E或N，X 2為L或V，X 3為I或V，X 4為S、T或F，X 5為H、K、L、Q、R或W，X 6為L或M，及X 7為G、K、Q或R；b) X 1X 2X 3X 4GX 5X 6X 7X 8X 9，其中X 1為L或V，X 2為A、G、L、T或V，X 3為A、F或S，X 4為L或V，X 5為C、F、H、I、L或Y，X 6為A、C、P、Q或S，X 7為A、F、G、I、S或V，X 8為A、P、S或T，及X 9為K或R；c) QX 1X 2LYRX 3VMX 4(SEQ ID NO: 1727)，其中X 1為K或R，X 2為A、D、E、G、N、S或T，X 3為D、E或S，及X 4為L或R；d) X 1X 2X 3FX 4DVX 5X 6X 7FX 8X 9X 10X 11(SEQ ID NO: 1728)，其中X 1為A、L、P或S，X 2為L或V，X 3為S或T，X 4為A、E、G、K或R，X 5為A或T，X 6為I或V，X 7為D、E、N或Y，X 8為S或T，X 9為E、P、Q、R或W，X 10為E或N，及X 11為E或Q；e) X 1X 2X 3PX 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10，其中X 1為E、G或R，X 2為E或K，X 3為A、D或E，X 4為C或W，X 5為I、K、L、M、T或V，X 6為I、L、P或V，X 7為D、E、K或V，X 8為E、G、K、P或R，X 9為A、D、R、G、K、Q或V，及X 10為D、E、G、I、L、R、S或V；f) LYX 1X 2VMX 3EX 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10(SEQ ID NO: 1729)，其中X 1為K或R，X 2為D或E，X 3為L、Q或R，X 4為N或T，X 5為F或Y，X 6為A、E、G、Q、R或S，X 7為H、L或N，X 8為L或V，X 9為A、G、I、L、T或V，及X 10為A、F或S；g) FX 1DVX 2X 3X 4FX 5X 6X 7EWX 8(SEQ ID NO: 1730)，其中X 1為A、E、G、K或R，X 2為A、S或T，X 3為I或V，X 4為D、E、N或Y，X 5為S或T，X 6為E、L、P、Q、R或W，X 7為D或E，及X 8為A、E、G、Q或R；h) X 1PX 2X 3X 4X 5X 6LEX 7X 8X 9X 10X 11X 12，其中X 1為K或R，X 2為A、D、E或N，X 3為I、L、M或V，X 4為I或V，X 5為F、S或T，X 6為H、K、L、Q、R或W，X 7為K、Q或R，X 8為E、G或R，X 9為D、E或K，X 10為A、D或E，X 11為L或P，及X 12為C或W；及i) X 1LX 2X 3X 4QX 5X 6，其中X 1為C、H、L、Q或W，X 2為D、G、N、R或S，X 3為L、P、S或T，X 4為A、S或T，X 5為K或R，及X 6為A、D、E、K、N、S或T；或包含第一及第二模體，其中該第一胺基酸序列模體包含a) LYX 1X 2VMX 3EX 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10(SEQ ID NO: 1729)，其中(i) X 1為K或R、(ii) X 2為D或E、(iii) X 3為L、Q或R、(iv) X 4為N或T、(v) X 5為F或Y、(vi)  X 6為A、E、G、Q、R或S、(vii) X 7為H、L或N、(viii) X 8為L或V、(ix) X 9為A、G、I、L、T或V，及(x) X 10為A、F或S；及b)該第二胺基酸序列模體包含FX 1DVX 2X 3X 4FX 5X 6X 7EWX 8(SEQ ID NO: 1730)，其中(i) X 1為A、E、G、K或R、(ii) X 2為A、S或T、(iii) X 3為I或V、(iv) X 4為D、E、N或Y、(iv) X 5為S或T、(v) X 6為E、L、P、Q、R或W、(vi) X 7為D或E，及(vii) X 8為A、E、G、Q或R；或包含選自由以下組成之群的胺基酸序列模體：a) DVAVYFSPEEWGCL (SEQ ID NO: 2945)；b) X 1X 2X 3QX 4X 5LY，其中(i) X 1為A、D、G、N、R或S、(ii) X 2為P、S或T、(iii) X 3為A、S或T、(iv) X 4為K或R，及(v) X 5為A、D、K、N、S或T；c)  X 1KPX 2X 3X 4X 5X 6，其中(i) X 1為A、P或S、(ii) X 2為A、D或E、(iii) X 3為L、M或V、(iv) X 4為I或V、(v) X 5為F、S或T，及(vi) X 6為H、K、L、Q、R或W；d) LEX 1X 2X 3X 4X 5X 6，其中(i) X 1為E、K、Q或R、(ii) X 2為E、G或R、(iii) X 3為A、D、E或K、(iv) X 4為A、D或E、(v) X 5為L或P，及(vi) X 6為C或W；及e) X 1VMLEX 2YX 3X 4X 5X 6SX 7X 8X 9(SEQ ID NO: 2946)，其中(i) X 1為D或E、(ii) X 2為N或T、(iii) X 3為A、E、G、Q、R或S、(iv) X 4為H或N、(v)  X 5為L、M或V、(vi) X 6為A、L或V、(vii) X 7為L或V、(ix) X 8為A、G或V，及(x) X 9為C、F或L，且第二抑制子域為DNMT3A序列，其包含SEQ ID NO: 126之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列變異體，第三抑制子為DNMT3L，其包含SEQ ID NO: 127之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列變異體，且四抑制子為ADD，其包含SEQ ID NO: 125之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列變異體，其中融合蛋白包含一或多種本文所描述之連接子肽，且其中融合蛋白能夠與系統中結合於目標核酸之gRNA形成RNP。在前述一些實施例中，RD1包含選自由SEQ ID NO: 130-1726組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列，且第二抑制子域為DNMT3A序列，其包含SEQ ID NO: 126之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列變異體，第三抑制子為DNMT3L，其包含SEQ ID NO: 127之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列變異體，且四抑制子為ADD，其包含SEQ ID NO: 125之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列變異體，其中融合蛋白包含一或多種本文所描述之連接子肽，且其中融合蛋白能夠與系統中結合於目標核酸之gRNA形成RNP。在前述其他實施例中，第一RD1包含選自由SEQ ID NO: 130-224組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列。在前述其他實施例中，第一RD1包含選自由SEQ ID NO: 130-138組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列。在前述其他實施例中，第一RD1包含SEQ ID NO: 135之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列。在前述其他實施例中，第一RD1包含SEQ ID NO: 131之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列。在前述實施例中，融合蛋白可包含第一及第二NLS，其包含選自由SEQ ID NO: 30-97組成之群的序列；及一或多種連接子肽，其包含選自由SEQ ID NO: 98-124組成之群的序列，如表5中所闡述。在該段落之前述實施例中，抑制子融合蛋白能夠與能夠結合至基因目標核酸之系統的gRNA形成RNP複合物。
熟習此項技術者應瞭解，包含上文所描述之模體、具有一或多個對模體之保守取代的RD1蛋白亦可充當RD1域且設想為在本發明之範疇內。
在一些實施例中，抑制子融合蛋白自N端至C端包含RD1、ADD、DNMT3A、DNMT3L及DNA結合蛋白。在一些實施例中，抑制子融合蛋白自N端至C端包含RD1、ADD、DNMT3A、DNMT3L及催化失活CRISPR蛋白。在一些實施例中，抑制子融合蛋白質自N端至C端包含RD1、ADD、DNMT3A、DNMT3L及dCasX。
在一些實施例中，抑制子融合蛋白自N端至C端包含ADD、DNMT3A、DNMT3L、RD1及DNA結合蛋白。在一些實施例中，抑制子融合蛋白自N端至C端包含ADD、DNMT3A、DNMT3L、RD1及催化失活CRISPR蛋白。在一些實施例中，抑制子融合蛋白質自N端至C端包含ADD、DNMT3A、DNMT3L、RD1及dCasX。
在一些實施例中，抑制子融合蛋白具有以下之N端至C端之組態：NLS-ADD-DNMT3A-DNMT3L-dCasX-RD1-NLS、NLS-dCasX-RD1-NLS- ADD-DNMT3A-DNMT3L、NLS- dCasX- ADD-DNMT3A- DNMT3L- RD1-NLS)、NLS-RD-ADD-DNMT3A-DNMT3L- dCasX-NLS或NLS-ADD-DNMT3A-DNMT3L-RD1-dCasX- NLS。在前述任一者中，可將連接子肽插入ADD、DNMT3A、DNMT3L、RD1或dCasX域中之一或多者之間。
在一些實施例中，抑制子融合蛋白具有以下之N端至C端之組態：組態1 (NLS-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子1-連接子3A-dCasX-連接子3B-RD1-NLS)、組態2 (NLS-連接子3A-dCasX-連接子3B-RD1-NLS-連接子1-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L)、組態3 (NLS-連接子3A-dCasX-連接子1-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子3B-RD1-NLS)、組態4 (NLS-RD1-連接子3A-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子1-dCasX-連接子3B-NLS)或組態5 (NLS-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子3A-RD1-連接子1-dCasX-連接子3B-NLS)。在一些實施例中，抑制子融合蛋白具有以下之N端至C端之組態：組態1' (NLS-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子1-連接子3A-dCasX-連接子3B-RD1-NLS)、組態2' (NLS-連接子3A-dCasX-連接子3B-RD1-NLS-連接子1-DNMT3A-連接子2-DNMT3L)、組態3' (NLS-連接子3A-dCasX-連接子1-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子3B-RD1-NLS)、組態4' (NLS-RD1-連接子3A-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子1-dCasX-連接子3B-NLS)或組態5' (NLS-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子3A-RD1-連接子1-dCasX-連接子3B-NLS)。熟習此項技術者應瞭解組態1'至5'對應於無ADD域之組態1至5。在系統之一些實施例中，系統之融合蛋白組分如圖1或圖2中所示意性描繪而組態。在組態1至5或1'至5'之前述實施例中，NLS包含選自由SEQ ID NO: 30-97組成之群的序列且連接子序列獨立地選自由如表5中所闡述之SEQ ID NO: 98-124組成之群。在一些實施例中，連接子序列係獨立地選自由SEQ ID NO 120-123組成之群。在一些實施例中，連接子1包含SEQ ID NO: 123之序列。在一些實施例中，連接子2包含SEQ ID NO: 122之序列。在一些實施例中，連接子3A及/或連接子3B包含SEQ ID NO: 120之序列。在一些實施例中，連接子4包含SEQ ID NO: 121之序列。 表 5 ： LTRP 融合蛋白之例示性連接子胺基酸序列
胺基酸序列* SEQ ID NO
(G)n 98
(GS)n 99
(GSGGS)n 100
(GGSGGS)n 101
(GGGS)n 102
GGSG 103
GGSGG 104
GSGSG 105
GSGGG 106
GGGSG 107
GSSSG 108
GPGP 109
PPAPPA 110
PPPG 111
PPPGPPP 112
PPP(GGGS)n 113
(GGGS)nPPP 114
AEAAAKEAAAKEAAAKA 115
VPPPGGGSGGGSGGGS 116
TGGGPGGGAAAGSGS 117
GGGSGGGSGGGSPPP 118
TPPKTKRKVEFE 119
GGSGGGS 120
GSGSGGG 121
SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH 122
GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE 123
GGSGGG 124
*n為1至5
在抑制子融合蛋白及包含其之系統之一些實施例中，抑制子融合蛋白包含DNA結合蛋白、經組態為選自由以下前述組態組成之群的第一、第二、第三及第四抑制子域：組態1、組態2、組態3、組態4、組態5、組態1'、組態2'、組態3'、組態4'、組態5'，在結合抑制子融合蛋白與具有與細胞中之 PCSK9目標核酸互補之靶向序列的gRNA的RNP後，目標核酸經表觀遺傳修飾且抑制 PCSK9基因之轉錄。在一些實施例中，當在活體外分析(包括基於細胞之分析)中進行分析時，與未處理之細胞或經包含非靶向間隔子的可比較系統處理之細胞相比， PCSK9基因之轉錄抑制至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少99%。最佳地， PCSK9基因抑制引起基因表現之完全抑制，使得無可偵測基因產物。在一些實施例中，至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、或至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或更多的由抑制子融合蛋白:gRNA系統靶向之群體的細胞的 PCSK9基因的轉錄經抑制。
在一些實施例中，當在活體外分析(包括基於細胞之分析)中分析時， PCSK9基因之轉錄之抑制持續至少約8小時、至少約1天、至少約7天、至少2週、至少約3週、至少約1個月或至少約2個月。在一些實施例中，當以治療有效劑量投與組合物時，個體之所靶向之細胞中的PCSK9基因之轉錄之抑制持續至少約7天、至少2週、至少約3週、至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月或至少約6個月，其中個體選自由以下組成之群：小鼠、大鼠、豬、非人類靈長類動物及人類。在一特定實施例中，在用於抑制子融合蛋白:gRNA系統中時，抑制子融合蛋白組態4及5或4'及5'引起相比於組態1在活體外分析中之較少脫靶甲基化或脫靶活性。在一些實施例中，在用於抑制子融合蛋白:gRNA系統中時，使用抑制子融合蛋白組態4及5或4'及5'在細胞中引起小於約10%、小於約9%、小於約8%、小於約7%、小於約6%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%、小於約1%、小於0.5%或低於0.1%的脫靶甲基化或脫靶活性。 a.編碼LTRP融合蛋白之mRNA組合物
在另一態樣中，本發明係關於信使RNA (mRNA)組合物，其包含編碼本發明之DNA結合蛋白(例如dCasX)及連接子抑制子域融合蛋白(抑制子融合蛋白)之序列。mRNA組合物可用於本發明之抑制子融合蛋白:gRNA系統，以及某些遞送調配物；例如顆粒，諸如脂質奈米顆粒(LNP)。在一些實施例中，組合物經設計以引起抑制子融合蛋白相對於由未經修飾之mRNA編碼之抑制子融合蛋白的表現改良、免疫原性降低、穩定性增加及可製造性增強中之一或多者。在一些實施例中，抑制子融合蛋白經設計以引起可遺傳抑制，其中 PCKS9基因之抑制持續至少1、2、3、4、5或6次或更多次細胞分裂。在一些實施例中，抑制子融合蛋白在活體外分析中分析時引起 PCSK9基因之轉錄抑制，其持續至少約8小時、至少約1天、至少約7天、至少2週、至少約3週、至少約1個月或至少約2個月。本發明亦提供用於設計組合物的方法及遞送組合物的調配物。
mRNA序列之修飾可影響mRNA穩定性、蛋白質轉譯及表現量以及免疫原性，且因此可對基於mRNA之遞送的效力具有顯著影響。編碼序列及非轉譯區(UTR)之最佳化可在遞送編碼所關注蛋白質之mRNA時尤其重要，與將轉錄成mRNA之DNA模板相反。DNA模板壽命長，可以複製，且能在其生命週期中產生許多RNA轉錄物。對於DNA模板而言，轉錄效率及前mRNA加工為蛋白質表現量之決定因素。相比之下，mRNA一般具有短得多的半衰期，約數小時，因為其易受細胞質降解影響，且本身無法產生更多複本。因此，mRNA穩定性及轉譯效率為基於mRNA之遞送的蛋白質表現量之關鍵決定因素，且因此可增強決定mRNA穩定性及轉譯效率之UTR及編碼序列之特定序列，以改良基於mRNA之遞送的功效。
在一些實施例中，本發明提供用於併入至編碼抑制子融合蛋白之mRNA的編碼dCasX 515 (SEQ ID NO: 6)的mRNA，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，本發明提供用於併入至編碼抑制子融合蛋白之mRNA的編碼dCasX 812 (SEQ ID NO: 29)的mRNA，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，本發明提供用於併入至編碼本發明之抑制子融合蛋白之mRNA的編碼dCasX 491 (SEQ ID NO: 4)的mRNA序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，本發明提供用於併入至編碼抑制子融合蛋白之mRNA的編碼dCasX 676 (SEQ ID NO: 28)的mRNA，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，本發明提供一種編碼抑制子融合蛋白之mRNA，該抑制子融合蛋白包含有包含SEQ ID NO: 3122之序列的dCasX 491。
可使用各種天然存在或經修飾核苷來產生根據本發明之mRNA。在一些實施例中，mRNA為或包含：天然核苷(例如腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷)；核苷類似物(例如2-胺基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷、O(6)-甲基鳥嘌呤、假尿苷(例如N-1-甲基-假尿苷)、2-硫代尿苷以及2-硫代胞苷)；經化學修飾之鹼基；經生物修飾之鹼基(例如甲基化鹼基)；插入鹼基；經修飾之糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-去氧核糖、阿拉伯糖以及己醣)；及/或經修飾之磷酸酯基(例如硫代磷酸酯以及5'-N-亞磷醯胺鍵聯)。在一些實施例中，mRNA包含一或多個非標準核苷酸殘基。非標準核苷酸殘基可包括例如5-甲基-胞苷(「5 mC」)、假尿苷(「ψU」)及/或2-硫代-尿苷(「2sU」)。在一特定實施例中，本發明之mRNA之尿苷殘基中之一或多者經N1-甲基-假尿苷置換。參見例如美國專利第8,278,036號或WO2011012316，以引用的方式併入本文中，其用於論述此類殘基及其併入至mRNA中。在一些實施例中，編碼CasX 515之mRNA具有置換序列中之一或多種或所有尿苷之N1-甲基-假尿苷核苷。在一些實施例中，編碼CasX 812之mRNA具有置換序列中之一或多種或所有尿苷之N1-甲基-假尿苷核苷。
在一些實施例中，編碼抑制子融合蛋白的mRNA序列進一步包含5' UTR序列及3' UTR序列。一般熟習此項技術者將能夠選擇適當UTR序列。在一些實施例中，3' UTR包含SEQ ID NO: 3189、3205-3209或3278的序列。在一些實施例中，5' UTR包含SEQ ID NO: 3200-3204或3274的序列。 V.          系統之引導核酸
在另一態樣中，本發明係關於引導核糖核酸(gRNA)，其包含骨架及與 PCSK9基因之目標核酸序列互補(且因此能夠與其雜交)之連接子靶向序列，該gRNA在真核細胞中之PCSK9目標核酸轉錄之抑制中具有效用。如本文所用，術語「gRNA」涵蓋天然存在之分子及gRNA變異體，包括包含來自不同gRNA之域的嵌合gRNA變異體。本發明之gRNA包含骨架及與細胞之目標核酸互補之靶向序列。
在一些實施例中，本發明提供系統，其包含編碼包含dCasX蛋白之抑制子融合蛋白的mRNA以及一或多種gRNA作為抑制子融合蛋白:gRNA系統，該系統在dCasX在經轉染細胞中表現時經設計以與gRNA形成核糖核蛋白(RNP)複合物。RNP靶向且結合於細胞之目標核酸序列中的特定位置以抑制轉錄。gRNA藉由包括靶向序列(或「間隔子」)而為RNP複合物提供目標特異性，該靶向序列包含與目標核酸序列之序列互補的核苷酸序列。系統之抑制子融合蛋白提供部位特異性活性，諸如目標序列之結合及抑制，且藉助於與RNP中之gRNA的結合來引導至目標核酸序列內之目標部位(例如在目標部位處穩定)。
用於 PCSK9目標核酸之抑制及/或表觀遺傳修飾的gRNA以及mRNA及gRNA之調配物的實施例描述於下文中。 a.參考gRNA及gRNA變異體
如本文所用，「參考gRNA」係指包含天然存在之gRNA之野生型序列的CRISPR引導核糖核酸。在一些實施例中，本發明之gRNA骨架可經歷一或多種突變誘發方法，諸如WO2022120095A1及WO2020247882A1 (以引用之方式併入本文中)中所描述之突變誘發方法，其可包括深度突變演變(DME)、深度突變掃描(DMS)、易錯PCR、卡匣突變誘發、隨機突變誘發、交錯延伸PCR、基因改組、域交換或經化學修飾以產生一或多個gRNA變異體，其特性相對於經修飾之gRNA骨架有所增強或改變。衍生出gRNA變異體之gRNA骨架的活性可用作比較gRNA變異體之活性的基準，藉此量測gRNA骨架之功能或其他特徵之改良。
表6提供參考gRNA tracr及骨架序列之序列。在一些實施例中，本發明提供gRNA序列，其中gRNA包含如下序列之骨架，該序列相對於表6之SEQ ID NO: 1731-1743中之任一者之參考gRNA序列具有一或多個核苷酸修飾。 表 6 ：參考 gRNA tracr 及骨架序列
SEQ ID NO. 核苷酸序列
1731 ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAACCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG
1732 UACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAAUCCGAUAAAUAAGAAGCAUCAAAG
1733 ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA
1734 ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGG
1735 UACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA
1736 UACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGG
1737 GUUUACACACUCCCUCUCAUAGGGU
1738 GUUUACACACUCCCUCUCAUGAGGU
1739 UUUUACAUACCCCCUCUCAUGGGAU
1740 GUUUACACACUCCCUCUCAUGGGGG
1741 CCAGCGACUAUGUCGUAUGG
1742 GCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAAUCCGAUAAAUAAGAAGC
1743 GGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGA
b.gRNA域及其功能
本發明之gRNA包含兩個區段：靶向序列及蛋白質結合區段。gRNA之靶向區段包括下文更充分描述之核苷酸序列(可互換地稱為間隔子、靶向子或靶向序列)，其與目標核酸序列(例如雙股目標DNA、目標ssRNA、目標ssDNA之股等)內之特定序列(目標部位)互補(且因此與其雜交)。本發明之上下文中，gRNA之靶向序列能夠結合至目標核酸序列，包括編碼序列、編碼序列之補體、非編碼序列及輔助元件。gRNA之蛋白質結合區段(或「活化子」或「蛋白質結合序列」)與CasX蛋白相互作用(例如與其結合)作為複合物，形成RNP (下文對此進行更全面的描述)。如本文所用，「骨架」係指除靶向序列之外的用於引導之所有部分，其包含若干區，下文對此進行更全面的描述。CasX gRNA (野生型及變異體)之特性及特徵描述於以引用的方式併入本文中的WO2020247882A1、US20220220508A1及WO2022120095A1中。
就參考gRNA而言，gRNA作為雙引導RNA (dgRNA)天然存在，其中靶向子及活化子部分各具有雙螺旋形成區段，其中靶向子之雙螺旋形成區段及活化子之雙螺旋形成區段彼此具有互補性且彼此雜交以形成雙股雙螺旋體(用於gRNA之dsRNA雙螺旋體)。本文所用之以術語「靶向子(targeter)」或「靶向子RNA (targeter RNA)」係指CasX雙引導RNA之crRNA樣分子(crRNA：「CRISPR RNA」) (且因此指當「活化子」及「靶向子」連接在一起(例如藉由插入核苷酸)時，CasX單引導RNA之crRNA樣分子)。crRNA具有與tracrRNA黏合之5'區域，隨後為靶向序列之核苷酸。在用於本發明系統中之gRNA的情況下，骨架經設計以使得活化子及目標部分彼此共價連接(而非彼此雜交)且包含單分子，且可稱為「單分子gRNA (single-molecule gRNA)」、「單引導RNA (single guide RNA)」、「單分子引導RNA (single-molecule guide RNA)」、「獨分子引導RNA(one-molecule guide RNA)」或「sgRNA」。用於系統之本發明之gRNA變異體為所有單分子型式。
總體而言，本發明之經組裝之gRNA包含不同結構化區域或域：RNA三螺旋體、骨架莖環、延伸莖環、假結及在本發明之實施例中對目標核酸具有特異性且位於gRNA之3'端上的靶向序列。RNA三螺旋體、骨架莖環、假結及延伸莖環連同橋接三螺旋體部分之非結構化三螺旋體環一起稱為gRNA之「骨架」。在一些情況下，骨架莖進一步包含泡。在其他情況下，骨架進一步包含三螺旋體環區。在其他情況下，骨架進一步包含5'非結構化區。在一些實施例中，用於抑制子融合蛋白:gRNA系統之本發明之gRNA骨架包含具有CCAGCGACUAUGUCGUAGUGG (SEQ ID NO: 1822)之序列或與其具有至少1、2、3、4或5個錯配之序列的骨架莖環。
結構化域中之各者對建立引導物之整體RNA摺疊且保留引導物之功能；尤其與dCasX蛋白恰當地複合之能力至關重要。舉例而言，引導骨架莖與dCasX蛋白之螺旋形I域相互作用，而三螺旋體、三螺旋體環及假結莖內之殘基與dCasX蛋白之OBD相互作用。總之，此等相互作用賦予引導物結合且與dCasX形成RNP之能力，該dCasX保留穩定性，而間隔子(或靶向序列)導引且限定RNP結合DNA之特定序列的特異性。
藉由dCasX蛋白之目標核酸序列(例如基因體DNA)之部位特異性結合可發生在藉由gRNA之靶向序列與目標核酸序列之間的鹼基配對互補測定之一或多個位置(例如目標核酸之序列)處。因此，舉例而言，本發明之gRNA具有與鄰近與TC原間隔子相鄰模體(PAM)模體或PAM序列(諸如ATC、CTC、GTC或TTC)互補之序列的目標核酸互補且因此可與該目標核酸雜交的序列。因為引導序列之靶向序列與目標核酸序列之序列雜交，所以只要考慮PAM序列之位置，靶向序列可由使用者修飾以與特異性目標核酸序列雜交。在一些實施例中，為設計靶向序列，目標核酸包含定位於靶向序列的5'處的PAM序列，該PAM序列具有至少一個單核苷酸將PAM與目標核酸中的第一核苷酸(其與靶向序列之第一核苷酸互補)分離開。在一些實施例中，PAM位於目標區域之非靶向股，亦即與目標核酸互補之股上。在一些實施例中，gRNA之靶向序列與距ATC PAM序列一個核苷酸的目標核酸序列互補。在一些實施例中，gRNA之靶向序列與距CTC PAM序列一個核苷酸的目標核酸序列互補。在一些實施例中，gRNA之靶向序列與距GTC PAM序列一個核苷酸的目標核酸序列互補。在一些實施例中，gRNA之靶向序列與距TTC PAM序列一個核苷酸的目標核酸序列互補。藉由選擇gRNA之靶向序列，可使用本文所描述之抑制子融合蛋白:gRNA系統抑制目標核酸序列的限定區或歸類目標核酸內之特定位置之序列。在一些實施例中，gRNA之靶向序列具有15至20個連續核苷酸。在一些實施例中，靶向序列具有15、16、17、18、19及20個連續核苷酸。在一些實施例中，靶向序列由20個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由19個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由18個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由17個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由16個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由15個連續核苷酸組成。藉由選擇gRNA之靶向序列，可使用本文所描述之抑制子融合蛋白:gRNA系統抑制及/或表觀遺傳修飾目標核酸序列之限定區。
本發明之基因抑制子系統可設計成靶向尋求轉錄抑制的 PCSK9基因或 PCSK9基因區域之任何區域或接近該基因或基因區域之任何區域。當要抑制整個基因時，本發明考慮設計具有與涵蓋或接近轉錄起始部位(TSS)之序列互補的靶向序列的引導物。視啟動子序列及起始受質濃度而定，TSS選擇發生在啟動子區內的不同位置。核心啟動子充當用於轉錄機制之結合平台，其包含Pol II及其相關通用轉錄因子(general transcription factor；GTF) (Haberle, V.等人, Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation (Nat Rev Mol Cell Biol. 19(10):621 (2018))。已提出TSS選擇之變化性涉及DNA『蜷縮(scrunching)』及『反蜷縮』，其標誌為：(i)RNA聚合酶前邊緣而非後邊緣相對於DNA之向前及反向移動，及(ii)轉錄泡之膨脹及收縮。在一些實施例中，與抑制子融合蛋白:gRNA系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因中轉錄起始部位(TSS)之1 kb內。在一些實施例中，與系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之TSS上游20 bp、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp、1 kb或1.5 kb內。在一些實施例中，與系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之TSS下游20 bp、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp、1 kb或1.5 kb內。在一些實施例中，與系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之TSS上游1.5 kb至下游1.5、上游1 kb至下游1 kb、上游500 bp至下游500 bp、或上游300 bp至下游300 bp、或上游100 bp至下游100 bp內。在一些實施例中，與系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之強化子的20 bp、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp、1 kb或1.5 kb內。在一些實施例中，與系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之3'至5'非轉譯區之1 kb內。在其他實施例中，與系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之開放閱讀框內，包括內含子(若存在)。在一些實施例中，本發明之系統之gRNA的靶向序列設計成對 PCSK9基因之外顯子具有特異性。在一特定實施例中，本發明之系統之gRNA的靶向序列設計成對 PCSK9基因之外顯子1具有特異性。在其他實施例中，本發明之系統之gRNA的靶向序列設計成對 PCSK9基因之內含子具有特異性。在其他實施例中，本發明之系統之gRNA的靶向序列經設計以對 PCSK9基因之內含子-外顯子接合點具有特異性。在其他實施例中，本發明之系統之gRNA的靶向序列設計成對 PCSK9基因之調節元件具有特異性。在其他實施例中，本發明之系統之gRNA的靶向序列設計成與 PCSK9基因之基因間區的序列互補。在其他實施例中，本發明之系統之gRNA的靶向序列設計成對 PCSK9基因之外顯子、內含子及/或調節元件之接合點具有特異性。在靶向序列對調節元件具有特異性之彼等情況下，此類調節元件包括(但不限於)啟動子區、強化子區、基因間區、5'非轉譯區(5' UTR)、3'非轉譯區(3' UTR)、保守元件及包含順式調節元件之區。啟動子區意欲涵蓋編碼序列之起始點之5 kb內的核苷酸，或在基因強化子元件或保守元件的情況下，可與 PCSK9基因之編碼序列相距數千bp、數十萬bp或甚至數百萬bp。在前述內容中，目標為其中目標之編碼 PCSK9基因意欲被抑制以使得 PCSK9基因產物在細胞中不表現或表現量較低的彼等目標。在一些實施例中，在本發明之系統之RNP結合於目標核酸之結合位置後，系統能夠抑制在RNP之結合位置5'的 PCSK9基因之轉錄。在其他實施例中，在系統之RNP結合於目標核酸之結合位置後，系統能夠抑制在RNP之結合位置3'的 PCSK9基因之轉錄。
在一些實施例中，目標核酸包含位於靶向序列之5'的PAM序列，其中至少一個單核苷酸將PAM與靶向序列之第一個核苷酸分離。在一些實施例中，PAM位於目標區域之非靶向股，亦即與目標核酸互補之股上。野生型 PCSK9核酸之靶向序列之代表性但非限制性實例呈現為SEQ ID NO: 1824-2944，且展示於下文如表7中，其表示用於連接至本發明之gRNA骨架之 PCSK9目標核酸之靶向序列；例如gRNA 174、235、316或其經化學修飾型式。在一些實施例中，gRNA之靶向序列包含與1824-2944具有至少約65%、至少約75%、至少約85%、至少約95%一致性之序列。在一些實施例中，PAM序列為TTC。在一些實施例中，TTC PAM之靶向序列包含SEQ ID NO: 1824-2944或與SEQ ID NO: 1824-2944至少50%一致、至少55%一致、至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少99%一致之序列。在一些實施例中，TTC PAM之靶向序列選自由SEQ ID NO: 1824-2944組成之群。
在一些實施例中，用於本發明之抑制子融合蛋白:gRNA系統之gRNA的靶向序列包含選自由SEQ ID NO: 1824-2545組成之群的序列。在一特定實施例中，用於本發明之抑制子融合蛋白:gRNA系統之gRNA的靶向序列由選自由SEQ ID NO: 1824-1890、1910、1925、2672、2675、2694及2714組成之群的序列組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1834組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 2009組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 2341組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1841組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1842組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1844組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1845組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 2672組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1884組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1851組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1849組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1852組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1853組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1855組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1856組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1857組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1858組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1859組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1860組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1862組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1863組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1867組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1869組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1870組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1872組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1875組成。在一些實施例中，靶向序列由SEQ ID NO: 1830組成。在前述任一者中，靶向序列可具有自靶向序列之3'端移除之1、2、3、4或5個核苷酸。 表 7 ：對 PCSK9 具有特異性之靶向序列
SEQ ID NO: PAM 序列
1824-2944 TTC
表 8 ： PCSK9 之例示性靶向序列
SEQ ID NO: PAM 序列
1824-1890、1910、1925、2672、2675、2694及2714 TTC
c.gRNA修飾
在另一態樣中，本發明係關於gRNA (本文中有時稱為gRNA變異體)，其包含相對於衍生gRNA之參考gRNA的修飾。gRNA可用於本發明之系統中。在一些實施例中，gRNA變異體相對於參考gRNA序列(其相對於參考gRNA具有改良特徵)包含一或多個核苷酸取代、插入、缺失或交換或置換域。修飾及交換區或域之例示性區域包括RNA三螺旋體、假結、骨架莖環及延伸莖環。在一些實施例中，gRNA變異體包含來自不同gRNA之至少第一交換區，產生嵌合gRNA。此類嵌合gRNA之代表性實例為引導物316 (SEQ ID NO: 1746)，其中gRNA骨架235之延伸莖環經gRNA骨架174之延伸莖環置換，其中當在可比條件下之活體外或活體內分析中評估時，所得316變異體保留與抑制子融合蛋白形成RNP之能力且展現相比於親本235改良之特徵。
當gRNA骨架變異體與衍生其之gRNA骨架相比時，具有一或多種改良功能、特徵或添加一或多種新功能，同時保持能夠與抑制子融合蛋白複合且將核糖核蛋白中空RNP複合物導引至目標核酸之功能特性的所有gRNA被設想為在本發明之範疇內。在一些實施例中，gRNA具有改良之特徵，該特徵選自由以下組成之群：增加之假結莖穩定性、增加之三螺旋體區穩定性、增加之骨架莖穩定性、延伸莖穩定性、減少之脫靶摺疊中間物、增加之與抑制子融合蛋白的結合親和力以及當與抑制子融合蛋白複合時增加之抑制活性，或其任何組合。在前述一些情況下，改良特徵在活體外分析(包括實例之分析)中評估。在上述其他情況下，評估活體內改良特徵。
表9提供用於產生gRNA之例示性gRNA變異體骨架序列。gRNA可用於本發明之抑制子融合蛋白:gRNA系統中。在一些實施例中，gRNA變異體骨架包含表9中所列之序列中之任一者，或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性之序列，其中該gRNA變異體保留與本發明之dCasX形成RNP之能力。在其他實施例中，gRNA變異體骨架包含表9中列舉之序列中之任一者，其中gRNA變異體保留與本發明之抑制子融合蛋白形成RNP之能力。應理解，在載體包含編碼gRNA之序列之DNA的彼等實施例中，胸腺嘧啶(T)鹼基可取代本文所描述之gRNA序列實施例中之任一者的尿嘧啶(U)鹼基。在一些實施例中，本發明提供下文所描述經化學修飾之表9的gRNA變異體。 表 9 ： gRNA 骨架序列
SEQ ID NO: 骨架變異體ID 核苷酸序列
1744 174 ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAG
1745 235 ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAG
1746 316 ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAG
預期用於gRNA及本發明之抑制子融合蛋白:gRNA系統中之額外gRNA骨架變異體選自由SEQ ID NO: 1747-1821組成之群。 d.gRNA骨架316
引導骨架可藉由包括重組方式或固相RNA合成的若干方法製備。然而，當使用固相RNA合成時，骨架的長度會影響可製造性，更長的長度會導致製造成本增加、純度及產率降低以及合成失敗率較高。對於用於顆粒調配物(諸如脂質奈米顆粒(LNP)調配物)，骨架之固相RNA合成較佳，以產生商業開發所需的量。雖然先前的實驗已鑑別gRNA骨架235具有相對於gRNA骨架174增強的特性，但其增加的長度(以核苷酸計)使其在LNP調配物中之使用存在問題。因此，尋求替代序列。在一些實施例中，本發明提供gRNA變異體骨架，其具有與衍生其之gRNA骨架相比改良之可製造性。在一些實施例中，本發明提供gRNA，其中gRNA骨架及連接靶向序列具有小於約115個核苷酸、小於約110個核苷酸或小於約100個核苷酸之序列。
在一些實施例中，設計gRNA骨架，其中骨架174 (SEQ ID NO: 1744)序列藉由在選自由U11、U24、A29及A87組成之群的位置處引入一或多個突變而經修飾。在一些實施例中，gRNA包含SEQ ID NO: 1744之序列或與其具有至少約70%序列一致性之序列，其包含SEQ ID NO: 49739之延伸莖環序列及選自由U11、U24、A29及A87組成之群的位置處之一或多個突變。在前述之一個實施例中，突變由U11C、U24C、A29C及A87G組成，得到SEQ ID NO: 1746之序列。
在另一實施例中，設計316 gRNA骨架，其中骨架235序列藉由域交換經修飾，其中骨架174之延伸莖環置換235骨架之延伸莖環，使得嵌合gRNA骨架316 (SEQ ID NO: 1746)，與gRNA骨架235之99個核苷酸相比較，其具有89個核苷酸。所得316骨架具有其他優勢，其中延伸莖環不含有CpG模體；此增強特性降低引起免疫反應的可能性。在一些實施例中，316骨架之較短序列長度賦予在產生以合成方式具有正確及完整序列之引導物的能力方面的較高保真度之改良，以及成功地併入LNP之增強的能力。在一些實施例中，本發明提供下文所描述經化學修飾之gRNA 316變異體。 e.經化學修飾之gRNA
在一些實施例中，gRNA具有一或多個化學修飾。在一些實施例中，化學修飾為將2'O-甲基添加至序列之一或多個核苷酸。在一些實施例中，化學修飾為序列之兩個或更多個核苷之間的硫代磷酸酯鍵之取代。在一些實施例中，骨架之5'端之前1、2或3個核苷(亦即在gRNA 174、235及316之情況下為A、C及U)藉由添加2'O-甲基修飾且經修飾之核苷中之各者藉由硫代磷酸酯鍵連接至鄰接核苷。類似地，連接至骨架之3'端之靶向序列之3'端的最後1、2或3個核苷酸經類似地修飾。在一些實施例中，本發明提供具有選自由以下組成之群的化學修飾之gRNA：如表25中所闡述之SEQ ID NO: 2948-2956、2958-2966及2968-2976序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，具有化學修飾之gRNA包含SEQ ID NO: 2948-2956、2958-2966及2968-2976之骨架，亦即無在前述序列中表示之間隔子的SEQ ID NO: 2948-2956、2958-2966及2968-2976序列作為未定義核苷酸。熟習此項技術者應瞭解，前述中之20個3'端未定義序列表示非靶向序列，且可經與 PCSK9基因之目標核酸互補的任何適合之靶向序列取代；例如選自由SEQ ID NO: 1824-2944組成之群的靶向序列。在一些實施例中，經化學修飾之gRNA包含SEQ ID NO: 2968之序列。gRNA變異體174、235及316之結構的示意圖分別示於圖19A至圖19C中。在一些實施例中，具有化學修飾之gRNA與不具有化學修飾之gRNA相比展現改良的穩定性。 f.與抑制子融合蛋白形成複合物
在遞送或表現目標細胞中之系統之組分後，gRNA變異體能夠與包含催化失活CRISPR蛋白之抑制子融合蛋白複合作為RNP且結合至 PCSK9基因之目標核酸。在一些實施例中，當與參考gRNA或衍生其之另一gRNA變異體相比時，gRNA變異體具有改良之與抑制子融合蛋白形成RNP複合物之能力。在一些實施例中，改良核糖核蛋白複合物形成可提高組裝功能性RNP之效率。在一些實施例中，大於90%、大於93%、大於95%、大於96%、大於97%、大於98%或大於99%之包含gRNA變異體及其靶向序列的RNP能勝任基因抑制目標核酸。 VI.        聚核苷酸及載體
在另一態樣中，本發明係關於編碼抑制子融合蛋白之聚核苷酸，且在一些實施例中，編碼gRNA之聚核苷酸，該等聚核苷酸在PCSK9基因之抑制及表觀遺傳修飾中具有效用。
本發明之抑制子融合蛋白或編碼抑制子融合蛋白之mRNA可藉由活體外合成，使用此項技術中已知之習知方法製備。各種商業合成裝置為可用的，例如Applied Biosystems,Inc., Beckman之自動化合成器等。天然存在之胺基酸或核苷酸(適當時)可藉由使用合成器經非天然胺基酸或核苷酸取代。製備之特定次序及方式將由便利性、經濟因素、所需之純度及其類似者確定。gRNA亦可以合成方式產生；例如藉由使用此項技術中已知之T7 RNA聚合酶系統。
抑制子融合蛋白及/或gRNA亦可藉由使用此項技術中已知之標準重組技術重組產生編碼本文所描述之實施例中之任一者的抑制子或gRNA的聚核苷酸序列，且將編碼基因併入至適合於宿主細胞之表現載體中來製備。為了產生所編碼之抑制子融合蛋白及/或gRNA，方法包括用包含編碼聚核苷酸之表現載體轉化適當宿主細胞，及在使得或允許所得抑制子或gRNA在經轉化宿主細胞中表現或轉錄之條件下培養宿主細胞，其藉由本文所描述之方法或藉由此項技術中已知之標準純化方法或如實例中所描述進行回收。分子生物學中之標準重組技術用於製造本發明之聚核苷酸及表現載體。
本發明之抑制子融合蛋白及/或gRNA亦可根據重組合成之習知方法分離及純化。可製備表現宿主之溶解物，且使用高效液相層析(HPLC)、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其他純化技術純化溶解物。大部分地，相對於涉及產物製備及其純化方法之污染物，所使用之組合物將佔所需產物之重量的50%或更大，更通常75重量%或更大，較佳95重量%或更大，且出於治療目的，通常99.5重量%或更大。通常，百分比將基於總蛋白質。因此，在一些情況下，本發明之抑制子融合蛋白或gRNA之純度為至少80%、純度為至少85%、純度為至少90%、純度為至少95%、純度為至少98%或純度為至少99% (例如不含污染物或其他大分子等)。
另外，本發明提供包含編碼抑制子融合蛋白及在一些情況下本文所描述之gRNA之聚核苷酸的載體。在一些情況下，利用載體表現及回收抑制子融合蛋白:gRNA系統之CasX及gRNA組分。在其他情況下，如下文更充分描述，利用載體將編碼聚核苷酸遞送至目標細胞以抑制及/或表觀遺傳修飾目標核酸。在一些實施例中，編碼抑制子融合蛋白及gRNA之序列由相同載體編碼。在一些實施例中，編碼抑制子融合蛋白及gRNA之序列由不同載體上之序列編碼。適合的載體描述於例如WO2022120095A1及WO2020247882A1中，其以引用之方式併入本文中。如WO2022120095A1及WO2020247882A1中所描述，視所用宿主/載體系統而定，表現載體中可使用多種適合轉錄及轉譯控制元件中之任一者，包括組成型及誘導型啟動子、轉錄強化子元件、轉錄終止子等。
在一些實施例中，本發明提供編碼抑制子融合蛋白之聚核苷酸序列，其包括如表20中所闡述之SEQ ID NO: 3131-3132之抑制子融合蛋白，或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，本發明提供編碼gRNA變異體之經分離聚核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供編碼gRNA之聚核苷酸，該gRNA包含SEQ ID NO: 1744-1746及2947-2976之骨架序列，或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、抑制至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性之序列，其中經表現之gRNA的變異體保留與抑制子融合蛋白形成RNP的能力。在一些實施例中，本發明提供編碼gRNA的聚核苷酸序列，該gRNA包含SEQ ID NO: 1824-2944之靶向序列或與其具有至少約65%、至少約75%、至少約85%或至少約95%一致性之序列。在一些實施例中，本發明提供編碼gRNA的聚核苷酸序列，該gRNA包含SEQ ID NO: 1824-1890、1910、1925、2672、2675、2694及2714之靶向序列或與其具有至少約65%、至少約75%、至少約85%或至少約95%一致性之序列。
在一些實施例中，本發明係關於產生編碼抑制子融合蛋白或gRNA (包括其變異體)之聚核苷酸序列的方法，以及表現由聚核苷酸序列轉錄之蛋白質或RNA的方法。一般而言，方法包括產生編碼本文所描述之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白或gRNA的聚核苷酸序列且將編碼基因併入表現載體中。在一些實施例中，載體經設計用於轉導細胞以抑制及/或表觀遺傳修飾 PCSK9目標核酸。此類載體可包括反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、單純疱疹病毒(HSV)載體、質體、微環、奈米質體、DNA載體及RNA載體。在其他實施例中，表現載體經設計用於產生無細胞系統或宿主細胞中之抑制子融合蛋白、編碼抑制子融合蛋白之mRNA或gRNA。為了在宿主細胞中產生本文所描述之實施例中之任一者之所編碼之抑制子融合蛋白或gRNA，方法包括用包含編碼聚核苷酸之表現載體轉化適當宿主細胞，及在使得或允許本文所描述之實施例中之任一者之所得抑制子融合蛋白或gRNA在經轉化宿主細胞中表現或轉錄之條件下培養宿主細胞，由此產生抑制子融合蛋白或gRNA，其藉由本文所描述之方法(例如以下實例中描述之方法)或藉由此項技術中已知之標準純化方法進行回收。分子生物學中之標準重組技術用於製造本發明之聚核苷酸及表現載體。
根據本發明，編碼本文所描述之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白或gRNA的核酸序列用於產生導引適當宿主細胞中之表現的重組DNA分子。若干選殖策略適合於進行本發明，其中之許多用於產生包含編碼本發明組合物之基因的構築體，或其補體。在一些實施例中，選殖策略用於產生編碼構築體之基因，該構築體包含編碼用於轉化宿主細胞以表現組合物之抑制子融合蛋白或gRNA的核苷酸。
在一種方法中，首先製備含有編碼抑制子融合蛋白或gRNA之DNA序列的構築體。製備此類構築體之例示性方法描述於實例中。隨後使用構築體產生適用於轉化宿主細胞，諸如用於表現及回收蛋白質構築體之原核或真核宿主細胞(在抑制子融合蛋白或gRNA之情況下)的表現載體。必要時，宿主細胞為大腸桿菌。在其他實施例中，宿主細胞為真核細胞。真核宿主細胞可選自幼倉鼠腎纖維母細胞(BHK)細胞、人類胚胎腎293 (HEK293)細胞、人類胚胎腎293T (HEK293T)細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、融合瘤細胞、NIH3T3細胞、CV-1 (猿猴)SV40遺傳物質來源(COS)細胞、希拉細胞(HeLa cell)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、酵母細胞，或此項技術中已知適合於生產重組產物的其他真核細胞。用於產生表現載體、轉化宿主細胞以及表現及回收抑制子融合蛋白或gRNA之例示性方法描述於實例中。
編碼抑制子融合蛋白或gRNA構築體之基因可在一或多個步驟中完全以合成方式或藉由與酶過程(諸如限制酶介導之選殖、PCR及重疊延伸)組合之合成製得，包括更全面描述於實例中之方法。本文所揭示之方法可用於例如將編碼各種組分之聚核苷酸的序列接合至所需序列之基因中。編碼多肽組合物之基因係使用基因合成之標準技術自寡核苷酸組裝。
在一些實施例中，編碼抑制子融合蛋白之核苷酸序列經密碼子最佳化。此類型最佳化可能需要編碼核苷酸序列之突變來模仿預期宿主生物體或細胞之密碼子偏好，同時編碼相同蛋白。因此，密碼子可改變，但經編碼之蛋白質保持不變。舉例而言，若抑制子融合蛋白之既定目標細胞為人類細胞，則可使用人類密碼子最佳化之抑制子融合蛋白編碼核苷酸序列。作為另一非限制性實例，若既定宿主細胞為小鼠細胞，則可產生小鼠密碼子最佳化之抑制子融合蛋白編碼核苷酸序列。可使用使適合於用於產生抑制子融合蛋白或gRNA之宿主細胞的密碼子使用及胺基酸組合物最佳化的算法進行基因設計。在一種本發明方法中，編碼構築體之組分的聚核苷酸庫經產生且接著組裝，如上文所描述。隨後組裝所得基因且所得基因用於轉化宿主細胞且產生及回收抑制子融合蛋白或gRNA組合物以評估其特性或用於修飾PCSK9目標核酸，如本文所描述。
在一些實施例中，編碼gRNA之核苷酸序列可操作地連接於控制元件，例如轉錄控制元件，諸如啟動子。在一些實施例中，編碼抑制子融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接於控制元件，例如轉錄控制元件，諸如啟動子。在一些情況下，啟動子為組成型活性啟動子。在一些情況下，啟動子為可調節啟動子。在一些情況下，啟動子為誘導型啟動子。在一些情況下，啟動子為組織特異性啟動子。在一些情況下，啟動子為細胞類型特異性啟動子。在一些情況下，轉錄控制元件(例如啟動子)在目標細胞類型或目標細胞群體中起作用。舉例而言，在一些情況下，轉錄控制元件可在真核細胞，例如肝細胞或肝竇內皮細胞中起作用。
與編碼本發明之抑制子融合蛋白的聚核苷酸可操作連接的Pol II啟動子的非限制性實例包括但不限於：EF-1α、EF-1α核心啟動子、Jens Tornoe (JeT)、巨細胞病毒(CMV)啟動子、CMV即刻早期(CMVIE)、CMV強化子、單純疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期及晚期猿猴病毒40 (SV40)、SV40強化子、來自反轉錄病毒之長末端重複序列(LTR)、小鼠金屬硫蛋白-I、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、CMV啟動子全長啟動子、最小CMV啟動子、雞β-肌動蛋白啟動子(CBA)、CBA雜交啟動子(CBh)、雞β-肌動蛋白啟動子與巨細胞病毒強化子(CB7)、雞β-肌動蛋白啟動子與兔β-球蛋白剪接接受體部位融合物(CAG)、勞氏肉瘤病毒(rous sarcoma virus，RSV)啟動子、HIV-Ltr啟動子、hPGK啟動子、HSV TK啟動子、7SK啟動子、Mini-TK啟動子、賦予神經元特異性表現之人類突觸蛋白I (SYN)啟動子、β-肌動蛋白啟動子、超核心啟動子1 (SCP1)、用於在神經元中選擇性表現之Mecp2啟動子、最小IL-2啟動子、勞氏肉瘤病毒強化子/啟動子(單一)、脾臟病灶形成病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、TBG啟動子、人類甲狀腺素結合球蛋白基因的啟動子(肝臟特異性)、PGK啟動子、人類泛素C啟動子(UBC)、UCOE啟動子(HNRPA2B1-CBX3之啟動子)、合成CAG啟動子、組蛋白H2啟動子、組蛋白H3啟動子、U1a1小核RNA啟動子(226 nt)、U1a1小核RNA啟動子(226 nt)、U1b2小核RNA啟動子(246 nt) 26、GUSB啟動子、CBh啟動子、視紫質(Rho)啟動子、更易沉默脾病灶形成病毒(SFFV)啟動子、人類H1啟動子(H1)、POL1啟動子、TTR最小強化子/啟動子、b-驅動蛋白啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、人類真核生物起始因子4A (EIF4A1)啟動子、ROSA26啟動子、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子、tRNA啟動子以及前述啟動子之經截短形式及序列變異體。在特定實施例中，Pol II啟動子為EF-1α，其中該啟動子增強轉染效率、轉殖基因轉錄或CRISPR核酸酶之表現、在長期培養中表現陽性純系之比例及附加型載體之複本數。
與編碼本發明之gRNA變異體的聚核苷酸可操作連接的Pol III啟動子的非限制性實例包括但不限於：U6、微型U6、U6截短啟動子、7SK及H1變異體、BiH1 (雙向H1啟動子)、BiU6、Bi7SK、BiH1 (雙向U6、7SK及H1啟動子)、大猩猩U6、恆河猴U6、人類7SK、人類H1啟動子，以及上述經截短形式及序列變異體。在前述實施例中，pol III啟動子增強gRNA之轉錄。在一特定實施例中，Pol III啟動子為U6，其中該啟動子增強gRNA之表現。在另一特定實施例中，連接於編碼向性因子之基因的啟動子為CMV啟動子。實例中提供使用此類啟動子之實驗細節及資料。
適當載體及啟動子之選擇完全在一般技術者之水平內，與其控制表現相關。表現載體亦可含有用於轉譯起始及轉錄終止之核糖體結合部位。表現載體亦可包括用於擴增表現之適當的序列。表現載體亦可包括編碼可融合至抑制子融合蛋白之蛋白質標籤(例如6×His標籤、血球凝集素標籤、螢光蛋白等)之核苷酸序列，因此產生用於純化或偵測之嵌合蛋白。
本發明之重組表現載體亦可包含促進本發明之蛋白及gRNA之穩固表現的元件。舉例而言，重組表現載體可包括聚腺苷酸化信號(聚(A))、內含子序列或轉錄後調節元件(諸如土拔鼠肝炎轉錄後調節元件(WPRE))中之一或多者。例示性聚(A)序列包括hGH聚(A)信號(短)、HSV TK聚(A)信號、合成聚腺苷酸化信號、SV40聚(A)信號、β-球蛋白聚(A)信號及其類似物(例如SEQ ID NO: 3459)。一般熟習此項技術者將能夠選擇本文所描述之重組表現載體中包括之適合元件。
編碼抑制子融合蛋白或gRNA序列之聚核苷酸可個別選殖於表現載體中。適當載體及啟動子之選擇完全符合一般技術者之水平，因為其係關於控制表現，例如用於抑制PCSK9基因之表現及/或表觀遺傳修飾。表現載體亦可含有用於轉譯起始及轉錄終止之核糖體結合部位。表現載體亦可包括用於擴增表現之適當的序列。
核酸序列係藉由多種程序插入至載體中。一般而言，DNA係使用此項技術中已知之技術插入至適當限制性核酸內切酶部位中。載體組分一般包括但不限於以下中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。含有此等組分中之一或多者之適合之載體的構築採用熟習此項技術者已知之標準連接技術。此類技術為此項技術中熟知且詳盡描述於科學及專利文獻中。各種載體為公開可用的。載體可例如呈可便利地經受重組DNA程序之質體、黏質體、病毒顆粒或噬菌體形式，且載體之選擇將通常取決於其所引入之宿主細胞。因此，載體可為自主複製載體，亦即以染色體外實體形式存在之載體，載體複製獨立於染色體複製，例如質體。或者，載體可為當引入宿主細胞中時整合至宿主細胞基因體中且連同其已整合之染色體進行複製之載體。一旦引入適合宿主細胞中，可使用此項技術中已知之任何核酸或蛋白質分析測定抑制子融合蛋白之表現。舉例而言，抑制子融合蛋白之經轉錄mRNA之存在可使用與CasX聚核苷酸之任何區域互補之探針，藉由習知雜交分析(例如北方墨點分析)、擴增程序(例如RT-PCR)、SAGE (美國專利第5,695,937號)及基於陣列之技術(參見例如美國專利第5,405,783號、第5,412,087號及第5,445,934號)經偵測及/或量化定量。
在一些實施例中，產生用於轉錄抑制子融合蛋白基因及表現及回收所得編碼mRNA的載體。在一些實施例中，mRNA係使用PCR產物或線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶藉由活體外轉錄(IVT)來產生，其中質體含有T7啟動子。若使用PCR產物，則編碼候選mRNA之DNA序列選殖至含有T7啟動子之質體中，其中質體DNA模板將經線性化，且隨後用於進行IVT反應以表現mRNA。此類載體之產生及mRNA之產生及回收的例示性方法提供於以下實例中。 VII.      用於遞送抑制子融合蛋白之顆粒
在另一態樣中，本發明提供用於將抑制子融合蛋白遞送至細胞或個體以進行 PCSK9基因之修飾的顆粒組合物。在一些實施例中，例如當抑制子融合蛋白包含催化失活CRISPR蛋白(諸如dCasX)時，顆粒組合物將抑制子融合蛋白:gRNA系統遞送至細胞或用於抑制 PCSK9基因之個體。在一些實施例中，本發明提供囊封gRNA變異體及mRNA之合成奈米顆粒，該等mRNA編碼包含本文所描述之實施例中之任一者之dCasX蛋白的抑制子融合蛋白。在一些實施例中，用於產生生物可降解聚合奈米顆粒之材料(PNP)包括聚乳酸交酯、聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸異丁酯)及聚(氰基丙烯酸異己酯)、聚麩胺酸(PGA)、聚(ɛ-己內酯) (PCL)、環糊精及天然聚合物，例如聚葡萄胺糖、白蛋白、明膠及海藻酸鹽係合成PNP最常用的聚合物(Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 3:16023; doi:10.1038 (2016))。在一些實施例中，本發明提供用於遞送包含dCasX蛋白之抑制子融合蛋白及gRNA變異體(參見WO2021113772A1，以引用的方式併入本文中)的病毒樣顆粒。在其它實施例中，本發明提供囊封本文所描述之實施例中之任一者之gRNA變異體及編碼包含dCasX蛋白之抑制子融合蛋白的mRNA的脂質奈米顆粒，下文對此進行更全面的描述。 a.脂質奈米顆粒(LNP)
在另一態樣中，本發明提供用於向細胞或向個體遞送本發明之抑制子融合蛋白:gRNA系統用於轉錄抑制 PCSK9基因之脂質奈米顆粒(LNP)。在一些實施例中，本發明之LNP為組織特異性或器官特異性的(例如，肝臟)，具有極佳生物相容性，且可以高效率遞送系統，且因此可有效地用於抑制 PCSK9基因。
在其天然形式中，核酸聚合物在生物流體中不穩定且無法穿透至目標細胞之細胞質中，由此需要遞送系統。已證明脂質奈米顆粒(LNP)適用於保護核酸及將核酸遞送至組織及細胞。此外，與DNA載體相比，使用LNP中之mRNA編碼CRISPR核酸酶可消除非期望基因體整合之可能性。此外，mRNA有效地在有絲分裂及非有絲分裂細胞轉譯成蛋白，因為其在細胞質區室中發揮其功能而不需要進入細胞核。作為遞送平台之LNP提供額外優勢：能夠將編碼核酸酶之mRNA及gRNA兩者共同調配至單一LNP顆粒中。
因此，在各種實施例中，本發明涵蓋脂質奈米顆粒及組合物，其可用於多種目的，包括活體外及活體內將囊封或結合(例如複合)治療劑，諸如核酸遞送至細胞。在某些實施例中，本發明涵蓋治療或預防有需要之個體中之疾病或病症的方法，其藉由使個體與脂質奈米顆粒接觸來進行，該脂質奈米顆粒囊封或結合適合治療劑，該適合治療劑與經由在組合物中使用的一或多種脂質組分之間的各種物理、化學或靜電相互作用而複合以製備LNP。在一些實施例中，適合治療劑包含如本文所描述之抑制子融合蛋白:gRNA系統。
在某些實施例中，脂質奈米顆粒適用於遞送核酸，包括例如編碼本發明之抑制子融合蛋白及本發明之gRNA變異體之mRNA，該gRNA變異體包括SEQ ID NO: 1744-1746及2947-2976之序列。在一些實施例中，本發明提供LNP，其中gRNA及編碼抑制子融合蛋白之mRNA併入單一LNP顆粒中。在其他實施例中，本發明提供LNP，其中gRNA及編碼抑制子融合蛋白之mRNA併入至LNP之各別群體中，LNP可一起調配成不同投與比率。在一些實施例中，併入至本發明之LNP中的mRNA編碼本文所描述之抑制子融合蛋白實施例中之任一者。在一些實施例中，用於LNP中之gRNA包含SEQ ID NO: 1744-1746及2947-2976之序列。
本發明之某些實施例的脂質奈米顆粒及系統可用於活體外及活體內藉由使細胞與包含一或多種本文所描述之新穎可離子化陽離子脂質或永久帶電荷之陽離子脂質的脂質奈米顆粒接觸來誘導所需蛋白質的表現，其中脂質奈米顆粒囊封或結合核酸，該核酸經表現以產生所需蛋白質(例如編碼CasX蛋白之信使RNA)。在一些實施例中，脂質奈米顆粒及系統可用於在活體外及活體內藉由使細胞與包含一或多種本文所描述之新穎可離子化/陽離子脂質的脂質奈米顆粒接觸來降低PCKS9目標基因的表現，其中脂質奈米顆粒囊封或結合CasX:gRNA系統之核酸，其可降低目標基因表現。本發明之實施例的脂質奈米顆粒及系統亦可單獨或以組合形式共同遞送不同核酸(例如mRNA、gRNA、siRNA、saRNA、mcDNA及質體DNA)，諸如可適用於提供需要不同核酸之共定位的效應(例如編碼適用於靶向目標核酸之修飾酶的mRNA及gRNA)。
在一些實施例中，本文所描述之LNP及LNP組合物包括至少一種陽離子脂質、至少一種結合脂質、至少一種類固醇或其衍生物、至少一種輔助脂質或其任何組合。或者，本發明之脂質組合物可包括可離子化脂質，諸如可離子化陽離子脂質、輔助脂質(通常為磷脂)、膽固醇及聚乙二醇-脂質結合物(PEG-脂質)，以藉由例如降低血漿蛋白之吸收比以及在奈米顆粒上形成水合層來改良生物環境中之膠態穩定性。此類脂質組合物可以50:10:37-39:1-3或20-50:8-65:15-70:1-3.0之典型莫耳比調配：IL:HL:固醇:PEG-脂質，使得變化形式包括或排除組分中之一或多者與LNP及LNP中之傳統4-組分系統以調節個別特性。
本發明之LNP及LNP組合物經組態以在活體外及活體內保護及遞送本發明系統之囊封有效負載至組織及細胞。本文中進一步詳細描述本發明之LNP及LNP組合物之各種實施例。 陽離子脂質
在一些實施例中，本發明之LNP及LNP組合物包括至少一種陽離子脂質。術語「陽離子脂質」係指具有淨正電荷之脂質物質。在一些實施例中，陽離子脂質為在＜可離子化脂質之pKa的所選pH下具有淨正電荷之可離子化陽離子脂質。在一些實施例中，可離子化陽離子脂質之pKa小於約7，使得LNP及LNP組合物在低於對應脂質之pKa之相對較低pH下達成有效負載囊封。在一些實施例中，陽離子脂質之pKa為約5至約8、約5.5至約7.5、約6至約7或約6.5至約7。在一些實施例中，陽離子脂質可在低於陽離子脂質之pKa之pH下質子化，且在高於該pKa之pH下，其可為基本上中性的。LNP及LNP組合物可在活體內安全地遞送至目標器官(例如肝臟、肺、心臟、脾，以及腫瘤)及/或細胞(肝細胞、LSEC、心臟細胞、癌細胞等)，且在胞吞作用期間，當pH下降至低於可離子化脂質pKa時展現正電荷，以經由與胞內體膜之陰離子脂質的靜電相互作用釋放囊封之有效負載。
利用持久陽離子脂質的早期LNP調配使得LNP具有陽性表面電荷且被吞噬細胞快速清除，已證實該等陽性表面電荷在活體內具有毒性。藉由變成帶有三級胺(尤其pKa ＜7)的可離子化陽離子脂質，使得LNP藉由與mRNA之磷酸酯主鏈之負電荷靜電相互作用而實現核酸聚合物在低pH下之有效囊封，其亦在生理pH值下產生基本上中性之系統，因此緩解與持久帶電陽離子脂質相關的問題。
如本文所用，「可離子化脂質(ionizable lipid)」意謂含胺脂質，其可容易地質子化，且例如其可為電荷狀態視周圍pH而改變的脂質。可離子化脂質可在低於陽離子脂質之pKa之pH下質子化(帶正電)，且在高於該pKa之pH下，其可為基本上中性的。在一個實例中，LNP可包含質子化可離子化脂質及/或顯示中性之可離子化脂質。在一些實施例中，LNP之pKa為5至8、5.5至7.5、6至7或6.5至7。LNP之pKa對於在目標細胞或器官中之LNP的核酸有效負載之活體內穩定性及釋放至關重要。在一些實施例中，具有前述pKa範圍之LNP可在活體內安全地遞送至目標器官(例如肝、肺、心臟、脾，以及腫瘤)及/或目標細胞(肝細胞、LSEC、心臟細胞、癌細胞等)，且在核內體內部呈現正電荷以經由與胞內體膜之陰離子脂質靜電相互作用而釋放所囊封的有效負載。
可離子化脂質為一般具有類似於脂質之特徵的可離子化化合物，且經由與核酸(例如，本發明之mRNA)之靜電相互作用可在LNP內以高效率囊封核酸有效負載。
根據包含於可離子化脂質中之胺及尾基之類型，LNP之(i)核酸囊封效率，(ii) PDI (多分散指數)，及/或(iii)向構成器官之組織及/或細胞(例如肝臟中之肝細胞或肝竇內皮細胞)中遞送核酸的效率可不同。在某些實施例中，可離子化脂質係可離子化陽離子脂質，且其佔顆粒中存在之總脂質的約25 mol%至約66 mol%。
包含有包含胺之可離子化脂質的LNP可具有一或多種類型之以下特徵：(1)以高效率囊封核酸之能力；(2)所製備顆粒之大小均勻(或具有低PDI值)；及/或(3)對諸如肝臟、肺、心臟、脾、骨髓之器官，以及腫瘤，及/或構成此類器官之細胞(例如肝細胞、LSEC、心臟細胞、癌細胞等)具有極佳核酸遞送效率。
在特定實施例中，陽離子脂質形式經由靜電相互作用及藉由破壞胞內體膜進行細胞內釋放而在核酸囊封中發揮關鍵作用。核酸有效負載藉由其與帶正電陽離子脂質形成之離子相互作用囊封於LNP內。用於本發明之LNP中的可離子化陽離子脂質組分之非限制性實例選自DLin-MC3-DMA (4-(二甲基胺基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯)、DLin-KC2-DMA (2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷)及TNT (1,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮)及TT (N1,N3,N5-參(2-胺基乙基)苯-1,3,5-三甲醯胺)。用於本發明之LNP中之輔助脂質的非限制性實例選自DSPC (1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、POPC (2-油醯基-1-軟脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)以及DOPE (1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-二氧磷基-(1'-rac-丙三醇) DOPG、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DLPC)、神經鞘脂以及神經醯胺。膽固醇及PEG-DMG ((R)-2,3-雙(十八烷氧基)丙基-1-(甲氧基聚乙二醇2000)胺基甲酸酯)、PEG-DSG (1,2-二硬脂醯基-rac-甘油-3-甲基聚氧基乙烯二醇2000)或DSPE-PEG2k (1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[胺基(聚乙二醇)-2000])係本發明之LNP中使用的組分，用於LNP的穩定性、循環以及大小。
在一些實施例中，本發明之LNP中之陽離子脂質包含三級胺。在一些實施例中，三級胺包括藉由醚鍵連接至三級胺之N的烷基鏈。在一些實施例中，烷基鏈包含具有0至3個雙鍵之C12-C30烷基鏈。在一些實施例中，烷基鏈包含C16-C22烷基鏈。在一些實施例中，烷基鏈包含C18烷基鏈。多種陽離子脂質及相關類似物已描述於美國專利公開案第20060083780號、第20060240554號、第20110117125號、第20190336608號、第20190381180號及第20200121809號；美國專利第5,208,036號；第5,264,618號；第5,279,833號；第5,283,185號；第5,753,613號；第5,785,992號；第9,738,593號；第10,106,490號；第10,166,298號；第10,221,127號；及第11,219,634號；以及PCT公開案第WO 96/10390號，該等揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之LNP中之陽離子脂質可包含例如一或多種可離子化陽離子脂質，其中該可離子化陽離子脂質為二烷基脂質。在其他實施例中，可離子化陽離子脂質為四烷基脂質。
在一些實施例中，本發明之LNP中的陽離子脂質係選自1,2-二亞油氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二次亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亞油基-4-(3-二甲胺基丙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亞油基-4-(4-二甲胺基丁基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C4-DMA)、2,2-二亞油基-5-二甲胺基甲基-[1,3]-二㗁烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亞油基-4-N-甲基哌𠯤并-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-MPZ)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、1,2-二亞油基胺甲醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-(N-𠰌啉基)丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油基硫基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油氧基-3-三甲基胺基丙烷氯化鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯化鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油氧基-3-(N-甲基哌𠯤基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基胺基)-1,2-丙烷二醇(DOAP)、1,2-二亞油基側氧基-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DODMA)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DSDMA)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)、3-(N-(N',N'-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥基乙基溴化銨(DMRIE)、2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、二(十八烷基)醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、3-二甲基胺基-2-(膽甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(膽甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊烯氧基)-3-二甲基-1-(順式,順式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油烯基胺基甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N'-二亞油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLincarbDAP)，以及前述之任意組合。
在一些實施例中，本發明之LNP中之陽離子脂質選自4-(二甲基胺基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin- KC2-DMA)、(1,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮) (TNT)、N1,N3,N5-參(2-胺基乙基)苯-1,3,5-三甲醯胺(TT)，以及前述之任意組合。
在一些實施例中，本發明之LNP中之N/P比(來自陽離子/可離子化脂質的氮與來自核酸的磷酸酯)在約3:1至7:1、或約4:1至6:1範圍內，或為3:1，或為4:1，或為5:1，或為6:1，或為7:1，或為8:1，或為9:1。 結合脂質
在一些實施例中，本發明之LNP及LNP組合物包括至少一種結合脂質。在一些實施例中，結合脂質可選自聚乙二醇(PEG)-脂質結合物、聚醯胺(ATTA)-脂質結合物、陽離子-聚合物-脂質結合物(CPL)及前述之任何組合。在一些情況下，結合脂質可抑制本發明之LNP的聚集。
在一些實施例中，本發明之LNP之結合脂質包含聚乙二醇化脂質。術語「聚乙二醇(PEG)-脂質結合物」、「聚乙二醇化脂質」、「脂質-PEG結合物」、「脂質-PEG」、「PEG-脂質」、「PEG-脂質」或「脂質-PEG」在本文中可互換使用且係指連接至聚乙二醇(PEG)聚合物(其為親水性聚合物)的脂質。聚乙二醇化脂質有助於LNP及LNP組合物之穩定性且減少LNP之聚集。在其他實施例中，LNP之脂質包含用於靶向細胞表面受體的經肽修飾之PEG脂質，例如：DSPE-PEG-RGD、DSPE-PEG-運鐵蛋白、DSPE-PEG-膽固醇。
由於PEG-脂質可形成表面脂質，LNP之尺寸可容易地藉由改變表面(PEG)脂質與核心(可離子化陽離子)脂質之比例來改變。在一些實施例中，本發明LNP之PEG-脂質可在約1 mol%至5 mol%之間變化以修改顆粒特性，諸如尺寸、穩定性及循環時間。
脂質-PEG結合物促成LNP內之奈米顆粒的顆粒血清穩定性，且起到預防奈米顆粒之間的聚集的作用。另外，脂質-PEG結合物可保護核酸(諸如編碼本發明之抑制子融合蛋白的mRNA，或本發明之gRNA)在活體內遞送核酸期間免受降解酶降解，且增強核酸之活體內穩定性且延長囊封於奈米顆粒中之所遞送核酸的半衰期。PEG-脂質結合物之實例包括但不限於PEG-DAG結合物、PEG-DAA結合物及其混合物。在某些實施例中，PEG-脂質結合物係選自由以下組成之群組：PEG-二醯基甘油(PEG-DAG)結合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)結合物、PEG-磷脂結合物、PEG-腦醯胺(PEG-Cer)結合物及其混合物。
在一些實施例中，本發明之LNP之聚乙二醇化脂質選自PEG-神經醯胺、聚乙二醇-二醯甘油、聚乙二醇-二烷氧基丙基、聚乙二醇-二烷氧基丙基胺基甲酸酯、PEG-磷脂醯乙醇胺、PEG-磷脂、PEG-丁二酸二醯甘油及前述之任何組合。
在一些實施例中，本發明之LNP之聚乙二醇化脂質為聚乙二醇-二烷氧基丙基。在一些實施例中，聚乙二醇化脂質選自PEG-二癸氧基丙基(C10)、PEG-二月桂氧基丙基(C12)、PEG-二肉豆蔻氧基丙基(C14)、PEG-二棕櫚醯氧基丙基(C16)、PEG-二硬脂醯氧基丙基(C18)及前述之任何組合。
在其他實施例中，本發明之LNP的脂質-PEG結合物可為結合於磷脂之PEG，諸如磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)；結合至神經醯胺之PEG (PEG-CER、神經醯胺-PEG結合物、神經醯胺-PEG)；膽固醇或結合至其衍生物之PEG；PEG-c-DOMG；PEG-DMG；PEG-DLPE；PEG-DMPE；PEG-DPPC；PEG-DSPE (DSPE-PEG)及其混合物，且舉例而言，可為C16-PEG2000神經醯胺(N-棕櫚醯基-神經鞘胺醇-1-{丁二醯基[甲氧基(聚乙二醇)2000]})、DMG-PEG 2000、14:0 PEG2000 PE。
在一些實施例中，本發明之LNP之聚乙二醇化脂質選自1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯基甘油、4-O-(2',3'-二(十四醯氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)胺基甲酸酯、2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)胺基甲酸酯，及前述之任何組合。
在一些實施例中，本發明之LNP之聚乙二醇化脂質選自mPEG2000-1,2-二-O-烷基-sn3-碳醯甘油酯(PEG-C-DOMG)、1-[8'-(1,2-二肉豆蔻醯基-3-丙氧基)-甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛基]胺甲醯基-w-甲基-聚(乙二醇)(2 KPEG-DMG)，及前述之任何組合。
在一些實施例中，PEG直接連接至聚乙二醇化脂質之脂質。在其他實施例中，PEG藉由選自無酯連接子部分或含酯連接子部分之連接子部分連接於聚乙二醇化脂質的脂質上。無酯連接子部分之非限制性實例包括醯胺基(-C(O)NH-)、胺基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、胺基甲酸酯(-NHC(O)O-)、脲(-NHC(O)NH-)、二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、丁二醯基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、丁二醯胺基(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚、二硫化物及其組合。舉例而言，連接子可含有胺基甲酸酯連接子部分及醯胺基連接子部分。含酯連接子部分之非限制性實例包括碳酸酯(-OC(O)O-)、丁二醯基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯及其組合。
本文所描述之本發明之LNP的聚乙二醇化脂質的PEG部分的平均分子量可在約550道爾頓至約10,000道爾頓範圍內。在某些實施例中，PEG部分具有約750道爾頓至約5,000道爾頓、約1,000道爾頓至約4,000道爾頓、約1,500道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約3,000道爾頓、約1750道爾頓至約2,000道爾頓之平均分子量。
在一些實施例中，結合脂質(例如，聚乙二醇化脂質)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的約1 mol%至約60 mol%、約2 mol%至約50 mol%、約5 mol%至約40 mol%或約5 mol%至約20 mol%。在某些實施例中，結合脂質佔顆粒中存在之總脂質的約0.5 mol%至約3 mol%。
在其他實施例中，本發明之LNP之結合脂質(例如聚乙二醇化脂質)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的至少約1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60 mol%或前述任一者之中間範圍。
對於本發明之LNP之脂質-PEG結合物中之脂質，可使用(但不限於)能夠結合於聚乙二醇之任何脂質，且亦可使用作為LNP之其他元件的磷脂及/或膽固醇。在一些實施例中，脂質-PEG結合物中之脂質可為神經醯胺、二肉豆蔻醯基甘油(DMG)、丁二醯基-二醯基甘油(s-DAG)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)或膽固醇，但不限於此。
在本發明之LNP的脂質-PEG結合物中，PEG可直接結合至脂質或經由連接子部分連接至脂質。可使用適合於使PEG結合至脂質的任何連接子部分，且舉例而言，該等連接子部分包括無酯連接子部分及含酯連接子部分。無酯連接子部分不僅包括醯胺基(-C(O)NH-)、胺基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、胺基甲酸酯(-NHC(O)O-)、脲(-NHC(O)NH-)、二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、丁二醯基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、丁二醯胺基(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚、二硫化物，而且包括其組合(例如含有胺基甲酸酯連接子部分及醯胺基連接子部分兩者的連接子)，但不限於此。含酯連接子部分包括例如碳酸酯(-OC(O)O-)、丁二醯基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯及其組合，但不限於此。 類固醇
在一些實施例中，本發明之LNP及LNP組合物包括至少一種類固醇或其衍生物。在一些實施例中，類固醇包含膽固醇。在一些實施例中，LNP及LNP組合物包含選自膽甾烷醇、膽甾烷酮、膽甾烯酮、糞甾醇、膽固醇基-2'-羥基乙基醚、膽固醇基-4'-羥基丁基醚及前述之任何組合的膽固醇衍生物。
在一些實施例中，本發明之LNP的類固醇(例如膽固醇)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的約1 mol%至約65 mol%、約2 mol%至約50 mol%、約5 mol%至約40 mol%或約5 mol%至約20 mol%。在其他實施例中，本發明之LNP的類固醇(例如膽固醇)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的至少約1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60 mol%或前述任一者之中間範圍。 輔助脂質 / 輔助脂質或結構性脂質
在一些實施例中，本發明之LNP及LNP組合物包括至少一種輔助脂質。在一些實施例中，輔助脂質為選自陰離子脂質、中性脂質或兩者之非陽離子脂質。在一些實施例中，輔助脂質包含至少一種磷脂。在一些實施例中，磷脂係選自陰離子磷脂、中性磷脂或兩者。LNP及LNP組合物之元件的磷脂可起到覆蓋及保護由LNP中陽離子脂質與核酸之相互作用形成之LNP核心的作用，且可有助於在藉由結合於目標細胞之磷脂雙層而細胞內遞送核酸期間的細胞膜滲透及胞內體逃逸。可促進LNP與細胞之融合的磷脂可包括(但不限於)選自以下所描述之群的磷脂中之任一者。
在一些實施例中，LNP及LNP組合物包含選自(但不限於)以下之至少一種磷脂：二棕櫚醯基-磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基-磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二油醯基-磷脂醯膽鹼(DOPC)、二油醯基-磷脂醯甘油(DOPG)、棕櫚醯油醯基-磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、棕櫚醯油醯基-磷脂醯甘油(POPG)、二棕櫚醯基-磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二棕櫚醯基-磷脂醯甘油(DPPG)、二肉豆蔻醯基-磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)、單甲基-磷脂醯乙醇胺、二甲基-磷脂醯乙醇胺、二反油醯基-磷脂醯乙醇胺(DEPE)、硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、蛋磷脂醯膽鹼(EPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-[二氧磷基-L-絲胺酸] (DOPS)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-[二氧磷基-L-絲胺酸]，以及前述之任何組合。在一個實例中，包含DOPE之LNP可有效進行mRNA遞送(藥物遞送功效極佳)。
在一些實施例中，本發明之LNP的輔助脂質(例如磷脂)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的約1 mol%至約60 mol%、約2 mol%至約50 mol%、約5 mol%至約40 mol%或約5 mol%至約20 mol%。在其他實施例中，本發明之LNP的輔助脂質(例如磷脂)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的至少約1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60 mol%或前述任一者之中間範圍。
應瞭解，LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質包含以下單獨或組合之脂質：陽離子脂質或可離子化陽離子脂質、結合脂質(例如聚乙二醇化脂質)、肽結合之PEG脂質、類固醇(例如膽固醇)、肽結合之結構性脂質(實例：DSPE-cRGD)及結構性脂質(例如磷脂)，產生在LNP調配物中含有一種至多種成分，但不限於一種、兩種、三種、四種或五種組分之LNP調配物。
LNP及/或LNP組合物可藉由以下方式製備：將總脂質(或其一部分)溶解於有機溶劑(例如乙醇)中，隨後經由微混合器與溶解於酸性緩衝液(例如pH在1.0至6.5之間)中之有效負載(例如系統之核酸)混合。在此pH下，可離子化陽離子脂質帶正電且與帶負電核酸聚合物相互作用。接著，當對中性緩衝液透析時，將含有核酸之所得奈米結構轉化為中性LNP，在將LNP更換為生理學相關緩衝液期間亦包括移除有機溶劑(例如乙醇)。因此形成之LNP及/或LNP組合物具有不同電子密集奈米結構化核心，其中陽離子脂質經組織在封裝的有效負載周圍組織成反向微胞，與傳統雙層脂質體結構相反。在另一實施例中，LNP可與核酸形成泡樣結構，該等核酸沿非電子緻密脂質核心位於水袋中。 b.脂質奈米顆粒特性
LNP及/或LNP組合物可藉由以下方式製備：將總脂質(或其一部分)溶解於有機溶劑(例如乙醇)中，隨後經由微混合器與溶解於酸性緩衝液(例如pH介於1.0-6.5之間)中之有效負載(例如系統之核酸)混合。在此pH下，可離子化陽離子脂質帶正電且與帶負電核酸聚合物相互作用。接著，當對中性緩衝液透析時，將含有核酸之所得奈米結構轉化為中性LNP，在將LNP更換為生理學相關緩衝液期間亦包括移除有機溶劑(例如乙醇)。因此形成之LNP及/或LNP組合物具有不同電子密集奈米結構化核心，其中陽離子脂質經組織在封裝的有效負載周圍組織成反向微胞，與傳統雙層脂質體結構相反。在另一實施例中，LNP可與核酸形成泡樣結構，該等核酸沿非電子緻密脂質核心位於水袋中。
在一些實施例中，本發明之LNP及/或LNP組合物包含陽離子脂質:輔助脂質(例如磷脂):類固醇(例如膽固醇):結合脂質(例如聚乙二醇化脂質)，莫耳比為20至50:10至30:30至60:0.5至5，莫耳比為25至45:10至25:40至50:0.5至3，莫耳比為25至45:10至20:40至55:0.5至3，或莫耳比為25至45:10至20:40至55:1.0至1.5。
在一些實施例中，本發明之LNP及/或LNP組合物之總脂質:有效負載比(質量/質量)為約1至約100。在一些實施例中，總脂質:有效負載比為約1至約50、約2至約25、約3至約20、約4至約15或約5至約10。在一些實施例中，總脂質:有效負載比為約5至約15，例如約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或前述任一者之中間範圍。
在某些實施例中，本發明之LNP包含約5:1至約15:1之總脂質:核酸質量比。在一些實施例中，LNP中包含之陽離子脂質及核酸之重量比可為1至20:1、1至15:1、1至10:1、5至20:1、5至15:1、5至10:1、7.5至20:1、7.5至15:1或7.5至10:1。
在一些實施例中，本發明之LNP可包含20至50重量份之陽離子脂質、10至30重量份之磷脂、20至60重量份(或20至60重量份)之膽固醇及0.1至10重量份(或0.25至10重量份、0.5至5重量份)之脂質-PEG結合物。或者，LNP可包含以總奈米顆粒重量計20至50重量%之陽離子脂質、10至60重量%之磷脂、20至60重量% (或30至60重量%)之膽固醇及0.1至10重量% (或0.25至10重量%、0.5至5重量%)之脂質-PEG結合物。作為另一替代方案，LNP可包含以總奈米顆粒重量計25至50重量%之陽離子脂質、10至20重量%之磷脂、35至55重量%之膽固醇及0.1至10重量% (或0.25至10重量%、0.5至5重量%)之脂質-PEG結合物。
在一些實施例中，本發明之LNP的平均直徑為約20至200 nm、20至180 nm、20至170 nm、20至150 nm、20至120 nm、20至100 nm、20至90 nm、30至200 nm、30至180 nm、30至170 nm、30至150 nm、30至120 nm、30至100 nm、30至90 nm、40至200 nm、40至180 nm、40至170 nm、40至150 nm、40至120 nm、40至100 nm、40至90 nm、40至80 nm、40至70 nm、50至200 nm、50至180 nm、50至170 nm、50至150 nm、50至120 nm、50至100 nm、50至90 nm、60至200 nm、60至180 nm、60至170 nm、60至150 nm、60至120 nm、60至100 nm、60至90 nm、70至200 nm、70至180 nm、70至170 nm、70至150 nm、70至120 nm、70至100 nm、70至90 nm、80至200 nm、80至180 nm、80至170 nm、80至150 nm、80至120 nm、80至100 nm、80至90 nm、90至200 nm、90至180 nm、90至170 nm、90至150 nm、90至120 nm或90至100 nm，或前述任一者之中間範圍。
在一些實施例中，本發明之LNP及/或LNP組合物在酸性pH值下具有正電荷且可經由由有效負載(例如治療劑)之負電荷產生的靜電相互作用囊封有效負載(例如治療劑)。術語「囊封」係指環繞有效負載(例如治療劑)且在生理條件下包埋有效負載(例如治療劑)以形成LNP的脂質之混合物。如本文所用，術語「囊封效率」為LNP囊封之有效負載(例如治療劑)的百分比量。其為在LNP破壞之前大批有效負載(例如治療劑)之量度除以使用基於界面活性劑之試劑(諸如1-2% Triton X-100)破壞LNP之後大批量測之有效負載(例如治療劑)之總量。LNP及/或LNP組合物之囊封效率可為70%或更高、75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、91%或更高、92%或更高、94%或更高或95%或更高。在其他實施例中，LNP及/或LNP組合物之囊封效率為約80%至99%、約85%至98%、約88%至95%、約90%至95%，或有效負載(例如，系統之核酸)可完全囊封在LNP組合物之脂質部分內，且從而保護其免受酶降解。在一些實施例中，在37℃下將LNP及/或LNP組合物暴露於核酸酶中至少約20、30、45或60分鐘或至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小時之後有效負載(例如治療劑)實質上不降解。在一些實施例中，有效負載(例如系統之核酸)與LNP及/或LNP組合物之脂質部分複合。本發明之LNP及/或LNP組合物對哺乳動物，諸如人類無毒。
術語「完全囊封」指示LNP及/或LNP組合物中之有效負載(例如系統之核酸)在暴露於使游離DNA、RNA或蛋白質顯著降解的條件後不會顯著降解。在完全囊封之系統中，LNP及/或LNP組合物中小於約25%、更佳小於約10%且最佳小於約5%的有效負載(例如，系統之核酸)係藉由降解100%未囊封有效負載之條件而降解。「完全囊封」亦指示LNP及/或LNP組合物係血清穩定的，且在活體內投與後在暴露於血清蛋白之後未立即分解成其組分部分，且保護運載物，直至胞內體逃避及釋放至細胞之細胞質中。
在一些實施例中，囊封有有效負載(例如治療劑)之LNP及/或LNP組合物之量為約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約80%至約90%，或至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或前述任一者之中間範圍。
在一些實施例中，囊封在LNP及/或LNP組合物內之有效負載(例如核酸)之量為約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約80%至約90%，或至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或前述任一者之中間範圍。
在一些實施例中，本發明之核酸，諸如編碼抑制子融合蛋白之mRNA及/或gRNA可提供於待與脂質溶液混合的溶液中，以使得核酸可囊封於脂質奈米顆粒中。適合核酸溶液可為含有以各種濃度囊封之核酸的任何水溶液。舉例而言，適合之核酸溶液可含有濃度為或大於約0.01 mg/ml、0.05 mg/ml、0.06 mg/ml、0.07 mg/ml、0.08 mg/ml、0.09 mg/ml、0.1 mg/ml、0.15 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml、1.0 mg/ml、1.25 mg/ml、1.5 mg/ml、1.75 mg/ml或2.0 mg/ml之一或多種核酸。在一些實施例中，核酸包含編碼抑制子融合蛋白之mRNA，且適合mRNA溶液可含有濃度在約0.01-2.0 mg/ml、0.01-1.5 mg/ml、0.01-1.25 mg/ml、0.01-1.0 mg/ml、0.01-0.9 mg/ml、0.01-0.8 mg/ml、0.01-0.7 mg/ml、0.01-0.6 mg/ml、0.01-0.5 mg/ml、0.01-0.4 mg/ml、0.01-0.3 mg/ml、0.01-0.2 mg/ml、0.01-0.1 mg/ml、0.05-1.0 mg/ml、0.05-0.9 mg/ml、0.05-0.8 mg/ml、0.05-0.7 mg/ml、0.05-0.6 mg/ml、0.05-0.5 mg/ml、0.05-0.4 mg/ml、0.05-0.3 mg/ml、0.05-0.2 mg/ml、0.05-0.1 mg/ml、0.1-1.0 mg/ml、0.2-0.9 mg/ml、0.3-0.8 mg/ml、0.4-0.7 mg/ml或0.5-0.6 mg/ml範圍內之mRNA。在一些實施例中，適合之mRNA溶液可含有以下濃度之mRNA：至多約5.0 mg/ml、4.0 mg/ml、3.0 mg/ml、2.0 mg/ml、1.0 mg/ml、0.9 mg/ml、0.8 mg/ml、0.7 mg/ml、0.6 mg/ml、0.5 mg/ml、0.4 mg/ml、0.3 mg/ml、0.2 mg/ml、0.1 mg/ml、0.05 mg/ml、0.04 mg/ml、0.03 mg/ml、0.02 mg/ml、0.01 mg/ml或0.05 mg/ml。在一些實施例中，適合之gRNA溶液可含有以下濃度之gRNA：至多約5.0 mg/ml、4.0 mg/ml、3.0 mg/ml、2.0 mg/ml、1.0 mg/ml、0.9 mg/ml、0.8 mg/ml、0.7 mg/ml、0.6 mg/ml、0.5 mg/ml、0.4 mg/ml、0.3 mg/ml、0.2 mg/ml、0.1 mg/ml、0.05 mg/ml、0.04 mg/ml、0.03 mg/ml、0.02 mg/ml、0.01 mg/ml或0.05 mg/ml。
在一些實施例中，LNP可具有20nm至200nm、20至180nm、20nm至170nm、20nm至150nm、20nm至120nm、20nm至100nm、20nm至90nm、30nm至200nm、30至180nm、30nm至170nm、30nm至150nm、30nm至120nm、30nm至100nm、30nm至90nm、40nm至200nm、40至180nm、40nm至170nm、40nm至150nm、40nm至120nm、40nm至100nm、40nm至90nm、40nm至80nm、40nm至70nm、50nm至200nm、50至180nm、50nm至170nm、50nm至150nm、50nm至120nm、50nm至100nm、50nm至90nm、60nm至200nm、60至180nm、60nm至170nm、60nm至150nm、60nm至120nm、60nm至100nm、60nm至90nm、70nm至200nm、70至180nm、70nm至170nm、70nm至150nm、70nm至120nm、70nm至100nm、70nm至90nm、80nm至200nm、80至180nm、80nm至170nm、80nm至150nm、80nm至120nm、80nm至100nm、80nm至90nm、90nm至200nm、90至180nm、90nm至170nm、90nm至150nm、90nm至120nm或90nm至100nm之平均直徑，以便容易引入肝組織、肝細胞及/或LSEC (肝竇內皮細胞)中。可設定LNP之尺寸以容易引入至器官或組織中，包括但不限於肝、肺、心臟、脾，以及引入至腫瘤。當LNP之尺寸小於以上範圍時，可能難以維持穩定性，因為LNP之表面積過度增加，且因此遞送至目標組織及/或藥物效應可能減小。LNP可特異性地靶向肝臟組織。不希望受理論所束縛，認為LNP可用於遞送治療劑之一種機制係經由模擬天然脂蛋白之代謝行為，且因此LNP可經由肝臟進行之脂質代謝過程有效地遞送至個體。在治療劑遞送至肝細胞及/或LSEC (肝竇內皮細胞)期間，自肝竇內腔通向肝細胞及LSEC之孔壁的直徑在哺乳動物中為約140 nm且在人類中為約100 nm，因此當相比於直徑在上述範圍外之LNP時，用於遞送具有直徑在上述範圍內之LNP的治療劑組合物對肝細胞及LSEC可具有極佳遞送效率。
根據一個實例，LNP組合物之LNP可包含上述範圍內的可離子化陽離子脂質:磷脂:膽固醇:脂質-PEG結合物，或莫耳比為20至50:10至30:30至60:0.5至5，莫耳比為25至45:10至25:40至50:0.5至3，莫耳比為25至45:10至20:40至55:0.5至3，或莫耳比為25至45:10至20:40至55:1.0至1.5。包含以上範圍內之莫耳比之組分的LNP可具有特定針對目標器官之細胞的治療劑的極佳遞送效率。
在某些態樣中，LNP在酸性pH條件下展現正電荷，其中pKa顯示5至8、5.5至7.5、6至7或6.5至7，且可藉由經由與治療劑(諸如顯示負電荷之核酸)之靜電相互作用而易於與核酸形成複合物，從而以高效率囊封核酸。在此類情況下，LNP可有效地用作用於細胞內或活體內遞送治療劑(例如核酸)之組合物。
在本文中，「囊封(encapsulate)」或「囊封(encapsulation)」係指治療劑有效地併入脂質包膜內部，亦即，藉由顆粒表面環繞其及/或將治療劑嵌入於由各種脂質製成之顆粒內部內，當脂質周圍之溶劑的極性增加時脂質進行自組裝。囊封效率意謂在LNP中囊封之治療劑的含量相對於在LNP破壞後量測之每一給定體積的LNP調配物量測的總治療劑含量。
將組合物之核酸囊封於LNP中可為組合物中70%或更高、75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、91%或更高、92%或更高、94%或更高、或95%或更高之LNP囊封核酸。在一些實施例中，組合物之核酸囊封於LNP中使得組合物中80%至99%之間、80%至97%之間、80%至95%之間、85%至95%之間、87%至95%之間、90%至95%之間、91%或更高至95%或更低、91%或更高至94%或更低、超過91%至95%或更低、92%至99%、92%至97%或92%至95%之間的LNP囊封核酸。在一些實施例中，編碼本發明之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白的mRNA及/或gRNA完全囊封於LNP中。
藉由LNP遞送核酸的目標器官包括但不限於肝臟、肺、心臟、脾臟以及腫瘤。根據一個實例之LNP為肝臟組織特異性的且具有極佳生物相容性，且可高效遞送組合物之核酸，因此其可有效地用於相關技術領域，諸如脂質奈米顆粒介導之基因療法。在一特定實施例中，藉由根據一個實例之LNP遞送核酸的目標細胞可為活體內肝細胞及/或LSEC。在其他實施例中，本發明提供經調配用於遞送實施例之核酸至離體細胞的LNP。
本發明提供一種醫藥組合物，其包含複數個包含核酸之LNP，該等核酸諸如編碼本文所描述之抑制子融合蛋白之mRNA及/或gRNA變異體，及醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中，包含核酸之LNP具有電子緻密核心。
本發明提供包含一或多種核酸之LNP，該LNP包含：(a)編碼本文所描述之抑制子融合蛋白的mRNA及/或gRNA變異體；(b)一或多種陽離子脂質或可離子化陽離子脂質或其鹽，佔LNP中存在之總脂質的約20 mol%至約60 mol%；(c)一或多種非陽離子脂質，佔LNP中存在之總脂質的約13 mol%至約49.5 mol%；及(d)一或多種抑制LNP聚集之結合脂質，佔顆粒中存在之總脂質的約0.5 mol%至約2 mol%。在另一實施例中，本發明提供包含一或多種核酸之LNP，該LNP包含：(a)編碼本文所描述之抑制子融合蛋白的mRNA及/或gRNA變異體；(b)一或多種陽離子脂質或可離子化陽離子脂質或其鹽，佔LNP中存在之總脂質的約22 mol%至約85 mol%；(c)一或多種非陽離子脂質/磷脂，佔LNP中存在之總脂質的約10 mol%至約70 mol%；(d) 15 mol%至約50 mol%的固醇；及(d)顆粒中1 mol%至約5 mol%的脂質-PEG或脂質-PEG-肽。在某些實施例中，抑制子融合蛋白mRNA及gRNA可存在於相同核酸-脂質顆粒中，或其可存在於不同核酸-脂質顆粒中。
本發明提供包含一或多種核酸之LNP，該LNP包含：(a)編碼本文所描述之抑制子融合蛋白的mRNA；(b)陽離子脂質或其鹽，佔LNP中存在之總脂質的約52 mol%至約62 mol%；(c)磷脂及膽固醇之混合物或其衍生物，佔LNP中存在之總脂質的約36 mol%至約47 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，佔LNP中存在之總脂質的約1 mol%至約2 mol%。在特定實施例中，調配物為包含約1.4 mol% PEG-脂質結合物(例如PEG2000-C-DMA)、約57.1 mol%陽離子脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽、約7.1 mol% DPPC (或DSPC)及約34.3 mol%膽固醇(或其衍生物)之四組分系統。
在其他實施例中，本發明提供包含一或多種核酸之LNP，該LNP包含：(a)編碼本文所描述之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白的mRNA及/或gRNA；(b)陽離子脂質或其鹽，佔LNP中存在之總脂質的約46.5 mol%至約66.5 mol%；(c)膽固醇或其衍生物，佔LNP中存在之總脂質的約31.5 mol%至約42.5 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，佔LNP中存在之總脂質的約1 mol%至約2 mol%。在特定實施例中，調配物為不含磷脂且包含約1.5 mol% PEG-脂質結合物(例如PEG2000-C-DMA)、約61.5 mol%陽離子脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽及約36.9 mol%膽固醇(或其衍生物)之三組分系統。
額外調配物描述於PCT公開案第WO 09/127060號以及美國專利公開案第US 2011/0071208 A1號及第US 2011/0076335 A1號中，該等文獻之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在其它實施例中，本發明提供包含一或多種核酸之LNP，該LNP包含：(a)編碼本文所描述之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白的mRNA及/或gRNA變異體；(b)一或多種陽離子脂質或可離子化陽離子脂質或其鹽，佔LNP中存在之總脂質的約2 mol%至約50 mol%；(c)一或多種非陽離子脂質或可離子化陽離子脂質，佔LNP中存在之總脂質的約5 mol%至約90 mol%；及(d)一或多種抑制顆粒聚集之結合脂質，佔LNP中存在之總脂質的約0.5 mol%至約20 mol%。
在其他實施例中，本發明提供包含一或多種核酸之LNP，該LNP包含：(a)編碼本文所描述之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白的mRNA以及gRNA；(b)陽離子脂質或其鹽，佔LNP中存在之總脂質的約30 mol%至約50 mol%；(c)磷脂及膽固醇之混合物或其衍生物，佔LNP中存在之總脂質的約47 mol%至約69 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，佔LNP中存在之總脂質的約1 mol%至約3 mol%。在特定實施例中，調配物為包含約2 mol% PEG-脂質結合物(例如PEG2000-C-DMA)、約40 mol%陽離子脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽、約10 mol% DPPC (或DSPC)及約48 mol%膽固醇(或其衍生物)之四組分系統。
在其他實施例中，本發明提供包含一或多種核酸之LNP，該LNP包含：(a)編碼本文所描述之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白的mRNA以及gRNA；(b)一或多種陽離子脂質或可離子化陽離子脂質或其鹽，佔LNP中存在之總脂質的約50 mol%至約65 mol%；(c)一或多種非陽離子脂質或可離子化陽離子脂質，佔LNP中存在之總脂質的約25 mol%至約45 mol%；及(d)一或多種抑制顆粒聚集之結合脂質，佔LNP中存在之總脂質的約5 mol%至約10 mol%。
在其他實施例中，本發明提供包含一或多種核酸之LNP，該LNP包含：(a)編碼本文所描述之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白的mRNA以及gRNA；(b)陽離子脂質或其鹽，佔LNP中存在之總脂質的約50 mol%至約60 mol%；(c)磷脂及膽固醇之混合物或其衍生物，佔LNP中存在之總脂質的約35 mol%至約45 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，佔LNP中存在之總脂質的約5 mol%至約10 mol%。
在某些實施例中，調配物中之非陽離子脂質混合物包含：(i)磷脂，其為LNP中存在之總脂質的約10 mol%至約70 mol%；(ii)膽固醇或其衍生物，其為LNP中存在之總脂質的約15 mol%至約50 mol%；及1至5%脂質-PEG或脂質-PEG-肽。在特定實施例中，調配物為包含約7 mol% PEG-脂質結合物(例如PEG750-C-DMA)、約54 mol%陽離子脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽、約7 mol% DPPC (或DSPC)及約32 mol%膽固醇(或其衍生物)之四組分系統。
在其他實施例中，本發明提供包含一或多種核酸之LNP，該LNP包含：(a)編碼本文所描述之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白的mRNA及/或gRNA；(b)陽離子脂質或其鹽，佔LNP中存在之總脂質的約55 mol%至約65 mol%；(c)膽固醇或其衍生物，佔LNP中存在之總脂質的約30 mol%至約40 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，佔LNP中存在之總脂質的約5 mol%至約10 mol%。在特定實施例中，調配物為不含磷脂且包含約7 mol% PEG-脂質結合物(例如PEG750-C-DMA)、約58 mol%陽離子脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽及約35 mol%膽固醇(或其衍生物)之三組分系統。
在其他實施例中，本發明提供包含一或多種核酸之LNP，該LNP包含：(a)編碼本文所描述之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白的mRNA及/或gRNA；(b)陽離子脂質或其鹽，佔LNP中存在之總脂質的約48 mol%至約62 mol%；(c)磷脂及膽固醇之混合物或其衍生物，其中磷脂佔LNP中存在之總脂質的約7 mol%至約17 mol%，且其中膽固醇或其衍生物佔LNP中存在之總脂質的約25 mol%至約40 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，佔LNP中存在之總脂質的約0.5 mol%至約3.0 mol%。 VIII.    用於抑制PCSK9目標核酸之系統及方法
在另一態樣中，本發明提供包含有包含催化失活CRISPR蛋白之抑制子融合蛋白及一或多種gRNA之系統(抑制子融合蛋白:gRNA系統)，其用於抑制細胞群體中 PCSK9基因之目標核酸。本文中所提供之系統適用於各種應用，包括作為治療劑、診斷及用於研究。為了實現本發明之方法，本文提供 PCSK9基因之抑制或沉默，其為可程式化抑制子融合蛋白:gRNA系統。本文所提供之系統的可程式化性質允許精確靶向以在 PCSK9基因目標核酸中之預定關注一或多個區域處達成所需效應。在一些實施例中，可能需要減少或消除包含突變之個體中的PCSK9蛋白之基因的表現，例如導致高膽固醇血症或家族性或常染色體顯性高膽固醇血症之顯性突變。在一些實施例中，可能需要減少或消除膽固醇水平升高之個體中PCSK9蛋白之表現，該膽固醇水平升高並非 PCSK9基因突變之結果。
在一些實施例中，本發明提供系統，其經特定設計以用於抑制或沉默真核細胞中 PCSK9基因之目標核酸轉錄的方法；抑或活體外、離體或在個體活體內。一般而言，基因之任何部分均可使用本文所提供之可程式化系統及方法靶向。在一個實施例中，本發明提供用於抑制細胞群體中 PCSK9基因之目標核酸序列的方法，該方法包含將以下引入至群體之各細胞中：i)本文所描述之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白:gRNA系統，其包含抑制子融合蛋白及gRNA；ii)本文所描述之實施例中之任一者之編碼抑制子融合蛋白及gRNA之核酸；iii)選自由反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體及單純疱疹病毒(HSV)載體組成之群之載體，以及包含上述(iv)之核酸的載體；v)LNP或合成奈米顆粒，其包含gRNA及編碼抑制子融合蛋白之mRNA；或vi)(i)至(v)中之兩者或更多者的組合，其中由gRNA靶向之細胞的目標核酸序列的轉錄藉由抑制子融合蛋白進行抑制。在該方法之一些實施例中，使細胞與實施例之抑制子融合蛋白:gRNA系統接觸使得至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、或至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或更多的群體之細胞的 PCSK9目標核酸經抑制。在該方法之一些實施例中，群體細胞中之 PCSK9基因經抑制或沉默，使得與 PCSK9基因尚未靶向之細胞相比，PCSK9蛋白之表現減少至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。在一些實施例中，當在活體外分析中分析時，群體細胞之PCSK9基因之轉錄的抑制持續至少約8小時、至少約1天、至少約7天、至少2週、至少約3週、至少約1個月或至少約2個月。在一些實施例中，群體細胞之 PCSK9基因之轉錄的抑制係可遺傳的，其中PCKS9基因之抑制持續至少1、2、3、4、5或6次或更多次細胞分裂。
在該方法之一些實施例中，細胞之抑制發生於活體外。在方法之一些實施例中，細胞之抑制係離體發生。在一些實施例中，抑制活體外發生於細胞內部，之後將細胞引入至個體中。在一些實施例中，細胞為個體自體的或同種異體的。在該方法之一些實施例中，細胞之抑制在投與本文所揭示之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白的個體中活體內發生。在該方法之一些實施例中，細胞為真核細胞。在該方法之一些實施例中，真核細胞選自由以下組成之群：嚙齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、靈長類動物細胞及非人類靈長類動物細胞。在該方法之一些實施例中，真核細胞係人類細胞。在該方法之一些實施例中，細胞為胚胎幹細胞、誘導型多能幹細胞、生殖細胞、纖維母細胞、寡樹突神經膠質細胞、膠細胞、造血幹細胞、神經元祖細胞、神經元、星形膠質細胞、肌肉細胞、骨細胞、肝細胞、胰臟細胞、視網膜細胞、癌細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、胚胎心肌細胞、肌纖維母細胞、間充質幹細胞、自體移植擴增之心肌細胞、脂肪細胞、全能細胞、多能細胞、血液幹細胞、肌母細胞、骨髓細胞、間充質細胞、實質細胞、上皮細胞、內皮細胞、間皮細胞、纖維母細胞、骨母細胞、軟骨細胞、造血幹細胞、骨髓衍生之祖細胞、心肌細胞、骨骼細胞、胚胎細胞、未分化細胞、多能祖細胞、單能祖細胞、單核球、心肌母細胞、骨骼肌母細胞、巨噬細胞、毛細管內皮細胞、異種細胞、同種異體細胞或出生後幹細胞。
在一些實施例中，本發明提供一種逆轉由抑制子融合蛋白:gRNA系統產生之細胞群體中 PCSK9基因之抑制的方法。在一些實施例中，抑制藉由將DNMT之抑制劑引入至群體之細胞中而為可逆的。在該方法之一些實施例中，抑制藉由使用DNMT之胞苷類似物抑制劑而為可逆的。在一些實施例中，抑制藉由使用選自由以下組成之群的抑制劑為可逆的：阿紮胞苷(azacytidine)、地西他濱(decitabine)、氯法拉濱(clofarabine)及澤布拉林(zebularine)。在一些實施例中，抑制藉由使用濃度為0.1 µM至40 µM或任何中間濃度之抑制劑而為可逆的。在一些實施例中，該方法包含向用本發明之系統治療之個體投與治療有效劑量之DNMT的抑制劑，由此逆轉由系統引起的 PCSK9抑制。
在一些實施例中，抑制子融合蛋白:gRNA系統包含抑制子融合蛋白，該抑制子融合蛋白包含如表20中所闡述之SEQ ID NO: 3131-3132之序列，或與其至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致或至少99.5%一致的序列；及gRNA骨架，其包含SEQ ID NO: 1744-1746或2947-2976之序列，或與其至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致的序列，且gRNA包含SEQ ID NO: 1824-2944之靶向序列且或與至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致或至少95%一致的序列且具有15及20個之間的胺基酸。在該系統之一些實施例中，gRNA包含SEQ ID NO: 1824-2944之靶向序列，如表7中所闡述。在一特定實施例中，該系統之抑制子融合蛋白包含選自由SEQ ID NO: 3131-3132組成之群的序列，gRNA骨架包含選自由SEQ ID NO: 1744-1746及2947-2976組成之群的序列，且抑制子融合蛋白:gRNA系統之gRNA之靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1824-2545之序列組成之群。在一特定實施例中，抑制子融合蛋白包含選自由SEQ ID NO: 3131-3132之序列組成之群的序列，gRNA骨架包含選自由SEQ ID NO: 1744-1746及2947-2976組成之群的序列，且gRNA之靶向序列係選自由如表8中所闡述之SEQ ID NO: 1824-1890、1910、1925、2672、2675、2694及2714之序列組成之群。在一特定實施例中，其中系統調配於LNP中，抑制子融合蛋白包含選自由SEQ ID NO: 3131-3132組成之群的序列且由mRNA編碼，gRNA骨架包含SEQ ID NO: 1746之序列，且gRNA之靶向序列選自由SEQ ID NO: 1824-1890、1910、1925、2672、2675、2694及2714組成之群。
在一些實施例中，系統包含mRNA，該mRNA包含一或多種選自由SEQ ID NO: 3105、3109及3115-3128組成之群的序列，或與其至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致或至少99.5%一致的序列。在一些實施例中，系統包含mRNA，該mRNA包含一或多種選自由SEQ ID NO: 3105、3109及3115-3128組成之群的序列。在一特定實施例中，系統調配於LNP中，該LNP囊封包含選自由SEQ ID NO: 3105、3109及3115-3128組成之群的一或多種序列的mRNA序列，及選自由SEQ ID NO: 2948-2956、2958-2966及2968-2976組成之群的gRNA，且gRNA之靶向序列選自由以下序列組成之群：SEQ ID NO: 1824-1890、1910、1925、2672、2675、2694及2714。在一些實施例中，mRNA包含序列，其中至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%之序列的尿苷核苷經N1-甲基假尿苷置換。在一些實施例中，mRNA進一步包含5'非轉譯區(UTR)及3'非轉譯區(UTR)。
在該方法之一個實施例中，使用包含編碼本文所揭示之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白之mRNA及gRNA變異體的LNP將系統引入細胞中。在一些實施例中，LNP包含編碼抑制子融合蛋白之mRNA，該抑制子融合蛋白包含一或多種選自由SEQ ID NO: 3105、3109及3115-3128組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或具有至少約99%序列一致性的序列。在前述之一些實施例中，LNP包含本發明之gRNA變異體，其具有與 PCSK9目標核酸互補之靶向序列。在一些實施例中，LNP包含編碼抑制子融合蛋白之mRNA，其中mRNA包含選自SEQ ID NO: 3129-3130之序列。在一些實施例中，LNP包含gRNA變異體骨架174 (SEQ ID NO: 1744)。在一些實施例中，LNP包含gRNA變異體骨架235 (SEQ ID NO: 1745)。在一些實施例中，LNP包含gRNA變異體骨架316 (SEQ ID NO: 1746)。在一些實施例中，LNP包含具有化學修飾之gRNA變異體骨架316，其包括SEQ ID NO: 2968-2976之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性的序列中所闡述之修飾。在一特定實施例中，LNP包含編碼包含dCasX 491 (SEQ ID NO: 4)之抑制子融合蛋白的mRNA以及具有化學修飾之gRNA變異體316，其選自由SEQ ID NO: 2968-2976組成之群，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性之序列，其連接有靶向序列，選自由經化學修飾之SEQ ID NO: 1824-2944的序列組成之群。在一特定實施例中，LNP包含編碼包含dCasX 491 (SEQ ID NO: 4)之抑制子融合蛋白的mRNA以及具有包含SEQ ID NO: 2968之序列的化學修飾之gRNA變異體骨架316，其連接有靶向序列，選自由經化學修飾之SEQ ID NO: 1824-2944的序列組成之群。在該方法之一些實施例中，待修飾之細胞選自由以下組成之群：嚙齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞及非人類靈長類動物細胞。在該方法之其他實施例中，待修飾細胞為人類細胞。在該方法之一些實施例中，細胞群體之轉錄抑制在個體活體內發生，其中個體選自由以下組成之群：嚙齒動物、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物及人類。在該等方法之一些實施例中，經修飾之細胞為肝細胞，或腸細胞、腎臟、中樞神經系統、平滑肌細胞、巨噬細胞，或動脈壁細胞，諸如內皮細胞。
LNP可藉由選自由靜脈內、動脈內、門靜脈內注射、腹膜內、肌內、腦室內、腦池內、鞘內、顱內、腰髓內、眼內、皮下及經口途徑組成之群的投與途徑進行投與。
在抑制 PCSK9基因之方法之一些實施例中，本發明之基因抑制子系統可經設計以靶向 PCSK9基因之任何區域或接近 PCSK9基因之區域，尋求轉錄抑制。當要抑制整個基因時，本發明考慮設計具有與涵蓋或接近轉錄起始部位(TSS)之序列互補的靶向序列的引導物。視啟動子序列及起始受質濃度而定，TSS選擇發生在啟動子區內的不同位置。核心啟動子充當用於轉錄機制之結合平台，其包含Pol II及其相關通用轉錄因子(general transcription factor；GTF) (Haberle, V.等人, Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation (Nat Rev Mol Cell Biol. 19(10):621 (2018))。已提出TSS選擇之變化性涉及DNA『蜷縮(scrunching)』及『反蜷縮』，其標誌為：(i)RNA聚合酶前邊緣而非後邊緣相對於DNA之向前及反向移動，及(ii)轉錄泡之膨脹及收縮。在一些實施例中，與抑制子融合蛋白:gRNA系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之轉錄起始部位(TSS)之1 kb內。在一些實施例中，與系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之TSS上游20 bp、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp或1 kb內。在一些實施例中，與系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之TSS下游20 bp、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp或1 kb內。在一些實施例中，與系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之TSS的上游500 bp至下游500 bp或上游300 bp至下游300 bp內。在一些實施例中，與系統之RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之強化子的20 bp、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp或1 kb內。在一些實施例中，與抑制子融合蛋白:gRNA RNP結合的目標核酸序列在 PCSK9基因之3'至5'非轉譯區之1 kb內。在其他實施例中，與系統之RNP結合的目標核酸序列在PCSK9基因之開放閱讀框內，包括內含子(若存在)。在一些實施例中，系統之gRNA的靶向序列設計成對 PCSK9基因之外顯子具有特異性。在一特定實施例中，系統之gRNA的靶向序列設計成對 PCSK9基因之外顯子1具有特異性。在其他實施例中，系統之gRNA的靶向序列設計成對 PCSK9基因之內含子具有特異性。在其他實施例中，系統之gRNA的靶向序列經設計以對 PCSK9基因之內含子-外顯子接合點具有特異性。在其他實施例中，系統之gRNA的靶向序列設計成對 PCSK9基因之調節元件具有特異性。在其他實施例中，系統之gRNA的靶向序列設計成與 PCSK9基因之基因間區的序列互補。在其他實施例中，系統之gRNA的靶向序列設計成對 PCSK9基因之外顯子、內含子及/或調節元件之接合點具有特異性。在靶向序列對調節元件具有特異性之彼等情況下，此類調節元件包括(但不限於)啟動子區、強化子區、基因間區、5'非轉譯區(5' UTR)、3'非轉譯區(3' UTR)、保守元件及包含順式調節元件之區。在一些實施例中，系統之gRNA之靶向序列與 PCSK9基因之強化子之1 kb內的基因目標核酸序列互補。在一些實施例中，系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之3'非轉譯區內的基因目標核酸序列互補。啟動子區意欲涵蓋編碼序列之起始點之5 kb內的核苷酸，或在基因強化子元件或保守元件的情況下，可與 PCSK9基因之編碼序列相距數千bp、數十萬bp或甚至數百萬bp。在前述內容中，目標為其中編碼 PCSK9基因意欲被抑制及/或表觀遺傳修飾以使得 PCSK9基因產物在細胞中不表現或表現量較低的彼等目標。在一些實施例中，在系統之RNP結合於目標核酸之結合位置後，系統能夠抑制在RNP之結合位置5'的 PCSK9基因之轉錄。在其他實施例中，在系統之RNP結合於目標核酸之結合位置後，系統能夠抑制在RNP之結合位置3'的 PCSK9基因之轉錄。
本文所描述之系統及方法可用於多種與疾病相關之細胞，例如肝細胞、腸細胞、腎細胞、中樞神經系統細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞或動脈壁細胞，其中 PCSK9基因經抑制或沉默。因此，此方法可用於應用於患有PCSK9相關病症之個體，該病症諸如(但不限於)常染色體顯性高膽固醇血症(ADH)、高膽固醇血症、總膽固醇水平升高、高血脂病、低密度脂蛋白(LDL)水平升高、LDL-膽固醇水平升高、高密度脂蛋白水平降低、肝臟脂肪變性、冠心病、缺血、中風、周邊血管疾病、血栓形成、2型糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、肥胖症、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、神經退化、老年性黃斑部病變(AMD)或其組合。 IX.        治療方法
本發明提供治療有需要之個體之PCSK9相關疾病或病症之方法，該病症包括(但不限於)常染色體顯性高膽固醇血症(ADH)、高膽固醇血症、總膽固醇水平升高、低密度脂蛋白(LDL)水平升高、高密度脂蛋白水平降低、肝臟脂肪變性、動脈粥樣硬化性心血管疾病、冠狀動脈疾病、缺血、中風、周邊血管疾病、血栓形成、2型糖尿病、高血壓、肥胖症、阿茲海默氏症、神經退化、老年性黃斑部病變(AMD)或其組合。在一些實施例中，本發明之方法可藉由向個體投與本發明之組合物來預防、治療及/或改善個體之PCSK9相關疾病或病症。在一些實施例中， PCSK9相關疾病為常染色體顯性高膽固醇血症(ADH)、高膽固醇血症、總膽固醇水平升高、高血脂病、低密度脂蛋白(LDL)水平升高、LDL-膽固醇水平升高、高密度脂蛋白水平降低、肝臟脂肪變性、冠心病、缺血、中風、周邊血管疾病、血栓形成、2型糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、肥胖症、主動脈狹窄、PCSK9水平升高或其組合。在一些實施例中，向個體投與之組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
在一些情況下，待藉由本發明方法治療之個體之PCSK9基因為野生型的，但個體仍然具有高膽固醇血症、總膽固醇水平升高、高血脂病、低密度脂蛋白(LDL)水平升高、LDL-膽固醇水平升高、高密度脂蛋白水平降低、肝臟脂肪變性、冠心病、缺血、中風、周邊血管疾病、血栓形成、2型糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、肥胖症、主動脈狹窄、PCSK9水平升高或其組合。在此類情況下，藉由向個體投與本發明之組合物，本發明之方法可預防、治療及/或改善個體之PCSK9相關疾病或病症。
在一些情況下，個體之 PCSK9基因之一個或兩個對偶基因包含突變。在一些情況下，PCSK9相關疾病或病症突變為功能獲得型突變，包括(但不限於)編碼選自由以下組成之群的胺基酸取代的突變：相對於SEQ ID NO: 1823之序列的S127R、D129G、F216L、D374H及D374Y。在其他情況下，PCSK9相關病症突變為功能喪失型突變，包括(但不限於)編碼選自由以下組成之群的胺基酸取代的突變：相對於SEQ ID NO: 1823之序列的R46L、G106R、Y142X、N157K、R237W及C679X。
在一些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之PCSK9或相關疾病或病症的方法，其包含使個體之細胞中之PCSK9基因抑制或沉默，該方法包含使該等細胞與治療有效劑量之以下接觸：i)抑制子融合蛋白:gRNA系統，其包含抑制子融合蛋白及gRNA；ii)本文所描述之實施例中之任一者之編碼抑制子融合蛋白及gRNA之核酸；iii)LNP或合成奈米顆粒，其包含本文所描述之實施例中之任一者之gRNA及編碼抑制子融合蛋白之mRNA；或iv)(i)至(iii)中之兩者或更多者的組合，其中由gRNA靶向之細胞的目標核酸序列藉由抑制子融合蛋白進行抑制或沉默。在該方法之一些實施例中，使細胞與抑制子融合蛋白:gRNA系統接觸使得至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、或至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或更多的靶向器官之細胞的 PCSK9目標核酸經抑制。在該方法之一些實施例中，靶向器官之細胞中之PCSK9基因經抑制，使得PCSK9蛋白質之表現相較於未處理細胞減少至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。在該方法之一些實施例中，使靶向器官之細胞與抑制子融合蛋白:gRNA系統接觸產生細胞中之PCSK9目標核酸的可遺傳抑制。經治療個體之修飾細胞可為選自由以下組成之群的真核細胞：嚙齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、靈長類動物細胞、非人類靈長類動物細胞及人類細胞。在一些實施例中，經治療之個體之真核生物細胞為人類細胞。在一些實施例中，細胞為涉及產生LDL之細胞，包括(但不限於)肝細胞、或腸細胞、腎細胞、中樞神經系統細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、視網膜細胞，或動脈壁(諸如內皮)之細胞。在一些實施例中，細胞為眼細胞。在治療個體之PCSK9相關病症之方法的一些實施例中，個體選自由小鼠、大鼠、豬、非人類靈長類動物及人類組成之群。
多種治療策略已用於設計用於治療患有PCSK9相關疾病或病症之個體之方法的系統。在一些實施例中，本發明提供治療患有PCSK9相關疾病或病症之個體的方法，該方法包含根據包含一或多個連續劑量、使用治療有效劑量之治療方案向個體投與本文所揭示之實施例中之任一者的抑制子融合蛋白:gRNA組合物。在治療方案之一些實施例中，治療有效劑量之組合物呈單次劑量形式投與。在治療方案之其他實施例中，治療有效劑量係經至少兩週、或至少一個月、或至少兩個月、或至少三個月、或至少四個月、或至少五個月、或至少六個月之時段以兩個或更多個劑量向個體投與。在治療方案之一些實施例中，有效劑量藉由選自由靜脈內、門靜脈內注射、腹膜內、肌內、皮下、眼內及經口途徑組成之群的途徑進行投與。
在一些實施例中，本發明提供本文所描述之實施例中之任一者之抑制子融合蛋白及gRNA的系統，其用於治療PCSK9相關疾病或病症之方法，其中向個體投與治療有效劑量之組合物。在一些實施例中，組合物包含如表20中所闡述之SEQ ID NO: 3131-3132之抑制子融合蛋白，或與其至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致或至少99.5%一致的序列；及gRNA骨架，其包含選自由如表9中所闡述之SEQ ID NO: 1744-1746或SEQ ID NO: 2947-2976組成之群之序列，或與其至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少81%一致、至少82%一致、至少83%一致、至少84%一致、至少85%一致、至少86%一致、至少86%一致、至少87%一致、至少88%一致、至少89%一致、至少89%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致的序列，且gRNA包含靶向序列，其為選自由SEQ ID NO: 1824-2944組成之群之序列或與其至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致或至少95%一致的序列且具有15及20個之間的胺基酸。在一些實施例中，gRNA包含選自由SEQ ID NO: 1824-1890、1910、1925、2672、2675、2694及2714組成之群的靶向序列或與其具有至少約65%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%一致性的序列。
在一些實施例中，組合物投與至LNP調配物中。在一些實施例中，本發明提供抑制子融合蛋白及gRNA組合物，其用於製造用於治療個體之PCSK9相關疾病或病症之藥劑，其中抑制PCSK9產生疾病改善或預防與疾病或病症相關之症狀或臨床結果。
在一些實施例中，向患有PCSK9相關疾病或病症之個體投與治療有效量之抑制子融合蛋白:gRNA模態，以抑制或沉默 PCSK9之表現，引起潛在PCSK9相關病症或病症之預防或改善，使得在個體中觀測到改善，儘管個體仍可罹患潛在病症。在一些實施例中，抑制子融合蛋白:gRNA模態包含LNP，該LNP包含gRNA及編碼抑制子融合蛋白之mRNA及本文所揭示之引導核糖核酸。在一些實施例中，投與治療有效量之抑制子融合蛋白:gRNA模態引起至少一個選自由以下組成之群的臨床相關終點得到改善，包括(但不限於)：LDL-膽固醇相對於基線之變化、斑塊動脈粥瘤體積之減少、冠狀動脈斑塊之減少、動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)之減少、心臟血管死亡、非致命心肌梗塞、缺血性中風、非致命中風、冠狀動脈血管再形成、不穩定型心絞痛或視力。在一些實施例中，投與治療有效量之抑制子融合蛋白:gRNA模態使得至少兩個臨床相關終點得到改善。在一些實施例中，個體係選自小鼠、大鼠、豬、犬、非人類靈長類動物及人類。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，治療方法進一步包含投與化學治療劑，其中該藥劑有效降低LDL水平。此類藥劑包括(但不限於)史他汀(statins)、菸酸、纖維酸酯或抗PCSK9抗體藥物。
自用於分析之經治療個體獲得樣品(諸如體液或組織)以測定治療之有效性的方法及製備樣品以允許分析之方法為熟習此項技術者所熟知。RNA及蛋白質水平之分析方法在上文論述且為熟習此項技術者所熟知。治療作用亦可藉由利用此項技術中已知之常規臨床方法量測自與一或多種本發明化合物接觸之動物收集的與前述流體、組織或器官中之 PCSK9基因表現相關之生物標記物來評估。PCSK9病症之生物標記物包括(但不限於) PCSK9水平、低密度脂蛋白(LDL-膽固醇)、脂蛋白元B、非HDL膽固醇、三酸甘油酯及脂蛋白a、可溶性CD40配位體、骨橋蛋白(OPN)、骨保護素(OPG)、基質金屬蛋白酶(MMP)及骨髓過氧化酶(MPOP)，其中標記物之濃度係與已知生理學上正常濃度或未患PCSK9病症之個體中的濃度相比。
存在表現PCSK9之突變形式之若干小鼠模型且適合於評估治療方法。PCSK9相關病症之轉殖基因小鼠模型包括具有hPCSK9之基因敲入小鼠模型(Carreras, A. In vivogenome and base editing of a human PCSK9 knock-in hypercholesterolemic mouse model. MC Biology 17:4 (2019)；Herbert B.等人, Increased secretion of lipoproteins in transgenic mice expressing human D374Y PCSK9 under physiological genetic control. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30(7):1333 (2010))。
在一些實施例中，治療個體之PCSK9相關疾病或病症之方法包含用增加肝LDL受體(LDLR)表現之治療劑來治療個體。在一些實施例中，治療劑為PCSK9抑制劑，諸如單株抗體、基於核酸之藥劑或小分子。例示性治療劑包括(但不限於)依洛尤單抗(evolocumab)、因利司然(inclisiran)、阿利庫單抗(alirocumab)及MK-0616。不希望受理論或機制束縛，咸信用PCSK9之抑制劑預治療可引起肝LDL受體(LDLR)表現增加，其隨後可促進隨後向個體投與之LNP的吸收，該LNP包含CasX:gRNA組合物。藉由增加LNP之肝細胞吸收，預期將增強 PCSK9基因之編輯以使得可獲得PCSK9相關病症之改善。 X.          醫藥組合物、套組及製品
在一些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：i)本發明之抑制子融合蛋白及包含對 PCSK9基因具有特異性之靶向序列的gRNA；ii)一或多種編碼(i)之抑制子及gRNA之核酸；iii)包含gRNA及編碼抑制子融合蛋白之mRNA的LNP或合成奈米顆粒，以及一或多種醫藥學上適合之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物經調配以用於選自由靜脈內、門靜脈內注射、腹膜內、肌內、皮下、眼內及經口途徑組成之群的投與途徑進行投與。在一個實施例中，醫藥組合物係呈液態形式或冷凍形式。在另一實施例中，醫藥組合物在用於單次注射之預填充注射器中。在另一實施例中，醫藥組合物呈固體形式，例如凍乾醫藥組合物。
在其他實施例中，本文提供套組，其包含本發明之實施例中之任一者的抑制子融合蛋白及一個或複數個CasX gRNA，該gRNA包含對PCSK9基因具有特異性之靶向序列，以及適合之容器(例如管、小瓶或培養盤)。
在其他實施例中，本文提供包含LNP調配物之套組，該LNP調配物囊封編碼本發明之實施例中之任一者的抑制子融合蛋白的mRNA及一個或複數個CasX gRNA，該gRNA包含對PCSK9基因具有特異性之靶向序列，以及適合之容器(例如管、小瓶或培養盤)。在例示性實施例中，本發明之套組包含本文所揭示之抑制子融合蛋白中之任一者及SEQ ID NO: 1744-1746及2947-2976中之任一者之gRNA骨架。
在一些實施例中，套組包含gRNA或編碼gRNA之載體，其中gRNA包含選自由SEQ ID NO: 1744-1746及2947-2976組成之群的骨架序列，及選自由如表7中所闡述之SEQ ID NO: 1824-2944組成之群的靶向序列。在一些實施例中，gRNA骨架包含選自由SEQ ID NO: 2948-2956、2958-2966及2968-2976組成之群的序列，及選自由如表7中所闡述之SEQ ID NO: 1824-2944組成之群的靶向序列。在一些實施例中，gRNA骨架包含選自由SEQ ID NO: 2948-2956、2958-2966及2968-2976組成之群的序列，及選自由SEQ ID NO: 1824-1890、1910、1925、2672、2675、2694及2714之序列組成之群的靶向序列。
在某些實施例中，本文提供套組，其包含：抑制子融合蛋白及gRNA抑制子對，其包含本文所揭示之抑制子融合蛋白中之任一者及gRNA變異體，該gRNA變異體包含選自表9中所闡述之由SEQ ID NO: 1744-1746組成之群的骨架序列及選自由如表7中所闡述之SEQ ID NO: 1824-2944組成之群的靶向序列。在一些實施例中，基因抑制對之gRNA包含選自由SEQ ID NO: 2947-2976組成之群的骨架序列及如表7中所闡述之SEQ ID NO: 1824-2944中之任一者的靶向序列。在一些實施例中，基因抑制對之gRNA包含選自由SEQ ID NO: 2948-2956、2958-2966及2968-2976組成之群的骨架序列及選自由SEQ ID NO: 1824-1890、1910、1925、2672、2675、2694及2714之序列組成之群的靶向序列。
在一些實施例中，套組進一步包含緩衝劑、核酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、脂質體、治療劑、標記、標記觀測試劑、使用說明書或前述之任何組合。在一些實施例中，套組進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
在一些實施例中，套組包含用於基因抑制應用之適當對照組合物，及使用說明書。
在一些實施例中，套組包含載體，該載體包含編碼本發明之抑制子融合蛋白及本發明之CasX gRNA的序列。
以下實例僅為說明性的且不意欲以任何方式限制本發明之任何態樣。 實例 實例 1 ：使用抑制子融合蛋白抑制人類細胞中之 PCSK9
CasX以減少目標基因表現之染色質重塑子及DNA甲基轉移酶為習知基因編輯用於減少與某些疾病及病症相關之蛋白質表現的替代方法。進行實驗以在HepG2細胞中短暫表現長期抑制子蛋白(LTRP，在本文中亦可互換地稱為抑制子融合蛋白)以減少PCSK9水平而無需使用永久基因體編輯。 材料及方法：
基於TTC PAM序列之可用性，人工選擇間隔子(亦稱為靶向序列)設計： PCSK9啟動子上游1KB及 PCSK9外顯子1中的間隔子。內含子1、外顯子5及內含子5中之間隔子係基於在人類肝臟中鑑別為低甲基化之區域中之TTC PAM之可用性而選擇。
使用標準分子選殖技術生成慢病毒質體構築體，該等慢病毒質體構築體包含編碼具有#1組態(如圖1所示)之LTRP蛋白的序列、引導骨架變異體174及表10中所列之靶向 PCSK9之間隔子。中量提取經選殖及序列驗證之構築體且進行品質評估，之後在HepG2細胞中轉染。根據製造商說明書使用Viafect轉染劑轉染質體構築體。
HepG2在補充有10% FBS及1% Pen/Strep之DMEM F/12培養基中生長且保持在生長階段中。
使用Zymo Quick-RNA套組分離mRNA，且根據製造商說明使用Thermo High-Capacity RNA-to-cDNA™套組進行反轉錄。
分泌之PCSK9及人類血清白蛋白水平分別經由PerkinElmer/Cisbio cat#63ADK050PEH及HSA ELISA: Perkin Elmer/Cisbio cat#6FHSAPEG評估。 表 10 ： 靶向人類 PCSK9 基因座之 LTRP 特異性間隔子的序列。
間隔子 ID PAM 間隔子 DNA 序列 SEQ ID NO: 間隔子 RNA 序列 SEQ ID NO: 靶向區域
6.1 TTC GAGGAGGACGGCCTGGCCGA 2977 GAGGAGGACGGCCUGGCCGA 1834 外顯子1
6.4 TTC GCCAGGCCGTCCTCCTCGGA 2978 GCCAGGCCGUCCUCCUCGGA 1836 外顯子1
6.5 TTC GTGCTCGGGTGCTTCGGCCA 2979 GUGCUCGGGUGCUUCGGCCA 1837 外顯子1
6.112 TTC CTTGGCAGTTGAGCACGCGC 2980 CUUGGCAGUUGAGCACGCGC 2223 外顯子5
6.117 TTC ACTTTGTTTGCAAAGACCTC 2981 ACUUUGUUUGCAAAGACCUC 1838 啟動子
6.118 TTC GAGTGAAATGGCCTGCTCTG 2982 GAGUGAAAUGGCCUGCUCUG 1839 啟動子
6.119 TTC GAGCAGGCCATTTCACTCGG 2983 GAGCAGGCCAUUUCACUCGG 1840 啟動子
6.120 TTC CTCGGAATCTGCTGTGCATC 2984 CUCGGAAUCUGCUGUGCAUC 1841 啟動子
6.121 TTC GGAAGGGCTGTCGATACTGG 2985 GGAAGGGCUGUCGAUACUGG 1842 啟動子
6.122 TTC CCTTTGTTTCTTCCCAGTAT 2986 CCUUUGUUUCUUCCCAGUAU 1883 啟動子
6.123 TTC TCCCAGTATCGACAGCCCTT 2987 UCCCAGUAUCGACAGCCCUU 1843 啟動子
6.124 TTC CAGTATCGACAGCCCTTCCA 2988 CAGUAUCGACAGCCCUUCCA 1844 啟動子
6.125 TTC AGAAAGAGCAAGCCTCATGT 2989 AGAAAGAGCAAGCCUCAUGU 1845 啟動子
6.126 TTC CCTTTTCATCCTCCTGCCTG 2990 CCUUUUCAUCCUCCUGCCUG 2672 啟動子
6.127 TTC TCCTCCTGCCTGGTACACAA 2991 UCCUCCUGCCUGGUACACAA 1884 啟動子
6.128 TTC AGAAATCAACTGGACAAGCA 2992 AGAAAUCAACUGGACAAGCA 1846 啟動子
6.129 TTC TTTTACACACCATGTTCAAG 2993 UUUUACACACCAUGUUCAAG 2675 啟動子
6.130 TTC ATTTGCAAAGATTCCTTTTA 2994 AUUUGCAAAGAUUCCUUUUA 2677 啟動子
6.131 TTC TGAACATGGTGTGTAAAAGG 2995 UGAACAUGGUGUGUAAAAGG 1847 啟動子
6.132 TTC AGAAGATTCAATTTGCAAAG 2996 AGAAGAUUCAAUUUGCAAAG 1848 啟動子
6.133 TTC ATGGTAGGCACAAGCTCAGC 2997 AUGGUAGGCACAAGCUCAGC 1849 啟動子
6.134 TTC GAATTCTATGGTAGGCACAA 2998 GAAUUCUAUGGUAGGCACAA 1850 啟動子
6.135 TTC GGAAAGCTGAGCTTGTGCCT 2999 GGAAAGCUGAGCUUGUGCCU 1851 啟動子
6.136 TTC GGTTTTAAGTTTGCAAAGAC 3000 GGUUUUAAGUUUGCAAAGAC 2683 啟動子
6.137 TTC GAATGTACCTATATGACGTC 3001 GAAUGUACCUAUAUGACGUC 1885 啟動子
6.138 TTC AGGGATTTATACTACAAAGA 3002 AGGGAUUUAUACUACAAAGA 1852 啟動子
6.139 TTC AGGAGCAGCTAGTTGGTAAG 3003 AGGAGCAGCUAGUUGGUAAG 1853 啟動子
6.140 TTC AAACTTAGCCTGGACCCCCT 3004 AAACUUAGCCUGGACCCCCU 1854 啟動子
6.141 TTC ACTGGCCTTAACCTGGCAGC 3005 ACUGGCCUUAACCUGGCAGC 1855 啟動子
6.142 TTC TTCCACTGGCCTTAACCTGG 3006 UUCCACUGGCCUUAACCUGG 1856 啟動子
6.143 TTC GAATCAATCCTACTGTGGAC 3007 GAAUCAAUCCUACUGUGGAC 1857 啟動子
6.144 TTC GTGGGCAGCGAGGAGTCCAC 3008 GUGGGCAGCGAGGAGUCCAC 1858 啟動子
6.145 TTC TGGGTCCACCTTGTCTCCTG 3009 UGGGUCCACCUUGUCUCCUG 1859 啟動子
6.146 TTC GAAGTCTCACTGGTCAGCAG 3010 GAAGUCUCACUGGUCAGCAG 1860 啟動子
6.147 TTC GTGTTTCCTGGGTCCACCTT 3011 GUGUUUCCUGGGUCCACCUU 1861 啟動子
6.148 TTC GCCGGGCCCACCTTTTCAGT 3012 GCCGGGCCCACCUUUUCAGU 2694 啟動子
6.149 TTC AGCCCAGTTAGGATTTGGGA 3013 AGCCCAGUUAGGAUUUGGGA 1862 啟動子
6.150 TTC TCCCTCTGCGCGTAATCTGA 3014 UCCCUCUGCGCGUAAUCUGA 1863 啟動子
6.151 TTC CTCTGCGCGTAATCTGACGC 3015 CUCUGCGCGUAAUCUGACGC 1864 啟動子
6.152 TTC GCCTCGCCCTCCCCAAACAG 3016 GCCUCGCCCUCCCCAAACAG 1865 啟動子
6.153 TTC GTTAATGTTTAATCAGATAG 3017 GUUAAUGUUUAAUCAGAUAG 1866 啟動子
6.154 TTC AGGGTGTGGGTGCTTGACGC 3018 AGGGUGUGGGUGCUUGACGC 1867 啟動子
6.155 TTC GCAGCGACGTCGAGGCGCTC 3019 GCAGCGACGUCGAGGCGCUC 1868 外顯子1
6.156 TTC GTTCAGGGTCTGAGCCTGGA 3020 GUUCAGGGUCUGAGCCUGGA 2702 外顯子1
6.157 TTC GGGTCTGAGCCTGGAGGAGT 3021 GGGUCUGAGCCUGGAGGAGU 1869 外顯子1
6.158 TTC GGAGCAGGGCGCGTGAAGGG 3022 GGAGCAGGGCGCGUGAAGGG 1870 外顯子1
6.159 TTC GCGCGCCCCTTCACGCGCCC 3023 GCGCGCCCCUUCACGCGCCC 1871 外顯子1
6.160 TTC CGCGCCCTGCTCCTGAACTT 3024 CGCGCCCUGCUCCUGAACUU 1872 外顯子1
6.161 TTC GCTCCTGCACAGTCCTCCCC 3025 GCUCCUGCACAGUCCUCCCC 1873 外顯子1
6.167 TTC CACTGAATAGCGCAGCCGCA 3026 CACUGAAUAGCGCAGCCGCA 1874 內含子1
6.168 TTC GTGGGAAGGTTCGCGGGGTT 3027 GUGGGAAGGUUCGCGGGGUU 1875 內含子1
6.169 TTC CGGGGTTGGGAGACCCGGAG 3028 CGGGGUUGGGAGACCCGGAG 1876 內含子1
6.170 TTC TCGGCCTCCGGGTCTCCCAA 3029 UCGGCCUCCGGGUCUCCCAA 1877 內含子1
6.171 TTC CAGTACGTTCCAGGCATTCA 3030 CAGUACGUUCCAGGCAUUCA 1878 內含子1
6.172 TTC GCTGAAACAGATGGAATACT 3031 GCUGAAACAGAUGGAAUACU 1879 內含子1
6.173 TTC ATCTGTTTCAGCCGAAGAAA 3032 AUCUGUUUCAGCCGAAGAAA 1922 內含子1
6.174 TTC TTTCTTCGGCTGAAACAGAT 3033 UUUCUUCGGCUGAAACAGAU 1923 內含子1
6.175 TTC GCCGAAGAAAAGAACCAGCT 3034 GCCGAAGAAAAGAACCAGCU 1924 內含子1
6.176 TTC CGAGGCCCATTGGCGTCCTT 3035 CGAGGCCCAUUGGCGUCCUU 1926 內含子1
6.177 TTC TCTCACTAGCTGTGGTGCTT 3036 UCUCACUAGCUGUGGUGCUU 1934 內含子1
6.178 TTC GTTGACCATGAGTGAACTTA 3037 GUUGACCAUGAGUGAACUUA 1938 內含子1
6.179 TTC CTGGCTCTGCGGCAGAGGCT 3038 CUGGCUCUGCGGCAGAGGCU 2225 內含子5
6.180 TTC TCTGCACTCGTGGCCACTGG 3039 UCUGCACUCGUGGCCACUGG 2226 內含子5
6.181 TTC TCATCTGCACTCGTGGCCAC 3040 UCAUCUGCACUCGUGGCCAC 2228 內含子5
6.182 TTC AGACTGTGACTACATTTAGT 3041 AGACUGUGACUACAUUUAGU 2235 內含子5
6.183 TTC TCAACTATTTAGCAGCTACG 3042 UCAACUAUUUAGCAGCUACG 2240 內含子5
6.184 TTC CAGCGAGTTCCCCAGCTTGA 3043 CAGCGAGUUCCCCAGCUUGA 2242 內含子5
6.185 TTC GCCCTGAGACTTTCCTACAG 3044 GCCCUGAGACUUUCCUACAG 2246 內含子5
6.186 TTC GCCCCATCAGGTGACCCCTT 3045 GCCCCAUCAGGUGACCCCUU 2248 內含子5
6.187 TTC GGAACTGACCTGACTGAGCC 3046 GGAACUGACCUGACUGAGCC 2249 內含子5
結果：
用組態#1之LTRP融合蛋白與表10中所列之靶向間隔子短暫轉染HepG2細胞，且隨後用嘌呤黴素選擇。使嘌呤黴素抗性細胞在培養物中擴增。培養4週之後，收集培養基以量測分泌之PCSK9水平，且分析mRNA。將分泌之PCSK9水平相對於分泌之人類血清白蛋白進行標準化以控制不同孔中細胞數目之差異，且結果呈現為圖3中之點圖。與非靶向(NT)對照相比，約60%之構築體展現PCSK9 mRNA及蛋白質水平降低，而約20%之構築體抑制PCSK9超過50%。 實例 2 ： 證實使用 LTRP 融合蛋白可誘導小鼠 Hepa 1-6 細胞中內源性 PCSK9 基因座之沉默
進行實驗以證實當呈與靶向gRNA共同轉染之mRNA形式遞送時，LTRP融合蛋白誘導小鼠Hepa1-6肝細胞中內源性 PCSK9基因座之持久抑制的能力。 材料及方法： 實驗 #1 ： 當呈 mRNA 形式遞送時 ， Hepa1-6 細胞中之 dXR1 與 LTRP #1dXR1及LTRP #1 mRNA之產生：
藉由內部或經由第三方活體外轉錄(IVT)來產生編碼dXR1 (一種融合至ZIM3-KRAB域之dCasX)或含有ZIM3-KRAB域之LTRP #1 (圖1中之組態#1)的mRNA (下文分別被稱為dXR1以及LTRP1-ZIM3)。簡言之，產生編碼5'UTR區、具有側接SV40 NLS之ZIM3-KRAB域的dXR1或LTRP1-ZIM3、及3'UTR區的構築體，且將其選殖至含有T7啟動子及80-核苷酸聚(A)尾之質體中。此等構築體亦含有2×FLAG序列。編碼dXR1及LTRP1-ZIM3分子之序列除使用公開可用之密碼子最佳化工具及按需要調節諸如GC含量之參數外，亦使用密碼子利用率表進行密碼子最佳化。對於內部活體外轉錄(IVT)，所得質體在用於IVT反應之前經線性化，用CleanCap® AG及N1-甲基-假尿苷進行。隨後對IVT反應物進行DNA酶消化及管柱上oligodT純化。對於實驗#1，編碼dXR1及LTRP1-ZIM3分子之DNA序列列於表11中。編碼dXR1及LTRP1-ZIM3 mRNA之對應mRNA序列列於表12中。dXR1及LTRP1-ZIM3之蛋白質序列顯示於表13中。 表 11 ： 此實例之實驗 #1 中評估之 dXR1 及 LTRP1-ZIM3 mRNA 分子之編碼序列 * 。
dXR 或LTRP ID 組分 DNA 序列或 SEQ ID NO:
dXR1 (密碼子最佳化) 5'UTR 3047
起始密碼子+ NLS +連接子 3048
dCasX491 3049
連接子+緩衝序列 3050
ZIM3-KRAB 3051
緩衝序列+ NLS 3052
標籤 3053
終止密碼子+緩衝序列 3054
3'UTR 3055
緩衝序列 TCTAG
聚(A)尾 3057
LTRP #1 (密碼子最佳化) 5'UTR 3047
起始密碼子+ NLS +緩衝序列+連接子 3058
起始密碼子+ DNMT3A催化域 3059
連接子 3060
DNMT3L相互作用域 3061
連接子 3062
dCasX491 3049
連接子 3050
ZIM3-KRAB 3051
緩衝序列+ NLS 3052
標籤 3053
終止密碼子+緩衝序列 3054
3'UTR 3055
緩衝序列 TCTAG
聚(A)尾 3057
*組分以5'至3'次序列於構築體內 表 12 ： 此實例之實驗 #1 中評估之 dXR1 及 LTRP1-ZIM3 mRNA 分子之全長 RNA 序列 。 修飾『 m ψ 』 = N1- 甲基 - 假尿苷 。
dXR 或 LTRP ID SEQ ID NO RNA 序列
dXR1 3063 AAAmψAAGAGAGAAAAGAAGAGmψAAGAAGAAAmψAmψAAGAGCCACCAmψGGCCCCmψAAGAAGAAGCGmψAAAGmψGAGCCGGGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGCCCAGGAGAmψmψAAACGGAmψCAACAAGAmψCAGAAGAAGACmψmψGmψGAAAGACAGCAACACCAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψGGmψmψAGAGmψGAmψGACACCCGAmψCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAAAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAAmψACAmψCmψAGAGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGAmψmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCGAmψCCmψGCAmψGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAGGACCCmψGmψGGGCCmψGAmψGAGCCGGGmψGGCCCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAACCmψGAGAmψGGACGAGAAGGGCAACCmψGACCACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCCCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAGCAGGmψGmψCmψGAGAAGGGCAAGGCmψmψACACCAACmψACmψmψCGGACGGmψGCAAmψGmψGGCCGAGCACGAAAAGCmψGAmψCCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCCGAGAAGGAmψAGCGACGAAGCCGmψGACAmψAmψAGCCmψGGGAAAGmψmψmψGGGCAGAGGGCCCmψGGAmψmψmψCmψACAGCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAGmψCCACCCACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCCCAGAmψCGCCGGAAACAGAmψACGCCmψCCGGACCmψGmψGGGAAAGGCCCmψGAGCGACGCAmψGmψAmψGGGCACAAmψCGCCmψCCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAACACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGGGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAAmψACCCmψAGCGmψGACCCmψGCCACCmψCAGCCmψCACACCAAGGAGGGCGmψmψGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGAAmψGmψGGGmψGAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψAAGCAGAGAmψGAmψGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGAmψmψCCCmψmψCCmψmψmψCCmψCmψGGmψCGAGAGACAGGCCAACGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAAAAGGAGGAmψGGCAAGGmψGmψmψmψmψGGCAGAAmψCmψGGCmψGGCmψACAAGAGACAGGAAGCCCmψGAGACCAmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGAmψCGGAAGAAGGGAAAGAAAmψmψCGCmψCGGmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGAAAGGmψGmψACGACGAGGCCmψGGGAGCGGAmψmψGACAAGAAAGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAAGAGGAACGGAGAAGCGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGCGGGCmψAAGGCCAGCmψmψCGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGGGACCmψGCGGGGAAAGCCCmψmψCGCCAmψCGAAGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGmψGCCmψmψCAmψCmψGGCAGAAGGACGGCGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψACmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAGAAGAmψCAAACCmψGAAGCCmψmψCGAAGCCAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψCAACAAAAAGAGCGGCGAGAmψCGmψGCCCAmψGGAGGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCCAACCmψGAmψCAmψCCmψGCCmψCmψGGCCmψmψmψGGCAAGAGACAGGGCAGAGAAmψmψCAmψCmψGGAACGACCmψGCmψGmψCCCmψGGAAACCGGCAGCCmψGAAGCmψGGCCAACGGAAGAGmψGAmψCGAGAAGACACmψGmψACAACAGAAGAACCCGGCAGGAmψGAGCCmψGCCCmψGmψmψCGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGCGGCGGGAGGmψCCmψGGACmψCCmψCCAAmψAmψCAAACCAAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGCAAGAGGCGAAAACAmψCCCCGCCGmψGAmψCGCCCmψGACCGACCCCGAGGGCmψGCCCACmψGAGCCGGmψmψmψAAGGAmψAGCCmψGGGAAACCCAACCCACAmψCCmψGAGAAmψCGGCGAGAGCmψAmψAAGGAGAAGCAGCGGACCAmψCCAGGCCAAGAAGGAGGmψGGAGCAGCGGAGAGCCGGCGGCmψACAGCCGGAAGmψACGCCAGCAAAGCCAAGAAmψCmψGGCAGACGAmψAmψGGmψGAGAAACACCGCmψAGAGAmψCmψGCmψGmψACmψACGCCGmψGACCCAGGAmψGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGCCAACCmψGAGCCGGGGCmψmψCGGCCGGCAGGGCAAGCGGACCmψmψCAmψGGCCGAGAGACAGmψACACACGGAmψGGAGGACmψGGCmψGACCGCCAAGCmψGGCCmψACGAGGGCCmψGAGCAAGACCmψACCmψGmψCCAAGACACmψGGCCCAGmψACACCmψCCAAGACAmψGCAGCAACmψGmψGGGmψmψmψACCAmψCACCAGCGCCGACmψACGACAGGGmψGCmψGGAGAAGCmψGAAGAAGACAGCAACAGGCmψGGAmψGACCACAAmψmψAACGGCAAGGAGCmψGAAGGmψGGAGGGCCAGAmψmψACCmψACmψACAACAGAmψACAAGAGACAGAACGmψAGmψCAAGGACCmψGmψCCGmψCGAGCmψGGAmψAGACmψGAGCGAAGAAmψCmψGmψGAACAACGACAmψCmψCCmψCCmψGGACAAAGGGCAGAAGCGGAGAAGCmψCmψGAGCCmψCCmψGAAGAAAAGAmψmψCmψCCCAmψAGACCCGmψGCAGGAGAAGmψmψCGmψGmψGCCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACACACGCAGCCGAGCAAGCCGCCCmψGAACAmψCGCCAGAmψCCmψGGCmψGmψmψCCmψGCGGAGCCAGGAGmψACAAGAAAmψACCAGACAAACAAGACAACCGGCAACACCGAmψAAGAGAGCCmψmψCGmψCGAGACCmψGGCAGmψCCmψmψmψmψACCGGAAGAAGCmψmψAAGGAGGmψGmψGGAAACCmψGCCGmψGCGGmψCmψGGCGGAmψCmψGGCGGAGGCmψCCACAAGCAmψGAACAACmψCCCAGGGCAGAGmψGACCmψmψCGAGGACGmψGACCGmψGAAmψmψmψmψACACAGGGAGAGmψGGCAGAGACmψGAACCCCGAGCAGAGAAACCmψGmψACCGGGAmψGmψGAmψGCmψGGAAAACmψACAGCAAmψCmψGGmψGmψCCGmψGGGCCAGGGCGAGACCACAAAGCCmψGACGmψGAmψCCmψGCGmψCmψGGAGCAGGGCAAGGAACCCmψGGCmψGGAGGAGGAGGAGGmψGCmψGGGAAGCGGACGGGCCGAGAAGAACGGCGACAmψCGGCGGACAGAmψCmψGGAAGCCmψAAGGACGmψGAAAGAAAGCCmψGACCAGCCCCAAGAAAAAGAGAAAAGmψCGACmψACAAGGAmψGACGAmψGACAAGGACmψACAAGGAmψGACGACGACAAGmψAAmψAGAmψAAGCGGCCGCmψmψAAmψmψAAGCmψGCCmψmψCmψGCGGGGCmψmψGCCmψmψCmψGGCCAmψGCCCmψmψCmψmψCmψCmψCCCmψmψGCACCmψGmψACCmψCmψmψGGmψCmψmψmψGAAmψAAAGCCmψGAGmψAGGAAGmψcmψagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
LTRP #1 3064 AAAmψAAGAGAGAAAAGAAGAGmψAAGAAGAAAmψAmψAAGAGCCACCAmψGGCCCCmψAAGAAGAAGCGmψAAAGmψGAGCCGGGmψGAACGGCAGCGGCAGCGGCGGCGGCAmψGAACCACGACCAGGAGmψmψCGACCCCCCmψAAGGmψGmψACCCmψCCCGmψCCCCGCCGAGAAGAGAAAGCCCAmψCCGGGmψCCmψGAGCCmψGmψmψCGAmψGGCAmψCGCCACCGGmψCmψGCmψGGmψGCmψGAAGGACCmψGGGCAmψCCAGGmψGGAmψAGGmψACAmψmψGCCmψCCGAGGmψGmψGCGAGGACmψCCAmψCACCGmψGGGAAmψGGmψGCGmψCAmψCAGGGCAAGAmψCAmψGmψACGmψGGGCGACGmψGCGGAGCGmψGACACAGAAGCAmψAmψCCAGGAGmψGGGGCCCmψmψmψCGACCmψGGmψGAmψCGGCGGCAGCCCmψmψGCAAmψGACCmψGAGCAmψCGmψGAACCCAGCCCGGAAGGGCCmψGmψACGAGGGAACCGGCAGACmψGmψmψCmψmψCGAGmψmψmψmψACAGACmψGCmψGCACGACGCCCGGCCmψAAGGAAGGCGACGACCGGCCCmψmψCmψmψmψmψGGCmψGmψmψCGAGAAmψGmψGGmψGGCCAmψGGGAGmψCAGCGACAAGCGGGAmψAmψmψAGCCGGmψmψCCmψGGAGAGCAACCCCGmψGAmψGAmψCGAmψGCCAAGGAAGmψGAGCGCCGCCCACCGGGCCAGAmψACmψmψCmψGGGGCAAmψCmψGCCmψGGCAmψGAACAGACCCCmψGGCCAGCACCGmψGAACGACAAGCmψGGAGCmψGCAGGAGmψGCCmψGGAGCACGGCCGGAmψCGCCAAGmψmψCAGCAAGGmψGAGAACCAmψCACCACCCGAAGCAACAGCAmψCAAACAAGGCAAGGACCAGCACmψmψmψCCmψGmψGmψmψCAmψGAACGAGAAGGAGGACAmψCCmψGmψGGmψGmψACCGAGAmψGGAGAGAGmψGmψmψCGGGmψmψCCCAGmψCCACmψACACAGAmψGmψCAGCAACAmψGmψCmψAGACmψGGCCAGACAGAGACmψGCmψGGGAAGAAGCmψGGmψCCGmψCCCmψGmψGAmψCAGACACCmψGmψmψCGCCCCmψCmψGAAGGAGmψACmψmψCGCCmψGCGmψGAGCAGCGGCAACAGCAACGCCAACAGCCGGGGCCCCAGCmψmψCmψCmψAGCGGCCmψGGmψGCCACmψGmψCCCmψGAGAGGGAGCCACAmψGGGCCCCAmψGGAGAmψCmψACAAAACCGmψGAGCGCCmψGGAAGCGGCAGCCmψGmψGCGCGmψGCmψGAGCCmψGmψmψmψCGGAAmψAmψCGAmψAAAGmψCCmψGAAAAGCCmψGGGAmψmψCCmψGGAGAGCGGCmψCmψGGCmψCCGGCGGmψGGCACCCmψGAAGmψACGmψGGAGGAmψGmψGACAAACGmψGGmψCAGACGGGAmψGmψGGAGAAGmψGGGGCCCCmψmψCGAmψCmψGGmψGmψACGGCAGCACCCAACCCCmψGGGCAGCmψCmψmψGmψGACCGGmψGCCCmψGGCmψGGmψACAmψGmψmψmψCAGmψmψCCACCGGAmψCCmψGCAGmψACGCCCmψGCCGAGACAGGAGmψCCCAGCGGCCAmψmψCmψmψmψmψGGAmψmψmψmψCAmψGGACAACmψmψGCmψGCmψGACCGAGGAmψGACCAGGAAACmψACCACmψCGGmψmψCCmψGCAGACCGAAGCCGmψGACCCmψGCAGGACGmψGAGAGGCCGGGACmψACCAGAACGCCAmψGCGGGmψGmψGGmψCCAACAmψCCCmψGGACmψGAAAAGCAAGCACGCACCmψCmψGACCCCmψAAAGAAGAGGAGmψACCmψGCAGGCCCAGGmψGCGGAGCAGAAGCAAGCmψGGACGCCCCmψAAGGmψGGAmψCmψGCmψGGmψGAAGAAmψmψGCCmψCCmψGCCCCmψGAGAGAGmψACmψmψCAAGmψAmψmψmψCAGCCAGAAmψAGmψCmψGCCCCmψGGGCGGCCCAAGCAGCGGCGCCCCmψCCmψCCCAGCGGCGGCAGCCCAGCCGGCmψCCCCAACCmψCmψACCGAGGAGGGCACCmψCmψGAGmψCCGCCACCCCCGAGAGCGGCCCmψGGCACCmψCCACCGAGCCCAGCGAGGGCAGCGCACCCGGCAGCCCmψGCCGGCAGCCCCACCmψCCACAGAGGAGGGAACCAGCACCGAGCCCAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGCACCAGCACCGAGCCmψAGmψGAGGGCGGCmψCmψGGCGGCGGCAGCGCCCAGGAGAmψmψAAACGGAmψCAACAAGAmψCAGAAGAAGACmψmψGmψGAAAGACAGCAACACCAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψGGmψmψAGAGmψGAmψGACACCCGAmψCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAAAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAAmψACAmψCmψAGAGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGAmψmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCGAmψCCmψGCAmψGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAGGACCCmψGmψGGGCCmψGAmψGAGCCGGGmψGGCCCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAACCmψGAGAmψGGACGAGAAGGGCAACCmψGACCACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCCCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAGCAGGmψGmψCmψGAGAAGGGCAAGGCmψmψACACCAACmψACmψmψCGGACGGmψGCAAmψGmψGGCCGAGCACGAAAAGCmψGAmψCCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCCGAGAAGGAmψAGCGACGAAGCCGmψGACAmψAmψAGCCmψGGGAAAGmψmψmψGGGCAGAGGGCCCmψGGAmψmψmψCmψACAGCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAGmψCCACCCACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCCCAGAmψCGCCGGAAACAGAmψACGCCmψCCGGACCmψGmψGGGAAAGGCCCmψGAGCGACGCAmψGmψAmψGGGCACAAmψCGCCmψCCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAACACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGGGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAAmψACCCmψAGCGmψGACCCmψGCCACCmψCAGCCmψCACACCAAGGAGGGCGmψmψGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGAAmψGmψGGGmψGAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψAAGCAGAGAmψGAmψGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGAmψmψCCCmψmψCCmψmψmψCCmψCmψGGmψCGAGAGACAGGCCAACGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAAAAGGAGGAmψGGCAAGGmψGmψmψmψmψGGCAGAAmψCmψGGCmψGGCmψACAAGAGACAGGAAGCCCmψGAGACCAmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGAmψCGGAAGAAGGGAAAGAAAmψmψCGCmψCGGmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGAAAGGmψGmψACGACGAGGCCmψGGGAGCGGAmψmψGACAAGAAAGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAAGAGGAACGGAGAAGCGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGCGGGCmψAAGGCCAGCmψmψCGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGGGACCmψGCGGGGAAAGCCCmψmψCGCCAmψCGAAGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGmψGCCmψmψCAmψCmψGGCAGAAGGACGGCGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψACmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAGAAGAmψCAAACCmψGAAGCCmψmψCGAAGCCAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψCAACAAAAAGAGCGGCGAGAmψCGmψGCCCAmψGGAGGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCCAACCmψGAmψCAmψCCmψGCCmψCmψGGCCmψmψmψGGCAAGAGACAGGGCAGAGAAmψmψCAmψCmψGGAACGACCmψGCmψGmψCCCmψGGAAACCGGCAGCCmψGAAGCmψGGCCAACGGAAGAGmψGAmψCGAGAAGACACmψGmψACAACAGAAGAACCCGGCAGGAmψGAGCCmψGCCCmψGmψmψCGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGCGGCGGGAGGmψCCmψGGACmψCCmψCCAAmψAmψCAAACCAAmψGAACCmψGAmCGGCGmψGGCAAGAGGCGAAAACAmψCCCCGCCGmψGAmψCGCCCmψGACCGACCCCGAGGGCmψGCCCACmψGAGCCGGmψmψmψAAGGAmψAGCCmψGGGAAACCCAACCCACAmψCCmψGAGAAmψCGGCGAGAGCmψAmψAAGGAGAAGCAGCGGACCAmψCCAGGCCAAGAAGGAGGmψGGAGCAGCGGAGAGCCGGCGGCmψACAGCCGGAAGmψACGCCAGCAAAGCCAAGAAmψCmψGGCAGACGAmψAmψGGmψGAGAAACACCGCmψAGAGAmψCmψGCmψGmψACmψACGCCGmψGACCCAGGAmψGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGCCAACCmψGAGCCGGGGCmψmψCGGCCGGCAGGGCAAGCGGACCmψmψCAmψGGCCGAGAGACAGmψACACACGGAmψGGAGGACmψGGCmψGACCGCCAAGCmψGGCCmψACGAGGGCCmψGAGCAAGACCmψACCmψGmψCCAAGACACmψGGCCCAGmψACACCmψCCAAGACAmψGCAGCAACmψGmψGGGmψmψmψACCAmψCACCAGCGCCGACmψACGACAGGGmψGCmψGGAGAAGCmψGAAGAAGACAGCAACAGGCmψGGAmψGACCACAAmψmψAACGGCAAGGAGCmψGAAGGmψGGAGGGCCAGAmψmψACCmψACmψACAACAGAmψACAAGAGACAGAACGmψAGmψCAAGGACCmψGmψCCGmψCGAGCmψGGAmψAGACmψGAGCGAAGAAmψCmψGmψGAACAACGACAmψCmψCCmψCCmψGGACAAAGGGCAGAAGCGGAGAAGCmψCmψGAGCCmψCCmψGAAGAAAAGAmψmψCmψCCCAmψAGACCCGmψGCAGGAGAAGmψmψCGmψGmψGCCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACACACGCAGCCGAGCAAGCCGCCCmψGAACAmψCGCCAGAmψCCmψGGCmψGmψmψCCmψGCGGAGCCAGGAGmψACAAGAAAmψACCAGACAAACAAGACAACCGGCAACACCGAmψAAGAGAGCCmψmψCGmψCGAGACCmψGGCAGmψCCmψmψmψmψACCGGAAGAAGCmψmψAAGGAGGmψGmψGGAAACCmψGCCGmψGCGGmψCmψGGCGGAmψCmψGGCGGAGGCmψCCACAAGCAmψGAACAACmψCCCAGGGCAGAGmψGACCmψmψCGAGGACGmψGACCGmψGAAmψmψmψmψACACAGGGAGAGmψGGCAGAGACmψGAACCCCGAGCAGAGAAACCmψGmψACCGGGAmψGmψGAmψGCmψGGAAAACmψACAGCAAmψCmψGGmψGmψCCGmψGGGCCAGGGCGAGACCACAAAGCCmψGACGmψGAmψCCmψGCGmψCmψGGAGCAGGGCAAGGAACCCmψGGCmψGGAGGAGGAGGAGGmψGCmψGGGAAGCGGACGGGCCGAGAAGAACGGCGACAmψCGGCGGACAGAmψCmψGGAAGCCmψAAGGACGmψGAAAGAAAGCCmψGACCAGCCCCAAGAAAAAGAGAAAAGmψCGACmψACAAGGAmψGACGAmψGACAAGGACmψACAAGGAmψGACGACGACAAGmψAAmψAGAmψAAGCGGCCGCmψmψAAmψmψAAGCmψGCCmψmψCmψGCGGGGCmψmψGCCmψmψCmψGGCCAmψGCCCmψmψCmψmψCmψCmψCCCmψmψGCACCmψGmψACCmψCmψmψGGmψCmψmψmψGAAmψAAAGCCmψGAGmψAGGAAGmψcmψagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
表 13 ： 此實例之實驗 #1 中評估之 dXR1 及 LTRP1-ZIM3 分子之全長蛋白序列 。
dXR 或LTRP ID 胺基酸序列SEQ ID NO:
dXR1 3065
LTRP #1 3066
gRNA之合成：
在實驗#1中，使用gRNA骨架174設計靶向 PCSK9基因座之gRNA且使用v1修飾概況(如以下實例7中所描述)以化學方式合成。間隔子經設計以接近PCSK9啟動子。靶向 PCSK9之間隔子及所得經化學修飾之gRNA的序列列於表14中。 表 14 ： 此實例中所用之靶向 PCSK9 基因座的間隔子及經化學修飾之 gRNA 的序列。 化學修飾： * = 硫代磷酸酯鍵； m = 2 ' OMe 修飾。
gRNA ID ( 骨架 - 變異體間隔子 ) 目標 靶向間隔子序列 (RNA) SEQ ID NO: 完整 gRNA 序列 (RNA) SEQ ID NO:
174-6.7 人類 PCSK9 UCCUGGCUUCCUGGUGAAGA 2008 mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA 3074
174-27.1 小鼠 PCSK9 GCCUCGCCCUCCCCAGACAG 3067 mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGCCUCGCCCUCCCCAGAmC*mA*mG 3075
174-27.88 小鼠 PCSK9 CGCUACCUGCCUAAACUUUG 3068 mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGCGCUACCUGCCUAAACUmU*mU*mG 3076
174-27.92 小鼠 PCSK9 CCCUCCAACAAUAUUAACUA 3069 mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGCCCUCCAACAAUAUUAAmC*mU*mA 3077
174-27.93 小鼠 PCSK9 GGGGUCUCCCAGCCACCCCU 3070 mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGGGGUCUCCCAGCCACCmC*mC*mU 3078
174-27.94 小鼠 PCSK9 CCCCUCUUAAUCCCCACUCC 3071 mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGCCCCUCUUAAUCCCCACmU*mC*mC 3079
174-27.100 小鼠 PCSK9 CUCUCUCUUUCUGAGGCUAG 3072 mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGCUCUCUCUUUCUGAGGCmU*mA*mG 3080
174-27.103 小鼠 PCSK9 UAAUCUCCAUCCUCGUCCUG 3073 mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUAAUCUCCAUCCUCGUCmC*mU*mG 3081
將mRNA及gRNA轉染至Hepa1-6細胞中且細胞內PCSK9染色：
用300 ng編碼dXR1或LTRP1-ZIM3之mRNA (表12)及150 ng靶向 PCSK9之gRNA (表14)脂質轉染用NATE TM抑制劑處理之所接種Hepa1-6細胞。測試跨小鼠 PCSK9基因座之啟動子區的七種不同gRNA，除與人類 PCSK9基因互補之非靶向序列以外(表14)。在轉染後6、13及25天收集細胞，以使用細胞內流式細胞測量術染色方案量測PCSK9蛋白之細胞內水平。簡言之，使用4%多聚甲醛於PBS中固定細胞，滲透，且使用小鼠抗PCSK9初級抗體(R&D Systems)染色，之後使用螢光山羊抗小鼠IgG二級抗體(Thermo Fisher)染色。使用Attune TMNxT流式細胞儀量測螢光水平，且使用FlowJo TM軟體分析資料。使用非靶向gRNA作為陰性對照來圈選細胞群體。 實驗 #2 ： 當呈 mRNA 形式遞送時 ， Hepa1-6 細胞中之 LTRP #1 與 LTRP #5mRNA之產生：
使用基於質體之PCR模板，藉由內部IVT來產生編碼含有ZIM3-KRAB域之LTRP #1或LTRP #5 (圖1中之組態#5)的mRNA (下文分別被稱為LTRP1-ZIM3或LTRP5-ZIM3，組態圖解於圖1中)。簡言之，利用含有T7啟動子之正向引子及編碼120-核苷酸聚(A)尾之逆向引子，對編碼具有側接NLS之ZIM3-KRAB域之LTRP #1或LTRP #5的質體進行PCR。此等構築體亦含有2×FLAG序列。編碼此等分子之DNA序列列於表15中。將所得PCR模板用於IVT反應，用CleanCap® AG及N1-甲基-假尿苷進行。隨後對IVT反應物進行DNA酶消化及oligo dT管柱純化。編碼LTRP mRNA之全長RNA序列列於表16中。
作為實驗對照，亦如所描述使用PCR模板藉由IVT類似地產生編碼催化活性CasX 491之mRNA。如上文關於實驗#1所描述由第三方藉由IVT產生編碼LTRP1-ZIM3及dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L (一種融合至ZNF10-KRAB域以及DNMT3A/L域兩者之催化失活Cas9)的mRNA。 表 15 ： 此實例之實驗 #2 中評估之 LTRP1-ZIM3 及 LTRP5-ZIM3 mRNA 分子之編碼序列 * 。
LTRP ID 組分 DNA 序列 SEQ ID NO:
LTRP #1 - ZIM3-KRAB 5'UTR 3082
起始密碼子+ NLS +連接子 3083
起始密碼子+ DNMT3A催化域 3084
連接子 3085
DNMT3L相互作用域 3086
連接子 3087
連接子+緩衝序列 3088
dCasX491 3089
連接子+緩衝序列 3090
ZIM3-KRAB 3091
緩衝序列+ NLS 3092
標籤 3093
緩衝序列 3094
聚(A)尾 3095
LTRP #5 - ZIM3-KRAB 5'UTR 3082
起始密碼子+ NLS +緩衝序列 3096
起始密碼子+ DNMT3A催化域 3084
連接子 3085
DNMT3L相互作用域 3086
連接子 3097
ZIM3-KRAB 3091
連接子 3087
dCasX491 3089
連接子+緩衝序列 3090
NLS 3098
標籤 3093
緩衝序列 3094
聚(A)尾 3095
*組分以5'至3'次序列於構築體內 表 16 ： 此實例之實驗 #2 中評估之 LTRP1-ZIM3 及 LTRP5-ZIM3 mRNA 分子之全長 RNA 序列。修飾『 m ψ 』 = N1- 甲基 - 假尿苷
LTRP ID SEQ ID NO RNA 序列
LTRP #1 - ZIM3-KRAB 3099 GACCGGCCGCCACCAmψGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGmψCmψCmψAGAGmψmψAACGGAmψCAGGCmψCmψGGAGGmψGGAAmψGAACCAmψGACCAGGAAmψmψmψGACCCCCCAAAGGmψmψmψACCCACCmψGmψGCCAGCmψGAGAAGAGGAAGCCCAmψCCGCGmψGCmψGmψCmψCmψCmψmψmψGAmψGGGAmψmψGCmψACAGGGCmψCCmψGGmψGCmψGAAGGACCmψGGGCAmψCCAAGmψGGACCGCmψACAmψCGCCmψCCGAGGmψGmψGmψGAGGACmψCCAmψCACGGmψGGGCAmψGGmψGCGGCACCAGGGAAAGAmψCAmψGmψACGmψCGGGGACGmψCCGCAGCGmψCACACAGAAGCAmψAmψCCAGGAGmψGGGGCCCAmψmψCGACCmψGGmψGAmψmψGGAGGCAGmψCCCmψGCAACGACCmψCmψCCAmψmψGmψCAACCCmψGCCCGCAAGGGACmψmψmψAmψGAGGGmψACmψGGCCGCCmψCmψmψCmψmψmψGAGmψmψCmψACCGCCmψCCmψGCAmψGAmψGCGCGGCCCAAGGAGGGAGAmψGAmψCGCCCCmψmψCmψmψCmψGGCmψCmψmψmψGAGAAmψGmψGGmψGGCCAmψGGGCGmψmψAGmψGACAAGAGGGACAmψCmψCGCGAmψmψmψCmψmψGAGmψCmψAACCCCGmψGAmψGAmψmψGACGCCAAAGAAGmψGmψCmψGCmψGCACACAGGGCCCGmψmψACmψmψCmψGGGGmψAACCmψmψCCmψGGCAmψGAACAGGCCmψmψmψGGCAmψCCACmψGmψGAAmψGAmψAAGCmψGGAGCmψGCAAGAGmψGmψCmψGGAGCACGGCAGAAmψAGCCAAGmψmψCAGCAAAGmψGAGGACCAmψmψACCACCAGGmψCAAACmψCmψAmψAAAGCAGGGCAAAGACCAGCAmψmψmψCCCCGmψCmψmψCAmψGAACGAGAAGGAGGACAmψCCmψGmψGGmψGCACmψGAAAmψGGAAAGGGmψGmψmψmψGGCmψmψCCCCGmψCCACmψACACAGACGmψGmψCCAACAmψGAGCCGCmψmψGGCGAGGCAGAGACmψGCmψGGGCCGGmψCGmψGGAGCGmψGCCGGmψCAmψCCGCCACCmψCmψmψCGCmψCCGCmψGAAGGAAmψAmψmψmψmψGCmψmψGmψGmψGmψCmψAGCGGCAAmψAGmψAACGCmψAACAGCCGCGGGCCGAGCmψmψCAGCAGCGGCCmψGGmψGCCGmψmψAAGCmψmψGCGCGGCAGCCAmψAmψGGGCCCmψAmψGGAGAmψAmψACAAGACAGmψGmψCmψGCAmψGGAAGAGACAGCCAGmψGCGGGmψACmψGAGCCmψCmψmψCAGAAACAmψCGACAAGGmψACmψAAAGAGmψmψmψGGGCmψmψCmψmψGGAAAGCGGmψmψCmψGGmψmψCmψGGGGGAGGAACGCmψGAAGmψACGmψGGAAGAmψGmψCACAAAmψGmψCGmψGAGGAGGGACGmψGGAGAAAmψGGGGCCCCmψmψmψGACCmψGGmψGmψACGGCmψCGACGCAGCCCCmψAGGCAGCmψCmψmψGmψGAmψCGCmψGmψCCCGGCmψGGmψACAmψGmψmψCCAGmψmψCCACCGGAmψCCmψGCAGmψAmψGCGCmψGCCmψCGCCAGGAGAGmψCAGCGGCCCmψmψCmψmψCmψGGAmψAmψmψCAmψGGACAAmψCmψGCmψGCmψGACmψGAGGAmψGACCAAGAGACAACmψACCCGCmψmψCCmψmψCAGACAGAGGCmψGmψGACCCmψCCAGGAmψGmψCCGmψGGCAGAGACmψACCAGAAmψGCmψAmψGCGGGmψGmψGGAGCAACAmψmψCCAGGGCmψGAAGAGCAAGCAmψGCGCCCCmψGACCCCAAAGGAAGAAGAGmψAmψCmψGCAAGCCCAAGmψCAGAAGCAGGAGCAAGCmψGGACGCCCCGAAAGmψmψGACCmψCCmψGGmψGAAGAACmψGCCmψmψCmψCCCGCmψGAGAGAGmψACmψmψCAAGmψAmψmψmψmψmψCmψCAAAACmψCACmψmψCCmψCmψmψGGAGGGCCGAGCmψCmψGGCGCACCCCCACCAAGmψGGAGGGmψCmψCCmψGCCGGGmψCCCCAACAmψCmψACmψGAAGAAGGCACCAGCGAAmψCCGCAACGCCCGAGmψCAGGCCCmψGGmψACCmψCCACAGAACCAmψCmψGAAGGmψAGmψGCGCCmψGGmψmψCCCCAGCmψGGAAGCCCmψACmψmψCCACCGAAGAAGGCACGmψCAACCGAACCAAGmψGAAGGAmψCmψGCCCCmψGGGACCAGCACmψGAACCAmψCmψGAGGGCGGmψmψCCGGCGGAGGAAGCGCmψCAAGAGAmψCAAGAGAAmψCAACAAGAmψCAGAAGGAGACmψGGmψCAAGGACAGCAACACAAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψCGmψCAGAGmψGAmψGACCCCmψGACCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCCGAGAACAmψCCCmψCAGCCmψAmψCAGCAACACCAGCAGGGCCAACCmψGAACAAGCmψGCmψGACCGACmψACACCGAGAmψGAAGAAAGCCAmψCCmψGCACGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAAGACCCCGmψGGGCCmψGAmψGAGCAGAGmψmψGCmψCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGACCAGAACAAGCmψGAAGCCCGAGAmψGGACGAGAAGGGCAAmψCmψGACCACAGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCmψCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAACAGGmψGmψCCGAGAAAGGCAAGGCCmψACACCAACmψACmψmψCGGCAGAmψGmψAACGmψGGCCGAGCACGAGAAGCmψGAmψmψCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAACCmψGAGAAGGACmψCmψGAmψGAGGCCGmψGACCmψACAGCCmψGGGCAAGmψmψmψGGACAGAGAGCCCmψGGACmψmψCmψACAGCAmψCCACGmψGACCAAAGAAAGCACACACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCmψCAGAmψCGCCGGCAAmψAGAmψACGCCmψCmψGGACCmψGmψGGGCAAAGCCCmψGmψCCGAmψGCCmψGCAmψGGGAACAAmψCGCCAGCmψmψCCmψGAGCAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAGCACCAGAAGGmψGGmψCAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAAAGCCmψGAGGGAGCmψGGCCGGCAAAGAGAACCmψGGAAmψACCCCAGCGmψGACCCmψGCCmψCCmψCAGCCmψCACACAAAAGAAGGCGmψGGACGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCAGAGmψGAGAAmψGmψGGGmψCAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAACmψGmψCCAGGGACGACGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGCmψmψCCCmψAGCmψmψCCCmψCmψGGmψGGAAAGACAGGCCAAmψGAAGmψGGAmψmψGGmψGGGACAmψGGmψCmψGCAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAGAAAGAGGAmψGGCAAGGmψmψmψmψCmψGGCAGAACCmψGGCCGGCmψACAAGAGACAAGAAGCCCmψGAGGCCmψmψACCmψGAGCAGCGAAGAGGACCGGAAGAAGGGCAAGAAGmψmψCGCCAGAmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGCAAAGmψGmψACGAmψGAGGCCmψGGGAGAGAAmψCGACAAGAAGGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψmψAAGCmψGGAAGAGGAAAGAAGGAGCGAGGACGCCCAAmψCmψAAAGCCGCmψCmψGACCGAmψmψGGCmψGAGAGCCAAGGCCAGCmψmψmψGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAAGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGCGAmψCmψGAGAGGCAAGCCCmψmψCGCCAmψmψGAGGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGCGCCmψmψCAmψmψmψGGCAGAAAGACGGCGmψCAAGAAACmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAAmψmψACmψmψCAAAGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAGAAGAmψCAAACCCGAGGCCmψmψCGAGGCmψAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψCAACAAAAAGmψCCGGCGAGAmψCGmψGCCCAmψGGAAGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCCAACCmψGAmψmψAmψCCmψGCCmψCmψGGCCmψmψCGGCAAGAGACAGGGCAGAGAGmψmψCAmψCmψGGAACGAmψCmψGCmψGAGCCmψGGAAACCGGCmψCmψCmψGAAGCmψGGCCAAmψGGCAGAGmψGAmψCGAGAAAACCCmψGmψACAACAGGAGAACCAGACAGGACGAGCCmψGCmψCmψGmψmψmψGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGAGAAGAGAGGmψGCmψGGACAGCAGCAACAmψCAAGCCCAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGCCCGGGGCGAGAAmψAmψCCCmψGCmψGmψGAmψCGCCCmψGACAGACCCmψGAAGGAmψGCCCACmψGAGCAGAmψmψCAAGGACmψCCCmψGGGCAACCCmψACACACAmψCCmψGAGAAmψCGGCGAGAGCmψACAAAGAGAAGCAGAGGACAAmψCCAGGCCAAGAAAGAGGmψGGAACAGAGAAGAGCCGGCGGAmψACmψCmψAGGAAGmψACGCCAGCAAGGCCAAGAAmψCmψGGCCGACGACAmψGGmψCCGAAACACCGCCAGAGAmψCmψGCmψGmψACmψACGCCGmψGACACAGGACGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGCGAAmψCmψGAGCAGAGGCm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LTRP #5 - ZIM3-KRAB 3100 GACCGGCCGCCACCAmψGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGmψCmψCmψAGAAmψGAACCAmψGACCAGGAAmψmψmψGACCCCCCAAAGGmψmψmψACCCACCmψGmψGCCAGCmψGAGAAGAGGAAGCCCAmψCCGCGmψGCmψGmψCmψCmψCmψmψmψGAmψGGGAmψmψGCmψACAGGGCmψCCmψGGmψGCmψGAAGGACCmψGGGCAmψCCAAGmψGGACCGCmψACAmψCGCCmψCCGAGGmψGmψGmψGAGGACmψCCAmψCACGGmψGGGCAmψGGmψGCGGCACCAGGGAAAGAmψCAmψGmψACGmψCGGGGACGmψCCGCAGCGmψCACACAGAAGCAmψAmψCCAGGAGmψGGGGCCCAmψmψCGACCmψGGmψGAmψmψGGAGGCAGmψCCCmψGCAACGACCmψCmψCCAmψmψGmψCAACCCmψGCCCGCAAGGGACmψmψmψAmψGAGGGmψACmψGGCCGCCmψCmψmψCmψmψmψGAGmψmψCmψACCGCCmψCCmψGCAmψGAmψGCGCGGCCCAAGGAGGGAGAmψGAmψCGCCCCmψmψCmψmψCmψGGCmψCmψmψmψGAGAAmψGmψGGmψGGCCAmψGGGCGmψmψAGmψGACAAGAGGGACAmψCmψCGCGAmψmψmψCmψmψGAGmψCmψAACCCCGmψGAmψGAmψmψGACGCCAAAGAAGmψGmψCmψGCmψGCACACAGGGCCCGmψmψACmψmψCmψGGGGmψAACCmψmψCCmψGGCAmψGAACAGGCCmψmψmψGGCAmψCCACmψGmψGAAmψGAmψAAGCmψGGAGCmψGCAAGAGmψGmψCmψGGAGCACGGCAGAAmψAGCCAAGmψmψCAGCAAAGmψGAGGACCAmψmψACCACCAGGmψCAAACmψCmψAmψAAAGCAGGGCAAAGACCAGCAmψmψmψCCCCGmψCmψmψCAmψGAACGAGAAGGAGGACAmψCCmψGmψGGmψGCACmψGAAAmψGGAAAGGGmψGmψmψmψGGCmψmψCCCCGmψCCACmψACACAGACGmψGmψCCAACAmψGAGCCGCmψmψGGCGAGGCAGAGACmψGCmψGGGCCGGmψCGmψGGAGCGmψGCCGGmψCAmψCCGCCACCmψCmψmψCGCmψCCGCmψGAAGGAAmψAmψmψmψmψGCmψmψGmψGmψGmψCmψAGCGGCAAmψAGmψAACGCmψAACAGCCGCGGGCCGAGCmψmψCAGCAGCGGCCmψGGmψGCCGmψmψAAGCmψmψGCGCGGCAGCCAmψAmψGGGCCCmψAmψGGAGAmψAmψACAAGACAGmψGmψCmψGCAmψGGAAGAGACAGCCAGmψGCGGGmψACmψGAGCCmψCmψmψCAGAAACAmψCGACAAGGmψACmψAAAGAGmψmψmψGGGCmψmψCmψmψGGAAAGCGGmψmψCmψGGmψmψCmψGGGGGAGGAACGCmψGAAGmψACGmψGGAAGAmψGmψCACAAAmψGmψCGmψGAGGAGGGACGmψGGAGAAAmψGGGGCCCCmψmψmψGACCmψGGmψGmψACGGCmψCGACGCAGCCCCmψAGGCAGCmψCmψmψGmψGAmψCGCmψGmψCCCGGCmψGGmψACAmψGmψmψCCAGmψmψCCACCGGAmψCCmψGCAGmψAmψGCGCmψGCCmψCGCCAGGAGAGmψCAGCGGCCCmψmψCmψmψCmψGGAmψAmψmψCAmψGGACAAmψCmψGCmψGCmψGACmψGAGGAmψGACCAAGAGACAACmψACCCGCmψmψCCmψmψCAGACAGAGGCmψGmψGACCCmψCCAGGAmψGmψCCGmψGGCAGAGACmψACCAGAAmψGCmψAmψGCGGGmψGmψGGAGCAACAmψmψCCAGGGCmψGAAGAGCAAGCAmψGCGCCCCmψGACCCCAAAGGAAGAAGAGmψAmψCmψGCAAGCCCAAGmψCAGAAGCAGGAGCAAGCmψGGACGCCCCGAAAGmψmψGACCmψCCmψGGmψGAAGAACmψGCCmψmψCmψCCCGCmψGAGAGAGmψACmψmψCAAGmψAmψmψmψmψmψCmψCAAAACmψCACmψmψCCmψCmψmψGGCGGmψmψCCGGCGGAGGAAmψGAACAAmψmψCCCAGGGAAGAGmψGACCmψmψCGAGGAmψGmψCACmψGmψGAACmψmψCACCCAGGGGGAGmψGGCAGCGGCmψGAAmψCCCGAACAGAGAAACmψmψGmψACAGGGAmψGmψGAmψGCmψGGAGAAmψmψACAGCAACCmψmψGmψCmψCmψGmψGGGACAAGGGGAAACCACCAAACCCGAmψGmψGAmψCmψmψGAGGmψmψGGAACAAGGAAAGGAGCCAmψGGmψmψGGAGGAAGAGGAAGmψGCmψGGGAAGmψGGCCGmψGCAGAAAAAAAmψGGGGACAmψmψGGAGGGCAGAmψmψmψGGAAGCCAAAGGAmψGmψGAAAGAGAGmψCmψCGGAGGGCCGAGCmψCmψGGCGCACCCCCACCAAGmψGGAGGGmψCmψCCmψGCCGGGmψCCCCAACAmψCmψACmψGAAGAAGGCACCAGCGAAmψCCGCAACGCCCGAGmψCAGGCCCmψGGmψACCmψCCACAGAACCAmψCmψGAAGGmψAGmψGCGCCmψGGmψmψCCCCAGCmψGGAAGCCCmψACmψmψCCACCGAAGAAGGCACGmψCAACCGAACCAAGmψGAAGGAmψCmψGCCCCmψGGGACCAGCACmψGAACCAmψCmψGAGCAAGAGAmψCAAGAGAAmψCAACAAGAmψCAGAAGGAGACmψGGmψCAAGGACAGCAACACAAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψCGmψCAGAGmψGAmψGACCCCmψGACCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCCGAGAACAmψCCCmψCAGCCmψAmψCAGCAACACCAGCAGGGCCAACCmψGAACAAGCmψGCmψGACCGACmψACACCGAGAmψGAAGAAAGCCAmψCCmψGCACGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAAGACCCCGmψGGGCCmψGAmψGAGCAGAGmψmψGCmψCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGACCAGAACAAGCmψGAAGCCCGAGAmψGGACGAGAAGGGCAAmψCmψGACCACAGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCmψCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAACAGGmψGmψCCGAGAAAGGCAAGGCCmψACACCAACmψACmψmψCGGCAGAmψGmψAACGmψGGCCGAGCACGAGAAGCmψGAmψmψCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAACCmψGAGAAGGACmψCmψGAmψGAGGCCGmψGACCmψACAGCCmψGGGCAAGmψmψmψGGACAGAGAGCCCmψGGACmψmψCmψACAGCAmψCCACGmψGACCAAAGAAAGCACACACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCmψCAGAmψCGCCGGCAAmψAGAmψACGCCmψCmψGGACCmψGmψGGGCAAAGCCCmψGmψCCGAmψGCCmψGCAmψGGGAACAAmψCGCCAGCmψmψCCmψGAGCAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAGCACCAGAAGGmψGGmψCAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAAAGCCmψGAGGGAGCmψGGCCGGCAAAGAGAACCmψGGAAmψACCCCAGCGmψGACCCmψGCCmψCCmψCAGCCmψCACACAAAAGAAGGCGmψGGACGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCAGAGmψGAGAAmψGmψGGGmψCAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAACmψGmψCCAGGGACGACGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGCmψmψCCCmψAGCmψmψCCCmψCmψGGmψGGAAAGACAGGCCAAmψGAAGmψGGAmψmψGGmψGGGACAmψGGmψCmψGCAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAGAAAGAGGAmψGGCAAGGmψmψmψmψCmψGGCAGAACCmψGGCCGGCmψACAAGAGACAAGAAGCCCmψGAGGCCmψmψACCmψGAGCAGCGAAGAGGACCGGAAGAAGGGCAAGAAGmψmψCGCCAGAmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGCAAAGmψGmψACGAmψGAGGCCmψGGGAGAGAAmψCGACAAGAAGGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψmψAAGCmψGGAAGAGGAAAGAAGGAGCGAGGACGCCCAAmψCmψAAAGCCGCmψCmψGACCGAmψmψGGCmψGAGAGCCAAGGCCAGCmψmψmψGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAAGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGCGAmψCmψGAGAGGCAAGCCCmψmψCGCCAmψmψGAGGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGCGCCmψmψCAmψmψmψGGCAGAAAGACGGCGmψCAAGAAACmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAAmψmψACmψmψCAAAGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAGAAGAmψCAAACCCGAGGCCmψmψCGAGGCmψAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψCAACAAAAAGmψCCGGCGAGAmψCGmψGCCCAmψGGAAGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCCAACCmψGAmψmψAmψCCmψGCCmψCmψGGCCmψmψCGGCAAGAGACAGGGCAGAGAGmψmψCAmψCmψGGAACGAmψCmψGCmψGAGCCmψGGAAACCGGCmψCmψCmψGAAGCmψGGCCAAmψGGCAGAGmψGAmψCGAGAAAACCCmψGmψACAACAGGAGAACCAGACAGGACGAGCCmψGCmψCmψGmψmψmψGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGAGAAGAGAGGmψGCmψGGACAGCAGCAACAmψCAAGCCCAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGCCCGGGGCGAGAAmψAmψCCCmψGCmψGmψGAmψCGCCCmψGACAGACCCmψGAAGGAmψGCCCACmψGAGCAGAmψmψCAAGGACmψCCCmψGGGCAACCCmψACACACAmψCCmψGAGAAmψCGGCGAGAGCmψACAAAGAGAAGCAGAGGACAAmψCCAGGCCAAGAAAGAGGmψGGAACAGAGAAGAGCCGGCGGAmψACmψCmψAGGAAGmψACGCCAGCAAGGCCAAGAAmψCmψGGCCGACGACAmψGGmψCCGAAACACCGCCAGAGAmψCmψGCmψGmψACmψACGCCGmψGACACAGGACGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGCGAAmψCmψGAGCAGAGGCmψmψCGGCCGGCAGGGCAAGAGAACCmψmψmψAmψGGCCGAGAGGCAGmψACACCAGAAmψGGAAGAmψmψGGCmψCACAGCmψAAACmψGGCCmψACGAGGGACmψGAGCAAGACCmψACCmψGmψCCAAAACACmψGGCCCAGmψAmψACCmψCCAAGACCmψGCAGCAAmψmψGCGGCmψmψCACCAmψCACCAGCGCCGACmψACGACAGAGmψGCmψGGAAAAGCmψCAAGAAAACCGCCACCGGCmψGGAmψGACCACCAmψCAACGGCAAAGAGCmψGAAGGmψmψGAGGGCCAGAmψCACCmψACmψACAACAGGmψACAAGAGGCAGAACGmψCGmψGAAGGAmψCmψGAGCGmψGGAACmψGGACAGACmψGAGCGAAGAGAGCGmψGAACAACGACAmψCAGCAGCmψGGACAAAGGGCAGAmψCAGGCGAGGCmψCmψGAGCCmψGCmψGAAGAAGAGGmψmψmψAGCCACAGACCmψGmψGCAAGAGAAGmψmψCGmψGmψGCCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACACACGCCGCmψGAACAGGCmψGCCCmψGAACAmψmψGCCAGAAGCmψGGCmψGmψmψCCmψGAGAAGCCAAGAGmψACAAGAAGmψACCAGACCAACAAGACCACCGGCAACACCGACAAGAGGGCCmψmψmψGmψGGAAACCmψGGCAGAGCmψmψCmψACAGAAAAAAGCmψGAAAGAAGmψCmψGGAAGCCCGCCGmψGCGAmψCGGGCGGmψmψCCGGCGGAGGmψmψCCACmψAGmψCCAAAAAAGAAGAGAAAGGmψAGAmψmψACAAAGAmψGACGAmψGACAAAGACmψACAAGGAmψGAmψGAmψGAmψAAGGGAmψCCGGCmψGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
對於實驗#2，如上文關於實驗#1所描述進行靶向 PCSK9之gRNA之合成，且靶向間隔子之序列列於表14中。為了與dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L配對，靶向間隔子如下：1) 7.148 ( B2M，作為非靶向對照；SEQ ID NO: 3101)，27.126 ( PCSK9；CACGCCACCCCGAGCCCCAU；SEQ ID NO: 3102)，及27.128 ( PCSK9；CAGCCUGCGCGUCCACGUGA；SEQ ID NO: 3103)。
將mRNA及gRNA轉染至Hepa1-6細胞中且細胞內PCSK9染色：
用300 ng編碼LTRP1-ZIM3、LTRP5-ZIM3、催化活性CasX 491或dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L的mRNA及150 ng靶向 PCSK9之gRNA (表14)脂質轉染用NATE TM抑制劑處理之所接種Hepa1-6細胞。如之前關於實驗#1所描述，在轉染後7天、14天、21天、36天及71天，使用細胞內染色方案量測PCSK9蛋白之細胞內水平。 結果：
在實驗#1中，將編碼dXR1或LTRP1-ZIM3之mRNA與靶向 PCSK9之gRNA共同轉染至小鼠Hepa1-6細胞中，以評估其藉由使小鼠 PCSK9基因座沉默而誘導PCSK9基因減量的能力。所得PCSK9基因減量之量化顯示於圖4至圖6中。資料證實，在第6天，使用七種靶向小鼠 PCSK9基因座之gRNA中的六種以及LTRP1-ZIM3 mRNA使得細胞內PCSK9之基因減量＞50%，其中主導間隔子27.94實現＞80%抑制水平(圖4)。使用dXR1 mRNA，在第6天觀測到類似趨勢，但抑制程度在與諸如間隔子27.92及27.100之某些間隔子配對時較不顯著(圖4)。結果亦證實，使用LTRP1-ZIM3 mRNA使得 PCSK9基因座之抑制保持至少25天，其中使用前兩個間隔子27.94及27.88展示沉默 PCSK9之最強持久性(圖6)。然而，第6天觀測到的由dXR1介導之PCSK9抑制在第13天恢復至與關於非靶向對照(間隔子6.7)所偵測到之水平類似的PCSK9水平；所有靶向 PCSK9基因之所分析gRNA均顯現此短暫抑制(圖5)。
在實驗#2中，將編碼LTRP1-ZIM3或LTRP5-ZIM3、dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L或催化活性CasX491之mRNA與靶向 PCSK9之gRNA共同轉染至小鼠Hepa1-6細胞中，以評估其藉由使小鼠 PCSK9基因座沉默而誘導PCSK9基因減量的能力。所得PCSK9抑制之量化顯示於圖7至圖8中。資料表明，當與具有前間隔子27.94之靶向gRNA配對時，IVT產生之LTRP1-ZIM3或LTRP5-ZIM3 mRNA之遞送引起可比水平之持續PCSK9基因減量(截至第71天約40%基因減量)，而使用替代間隔子27.88，截至第71天並不會引起持續有效的PCSK9基因減量(約12%) (圖7)。此外，編碼LTRP1-ZIM3及dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L之第三方產生之mRNA在與含有各種間隔子之gRNA配對時產生類似水平之持久PCSK9基因減量，其中使用間隔子27.94仍可產生最高水平之PCSK9抑制(圖8)。
此等實驗證實，具有不同組態之LTRP分子可誘導小鼠肝細胞株中之內源性基因座之可遺傳沉默。同時，如所預期，使用dXR構築體在較早時間點引起目標基因座之有效抑制，但其使用不引起持久沉默。此等發現亦顯示，dXR及LTRP分子(具有不同組態)可呈mRNA形式遞送且與靶向gRNA共同轉染至細胞，表明此遞送有效負載之短暫性質仍足以誘導沉默。 實例 3 ： 評估當與 LTRP5-ADD 分子配對時在人類肝細胞中實現 PCSK9 基因座之抑制的間隔子
進行實驗，以證明具有TTC識別模體的多個間隔子與含有ADD域之組態#5的LTRP分子(LTRP5；圖解於圖2)配對後，可誘導人類細胞中與治療相關的內源基因座的持久抑制。特定言之，在人類Huh7細胞中進行最初概念驗證實驗，以評估展現對非人類靈長類動物(NHP)基因體之序列保守的間隔子的子組，以識別用於未來活體內NHP研究中之測試的主導間隔子。 材料及方法： 用於與含有 ADD 域之 LTRP5 分子進行實驗測試之靶向 PCSK9 之間隔子的計算選擇 ：
為確定整個人類 PCSK9基因座中之潛在LTRP特異性間隔子，目標檢索區域經定義為在轉錄起始部位(TSS)上游5 KB開始至轉錄終止部位下游5 KB處。基於TTC PAM之可用性確定間隔子；因此，在整個目標 PCSK9基因座中供識別出1,121個TTC間隔子。此等間隔子隨後藉由基於其定位(亦即確定推定間隔子是否靶向啟動子區內之外顯子、內含子或候選順式-調節元件(cCRE)，及/或與基因變異(例如SNP)之共同部位重疊)覆蓋關鍵基因體特徵而對其進行功能上註釋。為了縮小且確定用於實驗篩選的間隔子的初始間隔子群組，對所提取的間隔子進行一組過濾準則。首先，藉由移除與中靶部位含有至多一個鹼基對錯配之脫靶部位的間隔子來排除非特異性間隔子。此外，排除含有以下單核苷酸重複序列之間隔子：長度超過四個鹼基對(bp)之胸腺嘧啶核苷酸重複序列或長度超過5 bp之腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶核苷酸重複序列。接著，自此過濾組排除在間隔子之最後四個核苷酸中具有超過一個含有錯配之脫靶部位之間隔子。最後，排除以TSS上游＞2KB且在轉錄終止部位下游＞2KB為靶向之間隔子。此產生722個TTC間隔子之經過濾組(SEQ ID NO: 1824-2545)。自此經過濾組722間隔子中，選擇TSS-近端(在TSS上游及下游1100 bp內)之間隔子用於實驗評估，使得鑑別出67個TTC間隔子。額外兩個間隔子TG-06-354及TG-06-352位於1100 bp臨限值窗之外，亦被選擇以包括在其中。所得69個TTC間隔子之序列展示於表17中。 表17 ： 靶向人類 PCSK9 基因座之 69 個 TTC 間隔子的 RNA 序列。 粗體間隔子為在人類與非人類靈長類動物基因體之間具有共通序列的間隔子且在此實例中進行評估。
間隔子ID 間隔子RNA 序列 SEQ ID NO:
TG-06-342 AAUUACAGGCAACAGGAAGG 1824
TG-06-343 CCCCAUGUAAGAGAGGAAGU 1825
TG-06-344 CAGUUUCUGCCUCGCCGCGG 1826
TG-06-345 GCCUCGCCGCGGCACAGGUG 1827
TG-06-346 CCCACCUGUGCCGCGGCGAG 1828
TG-06-347 CUCCUUCACCCACCUGUGCC 1829
TG-06-348 AGGCAUUCACUCCUUCACCC 1830
TG-06-349 CUGUGCCUGGUGCAGUUCCC 1831
TG-06-350 GUGUCAUAAAGAAAUUGCCU 1832
TG-06-351 UUAUGACACAGAACUCAUGC 1833
TG-06-001 GAGGAGGACGGCCUGGCCGA 1834
TG-06-002 ACCGCUGCGCCAAGGUGCGG 1835
TG-06-004 GCCAGGCCGUCCUCCUCGGA 1836
TG-06-005 GUGCUCGGGUGCUUCGGCCA 1837
TG-06-117 ACUUUGUUUGCAAAGACCUC 1838
TG-06-118 GAGUGAAAUGGCCUGCUCUG 1839
TG-06-119 GAGCAGGCCAUUUCACUCGG 1840
TG-06-120 CUCGGAAUCUGCUGUGCAUC 1841
TG-06-121 GGAAGGGCUGUCGAUACUGG 1842
TG-06-123 UCCCAGUAUCGACAGCCCUU 1843
TG-06-124 CAGUAUCGACAGCCCUUCCA 1844
TG-06-125 AGAAAGAGCAAGCCUCAUGU 1845
TG-06-128 AGAAAUCAACUGGACAAGCA 1846
TG-06-131 UGAACAUGGUGUGUAAAAGG 1847
TG-06-132 AGAAGAUUCAAUUUGCAAAG 1848
TG-06-133 AUGGUAGGCACAAGCUCAGC 1849
TG-06-134 GAAUUCUAUGGUAGGCACAA 1850
TG-06-135 GGAAAGCUGAGCUUGUGCCU 1851
TG-06-138 AGGGAUUUAUACUACAAAGA 1852
TG-06-139 AGGAGCAGCUAGUUGGUAAG 1853
TG-06-140 AAACUUAGCCUGGACCCCCU 1854
TG-06-141 ACUGGCCUUAACCUGGCAGC 1855
TG-06-142 UUCCACUGGCCUUAACCUGG 1856
TG-06-143 GAAUCAAUCCUACUGUGGAC 1857
TG-06-144 GUGGGCAGCGAGGAGUCCAC 1858
TG-06-145 UGGGUCCACCUUGUCUCCUG 1859
TG-06-146 GAAGUCUCACUGGUCAGCAG 1860
TG-06-147 GUGUUUCCUGGGUCCACCUU 1861
TG-06-149 AGCCCAGUUAGGAUUUGGGA 1862
TG-06-150 UCCCUCUGCGCGUAAUCUGA 1863
TG-06-151 CUCUGCGCGUAAUCUGACGC 1864
TG-06-152 GCCUCGCCCUCCCCAAACAG 1865
TG-06-153 GUUAAUGUUUAAUCAGAUAG 1866
TG-06-154 AGGGUGUGGGUGCUUGACGC 1867
TG-06-155 GCAGCGACGUCGAGGCGCUC 1868
TG-06-157 GGGUCUGAGCCUGGAGGAGU 1869
TG-06-158 GGAGCAGGGCGCGUGAAGGG 1870
TG-06-159 GCGCGCCCCUUCACGCGCCC 1871
TG-06-160 CGCGCCCUGCUCCUGAACUU 1872
TG-06-161 GCUCCUGCACAGUCCUCCCC 1873
TG-06-167 CACUGAAUAGCGCAGCCGCA 1874
TG-06-168 GUGGGAAGGUUCGCGGGGUU 1875
TG-06-169 CGGGGUUGGGAGACCCGGAG 1876
TG-06-170 UCGGCCUCCGGGUCUCCCAA 1877
TG-06-171 CAGUACGUUCCAGGCAUUCA 1878
TG-06-172 GCUGAAACAGAUGGAAUACU 1879
TG-06-249 AAACCAAAUCGGAACCCACU 1880
HS-6-147 UGUUGCCUGUAAUUGGAAUU 1881
HS-6-149 CCUUCCUGUUGCCUGUAAUU 1882
TG-06-122 CCUUUGUUUCUUCCCAGUAU 1883
TG-06-127 UCCUCCUGCCUGGUACACAA 1884
TG-06-137 GAAUGUACCUAUAUGACGUC 1885
TG-06-188 CCCCGGCCUCCCAUCCCUAC 1886
TG-06-243 CUUGGCACGAUCUUGGGGAC 1887
TG-06-250 GAUUUGGUUUGGAAAACAUG 1888
TG-06-251 CUCCAGGCCCUCCACCCUCC 1889
HS-6-159 CACCCCGCCCCUGUCUCGGG 1890
TG-06-354 CCCCUGCCCCUUCAGCUGGU 1925
TG-06-352 UCCCUCACCAAUUACCCCUC 1910
應注意，對於整個此等實例之間隔子命名法，短劃線及句點可互換地使用。因此，間隔子「06-146」與間隔子「6.146」相同。 評估 PCSK9 分泌水平以選擇對非人類靈長類動物基因體具有序列保守性之靶向 PCSK9 之間隔子 ：
在經識別的69個TTC間隔子中，首先測試展現人類與非人類靈長類動物基因體之間的序列保守性的15個間隔子(表17中之粗體間隔子)以評估其對PCSK9分泌水平之影響。
編碼以下分子之mRNA遵循如實例2中所描述之類似方法由IVT產生：1)催化活性CasX 676 (如實例5中所描述)、2) dXR1 (如實例2中所描述)及3) LTRP5-ADD-ZIM3 (如實例4中所描述)。CasX 676之DNA及mRNA序列展示於表21及表22中；dXR1之DNA及mRNA序列展示於表11及表12中；LTRP5-ADD-ZIM3之DNA及mRNA序列展示於表18及表19中。
含有靶向 PCSK9基因座之NHP保守間隔子(表17中粗體間隔子)之gRNA係使用gRNA骨架316設計且以化學方式合成。此外，靶向 B2M之gRNA用作非靶向對照，而間隔子TG-06-138 (亦稱為間隔子6.138；SEQ ID NO: 1852)用於與dXR1配對，且間隔基TG-06-001 (亦稱為間隔子6.1；SEQ ID NO: 1834)用於與CasX 676配對。鑒於間隔子TG-06-157 (亦稱為間隔子6.157；SEQ ID NO: 1869) (其不為NHP保守間隔子)在持續抑制 PCSK9基因座之面展現出的效力，將其包括為陽性對照，且展示於下文實例5中。
為評估PCSK9分泌，用編碼催化活性CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA及具有骨架316及靶向 B2M或 PCSK9基因座之間隔子的gRNA轉染所接種之Huh7細胞。轉染後6天、18天、36天及87天收穫培養基上清液以藉由ELISA評估PCSK9分泌之水平。PCSK9分泌之水平相對於總細胞計數標準化。作為額外對照，亦在自含有未經處理之原始細胞之孔收集之培養基上清液中量測PCSK9分泌。 結果：
經編碼催化活性CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA與靶向 PCSK9基因座之NHP保守gRNA轉染的Huh7細胞在四個時間點處的標準化PCSK9分泌水平之定量展示於圖9中。資料表明，當與對照條件(亦即未處理之細胞、經dXR1處理之細胞及經非靶向對照處理之細胞)相比時，使用大部分NHP保守間隔子與LTRP5-ADD-ZIM3產生持續抑制直至轉染後36天(使用靶向 B2M基因座之間隔子7.37)。特定言之，相比於使用間隔子6.1與CasX 676配對所觀測到之PCSK9分泌水平，使用TSS-近端間隔子TG-06-147、TG-06-167、TG-06-133、TG-06-146及TG-06-154與LTRP5-ADD-ZIM3配對產生類似或進一步降低之持續抑制水平直至第36天(圖9)。有趣的是，使用TG-06-352 (其經定位超出此處稱為「TSS-近端」之1100 bp臨限值窗)亦在第36天產生有效抑制(圖9)。類似於實例5中觀測到的結果，用LTRP5-ADD-ZIM3與間隔子6.157處理產生分泌PCSK9水平之持續抑制，而用dXR1及間隔子6.138處理則產生短暫抑制。此外，用三種mRNA分子中之任一者與靶向 B2M基因座之間隔子7.37處理不影響PCSK9分泌(圖9)。然而，轉染後87天，當與使用與CasX 676配對之間隔子6.1相比時，使用僅與LTRP5-ADD-ZIM3配對之間隔子TG-06-157、TG-06-154、TG-06-167及TG-06-243產生類似或進一步降低之持續抑制水平(圖9)。
此等結果證明遞送編碼具有ADD域的LTRP分子之mRNA與適當的靶向PCSK9之gRNA可引起人類細胞中內源性目標基因座之持續抑制。此外，此等實驗顯示，與非人類靈長類動物物種具有共通序列之若干人類間隔子由於靶向治療相關基因座而實現強表型作用，此支持了在利用非人類靈長類動物模型進行臨床前功效研究中此等所選間隔子的潛在用途。 實例 4 ： 證明將 ADD 域包括至 LTRP 分子中可增強小鼠 Hepa1-6 細胞中內源性基因座之抑制
進行實驗，以證明當作為與靶向gRNA共轉染之mRNA遞送時，將ADD域併入至LTRP分子中可增強LTRP誘導小鼠Hepa1-6肝細胞中內源性基因座的持久抑制的能力。 材料及方法： LTRP #5 mRNA 之產生：
藉由活體外轉錄(IVT)來產生編碼LTRP #5分子之兩種變異體的mRNA：1)含有ZIM3-KRAB域之LTRP #5分子(在下文中被稱為LTRP5-ZIM3)以及2)含有DNMT3A-ADD域之LTRP5-ZIM3(在下文中被稱為LTRP5-ADD-ZIM3)。簡言之，產生編碼5'UTR區、具有側接SV40 NLS之LTRP5-ZIM3或LTRP5-ADD-ZIM3、及3'UTR區的構築體，且將其選殖至含有T7啟動子及79-核苷酸聚(A)尾之質體中。編碼LTRP5-ZIM3或LTRP5-ADD-ZIM3分子之序列除使用公開可用之密碼子最佳化工具及按需要調節諸如GC含量之參數外，亦使用密碼子利用率表進行密碼子最佳化。編碼LTRP5-ZIM3及LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA之DNA序列列於表18中。相應mRNA序列及蛋白質序列分別列於表19及表20中。 表 18 ： 此實例中評估之 LTRP5-ZIM3 及 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA 分子之編碼 DNA 及 RNA 序列 * 。
LTRP 分子 組分 DNA 序列或SEQ ID NO RNA 序列或SEQ ID NO
LTRP5-ZIM3 5'UTR 3047 3115
起始密碼子+ NLS +連接子 3104 3116
起始密碼子+ DNMT3A催化域 3059 3117
連接子 3060 3118
DNMT3L相互作用域 3061 3119
連接子 3105 3105
ZIM3-KRAB 3051 3120
連接子 3106 3121
dCasX491 3049 3122
緩衝序列+連接子 3107 3123
NLS +終止密碼子+緩衝序列 3108 3124
3'UTR 3055 3125
緩衝序列 TCTAG UCUAG
聚(A)尾 3109 3109
LTRP5-ADD-ZIM3 5'UTR 3047 3115
起始密碼子+ NLS +連接子 3104 3116
起始密碼子+ DNMT3A ADD域 3111 3127
DNMT3A催化域 3112 3128
連接子 3060 3118
DNMT3L相互作用域 3061 3119
連接子 3105 3105
ZIM3-KRAB 3051 3120
連接子 3106 3121
dCasX491 3049 3122
緩衝序列+連接子 3107 3123
NLS +終止密碼子+緩衝序列 3108 3124
3'UTR 3055 3125
緩衝序列 3056 3126
聚(A)尾 3109 3109
*組分以5'至3'次序列於構築體內 表 19 ： 此實例中評估之 LTRP5-ZIM3 及 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA 分子之全長 RNA 序列。修飾『 m ψ 』 = N1- 甲基 - 假尿苷 。
LTRP 分子 SEQ ID NO RNA 序列
LTRP5-ZIM3 3129 AAAmψAAGAGAGAAAAGAAGAGmψAAGAAGAAAmψAmψAAGAGCCACCAmψGGCCCCmψAAGAAGAAGCGmψAAAGmψGAGCCGGAmψGAACCACGACCAGGAGmψmψCGACCCCCCmψAAGGmψGmψACCCmψCCCGmψCCCCGCCGAGAAGAGAAAGCCCAmψCCGGGmψCCmψGAGCCmψGmψmψCGAmψGGCAmψCGCCACCGGmψCmψGCmψGGmψGCmψGAAGGACCmψGGGCAmψCCAGGmψGGAmψAGGmψACAmψmψGCCmψCCGAGGmψGmψGCGAGGACmψCCAmψCACCGmψGGGAAmψGGmψGCGmψCAmψCAGGGCAAGAmψCAmψGmψACGmψGGGCGACGmψGCGGAGCGmψGACACAGAAGCAmψAmψCCAGGAGmψGGGGCCCmψmψmψCGACCmψGGmψGAmψCGGCGGCAGCCCmψmψGCAAmψGACCmψGAGCAmψCGmψGAACCCAGCCCGGAAGGGCCmψGmψACGAGGGAACCGGCAGACmψGmψmψCmψmψCGAGmψmψmψmψACAGACmψGCmψGCACGACGCCCGGCCmψAAGGAAGGCGACGACCGGCCCmψmψCmψmψmψmψGGCmψGmψmψCGAGAAmψGmψGGmψGGCCAmψGGGAGmψCAGCGACAAGCGGGAmψAmψmψAGCCGGmψmψCCmψGGAGAGCAACCCCGmψGAmψGAmψCGAmψGCCAAGGAAGmψGAGCGCCGCCCACCGGGCCAGAmψACmψmψCmψGGGGCAAmψCmψGCCmψGGCAmψGAACAGACCCCmψGGCCAGCACCGmψGAACGACAAGCmψGGAGCmψGCAGGAGmψGCCmψGGAGCACGGCCGGAmψCGCCAAGmψmψCAGCAAGGmψGAGAACCAmψCACCACCCGAAGCAACAGCAmψCAAACAAGGCAAGGACCAGCACmψmψmψCCmψGmψGmψmψCAmψGAACGAGAAGGAGGACAmψCCmψGmψGGmψGmψACCGAGAmψGGAGAGAGmψGmψmψCGGGmψmψCCCAGmψCCACmψACACAGAmψGmψCAGCAACAmψGmψCmψAGACmψGGCCAGACAGAGACmψGCmψGGGAAGAAGCmψGGmψCCGmψCCCmψGmψGAmψCAGACACCmψGmψmψCGCCCCmψCmψGAAGGAGmψACmψmψCGCCmψGCGmψGAGCAGCGGCAACAGCAACGCCAACAGCCGGGGCCCCAGCmψmψCmψCmψAGCGGCCmψGGmψGCCACmψGmψCCCmψGAGAGGGAGCCACAmψGGGCCCCAmψGGAGAmψCmψACAAAACCGmψGAGCGCCmψGGAAGCGGCAGCCmψGmψGCGCGmψGCmψGAGCCmψGmψmψmψCGGAAmψAmψCGAmψAAAGmψCCmψGAAAAGCCmψGGGAmψmψCCmψGGAGAGCGGCmψCmψGGCmψCCGGCGGmψGGCACCCmψGAAGmψACGmψGGAGGAmψGmψGACAAACGmψGGmψCAGACGGGAmψGmψGGAGAAGmψGGGGCCCCmψmψCGAmψCmψGGmψGmψACGGCAGCACCCAACCCCmψGGGCAGCmψCmψmψGmψGACCGGmψGCCCmψGGCmψGGmψACAmψGmψmψmψCAGmψmψCCACCGGAmψCCmψGCAGmψACGCCCmψGCCGAGACAGGAGmψCCCAGCGGCCAmψmψCmψmψmψmψGGAmψmψmψmψCAmψGGACAACmψmψGCmψGCmψGACCGAGGAmψGACCAGGAAACmψACCACmψCGGmψmψCCmψGCAGACCGAAGCCGmψGACCCmψGCAGGACGmψGAGAGGCCGGGACmψACCAGAACGCCAmψGCGGGmψGmψGGmψCCAACAmψCCCmψGGACmψGAAAAGCAAGCACGCACCmψCmψGACCCCmψAAAGAAGAGGAGmψACCmψGCAGGCCCAGGmψGCGGAGCAGAAGCAAGCmψGGACGCCCCmψAAGGmψGGAmψCmψGCmψGGmψGAAGAAmψmψGCCmψCCmψGCCCCmψGAGAGAGmψACmψmψCAAGmψAmψmψmψCAGCCAGAAmψAGmψCmψGCCCCmψGGGAGGCAGCGGCGGCGGCAmψGAACAACmψCCCAGGGCAGAGmψGACCmψmψCGAGGACGmψGACCGmψGAAmψmψmψmψACACAGGGAGAGmψGGCAGAGACmψGAACCCCGAGCAGAGAAACCmψGmψACCGGGAmψGmψGAmψGCmψGGAAAACmψACAGCAAmψCmψGGmψGmψCCGmψGGGCCAGGGCGAGACCACAAAGCCmψGACGmψGAmψCCmψGCGmψCmψGGAGCAGGGCAAGGAACCCmψGGCmψGGAGGAGGAGGAGGmψGCmψGGGAAGCGGACGGGCCGAGAAGAACGGCGACAmψCGGCGGACAGAmψCmψGGAAGCCmψAAGGACGmψGAAAGAAAGCCmψGGGCGGCCCAAGCAGCGGCGCCCCmψCCmψCCCAGCGGCGGCAGCCCAGCCGGCmψCCCCAACCmψCmψACCGAGGAGGGCACCmψCmψGAGmψCCGCCACCCCCGAGAGCGGCCCmψGGCACCmψCCACCGAGCCCAGCGAGGGCAGCGCACCCGGCAGCCCmψGCCGGCAGCCCCACCmψCCACAGAGGAGGGAACCAGCACCGAGCCCAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGCACCAGCACCGAGCCmψAGmψGAGCAGGAGAmψmψAAACGGAmψCAACAAGAmψCAGAAGAAGACmψmψGmψGAAAGACAGCAACACCAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψGGmψmψAGAGmψGAmψGACACCCGAmψCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAAAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAAmψACAmψCmψAGAGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGAmψmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCGAmψCCmψGCAmψGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAGGACCCmψGmψGGGCCmψGAmψGAGCCGGGmψGGCCCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAACCmψGAGAmψGGACGAGAAGGGCAACCmψGACCACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCCCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAGCAGGmψGmψCmψGAGAAGGGCAAGGCmψmψACACCAACmψACmψmψCGGACGGmψGCAAmψGmψGGCCGAGCACGAAAAGCmψGAmψCCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCCGAGAAGGAmψAGCGACGAAGCCGmψGACAmψAmψAGCCmψGGGAAAGmψmψmψGGGCAGAGGGCCCmψGGAmψmψmψCmψACAGCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAGmψCCACCCACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCCCAGAmψCGCCGGAAACAGAmψACGCCmψCCGGACCmψGmψGGGAAAGGCCCmψGAGCGACGCAmψGmψAmψGGGCACAAmψCGCCmψCCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAACACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGGGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAAmψACCCmψAGCGmψGACCCmψGCCACCmψCAGCCmψCACACCAAGGAGGGCGmψmψGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGAAmψGmψGGGmψGAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψAAGCAGAGAmψGAmψGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGAmψmψCCCmψmψCCmψmψmψCCmψCmψGGmψCGAGAGACAGGCCAACGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAAAAGGAGGAmψGGCAAGGmψGmψmψmψmψGGCAGAAmψCmψGGCmψGGCmψACAAGAGACAGGAAGCCCmψGAGACCAmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGAmψCGGAAGAAGGGAAAGAAAmψmψCGCmψCGGmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGAAAGGmψGmψACGACGAGGCCmψGGGAGCGGAmψmψGACAAGAAAGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAAGAGGAACGGAGAAGCGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGCGGGCmψAAGGCCAGCmψmψCGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGGGACCmψGCGGGGAAAGCCCmψmψCGCCAmψCGAAGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGmψGCCmψmψCAmψCmψGGCAGAAGGACGGCGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψACmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAGAAGAmψCAAACCmψGAAGCCmψmψCGAAGCCAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψCAACAAAAAGAGCGGCGAGAmψCGmψGCCCAmψGGAGGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCCAACCmψGAmψCAmψCCmψGCCmψCmψGGCCmψmψmψGGCAAGAGACAGGGCAGAGAAmψmψCAmψCmψGGAACGACCmψGCmψGmψCCCmψGGAAACCGGCAGCCmψGAAGCmψGGCCAACGGAAGAGmψGAmψCGAGAAGACACmψGmψACAACAGAAGAACCCGGCAGGAmψGAGCCmψGCCCmψGmψmψCGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGCGGCGGGAGGmψCCmψGGACmψCCmψCCAAmψAmψCAAACCAAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGCAAGAGGCGAAAACAmψCCCCGCCGmψGAmψCGCCCmψGACCGACCCCGAGGGCmψGCCCACmψGAGCCGGmψmψmψAAGGAmψAG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LTRP5-ADD-ZIM3 3130 AAAmψAAGAGAGAAAAGAAGAGmψAAGAAGAAAmψAmψAAGAGCCACCAmψGGCCCCmψAAGAAGAAGCGmψAAAGmψGAGCCGGAmψGGAACGCCmψCGmψCmψACGAGGmψGCGGCAGAAGmψGCAGAAACAmψCGAGGACAmψCmψGCAmψCmψCCmψGCGGAmψCmψCmψGAACGmψGACCCmψGGAGCACCCACmψGmψmψCAmψCGGCGGCAmψGmψGCCAGAACmψGmψAAAAACmψGmψmψmψmψCmψGGAGmψGmψGCCmψAmψCAAmψACGACGAmψGACGGCmψACCAGAGCmψACmψGCACCAmψCmψGmψmψGCGGCGGAAGAGAGGmψGCmψGAmψGmψGmψGGAAAmψAACAACmψGCmψGCCGGmψGCmψmψCmψGCGmψGGAAmψGCGmψGGACCmψGCmψGGmψGGGCCCCGGCGCCGCCCAGGCCGCmψAmψmψAAGGAAGAmψCCmψmψGGAACmψGCmψACAmψGmψGCGGCCACAAGGGCACAmψACGGCCmψGCmψGAGACGGAGAGAGGACmψGGCCmψAGCAGACmψGCAGAmψGmψmψCmψmψCGCCAAmψAACCACGACCAGGAGmψmψCGACCCCCCmψAAGGmψGmψACCCmψCCCGmψCCCCGCCGAGAAGAGAAAGCCCAmψCCGGGmψCCmψGAGCCmψGmψmψCGAmψGGCAmψCGCCACCGGmψCmψGCmψGGmψGCmψGAAGGACCmψGGGCAmψCCAGGmψGGAmψAGGmψACAmψmψGCCmψCCGAGGmψGmψGCGAGGACmψCCAmψCACCGmψGGGAAmψGGmψGCGmψCAmψCAGGGCAAGAmψCAmψGmψACGmψGGGCGACGmψGCGGAGCGmψGACACAGAAGCAmψAmψCCAGGAGmψGGGGCCCmψmψmψCGACCmψGGmψGAmψCGGCGGCAGCCCmψmψGCAAmψGACCmψGAGCAmψCGmψGAACCCAGCCCGGAAGGGCCmψGmψACGAGGGAACCGGCAGACmψGmψmψCmψmψCGAGmψmψmψmψACAGACmψGCmψGCACGACGCCCGGCCmψAAGGAAGGCGACGACCGGCCCmψmψCmψmψmψmψGGCmψGmψmψCGAGAAmψGmψGGmψGGCCAmψGGGAGmψCAGCGACAAGCGGGAmψAmψmψAGCCGGmψmψCCmψGGAGAGCAACCCCGmψGAmψGAmψCGAmψGCCAAGGAAGmψGAGCGCCGCCCACCGGGCCAGAmψACmψmψCmψGGGGCAAmψCmψGCCmψGGCAmψGAACAGACCCCmψGGCCAGCACCGmψGAACGACAAGCmψGGAGCmψGCAGGAGmψGCCmψGGAGCACGGCCGGAmψCGCCAAGmψmψCAGCAAGGmψGAGAACCAmψCACCACCCGAAGCAACAGCAmψCAAACAAGGCAAGGACCAGCACmψmψmψCCmψGmψGmψmψCAmψGAACGAGAAGGAGGACAmψCCmψGmψGGmψGmψACCGAGAmψGGAGAGAGmψGmψmψCGGGmψmψCCCAGmψCCACmψACACAGAmψGmψCAGCAACAmψGmψCmψAGACmψGGCCAGACAGAGACmψGCmψGGGAAGAAGCmψGGmψCCGmψCCCmψGmψGAmψCAGACACCmψGmψmψCGCCCCmψCmψGAAGGAGmψACmψmψCGCCmψGCGmψGAGCAGCGGCAACAGCAACGCCAACAGCCGGGGCCCCAGCmψmψCmψCmψAGCGGCCmψGGmψGCCACmψGmψCCCmψGAGAGGGAGCCACAmψGGGCCCCAmψGGAGAmψCmψACAAAACCGmψGAGCGCCmψGGAAGCGGCAGCCmψGmψGCGCGmψGCmψGAGCCmψGmψmψmψCGGAAmψAmψCGAmψAAAGmψCCmψGAAAAGCCmψGGGAmψmψCCmψGGAGAGCGGCmψCmψGGCmψCCGGCGGmψGGCACCCmψGAAGmψACGmψGGAGGAmψGmψGACAAACGmψGGmψCAGACGGGAmψGmψGGAGAAGmψGGGGCCCCmψmψCGAmψCmψGGmψGmψACGGCAGCACCCAACCCCmψGGGCAGCmψCmψmψGmψGACCGGmψGCCCmψGGCmψGGmψACAmψGmψmψmψCAGmψmψCCACCGGAmψCCmψGCAGmψACGCCCmψGCCGAGACAGGAGmψCCCAGCGGCCAmψmψCmψmψmψmψGGAmψmψmψmψCAmψGGACAACmψmψGCmψGCmψGACCGAGGAmψGACCAGGAAACmψACCACmψCGGmψmψCCmψGCAGACCGAAGCCGmψGACCCmψGCAGGACGmψGAGAGGCCGGGACmψACCAGAACGCCAmψGCGGGmψGmψGGmψCCAACAmψCCCmψGGACmψGAAAAGCAAGCACGCACCmψCmψGACCCCmψAAAGAAGAGGAGmψACCmψGCAGGCCCAGGmψGCGGAGCAGAAGCAAGCmψGGACGCCCCmψAAGGmψGGAmψCmψGCmψGGmψGAAGAAmψmψGCCmψCCmψGCCCCmψGAGAGAGmψACmψmψCAAGmψAmψmψmψCAGCCAGAAmψAGmψCmψGCCCCmψGGGAGGCAGCGGCGGCGGCAmψGAACAACmψCCCAGGGCAGAGmψGACCmψmψCGAGGACGmψGACCGmψGAAmψmψmψmψACACAGGGAGAGmψGGCAGAGACmψGAACCCCGAGCAGAGAAACCmψGmψACCGGGAmψGmψGAmψGCmψGGAAAACmψACAGCAAmψCmψGGmψGmψCCGmψGGGCCAGGGCGAGACCACAAAGCCmψGACGmψGAmψCCmψGCGmψCmψGGAGCAGGGCAAGGAACCCmψGGCmψGGAGGAGGAGGAGGmψGCmψGGGAAGCGGACGGGCCGAGAAGAACGGCGACAmψCGGCGGACAGAmψCmψGGAAGCCmψAAGGACGmψGAAAGAAAGCCmψGGGCGGCCCAAGCAGCGGCGCCCCmψCCmψCCCAGCGGCGGCAGCCCAGCCGGCmψCCCCAACCmψCmψACCGAGGAGGGCACCmψCmψGAGmψCCGCCACCCCCGAGAGCGGCCCmψGGCACCmψCCACCGAGCCCAGCGAGGGCAGCGCACCCGGCAGCCCmψGCCGGCAGCCCCACCmψCCACAGAGGAGGGAACCAGCACCGAGCCCAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGCACCAGCACCGAGCCmψAGmψGAGCAGGAGAmψmψAAACGGAmψCAACAAGAmψCAGAAGAAGACmψmψGmψGAAAGACAGCAACACCAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψGGmψmψAGAGmψGAmψGACACCCGAmψCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAAAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAAmψACAmψCmψAGAGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGAmψmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCGAmψCCmψGCAmψGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAGGACCCmψGmψGGGCCmψGAmψGAGCCGGGmψGGCCCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAACCmψGAGAmψGGACGAGAAGGGCAACCmψGACCACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCCCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAGCAGGmψGmψCmψGAGAAGGGCAAGGCmψmψACACCAACmψACmψmψCGGACGGmψGCAAmψGmψGGCCGAGCACGAAAAGCmψGAmψCCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCCGAGAAGGAmψAGCGACGAAGCCGmψGACAmψAmψAGCCmψGGGAAAGmψmψmψGGGCAGAGGGCCCmψGGAmψmψmψCmψACAGCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAGmψCCACCCACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCCCAGAmψCGCCGGAAACAGAmψACGCCmψCCGGACCmψGmψGGGAAAGGCCCmψGAGCGACGCAmψGmψAmψGGGCACAAmψCGCCmψCCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAACACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGGGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAAmψACCCmψAGCGmψGACCCmψGCCACCmψCAGCCmψCACACCAAGGAGGGCGmψmψGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGAAmψGmψGGGmψGAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψAAGCAGAGAmψGAmψGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGAmψmψCCCmψmψCCmψmψmψCCmψCmψGGmψCGAGAGACAGGCCAACGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAAAAGGAGGAmψGGCAAGGmψGmψmψmψmψGGCAGAAmψCmψGGCmψGGCmψACAAGAGACAGGAAGCCCmψGAGACCAmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGAmψCGGAAGAAGGGAAAGAAAmψmψCGCmψCGGmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGAAAGGmψGmψACGACGAGGCCmψGGGAGCGGAmψmψGACAAGAAAGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAAGAGGAACGGAGAAGCGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGCGGGCmψAAGGCCAGCmψmψCGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGGGACCmψGCGGGGAAAGCCCmψmψCGCCAmψCGAAGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGmψGCCmψmψCAmψCmψGGCAGAAGGACGGCGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψACmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAG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表 20 ： 此實例中評估之 LTRP5-ZIM3 及 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA 分子之全長蛋白序列
LTRP 分子 胺基酸序列SEQ ID NO
LTRP5-ZIM3 3131
LTRP5-ADD-ZIM3 3132
gRNA 之合成：
靶向小鼠 PCSK9基因座之兩種gRNA係使用gRNA骨架316設計，且以化學方式合成。在此實例中評估靶向 PCSK9之間隔子27.88及27.94 (序列列於表14中)。如實例2中所示，使用間隔子27.88不如使用間隔子27.94有效地達成PCSK9基因減量。
如實例2中所描述，將mRNA及gRNA轉染至Hepa1-6細胞中且進行細胞內PCSK9染色。簡言之，用300 ng編碼LTRP5-ZIM3或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA及150 ng具有間隔子27.88或27.94之靶向 PCSK9之gRNA轉染所接種Hepa1-6細胞的各孔。在不同時間點，直至轉染後第53天，使用如先前在實例2中所描述之細胞內染色方案量測PCSK9蛋白之細胞內水平。非靶向gRNA用作實驗對照。 結果：
為確定將ADD域併入至LTRP分子對活性(亦即活體外誘導內源性基因座之更持久的抑制)之影響，將編碼LTRP5-ZIM3或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA與靶向 PCSK9之gRNA共轉染至Hepa1-6細胞中。所得PCSK9基因減量之量化顯示於圖10A至圖10B中。資料表明，當細胞用LTRP5-ADD-ZIM3處理時與LTRP5-ZIM3相比達成PCSK9基因減量的顯著改良，且當使用含有較弱間隔子27.88之靶向 PCSK9之gRNA時，此改良更加明顯。當與LTRP5-ZIM3或LTRP5-ADD-ZIM3分子配對時，進一步支持實例2中所論述之資料，截至第53天使用間隔子27.94比使用間隔子27.88產生更持久之抑制(圖10B)。正如所料，使用非靶向未引起PCSK9基因減量。
此等實驗表明與不具有ADD域之構築體相比，使用具有ADD域之LTRP構築體可引起細胞中內源性基因座之增加的持久抑制。此外，此等結果展示具有ADD域之LTRP分子可作為mRNA遞送且與靶向gRNA共轉染至細胞以誘導有效沉默。 實例 5 ： 證明編碼含有 ADD 域之 LTRP 之 mRNA 可誘導多個人類細胞株源中內性基因座之抑制
進行實驗，以證明當作為與靶向gRNA共轉染之mRNA遞送時，編碼含有ADD域之LTRP之mRNA可誘導各種人類細胞株中內源性目標基因座的長期抑制。 材料及方法 mRNA 之產生：
編碼以下分子之mRNA遵循如實例2中所描述之類似方法由IVT產生：1)催化活性CasX 676、2) dXR1 (如實例2中所描述)及3) LTRP5-ADD-ZIM3 (如實例4中所描述)。編碼此等分子之序列除使用公開可用之密碼子最佳化工具及按需要調節諸如GC含量之參數外，亦使用密碼子利用率表進行密碼子最佳化。編碼催化活性之CasX 676之DNA及mRNA序列分別展示於表21及表22中。編碼dXR1之DNA及mRNA序列分別展示於表11及表12中。編碼LTRP5-ADD-ZIM3之DNA及mRNA序列分別展示於表18及表19中。 表 21 ： 在此實例中評估之催化活性 CasX 676 mRNA 分子之編碼序列。 *
CasX mRNA ID 組分(ID) 描述 DNA 序列或SEQ ID NO:
CasX 676 mRNA 5'UTR TriLink 3047
起始密碼子+ c-MYC NLS 3133
CasX 676 3134
c-MYC NLS +終止密碼子 3135
3'UTR 小鼠 HBA 3055
XbaI限制部位(部分) TCTAG
聚(A)尾 3057
*組分以5'至3'次序列於構築體內 表 22 ： 在此實例中評估之催化活性 CasX 676 mRNA 分子之全長 RNA 序列。修飾『 mψ 』 = N1- 甲基 - 假尿苷 。
CasX mRNA SEQ ID NO RNA 序列
CasX 676 mRNA 3136 AAAmψAAGAGAGAAAAGAAGAGmψAAGAAGAAAmψAmψAAGAGCCACCAmψGGCCCCmψGCmψGCCAAGAGAGmψGAAGCmψGGAmψAGCAGACAGGAGAmψCAAGCGGAmψmψAAmψAAAAmψmψCGGAGAAGACmψGGmψGAAGGAmψmψCmψAACACAAAGAAGGCmψGGCAAGACACGGGGCCCmψAmψGAAGACACmψGCmψGGmψGAGAGmψGAmψGACACCCGACCmψGAGAGAAAGACmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAGAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAACACAAGCCGGGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGACmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCCAmψCCmψGCACGmψGmψAmψmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAAGACCCAGmψCGGCCmψGAmψGAGCAGAGmψGGCmψCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAGCCCGAAAmψGGACGAGAAGGGGAACCmψGACAACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGmψAGCCAGmψGCGGCCAGCCCCmψGmψmψmψGmψGmψACAAACmψGGAACAGGmψGAGCGAAAAGGGCAAGGCmψmψACACGAAmψmψACmψmψCGGCAGAmψGCAACGmψGGCCGAGCACGAGAAGCmψGAmψCAAGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCmψGAGAAGGAmψAGCGAmψGAGGCAGmψGACAmψAmψmψCCCmψGGGCAAGmψmψCGGACAGCGGGCCCmψGGAmψmψmψmψmψAmψmψCCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAAmψCCACCCACCCCGmψCAAGCCmψCmψmψGCCCAAAmψmψGCCGGCAACAGAmψACGCCmψCCAGCCCCGmψGGGCAAGGCCCmψGAGCGACGCCmψGmψAmψGGGCACCAmψCGCCAGCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψmψAmψCAmψCGAGCACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGCGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAGmψAmψCCmψAGCGmψGACCCmψGCCmψCCmψCAGCCmψCAmψACAAAGGAGGGCGmψGGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGGAmψGmψGGGmψGAACCmψGAAmψCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψGmψCmψAGAGACGACGCCAAGCCCCmψGCmψGAGACmψGAAGGGCmψmψCCCCAGCmψmψCCCmψCmψGGmψGGAGAGACAGGCAAAmψGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAAmψGAGAAGAAGGAGGACGGCAAAGmψGmψmψCmψGGCAGAAmψCmψGGCCGGCmψACAAGCGmψCAGGAGGCCCmψGCGGCCCmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGACAGAAAGAAGGGCAAGAAGmψmψCGCCCGGmψAmψCAGCmψGGGGGACCmψGCmψGCmψGCACCmψCGAGAAGAAGCACGGCGAAGACmψGGGGGAAGGmψGmψACGAmψGAGGCCmψGGGAGCGGAmψCGAmψAAGAAGGmψGGAGGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAGGAGGAACGGAGAmψCmψGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGAGAGCCAAGGCCAGCmψmψCGmψCAmψCGAGGGGCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCCGGmψGCGAACmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGAGAmψCmψGAGAGGCAAACCmψmψmψCGCCAmψCGAGGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGCGCCmψmψmψAmψmψmψGGCAGAAGGACGGAGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψAmψmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGAGAmψmψCAAGAAGAmψCAAGCCmψGAAGCCmψmψCGAGGCCAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψmψAACAAGAAAAGCGGAGAGAmψCGmψGCCAAmψGGAAGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCmψAACCmψGAmψCAmψCCmψGCCCCmψGGCAmψmψmψGGCAAGCGGCAGGGCAGAGAGmψmψCAmψCmψGGAACGACCmψGCmψGmψCmψCmψGGAGACCGGCAGCCmψGAAGCmψGGCCAACGGCAGAGmψGAmψCGAGAAGACACmψGmψACAACAGACGAACCAGACAAGACGAGCCCGCCCmψGmψmψmψGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGAGAAGAGAGGmψGCmψGGACAGCAGCAAmψAmψCAAGCCmψAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGACCGGGGCGAGAACAmψCCCmψGCCGmψGAmψCGCCCmψmψACCGACCCCGAGGGAmψGCCCmψCmψGAGCCGGmψmψmψAAAGACAGCCmψGGGCAACCCmψACCCACAmψCCmψGAGAAmψmψGGCGAGmψCCmψACAAGGAGAAGCAGAGAACCAmψCCAGGCCAAGAAGGAGGmψGGAGCAGCGGCGGGCmψGGCGGCmψACmψCCCGGAAGmψACGCCAGCAAGGCCAAGAACCmψGGCCGACGACAmψGGmψmψAGAAAmψACCGCCAGAGACCmψCCmψGmψACmψACGCmψGmψGACCCAGGACGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGAGAACCmψGAGCAGAGGCmψmψCGGCAGACAGGGCAAGAGAACCmψmψCAmψGGCCGAGAGACAGmψACACCCGGAmψGGAGGACmψGGCmψGACCGCCAAGCmψGGCCmψACGAGGGCCmψGCCCmψCmψAAGACCmψACCmψGmψCCAAGACCmψmψGGCACAGmψACACCAGCAAGACAmψGCmψCmψAACmψGCGGCmψmψCACAAmψCACGAGCGCCGACmψACGACCGGGmψGCmψGGAGAAACmψGAAGAAGACCGCCACAGGCmψGGAmψGACCACCAmψmψAACGGCAAGGAGCmψGAAGGmψGGAGGGCCAGAmψCACCmψACmψACAACAGGmψACAAACGGCAGAACGmψGGmψGAAGGACCmψGAGCGmψGGAACmψGGAmψAGACmψGAGCGAGGAAAGCGmψAAACAAmψGACAmψCAGCAGCmψGGACCAAGGGCCGGAGCGGCGAGGCCCmψGAGCCmψGCmψGAAGAAGAGAmψmψCmψCCCACAGACCAGmψGCAGGAGAAGmψmψCGmψGmψGmψCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACCCACGCCGACGAGCAAGCCGCCCmψGAACAmψCGCCCGGmψCmψmψGGCmψmψmψmψCCmψGCGGAGCCAGGAGmψACAAGAAGmψACCAGACAAACAAGACCACAGGCAACACAGACAAGAGAGCCmψmψCGmψCGAGACCmψGGCAGAGCmψmψCmψACAGAAAGAAGCmψGAAGGAGGmψGmψGGAAGCCmψGCCGmψGGGAAGCCCCGCmψGCCAAGAGAGmψGAAGCmψGGACmψAAmψAGAmψAAGCmψGCCmψmψCmψGCGGGGCmψmψGCCmψmψCmψGGCCAmψGCCCmψmψCmψmψCmψCmψCCCmψmψGCACCmψGmψACCmψCmψmψGGmψCmψmψmψGAAmψAAAGCCmψGAGmψAGGAAGmψCmψAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
gRNA 之合成：
靶向人類 PCSK9基因座之gRNA使用gRNA骨架316設計，且以化學方式合成。此外，靶向 B2M之gRNA用作實驗對照。在此實例中評估之靶向間隔子序列如表23中所列出。 表 23 ： 在此實例中評估之間隔子的序列。
間隔子 ID 目標 靶向間隔子序列 (RNA) SEQ ID NO
7.37 人類 B2M GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG 3137
6.1 人類 PCSK9 GAGGAGGACGGCCUGGCCGA 1834
6.125 人類 PCSK9 AGAAAGAGCAAGCCUCAUGU 1845
6.138 人類 PCSK9 AGGGAUUUAUACUACAAAGA 1852
6.153 人類 PCSK9 GUUAAUGUUUAAUCAGAUAG 1866
6.157 人類 PCSK9 GGGUCUGAGCCUGGAGGAGU 1869
6.172 人類 PCSK9 GCUGAAACAGAUGGAAUACU 1879
6.181 人類 PCSK9 UCAUCUGCACUCGUGGCCAC 2228
將 mRNA 及 gRNA 轉染至 HepG2 細胞、 Hep3B 細胞及 Huh7 細胞中 ， 且進行 ELISA 以評估 PCSK9 分泌 ：
在此實驗中使用以下三種人類肝細胞癌細胞株：HepG2細胞、Hep3B細胞及Huh7細胞。每孔接種各細胞株之約15,000個細胞；次日，用編碼催化活性CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA及具有骨架316及靶向 B2M或 PCSK9基因座之間隔子的gRNA轉染所接種細胞(特定間隔子及序列參見表23)。轉染後4天收集培養基上清液以藉由ELISA評估PCSK9分泌之水平，且將PCSK9分泌之水平相對於總細胞計數標準化且示於圖11A至圖11C。繼續培養經處理之Huh7細胞，且轉染後14及27天收集培養基上清液用於藉由ELISA量測PCSK9分泌。作為額外實驗對照，亦在自含有未經處理之原始細胞之孔收集之培養基上清液中量測PCSK9分泌。 結果：
用編碼催化活性CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA及靶向 B2M或 PCSK9基因座之gRNA轉染HepG2細胞、Hep3B細胞及Huh7細胞，且量測PCSK9水平。在轉染後4天，各條件之標準化PCSK9分泌水平之定量描繪於圖11A至圖11C中。資料表明在Huh7細胞中觀測到由CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3引起之PCSK9分泌之最高效的基因減量，而HepG2細胞對所分泌PCSK9水平未展現出有效的基因減量(圖11A至圖11C)。同時，Hep3B細胞總體上展現低PCSK9分泌水平，說明在所用細胞株中，Hep3B細胞株最不適於誘導及展現PCSK9抑制(圖11A至圖11C)。
在轉染後持續培養經處理之Huh7細胞直至第27天，且在第14天及第27天量測PCSK9分泌。圖12中之條形圖展示在第4天、第14天及第27天時間點PCSK9抑制之定量結果，該等結果呈現為相對於在第4天時間點偵測到的未經處理之對照的水平的PCSK9基因減量。資料表明用LTRP5-ADD-ZIM3與具有間隔子6.138及6.157之gRNA處理Huh7細胞產生PCSK9分泌之最有效抑制，且此抑制持續至轉染後第27天(圖12)。類似地，在用催化活性CasX 676與間隔子6.1之處理Huh7細胞時觀測到持續基因減量。雖然用dXR1及間隔子6.138處理在第4天產生初始強力抑制，但此抑制效應為短暫的，因為PCSK9分泌水平在轉染後第14天及第27天返回至基線水平(圖12)。如所預期，在此時程實驗期間，用三個mRNA分子中之任一者與靶向 B2M基因座之間隔子7.37處理並不影響PCSK9分泌水平。
此等實驗證明使用具有ADD域之LTRP分子與適當的靶向間隔子可引起各種人類細胞株中內源性目標基因座之長期沉默。此等結果亦表明具有ADD域之LTRP分子可作為mRNA與靶向gRNA共同遞送至細胞以誘導抑制。 實例 6 ： 證明使用某些靶向 PCSK9 之間隔子可導致不合需要之細胞內 PCSK9 滯留
無法正常摺疊之分泌蛋白因此滯留在內質網(ER)中以最終靶向蛋白酶體降解。然而，ER中之過度蛋白質積聚可引起ER應激。PCSK9最初以酶原(稱為原PCSK9)形式合成，該等酶原在ER成熟期間經歷自催化裂解成為非活性分泌蛋白(亦稱為成熟或經處理之PCSK9)。此外，某些導致高膽固醇血症之PCSK9基因的功能獲得型突變與細胞內PCSK9滯留在ER中有關(Benjannet S等人, NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. J. Biol. Chem. 279:48865-48875 (2004)；Park SW等人, Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. J. Biol. Chem. 279:50630-50638 (2004)；Uribe KB等人, A Systematic Approach to Assess the Activity and Classification of PCSK9 Variants. Int. J. Mol. Sci. 22:13602 (2021))，其表明靶向 PCSK9基因座之某些區域可能會導致非所需的細胞內滯留。因此，進行實驗以證明使用某些靶向 PCSK9之間隔子可導致細胞內PCSK9水平發生不合需要的增加，從而可能引起意想不到的後果，諸如異常ER應激。 材料及方法：
如以下實例7所描述進行CasX 676 mRNA #2 (序列列於以下表28)之活體外轉錄。合成使用骨架316及靶向 PCSK9之間隔子的引導RNA，其具有v1修飾概況(如實例7中所論述)。評估間隔子6.1、6.8、6.86、6.114、6.197及6.203 (序列列於表24中)之細胞內PCSK9滯留。 表 24 ：靶向人類 PCSK9 之間隔子的序列
間隔子 ID 間隔子 DNA 序列 SEQ ID NO: 間隔子 RNA 序列 SEQ ID NO:
6.1 GAGGAGGACGGCCTGGCCGA 2977 GAGGAGGACGGCCUGGCCGA 1834
6.8 TGGCTTCCTGGTGAAGATGA 3139 UGGCUUCCUGGUGAAGAUGA 2009
6.86 TGGTGAAGATGAGTGGCGAC 3464 UGGUGAAGAUGAGUGGCGAC 3466
6.114 TCCCAGGCCTGGAGTTTATT 3141 UCCCAGGCCUGGAGUUUAUU 2291
6.197 AGGTCATCACAGTTGGGGCC 3465 AGGUCAUCACAGUUGGGGCC 3467
6.203 CCAGGAGTGGGAAGCGGCGG 3144 CCAGGAGUGGGAAGCGGCGG 2341
經由轉染活體外遞送 CasX mRNA 及 gRNA ：
為確定使用某些靶向 PCSK9之間隔子是否將產生潛在的細胞內PCSK9保留，在96孔培養盤中每孔接種約50,000個HepG2細胞。使用脂染胺將CasX 676 mRNA #2與靶向PCSK9之gRNA一起轉染至HepG2細胞中。在更換培養基後，轉染後兩天收集以下：1)培養基上清液，以藉由ELISA量測所分泌的PCSK9蛋白質水平；及2)經轉染的細胞，以進行西方墨點法分析評估細胞內PCSK9水平。對所收集之細胞進行全細胞溶解物提取以用於西方墨點法分析。簡言之，藉由SDS-PAGE解析所提取之蛋白質樣品，接著藉由免疫墨點法分析原PCSK9及經處理之PCSK9之水平，其藉由密度測定法定量。按照製造商說明書使用BioLegend® ELISA MAX TM套組分析培養基上清液中分泌的PCSK9水平。未經處理之細胞及僅經CasX 676 mRNA #2轉染之細胞充當兩個實驗對照。 結果：
用CasX 676 mRNA #2及靶向 PCSK9之gRNA轉染HepG2細胞後，藉由ELISA對培養基上清液中分泌的PCSK9水平進行定量，且結果如圖13所示。資料表明，用CasX 676 mRNA及靶向 PCSK9之gRNA轉染HepG2細胞引起不同程度之分泌PCSK9水平降低。在所測試之間隔子中，與僅經CasX 676 mRNA轉染之細胞相比，使用間隔子6.1、6.8、6.86及6.203引起分泌水平降低近乎50% (圖13)。
亦在經轉染之HepG2細胞中評估PCSK9之細胞內水平。圖14係經轉染之HepG2細胞中PCSK9蛋白水平以及總蛋白內參考物的西方墨點分析，圖15係條形圖，示出原PCSK9、經處理PCSK9以及總PCSK9蛋白質水平(其相對於來自未經處理條件之總PCSK9水平標準化)的密度測定法定量。資料展示在所評估之靶向PCSK9之間隔子中，僅使用間隔子6.1不會引起原PCSK9水平的顯著增加，因此表明使用間隔子6.1不會增加細胞內蛋白質水平(圖14至圖15)。雖然間隔子6.203之使用亦不會明顯地增加細胞內蛋白質水平，但其使用引起經處理之PCSK9水平增加(圖14至圖15)，似乎與未經處理對照或僅有CasX mRNA的對照相比，與其減少分泌PCSK9水平的效果(圖13)相矛盾。使用間隔子6.203觀測到的此明顯矛盾的效果表明，經處理之PCSK9的滯留可涉及使用間隔子6.203減少PCSK9分泌的機制。
結果證明，儘管使用某些靶向 PCSK9之間隔子將導致分泌PCSK9水平降低，但此等似乎有效之間隔子中之一些展現出可能不合需要之特徵(諸如增加之細胞內蛋白質滯留)的可能性。因此，來自此等實驗之結果表明，使用評估細胞內蛋白質滯留增加作為潛在的安全準則，以識別用於治療用途之有效靶向間隔子。 實例 7 ： 經修飾之 gRNA 在活體外及活體內與 CasX mRNA 一起遞送時改良編輯之設計及評估
進行實驗以鑑別新gRNA變異體序列，且證明此等gRNA變異體之化學修飾增強CasX:gRNA系統在活體外與CasX mRNA一起遞送時之編輯效率。 材料及方法： gRNA 之合成：
此實例中測試之所有gRNA為經化學合成的且來源於gRNA骨架174、235及316。gRNA骨架174、235及316之序列及其化學修飾概況列於表25中。所得gRNA之序列(包括靶向 PCSK9、 B2M或 ROSA26之間隔子)及其在此實例中所分析之化學修飾概況列於表26中。gRNA骨架變異體174、235及316之結構的示意圖分別示於圖19A至圖19C中，以及gRNA變異體之化學修飾部位示意性地示於圖16A、圖16B、圖18、圖24及圖25中。 表 25. 具有不同化學修飾概況 ( 用型式編號表示 ) 之 gRNA 骨架序列 ， 其中「 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 」係間隔占位符。 化學修飾： * = 硫代磷酸酯鍵； m = 2 ' OMe 修飾
gRNA 骨架 ( 型式 ) gRNA 序列 SEQ ID NO:
174 (v0) ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 2947
174 (v1) mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN 2948
174 (v2) mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN*mU*mU*mU 2949
174 (v3) mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmUmUmAmUmCmUmGmAmUUACUUUGmAmGmAmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUmCmAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN 2950
174 (v4) mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUUUmAmUmCmUmGmAmUUACUUUGmAmGmAmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN 2951
174 (v5) mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN 2952
174 (v6) mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN 2953
174 (v7) mA*mC*mU*GGmCGmCmUUUUAmUmCUGAUUACUUUGmAmGAGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2954
174 (v8) mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2955
174 (v9) mA*mC*mU*GGmCmGCmUUUUAmUmCUGAUUACUUUGmAmGAGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2956
235 (v0) ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 2957
235 (v1) mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN 2958
235 (v2) mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN*mU*mU*mU 2959
235 (v3) mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUmCmAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN 2960
235 (v4) mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN 2961
235 (v5) mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN 2962
235 (v6) mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN 2963
235 (v7) mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2964
235 (v8) mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2965
235 (v9) mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2966
316 (v0) ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 2967
316 (v1) mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2968
316 (v2) mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN*mU*mU*mU 2969
316 (v3) mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUmCmAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2970
316 (v4) mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2971
316 (v5) mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2972
316 (v6) mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2973
316 (v7) mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2974
316 (v8) mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2975
316 (v9) mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN 2976
表 26 ： 在此實例中分析之具有不同化學修飾概況 ( 由型式編號表示 ) 之 gRNA 的序列。 化學修飾： * = 硫代磷酸酯鍵； m = 2 ' Ome 修飾
gRNA ID(骨架變異體-間隔子) 目標 gRNA 序列 SEQ ID NO:
174-6.7 (v0) 人類 PCSK9 ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGA 3145
174-6.7 (v1) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA 3074
174-6.8 (v0) 人類 PCSK9 ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA 3146
174-6.8 (v1) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA 3147
174-7.9 (v0) 人類 B2M ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGUGUAGUACAAGAGAUAGAA 3148
174-7.9 (v1) 人類 B2M mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGUGUAGUACAAGAGAUAmG*mA*mA 3149
316-6.7 (v0) 人類 PCSK9 ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGA 3150
316-6.7 (v1') 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA 3151
316-6.8 (v0) 人類 PCSK9 ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA 3152
316-6.8 (v1') 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA 3153
316-7.9 (v0) 人類 B2M ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGGUGUAGUACAAGAGAUAGAA 3154
316-7.9 (v1') 人類 B2M mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGGUGUAGUACAAGAGAUAmG*mA*mA 3155
174-7.37 (v0) 人類 B2M ACUGGCGCUUUUAUCUgAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAgUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGGCCGAGAUGUCUCGCUC 3156
174-7.37 (v1*) 人類 B2M mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUgAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAgUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGGCCGAGAUGUCUCG*mC*mU*mC 3157
235-6.7 (v0) 人類 PCSK9 ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGA 3158
235-6.7 (v1) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA 3159
235-6.7 (v2) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGAU*mU*mU*mU 3160
235-6.7 (v3) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUmCmAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA 3161
235-6.7 (v4) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA 3162
235-6.7 (v5) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA 3163
235-6.7 (v6) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA 3164
235-6.8 (v0) 人類 PCSK9 ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA 3165
235-6.8 (v1) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA 3166
235-6.8 (v2) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA*mU*mU*mU 3167
235-6.8 (v3) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUmCmAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA 3168
235-6.8 (v4) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA 3169
235-6.8 (v5) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA 3170
235-6.8 (v6) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA 3171
316-27.107 (v0) 小鼠 PCSK9 ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAGAUG 3172
316-27.107 (v1) 小鼠 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAG*mA*mU*mG 3173
316-27.107 (v7)    小鼠 PCSK9 mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAG*mA*mU*mG 3174
316-27.107 (v8) 小鼠 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAG*mA*mU*mG 3175
316-27.107 (v9*) 小鼠 PCSK9 mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAA*mG*mA*mU*mG 3176
174-35.2 (v0) ROSA26 ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGAGAAGAUGGGCGGGAGUCUU 3177
174-35.2 (v2) ROSA26 mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGAGAAGAUGGGCGGGAGUCUU*mU*mU*mU 3178
316-35.2 (v0) ROSA26 ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGAGAAGAUGGGCGGGAGUCUU 3179
316-35.2 (v1) ROSA26 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGAGAAGAUGGGCGGGAGU*mC*mU*mU 3180
316-35.2 (v5) ROSA26 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGAGAAGAUGGGCGGGAGU*mC*mU*mU 3181
注意，註釋有v1'設計之gRNA在gRNA之3'端上少含一個硫代磷酸酯鍵。註釋有v1*之gRNA在gRNA之3'端上多含一個硫代磷酸酯鍵。註釋有v9*之gRNA在gRNA之3'端上含有額外的硫代磷酸酯鍵。 gRNA 活性之生物化學表徵：
在5'端上具有螢光部分之目標DNA寡核苷酸為市售購買的(序列列於表27中)。將寡核苷酸以1:1比率混合在1×裂解緩衝液(20 mM Tris HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM TCEP，5%甘油，10 mM MgCl 2)中，隨後加熱至95℃持續10分鐘，且隨後使溶液冷卻至室溫來形成雙股DNA (dsDNA)目標。CasX核糖核蛋白(RNP)用CasX 491及指定gRNA以1 µM之最終濃度復原，其中1×裂解緩衝液中有1.2倍過量之指定gRNA。使RNP在37℃下形成10分鐘。
測定gRNA骨架之各種結構及化學修飾對CasX 491 RNP之裂解速率的影響。用200 nM之最終RNP濃度及10 nM之最終目標濃度製備裂解反應，且在16℃下進行反應且藉由添加經標記目標DNA受質來起始反應(表27)。在0.25、0.5、1、2、5及10分鐘獲取反應的等分試樣且藉由添加相等體積之95%甲醯胺及20 mM EDTA來淬滅。樣品在95℃下變性10分鐘且在10%脲-PAGE凝膠上解析。將凝膠成像在Typhoon TM雷射-掃描儀平台上且使用ImageQuant TMTL 8.2影像分析軟體(Cytiva TM)定量。針對各CasX:gRNA組合測定非目標股裂解(k 裂解)之表觀一級速率常數。
為確定由各gRNA形成之勝任部分，製備具有100 nM之最終RNP濃度及100 nM之最終目標濃度的裂解反應。在37℃下進行反應且藉由添加經標記之目標受質來起始(表27)。在0.5、1、2、5、10及30分鐘獲取等分試樣且藉由添加相等體積之95%甲醯胺及25 mM EDTA來淬滅。樣品藉由在95℃下加熱10分鐘來變性且在10%脲-PAGE凝膠上解析。如上對凝膠進行成像及定量。假設CasX在分析條件下充當單次周轉酶，如由以下觀測結果指示：亞化學計算量之酶即使在擴展時間標度下亦無法裂解大於化學計算量之目標受質，反而接近與存在的酶量成比例的平穩段。因此，在長時間標度上藉由等莫耳量之RNP裂解的目標受質之部分將指示恰當地形成且對裂解具有活性的RNP的部分。用兩相速率模型擬合=裂解跡線，因為裂解反應在此濃度方案下明顯偏離單相。確定各擬合之平穩段且報導為表30中之各RNP之活性部分。 表 27 ： 用於 gRNA 活性之生物化學表徵的在 5' 端上具有螢光部分之目標 DNA 受質寡核苷酸的序列。 /700/ = IRDye700 ； /800/ = IRDye800
DNA 受質 序列
6.7/6.8目標頂股 (SEQ ID NO: 3182) /700/catgtcttccatggccttcttcctggcttcctggtgaagatgagtggcgacctgctggag
6.7/6.8目標底股 (SEQ ID NO: 3183) /800/ctccagcaggtcgccactcatcttcaccaggaagccaggaagaaggccatggaagacatg
CasX mRNA 之活體外轉錄：
藉由PCR使用含有T7啟動子之正向引子，接著用瓊脂糖凝膠提取適當大小的DNA來產生用於活體外轉錄之編碼CasX 491 (關於編碼序列參見表28)的DNA模板。在各活體外轉錄反應中使用最終濃度為25 ng/µL之模板DNA，該轉錄反應按照製造商建議之方案略加修改後進行。在37℃下進行2至3小時之活體外轉錄反應培育(用CleanCap® AG及N1-甲基-假尿苷進行)之後，對模板DNA進行DNA酶消化且使用Zymo RNA miniprep套組進行基於管柱之純化。按照製造商的方案使用大腸桿菌聚A聚合酶添加聚(A)尾，隨後如上所陳述進行基於管柱之純化。將活體外聚(A)尾轉錄之RNA在無RNA酶水中溶離，在Agilent TapeStation上分析完整性，且在儲存之前在-80℃下快速冷凍。 表 28 ： 此實例中評估之 CasX mRNA 分子之編碼序列 * 。
CasX 491 mRNA ID 組分(ID) DNA 序列或SEQ ID NO:
CasX 491 mRNA #1 5'UTR 3082
起始密碼子+ c-MYC NLS +連接子 3184
CasX 491 3185
連接子+ c-MYC NLS 3186
P2A mScarlet +終止密碼子 3187
CasX 676 mRNA #2 5'UTR 3047
起始密碼子+ c-MYC NLS 3133
CasX 676 3134
c-MYC NLS +終止密碼子 3135
3'UTR 3055
XbaI限制部位(部分) TCTAG
聚(A)尾 3057
*組分以5'至3'次序列於構築體內 經由轉染活體外遞送 gRNA 及 CasX mRNA ：
與使用具有骨架變異體316之靶向 PCSK9的gRNA之條件相比，使用與具有骨架變異體174之靶向 PCSK9的gRNA共同遞送CasX 491 mRNA的條件來評估 PCSK9基因座之編輯以及對分泌PCSK9水平的隨後影響。使用脂染胺將100 ng編碼具有P2A及mScarlet螢光蛋白之CasX 491的活體外轉錄mRNA與gRNA 174-6.7、174-6.8、316-6.7及316-6.8之型式1 (v1)轉染至HepG2細胞中(參見表26)。在更換培養基後，在轉染後28小時收集以下：1)收集經轉染細胞用於藉由NGS (下一代定序)評估在 PCSK9基因座的編輯；及2)收集培養基上清液以藉由ELISA量測所分泌的PCSK9蛋白質水平。對於藉由NGS進行編輯分析，用一組靶向 PCSK9基因座之引子自所提取的200 ng gDNA中擴增出擴增子，且藉由NGS進行處理(如以下描述)。亦按照製造商說明書，使用來自CISBio的基於螢光共振能量轉移的免疫分析來分析培養基上清液中所分泌之PCSK9水平。此處，使用具有間隔子7.37 (v0；參見表26)之骨架174之gRNA (其靶向內源性 B2M(β-2-微球蛋白)基因座)充當非靶向(NT)對照。此等結果展示於圖20中。
為比較型式0 (v0)及型式1 (v1)之靶向 B2M的gRNA之編輯效能，96孔盤的每孔中接種約6E4個HepG2肝細胞。24小時後，使用脂染胺與100 ng編碼CasX 491之活體外轉錄mRNA及不同劑量(1、5或50 ng)之含有骨架變異體174及間隔子7.37之靶向 B2M的gRNA之v0或v1型共轉染接種細胞(參見表26)。轉染後六天，經由對B2M依賴性HLA蛋白質進行免疫染色收集細胞以用於B2M蛋白質表現分析，接著使用Attune TMNxT流式細胞儀來進行流式細胞測量術。此等結果展示於圖17中。
評估經化學修飾之靶向 PCSK9的gRNA的V1至v6變異體(表26)對編輯效能的影響及對活體外分泌PCSK9水平之後續影響。簡言之，使用脂染胺將100 ng編碼CasX變異體491及P2A以及mScarlet螢光蛋白之活體外轉錄mRNA與50 ng之指定經化學修飾之gRNA轉染至HepG2細胞中。在更換培養基後，在轉染後28小時收集以下：1)如上文所描述收集經轉染細胞用於藉由NGS評估在 PCSK9基因座的編輯；及2)如上文所描述收集培養基上清液以藉由ELISA量測所分泌的PCSK9蛋白質水平。此處，靶向 B2M之gRNA用作非靶向對照。此等結果展示於表31中。 NGS 處理及分析：
遵循製造商說明書使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus套組提取來自所收集細胞之基因體DNA (gDNA)。目標擴增子係藉由用一組靶向人類 PCSK9基因座之引子擴增來自約50-200 ng所提取之gDNA的感興趣區域而形成。此等基因特異性引子在5'端含有額外序列以引入Illumina讀段1及2序列。此外，其含有充當獨特分子識別符(UMI)之16-核苷酸隨機序列。使用Fragment Analyzer DNA分析儀套組(Agilent，dsDNA 35-1500 bp)評估擴增子之品質及定量。根據製造商之說明書在Illumina MiSeq™上定序擴增子。原始fastq定序檔案藉由修整品質及銜接子序列且將讀段1及讀段2合併為單個插入序列來處理；接著藉由CRISPResso2 (v 2.0.29)程式分析插入序列。確定在間隔子之3'端周圍的窗中經修飾之讀段百分比。對於各種，CasX分子之活性定量為在此窗內任何地方含有插入、取代及/或缺失之讀段的總百分比。 脂質奈米顆粒 (LNP) 之調配
按照製造商的指導，使用GenVoy-ILM TM脂質在Precision NanoSystems公司(PNI)的Ignite TMBenchtop系統上將CasX mRNA及gRNA囊封至LNP中。GenVoy-ILM TM脂質由PNI以50:10:37.5:2.5 mol%的可離子化脂質:DSPC:膽固醇:穩定劑的專用組合物進行製造。
簡言之，為調配LNP，將相等質量比之CasX mRNA及gRNA稀釋於PNI調配緩衝液(pH 4.0)中。GenVoy-ILM TM在無水乙醇中1:1稀釋。使用預定N/P比進行mRNA/gRNA共同調配。將RNA及脂質在PNI Ignite™ Benchtop系統上以預定流動速率比(RNA:Genvoy-ILM TM)穿過PNI層流濾筒。調配後，將LNP稀釋於PBS (pH 7.4)中，以降低乙醇濃度且提高pH，由此提高顆粒之穩定性。將藉由在4℃下使用10k Slide-A-Lyzer™滲析卡匣(Thermo Scientific™)隔夜滲析至PBS (pH 7.4)中來實現mRNA/sgRNA-LNP之緩衝更換。滲析之後，將mRNA/gRNA-LNP使用100 kDa Amicon®-Ultra離心過濾器(Millipore)濃縮至＞ 0.5 mg/mL，隨後過濾滅菌。於Stunner (Unchained Labs)上分析所調配LNP以測定其直徑及多分散性指數(PDI)。將使用英傑公司(Invitrogen)之Quant-iT™ RiboGreen™ RNA分析套組藉由RiboGreen™分析測定囊封效率及RNA濃度。在各個實驗中使用LNP將CasX mRNA及gRNA遞送至目標細胞及組織。 活體外遞送囊封 CasX mRNA 及靶向 gRNA 之 LNP ：
於96孔盤中每孔接種約50,000個HepG2細胞(其在含有10% FBS及1%青黴素鏈黴素之DMEM/F-12培養基中培養)。次日，用不同濃度之LNP處理所接種之細胞，LNP以250 ng起始，按六個2倍連續稀釋製備。調配此等LNP以封裝CasX 491 mRNA及併入骨架變異體174或316與間隔子7.9之靶向 B2M的gRNA (v1；參見表26)。在LNP處理之後24小時更換培養基，且在收集gDNA提取物之前額外培養細胞六天，用於藉由NGS及B2M蛋白質表現分析經由HLA免疫染色來評估 B2M基因座處之編輯，隨後使用Attune NxT流式細胞儀進行流式細胞測量術。簡言之，對於編輯評估，用靶向人類 B2M基因座之引子自所提取的200 ng gDNA中擴增出擴增子，且如實例7中所描述，使用類似方法藉由NGS進行處理。此等分析之結果示於圖21A及圖21B。
在96孔盤中每孔接種約20,000個小鼠Hepa1-6細胞。第二天，用不同濃度之LNP處理所接種之細胞，LNP以1000 ng起始，按八個2倍連續稀釋製備。調配此等LNP以封裝CasX 676 mRNA #2 (參見表28)及併入骨架變異體316與間隔子35.2之靶向 ROSA26的gRNA (v1或v5；參見表26)。在用LNP處理後24小時更換培養基，且細胞在收集用於gDNA提取之前額外培養七天，用於藉由NGS評估在 ROSA26基因座處之編輯。簡言之，用靶向小鼠 ROSA26基因座之引子自所提取的gDNA中擴增出擴增子，且如實例7中所描述，使用類似方法藉由NGS進行處理。此實驗之結果顯示於圖22A中。 活體內遞送囊封 CasX mRNA 及靶向 gRNA 之 LNP ：
為評估活體內使用v1及v5骨架316之影響，使用1:1的mRNA:gRNA質量比將CasX 676 mRNA #2 (參見表28)以及使用骨架316與間隔子35.2之靶向 ROSA26的gRNA (v1或v5；參見表26)囊封在統一LNP內。調配之LNP經緩衝更換至PBS以用於活體內注射。簡言之，將LNP以眶後竇方式靜脈內投與至4週齡C57BL/6小鼠中。在注射之後觀測小鼠五分鐘以確保其自麻醉恢復，隨後置放於飼養籠中。未經處理、未經注射之動物充當實驗對照。投與後六天，將小鼠安樂死，且按照製造商說明書使用Zymo Research Quick DNA/RNA Miniprep套組收集肝組織以用於gDNA提取。隨後用一組靶向小鼠 ROSA26基因座之引子自所提取的gDNA中擴增出目標擴增子，且如實例7中所描述使用類似方法進行處理以藉由NGS進行編輯評估。此實驗之結果顯示於圖22B中。
為了比較活體內使用v7、v8及v9之骨架316對 PCSK9基因座之編輯的影響，對於各gRNA，使用1:1的mRNA:gRNA質量比將CasX 676 mRNA #1 (關於序列參見表29)以及使用骨架316與間隔子27.107之靶向 PCSK9的gRNA (v1、v7、v8或v9；參見表26)囊封在統一LNP內。如以上所描述，將LNP以眼眶後方式投與至6週齡C57BL/6小鼠中，且注射後七天將小鼠安樂死以收集肝組織用於gDNA提取，以藉由NGS進行 PCSK9基因座處的編輯評估。此實驗之結果顯示於圖23中。 表 29 ： CasX 676 mRNA #1 分子之編碼序列
CasX ID 組分(ID) 描述 SEQ ID NO:
CasX 676 mRNA #1 5'UTR hHBA 3188
起始密碼子+ c-MYC NLS    3133
CasX 676    3134
c-MYC NLS +終止密碼子    3135
3'UTR hHBA 3189
聚(A)尾    3057
*組分以5'至3'次序列於構築體內 結果： 評估各種化學修飾對 gRNA 活性之影響 ：
涉及Cas9之若干研究已證明，對gRNA進行化學修飾可顯著提高與Cas9 mRNA遞送時的編輯活性。在將Cas9 mRNA及gRNA遞送至目標細胞中之後，未受保護之gRNA在mRNA轉譯過程期間易降解。添加化學修飾(諸如2'O-甲基(2'Ome)基團及硫代磷酸酯鍵)可降低gRNA對細胞核糖核酸酶之易感性，但亦有可能破壞gRNA摺疊及其與CRISPR-Cas蛋白質之相互作用。鑒於CasX與Cas9以及其各別gRNA之間缺乏結構類似性，必須重新設計及驗證適當化學修飾概況。使用來自δ變形菌綱之野生型CasX之公開結構(PDB編碼6NY1、6NY2及6NY3)作為參考物，選擇似乎可能適合於修飾之殘基。然而，公開之結構為野生型CasX直系同源物及gRNA的結構，與用作本文呈現之經工程改造之變異體之基礎的物種不同，且其亦缺乏解析度，無法確定蛋白質側鏈與RNA主鏈之間的相互作用。此等限制為確定哪些核苷酸可安全地進行修飾帶來大量的不確定性。因此，設計六個化學修飾之概況(表示為型式)以用於初始測試，且此等六個概況示於圖16A及圖16B中。v1概況經設計為簡單的末端保護結構，其中第一個及最後三個核苷酸經2'Ome及硫代磷酸酯鍵修飾。在v2概況中，添加3'UUU尾部以模擬用於細胞轉錄系統中之終止序列，且將經修飾之核苷酸移動至涉及目標識別之間隔子區之外部。v3概況包括如同v1中之末端保護，以及在基於結構分析鑑別為潛在可修飾的所有核苷酸上添加2'Ome修飾。v4概況係基於v3進行建模，但移除三螺旋體區域中之所有修飾，因為根據預測此結構對RNA螺旋結構及主鏈靈活性之任何擾動均更敏感。v5概況維持骨架莖及延伸莖區中之化學修飾，而v6概況僅具有延伸莖中之修飾。延伸莖係完全暴露於RNP中之溶劑的區域，且其能夠經其他髮夾結構置換且因此可能對化學修飾相對不敏感。
首先評估了經最小修飾之v1 gRNA與未修飾之gRNA (v0)，以確定當gRNA與CasX mRNA共同遞送至目標細胞時，此類化學修飾對編輯的潛在益處。將帶有間隔子7.37的經修飾(v1)和未經修飾(v0)之靶向 B2M的gRNA與CasX mRNA共轉染至HepG2細胞中，且藉由流式細胞測量術偵測B2M依賴性HLA複合物表面呈現的損失來量測 B2M基因座處的編輯(圖17)。資料證明，與在不同劑量之v0 gRNA所觀察到的水平相比，使用v1 gRNA導致的B2M表現損失要大得多，由此證實gRNA之末端修飾在遞送CasX mRNA及gRNA後增加CasX介導之編輯活性。
使用骨架變異體235及間隔子6.7及6.8靶向 PCSK9的gRNA評估較廣泛gRNA化學修飾概況集合，以確定額外化學修飾是否將能夠支持活性RNP之形成。進行上文所描述之活體外裂解分析以測定具有各種化學修飾概況之此等經工程改造之gRNA的k 裂解及勝任部分。來自此等活體外裂解分析之結果顯示於表30中。資料表明具有v3概況之gRNA不展現活性，表明添加一些化學修飾會顯著干擾RNP形成或活性。添加v4化學修飾引起過量RNP條件中之合理裂解速率，但展現極低的勝任部分。v3與v4修飾之間的差異證實，三螺旋體區之修飾阻止任何活性RNP形成，因為gRNA不能正常摺疊或gRNA-蛋白質相互作用受到破壞。由附加v4修飾產生之降低的勝任部分表明，雖然gRNA能夠與CasX蛋白成功組裝形成裂解勝任型RNP，但大部分gRNA摺疊錯誤，或附加的化學修飾降低了gRNA對CasX蛋白之親和力，阻礙了RNP的形成效率。應用v5或v6概況產生的勝任型部分與使用v1及v2修飾之反應獲得的勝任型部分相當，但略低於後者。當v5與v6 gRNA之間的k 裂解值相對一致時，v5與v6 gRNA之k 裂解值均幾乎為v1及v2 gRNA的一半。v6 gRNA之k 裂解值降低尤其出人意料，考慮到在經修飾之延伸莖中，gRNA與CasX蛋白之間缺乏預期的相互作用。然而，對於v5及v6 gRNA兩者，有可能係由2'Ome修飾產生之gRNA之靈活性降低，從而抑制有效裂解所需之RNP之結構變化，或係由於包括了2'Ome基團，使得涉及CasX蛋白相互作用之髮夾的經修飾初始鹼基對受到負面影響。 表 30 ： 使用骨架 235 及含有指定化學修飾概況 ( 由型式編號指示 ) 之各種靶向 PCSK9 的 gRNA 對 CasX RNP 所評估之裂解活性參數。
gRNA(骨架變異體-間隔子， 型式編號) k 裂解(min -1) 勝任部分
235-6.7, v1 0.901 0.398
235-6.8, v1 1.36 0.398
235-6.7, v2 0.454 0.386
235-6.8, v2 2.03 0.361
235-6.7, v3 0 0
235-6.8, v3 0 0
235-6.7, v4 0.434 0.031
235-6.8, v4 0.257 0.005
235-6.7, v5 0.506 0.313
235-6.8, v5 0.680 0.388
235-6.7, v6 0.462 0.346
235-6.8, v6 0.715 0.325
隨後在基於細胞之分析中評估基於骨架235之經化學修飾之靶向 PCSK9的gRNA的編輯。使用脂染胺將CasX mRNA及經化學修飾之靶向 PCSK9的gRNA共轉染至HepG2細胞中。藉由NGS偵測在 PCSK9基因座處的插入/缺失率及藉由ELISA偵測分泌之PCSK9水平來量測編輯水平，且資料顯示於表31中。資料表明，使用v3及v4 gRNA引起PCSK9基因座處之最低編輯活性，與來自表30中所示之生物化學活體外裂解分析之發現一致。同時，使用v5及v6 gRNA產生的編輯水平(藉由插入/缺失率及PCSK9分泌量測)，略微低於使用v1及v2 gRNA實現的水平(表31)。特定言之，結果顯示，使用具有末端修飾之v1及v2 gRNA在PCSK9基因座產生約80至85%編輯，表明向gRNA端添加化學修飾足以實現CasX之有效編輯。儘管資料表明使用v5及v6 gRNA產生活體外有效編輯，但在此實驗中使用v1 gRNA觀測到編輯接近飽和水平，其中轉染單次劑量之gRNA。因此，由於使用單次劑量，使得清楚地評估化學修飾對準則限制條件下之編輯的影響具有挑戰性。因此，選擇概況v1及v5用於進一步測試，因為v1含有最簡單的修飾概況，且v5為修飾最重之概況，其在活體外應用顯示出穩定活性(表30及表31)。 表 31 ： 在經 CasX 491 mRNA 及使用骨架 235 及間隔子 6.7 或 6.8 之各種經化學修飾靶向 PCSK9 的 gRNA 共轉染的 HepG2 細胞中 ， 藉由 NGS 偵測在 PCSK9 基因座處之插入 / 缺失率量測編輯水平及藉由 ELISA 量測分泌 PCSK9 水平。
實驗條件 插入/ 缺失率( 編輯分數) 分泌之PCSK9 (ng/mL)
平均值 標準偏差 平均值 標準偏差
僅CasX mRNA 0.0021 0.003 52 14
235-6.7, v1 0.83 0.0058 18 5.7
235-6.7, v2 0.79 0.0071 21 4
235-6.7, v3 0.024 0.02 48 19
235-6.7, v4 0.12 0.006 34 5.5
235-6.7, v5 0.73 0.023 21 9
235-6.7, v6 0.75 0.0069 22 8.8
235-6.8, v1 0.85 0.017 16 4.4
235-6.8, v2 0.83 0.0028 20 1.5
235-6.8, v3 0.023 0.0027 39 2.7
235-6.8, v4 0.088 0.0086 42 10
235-6.8, v5 0.77 0.017 19 1.6
235-6.8, v6 0.78 0.014 24 6.9
非靶向對照 0.0019 0.0026 42 12
在另一基於細胞之分析中進一步測試v1及v5概況以評估其對編輯效率之影響。調配LNP以封裝CasX 676 mRNA #2以及使用新設計之gRNA骨架316的經v1及v5化學修飾之靶向 ROSA26的gRNA (在下面小節中將進一步描述)。「v5」略經修飾以應用於316骨架。在接近延伸莖之5'的非鹼基配對之區域中移除三個2'Ome修飾以限制對兩個莖環區之修飾。用各種劑量的所得LNP處理Hepa1-6肝細胞且在處理後八天收集以評估 ROSA26基因座處之編輯，其量測為藉由NGS偵測之插入/缺失率(圖22A)。資料表明，與藉由對應體v1達成之水平相比，用遞送v5靶向 ROSA26之gRNA的LNP進行處理，在整個劑量範圍內均引起明顯較低的編輯水平(圖22A)。圖22A中使用v5 gRNA所觀測到的相對活性與表31中觀測到的不同，可能有若干種解釋。第一及最可能的解釋為表31中所示的用於實現編輯之單次劑量過高，無法量測使用v5 gRNA與v1 gRNA之間的活性差異。亦有可能為在v5之316型式中之莖環模體外移除了修飾，對引導活性產生不利地影響。儘管此等修飾有可能提供比由莖環修飾賦予之活動代價更重要的穩定性益處，但鑒於迄今為止修飾水平的增加導致活性的降低，其似乎不太可能。最後一種可能的解釋為v5概況中之修飾可經由經修飾之核苷酸主鏈與LNP之可離子化脂質之間的差異相互作用而對LNP調配物或行為產生不利地影響，從而潛在地導致內化後更低效的gRNA囊封或更低效的gRNA釋放。
進一步活體內測試共囊封CasX mRNA #2以及基於骨架316之經v1及v5化學修飾之靶向 ROSA26的gRNA的LNP。圖22B顯示以 ROSA26基因座處之插入/缺失率量測的編輯百分比形式的編輯分析結果。資料表明在活體內LNP遞送之更相關測試條件下，相比於使用v1 gRNA達成之編輯，使用v5 gRNA達成之編輯降低了約5倍。此等發現支持表30中對於v5 gRNA在生物化學上觀測到之裂解速率降低，表明v5修飾已干擾CasX活性之一些態樣。鑒於在v5及v6概況(表30)中偵測到活性之一致降低，編輯降低可歸因於經延伸莖區中之修飾。儘管gRNA之延伸莖與CasX蛋白具有最小相互作用，但在第一鹼基對處添加2'Ome基團有可能破壞CasX蛋白-gRNA相互作用，或破壞延伸莖與假結及三螺旋體區相接處的複雜RNA摺疊。更特定言之，包括2'Ome基團可能不利地影響gRNA延伸莖之基底鹼基對及CasX蛋白之殘基R49、K50及K51。最後，CasX之結構研究表明有效DNA裂解需要gRNA之靈活性(Liu J等人, CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature566:218-223 (2019)；Tsuchida CA等人, Chimeric CRISPR-CasX enzymes and guide RNAs for improved genome editing activity. Mol Cell82(6): 1199-1209 (2022))。因此，在整個延伸莖中添加2'Ome基團可能會加強更剛性的A-型式螺旋形結構，且阻止gRNA有效裂解所需的靈活性。此外，可能的係，v5及v6概況中之骨架莖中的額外修飾可能對活性不利，但由於v5與v6概況之間的比較有限，因此當前並不清楚。
額外修飾概況設計成目的為增強gRNA穩定性同時減輕對RNP裂解活性之不良作用。使用最近公開之浮黴菌門之野生型CasX結構(PDB編碼7WAY、7WAZ、7WB0、7WB1)，其與所評估之經工程改造之CasX變異體具有更高同源性，設計gRNA之額外化學修飾概況且示於圖18中。此等概況示出在新設計之gRNA骨架變異體中添加2'Ome基團及硫代磷酸酯鍵，其描述於隨後小節中。此等新gRNA化學修飾概況係基於在表31中觀測到之使用v5 gRNA足夠編輯活性的初始資料設計的，該資料表明對延伸莖及骨架莖區之修飾不會對活性產生不利影響。v7概況經設計以在整個gRNA結構中可能可修飾之殘基處包括2'Ome，但排除三螺旋體區，因為考慮到之前在v3概況中觀測到添加此類修飾會產生顯著的負面影響。亦設計更保守性概況v8及v9，如圖18中所示。對於v8構築體，移除假結及三螺旋體環區之修飾，但保留骨架莖、延伸莖及其側接單股區以及5'及3'端的修飾。對於v9概況，移除側接莖環之單股區域的修飾，但保留莖環本身以及假結、三螺旋體環以及5'及3'端的修飾。在 PCSK9基因座處對新設計之gRNA骨架變異體316之額外化學修飾概況v7、v8及v9 (下文將進一步討論)進行活體內評估。經定量為在 PCSK9基因座處以插入/缺失率(經NGS偵測到)量測之編輯百分比的活體內編輯分析之結果示於圖23中。儘管總體上偵測到之編輯效率較低，但資料表明，與使用v1 gRNA所實現的插入/缺失率相比，使用v7、v8及v9 gRNA在 PCSK9基因座上產生較低的編輯水平(圖23)。鑒於圖22A至圖22B中之發現，其顯示v5 gRNA所實現之編輯活性較低，v7、v8和v9概況同樣表現出較低的編輯活性亦不足為奇。如圖18中所示出，v7、v8及v9概況包括整個經延伸莖區之修飾，其可能干擾RNP活性。 使用活體外裂解分析比較 gRNA 骨架變異體 174 及 316 ：
先前工作已確定，在多種遞送條件下，gRNA骨架變異體235為表現最好的骨架變異體。然而，相對於包括骨架174 (當使用20 bp間隔子時，為109 bp)之gRNA，骨架235之長度較長(當使用20 bp間隔子時，為119 bp)，增加了固相RNA合成之困難，其將導致製造成本增加、純度及產率降低以及合成失敗率較高。為解決此等問題，但同時保留使用骨架變異體235之經改良活性，主要在骨架235序列之基礎上設計嵌合gRNA骨架，但將骨架235之延伸莖環置換為骨架變異體174的較短延長莖環(圖19A至圖19C)。所得嵌合骨架被命名為骨架316，其與骨架174、靶向 PCSK9的間隔子6.7及6.8以及靶向 B2M的間隔子7.9平行合成，具有v1化學修飾概況，在所有gRNA的前三個和後三個核苷酸上均有2'OMe及硫代磷酸酯鍵(參見表26)。之所以選擇骨架變異體174而非變異體235作為比較物，此係由於變異體174係先前表徵最佳的骨架，其長度與變異體316相同。
評估具有骨架174及316及間隔子6.7及6.8之gRNA的活體外裂解活性。裂解分析係在RNP過量20倍於匹配的dsDNA目標的情況下進行的。對於所有四種引導物定量裂解速率，且結果顯示於表32中。資料表明，在間隔子6.7之情形下，使用骨架174或316產生類似裂解速率，其中骨架316所達成之裂解略微快於骨架174所達成的裂解。在間隔子6.8之情形下，裂解活性差異更明顯：使用骨架316之CasX RNP對DNA的裂解幾乎係使用骨架174之CasX RNP的兩倍(表32)。
亦用等莫耳量之RNP及DNA目標歷經較長時間過程進行分析，以評估預期RNP中具有裂解活性的部分。因為CasX RNP在所測試之時間標度內基本上單次周轉，且預期所用濃度實質上高於DNA-結合反應之K D，所以裂解DNA之量應近似活性RNP之量。對於間隔子6.7或6.8，併入骨架316之CasX RNP之活性部分比使用骨架174之CasX RNP之活性部分高25%至30% (表32)。此等資料表明，使用骨架316之更高部分gRNA經適當摺疊以與CasX蛋白結合，或使用骨架316之gRNA能夠與CasX蛋白更大程度地結合。相比於骨架174，骨架316攜帶突變，預期使正確gRNA摺疊所需的假結及三螺旋體結構穩定。特定言之與gRNA結構中其他地方發現之簡單髮夾相比，此等模體更可能發生錯誤摺疊，因此該等模體的穩定性增加可導致摺疊為活性構形之gRNA的部分略微較高。 表 32 ： 含有骨架變異體 174 或 316 及型式 1(v1) 化學修飾概況之 gRNA 對 CasX RNP 所評估之裂解活性參數。
gRNA(骨架變異體-間隔子) k 裂解(min -1) 勝任部分
174-6.7, v1 0.236 0.194
174-6.8, v1 0.142 0.165
316-6.7, v1 0.264 0.244
316-6.8, v1 0.272 0.213
基於細胞之分析中 gRNA 骨架變異體 174 及 316 之比較：
在基於細胞之分析中使用與變異體316相比之gRNA骨架變異體174進行編輯評估。經CasX 491 mRNA及使用間隔子6.7及6.8之靶向PCSK9的gRNA的型式1 (v1)用脂質體轉染至HepG2細胞中。轉染後28小時收集經處理細胞以藉由NGS分析PCSK9基因座處之編輯水平及藉由ELISA分析分泌PCSK9水平，且資料呈現於圖20中。資料表明，與使用靶向B2M之gRNA的非靶向對照相比，使用靶向PCSK9之gRNA中之任一者均在PCSK9基因座處高效編輯，且顯著減少PCSK9之分泌。結果亦展示，骨架316之使用在PCSK9基因座處產生比使用骨架174所觀測到的更有效的編輯(與骨架174相比，使用骨架316達成之編輯率提高約10個百分比點)。此發現進一步由ELISA結果支持，使得與使用骨架174所達成的分泌相比，使用骨架316能更有效地減少PCSK9的分泌。
亦在編輯分析中評估骨架變異體174及316，其中LNP經調配以共同囊封CasX 491 mRNA及含有骨架變異體之靶向B2M的gRNA。用各種劑量之所得LNP處理HepG2細胞且處理後七天收集以評估B2M基因座處之編輯(以藉由NGS偵測之插入/缺失率量測(圖21A))及B2M依賴性HLA複合物表面呈現的損失(藉由流動式細胞測量術所偵測(圖21B))。來自兩種分析之結果表明，與以各劑量之遞送使用骨架174之gRNA的LNP相比，用遞送使用骨架316之靶向B2M的gRNA的LNP處理可在B2M基因座處引起較高的編輯效能(圖21A及圖21B)。特定言之，在250 ng之最高劑量下，使用骨架316產生所獲得之編輯水平比使用骨架174獲得之水平高接近兩倍。相比於自活體外裂解分析觀測之活性的相對適度差異，當使用骨架316相對於骨架174時編輯功效之此實質性增加可歸因於LNP調配物期間之gRNA結構及摺疊的不穩定。在LNP調配期間低pH條件及陽離子脂質之結合會不利地影響gRNA結構之部分且產生去摺疊。因此，gRNA有必要在遞送後在細胞質中快速再摺疊，以便與CasX蛋白結合以形成RNP且避免核糖核酸酶降解。與骨架174相比，骨架316中增加穩定性的突變可對支持gRNA在LNP遞送之後在細胞質中之適當再摺疊中提供實質性益處，而在生物化學分析之前針對gRNA進行有意摺疊方案可能降低此等突變之影響。 實例 8 ： 證明改變經工程改造之 CasX mRNA 之 UTR 序列可影響 CasX 介導之編輯
5'及3' UTR為有效轉譯mRNA所基本及所需的。此處，進行實驗以證明，當經由轉染活體外遞送CasX mRNA及靶向gRNA時，改變經工程改造之CasX mRNA之5'及3' UTR序列影響目標基因座處的CasX介導之編輯。 材料及方法： CasX mRNA 之 IVT ：
由IVT產生CasX 676 mRNA。簡言之，將編碼5' UTR區、具有側接c-MYC NLSes之密碼子最佳化CasX 676及3' UTR區之構築體選殖至含有T7啟動子及80-核苷酸聚(A)尾之質體中。使CasX 676之編碼序列最佳化以改良蛋白質表現。將所得質體在用於IVT反應之前線性化，使用CleanCap® AG及N1-甲基-假尿苷進行。對於5'帽，CleanCap® AG含有m7G(5')ppp(5')mAG結構，其中「m7G」指示N 7-甲基鳥苷，「mA」指示2'O-甲基腺苷，且(5')ppp(5')指示5'至5'三磷酸酯橋。在CleanCap® AG之後併入額外鳥嘌呤核苷酸以增強轉錄起始，從而引起併入m7G(5')ppp(5')mAGG作為完整5'帽結構。如在以下實例9中所論述，尿苷核苷取代為N1-甲基-假尿苷以改良mRNA效能且降低mRNA免疫原性。
隨後對IVT反應物進行去氧核糖核酸酶消化以移除模板DNA且使用寡核苷酸-dT管柱純化。在此實例中，產生CasX 676 mRNA之兩種組態以用於活體外評估。兩種CasX mRNA組態之編碼序列詳述於表33中。編碼具有化學修飾之CasX mRNA之全長RNA序列列於表34中。 表 33： 此實例中評估之兩種 CasX mRNA 分子之編碼序列*。
CasX mRNA ID 組分(ID) 描述 DNA 序列或SEQ ID NO:
CasX 676 mRNA #1 5'UTR 人類 HBA 3188
起始密碼子+ c-MYC NLS    3133
CasX 676    3134
c-MYC NLS +終止密碼子    3135
3'UTR 人類 HBA 3189
聚(A)尾    3057
CasX 676 mRNA #2 5'UTR 合成(TriLink) 3047
起始密碼子+ c-MYC NLS    3133
CasX 676    3134
c-MYC NLS +終止密碼子    3135
3'UTR 小鼠 HBA 3055
XbaI限制部位(部分)    TCTAG
聚(A)尾    3057
*組分以5'至3'次序列於構築體內 表 34 ： 此實例中評估之 CasX mRNA 分子之全長 RNA 序列 。 在本文中之實例中所論述之 5' 帽 (m7G(5 ' )ppp(5 ' )mAG) 未展示於表中。修飾『 mψ 』 =N1- 甲基 - 假尿苷
CasX mRNA SEQ ID NO RNA 序列
CasX 676 mRNA #1 3190 ACmψCmψmψCmψGGmψCCCCACAGACmψCAGAGAGAACCCGCCACCAmψGGCCCCmψGCmψGCCAAGAGAGmψGAAGCmψGGAmψAGCAGACAGGAGAmψCAAGCGGAmψmψAAmψAAAAmψmψCGGAGAAGACmψGGmψGAAGGAmψmψCmψAACACAAAGAAGGCmψGGCAAGACACGGGGCCCmψAmψGAAGACACmψGCmψGGmψGAGAGmψGAmψGACACCCGACCmψGAGAGAAAGACmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAGAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAACACAAGCCGGGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGACmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCCAmψCCmψGCACGmψGmψAmψmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAAGACCCAGmψCGGCCmψGAmψGAGCAGAGmψGGCmψCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAGCCCGAAAmψGGACGAGAAGGGGAACCmψGACAACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGmψAGCCAGmψGCGGCCAGCCCCmψGmψmψmψGmψGmψACAAACmψGGAACAGGmψGAGCGAAAAGGGCAAGGCmψmψACACGAAmψmψACmψmψCGGCAGAmψGCAACGmψGGCCGAGCACGAGAAGCmψGAmψCAAGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCmψGAGAAGGAmψAGCGAmψGAGGCAGmψGACAmψAmψmψCCCmψGGGCAAGmψmψCGGACAGCGGGCCCmψGGAmψmψmψmψmψAmψmψCCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAAmψCCACCCACCCCGmψCAAGCCmψCmψmψGCCCAAAmψmψGCCGGCAACAGAmψACGCCmψCCAGCCCCGmψGGGCAAGGCCCmψGAGCGACGCCmψGmψAmψGGGCACCAmψCGCCAGCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψmψAmψCAmψCGAGCACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGCGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAGmψAmψCCmψAGCGmψGACCCmψGCCmψCCmψCAGCCmψCAmψACAAAGGAGGGCGmψGGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGGAmψGmψGGGmψGAACCmψGAAmψCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψGmψCmψAGAGACGACGCCAAGCCCCmψGCmψGAGACmψGAAGGGCmψmψCCCCAGCmψmψCCCmψCmψGGmψGGAGAGACAGGCAAAmψGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAAmψGAGAAGAAGGAGGACGGCAAAGmψGmψmψCmψGGCAGAAmψCmψGGCCGGCmψACAAGCGmψCAGGAGGCCCmψGCGGCCCmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGACAGAAAGAAGGGCAAGAAGmψmψCGCCCGGmψAmψCAGCmψGGGGGACCmψGCmψGCmψGCACCmψCGAGAAGAAGCACGGCGAAGACmψGGGGGAAGGmψGmψACGAmψGAGGCCmψGGGAGCGGAmψCGAmψAAGAAGGmψGGAGGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAGGAGGAACGGAGAmψCmψGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGAGAGCCAAGGCCAGCmψmψCGmψCAmψCGAGGGGCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCCGGmψGCGAACmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGAGAmψCmψGAGAGGCAAACCmψmψmψCGCCAmψCGAGGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGCGCCmψmψmψAmψmψmψGGCAGAAGGACGGAGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψAmψmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGAGAmψmψCAAGAAGAmψCAAGCCmψGAAGCCmψmψCGAGGCCAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψmψAACAAGAAAAGCGGAGAGAmψCGmψGCCAAmψGGAAGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCmψAACCmψGAmψCAmψCCmψGCCCCmψGGCAmψmψmψGGCAAGCGGCAGGGCAGAGAGmψmψCAmψCmψGGAACGACCmψGCmψGmψCmψCmψGGAGACCGGCAGCCmψGAAGCmψGGCCAACGGCAGAGmψGAmψCGAGAAGACACmψGmψACAACAGACGAACCAGACAAGACGAGCCCGCCCmψGmψmψmψGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGAGAAGAGAGGmψGCmψGGACAGCAGCAAmψAmψCAAGCCmψAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGACCGGGGCGAGAACAmψCCCmψGCCGmψGAmψCGCCCmψmψACCGACCCCGAGGGAmψGCCCmψCmψGAGCCGGmψmψmψAAAGACAGCCmψGGGCAACCCmψACCCACAmψCCmψGAGAAmψmψGGCGAGmψCCmψACAAGGAGAAGCAGAGAACCAmψCCAGGCCAAGAAGGAGGmψGGAGCAGCGGCGGGCmψGGCGGCmψACmψCCCGGAAGmψACGCCAGCAAGGCCAAGAACCmψGGCCGACGACAmψGGmψmψAGAAAmψACCGCCAGAGACCmψCCmψGmψACmψACGCmψGmψGACCCAGGACGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGAGAACCmψGAGCAGAGGCmψmψCGGCAGACAGGGCAAGAGAACCmψmψCAmψGGCCGAGAGACAGmψACACCCGGAmψGGAGGACmψGGCmψGACCGCCAAGCmψGGCCmψACGAGGGCCmψGCCCmψCmψAAGACCmψACCmψGmψCCAAGACCmψmψGGCACAGmψACACCAGCAAGACAmψGCmψCmψAACmψGCGGCmψmψCACAAmψCACGAGCGCCGACmψACGACCGGGmψGCmψGGAGAAACmψGAAGAAGACCGCCACAGGCmψGGAmψGACCACCAmψmψAACGGCAAGGAGCmψGAAGGmψGGAGGGCCAGAmψCACCmψACmψACAACAGGmψACAAACGGCAGAACGmψGGmψGAAGGACCmψGAGCGmψGGAACmψGGAmψAGACmψGAGCGAGGAAAGCGmψAAACAAmψGACAmψCAGCAGCmψGGACCAAGGGCCGGAGCGGCGAGGCCCmψGAGCCmψGCmψGAAGAAGAGAmψmψCmψCCCACAGACCAGmψGCAGGAGAAGmψmψCGmψGmψGmψCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACCCACGCCGACGAGCAAGCCGCCCmψGAACAmψCGCCCGGmψCmψmψGGCmψmψmψmψCCmψGCGGAGCCAGGAGmψACAAGAAGmψACCAGACAAACAAGACCACAGGCAACACAGACAAGAGAGCCmψmψCGmψCGAGACCmψGGCAGAGCmψmψCmψACAGAAAGAAGCmψGAAGGAGGmψGmψGGAAGCCmψGCCGmψGGGAAGCCCCGCmψGCCAAGAGAGmψGAAGCmψGGACmψAAmψAGAmψAAGCmψGGAGCCmψCGGmψGGCCAmψGCmψmψCmψmψGCCCCmψmψGGGCCmψCCCCCCAGCCCCmψCCmψCCCCmψmψCCmψGCACCCGmψACCCCCGmψGGmψCmψmψmψGAAmψAAAGmψCmψGAGmψGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
CasX 676 mRNA #2 3136 關於序列參見表 22
gRNA 之合成：
在此實例中，使用具有v1修飾概況(參見實例7)之gRNA骨架174設計靶向小鼠 PCSK9基因座之gRNA且以化學方式合成。靶向PCSK9之間隔子之序列列於表35中。 表 35 ： 在此實例中分析之靶向小鼠 PCSK9 基因座的間隔子的序列。
間隔子 ID 目標 RNA 序列 SEQ ID NO:
27.103 小鼠 PCSK9 UAAUCUCCAUCCUCGUCCUG 3073
27.105 小鼠 PCSK9 CCAAGAAGCCAGGGAAGAGG 3192
27.106 小鼠 PCSK9 ACAUAUCUUUUAUGACCUCU 3193
27.107 小鼠 PCSK9 CUGGCUUCUUGGUGAAGAUG 3194
27.108 小鼠 PCSK9 UGGUGAAGAUGAGCAGUGAC 3195
27.116 小鼠 PCSK9 GCCGUUGCUCCAAGGUAUGG 3196
27.117 小鼠 PCSK9 UUCUUGGGGAUCAGGAGGCC 3197
將 CasX mRNA 及 gRNA 活體外轉染至小鼠 Hepa1-6 細胞中 ：
經由轉染將活體外經轉錄之CasX mRNA (CasX mRNA #1或CasX mRNA #2；參見表33)及合成的靶向PCSK9之gRNA藉由遞送至Hepa1-6細胞來對小鼠PCSK9基因座處的編輯進行評估。簡言之，將各孔的20,000個Hepa1-6細胞用編碼CasX 676及靶向PCSK9之gRNA的活體外轉錄之mRNA進行脂質轉染。在培養基更換之後，轉染後20小時收集經轉染細胞以藉由NGS進行PCSK9基因座處的編輯評估，如先前實例4中所描述。作為實驗對照，在無gRNA之情況下個別轉染CasX mRNA #1及CasX mRNA #2。 結果：
在小鼠 PCSK9基因座處之CasX介導之編輯用於評估將不同5'及3' UTR併入至經工程改造之CasX mRNA中之作用。圖26中之圖顯示以在小鼠Hepa1-6細胞(經CasX 676 mRNA #1或CasX 676 mRNA #2以及指定靶向 PCSK9之gRNA轉染)中 PCSK9基因座處的插入/缺失率形式所量測的編輯百分比之定量。資料表明，對於本實驗中所測試之所有靶向間隔子，與CasX mRNA #1所達成的編輯水平相比，CasX mRNA #2在小鼠 PCSK9基因座上始終表現出更高的編輯水平。特定言之，達成最高水平編輯率的係間隔子27.116，其使用CasX mRNA #2之編輯效率約為35%，而使用CasX mRNA #1之編輯效率約為20% (圖26)。
結果表明在基於細胞之分析中改變CasX mRNA之5'UTR及3'UTR序列可影響之目標基因座處之CasX的編輯活性。 實例 9 ： 設計且評估密碼子最佳化之 CasX mRNA 與靶向 gRNA 一起活體外遞送時的編輯效率
mRNA序列及相關修飾可對基於mRNA之遞送的效力具有顯著影響。經修飾之核苷酸，包括編碼5'帽結構之彼等核苷酸，為mRNA穩定性、可表現性及免疫原性之重要決定因素。此處，對於所有設計及測試之CasX mRNA均使用「帽1」結構，其包括5'm7G，以5'-5'三磷酸酯鍵連接至一個帶有2'Ome修飾的起始核苷酸。此結構與缺少2'Ome修飾之「帽0」結構類似，此結構促進高效轉譯，且相比於「帽0」結構具有降低的免疫原性。此外，使用經修飾核鹼基可降低mRNA之免疫原性。此處，N1-甲基-假尿苷用於取代所有活體外轉錄反應之尿苷核糖苷，因為公佈之研究已表明，N1-甲基-假尿苷顯著增強mRNA效能且降低mRNA免疫原性。預期修飾可潛在地藉由避免活化RIG-I (其為雙股RNA之主要胞溶質感測器，係活體外轉錄mRNA之常見摻雜物)來使活體內免疫原性降低且提高轉譯速率。
亦將研究聚(A)尾之最佳化。聚(A)尾對於轉譯及mRNA穩定性為必需的，其中較長尾部與較長mRNA半衰期相關。聚腺苷酸化可以聚(A)聚合酶轉錄方式進行，但此產生可變尾部長度且向mRNA生產過程添加步驟。由於含有120A尾部模板之質體的構築體在大腸桿菌中繁殖時不穩定，往往導致殖株的尾部長度明顯縮短，因此使用含有80A尾部模板的質體進行mRNA生產，且以IIS型限制部位終止，以便進行徑流轉錄。亦選殖在兩條60A鏈之間帶有SphI限制部位的替代質體，因為已公開的研究證明類似構築體在大腸桿菌次選殖及擴增期間更穩定，且在哺乳動物細胞中產生活性等效的mRNA。將使用活體外編輯分析，在整個CasX mRNA及gRNA劑量範圍內比較此等替代型式的活性，以測定對編輯活性之後續影響。本文所描述之聚(A)尾之序列列於表36中。
編碼5'及3'UTR之序列以及用於CasX蛋白編碼序列之密碼子對於有效轉譯亦為關鍵的。UTR係基於先前表徵為具有高mRNA穩定性之基因(例如編碼α-球蛋白、β-球蛋白的基因)，以及預期或先前證明在肝臟中表現較好的基因(亦即編碼下列蛋白的基因：白蛋白、補體3及細胞色素P450 2E1)，選自標註的人類基因轉錄物。來自此等各種基因之5'及3'UTR之序列列於表36中。對於3' UTR，亦測試個別3'UTR之串接。將此等構築體選殖至含有T7啟動子、CasX變異體515或676及聚(A)尾之質體中。為分離個別5'及3' UTR之影響，將各UTR分別選殖入含有3'或5'α-球蛋白UTR的構築體中。進行IVT且將其藉由結合至聚(dT)珠粒進行純化，以捕捉全長轉錄物。所得mRNA最初將藉由使用一範圍內的劑量與靶向 B2M之gRNA共轉染至HepG2細胞中來評估。編輯效率將藉由如實例7中所描述之HLA-免疫染色及流式細胞測量術測定。效能最佳之個別UTR將組合成各種組態，調配成LNP，且在初代人類肝細胞及小鼠中測試。
亦正在探索替代性密碼子最佳化。除用於其他遞送模態之CasX密碼子最佳化以外，藉由基於核糖體蛋白密碼子的使用來構建密碼子使用表且重新平衡CasX密碼子使用情況以進行匹配，來設計新型式。除了潛在改良轉譯速率之外，此亦有效地引起尿嘧啶鹼基之耗竭，從而可降低免疫原性。此密碼子最佳化亦用於產生mRNA。已利用各種可用的密碼子最佳化工具設計額外的密碼子使用，視需要調節設定以達成一範圍內的GC含量水平。將在用於測試如上文所描述之UTR的類似實驗設計下測試此等密碼子最佳化，且前導密碼子最佳化CasX候選物將與前導UTR候選物組合以產生新CasX前導物以供進一步驗證。 表 36 ： 用於產生及最佳化 CasX mRNA 之指定元件之編碼 DNA 序列的清單。
描述 編輯序列 SEQ ID NO:
聚 (A) 尾
A 80 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3057
A 120 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3198
A 60SphIA 60 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3199
5 ' UTR
α-球蛋白 ACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC 3200
β-球蛋白 ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACA 3201
白蛋白 CTAGCTTTTCTCTTCTGTCAACCCCACACGCCTTT 3202
細胞色素P450 2E1 (CYP2E1) CTCCCGGGCTGGCAGCAGGGCCCCAGC 3203
補體3 (C3) ACTCCTCCCCATCCTCTCCCTCTGTCCCTCTGTCCCTCTGACCCTGCACTGTCCC 3204
3 ' UTR
α-球蛋白 GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA 3189
白蛋白 CATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCTAATAGAGTGGTACAGCACTGTTATTTTTCAAAGATGTGTTGCTATCCTGAAAATTCTGTAGGTTCTGTGGAAGTTCCAGTGTTCTCTCTTATTCCACTTCGGTAGAGGATTTCTAGTTTCTTGTGGGCTAATTAAATAAATCATTAATACTCTTCTAAGTTATGGATTATAAACATTCAAAATAATATTTTGACATTATGATAATTCTGAATAAAAGAACAAAAACCA 3205
白蛋白(經截短) GCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTAGATCT 3206
β-球蛋白 GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA 3207
α-球蛋白+ β-球蛋白 GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA 3208
β-球蛋白+α-球蛋白 GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA 3209
實例 10 ： 證明經由 LNP 遞送 LTRP mRNA 及靶向 gRNA 以實現活體外目標基因座之抑制的概念驗證實驗
進行實驗以評估基於細胞之分析中囊封LTRP mRNA及靶向 PCSK9之gRNA的脂質奈米顆粒(LNP)之遞送是否可誘導目標 PCSK9基因座的持久抑制。調配囊封編碼催化活性CasX 515之mRNA的LNP且將其包括以用於比較。 材料及方法： mRNA之產生：
編碼以下分子之mRNA遵循如實例2中所描述之類似方法由IVT產生：1)催化活性CasX 515及2) LTRP5-ADD-ZIM3 (如實例4中所描述)。簡言之，對於生成CasX 515，將編碼合成5'UTR、側接有c-MYC NLSes之密碼子最佳化CasX 515及衍生自小鼠血紅蛋白α (mHBA)之3'UTR的構築體選殖至含有T7啟動子及79-核苷酸聚(A)尾的質體中。所得質體在用於IVT反應之前經線性化，其如實例2中所描述類似方式進行。編碼催化活性CasX 515之DNA及mRNA序列分別如表37及表38所示。編碼LTRP5-ADD-ZIM3之DNA及mRNA序列分別如表18及表19所示。 表 37： 此實例中評估之催化活性 CasX 515 mRNA 分子之編碼序列 * 。
CasX mRNA ID 組分(ID) 描述 DNA 序列或SEQ ID NO:
CasX 515 mRNA 5'UTR 合成(TriLink) 3274
起始密碼子+ c-MYC NLS 3275
CasX 515 3276
c-MYC NLS +終止密碼子 3277
3'UTR 小鼠 HBA 3278
XbaI限制部位(部分) TCTAG
聚(A)尾 3279
*組分以5'至3'次序列於構築體內 表 38 ： 此實例中評估之催化活性 CasX 515 mRNA 分子之全長 RNA 序列 。修飾『 m ψ 』 =N1- 甲基 - 假尿苷。
CasX mRNA SEQ ID NO RNA 序列
CasX 515 mRNA 3280 AAAmψAAGAGAGAAAAGAAGAGmψAAGAAGAAAmψAmψAAGAGCCACCAmψGGCCCCmψGCmψGCCAAGAGAGmψGAAGCmψGGAmψAGCAGACAGGAGAmψCAAGCGGAmψmψAAmψAAAAmψmψCGGAGAAGACmψGGmψGAAGGAmψmψCmψAACACAAAGAAGGCmψGGCAAGACAGGCCCmψAmψGAAGACACmψGCmψGGmψGAGAGmψGAmψGACACCCGACCmψGAGAGAAAGACmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAGAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAACACAAGCCGGGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGACmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCCAmψCCmψGCACGmψGmψAmψmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAAGACCCAGmψCGGCCmψGAmψGAGCAGAGmψGGCmψCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAGCCCGAAAmψGGACGAGAAGGGGAACCmψGACAACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGmψAGCCAGmψGCGGCCAGCCCCmψGmψmψmψGmψGmψACAAACmψGGAACAGGmψGAGCGAAAAGGGCAAGGCmψmψACACGAAmψmψACmψmψCGGCAGAmψGCAACGmψGGCCGAGCACGAGAAGCmψGAmψCCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCmψGAGAAGGAmψAGCGAmψGAGGCAGmψGACAmψAmψmψCCCmψGGGCAAGmψmψCGGACAGCGGGCCCmψGGAmψmψmψmψmψAmψmψCCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAAmψCCACCCACCCCGmψCAAGCCmψCmψmψGCCCAAAmψmψGCCGGCAACAGAmψACGCCAGCGGCCCCGmψGGGCAAGGCCCmψGAGCGACGCCmψGmψAmψGGGCACCAmψCGCCAGCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψmψAmψCAmψCGAGCACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGCGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAGmψAmψCCmψAGCGmψGACCCmψGCCmψCCmψCAGCCmψCAmψACAAAGGAGGGCGmψGGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGGAmψGmψGGGmψGAACCmψGAAmψCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψGmψCmψAGAGACGACGCCAAGCCCCmψGCmψGAGACmψGAAGGGCmψmψCCCCAGCmψmψCCCmψCmψGGmψGGAGAGACAGGCAAAmψGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAAmψGAGAAGAAGGAGGACGGCAAAGmψGmψmψCmψGGCAGAAmψCmψGGCCGGCmψACAAGCGmψCAGGAGGCCCmψGCGGCCCmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGACAGAAAGAAGGGCAAGAAGmψmψCGCCCGGmψAmψCAGCmψGGGGGACCmψGCmψGCmψGCACCmψCGAGAAGAAGCACGGCGAAGACmψGGGGGAAGGmψGmψACGAmψGAGGCCmψGGGAGCGGAmψCGAmψAAGAAGGmψGGAGGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAGGAGGAACGGAGAmψCmψGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGAGAGCCAAGGCCAGCmψmψCGmψCAmψCGAGGGGCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCCGGmψGCGAACmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGAGAmψCmψGAGAGGCAAACCmψmψmψCGCCAmψCGAGGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGCGCCmψmψmψAmψmψmψGGCAGAAGGACGGAGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψAmψmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGAGAmψmψCAAGAAGAmψCAAGCCmψGAAGCCmψmψCGAGGCCAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψmψAACAAGAAAAGCGGAGAGAmψCGmψGCCAAmψGGAAGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCmψAACCmψGAmψCAmψCCmψGCCCCmψGGCAmψmψmψGGCAAGCGGCAGGGCAGAGAGmψmψCAmψCmψGGAACGACCmψGCmψGmψCmψCmψGGAGACCGGCAGCCmψGAAGCmψGGCCAACGGCAGAGmψGAmψCGAGAAGACACmψGmψACAACAGACGAACCAGACAAGACGAGCCCGCCCmψGmψmψmψGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGAGAAGAGAGGmψGCmψGGACAGCAGCAAmψAmψCAAGCCmψAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGACCGGGGCGAGAACAmψCCCmψGCCGmψGAmψCGCCCmψmψACCGACCCCGAGGGAmψGCCCmψCmψGAGCCGGmψmψmψAAAGACAGCCmψGGGCAACCCmψACCCACAmψCCmψGAGAAmψmψGGCGAGmψCCmψACAAGGAGAAGCAGAGAACCAmψCCAGGCCAAGAAGGAGGmψGGAGCAGCGGCGGGCmψGGCGGCmψACmψCCCGGAAGmψACGCCAGCAAGGCCAAGAACCmψGGCCGACGACAmψGGmψmψAGAAAmψACCGCCAGAGACCmψCCmψGmψACmψACGCmψGmψGACCCAGGACGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGAGAACCmψGAGCAGAGGCmψmψCGGCAGACAGGGCAAGAGAACCmψmψCAmψGGCCGAGAGACAGmψACACCCGGAmψGGAGGACmψGGCmψGACCGCCAAGCmψGGCCmψACGAGGGCCmψGCCCmψCmψAAGACCmψACCmψGmψCCAAGACCmψmψGGCACAGmψACACCAGCAAGACAmψGCmψCmψAACmψGCGGCmψmψCACAAmψCACGAGCGCCGACmψACGACCGGGmψGCmψGGAGAAACmψGAAGAAGACCGCCACAGGCmψGGAmψGACCACCAmψmψAACGGCAAGGAGCmψGAAGGmψGGAGGGCCAGAmψCACCmψACmψACAACAGGmψACAAACGGCAGAACGmψGGmψGAAGGACCmψGAGCGmψGGAACmψGGAmψAGACmψGAGCGAGGAAAGCGmψAAACAAmψGACAmψCAGCAGCmψGGACCAAGGGCCGGAGCGGCGAGGCCCmψGAGCCmψGCmψGAAGAAGAGAmψmψCmψCCCACAGACCAGmψGCAGGAGAAGmψmψCGmψGmψGmψCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACCCACGCCGACGAGCAAGCCGCCCmψGAACAmψCGCCCGGmψCmψmψGGCmψmψmψmψCCmψGCGGAGCCAGGAGmψACAAGAAGmψACCAGACAAACAAGACCACAGGCAACACAGACAAGAGAGCCmψmψCGmψCGAGACCmψGGCAGAGCmψmψCmψACAGAAAGAAGCmψGAAGGAGGmψGmψGGAAGCCmψGCCGmψGGGAAGCCCCGCmψGCCAAGAGAGmψGAAGCmψGGACmψAAGCmψGCCmψmψCmψGCGGGGCmψmψGCCmψmψCmψGGCCAmψGCCCmψmψCmψmψCmψCmψCCCmψmψGCACCmψGmψACCmψCmψmψGGmψCmψmψmψGAAmψAAAGCCmψGAGmψAGGAAGmψCmψAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
gRNA 之合成：
靶向 PCSK9之gRNA使用gRNA骨架316及間隔子6.1 (序列列於表24中)設計，且以化學方式合成。具有v1修飾概況之靶向PCSK9之gRNA的序列(如以上實例7中所描述)列於表39中。gRNA骨架變異體316之『v1』概況的化學修飾部位之示意圖示於圖24中。 表 39 ： 在此實例中分析之靶向人類 PCSK9 基因座的經化學修飾之 gRNA 的序列。
gRNA ID ( 骨架變異體 - 間隔子 ) 目標 gRNA 序列 SEQ ID NO
316-6.1 (v1) 人類 PCSK9 mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGGAGGAGGACGGCCUGGC*mC*mG*mA 3447
使用下文實例11中所描述之方法用下表40中所列之LNP脂質產生LNP調配物。 將囊封 LTRP 或 CasX mRNA 及靶向 gRNA 之 LNP 遞送至初代食蟹獼猴 (CM) 肝細胞中 ：
使用來源於兩個不同供體(產物編號：M003055-P；BioIVT)之初代CM肝細胞的兩個批次(稱為BJE及VDU)，以評估當藉由LNP遞送時在 PCSK9基因座處的LTRP介導之抑制或CasX介導之編輯。對於各批次，在96孔盤中每孔接種約50,000個細胞(該等細胞在Williams' E完整培養基中培養)。次日，用不同濃度之LNP處理所接種之細胞，LNP以1,200 ng/100 µL起始，按六個3倍連續稀釋製備。調配此等LNP以共同囊封CasX 515或LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA及併入骨架變異體316與間隔子6.1之靶向 PCSK9的gRNA (v1；參見表39)。此實例中測試之LNP調配物顯示於表40中。培養基在LNP處理後一天後更換，且細胞再培養若干天，隨後收穫培養基上清液，以量測第4天及第11天時間點之PCSK9分泌水平。簡言之，按照製造商說明書使用BioLegend® ELISA MAX TM套組藉由ELISA來量測PCSK9分泌水平。為了確保量化PCSK9分泌水平之精確性，使用重組CM PCSK9蛋白質作為參考物(食蟹獼猴PCSK9蛋白，來自Acro Biosystems)構築標準曲線。在第4天，亦定量未經處理之初代CM肝細胞(對於各批次)之基線PCSK9分泌水平(ng/mL)。 表 40 ：在此實例中測試之 LNP 調配物。
LNP 脂質 經囊封之mRNA 經囊封之gRNA
GenVoy-ILM™ CasX 515 gRNA骨架316與間隔子6.1 (v1)
MC3
MC3 LTRP5-ADD-ZIM3
ALC-0315
SM-102
結果：
兩個批次的初代CM肝細胞用以各種劑量之五種不同LNP處理，該等LNP共同囊封CasX 515或LTRP5-ADD-ZIM3及使用間隔子6.1之靶向 PCSK9的gRNA。處理後4及11天收集培養基上清液以評估對PCSK9分泌之作用(圖61至圖64)。圖61至圖64中的結果表明，LTRP5-ADD-ZIM3或CasX mRNA及靶向gRNA可經共同囊封於各種LNP內，且遞送至其中分泌PCSK9水平降低之目標細胞。在處理後4天觀測到兩批初代CM肝細胞中所有經調配之LNP的所分泌之PCSK9水平的劑量依賴性降低(圖61至圖62)。處理後11天，觀測到兩個批次中之所有經調配之LNP的所分泌之PCSK9水平之劑量依賴性降低，除了MC3-囊封LTRP5-ADD-ZIM3及靶向gRNA以外(圖63至圖64)。將在較長時間點檢查分泌之PCSK9水平以進一步測定各LNP調配物對減少PCSK9分泌的作用。
來自此實驗之結果顯示LTRP mRNA以及CasX mRNA與靶向gRNA可囊封於LNP內以遞送至目標細胞，以誘導目標內源性基因座之沉默。 實例 11 ： 調配脂質奈米顆粒 (LNP) 以將 dXR 或 LTRP mRNA 及 gRNA 有效負載遞送至目標細胞及組織
如實例10中所描述，進行實驗以將dXR或LTRP mRNA及gRNA囊封至LNP中以遞送至目標細胞及組織。以下實例提供用於用各種LNP脂質調配LNP之方法。 對於使用基於GenVoy-ILM TM之LNP的實驗：
按照製造商的指導，使用GenVoy-ILM™脂質在Precision NanoSystems公司(PNI)的Ignite™ Benchtop系統上將dXR或LTRP mRNA及gRNA囊封至LNP中。GenVoy-ILM™脂質為50:10:37.5:2.5mol%之可離子化脂質:DSPC:膽固醇:穩定劑的組合物。簡言之，為調配LNP，將相等質量比之dXR或LTRP mRNA及gRNA稀釋於PNI調配緩衝液(pH 4.0)中。GenVoy-ILM™脂質在無水乙醇中1:1稀釋。使用預定N/P比產生mRNA/gRNA共同調配。將RNA及脂質在PNI Ignite™ Benchtop系統上以預定流動速率比穿過PNI層流濾筒。調配後，將LNP稀釋於PBS (pH 7.4)中，以降低乙醇濃度且提高pH，由此將提高顆粒之穩定性。將藉由在4℃下使用10k Slide-A-Lyzer™滲析卡匣(Thermo Scientific™)隔夜滲析至PBS (pH 7.4)中來實現mRNA/sgRNA-LNP之緩衝劑更換。滲析之後，將mRNA/gRNA-LNP使用100 kDa Amicon®-Ultra離心過濾器(Millipore)濃縮至＞ 0.5 mg/mL，隨後過濾滅菌。將於Stunner (Unchained Labs)上分析所調配LNP以測定其直徑及多分散性指數(PDI)。將使用英傑公司(Invitrogen)之Quant-iT™ RiboGreen™ RNA分析套組藉由RiboGreen™分析測定囊封效率及RNA濃度。
對於使用基於ALC-0315 (6-((2-己基癸醯基)氧基)-N-(6-((2-己基癸醯基)氧基)己基)-N-(4-羥基丁基)己-1-銨)、SM-102 (8-[(2-羥基乙基)[6-側氧基-6-(十一烷氧基)己基]胺基]-辛酸,1-辛基壬基酯)以及MC3 (DLin-MC3-DMA)之LNP的實驗：
使用定製的T-混合器微型混合裝置，以20 mL/min之流動速率及3:1水性與有機相之混合比，使用基於ALC-0315、SM-102或MC3之脂質混合物將dXR或LTRP mRNA及gRNA囊封至LNP中。對於全部三種脂質混合物，組成為以下：50:10:38.5:1.5 mol%之可離子化脂質:DSPC:膽固醇:DMG-PEG2000。簡言之，為調配LNP，將相等質量比之dXR或LTRP mRNA及gRNA稀釋於25 mM乙酸鈉(pH 4.0)中。在無水乙醇中以10 mM濃度製備脂質混合物。使用預定N/P比產生mRNA/gRNA共同調配。使用注射泵輸注器，將RNA及脂質以預定流動速率比穿過定製的T-混合器裝置。調配後，將LNP滲析至PBS (pH 7.4)中，以降低乙醇濃度且提高pH，由此提高顆粒之穩定性。將藉由在4℃下使用10k Slide-A-Lyzer™滲析卡匣(Thermo Scientific™)或12-14 kDa滲析管(Repligen)隔夜滲析至PBS (pH 7.4)中來實現mRNA/sgRNA-LNP之緩衝劑交換。滲析之後，將mRNA/gRNA-LNP使用30-100 kDa Amicon®-Ultra離心過濾器(Millipore)濃縮至＞ 0.2 mg/mL，隨後使用Acrodisc PES膜過濾器進行滅菌過濾。於Malvern Zetasizer上分析所調配LNP以測定其直徑及多分散性指數(PDI)。將使用英傑公司(Invitrogen)之Quant-iT™ RiboGreen™ RNA分析套組藉由RiboGreen™分析測定囊封效率及RNA濃度。
上文所描述之GenVoy-ILM™、ALC-0315、SM-102及MC3 LNP用於各種實驗以將XR或LTRP mRNA及gRNA遞送至目標細胞，且可進一步用於遞送至目標組織。 實例 12 ： 對編碼引導 RNA 骨架之 DNA 進行 CpG- 耗竭可改良活體外 CasX 介導之編輯
病原相關分子模式(PAMP)，諸如未甲基化CpG模體，為微生物類別內保守的小分子模體。其藉由真核細胞中之鐸樣受體(TLR)及其他模式識別受體進行識別且通常誘導非特異性免疫活化。在基因療法之情形下，含有PAMP之治療劑通常不具有良好耐受性且在所觸發之強力免疫反應的情況下自患者快速清除，此最終導致治療功效降低。CpG模體為含有CG二核苷酸之短單股DNA序列。當此等CpG模體未甲基化時，其充當PAMP且因此刺激免疫反應。在此實例中，進行實驗以在編碼CasX變異體491、引導骨架變異體235及靶向內源性B2M ( β-2-微球蛋白)基因座之間隔子7.37的AAV構築體的情形下耗竭引導骨架編碼序列中之CpG模體，且測試引導骨架中之CpG耗竭對 B2M基因座之活體外編輯的影響。 材料及方法： CpG 耗竭之引導骨架之設計：
核苷酸取代係經合理設計以置換鹼基gRNA骨架變異體(gRNA骨架235)內之天然CpG模體，意欲保持編輯活性同時降低骨架免疫原性。咸信，應自骨架編碼序列移除儘可能多的CpG-模體以便充分降低免疫原性。骨架235含有總共八個CpG元件；其中六個經預測以鹼基配對且形成雙股二級結構之互補股(參見圖27A)。因此，對形成三個對之六個鹼基配對進行CpG協同突變以維持重要二級結構。此將獨立含CpG之區域之數目減少至五個(三個對及兩個單一CpG)以獨立地考慮用於CpG移除。特定言之，在(1)假結莖、(2)骨架莖、(3)延伸莖泡、(4)延伸莖及(5)延伸莖環中設計突變，如圖27B中所圖解說明且在下文詳細描述。
在假結莖(區域1)中，CpG對翻轉為GpC以使鹼基組合物及序列之改變降至最低。基於先前涉及置換個別鹼基對之實驗，預期此突變不可能不利於引導RNA骨架之結構及功能。
類似地，在骨架莖(區域2)中，CpG對翻轉為GpC以使鹼基組合物及序列之變化減到最少。預期此突變可能不利於引導RNA骨架之結構及功能，因為在先前實驗中在此區域中發現強序列保守使個別鹼基或鹼基對突變。此強序列保守可能係由於骨架莖環與CasX蛋白相互作用以及與假結區域形成三螺旋體結構元件方面起著重要作用。
在延伸的莖泡(區域3)中，單一CpG藉由三種策略之一移除。首先，藉由突變CG-＞C刪除泡。其次，藉由突變CG-＞CT解析泡以恢復理想的鹼基配對。第三，整個延伸莖環用骨架174之延伸莖環替換。應注意，用骨架174的延伸莖環置換延伸莖環本身就再現了骨架316 (其先前已被證明能進行高效編輯)。骨架174之延伸莖環中不存在CpG模體。因此，用骨架174之延伸莖環置換延伸莖環亦移除延伸莖中之CpG模體(區域4)。基於先前實驗表明延伸莖對微小變化具有相對的穩健性，因此預期突變延伸莖泡對引導RNA骨架之結構及功能可能有一定的損害。
在延伸莖(區域4)中，CpG對不能翻轉成GpC而不產生額外CpG模體。因此，CpG變成GG及互補CC模體。類似於區域3，基於延伸莖對微小變化具有相對的穩健性，因此預期此突變不太可能對引導RNA骨架之結構及功能造成損害。
最後，延伸莖環(區域5)以基於檢查莖環穩定性之先前實驗設計的三種方式中之一者進行突變。詳言之，先前已展示莖環之若干變化形式具有類似的穩定性水平，且莖環之此等變化中的一些不含有CpG。基於此等發現，首先，用具有CUUG序列之新環置換該環。其次，用具有GAAA序列之新環置換該環。由於GAAA環置換將產生鄰近於環之新穎CpG，因此將其與互補股上的C-＞G鹼基交換以及相應的G-＞C鹼基交換相結合，最終形成CUUCGG-＞GGAAAC交換。第三，藉由插入A以使環發生突變以中斷CpG模體且從而將環大小自4個鹼基增加至5個鹼基。預期隨機突變延伸莖環將可能對二級結構穩定性產生不利影響，且因此對編輯造成不利影響。然而，依賴於先前確認之序列被認為與置換相關之風險較低。
為了產生由DNA編碼之具有降低CpG水平的引導RNA骨架，以各種組態組合上文所描述之突變。下表41概述所用突變之組合。在表41中，0指示無突變引入至指定區域，1、2或3指示該區域中引入突變，如圖27B中所圖解說明，而n/a指示不適用。特定言之，對於區域1假結莖，1指示引入CG-＞GC突變。對於區域2骨架莖，1指示引入CG-＞GC突變。對於區域3延伸莖泡，1指示藉由缺失形成泡之G鹼基及A鹼基來移除泡，2指示藉由CG-＞CU突變解析泡，從而允許A鹼基與U鹼基之間鹼基配對，且3指示延伸莖環經來自引導骨架174之延伸莖環置換。對於區域4延伸莖，1指示引入CG-＞GC突變。對於區5延伸莖環，1指示環係由UUCG-＞CUUG置換，2指示環與鄰近於環之鹼基對一起自CUUCGG-＞GGAAAC置換，且3指示在C與G之間插入A。 表 41 ： 引導骨架 235 中之 CpG- 減少及耗竭的突變概述
骨架ID 區域1 ( 假結莖) 區域2 ( 骨架莖) 區域3 ( 延伸莖泡) 區域4 ( 延伸莖) 區域5 ( 延伸莖環)
320 1 0 0 1 0
321 1 0 1 1 0
322 1 0 2 1 0
323 1 0 3 n/a 0
324 1 0 1 1 1
325 1 0 2 1 1
326 1 0 3 n/a 1
327 1 0 1 1 2
328 1 0 2 1 2
329 1 0 3 n/a 2
330 1 0 1 1 3
331 1 0 2 1 3
332 1 0 3 n/a 3
334 1 1 2 1 1
335 1 1 3 n/a 1
336 1 1 1 1 2
337 1 1 2 1 2
338 1 1 3 n/a 2
339 1 1 1 1 3
340 1 1 2 1 3
341 1 1 3 n/a 3
235 0 0 0 0 0
以下表42列出編碼經設計之CpG-減少或耗竭之引導骨架的DNA序列。 表 42 ： 編碼 CpG- 減少或耗竭之引導 RNA 骨架的 DNA 序列
骨架ID SEQ ID NO
320 3210
321 3211
322 3212
323 3213
324 3214
325 3215
326 3216
327 3217
328 3218
329 3219
330 3220
331 3221
332 3222
333 3223
334 3224
335 3225
336 3226
337 3227
338 3228
339 3229
340 3230
341 3231
CpG- 耗竭之 AAV 質體的產生 ：
除AAV2 ITR之外，CpG-減少或耗竭之gRNA骨架在AAV載體之情形下進行測試，該等載體在其他情況下亦為CpG-耗竭的。特定言之，基於相關物種之同源核苷酸序列，為以下元件設計用於置換AAV組分中天然CpG模體的核苷酸取代：小鼠U1a snRNA (小核RNA)基因啟動子、bGHpA (牛生長激素聚腺苷酸化)序列及人類U6啟動子。CasX 491之編碼序列針對CpG耗竭經密碼子最佳化。所有所得序列(表42及表43)經定序為具有用於選殖及等溫組裝之適當懸垂物的基因片段，以單獨地置換現有鹼基AAV質體(構築體ID 183)之對應元件。將靶向內源性B2M基因的間隔子7.37 (GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG；SEQ ID NO: 3137)用於此實例中論述之實驗。首次進行實驗時(「N=1」)，亦包括具有非靶向間隔子0.0之樣品作為對照(CGAGACGUAAUUACGUCUCG，SEQ ID NO: 3232；參見圖28)。
使用標準分子選殖技術產生所得AAV構築體。中量提取選殖及定序驗證之質體構築體，用於後續的核轉染及AAV載體產生。除編碼gRNA之序列(表41)以外，AAV構築體之額外組分之序列列於表43中。 表 43 ： AAV 元件之序列 (AAV 構築體中之 5'-3' )
元件 DNA 序列 SEQ ID NO:
AAV2 5' ITR 3233
CpG-耗竭之U1a啟動子 3234
CpG-耗竭之cMycNLS-CasX491-cMycNLS 3235
CpG-耗竭之bGH-聚A序列 3236
CpG-耗竭之U6啟動子 3237
參見上文表42 中之sgRNA 序列。
AAV2 3' ITR 3238
AAV 產生：
在轉染當天將保持在FreeStyle 293培養基中的懸浮液調適之HEK293T細胞以1.5E6個細胞/毫升接種於20-30 mL培養基中。在無血清Opti-MEM培養基中，使用PEI-Max (Polysciences)將具有由ITR重複序列側接之轉殖基因的無內毒素pAAV質體與提供用於複製的腺病毒輔助基因以及AAV rep/cap基因體的質體共轉染。三天後，將培養物離心以將上清液與細胞集結粒分離，且遵循標準程序收集AAV顆粒，濃縮且過濾。
為了確定病毒基因體(vg)效價，用DNA酶及ProtK消化來自粗溶解物病毒之1 µL，接著進行定量PCR。5 µL經消化病毒用於25 µL qPCR反應，其由IDT primetime主混合物、一組引子及6'FAM/Zen/IBFQ探針(IDT)構成，經設計以擴增位於AAV2-ITR中的62 bp-片段。AAV ITR質體用作參考標準以計算病毒樣品之效價(vg/mL)。 經誘導之神經元的活體外 AAV 轉導 ：
在轉導之前24小時，將誘導之神經元以每孔50,000個接種於塗佈有基質膠的96孔培養盤上。表現具有各種型式之引導骨架的CasX:gRNA系統的AAV隨後在神經元塗鋪培養基中稀釋且添加至細胞中。首次進行實驗(「N=1」)時，細胞以4e3個病毒基因體(vg)/細胞之感染倍率(MOI)轉導(參見圖28)。接種後七天，誘導之神經元用稀釋於新鮮進料培養基中的病毒進行轉導。轉導後八天，使用溶解緩衝液提取細胞，根據實驗條件合併4孔複本，且收集基因體DNA (gDNA)且準備，以便使用下一代定序(NGS)進行B2M基因座之編輯分析。第二次進行實驗(「N=2」)時，細胞以3e3個vg/細胞、1e3個vg/細胞或3e2個vg/細胞之MOI轉導(參見圖29、圖30以及圖31)。接種後七天，誘導之神經元用稀釋於新鮮進料培養基中的病毒進行轉導。轉導後七天，使用溶解緩衝液提取細胞，根據實驗條件合併2孔複本，且收集gDNA且準備，以便使用NGS進行B2M基因座之編輯分析。包括未經AAV轉導之樣品作為對照。 NGS 處理及分析：
遵循製造商說明書使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus套組提取來自所收集細胞之基因體DNA (gDNA)。目標擴增子藉由用一組對人類B2M基因具有特異性之引子擴增來自200 ng所提取之gDNA的感興趣區域而形成。此等基因特異性引子在5'末端含有額外序列以引入Illumina銜接子及16核苷酸之獨特分子識別符。用Ampure XP DNA淨化套組純化擴增DNA產物。使用Fragment Analyzer DNA分析儀套組(Agilent，dsDNA 35-1500 bp)評估擴增子之品質及定量。根據製造商之說明書在Illumina MiSeq上定序擴增子。使用cutadapt v2.1、flash2 v2.2.00及CRISPResso2 v2.0.29對定序之原始fastq檔案進行品質控制及處理。在間隔子3'末端周圍的窗(以間隔子3'末端-3 bp為中心的30 bp窗)內，針對相對於參考序列含有插入或缺失(插入/缺失)，對各序列進行定量。對於各樣品，CasX活性定量為此窗內任何地方含有插入、取代及/或缺失之讀段的總百分比。 結果：
將突變引入引導骨架235中，以減少編碼引導骨架之DNA序列的CpG含量。出人意料地，與骨架235相比，CpG-減少及CpG-耗竭之骨架變異體均產生經誘導神經元中之較高編輯水平。此為在實驗之兩個獨立重複(其中第一次重複實驗的結果如圖28所示，第二次重複實驗的結果如圖29至圖31所示)以及多個MOI (參見圖30至圖31)的情況。增強的編輯程度係出人意料的，因為降低CpG含量的目的為在降低免疫原性的同時簡單地保持編輯活性。實際上，突變增強編輯活性，而非僅保持該編輯活性。
值得注意地，骨架320的效能顯著增加更甚於骨架235。骨架320僅包括對骨架之兩個區域的突變：假結莖及延伸莖(區域1及區域4)。此外，一些突變組合產生的編輯效果比骨架320更差。不過，即使比骨架320表現更差的CpG-減少之骨架，例如骨架331及334，其表現亦與骨架235相似或更好。
基於此等結果，在不希望受理論束縛的情況下，咸信在許多CpG-減少及CpG-耗竭之骨架中所見之效能增強可能由存在於所有CpG-減少之骨架(亦即區域1及/或4)中的一種突變引起。由於延伸莖環置換(亦即對區域3的第三次突變)的骨架中不存在對區域4之突變，而且此等骨架顯示出與320類似的超過235的效力改良，因此認為有益效果可能係由區域1 (假結莖)的突變引起的，而該突變存在於所有測試的骨架中。將進行其他實驗以分別測試假結莖(區域1)及延伸莖(區域4)中之個別突變的作用。
另外，如圖28中所呈現之N=1資料表明，攜有區域2 (骨架莖)中之突變之所有新骨架的編輯水平均略低於未攜帶該突變的各別對應體骨架。此表明使骨架莖中之此位置突變可能對編輯效能具有較小有害影響。此將在額外實驗中檢驗。
本文所描述之結果證明，引入降低編碼引導RNA骨架之DNA的CpG含量的突變產生相對於引導骨架235之基因編輯的改良。 實例 13 ： 使用與來自 DNMT3A 及 DNMT3L 之 額外域融合的催化失活 CasX 抑制子系統誘導 B2M 基因座之持久沉默
進行實驗以確定經合理設計之LTRP構築體是否將活體外誘導內源性 B2M基因座之持久長期抑制，其中由轉錄抑制子域、來自DNMT3A之催化域及來自DNMT3L之相互作用域構成的三個抑制子域與催化失活CasX (dCasX) 491融合。另外，設計相對於dCasX含有不同表觀遺傳域置放的多種組態之LTRP分子，以評估其配置將如何影響 B2M基因座之沉默的持續時間以及其中靶甲基化活性之特異性。 材料及方法： LTRP 構築體之產生及慢病毒質體選殖 ：
使用標準分子選殖技術建構編碼LTRP分子之慢病毒質體構築體。此等構築體包含編碼催化失活CasX蛋白491 (dCasX491)之序列、來自ZNF10或ZIM3之KRAB域以及分別來自DNMT3A (D3A)及DNMT3L (D3L)之催化域及相互作用域。簡言之，構築體呈寡核苷酸排序且藉由重疊延伸PCR繼之以等溫組裝進行組裝。此等關鍵LTRP元件之胺基酸序列提供於表44中。所得質體含有以不同組態安置之構築體，以產生LTRP分子。LTRP分子之蛋白質序列列於表45中，且LTRP組態示於圖1。編碼LTRP分子之序列亦含有2×FLAG標籤。質體亦具有編碼具有靶向內源性 B2M基因座之間隔子或非靶向對照(表46中所列之間隔子序列)之gRNA骨架變異體174的序列。此等構築體均選殖於慢病毒質體上之P2A嘌呤黴素元件上游。中量提取經選殖及序列驗證之構築體且進行品質評估，之後在HEK293T細胞中轉染。 表 44 ： 用以產生 LTRP 變異體質體 ( 圖 1 中所繪示 ) 的 LTRP 組分 ( 例如與 CasX 融合之額外域 ) 的序列
組分 SEQ ID NO
ZNF10 KRAB域 3239
ZIM3 KRAB域 3240
DNMT3A催化域 3241
DNMT3L相互作用域 127
dCasX491 4
連接子1 123
連接子2 122
連接子3A 120
連接子3B
連接子4 121
NLS A 30
表 45 ： LTRP 分子之蛋白質序列
LTRP ID SEQ ID NO
1.A 3242
1.B 3243
2.A 3244
2.B 3245
3.A 3246
3.B 3247
4.A 3248
4.B 3249
5.A 3250
5.B 3251
表 46 ： 構築體中所用之間隔子的序列
間隔子ID 目標基因 PAM 序列 SEQ ID NO
7.37 B2M TTC GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG 3137
7.148 B2M NGG CGCGAGCACAGCUAAGGCCA 3101
0.0 非目標 N/A CGAGACGUAAUUACGUCUCG 3232
HEK293T 細胞之轉染：
HEK293T細胞以各孔30,000個細胞之密度接種於96孔盤中。次日，各孔使用脂染胺與100 ng LTRP變異體質體來短暫轉染，各變異體質體含有編碼以不同方式組態之LTRP蛋白(圖1)以及具有非靶向間隔子0.0或靶向B2M基因座之間隔子7.37的gRNA的構築體。特定言之，對於一個實驗，用編碼LTRP蛋白#1-3之質體轉染HEK293T細胞，且在第二實驗中，用編碼LTRP蛋白#1、#4及#5之質體脂質轉染細胞。在兩個實驗中，LTRP分子均具有來自ZNF10或ZIM3的KRAB域。實驗對照包括dCasX491 (具有或不具有ZNF10抑制子域)、催化活性CasX 491以及與ZNF10-KRAB域及DNMT3A/L域兩者融合的催化失活Cas9，以上各種與相同靶向B2M之gRNA或非靶向gRNA使用。重複三次測試各構築體。轉染後24小時，用1 μg/mL嘌呤黴素選擇細胞兩天。在轉染後六天開始，收集細胞以藉由經由HLA免疫染色繼之以流式細胞測量術分析B2M蛋白表現來每2-3天進行抑制分析。藉由使用將偵測細胞表面上表現之B2M依賴性HLA蛋白的抗體來測定B2M表現。使用Attune™ NxT流式細胞儀來量測HLA+細胞。另外，在單獨的實驗中，用LTRP變異體質體短暫轉染HEK293T細胞，且在脂質轉染後五天收集靶向 B2M之gRNA或非靶向gRNA，以進行基因體DNA (gDNA)提取以供亞硫酸氫鹽定序。 亞硫酸氫鹽定序以評估藉由目標基因座處之脫靶甲基化水平量測的 LTRP 特異性 ：
為測定B2M基因座處之脫靶甲基化水平，遵循製造商說明書使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus套組自所收集細胞提取gDNA。隨後遵循製造商之方案使用EZ DNA Methylation TM套組(Zymo)對所提取gDNA進行亞硫酸氫鹽轉化，將所有非甲基化胞嘧啶轉化成尿嘧啶。隨後使用下一代定序(NGS)對所得亞硫酸氫鹽處理的DNA進行定序，以測定 B2M及 VEGFA基因座處之脫靶甲基化的水平。 NGS 處理及分析：
利用對所關注的經亞硫酸氫鹽轉化目標位置(人類 B2M及 VEGFA基因座)具特異性的一組引子，經由PCR自100 ng亞硫酸氫鹽處理之DNA擴增目標擴增子。此等基因特異性引子在5'端含有額外序列以引入Illumina TM銜接子。利用Cytiva Sera-Mag Select DNA淨化套組來純化經擴增DNA產物。使用Fragment Analyzer DNA分析套組(Agilent，dsDNA 35-1500 bp)評估擴增子之品質及量化。根據製造商說明書在Illumina TMMiseq TM上對擴增子進行定序。使用Bismark亞硫酸氫鹽讀段定位程式(Bisulfite Read Mapper)及甲基化調用程式(Methylation caller)處理定序之原始fastq檔案。亞硫酸氫鹽處理之DNA之PCR擴增將所有尿嘧啶核苷酸轉化成胸腺嘧啶，且PCR產物之定序將測定胞嘧啶至胸腺嘧啶轉化速率，呈由各LTRP分子介導的 B2M及 VEGFA基因座處之潛在脫靶甲基化水平的讀段形式。 結果：
將編碼以不同方式組態之LTRP蛋白(圖1)的LTRP變異體質體短暫轉染至HEK293T細胞中，以確定經合理設計之LTRP分子是否可以遺傳方式活體外沉默目標B2M基因座之基因表現。圖32A及圖32B描繪時程實驗之結果，該時程實驗評估由LTRP蛋白#1-3介導之B2M蛋白抑制，該等LTRP蛋白之各者具有來自ZNF10 (圖32A)或ZIM3 (圖32B)之KRAB域。表47顯示在轉染後50天於各條件下表徵為HLA陰性(指示消耗B2M表現)的細胞之平均百分比。結果表明，所有具有靶向B2M基因座之gRNA的LTRP分子能夠活體外展現50天的持續B2M抑制，但抑制效力因KRAB域及LTRP組態之選擇而變化。舉例而言，具有ZIM3-KRAB域使得LTRP蛋白成為相比具有ZNF10-KRAB更有效之抑制子，且最明顯地觀測到LTRP #2之此作用(比較圖32A與圖32B)。此外，DNMT3A/L域定位於dCasX491之N端(LTRP #1)使得B2M表現之沉默與由dCasX491之C端處具有DNMT3A/L域之LTRP (LTRP #2及#3；圖32A及圖32B)介導的效應相比更穩定。此等結果亦顯示，兩種類型之抑制子域的相對定位(亦即LTRP #2之dCasX491-KRAB-DNMT3A/L與LTRP #3之dCasX491-DNMT3A/L-KRAB)亦可影響LTRP分子之總體效力，儘管兩種組態均為dCasX491之C端融合物(LTRP #2及#3；圖32A及圖32B)。
在第二時程實驗中，評估LTRP蛋白#1、#4及#5之持久B2M抑制，其中對於LTRP #4及#5，DNMT3A/L及KRAB域兩者定位於dCasX491之N端處(圖1)。表48顯示在脂質轉染後73天，各條件下之HLA陰性細胞之平均百分比。如第一時程中類似地可見，利用B2M靶向gRNA之所有LTRP條件維持B2M基因座之持沉默(圖33A及圖33B；表48)。實際上，此實驗中之結果表明，與LTRP #1或LTRP #4相比，LTRP #5能夠在活體外實現且持續最高水平的B2M抑制長達73天(圖33A及圖33B)。此外，含有ZIM3-KRAB之LTRP #4似乎亦勝過其LTRP #1對應物(圖33B)。對於上文論述之兩個時程實驗，CasX 491介導之編輯引起B2M表現之持久沉默，而僅使KRAB域與dCasX491融合的XR構築體(dCasX491-ZNF10)僅僅引起短暫B2M基因減量。 表 47 ： 轉染後 50 天量化的由 CasX 及 Cas9 分子以及 LTRP 構築體 #1-3 介導之 B2M 抑制的水平
分子 間隔子 HLA 陰性細胞% ( 平均值) 標準偏差
CasX 491 0.0 0.29 0.09
dCasX491 0.0 N/A N/A
dCasX491-ZNF10 0.0 0.40 0.18
dCas9-ZNF10-D3A/L 0.0 1.05 0.63
LTRP1-ZNF10 0.0 0.99 0.35
LTRP2-ZNF10 0.0 0.61 0.11
LTRP3-ZNF10 0.0 0.79 0.29
LTRP1-ZIM3 0.0 0.99 0.22
LTRP2-ZIM3 0.0 0.78 0.27
LTRP3-ZIM3 0.0 0.71 0.53
CasX 491 7.37 76.57 11.03
dCasX491 7.37 0.49 0.10
dCasX491-ZNF10 7.148 0.89 0.19
dCas9-ZNF10-D3A/L 7.148 57.30 17.36
LTRP1-ZNF10 (LTRP #1.B) 7.37 69.97 7.89
LTRP2-ZNF10 (LTRP #2.B) 7.37 36.87 8.31
LTRP3-ZNF10 (LTRP #3.B) 7.37 17.07 3.50
LTRP1-ZIM3 (LTRP #1.A) 7.37 73.70 9.28
LTRP2-ZIM3 (LTRP #2.A) 7.37 58.83 0.87
LTRP3-ZIM3 (LTRP #3.A) 7.37 17.50 4.30
表 48 ： 在轉染後 73 天量化的由 CasX 及 Cas9 分子以及 LTRP 構築體 #1 、 #4 及 #5 介導之 B2M 抑制的水平
分子 間隔子 HLA 陰性細胞% ( 平均值) 標準偏差
CasX 491 0.0 0.71 0.05
dCasX491 0.0 N/A N/A
dCasX491-ZNF10 0.0 0.76 0.12
dCas9-ZNF10-D3A/L 0.0 0.83 0.08
LTRP1-ZNF10 0.0 1.04 0.44
LTRP4-ZNF10 0.0 1.17 0.52
LTRP5-ZNF10 0.0 1.94 1.27
LTRP1-ZIM3 0.0 1.83 0.76
LTRP4-ZIM3 0.0 N/A N/A
LTRP5-ZIM3 0.0 1.15 0.26
CasX 491 7.37 73.30 8.43
dCasX491 7.37 0.83 0.16
dCasX491-ZNF10 7.148 1.37 0.37
dCas9-ZNF10-D3A/L 7.148 68.97 5.21
LTRP1-ZNF10 (LTRP #1.B) 7.37 48.27 3.66
LTRP4-ZNF10 (LTRP #4.B) 7.37 55.17 4.83
LTRP5-ZNF10 (LTRP #5.B) 7.37 60.77 8.12
LTRP1-ZIM3 (LTRP #1.A) 7.37 58.90 2.69
LTRP4-ZIM3 (LTRP #4.A) 7.37 69.00 6.58
LTRP5-ZIM3 (LTRP #5.A) 7.37 74.90 10.61
為評估由LTRP分子內之DNMT3A/L域介導的 B2M基因座處之脫靶CpG甲基化程度，使用自用含有ZIM3-KRAB域之LTRP蛋白#1-3處理且在脂質轉染後五天收集的HEK293T細胞提取的基因體DNA進行亞硫酸氫鹽定序。圖34繪示來自亞硫酸氫鹽定序之結果，具體顯示了在各實驗條件具有某一CpG甲基化水平之 B2M基因座之轉錄起始部位周圍的CpG部位的數目分佈。結果顯示，雖然證實LTRP #1具有最強中靶CpG甲基化活性(LTRP1-ZIM3 7.37)，但其誘導最高脫靶CpG甲基化水平(LTRP1-ZIM3 NT)。LTRP #2及LTRP #3展示較弱中靶CpG甲基化活性，但展示相對較低之脫靶甲基化(圖34)。圖35為散佈圖，繪製以CasX 491及dCas9-ZNF10-DNMT3A/L為基準的LTRP蛋白#1-3的活性-特異性概況，其中活性以第21天的HLA陰性細胞之平均百分比形式量測，且特異性由第5天量化的 B2M基因座處之脫靶CpG甲基化百分比表示。
藉由使用與先前針對圖34所使用相同的所提取gDNA進行亞硫酸氫鹽定序，評估不同基因座(亦即 VEGFA)處CpG甲基化之水平，從而進一步評估由DNMT3A/L域介導之脫靶CpG甲基化程度。圖36中之小提琴圖繪示亞硫酸氫鹽定序結果，其顯示在用含有ZIM3-KRAB域之LTRP蛋白#1-3以及 B2M靶向gRNA處理的細胞中，在 VEGFA基因座處具有CpG甲基化的CpG部位之分佈。該等結果進一步證實，使用LTRP #1引起最高水平之脫靶CpG甲基化，支援了早先在圖34中所示之資料。相比之下，使用LTRP #2或LTRP #3引起 -3基因座處的脫靶甲基化顯著降低(圖36)。
亦分析LTRP分子#1、#4及#5在 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化的程度。圖37A至圖37B中的圖繪示亞硫酸氫鹽定序結果，其顯示在用含有ZNF10或ZIM3-KRAB域之LTRP #1、#4及#5以及非靶向gRNA (圖37B)或靶向 B2M之gRNA (圖37A)處理的細胞中， VEGFA基因座處之CpG甲基化部位之分佈。圖37B中之資料顯示，與使用LTRP1-ZNF10或LTRP1-ZIM3相比，使用LTRP4-ZNF10、LTRP5-ZFN10或LTRP5-ZIM3引起 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化明顯降低。類似地，圖37A中之資料顯示，與使用LTRP1-ZNF10相比，使用具有任一KRAB域之LTRP #4或LTRP #5使得脫靶CpG甲基化部位之水平顯著降低。如圖37A及圖37B兩者中所展現，LTRP #1展示之非特異性CpG甲基化水平與dCas9-ZNF10-DNMT3A/L基準所實現之水平相當。
圖38為散佈圖，繪製以CasX 491及dCas9-ZNF10-DNMT3A/L為基準的含有ZNF10-KRAB域或ZIM3-KRAB域之LTRP分子#1-5的活性-特異性概況，其中活性以第21天的HLA陰性細胞之平均百分比形式量測，且特異性由第5天偵測到的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之中值百分比表示。資料顯示，所評估的五種LTRP分子中，使用LTRP #5引起最高水平之抑制活性，而使用LTRP #4引起最強水平之特異性。
實驗證實，經合理工程改造之LTRP分子能夠以轉錄方式及可遺傳方式抑制內源性 B2M基因座，使得持續消耗目標蛋白。該等發現亦顯示，選擇KRAB域以及DNMT3A/L域之位置及相對組態可影響LTRP分子在持久沉默目標基因座方面的總體效力及特異性。 實例 14 ： 證實包括 來自 DNMT3A 之 ADD 域增強了 LTRP 分子之活性及特異性
除其C端甲基轉移酶域以外，DNMT3A亦含有調控其功能及對染色質之募集的兩個N端域：ADD域及PWWP域。據報導，PWWP域與甲基化組蛋白尾(包括H3K36me3)相互作用。已知ADD域具有兩個關鍵功能：1)其藉由充當甲基轉移酶自身抑制域異位調控DNMT3A之催化活性，且2)其識別未甲基化H3K4 (H3K4me0)。ADD域與H3K4me0標記物之相互作用顯露DNMT3A之催化部位，從而向染色質募集活性DNMT3A以重新實施此等部位處之甲基化。
鑒於ADD域之此等功能，進行實驗以評估將ADD域併入LTRP #5構築體中(先前描述於實例13中)是否將使目標基因座之長期抑制改良及脫靶甲基化降低。亦評估併入PWWP域與ADD域對LTRP活性及特異性之效應。 材料及方法： LTRP 構築體之產生及質體選殖：
使用標準分子選殖技術構建編碼具有ZIM3-KRAB域之LTRP #5構築體之變異體(LTRP #5.A；LTRP #5組態參見圖1)的質體構築體。所得構築體包含編碼LTRP5-ZIM3之以下四個替代變異體中之一者的序列，其中併入額外DNMT3A域：1) LTRP5-ZIM3 + ADD；2) LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP；3) LTRP5-ZIM3 + ADD，無DNMT3A催化域；及4) LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP，無DNMT3A催化域。LTRP5-ZIM3分子及其變異體內之關鍵元件的序列列於表49中，其中各LTRP5-ZIM3及其變異體之全長蛋白序列列於表50中。圖45為示意圖，其繪示在此實例中分析之各種LTRP #5架構。編碼LTRP分子之序列亦含有2×FLAG標籤。質體亦具有編碼具有靶向內源性 B2M基因座之間隔子或非靶向對照(表51中所列之間隔子序列)之gRNA骨架變異體174的構築體。 表 49 ： 用以產生圖 45 中所繪示之 LTRP5 變異體質體的 LTRP 組分 ( 例如與 dCasX 融合之額外域 ) 的序列
組分 胺基酸序列 SEQ ID NO
ZIM3 KRAB域 3240
DNMT3A催化域(CD) 126
DNMT3L相互作用域 127
dCasX491 4
連接子1 123
連接子2 122
連接子3A' 124
連接子3B 120
連接子4 121
NLS A 30
NLS B
DNMT3A ADD域 125
DNMT3A PWWP域 3252
DNMT3A PWWP與ADD域之間的內源序列(endo) 3253
表 50 ： 在此實例中分析之 LTRP5 變異體之蛋白序列
LTRP ID 胺基酸序列 SEQ ID NO
LTRP5-ZIM3 3131
LTRP5-ZIM3 + ADD 3132
LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP 3254
LTRP5-ZIM3 + ADD - CD 3255
LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP - CD 3256
表 51 ： 構築體中所用之間隔子的序列
間隔子ID 目標基因 序列 SEQ ID NO
0.0 非目標 CGAGACGUAAUUACGUCUCG 3232
7.37 B2M GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG 3137
7.160 B2M UAAACAUCACGAGACUCUAA 3113
7.165 B2M UCCCUAUGUCCUUGCUGUUU 3114
HEK293T 細胞 之轉染：
用100 ng LTRP5變異體質體短暫轉染所接種HEK293T細胞，該等質體各自含有編碼LTRP5-ZIM3之LTRP:gRNA構築體或其替代變異體中之一者(圖45；序列見表50)，其中gRNA具有非靶向間隔子0.0或靶向 B2M之間隔子(間隔子序列見表51)。間隔子7.160及7.165已展示當與LTRP一起使用而非與由融合至ZIM3 KRAB域之dCasX製成之dXR一起使用時可抑制 B2M基因座(資料未示出)。重複三次測試各構築體。轉染後24小時，用1 μg/mL嘌呤黴素選擇細胞三天。在轉染後第5天、第12天、第21天及第51天收集細胞用於抑制分析。簡言之，藉由如實例13中所描述經由HLA免疫染色繼之以流式細胞測量術分析B2M蛋白表現來進行抑制分析。另外，在轉染後七天收集經LTRP5變異體質體及靶向 B2M之gRNA或非靶向gRNA短暫轉染之HEK293T細胞，用於進行供亞硫酸氫鹽定序之gDNA提取，以評估 VEGFA基因座處之脫靶甲基化，該操作如實例13中所描述進行。 結果：
評估將ADD域伴隨或不伴隨PWWP域併入至LTRP5分子中對目標 B2M基因座之長期抑制增加及脫靶甲基化減少的影響。用靶向 B2M之gRNA (具有間隔子7.37以及LTRP特異性間隔子7.160及7.165)或非靶向gRNA評估LTRP5-ZIM3分子之變異體，且結果描繪於圖39至圖42中之圖中。圖39顯示，當與LTRP5-ZIM3、LTRP5-ZIM3 + ADD及LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP配對時，使用間隔子7.37產生飽和水平之抑制活性，使得評估LTRP5變異體之間的活性差異更具有挑戰性。然而，當使用間隔子7.160及7.165時，LTRP5變異體之間的抑制活性差異更明顯(圖40及圖41)。資料證實，與用其他LTRP5-ZIM3分子實現之抑制水平相比，當與兩個LTRP特異性間隔子配對時，併入ADD域引起長期抑制之顯著增加。同時，併入ADD及PWWP域兩者並不引起 B2M基因座之抑制改良，尤其與基線LTRP5-ZIM3分子相比。如所預期，無DNMT3A催化域之兩個LTRP5變異體展現不良長期抑制。此外，圖42指示，相對於基線LTRP5-ZIM3分子，鑒於觀測到較低百分比之HLA陰性細胞，添加ADD域似乎使得特異性提高。
使用亞硫酸氫鹽定序評估可能由LTRP5變異體介導的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化。圖43描繪亞硫酸氫鹽定序之結果，具體顯示 VEGFA基因座周圍之CpG甲基化之百分比。結果證實，對於所有靶向 B2M之gRNA以及非靶向gRNA，將ADD域併入LTRP5-ZIM3分子中皆顯著降低 VEGFA基因座處之脫靶甲基化水平(圖43)。圖44為散佈圖，繪製在此實例中研究之LTRP5-ZIM3變異體的活性-特異性概況，其中活性以與間隔子7.160配對時在第21天之HLA陰性細胞之平均百分比形式量測，且特異性由與間隔子7.160配對時在第7天量化的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化百分比表示。散佈圖清楚顯示，添加ADD域使LTRP5分子之活性相對於無ADD域之基線ELX5分子顯著提高(圖44)。
實驗證實，包括DNMT3A ADD域但不包括ADD及PWWP域可改良LTRP分子之抑制活性及特異性。在多種gRNA之情況下觀測到活性及特異性之增強，證實將ADD域併入LTRP中的重要性。 實例 15 ： 證實將來自 DNMT3A 之 ADD 域納入 LTRP 中會 增強中靶活性且減少脫靶甲基化
進行實驗以評估將ADD域併入先前於實例13中描述的具有組態#1、#4及#5之LTRP分子中對目標基因座之長期抑制及脫靶甲基化的影響。 材料及方法： LTRP 構築體之產生及質體選殖 ：
使用標準分子選殖技術構建編碼具有組態#1、#4及#5、具有ZNF10-KRAB或ZIM3-KRAB域及DNMT3A ADD域的LTRP分子之質體構築體。所得LTRP分子之序列列於表52中，其亦顯示特定LTRP分子之縮寫構築體名稱(例如LTRP #1 .A、LTRP #1 .B)。圖46為示意圖，其繪示LTRP組態#1、#4及#5的併入有ADD域之LTRP分子之通用架構。編碼LTRP分子之序列亦含有2×FLAG標籤。質體亦具有編碼具有靶向內源性 B2M基因座之間隔子或非靶向對照(表51中所列之間隔子序列)之gRNA骨架174的序列。 表 52 ： 在此實例中分析之各種 LTRP #1 、 #4 及 #5 變異體的蛋白質序列
LTRP # 域 胺基酸序列 SEQ ID NO
LTRP #1 ZNF10-KRAB、DNMT3A ADD、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #1.D) 3257
ZIM3-KRAB、DNMT3A ADD、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #1.C) 3258
ZNF10-KRAB、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #1.B) 3259
ZIM3-KRAB、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #1.A) 3066
LTRP #4 ZNF10-KRAB、DNMT3A ADD、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #4.D) 3260
ZIM3-KRAB、DNMT3A ADD、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #4.C) 3261
ZNF10-KRAB、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #4.B) 3262
ZIM3-KRAB、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #4.A) 3263
LTRP #5 ZNF10-KRAB、DNMT3A ADD、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #5.D) 3264
ZIM3-KRAB、DNMT3A ADD、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #5.C) 3132
ZNF10-KRAB、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #5.B) 3265
ZIM3-KRAB、DNMT3A CD、DNMT3L相互作用 (LTRP #5.A) 3131
HEK293T 細胞 之轉染：
用100 ng LTRP變異體質體短暫轉染所接種HEK293T細胞，該等質體各自含有編碼LTRP分子(表52；圖46)之LTRP:gRNA構築體，其中gRNA具有非靶向間隔子0.0或靶向 B2M之間隔子(表51)。重複三次測試各構築體。轉染後24小時，用1 μg/mL嘌呤黴素選擇細胞3天。收集細胞以在轉染後第8天、第13天、第20天及第27天用於抑制分析。簡言之，藉由如實例13中所描述經由HLA免疫染色繼之以流式細胞測量術分析B2M蛋白表現來進行抑制分析。另外，亦在轉染後第5天收集細胞，用於進行供亞硫酸氫鹽定序之gDNA提取，以評估非目標 VEGFA基因座處之脫靶甲基化，該操作使用與如實例13中所描述類似之方法進行。 結果：
評估將ADD域併入至具有組態#1、#4或#5 (參見圖2)、具有ZNF10或ZIM-KRAB的分子中對 B2M基因座之長期抑制及脫靶甲基化的影響。用靶向 B2M之gRNA或非靶向gRNA測試LTRP分子，且結果描繪於圖47A至圖50B中之圖表中。資料證實，當使用間隔子7.160時，將ADD域併入LTRP分子中明顯使得含有ZIM3-KRAB之所有LTRP組態在所有時間點之B2M抑制顯著增加(圖47A)，且在使用間隔子7.165及7.37時觀測到類似發現(資料未顯示)。圖47B顯示當與具有間隔子7.160之gRNA配對時，使用含有ZNF10或ZIM3-KRAB之LTRP #5後所得的B2M抑制；資料證實，包括ADD域總體上增加持久B2M抑制，其中LTRP5-ZIM3 + ADD具有比LTRP5-ZNF10 + ADD高之活性。針對LTRP #1及LTRP #4以及其他兩個間隔子，觀測到類似時程發現(資料未展示)。圖47C顯示當與三種靶向 B2M之gRNA中之任一者配對時，在使用含有ZIM3-KRAB之LTRP #5後所得的B2M抑制，且資料證實，包括ADD域總體上引起較高之B2M抑制。針對LTRP #1及LTRP #4，亦觀測到類似時程發現(資料未展示)。
圖48A至圖48C顯示所有LTRP組態及所測試gRNA在第27天時間點的所得B2M抑制。結果顯示與使用間隔子7.37相比，使用次佳間隔子7.160及7.165之B2M抑制的增加更加顯著。此外，使用在分子之N端含有DNMT3A及DNMT3L域的LTRP #1及LTRP #5使得B2M抑制在添加DNMT3A ADD域後增加最多(圖48A至圖48C)。使用在KRAB域之3'及dCasX之5'具有DNMT3A/3L域的LTRP #4引起較少活性提高，其可歸因於ADD域與染色質適當相互作用之能力下降。
藉由使用亞硫酸氫鹽定序剖析 VEGFA基因(脫靶基因座)處之CpG甲基化水平來測定LTRP分子之特異性，且資料繪示於圖49A至圖52B中。資料證實，包括DNMT3A ADD域引起所有所測試條件的 VEGFA基因座之脫靶甲基化顯著減少(圖49A至圖49C)。值得注意的是，由包括ADD域介導的特異性提高對於LTRP #1及LTRP #5組態最為顯著，該等兩個組態在分子之N端末端具有DNMT3A/3L域。有趣的是，含有ZIM3-KRAB域之LTRP分子引起 VEGFA基因座之更強脫靶甲基化。此外，即使在不存在ADD域之情況下，使用LTRP #4及#5組態產生之特異性比使用LTRP #1組態高。與LTRP1-ZIM3及LTRP4-ZIM3組態相比，將ADD域包括於LTRP5-ZIM3中引起最低之脫靶甲基化。
圖50A至圖52B為一系列散佈圖，繪製各種LTRP分子之活性-特異性概況，其中活性以第27天的HLA陰性細胞之平均百分比形式量測，且特異性由第5天 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化百分比表示。資料證實，在所測試之所有三個 B2M靶向間隔子中，包括ADD域使得中靶B2M抑制增加且 VEGFA基因座處之脫靶甲基化減少。具有#1及#5組態之LTRP分子在所測試之各間隔子下展現活性及特異性之最大提高。
在此實例中論述之實驗結果支援實例14中之發現，亦即資料證實，包括DNMT3A ADD域會增強早期時間點之抑制強度及沉默跨細胞分裂之遺傳可能性，且減少由LTRP分子中之DNMT3A催化域引發的脫靶甲基化。資料亦確證，不同LTRP組態之特異性具有固有差異，其可因使用更強效KRAB域而加劇。此特異性降低可藉由包括DNMT3A ADD域而減輕，其亦可總體上引起更多中靶抑制。認為抑制活性之提高係由DNMT3A ADD域識別H3K4me0的功能及至染色質之後續募集介導。認為特異性提高係經由DNMT3A ADD域在不存在H3K4me0結合之情況下誘導DNMT3A之催化域之異位抑制的功能介導。結果亦突顯，將ADD域定位於不同所測試組態中對於實現LTRP分子之特異性及活性的最強提高十分重要。 實例 16 ： 證實 dXR 對 HBEGF 之有效性以進行高通量篩選
進行實驗以確定使用dXR構築體高通量篩選哺乳動物細胞中之分子的可行性。 材料及方法：
將HEK293T細胞以300,000個細胞/孔接種於6孔盤中且用1 µg編碼CasX分子(491)、具有ZNF10-KRAB抑制子域的催化失活CasX 491 (dXR)以及含靶向 HBEGF基因之間隔子或非靶向間隔子之引導骨架174 (SEQ ID NO: 1744)的質體脂質轉染。將基於CasX之分子與具有指定間隔子(表53)之gRNA的五個組合轉染至五個單獨的孔中。HBEGF為介導白喉毒素之進入的受體，白喉毒素在添加至細胞時抑制轉譯且引起細胞死亡。用CasX或dXR分子及靶向gRNA來靶向 HBEGF基因應防止毒素進入且允許細胞存活，而用CasX及dXR分子以及非靶向gRNA處理之細胞不宜存活。轉染後一天，將各經轉染孔中之細胞分到96孔盤中之12個不同孔中且用嘌呤黴素選擇。歷經三天，用六種不同濃度之白喉毒素(0、0.2、2、20、200及2000 ng/mL)處理細胞，且進行生物學重複。再過兩天後，將細胞分離至新鮮培養基中，且在ImageXpress Pico自動化細胞成像系統上量測總細胞計數。 表 53 ： 所測試間隔子之序列
間隔子ID RNA 序列 SEQ ID NO 分子
34.19 ACUGGGAGGCUCAGCCCAUG 3266 CasX
34.21 UGUUCUGUCUUGAACUAGCU 3267 CasX
34.28 UGAGUGUCUUGUCUUGCUCA 3268 dXR
0.0 CGAGACGUAAUUACGUCUCG 3232 CasX及dXR
結果：
白喉毒素分析之結果展示於圖53中之圖中。dXR介導之 HBEGF基因之抑制使得細胞存活，但僅在低劑量(0.2-20 ng/mL)之毒素下存活。然而，彼等相同劑量引起用非靶向構築體處理之對照細胞之全部細胞死亡。高劑量(＞ 20 ng/mL)之毒素引起dXR及對照樣品兩者中之細胞死亡，表明dXR允許之基礎轉錄水平允許充足的毒素進入且觸發細胞死亡。結果顯示，經CasX編輯之細胞仍受保護，因為基因座之編輯使得功能蛋白完全損耗。非靶向對照在所有劑量下死亡，證實了毒素在HBEGF未經抑制或編輯時的功效。
結果顯示，dXR在低劑量之毒素下具有保護作用，證實可在0.2-20 ng/mL白喉毒素之範圍內篩選此構築體，在0.2 ng/mL下觀測到dXR與對照之間的最高倍數富集。應注意，雖然CasX在所有劑量下具有保護作用，但dXR之抑制仍誘導目標之低基礎表現，從而在高劑量之毒素下引起細胞毒性。 實例 17 ： 開發選擇流程以識別包括於抑制子融合蛋白中之改良抑制子域。為產生更佳之LTRP融合蛋白構築體，在選擇分析中測試來自許多非人類物種之轉錄效應域庫。由於KRAB域為脊椎動物中之最大及進化最快的域之一，預期來自先前未評估之物種的抑制子域提供經改良之強度及持久性抑制。 材料及方法： 候選抑制子域之識別 ：
藉由下載所有標註有Prosite寄存編號ps50805 (KRAB域之寄存編號)的序列來鑑別KRAB域的同源物。所有域均擴展100個胺基酸(其中標註集中在中間)以包括可能未標註之功能序列。另外，對來自所描述的近期完成之長讀段靈長類動物基因體組裝之比對的一組高品質靈長類動物標註運行HMMER，其為一種識別域之工具(Warren, WC.等人, Sequence diversity analyses of an improved rhesus macaque genome enhance its biomedical utility. Science 370, Issue 6523, eabc6617in (2020)；Fiddes, IT.等人, Comparative Annotation Toolkit (CAT)-simultaneous clade and personal genome annotation. Genome Res. 28(7):1029 (2018)；Mao, Y.等人, A high-quality bonobo genome refines the analysis of hominid evolution. Nature 594:77 (2021))，以識別此等組裝中之域，其中大多數不存在於UniProt中。搜尋產生來自159種不同生物體之32,120個獨特序列，測試其在轉錄抑制中之效力。另外，將長度為80個殘基的580個隨機胺基酸序列作為陰性對照包括於庫中，且基於Tycko, J.等人之工作包括304個人類KRAB域( Cell. 2020 Dec 23;183(7):2020-2035)。 篩選方法：
上文所描述之域經合成為DNA寡核苷酸，擴增且選殖至dCasX491 C端GS連接子慢病毒構築體以及間隔子34.28及引導骨架174 (SEQ ID NO: 1744)中，以抑制 HBEGF且賦予如上文實例16中所描述之白喉毒素選擇中的存活。對於各域，C端GS連接子經同義取代以產生特有DNA條形碼，該等DNA條形碼可藉由NGS區分，從而允許在各合併實驗中評估內部技術重複。此等質體用於產生庫之慢病毒構築體。
轉導HEK293T細胞，用1 µg/mL嘌呤黴素處理以移除未經轉導之細胞，且在2 ng/mL白喉毒素下進行選擇48小時。gDNA經提取、擴增及定序，如上文所描述。gDNA樣品亦自細胞提取、擴增且定序，隨後用白喉毒素進行選擇，以作為對照。對白喉毒素選擇兩者進行兩次獨立重複。 B2M 抑制之評估：
將代表性域選殖至dCasX491 C端GS連接子慢病毒構築體以及具有靶向 B2M基因座之間隔子7.15 (GGAAUGCCCGCCAGCGCGAC；SEQ ID NO: 3110)的引導骨架316 (SEQ ID NO: 1746)。單獨地，將代表性域選殖至dCasX491 C端GS連接子慢病毒構築體以及具有靶向 B2M基因座之間隔子7.37 (GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG；SEQ ID NO: 3137)的引導骨架174 (SEQ ID NO: 1744)。使用標準分子選殖技術產生編碼具有各種域之dXR的慢病毒質體構築體。此等構築體包括編碼dCasX491之序列及來自ZNF10、ZIM3或庫中所測試域之一的KRAB域。中量提取經選殖及序列驗證之構築體且進行品質評估，之後在HEK293T細胞中轉染。
HEK293T細胞以各孔30,000個細胞之密度接種於96孔盤中。次日，使用脂染胺與100 ng dXR質體短暫轉染各孔，各質體含有具有不同域之dXR構築體及具有靶向 B2M基因座之間隔子的gRNA。實驗對照包括具有來自ZNF10或ZIM3之KRAB域、在庫中但不在前95或1597個最有效抑制子之域、或dCas9-ZNF10的dXR構築體，各具有對應靶向 B2M之gRNA。重複三次測試各構築體。轉染後24小時，用1 μg/mL嘌呤黴素選擇細胞兩天。轉染後七天或十天，收集細胞以藉由經由HLA免疫染色繼之以流式細胞測量術分析B2M蛋白表現來進行編輯抑制分析。藉由使用將偵測細胞表面上表現之B2M依賴性HLA蛋白的抗體來測定B2M表現。使用Attune™ NxT流式細胞儀來量測HLA+細胞。 資料分析：
為理解所測試之庫中蛋白質序列之多樣性，將進化規模模型化(evolutionary scale modeling；ESM)變換器(ESM-1b)應用於32,120個域胺基酸序列之初始庫以產生序列之高維表示(Rives, A.等人, Proc Natl Acad Sci USA. 2021年4月13;118(15))。接下來，應用均勻流形近似與投影(UMAP)將資料集縮減為序列多樣性的二維表示(McInnes, L., Healy, J., ArXiv e-prints1802.03426, 2018)。使用此技術，鑑別75個域序列群集。
蛋白質序列模體係使用STREME演算法(Bailey, T., Bioinformatics. 2021年3月24;37(18):2834-2840)以識別富集強抑制子的模體。 結果：
進行選擇以自32,120個特有序列之庫鑑別出域，該等特有序列為最強效轉錄抑制子。為各條形碼-域對計算選擇前後庫中各域之豐度的變化倍數，使得實驗之兩個獨立重複一起表示各域之適合度的12次量測。
圖54顯示整個庫之log 2(變化倍數)值之範圍、充當陰性對照之隨機化序列、KRAB域之陽性對照集合，顯示該等KRAB域在由Tycko等人進行之HT募集實驗之第5天具有大於1之log 2(變化倍數)( Cell. 2020 Dec 23;183(7):2020-2035)。如圖54中所示，白喉毒素選擇成功地富集作為更強效轉錄抑制子之域。在選擇後自庫去富集陰性對照序列。
為鑑別可再現地富集於選擇後庫中的域，設定小於0.01之p值臨限值及大於2之log 2(變化倍數)。1597個域符合此等準則。經由MAGeCK演算法計算p值，該演算法對多個測試使用置換檢驗及假髮現率調整(Wei, L.等人, Genome Biol. 2014;15(12):554)。此等前1597個抑制子域之log 2(變化倍數)值顯示於圖54中，且胺基酸序列、p值及log 2(變化倍數)值提供於下表54中。相比之下，ZIM3具有1.7787之log 2(變化倍數)，標準ZNF10具有1.3637之log 2(變化倍數)，且用於Tycko, J.等人的對應於ZNF10 KRAB域之替代ZNF10( Cell. 2020 Dec 23;183(7):2020-2035)具有1.6182之log 2(變化倍數)。因此，前1597個抑制子域為實質上優於ZNF10及ZIM3之轉錄抑制子。許多此等靠前抑制子域含有具有殘基之胺基酸，預測與ZIM3及ZNF10相比，該等抑制子域使與Trim28蛋白之相互作用穩定(Stoll, G.A.等人, bioRxiv 2022.03.17.484746)。
為了進一步縮小抑制子域的範圍，同時保持胺基酸序列多樣性的廣度，藉由自各群集中選擇最有效的抑制子自1597個抑制子域中選擇了一組95個抑制子域，以及1597個最佳抑制子中的前25個，如表54所示。 表 54 ： 來自評估 dXR 對 HBEGF 基因之抑制的高通量篩選中識別之 1,597 個候選抑制子域的清單以及後續應用的以下準則 ： p 值 ＜0.01 且 log 2 ( 變化倍數 ) ＞2
域 ID 物種 SEQ ID NO Log2 ( 變化倍數 ) P 值
前 95 個最有效抑制子域
域_7694 野鴿(Columba livia) 130 3.7111 1.13E-04
域_10123 褐家鼠(Rattus norvegicus) 131 3.6356 8.11E-06
域_15507 巴拿馬卷尾猴(Cebus imitator) 132 3.8531 1.53E-07
域_17905 黑猩猩(Chimp) 133 2.5038 5.60E-04
域_20505 西非綠猴(Chlorocebus sabaeus) 134 3.4989 2.91E-06
域_26749 眼鏡王蛇(Ophiophagus hannah) 135 5.4323 1.53E-07
域_27604 大熊貓(Ailuropoda melanoleuca) 136 2.8198 6.05E-05
域_29304 東方鹿鼠(Peromyscus maniculatus bairdii) 137 4.0496 1.53E-07
域_30173 蒼白矛鼻蝠(Phyllostomus discolor) 138 2.2538 5.41E-04
域_737 倭黑猩猩(Bonobo) 139 4.544 1.53E-07
域_10331 東非安哥拉黑白疣猴(Colobus angolensis palliatus) 140 3.6796 1.53E-07
域_10948 東非安哥拉黑白疣猴 141 3.2959 2.30E-06
域_11029 鬼狒(Mandrillus leucophaeus) 142 3.5748 1.53E-07
域_17358 印度牛x歐洲牛(Bos indicus x Bos taurus) 143 4.9878 1.53E-07
域_17759 家貓(Felis catus) 144 3.3159 1.38E-06
域_18258 抹香鯨(Physeter macrocephalus) 145 3.75 3.42E-04
域_19804 北方海狗(Callorhinus ursinus) 146 3.8217 1.53E-07
域_221 倭黑猩猩 147 3.5533 3.06E-06
域_881 倭黑猩猩 148 4.3546 4.59E-07
域_2380 紅毛猩猩(Orangutan) 149 3.2024 1.74E-04
域_2942 長臂猿(Gibbon) 150 3.3658 1.38E-06
域_4687 狨猴(Marmoset) 151 5.2288 3.22E-06
域_4806 狨猴 152 3.3896 1.58E-04
域_4968 狨猴 153 3.0315 0.0022262
域_5066 狨猴 154 2.9062 0.0067409
域_5290 梟猴(Owl Monkey) 155 3.0993 5.16E-05
域_5463 梟猴 156 3.2102 0.0022788
域_6248 亞馬遜松鼠猴(Saimiri boliviensis boliviensis) 157 2.4415 0.0056883
域_6445 揚子江鱷(Alligator sinensis) 158 3.1151 4.51E-04
域_6802 玉米蛇(Pantherophis guttatus) 159 3.0403 5.18E-04
域_6807 非洲爪蟾(Xenopus laevis) 160 3.1615 5.16E-05
域_7255 單色蚯蚓(Microcaecilia unicolor) 161 4.5265 1.38E-06
域_8503 田鼷鼠(Mus caroli) 162 2.8193 0.003503
域_8790 美洲旱獺(Marmota monax) 163 2.7436 2.06E-04
域_8853 金倉鼠(Mesocricetus auratus) 164 4.6199 1.53E-07
域_9114 東方鹿鼠 165 2.2058 0.0048423
域_9331 東方鹿鼠 166 4.1063 4.59E-07
域_9538 小家鼠(Mus musculus) 167 3.5443 1.20E-04
域_9960 八齒鼠(Octodon degus) 168 3.4751 1.07E-06
域_10277 奧氏更格盧鼠(Dipodomys ordii) 169 2.8257 4.16E-04
域_10577 東非安哥拉黑白疣猴 170 4.1248 1.53E-07
域_11348 西非綠猴 171 3.3651 2.95E-05
域_11386 家山羊(Capra hircus) 172 3.7637 4.75E-06
域_11486 野犛牛(Bos mutus) 173 4.8326 1.53E-07
域_11683 白頰長臂猿(Nomascus leucogenys) 174 2.9249 0.0015672
域_12292 野豬(Sus scrofa) 175 4.3194 1.53E-07
域_12452 長江江豚(Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis) 176 3.8774 5.05E-06
域_12631 長尾獼猴(Macaca fascicularis) 177 3.6926 1.53E-07
域_13331 長尾獼猴 178 3.5154 2.15E-04
域_13468 無尾熊(Phascolarctos cinereus) 179 4.1548 1.38E-06
域_13539 大猩猩(Gorilla) 180 3.4924 1.79E-05
域_14659 獵豹(Acinonyx jubatus) 181 4.0495 1.06E-05
域_14755 巴拿馬卷尾猴 182 3.1667 1.88E-04
域_15126 白鬢狨(Callithrix jacchus) 183 2.9781 4.08E-04
域_16444 獵豹 184 3.2246 2.30E-06
域_16688 白鱀豚(Lipotes vexillifer) 185 3.5601 4.26E-05
域_16806 黑帽懸猴(Sapajus apella) 186 3.9386 1.53E-07
域_17317 小耳大嬰猴(Otolemur garnettii) 187 3.4551 1.81E-04
域_17432 小耳大嬰猴 188 3.11 1.36E-05
域_18137 負鼠(Monodelphis domestica) 189 3.292 3.51E-05
域_18216 抹香鯨 190 3.0602 9.40E-04
域_18563 梟猴 191 3.0406 0.0034849
域_19229 阿拉斯加海獺(Enhydra lutris kenyoni) 192 4.0294 5.01E-05
域_19460 負鼠 193 3.995 1.97E-05
域_19476 梟猴 194 4.1343 1.53E-07
域_19821 川金絲猴(Rhinopithecus roxellana) 195 3.583 1.53E-07
域_19892 北極熊(Ursus maritimus) 196 3.1396 5.21E-04
域_19896 綿羊(Ovis aries) 197 2.2228 1.58E-04
域_19949 北方海狗 198 3.2903 2.62E-04
域_21247 美洲水鼬(Neovison vison) 199 2.741 0.0043129
域_21317 馬來大狐蝠(Pteropus vampyrus) 200 4.0893 1.18E-05
域_21336 家馬(Equus caballus) 201 2.738 0.005135
域_21603 白鱀豚 202 2.8535 4.35E-04
域_21755 家馬 203 3.1889 0.0028238
域_22153 加州海獅(Zalophus californianus) 204 3.6967 3.52E-06
域_22270 倭黑猩猩 205 2.3813 0.0030391
域_23394 小羊駝(Vicugna pacos) 206 4.0769 3.06E-07
域_23723 菲律賓眼鏡猴(Carlito syrichta) 207 3.5301 8.71E-05
域_24125 亞馬遜松鼠猴 208 3.9692 1.53E-07
域_24458 伊比利亞猞猁(Lynx pardinus) 209 3.4012 9.66E-05
域_24663 布氏鼠耳蝠(Myotis brandtii) 210 2.9806 1.49E-04
域_25289 北極熊 211 3.4113 7.70E-05
域_25379 黑帽懸猴 212 3.5892 1.53E-07
域_25405 吸血蝠(Desmodus rotundus) 213 3.8846 3.20E-05
域_26070 連加蓬蚓螈(Geotrypetes seraphini) 214 3.7958 1.53E-07
域_26322 連加蓬蚓螈 215 2.9265 7.13E-04
域_26732 野生火雞(Meleagris gallopavo) 216 2.7548 0.0057183
域_27060 沙漠龜(Gopherus agassizii) 217 2.7943 0.0029172
域_27385 八齒鼠 218 4.1339 2.77E-05
域_27506 野犛牛 219 3.8121 4.29E-06
域_27811 白鬢狨 220 2.9728 8.34E-05
域_28640 山齒鶉 221 3.624 4.13E-06
域_28803 負鼠 222 3.0697 2.07E-05
域_30661 抹香鯨 223 2.15 4.76E-05
域_31643 南美珊瑚蛇(Micrurus lemniscatus lemniscatus) 224 3.8782 3.57E-04
前 1597 個最有效抑制子域中的剩餘抑制子域
域_10870 小羊駝 225 2.5964 0.004315
域_10918 太平洋海象(Odobenus rosmarus divergens) 226 3.2079 9.21E-04
域_92 倭黑猩猩 227 2.1475 0.0021413
域_98 倭黑猩猩 228 2.7848 0.0055875
域_134 倭黑猩猩 229 2.9322 0.004676
域_143 倭黑猩猩 230 3.63 3.17E-05
域_145 倭黑猩猩 231 3.1497 4.09E-05
域_214 倭黑猩猩 232 2.1073 0.00941
域_225 倭黑猩猩 233 2.259 0.0013991
域_226 倭黑猩猩 234 3.0188 2.76E-04
域_235 倭黑猩猩 235 2.9615 0.0016622
域_302 倭黑猩猩 236 2.5092 0.0033327
域_313 倭黑猩猩 237 2.4558 0.0049862
域_344 倭黑猩猩 238 2.4948 0.0087725
域_362 倭黑猩猩 239 3.6736 2.38E-04
域_382 倭黑猩猩 240 3.1625 0.0019781
域_389 倭黑猩猩 241 3.011 3.42E-04
域_407 倭黑猩猩 242 3.8312 1.59E-04
域_418 倭黑猩猩 243 3.2429 1.37E-04
域_419 倭黑猩猩 244 3.5913 5.13E-05
域_421 倭黑猩猩 245 3.2969 1.06E-05
域_451 倭黑猩猩 246 3.0774 0.0018269
域_504 倭黑猩猩 247 3.2187 4.17E-04
域_516 倭黑猩猩 248 2.0448 0.0018554
域_621 倭黑猩猩 249 2.1025 0.0034678
域_623 倭黑猩猩 250 3.3299 6.50E-04
域_624 倭黑猩猩 251 2.8281 0.0031625
域_629 倭黑猩猩 252 3.6318 1.09E-05
域_668 倭黑猩猩 253 2.9256 6.60E-04
域_718 倭黑猩猩 254 3.9 8.73E-06
域_731 倭黑猩猩 255 2.1318 0.0058273
域_749 倭黑猩猩 256 3.1162 0.0060655
域_759 倭黑猩猩 257 3.3019 0.0046077
域_761 倭黑猩猩 258 3.181 9.64E-04
域_784 倭黑猩猩 259 2.4886 0.0083818
域_801 倭黑猩猩 260 2.4863 0.0040602
域_802 倭黑猩猩 261 2.6563 5.66E-04
域_811 倭黑猩猩 262 2.4706 0.0035997
域_812 倭黑猩猩 263 2.8201 0.0013526
域_888 倭黑猩猩 264 2.8951 0.0033756
域_893 倭黑猩猩 265 2.7511 5.41E-04
域_938 倭黑猩猩 266 2.2926 0.0040367
域_966 黑猩猩 267 3.3535 5.49E-04
域_972 黑猩猩 268 3.7627 5.59E-05
域_980 黑猩猩 269 2.9297 0.0011707
域_987 黑猩猩 270 2.6881 5.48E-04
域_999 黑猩猩 271 2.7361 0.0038248
域_1006 黑猩猩 272 3.2119 1.28E-04
域_1079 黑猩猩 273 3.7915 3.90E-05
域_1137 黑猩猩 274 3.1719 4.58E-04
域_1153 黑猩猩 275 3.7928 5.16E-04
域_1184 黑猩猩 276 3.2772 5.47E-04
域_1237 黑猩猩 277 2.1795 0.0059151
域_1242 黑猩猩 278 2.7144 0.0037672
域_1247 黑猩猩 279 2.9622 4.18E-04
域_1378 大猩猩 280 3.2279 0.0022191
域_1381 大猩猩 281 4.1424 3.35E-05
域_1382 大猩猩 282 3.0579 1.91E-04
域_1457 大猩猩 283 2.6896 0.0026956
域_1523 大猩猩 284 2.8607 0.0042127
域_1539 大猩猩 285 2.9337 0.0028055
域_1561 大猩猩 286 2.8783 0.0011557
域_1565 大猩猩 287 2.771 3.04E-04
域_1578 大猩猩 288 3.4875 5.97E-04
域_1621 大猩猩 289 3.3004 1.20E-04
域_1790 大猩猩 290 3.0669 0.0038707
域_1816 大猩猩 291 3.108 0.0011178
域_1818 大猩猩 292 3.2866 6.15E-04
域_1822 大猩猩 293 2.4697 1.04E-04
域_1870 大猩猩 294 2.215 0.0044522
域_1875 大猩猩 295 2.5576 0.0043383
域_1893 大猩猩 296 2.3898 0.0043422
域_1946 紅毛猩猩 297 3.1449 9.41E-04
域_1952 紅毛猩猩 298 3.0762 5.53E-04
域_1964 紅毛猩猩 299 2.3009 0.0099771
域_1978 紅毛猩猩 300 3.2215 0.0029968
域_2014 紅毛猩猩 301 2.7323 3.95E-04
域_2034 紅毛猩猩 302 3.7415 1.38E-06
域_2119 紅毛猩猩 303 2.2117 0.0054271
域_2208 紅毛猩猩 304 2.3044 0.009903
域_2223 紅毛猩猩 305 2.6106 0.0087315
域_2229 紅毛猩猩 306 2.9337 0.0032308
域_2245 紅毛猩猩 307 3.2712 0.0012727
域_2255 紅毛猩猩 308 3.1952 0.002815
域_2295 紅毛猩猩 309 3.2816 6.61E-04
域_2299 紅毛猩猩 310 2.5125 0.0042678
域_2376 紅毛猩猩 311 2.1539 9.52E-04
域_2391 紅毛猩猩 312 2.4608 0.0045936
域_2398 紅毛猩猩 313 3.3125 3.44E-04
域_2470 紅毛猩猩 314 2.3815 0.0031273
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域_5716 梟猴 430 3.0606 5.36E-04
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域_5896 歐洲牛 442 2.9429 0.0023166
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域_5943 小家鼠 446 2.501 0.0027917
域_5946 智人 447 3.2998 1.38E-06
域_5968 歐洲牛 448 3.2856 3.86E-04
域_5984 智人 449 2.9852 2.37E-04
域_5989 小家鼠 450 3.6632 9.30E-04
域_5994 紅毛猩猩 451 2.9214 5.04E-04
域_6038 智人 452 3.3315 2.59E-04
域_6053 紅毛猩猩 453 3.2566 1.21E-04
域_6063 智人 454 3.5653 0.0019059
域_6078 智人 455 2.6246 0.0075453
域_6134 智人 456 2.7081 0.0034203
域_6169 智人 457 3.3909 1.68E-06
域_6172 智人 458 3.883 1.07E-06
域_6249 亞馬遜松鼠猴 459 3.5469 4.44E-06
域_6293 褐家鼠 460 2.6707 0.0034812
域_6354 卡羅萊納箱龜(Terrapene carolina triunguis) 461 2.4812 0.0095055
域_6356 卡羅萊納箱龜 462 2.9197 0.0031965
域_6382 沙漠龜 463 3.2875 1.66E-04
域_6398 沙漠龜 464 2.8238 0.0059966
域_6410 足蠓(Podarcis muralis) 465 2.7633 0.0034243
域_6433 足蠓 466 3.0313 1.16E-04
域_6458 沙漠龜 467 2.8973 0.0048435
域_6472 揚子江鱷 468 2.9259 0.0052565
域_6482 豹貓守宮(Paroedura picta) 469 3.3106 0.0019705
域_6501 豹貓守宮 470 3.4172 0.0010204
域_6539 豹貓守宮 471 3.2371 0.0025654
域_6555 豹貓守宮 472 3.534 4.92E-04
域_6577 卡羅萊納箱龜 473 3.3168 3.95E-04
域_6595 卡羅萊納箱龜 474 2.2407 0.0027133
域_6599 卡羅萊納箱龜 475 3.3653 4.49E-05
域_6697 足蠓 476 2.6712 7.35E-04
域_6737 單色蚯蚓 477 2.4861 0.0065704
域_6738 單色蚯蚓 478 2.9275 7.79E-04
域_6741 單色蚯蚓 479 3.5726 2.50E-04
域_6866 美國短吻鱷(Alligator mississippiensis) 480 3.5825 1.02E-04
域_6936 鱗斑鶉(Callipepla squamata) 481 3.5294 9.07E-04
域_6938 美國短吻鱷 482 2.6093 0.0020584
域_6952 美國短吻鱷 483 2.3403 0.0084774
域_6970 環頸雉(Phasianus colchicus) 484 3.343 3.02E-04
域_7000 環頸雉 485 2.8279 0.0039843
域_7098 單色蚯蚓 486 2.7074 0.0030553
域_7109 單色蚯蚓 487 2.9932 0.0077318
域_7123 單色蚯蚓 488 2.9074 0.0043723
域_7166 單色蚯蚓 489 3.1419 5.72E-04
域_7183 單色蚯蚓 490 2.4918 1.27E-04
域_7184 單色蚯蚓 491 2.2019 0.0099168
域_7328 卡羅萊納箱龜 492 3.1808 5.04E-05
域_7353 單色蚯蚓 493 2.6649 0.0042219
域_7365 單色蚯蚓 494 2.597 0.0042403
域_7480 沙漠龜 495 3.1707 5.44E-04
域_7510 沙漠龜 496 3.0452 6.73E-04
域_7534 沙漠龜 497 3.4086 2.50E-04
域_7553 沙漠龜 498 2.9036 0.0088341
域_7605 揚子江鱷 499 2.8444 0.0018789
域_7607 揚子江鱷 500 2.7102 0.0018612
域_7641 原雞(Gallus gallus) 501 3.6727 4.51E-04
域_7653 原雞 502 3.3772 0.0028364
域_7678 綠海龜(Chelonia mydas) 503 2.7348 0.0039197
域_7711 野鴿 504 3.7965 1.67E-05
域_7716 鬃獅蜥(Pogona vitticeps) 505 3.1171 0.0011931
域_7745 野生火雞 506 3.4946 0.0016126
域_7750 野鴿 507 2.8111 0.0012249
域_7774 鬃獅蜥 508 3.427 8.09E-04
域_7796 綠海龜 509 2.9513 1.04E-04
域_7813 野鴿 510 3.4645 7.95E-04
域_7824 野鴿 511 2.9383 5.45E-04
域_7850 卡羅萊納箱龜 512 3.124 5.15E-04
域_7895 斑尾鴿(Patagioenas fasciata monilis) 513 3.2254 0.0013863
域_7925 原雞 514 3.3919 0.0025195
域_8012 鱗斑鶉 515 3.2046 0.0023734
域_8013 鱗斑鶉 516 3.9783 2.13E-05
域_8014 鱗斑鶉 517 3.7425 6.23E-05
域_8036 美國短吻鱷 518 2.3504 0.0094483
域_8041 奧氏更格盧鼠 519 3.6568 3.47E-04
域_8054 豚鼠(Cavia porcellus) 520 3.5889 4.15E-05
域_8148 灰倉鼠(Cricetulus griseus) 521 3.6904 4.82E-05
域_8151 灰倉鼠 522 3.1527 0.0034782
域_8154 灰倉鼠 523 2.8774 0.0027807
域_8167 小家鼠 524 3.9362 1.04E-04
域_8179 金倉鼠 525 3.0623 0.0026242
域_8182 田鼷鼠 526 2.2411 0.0018051
域_8216 灰倉鼠 527 3.1747 9.05E-05
域_8226 褐家鼠 528 2.4602 0.0090772
域_8235 田鼷鼠 529 2.8965 0.0012522
域_8282 東方鹿鼠 530 3.9882 1.07E-06
域_8289 東方鹿鼠 531 3.3026 2.94E-04
域_8301 金倉鼠 532 3.1084 0.0017647
域_8303 十三條紋地松鼠(Ictidomys tridecemlineatus) 533 3.6843 1.34E-04
域_8305 十三條紋地松鼠 534 2.5554 0.0084633
域_8308 美洲旱獺 535 2.6564 3.69E-04
域_8317 田鼷鼠 536 3.3091 2.40E-05
域_8340 東方鹿鼠 537 2.2764 0.0086378
域_8353 東方鹿鼠 538 2.7989 4.14E-04
域_8370 豚鼠 539 3.5737 2.58E-04
域_8412 小家鼠 540 2.4486 0.0077639
域_8418 灰倉鼠 541 2.4014 0.001307
域_8424 東方鹿鼠 542 2.7945 0.0019818
域_8425 東方鹿鼠 543 2.8391 0.004804
域_8460 東方鹿鼠 544 3.1352 6.66E-05
域_8467 金倉鼠 545 3.8156 7.15E-05
域_8489 田鼷鼠 546 2.8336 0.0042299
域_8492 小家鼠 547 3.3107 0.0032374
域_8502 灰倉鼠 548 2.1429 4.22E-04
域_8545 褐家鼠 549 3.1044 0.0011282
域_8546 小家鼠 550 2.9439 0.0033958
域_8547 田鼷鼠 551 3.3997 0.0022286
域_8549 田鼷鼠 552 2.8508 0.0052033
域_8555 灰倉鼠 553 3.2852 5.62E-05
域_8618 金倉鼠 554 2.6363 0.008293
域_8688 小家鼠 555 2.4409 2.00E-04
域_8689 小家鼠 556 2.8548 6.62E-04
域_8712 金倉鼠 557 2.7776 0.0028768
域_8742 東方鹿鼠 558 2.3354 0.002149
域_8746 金倉鼠 559 3.317 1.64E-04
域_8789 美洲旱獺 560 3.1756 0.0021937
域_8793 田鼷鼠 561 2.6774 9.60E-05
域_8816 東方鹿鼠 562 2.4156 2.32E-04
域_8830 豚鼠 563 3.0644 0.0025588
域_8839 東方鹿鼠 564 3.0637 0.0036542
域_8844 東方鹿鼠 565 4.1629 7.81E-06
域_8850 東方鹿鼠 566 2.695 0.0040575
域_8862 美洲旱獺 567 2.3521 0.0061537
域_8881 灰倉鼠 568 3.743 1.49E-05
域_8886 灰倉鼠 569 3.5727 1.94E-05
域_8899 金倉鼠 570 3.2182 9.45E-05
域_8931 灰倉鼠 571 2.9497 8.73E-04
域_8936 灰倉鼠 572 4.3486 1.07E-06
域_8953 田鼷鼠 573 2.5941 0.0032969
域_8982 金倉鼠 574 3.1585 3.54E-05
域_8989 美洲旱獺 575 2.2309 0.0094553
域_9012 小家鼠 576 2.3905 0.0070058
域_9042 田鼷鼠 577 2.5894 0.0033885
域_9060 灰倉鼠 578 2.5974 0.0027286
域_9119 金倉鼠 579 2.2985 0.0052412
域_9141 田鼷鼠 580 3.035 2.62E-05
域_9159 奧氏更格盧鼠 581 3.0141 0.0023052
域_9174 東方鹿鼠 582 2.5194 0.0035749
域_9175 東方鹿鼠 583 2.4231 0.0042293
域_9189 裸鼴鼠(Heterocephalus glaber) 584 3.3801 1.76E-04
域_9192 田鼷鼠 585 2.7981 0.008526
域_9217 金倉鼠 586 3.8919 5.43E-05
域_9235 小家鼠 587 2.7307 0.0035899
域_9250 美洲旱獺 588 3.466 0.0012007
域_9265 小家鼠 589 2.1221 0.0021172
域_9290 東方鹿鼠 590 4.256 1.07E-06
域_9303 美洲旱獺 591 2.5344 0.0051732
域_9313 小家鼠 592 2.7692 0.0061916
域_9324 東方鹿鼠 593 3.1782 0.0020198
域_9329 東方鹿鼠 594 4.263 7.81E-06
域_9332 東方鹿鼠 595 3.9002 1.38E-06
域_9356 十三條紋地松鼠 596 2.9297 0.0037302
域_9389 美洲旱獺 597 3.1785 2.65E-05
域_9424 奧氏更格盧鼠 598 3.771 1.53E-07
域_9435 達馬拉蘭鼴鼠(Fukomys damarensis) 599 3.1672 3.01E-04
域_9446 美洲旱獺 600 2.8722 3.80E-04
域_9489 奧氏更格盧鼠 601 3.0215 0.0074336
域_9503 十三條紋地松鼠 602 2.9864 0.0021536
域_9526 金倉鼠 603 2.9435 0.0042492
域_9530 金倉鼠 604 2.7003 0.0026178
域_9541 奧氏更格盧鼠 605 2.8442 0.0028404
域_9542 八齒鼠 606 2.6734 0.0036809
域_9544 八齒鼠 607 2.9143 0.0054966
域_9559 田鼷鼠 608 3.327 0.001653
域_9563 小家鼠 609 3.7261 3.81E-05
域_9576 八齒鼠 610 2.1952 0.0094564
域_9617 金倉鼠 611 2.4034 0.0040152
域_9643 奧氏更格盧鼠 612 3.4306 0.0023603
域_9697 八齒鼠 613 2.7566 0.0063579
域_9704 奧氏更格盧鼠 614 3.1674 0.0013462
域_9706 八齒鼠 615 2.821 0.0041809
域_9713 灰倉鼠 616 3.0323 0.002243
域_9716 田鼷鼠 617 2.9009 0.0040762
域_9723 田鼷鼠 618 2.1903 0.0058971
域_9725 田鼷鼠 619 2.9654 0.0028095
域_9776 美洲旱獺 620 2.6258 0.0084697
域_9787 田鼷鼠 621 3.2962 8.37E-05
域_9789 小家鼠 622 2.5801 0.0012534
域_9822 十三條紋地松鼠 623 2.9382 0.0065879
域_9824 裸鼴鼠 624 3.1306 8.34E-05
域_9827 田鼷鼠 625 2.1904 0.0077554
域_9843 小家鼠 626 2.3385 0.0035982
域_9846 灰倉鼠 627 2.7865 0.0025033
域_9857 金倉鼠 628 3.3666 8.92E-04
域_9858 金倉鼠 629 3.0047 1.33E-04
域_9878 美洲旱獺 630 3.7349 2.61E-04
域_9891 田鼷鼠 631 2.8116 3.13E-04
域_9915 田鼷鼠 632 3.4011 3.45E-04
域_9962 褐家鼠 633 2.7249 0.004063
域_9993 褐家鼠 634 2.7601 0.0035973
域_10018 八齒鼠 635 3.3372 4.27E-04
域_10041 田鼷鼠 636 2.8662 0.0062437
域_10044 小家鼠 637 2.826 0.0043095
域_10050 八齒鼠 638 3.3147 0.0020066
域_10057 小家鼠 639 2.2961 0.0026799
域_10091 達馬拉蘭鼴鼠 640 2.1679 4.36E-04
域_10127 東方鹿鼠 641 3.6912 3.83E-06
域_10160 十三條紋地松鼠 642 2.9333 4.23E-04
域_10184 田鼷鼠 643 4.2854 1.53E-07
域_10241 八齒鼠 644 3.5766 8.19E-05
域_10257 八齒鼠 645 3.1757 5.20E-04
域_10294 小家鼠 646 2.689 0.0067073
域_10334 雪貂(Mustela putorius furo) 647 3.3529 5.07E-05
域_10351 白鯨(Delphinapterus leucas) 648 3.3309 3.78E-04
域_10359 白鯨 649 2.9199 0.0036842
域_10381 小羊駝 650 2.215 0.0057838
域_10386 太平洋海象 651 2.8337 0.0028753
域_10403 小羊駝 652 3.3993 0.0016441
域_10420 太平洋海象 653 3.7185 1.01E-04
域_10425 白鯨 654 2.8616 0.0041775
域_10427 菲律賓眼鏡猴 655 2.3719 0.0078328
域_10491 小羊駝 656 3.7199 0.0012761
域_10495 白鯨 657 3.4705 5.27E-04
域_10526 白鯨 658 2.4499 0.0033355
域_10573 歐洲馬鹿(Cervus elaphus hippelaphus) 659 2.4077 5.02E-04
域_10612 小羊駝 660 2.4997 0.0035134
域_10613 太平洋海象 661 2.9148 5.62E-05
域_10623 菲律賓眼鏡猴 662 3.2233 0.0018333
域_10646 白鯨 663 2.9354 0.0036496
域_10647 白鯨 664 2.9514 7.60E-04
域_10675 鴨嘴獸(Ornithorhynchus anatinus) 665 3.2777 5.13E-05
域_10684 太平洋海象 666 4.531 1.64E-05
域_10704 東非安哥拉黑白疣猴 667 3.1582 0.004292
域_10705 東非安哥拉黑白疣猴 668 3.6392 4.09E-05
域_10733 太平洋海象 669 3.315 0.0028523
域_10762 西歐刺蝟(Erinaceus europaeus) 670 3.9254 4.55E-05
域_10763 雪貂 671 2.5924 0.0073193
域_10765 雪貂 672 2.5661 0.0076445
域_10807 西歐刺蝟 673 3.5237 1.54E-04
域_10882 小羊駝 674 3.6289 2.93E-04
域_10902 小羊駝 675 3.1052 0.0096752
域_10917 太平洋海象 676 3.7871 1.53E-07
域_10943 歐洲馬鹿 677 2.5554 0.0037715
域_10974 綠海龜 678 2.6444 0.0091318
域_11006 非洲草原象(Loxodonta africana) 679 2.6669 6.71E-04
域_11024 狐獴(Suricata suricatta) 680 3.2397 2.77E-04
域_11031 鬼狒 681 2.5516 0.005857
域_11034 鬼狒 682 2.2541 0.0042161
域_11040 野豬 683 3.5161 3.39E-04
域_11049 長江江豚 684 2.7072 0.0015299
域_11053 白頰長臂猿 685 3.677 4.44E-06
域_11069 家山羊 686 3.2745 0.0036948
域_11071 金鼴鼠(Chrysochloris asiatica) 687 3.1268 0.0012421
域_11097 鬼狒 688 3.239 0.0011508
域_11110 野豬 689 3.6632 4.76E-04
域_11129 白頰長臂猿 690 2.3864 1.88E-04
域_11130 白頰長臂猿 691 2.3487 6.64E-04
域_11132 印度牛 692 3.5671 3.08E-05
域_11157 狐獴 693 3.6671 8.22E-05
域_11158 金鼴鼠 694 2.6889 0.0035388
域_11162 鬼狒 695 3.2804 2.65E-04
域_11178 野豬 696 2.4845 0.0043413
域_11192 長江江豚 697 2.8798 2.10E-04
域_11202 白頰長臂猿 698 3.5851 4.18E-05
域_11204 白頰長臂猿 699 3.5793 5.22E-05
域_11225 家山羊 700 3.606 0.0011566
域_11227 家山羊 701 2.7556 0.0032733
域_11264 野豬 702 3.5019 5.64E-04
域_11265 野豬 703 4.2521 1.53E-07
域_11282 狐獴 704 3.536 1.53E-07
域_11289 狐獴 705 2.69 2.48E-04
域_11291 狐獴 706 4.0373 4.59E-07
域_11307 鬼狒 707 3.6383 1.07E-06
域_11312 野豬 708 3.8532 9.26E-05
域_11314 野豬 709 2.9575 0.0015357
域_11321 白頰長臂猿 710 2.9718 0.0086853
域_11331 家山羊 711 3.0611 4.37E-04
域_11332 家山羊 712 3.0468 2.19E-04
域_11356 野豬 713 2.6549 0.0027629
域_11359 野豬 714 3.1036 0.0092232
域_11381 白頰長臂猿 715 3.1705 4.83E-04
域_11393 狐獴 716 3.4256 1.65E-04
域_11401 狐獴 717 2.6345 0.0077459
域_11403 狐獴 718 3.4222 2.27E-04
域_11413 野豬 719 2.1814 0.0084919
域_11433 長江江豚 720 3.3986 1.91E-05
域_11446 白頰長臂猿 721 2.6971 3.26E-04
域_11461 家馬 722 2.508 0.0090515
域_11466 狐獴 723 3.4716 0.0027896
域_11470 鬼狒 724 3.1038 0.0012895
域_11502 西印度海牛(Trichechus manatus latirostris) 725 3.601 4.21E-05
域_11505 西印度海牛 726 3.0969 9.19E-07
域_11534 野豬 727 3.8118 1.91E-05
域_11554 白頰長臂猿 728 3.0498 4.11E-04
域_11567 加州海獅 729 3.4239 0.0010611
域_11581 家馬 730 3.1882 4.10E-04
域_11612 非洲草原象 731 3.3006 0.0040119
域_11621 金鼴鼠 732 3.2074 5.42E-04
域_11643 白頰長臂猿 733 2.3544 0.0020207
域_11662 家山羊 734 3.7889 2.36E-04
域_11672 狐獴 735 3.318 0.0022931
域_11701 家山羊 736 2.5282 0.0084694
域_11726 野豬 737 3.4183 1.09E-05
域_11749 西非綠猴 738 3.2721 0.0023817
域_11753 鬼狒 739 2.6119 0.0062269
域_11760 長江江豚 740 2.8102 0.0039794
域_11796 野豬 741 2.2811 0.0010219
域_11813 家犬(Canis lupus familiaris) 742 3.5195 7.62E-04
域_11825 鬼狒 743 3.9893 1.53E-07
域_11851 白頰長臂猿 744 3.0241 1.32E-04
域_11858 家犬 745 3.6419 1.53E-07
域_11862 家犬 746 2.8817 0.0032412
域_11865 赤麂(Muntiacus muntjak) 747 3.0474 0.0026931
域_11868 鬼狒 748 3.5158 4.44E-06
域_11908 家犬 749 2.894 0.0035529
域_11923 野豬 750 3.2271 0.0018734
域_11925 鬼狒 751 3.5582 3.04E-04
域_11928 長江江豚 752 3.751 7.59E-04
域_11933 長江江豚 753 4.1135 1.52E-05
域_11944 印度牛 754 3.2762 0.0022727
域_11950 家犬 755 4.3869 2.91E-06
域_11988 赤麂 756 3.5916 3.83E-06
域_11996 家犬 757 3.0831 0.0015161
域_11999 家犬 758 3.7891 5.04E-05
域_12001 鬼狒 759 2.4384 0.0057376
域_12021 家犬 760 2.4637 0.0018489
域_12051 赤麂 761 2.7925 0.0039375
域_12057 赤麂 762 2.0631 0.0086017
域_12079 赤麂 763 2.4029 0.0095567
域_12092 野犛牛 764 3.1752 1.82E-05
域_12114 長江江豚 765 3.3227 6.62E-04
域_12133 家犬 766 3.0204 0.0034751
域_12139 家犬 767 2.8097 0.0066678
域_12147 長江江豚 768 2.6974 9.14E-04
域_12158 白頰長臂猿 769 3.0332 0.006631
域_12187 家犬 770 3.6477 5.13E-05
域_12191 赤麂 771 3.6138 8.18E-04
域_12195 家犬 772 2.9023 1.11E-04
域_12206 野犛牛 773 2.9101 5.13E-04
域_12210 印度牛 774 3.6136 0.0018284
域_12214 赤麂 775 2.613 9.76E-04
域_12231 白頰長臂猿 776 2.6703 0.00421
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域_12285 大猩猩 778 2.2573 0.0091023
域_12313 印度牛 779 2.6903 0.0012684
域_12320 赤麂 780 2.5075 0.0023021
域_12365 白頰長臂猿 781 3.5626 7.78E-04
域_12395 大熊貓 782 3.1504 3.56E-04
域_12459 印度牛 783 4.0425 3.06E-06
域_12463 大熊貓 784 3.2567 0.009339
域_12467 大猩猩 785 2.9575 4.85E-04
域_12498 赤麂 786 2.8947 0.0075569
域_12499 赤麂 787 2.2932 0.0064341
域_12508 大猩猩 788 3.0173 0.0024497
域_12511 大猩猩 789 3.0694 0.0023557
域_12517 加拿大猞猁(Lynx canadensis) 790 2.6983 0.0017522
域_12544 大猩猩 791 3.306 4.83E-04
域_12550 大熊貓 792 3.0229 2.37E-04
域_12576 大猩猩 793 3.04 0.0044151
域_12590 印度牛 794 2.5531 0.0020023
域_12591 印度牛 795 3.4169 0.0011553
域_12598 赤麂 796 3.3709 4.18E-05
域_12599 赤麂 797 2.2098 0.007064
域_12630 長尾獼猴 798 3.6424 4.03E-05
域_12646 避光鼠耳蝠(Myotis lucifugus) 799 3.487 0.0014708
域_12686 無尾熊 800 2.76 0.0032103
域_12698 無尾熊 801 2.8029 0.0066675
域_12704 避光鼠耳蝠 802 2.9127 0.0034078
域_12712 美洲獅(Puma concolor) 803 2.1195 0.008023
域_12728 加拿大猞猁 804 3.1999 9.49E-04
域_12734 蒼白矛鼻蝠 805 3.5207 1.38E-06
域_12755 家兔(Oryctolagus cuniculus) 806 2.8082 0.0061475
域_12764 吸血蝠 807 3.9505 1.53E-07
域_12769 長尾獼猴 808 2.0555 0.0080928
域_12777 無尾熊 809 2.1778 0.0057731
域_12780 無尾熊 810 3.2671 1.01E-04
域_12801 黑帽懸猴 811 2.0238 0.006988
域_12811 長尾獼猴 812 2.4278 0.0068959
域_12815 長尾獼猴 813 2.7296 0.0029445
域_12818 長尾獼猴 814 3.6211 9.69E-05
域_12829 無尾熊 815 3.3994 3.20E-04
域_12831 無尾熊 816 2.9845 0.0029084
域_12839 家兔 817 3.4039 3.03E-04
域_12849 赤麂 818 4.1042 1.53E-07
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域_12901 長尾獼猴 820 3.5686 4.75E-06
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域_13029 避光鼠耳蝠 827 3.1708 3.58E-04
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域_13439 黑帽懸猴 853 2.5091 0.0050786
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域_13565 無尾熊 862 2.994 0.0032926
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域_13851 家犬 886 2.6472 0.0033845
域_13859 長尾獼猴 887 2.2006 0.0086366
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域_13987 避光鼠耳蝠 898 3.0633 4.59E-04
域_13997 美洲獅 899 2.984 2.51E-04
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域_14444 蒼白矛鼻蝠 928 2.4641 0.0037357
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域_14526 大熊貓 930 3.2232 0.003818
域_14532 加拿大猞猁 931 3.2071 2.43E-04
域_14534 加拿大猞猁 932 2.8122 0.0039834
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域_14557 加拿大猞猁 935 2.9876 2.85E-04
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域_14639 恆河猴 940 2.7046 0.0033915
域_14714 德克薩斯白尾鹿(Odocoileus virginianus texanus) 941 3.2752 2.48E-04
域_14746 德克薩斯白尾鹿 942 2.605 0.0084645
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域_14820 白鬢狨 948 2.8836 0.0021743
域_14829 川金絲猴 949 2.7188 4.08E-04
域_14845 巴拿馬卷尾猴 950 2.7224 0.0041993
域_14849 巴拿馬卷尾猴 951 2.3659 0.0093133
域_14862 白鬢狨 952 2.8116 0.0079314
域_14864 恆河猴 953 3.3492 2.46E-04
域_14885 巴拿馬卷尾猴 954 3.5373 4.09E-05
域_14901 歐洲牛 955 2.9774 0.0085175
域_14905 川金絲猴 956 3.372 0.0034794
域_14928 白鬢狨 957 3.1547 2.58E-04
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域_14948 獵豹 960 3.3727 1.73E-04
域_14974 黑帽懸猴 961 2.9963 0.0091608
域_14977 黑帽懸猴 962 3.0085 5.11E-04
域_14978 獵豹 963 3.0358 0.0017363
域_14983 川金絲猴 964 3.704 1.53E-07
域_14994 野牛(Bison bison bison) 965 2.4997 0.0054874
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域_15279 白鬢狨 991 3.8574 6.87E-05
域_15352 巴拿馬卷尾猴 992 3.0832 0.0079363
域_15354 寬吻海豚(Tursiops truncatus) 993 3.5099 5.16E-05
域_15356 獵豹 994 3.5466 0.0019099
域_15360 長江江豚 995 3.2575 3.95E-04
域_15363 紅毛猩猩 996 4.3121 1.53E-07
域_15391 韋德爾氏海豹(Leptonychotes weddellii) 997 3.9053 1.53E-07
域_15406 黑猩猩 998 3.4616 1.53E-07
域_15419 川金絲猴 999 2.6943 0.0012439
域_15426 德克薩斯白尾鹿 1000 2.9673 0.0024959
域_15447 川金絲猴 1001 3.1112 0.0031907
域_15451 野牛 1002 3.2905 0.0024601
域_15527 北太平洋小鬚鯨(Balaenoptera acutorostrata scammoni) 1003 3.0354 0.0023685
域_15536 巴拿馬卷尾猴 1004 2.4515 0.0048713
域_15540 白鬢狨 1005 3.124 0.0020464
域_15575 白鬢狨 1006 2.594 0.0095671
域_15577 白鬢狨 1007 2.4456 0.0010642
域_15581 北方海狗 1008 3.2465 0.0031873
域_15586 北方海狗 1009 2.6157 0.002815
域_15603 巴拿馬卷尾猴 1010 3.5111 0.0027084
域_15605 巴拿馬卷尾猴 1011 3.8196 2.50E-04
域_15634 白鯨 1012 3.3574 0.0025587
域_15636 黑猩猩 1013 2.2086 0.0062339
域_15638 黑帽懸猴 1014 3.4277 1.53E-07
域_15669 北方海狗 1015 2.8865 0.0027889
域_15687 巴拿馬卷尾猴 1016 2.5362 0.0063187
域_15688 巴拿馬卷尾猴 1017 3.2098 6.98E-04
域_15693 恆河猴 1018 3.8571 9.95E-06
域_15699 歐洲牛 1019 3.5255 7.09E-04
域_15753 綿羊 1020 3.1699 0.0035272
域_15759 綿羊 1021 3.1884 0.0011061
域_15764 小耳大嬰猴 1022 3.107 3.97E-04
域_15800 小耳大嬰猴 1023 3.4462 1.80E-04
域_15814 恆河猴 1024 3.9503 3.26E-05
域_15823 綿羊 1025 2.8458 0.0034405
域_15834 小耳大嬰猴 1026 3.7629 1.30E-05
域_15839 白鬢狨 1027 2.3399 0.0090833
域_15863 赤狐 1028 2.7434 0.0042734
域_15931 綿羊 1029 3.0861 0.0028731
域_15940 阿拉斯加海獺 1030 2.8684 0.007571
域_15956 歐洲牛 1031 3.2271 4.36E-04
域_15972 阿拉斯加海獺 1032 2.3299 1.05E-04
域_16009 加州海獅 1033 3.2738 0.0020718
域_16011 白鯨 1034 4.3363 1.53E-07
域_16017 綿羊 1035 2.6715 0.0041604
域_16023 滇金絲猴(Rhinopithecus bieti) 1036 2.2831 0.0064672
域_16050 綿羊 1037 2.7105 0.0086883
域_16063 恆河猴 1038 2.1603 0.0054023
域_16084 阿拉斯加海獺 1039 3.0131 0.0022672
域_16115 歐洲牛 1040 2.9023 0.0027605
域_16123 綿羊 1041 2.3799 0.0079176
域_16147 紅毛猩猩 1042 2.5699 4.83E-04
域_16184 綿羊 1043 3.7743 4.44E-06
域_16188 小耳大嬰猴 1044 2.5145 0.0014414
域_16238 紅毛猩猩 1045 3.8734 2.87E-04
域_16246 恆河猴 1046 2.3971 3.89E-04
域_16253 綿羊 1047 4.488 1.53E-07
域_16266 小耳大嬰猴 1048 3.075 0.0019834
域_16274 小耳大嬰猴 1049 2.7655 0.0014904
域_16312 小羊駝 1050 2.4302 0.0024702
域_16323 西印度海牛 1051 4.0053 2.15E-04
域_16340 綿羊 1052 2.778 0.0034068
域_16372 德克薩斯白尾鹿 1053 4.2664 1.53E-07
域_16378 白鬢狨 1054 2.9868 0.0037718
域_16399 川金絲猴 1055 4.0639 1.53E-07
域_16408 巴拿馬卷尾猴 1056 2.0194 0.009233
域_16461 巴拿馬卷尾猴 1057 3.1155 0.0020676
域_16471 獵豹 1058 3.3465 0.0021006
域_16478 川金絲猴 1059 2.8285 0.0023275
域_16516 恆河猴 1060 3.8473 1.94E-05
域_16517 白鬢狨 1061 3.3189 2.60E-06
域_16534 獵豹 1062 2.7531 0.0057425
域_16556 川金絲猴 1063 2.4217 0.0084734
域_16566 德克薩斯白尾鹿 1064 3.3903 7.82E-04
域_16576 黑猩猩 1065 2.6949 0.0021998
域_16597 巴拿馬卷尾猴 1066 2.9869 0.0023416
域_16611 阿努比斯狒狒(Papio anubis) 1067 3.4786 1.53E-07
域_16618 北極熊 1068 3.1184 0.0015351
域_16629 巴拿馬卷尾猴 1069 3.7569 1.57E-04
域_16630 巴拿馬卷尾猴 1070 3.2435 1.36E-04
域_16638 豬尾獼猴(Macaca nemestrina) 1071 3.3871 0.0011337
域_16648 抹香鯨 1072 3.629 1.88E-05
域_16651 白鯨 1073 2.0926 0.0074143
域_16659 韋德爾氏海豹 1074 3.8913 2.37E-05
域_16664 韋德爾氏海豹 1075 3.4502 1.76E-05
域_16673 無尾熊 1076 3.0938 0.0039727
域_16677 紅毛猩猩 1077 3.1577 0.0023254
域_16694 北方海狗 1078 2.0979 0.0094743
域_16695 北方海狗 1079 3.965 3.06E-07
域_16696 寬吻海豚 1080 3.0806 0.002705
域_16703 無尾熊 1081 3.3969 2.19E-04
域_16731 灰熊(Ursus arctos horribilis) 1082 2.849 1.30E-05
域_16734 韋德爾氏海豹 1083 3.4791 2.57E-04
域_16738 黑猩猩 1084 3.5957 8.11E-06
域_16744 阿拉斯加海獺 1085 3.637 6.38E-05
域_16763 負鼠 1086 2.9244 0.0053031
域_16771 亞馬遜松鼠猴 1087 3.3025 0.0027295
域_16773 北太平洋小鬚鯨 1088 4.5309 1.38E-06
域_16776 北方海狗 1089 3.0877 0.0024757
域_16809 白鯨 1090 2.4357 0.0068567
域_16811 北太平洋小鬚鯨 1091 3.5141 3.08E-04
域_16856 北極熊 1092 2.7613 0.0040844
域_16865 阿努比斯狒狒 1093 3.9619 1.53E-07
域_16876 北方海狗 1094 3.2183 4.66E-04
域_16877 馬鐵菊頭蝠(Rhinolophus ferrumequinum) 1095 3.3745 3.78E-05
域_16936 川金絲猴 1096 2.9808 0.0044295
域_16953 北方海狗 1097 3.3286 1.62E-04
域_16973 白鯨 1098 3.0187 0.0041062
域_16994 德克薩斯白尾鹿 1099 3.0575 0.0025431
域_17001 馬鐵菊頭蝠 1100 3.045 0.003661
域_17023 黑帽懸猴 1101 2.5472 0.0041588
域_17027 北太平洋小鬚鯨 1102 3.131 0.0028042
域_17041 川金絲猴 1103 2.7589 0.0074146
域_17062 川金絲猴 1104 3.2594 7.33E-05
域_17105 恆河猴 1105 2.637 0.0054256
域_17108 蒼白矛鼻蝠 1106 2.4499 0.0018315
域_17134 非洲豹(Panthera pardus) 1107 3.2502 0.0016926
域_17139 灰熊 1108 4.0326 2.13E-05
域_17153 灰熊 1109 2.1759 0.0043459
域_17167 北極熊 1110 4.1644 1.52E-05
域_17177 抹香鯨 1111 3.2446 0.002928
域_17180 加州海獅 1112 2.945 0.0082198
域_17195 北極熊 1113 3.0566 0.0037464
域_17202 灰熊 1114 2.6589 0.0072284
域_17206 馬來大狐蝠 1115 3.7092 5.05E-06
域_17234 白鯨 1116 2.0152 0.0059669
域_17236 馬鐵菊頭蝠 1117 2.7166 0.0039056
域_17241 赤麂 1118 2.2217 0.003544
域_17264 小羊駝 1119 3.0866 0.0021294
域_17278 寬吻海豚 1120 3.4898 4.12E-05
域_17279 野牛 1121 3.591 8.11E-06
域_17333 單峰駱駝(Camelus dromedarius) 1122 2.8765 0.003642
域_17340 韋德爾氏海豹 1123 3.1536 5.34E-05
域_17382 韋德爾氏海豹 1124 3.075 0.0035284
域_17383 韋德爾氏海豹 1125 2.953 0.0032519
域_17412 綿羊 1126 4.9319 1.53E-07
域_17421 赤狐 1127 3.3129 2.83E-05
域_17474 負鼠 1128 2.683 0.0036059
域_17483 白頂白眉猴(Cercocebus atys) 1129 3.5742 3.44E-05
域_17495 夏威夷僧海豹(Neomonachus schauinslandi) 1130 3.1828 5.59E-05
域_17497 負鼠 1131 2.8088 5.07E-05
域_17509 抹香鯨 1132 3.438 8.07E-04
域_17516 負鼠 1133 3.1523 4.18E-04
域_17525 大衛鼠耳蝠(Myotis davidii) 1134 3.4986 7.28E-04
域_17534 白頂白眉猴 1135 2.9374 0.0033612
域_17547 夏威夷僧海豹 1136 3.2455 5.64E-04
域_17548 夏威夷僧海豹 1137 2.8002 5.08E-04
域_17574 白頂白眉猴 1138 3.4893 2.80E-05
域_17632 負鼠 1139 3.3689 2.06E-04
域_17658 負鼠 1140 3.8781 1.99E-06
域_17662 負鼠 1141 2.7612 0.0040459
域_17666 負鼠 1142 2.6895 0.002059
域_17671 負鼠 1143 3.0937 0.008519
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域_17714 負鼠 1146 2.2724 0.0043612
域_17717 抹香鯨 1147 2.9442 7.54E-04
域_17748 韋德爾氏海豹 1148 3.0918 2.44E-04
域_17752 韋德爾氏海豹 1149 3.2541 4.59E-04
域_17775 單峰駱駝 1150 2.6595 0.0033885
域_17798 紅毛猩猩 1151 3.3458 5.16E-05
域_17801 紅毛猩猩 1152 2.9733 0.0022819
域_17871 韋德爾氏海豹 1153 3.1894 1.49E-05
域_17873 韋德爾氏海豹 1154 3.4076 3.00E-04
域_17890 白頂白眉猴 1155 4.2356 2.80E-05
域_17898 阿拉斯加海獺 1156 3.2117 0.0034476
域_17903 紅毛猩猩 1157 2.4683 0.0030976
域_17925 小耳大嬰猴 1158 2.7982 0.0042639
域_18048 梟猴 1159 2.5186 0.0087422
域_18083 阿努比斯狒狒 1160 2.9283 4.79E-04
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域_18103 負鼠 1162 2.7334 0.0056181
域_18136 負鼠 1163 2.7288 6.75E-04
域_18155 袋獾(Sarcophilus harrisii) 1164 2.7528 0.0052222
域_18161 白頂白眉猴 1165 2.6663 0.0060803
域_18181 抹香鯨 1166 4.696 4.59E-07
域_18203 負鼠 1167 3.7912 4.81E-04
域_18206 負鼠 1168 2.3929 0.0046062
域_18214 抹香鯨 1169 2.6389 0.0094737
域_18227 梟猴 1170 3.5267 5.66E-06
域_18241 韋德爾氏海豹 1171 3.8187 9.60E-05
域_18243 家貓 1172 3.5331 6.96E-04
域_18244 韋德爾氏海豹 1173 3.1726 0.0050817
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域_18312 負鼠 1176 2.8473 8.20E-04
域_18323 負鼠 1177 2.3956 0.0040336
域_18325 負鼠 1178 2.7636 0.0038297
域_18332 負鼠 1179 3.4328 4.68E-04
域_18345 負鼠 1180 3.349 4.43E-04
域_18356 負鼠 1181 3.1967 4.67E-04
域_18385 夏威夷僧海豹 1182 2.1472 0.0044932
域_18415 夏威夷僧海豹 1183 2.9768 4.55E-04
域_18424 抹香鯨 1184 3.7744 3.31E-04
域_18426 抹香鯨 1185 2.8011 0.0079672
域_18428 抹香鯨 1186 2.5903 0.0095383
域_18433 梟猴 1187 3.4614 0.0022427
域_18441 家貓 1188 3.7534 1.77E-04
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域_18485 負鼠 1192 2.8817 0.0011922
域_18498 梟猴 1193 2.7354 0.0021141
域_18502 大衛鼠耳蝠 1194 3.4127 1.93E-04
域_18504 白頂白眉猴 1195 3.2213 5.38E-04
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域_18580 白頂白眉猴 1197 4.4477 3.22E-06
域_18589 夏威夷僧海豹 1198 3.039 0.0025063
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域_18873 單峰駱駝 1217 3.262 0.0049846
域_18891 紅毛猩猩 1218 3.6429 1.38E-06
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域_18971 阿拉斯加海獺 1222 3.3941 5.05E-06
域_18977 紅毛猩猩 1223 3.6262 9.03E-06
域_18979 紅毛猩猩 1224 2.0034 0.0071822
域_19005 阿拉斯加海獺 1225 3.4092 4.57E-04
域_19028 紅毛猩猩 1226 2.3618 0.0022277
域_19056 印度牛x歐洲牛 1227 3.0542 0.001874
域_19072 赤狐 1228 2.8133 0.0016331
域_19079 小耳大嬰猴 1229 4.0159 4.88E-05
域_19125 小耳大嬰猴 1230 2.9892 8.36E-04
域_19207 阿拉斯加海獺 1231 2.655 0.0091617
域_19220 單峰駱駝 1232 3.1947 0.0088687
域_19221 單峰駱駝 1233 3.1733 4.21E-04
域_19299 大衛鼠耳蝠 1234 2.8882 0.0043533
域_19351 紅毛猩猩 1235 3.1988 2.17E-04
域_19385 負鼠 1236 2.9198 0.008105
域_19387 負鼠 1237 3.4706 1.85E-04
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域_19563 阿努比斯狒狒 1249 2.5522 0.0089134
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域_19597 負鼠 1253 3.5081 4.46E-04
域_19600 負鼠 1254 2.5854 0.0042185
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域_19629 負鼠 1257 3.0535 0.0017954
域_19699 小耳大嬰猴 1258 2.8474 3.15E-04
域_19708 印度牛x歐洲牛 1259 3.6339 8.02E-04
域_19713 黑猩猩 1260 3.845 2.95E-05
域_19721 小耳大嬰猴 1261 2.6913 0.0089069
域_19776 阿拉斯加海獺 1262 2.617 0.0093497
域_19777 紅毛猩猩 1263 3.2427 0.0075444
域_19780 紅毛猩猩 1264 3.0867 1.72E-04
域_19786 黑猩猩 1265 2.9155 5.94E-04
域_19788 阿拉斯加海獺 1266 3.3393 4.71E-04
域_19800 加州海獅 1267 2.368 0.009162
域_19805 馬鐵菊頭蝠 1268 2.6527 0.0030997
域_19818 川金絲猴 1269 2.3477 0.0022161
域_19883 加州海獅 1270 3.5504 3.42E-04
域_19886 非洲豹 1271 2.8642 4.04E-05
域_19889 小羊駝 1272 3.1963 4.15E-05
域_19891 加州海獅 1273 3.2135 0.0010023
域_19921 北方海狗 1274 2.0083 0.0055679
域_19944 加州海獅 1275 3.8559 8.71E-05
域_19947 倭黑猩猩 1276 2.2608 0.00818
域_19967 寬吻海豚 1277 2.9548 0.0027997
域_19968 寬吻海豚 1278 2.8089 0.004093
域_19990 非洲豹 1279 3.5329 0.0018768
域_19993 寬吻海豚 1280 3.4227 0.0047476
域_20012 韋德爾氏海豹 1281 3.8253 3.41E-05
域_20023 抹香鯨 1282 3.6893 5.78E-04
域_20025 菲律賓眼鏡猴 1283 2.2451 0.002157
域_20030 寬吻海豚 1284 4.1273 3.22E-06
域_20089 非洲豹 1285 4.2275 8.99E-05
域_20095 無尾熊 1286 3.7141 1.55E-05
域_20115 抹香鯨 1287 3.1154 0.0030089
域_20134 獵豹 1288 3.2457 3.20E-04
域_20136 野豬 1289 3.3856 2.94E-04
域_20147 德克薩斯白尾鹿 1290 3.7467 1.53E-07
域_20171 西印度海牛 1291 3.951 1.03E-05
域_20208 馬來大狐蝠 1292 2.4805 0.0041634
域_20249 小羊駝 1293 2.7041 0.0043741
域_20250 無尾熊 1294 3.5525 1.37E-04
域_20287 白頂白眉猴 1295 3.4486 5.29E-04
域_20318 白鬢狨 1296 3.5311 3.52E-06
域_20332 白鬢狨 1297 3.2855 0.0011689
域_20336 非洲豹 1298 2.3293 0.0076785
域_20345 巴拿馬卷尾猴 1299 3.8132 1.53E-07
域_20352 小羊駝 1300 2.9839 9.79E-04
域_20359 馬來大狐蝠 1301 3.9594 4.06E-05
域_20371 灰熊 1302 2.8418 0.0061393
域_20381 亞馬遜松鼠猴 1303 2.0412 0.0013486
域_20398 抹香鯨 1304 3.1266 0.0039215
域_20436 野豬 1305 2.724 0.0058616
域_20455 白頰長臂猿 1306 3.112 2.94E-04
域_20462 西印度海牛 1307 5.4429 1.53E-07
域_20469 家馬 1308 2.7506 0.0077201
域_20487 鬼狒 1309 2.8325 0.0020982
域_20524 白頰長臂猿 1310 3.2893 0.0024993
域_20537 西非綠猴 1311 3.2762 0.0027249
域_20540 鬼狒 1312 2.8477 0.0021931
域_20545 野豬 1313 2.711 0.0086718
域_20561 金鼴鼠 1314 3.8309 3.52E-05
域_20565 狐獴 1315 3.148 2.90E-04
域_20601 野豬 1316 2.9097 0.0037911
域_20652 長江江豚 1317 2.7283 0.0038931
域_20667 狐獴 1318 3.7485 1.38E-06
域_20674 鬼狒 1319 3.3115 1.53E-07
域_20716 狐獴 1320 3.6174 3.02E-05
域_20729 鬼狒 1321 2.5535 0.0090894
域_20746 金鼴鼠 1322 3.4727 4.79E-04
域_20767 野豬 1323 3.1224 3.16E-04
域_20835 狐獴 1324 3.0025 0.0031432
域_20915 鬼狒 1325 2.4373 0.0054586
域_20998 倭黑猩猩 1326 2.6659 0.0044767
域_21010 家馬 1327 2.2253 0.0040982
域_21023 袋獾 1328 3.1196 0.0023342
域_21067 加州海獅 1329 3.0246 0.0010917
域_21082 非洲草原象 1330 3.2032 0.0040056
域_21086 馬來大狐蝠 1331 2.1339 0.0079029
域_21095 西印度海牛 1332 2.5003 0.0091721
域_21110 美洲水鼬 1333 2.499 0.0065113
域_21123 北方海狗 1334 3.237 4.13E-04
域_21133 狐獴 1335 3.1021 4.18E-04
域_21161 袋獾 1336 3.2208 5.87E-04
域_21162 袋獾 1337 2.885 6.85E-04
域_21175 北方海狗 1338 3.3334 2.29E-04
域_21197 寬吻海豚 1339 2.214 0.0073288
域_21226 袋獾 1340 2.6942 0.0033484
域_21260 馬來大狐蝠 1341 3.1806 0.0039855
域_21276 鬼狒 1342 3.0178 0.0029699
域_21277 梟猴 1343 2.7115 0.0075352
域_21312 白鱀豚 1344 3.5287 4.75E-06
域_21333 加州海獅 1345 3.5801 3.57E-05
域_21334 家馬 1346 2.9508 8.67E-04
域_21335 家馬 1347 2.518 0.0034809
域_21367 家馬 1348 2.9921 0.0091001
域_21369 家馬 1349 2.7947 0.0011824
域_21371 抹香鯨 1350 3.8804 4.44E-06
域_21421 馬來大狐蝠 1351 2.7713 7.52E-05
域_21481 倭黑猩猩 1352 2.7056 0.0012415
域_21494 寬吻海豚 1353 3.783 1.36E-04
域_21583 袋獾 1354 3.1529 0.0026931
域_21588 北方海狗 1355 3.4914 5.39E-04
域_21612 梟猴 1356 3.2931 4.09E-05
域_21626 負鼠 1357 3.5419 1.57E-04
域_21632 負鼠 1358 2.6551 0.0071923
域_21658 負鼠 1359 3.1325 2.50E-04
域_21786 西印度海牛 1360 3.2249 2.76E-04
域_21822 家馬 1361 3.5647 3.22E-06
域_21823 家馬 1362 3.2474 0.0072446
域_21844 梟猴 1363 3.467 4.44E-06
域_21862 西非綠猴 1364 2.3797 0.0032299
域_21889 家馬 1365 3.6563 4.18E-04
域_21896 白鱀豚 1366 2.8718 0.0093653
域_21900 家馬 1367 2.7606 0.0041711
域_21909 狐獴 1368 3.2301 3.40E-04
域_21928 北方海狗 1369 3.758 1.67E-05
域_21947 西印度海牛 1370 3.1204 0.003623
域_21951 家馬 1371 2.8972 3.24E-04
域_21985 狐獴 1372 3.6273 1.99E-06
域_21988 袋獾 1373 3.3393 0.0011817
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域_22022 寬吻海豚 1375 3.9558 4.44E-06
域_22079 西印度海牛 1376 3.4511 6.43E-04
域_22117 袋獾 1377 2.5969 0.0040801
域_22143 馬來大狐蝠 1378 2.6595 9.36E-04
域_22151 西印度海牛 1379 3.1615 5.26E-04
域_22158 白鱀豚 1380 2.0562 0.0010562
域_22166 西印度海牛 1381 4.2024 2.53E-05
域_22192 西印度海牛 1382 2.8134 0.0083622
域_22220 倭黑猩猩 1383 2.8922 0.0013379
域_22268 白鱀豚 1384 2.6534 0.0053876
域_22278 馬來大狐蝠 1385 3.3575 0.0037798
域_22280 馬來大狐蝠 1386 3.1521 0.0017347
域_22285 西印度海牛 1387 3.0261 6.83E-04
域_22297 袋獾 1388 2.4261 0.0066953
域_22311 負鼠 1389 2.9903 0.0017115
域_22322 寬吻海豚 1390 3.4452 3.85E-04
域_22366 梟猴 1391 4.848 3.06E-07
域_22375 寬吻海豚 1392 2.5484 0.0090894
域_22381 寬吻海豚 1393 3.8641 2.63E-04
域_22383 馬來大狐蝠 1394 3.4752 2.48E-04
域_22407 梟猴 1395 2.5308 0.0081831
域_22425 梟猴 1396 3.0333 0.0032208
域_22430 北方海狗 1397 2.982 0.0064761
域_22454 負鼠 1398 2.6042 0.0022491
域_22458 負鼠 1399 3.0003 0.0025373
域_22459 負鼠 1400 2.9261 0.0013171
域_22462 負鼠 1401 3.5597 2.34E-05
域_22471 阿努比斯狒狒 1402 3.6293 1.68E-06
域_22479 梟猴 1403 3.9668 4.18E-05
域_22483 梟猴 1404 2.1702 0.0013107
域_22495 北方海狗 1405 2.2623 0.0043918
域_22512 梟猴 1406 2.93 0.003255
域_22518 白鱀豚 1407 2.8869 0.0024472
域_22520 北方海狗 1408 3.3586 2.83E-05
域_22527 寬吻海豚 1409 2.989 9.71E-04
域_22566 阿努比斯狒狒 1410 3.5278 6.63E-05
域_22586 白頰長臂猿 1411 2.1811 0.0021723
域_22615 智人 1412 3.0957 4.43E-04
域_22654 灰熊 1413 3.248 5.59E-05
域_22667 亞馬遜松鼠猴 1414 3.4947 0.0037256
域_22669 北太平洋小鬚鯨 1415 3.583 4.34E-04
域_22692 克氏冕狐猴(Propithecus coquereli) 1416 3.2791 3.52E-04
域_22710 克氏冕狐猴 1417 3.4387 0.0032081
域_22740 非洲豹 1418 2.692 0.0027611
域_22742 非洲豹 1419 2.9133 0.0027938
域_22768 北極熊 1420 4.0609 7.81E-06
域_22771 美洲黑熊(Ursus americanus) 1421 3.3498 2.83E-05
域_22776 克氏冕狐猴 1422 2.7757 2.88E-04
域_22778 亞馬遜松鼠猴 1423 3.1251 4.93E-04
域_22782 塔斯馬尼亞袋熊(Vombatus ursinus) 1424 3.1663 4.24E-04
域_22917 歐洲馬鹿 1425 3.8061 2.77E-05
域_22919 東非安哥拉黑白疣猴 1426 2.8609 0.003796
域_22928 北樹鼩(Tupaia chinensis) 1427 3.0141 0.0015348
域_22937 灰熊 1428 3.0779 0.0032951
域_22939 小麂(Muntiacus reevesi) 1429 3.6187 1.78E-04
域_22944 小麂 1430 3.3908 5.28E-04
域_23007 伊比利亞猞猁 1431 3.7329 1.09E-04
域_23009 亞馬遜松鼠猴 1432 3.1269 0.0062706
域_23011 歐洲馬鹿 1433 3.6236 3.51E-05
域_23012 歐洲馬鹿 1434 3.6131 2.50E-04
域_23013 歐洲馬鹿 1435 3.4615 4.85E-04
域_23018 東非安哥拉黑白疣猴 1436 3.4177 2.30E-04
域_23039 亞馬遜松鼠猴 1437 2.8829 5.70E-04
域_23040 亞馬遜松鼠猴 1438 2.5742 0.0056531
域_23041 塔斯馬尼亞袋熊 1439 3.6194 1.92E-04
域_23050 北太平洋小鬚鯨 1440 2.9754 0.003318
域_23082 雪貂 1441 3.9481 5.17E-05
域_23093 克氏冕狐猴 1442 3.2165 5.48E-04
域_23109 雪貂 1443 2.9639 0.0019589
域_23113 野雙峰駝(Camelus ferus) 1444 3.4612 3.52E-04
域_23136 小羊駝 1445 3.285 2.16E-04
域_23181 東非安哥拉黑白疣猴 1446 2.7665 0.0021609
域_23196 太平洋海象 1447 4.3363 3.22E-06
域_23200 美洲黑熊 1448 3.755 1.84E-06
域_23215 塔斯馬尼亞袋熊 1449 3.0212 0.0035725
域_23217 塔斯馬尼亞袋熊 1450 4.1674 2.76E-06
域_23239 小羊駝 1451 3.0945 0.0090937
域_23250 白鯨 1452 2.71 3.14E-04
域_23260 北樹鼩 1453 2.7567 0.0029622
域_23281 東非安哥拉黑白疣猴 1454 2.5048 0.0036625
域_23286 雪貂 1455 3.3651 1.66E-04
域_23301 貂熊(Gulo gulo) 1456 2.6839 0.0035226
域_23323 西歐刺蝟 1457 3.2619 0.0031362
域_23331 菲律賓眼鏡猴 1458 2.8995 5.23E-04
域_23336 菲律賓眼鏡猴 1459 2.239 0.0065533
域_23341 菲律賓眼鏡猴 1460 2.656 0.0058992
域_23375 小羊駝 1461 3.266 7.64E-04
域_23378 太平洋海象 1462 3.0623 0.0016508
域_23419 貂熊 1463 3.5213 7.41E-04
域_23453 菲律賓眼鏡猴 1464 2.2331 0.006161
域_23454 菲律賓眼鏡猴 1465 3.0632 7.96E-04
域_23458 小羊駝 1466 2.4232 0.0045857
域_23480 太平洋海象 1467 3.4432 3.38E-04
域_23494 雪貂 1468 3.847 5.05E-06
域_23508 雪貂 1469 2.3582 0.0047712
域_23513 北樹鼩 1470 3.2927 5.31E-05
域_23514 太平洋海象 1471 3.0166 4.77E-04
域_23561 東非安哥拉黑白疣猴 1472 3.2392 0.0021906
域_23574 貂熊 1473 2.939 0.0083249
域_23575 西歐刺蝟 1474 3.4624 0.001589
域_23576 西歐刺蝟 1475 3.8014 2.89E-05
域_23590 太平洋海象 1476 2.8653 0.0052881
域_23604 小羊駝 1477 2.6984 0.0046123
域_23641 菲律賓眼鏡猴 1478 2.6942 0.0081075
域_23642 白鯨 1479 3.8829 2.28E-04
域_23654 菲律賓眼鏡猴 1480 2.337 0.0083622
域_23679 北樹鼩 1481 3.7951 5.10E-05
域_23680 小羊駝 1482 2.712 0.0034785
域_23709 菲律賓眼鏡猴 1483 4.545 1.53E-07
域_23711 貂熊 1484 2.658 0.0016432
域_23721 菲律賓眼鏡猴 1485 2.972 0.0022972
域_23731 東非安哥拉黑白疣猴 1486 3.1609 2.35E-04
域_23745 布氏鼠耳蝠 1487 3.4544 3.54E-04
域_23793 太平洋海象 1488 2.7573 0.0081197
域_23804 東非安哥拉黑白疣猴 1489 2.3403 0.0086366
域_23827 太平洋海象 1490 2.3013 0.009767
域_23854 貂熊 1491 3.838 7.18E-05
域_23856 西歐刺蝟 1492 3.1072 0.0035694
域_23863 雪貂 1493 2.8758 0.0085493
域_23885 東非安哥拉黑白疣猴 1494 3.033 0.0034316
域_23895 雪貂 1495 2.6148 0.003318
域_23898 雪貂 1496 2.7383 0.0035921
域_23916 太平洋海象 1497 3.3232 1.63E-04
域_23931 貂熊 1498 3.8077 1.49E-05
域_23940 智人 1499 2.5087 0.0010424
域_23953 小麂 1500 2.4156 0.0075055
域_23979 北太平洋小鬚鯨 1501 4.0461 5.77E-05
域_24020 馬鐵菊頭蝠 1502 3.1125 1.66E-04
域_24028 灰熊 1503 3.8797 1.53E-07
域_24035 克氏冕狐猴 1504 3.2225 0.0017975
域_24042 克氏冕狐猴 1505 3.3038 4.75E-06
域_24083 布氏鼠耳蝠 1506 3.9804 2.77E-05
域_24113 克氏冕狐猴 1507 3.3264 2.89E-04
域_24152 塔斯馬尼亞袋熊 1508 3.3664 0.0022672
域_24204 克氏冕狐猴 1509 3.0779 4.60E-04
域_24212 中央狐蝠(Pteropus alecto) 1510 2.498 0.0034998
域_24230 小麂 1511 3.1832 1.53E-07
域_24256 灰熊 1512 2.7933 0.0018808
域_24282 小麂 1513 2.694 0.0052575
域_24306 克氏冕狐猴 1514 3.2084 0.0023952
域_24317 布氏鼠耳蝠 1515 3.9767 3.17E-05
域_24379 豬尾獼猴 1516 2.4643 0.0086804
域_24393 克氏冕狐猴 1517 3.8008 2.45E-06
域_24446 克氏冕狐猴 1518 3.6312 7.27E-05
域_24463 北太平洋小鬚鯨 1519 2.5362 0.007147
域_24496 美洲黑熊 1520 3.6403 4.24E-04
域_24515 北太平洋小鬚鯨 1521 3.7358 5.28E-05
域_24518 北太平洋小鬚鯨 1522 3.4135 3.05E-05
域_24546 美洲黑熊 1523 3.4262 8.42E-06
域_24570 亞馬遜松鼠猴 1524 3.6773 1.45E-05
域_24571 北太平洋小鬚鯨 1525 2.6912 0.0038376
域_24600 美洲黑熊 1526 3.156 0.0012483
域_24614 歐洲馬鹿 1527 2.6295 0.0046463
域_24615 東非安哥拉黑白疣猴 1528 2.4075 0.0069247
域_24653 歐洲馬鹿 1529 2.9883 0.0083016
域_24677 伊比利亞猞猁 1530 2.3115 0.0094713
域_24719 小麂 1531 2.7499 0.005142
域_24725 灰熊 1532 3.4496 4.09E-05
域_24771 布氏鼠耳蝠 1533 3.3701 0.0025351
域_24786 塔斯馬尼亞袋熊 1534 2.9237 0.0078001
域_24788 塔斯馬尼亞袋熊 1535 2.7694 0.0021557
域_24838 中央狐蝠 1536 2.3323 0.0042954
域_24867 白頰長臂猿 1537 3.469 2.97E-04
域_24903 大熊貓 1538 3.0377 0.0030054
域_24939 無尾熊 1539 3.3066 6.08E-04
域_24947 北極熊 1540 2.9491 0.0055208
域_24975 赤麂 1541 3.2737 0.0069767
域_24993 家兔 1542 3.3817 5.00E-04
域_25016 家兔 1543 2.9822 0.0034776
域_25052 中央狐蝠 1544 2.3634 0.0072024
域_25060 大熊貓 1545 3.6002 4.82E-04
域_25063 無尾熊 1546 2.9436 0.0042752
域_25070 黑帽懸猴 1547 2.9649 0.0043634
域_25091 無尾熊 1548 2.9006 0.0039332
域_25094 無尾熊 1549 3.0413 0.0026876
域_25106 家犬 1550 2.8622 0.0075508
域_25126 美洲獅 1551 2.1478 0.005514
域_25128 黑帽懸猴 1552 2.588 0.0029475
域_25131 黑帽懸猴 1553 2.592 0.0051895
域_25146 豬尾獼猴 1554 3.629 1.68E-06
域_25150 小麂 1555 3.147 0.0018391
域_25157 布氏鼠耳蝠 1556 3.0902 0.0012442
域_25194 豬尾獼猴 1557 2.4613 0.003597
域_25204 非洲豹 1558 2.7595 0.0027917
域_25234 亞馬遜松鼠猴 1559 2.743 0.0042296
域_25235 家兔 1560 3.6965 1.76E-05
域_25334 無尾熊 1561 2.7501 0.0096299
域_25384 馬鐵菊頭蝠 1562 3.5139 8.10E-05
域_25389 北極熊 1563 3.0814 6.54E-04
域_25400 加拿大猞猁 1564 2.2285 3.10E-04
域_25410 美洲獅 1565 2.8699 0.0022843
域_25443 小麂 1566 3.2531 0.0016615
域_25534 北極熊 1567 2.2698 0.0054246
域_25554 非洲豹 1568 3.0101 0.003898
域_25564 小麂 1569 3.4378 6.04E-04
域_25565 小麂 1570 2.6133 0.0011572
域_25623 北極熊 1571 3.4886 2.91E-06
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域_25654 中央狐蝠 1574 2.2996 0.0031144
域_25671 小麂 1575 3.5244 1.53E-07
域_25682 滇金絲猴 1576 2.5621 0.002108
域_25686 非洲豹 1577 2.8635 0.0031882
域_25726 中央狐蝠 1578 2.8203 0.0039506
域_25741 黑帽懸猴 1579 3.7244 1.32E-04
域_25780 滇金絲猴 1580 2.8383 0.0018385
域_25807 美洲獅 1581 3.6511 0.0018679
域_25842 馬鐵菊頭蝠 1582 3.0942 2.44E-04
域_25844 北極熊 1583 2.5635 0.0037997
域_25857 北太平洋小鬚鯨 1584 2.898 0.0026959
域_25865 塔斯馬尼亞袋熊 1585 3.1027 0.0066133
域_25869 塔斯馬尼亞袋熊 1586 2.3538 0.006932
域_25972 連加蓬蚓螈 1587 3.2178 0.0036689
域_25973 連加蓬蚓螈 1588 2.7804 0.001766
域_25996 連加蓬蚓螈 1589 3.984 1.24E-05
域_26010 連加蓬蚓螈 1590 2.1911 0.008383
域_26012 連加蓬蚓螈 1591 2.3532 9.70E-04
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域_26103 連加蓬蚓螈 1593 2.5308 0.0033422
域_26127 連加蓬蚓螈 1594 2.5183 0.00586
域_26131 連加蓬蚓螈 1595 2.4087 0.0068533
域_26134 連加蓬蚓螈 1596 2.4433 0.0072939
域_26163 連加蓬蚓螈 1597 2.4527 0.0041806
域_26177 連加蓬蚓螈 1598 3.4467 1.27E-05
域_26180 連加蓬蚓螈 1599 3.4522 1.35E-04
域_26194 連加蓬蚓螈 1600 2.8857 0.0031518
域_26211 中華鱉(Pelodiscus sinensis) 1601 2.6058 0.0064871
域_26233 山齒鶉 1602 3.6739 1.77E-04
域_26236 中華鱉 1603 2.7094 0.003991
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域_26292 連加蓬蚓螈 1606 2.4722 0.0074388
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域_26305 連加蓬蚓螈 1608 3.0107 0.0084216
域_26306 連加蓬蚓螈 1609 2.6178 0.0051922
域_26335 山齒鶉 1610 4.0965 3.41E-04
域_26340 中華鱉 1611 3.1704 0.003352
域_26353 中華鱉 1612 3.5785 1.16E-04
域_26373 東部棕蛇(Pseudonaja textilis) 1613 3.3204 5.13E-04
域_26407 山齒鶉 1614 2.9778 0.0049206
域_26414 中華鱉 1615 2.9544 0.0089308
域_26415 中華鱉 1616 2.5032 0.0035489
域_26416 中華鱉 1617 3.6321 4.36E-05
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域_26430 中華鱉 1620 2.6946 0.0051824
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域_26469 中華鱉 1623 3.021 5.08E-04
域_26496 連加蓬蚓螈 1624 2.7991 0.0040994
域_26501 連加蓬蚓螈 1625 2.6513 0.0041882
域_26518 連加蓬蚓螈 1626 2.397 0.0087878
域_26577 連加蓬蚓螈 1627 2.4722 0.0035247
域_26634 沙漠龜 1628 2.8182 0.0079972
域_26636 沙漠龜 1629 2.6934 0.0090052
域_26660 環頸雉 1630 3.201 4.90E-04
域_26679 豹貓守宮 1631 2.6033 0.001326
域_26780 野生火雞 1632 3.1696 0.0031591
域_26783 野生火雞 1633 3.2848 0.0020241
域_26795 野生火雞 1634 3.3538 0.001228
域_26800 野生火雞 1635 3.8197 1.62E-04
域_26803 金鵰(Aquila chrysaetos chrysaetos) 1636 3.4265 0.001246
域_26852 小家鼠 1637 2.8783 0.0025253
域_26853 小家鼠 1638 3.6235 7.59E-04
域_26886 智人 1639 3.3209 0.0016312
域_26925 揚子江鱷 1640 3.2248 0.0036928
域_26999 非洲爪蟾 1641 3.4317 4.75E-06
域_27032 美國短吻鱷 1642 3.4805 0.0019423
域_27285 東方鹿鼠 1643 3.092 5.16E-04
域_27498 野豬 1644 2.9278 0.0029754
域_27521 狐獴 1645 2.7447 0.0010703
域_27563 赤麂 1646 3.6292 6.63E-05
域_27566 赤麂 1647 2.7825 0.0020795
域_27579 赤麂 1648 3.8878 7.50E-06
域_27581 家犬 1649 2.4582 0.0090172
域_27639 長尾獼猴 1650 2.452 0.0032574
域_27642 美洲獅 1651 2.8615 0.0015287
域_27690 避光鼠耳蝠 1652 3.1465 0.0012118
域_27705 無尾熊 1653 2.5921 0.0030483
域_27759 歐洲牛 1654 2.2124 0.0070756
域_27767 白鬢狨 1655 2.2153 0.0023952
域_27777 德克薩斯白尾鹿 1656 2.6766 0.0067364
域_27784 綿羊 1657 2.1631 0.0040915
域_27809 巴拿馬卷尾猴 1658 2.8715 0.0025161
域_27827 赤狐 1659 3.1318 2.13E-05
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域_27902 赤狐 1663 2.9068 0.0039341
域_27988 單峰駱駝 1664 2.5381 0.0015476
域_28051 夏威夷僧海豹 1665 2.4353 0.0018581
域_28071 阿拉斯加海獺 1666 3.2938 2.61E-04
域_28085 阿拉斯加海獺 1667 2.2962 0.0029074
域_28103 抹香鯨 1668 2.4116 0.009594
域_28118 梟猴 1669 3.1049 0.0027807
域_28158 德克薩斯白尾鹿 1670 3.0762 0.0016156
域_28164 白鬢狨 1671 2.7356 0.0064115
域_28299 家山羊 1672 3.5584 6.41E-05
域_28309 馬來大狐蝠 1673 3.5338 3.28E-04
域_28335 倭黑猩猩 1674 3.3013 2.50E-04
域_28341 智人 1675 2.7008 5.14E-04
域_28417 貂熊 1676 2.5366 5.02E-04
域_28421 西歐刺蝟 1677 3.0763 0.0038713
域_28507 小麂 1678 3.2874 8.76E-04
域_28513 克氏冕狐猴 1679 2.3747 0.0050076
域_28533 克氏冕狐猴 1680 2.7575 0.0031303
域_28588 馬鐵菊頭蝠 1681 2.6131 0.0030648
域_28619 馬鐵菊頭蝠 1682 2.6504 0.0027237
域_28823 單色蚯蚓 1683 2.331 0.0078575
域_28845 野雙峰駝 1684 3.0175 0.0017733
域_28929 小家鼠 1685 3.1025 6.70E-04
域_29066 熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis) 1686 2.6393 3.67E-04
域_29164 綠海龜 1687 2.1345 0.0029635
域_29260 東方鹿鼠 1688 2.5127 0.0074146
域_29339 金倉鼠 1689 2.9581 0.0028165
域_29377 金倉鼠 1690 2.672 0.0070692
域_29426 田鼷鼠 1691 2.0491 6.64E-04
域_29434 田鼷鼠 1692 2.2707 0.005184
域_29467 田鼷鼠 1693 3.4689 5.79E-05
域_29471 灰倉鼠 1694 3.1911 4.18E-05
域_29511 東方鹿鼠 1695 3.4739 7.00E-05
域_29614 東方鹿鼠 1696 3.4528 1.82E-04
域_29616 金倉鼠 1697 2.2807 0.0035376
域_29765 西歐刺蝟 1698 3.3088 9.79E-04
域_29900 白頰長臂猿 1699 2.1583 0.0098463
域_30185 川金絲猴 1700 3.0766 5.83E-05
域_30211 野牛 1701 2.3322 0.0023122
域_30236 白鬢狨 1702 2.7293 0.0021744
域_30329 恆河猴 1703 2.1216 0.0099018
域_30783 黑猩猩 1704 2.952 0.001698
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域_31340 智人 1706 2.8261 0.0021028
域_31383 克氏冕狐猴 1707 2.1919 0.0087058
域_31638 北太平洋小鬚鯨 1708 2.0254 0.0036297
域_31798 虎蛇(Notechis scutatus) 1709 4.8007 7.82E-04
域_31935 馬鐵菊頭蝠 1710 3.5544 0.0084786
域_32127 人類 1711 3.7547 2.62E-05
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域_32146 人類 1713 2.7628 0.0016129
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域_32215 人類 1715 3.2653 0.001461
域_32223 人類 1716 2.8836 0.0068873
域_32255 人類 1717 3.8237 1.39E-05
域_32279 人類 1718 2.4917 0.0060199
域_32286 人類 1719 2.8921 0.0070992
域_32312 人類 1720 2.9151 0.0030308
域_32321 人類 1721 3.0441 0.0040854
域_32327 人類 1722 3.1024 0.0044212
域_32334 人類 1723 2.8117 0.0015241
域_32351 人類 1724 2.0727 0.0036362
域_32386 人類 1725 3.5521 3.87E-04
域_32390 人類 1726 3.757 4.30E-05
具有最高log 2(變化倍數)之抑制子域衍生自眼鏡王蛇(king cobra/ Ophiophagus hannah) (域_26749；SEQ ID NO: 135)。出乎意料地，此序列與人類KRAB域截然不同(僅具有41%序列一致性)且被分組於不良抑制子域之序列群集中。
為驗證在獨立分析中之支援選擇之轉錄抑制中鑑別的域，使用前95及1597個抑制子域之代表性成員產生dXR構築體，且測試其抑制 B2M基因座之轉錄的能力。如圖55中所示，轉導後七天，測試出具有除代表性前95或1597個抑制子域之一以外的全部域的dXR對 B2M之抑制程度均大於具有ZNF10 KRAB域之dXR。如圖56中所示，轉導後十天，測試出具有除代表性前95或1597個抑制子域之一以外的全部域的dXR對 B2M之抑制程度均大於具有ZNF10或ZIM3之dXR。dXR對目標基因座之抑制往往會隨時間惡化，且轉導後十天被認為係用於量測dXR抑制之相對較晚的時間點。因此，尤其值得注意的是，直至轉導後十天，具有前95及1597中之抑制子域的許多dXR構築體能夠抑制 B2M的程度仍大於具有衍生自ZNF10或ZIM3之KRAB域的dXR。
為進一步理解所鑑別抑制子域抑制轉錄之優異能力的基礎，使用STREME演算法識別前1597個抑制子域之蛋白質序列模體。特定言之，藉由比較前1597抑制子域之胺基酸序列與具有p值小於0.01且log 2(變化倍數)值小於0之1506抑制子域的陰性訓練組，產生五個模體(模體1至5)。模體1至5之標識提供於圖57A、圖57B、圖57C、圖57D及圖57E中。另外，藉由比較前1597個抑制子域與衍生自1597個抑制子域序列之改組序列來產生四個模體(模體6至9)。模體6至9之標識提供於圖57F、圖57G、圖57H及圖57I中。
下表55提供九個模體中之各者的前1597個抑制子域的p值、E值(統計顯著性量測值)及匹配模體之序列之數目與百分比，如藉由STREME所計算。表56提供各模體之序列，顯示存在於模體內之各位置(自N端至C端)處的胺基酸殘基。 表 55 ：前 1597 個 抑制子域之蛋白質序列模體之特徵
模體ID P 值 E 值 1597 個 抑制子域中匹配模體之部位的數目及百分比
與陰性訓練組比較產生之模體
1 3.7e-014 7.1e-013 1158 (72.5%)
2 3.4e-012 6.4e-011 978 (61.2%)
3 7.5e-010 1.4e-008 1017 (63.7%)
4 7.0e-008 1.3e-006 987 (61.8%)
5 1.7e-007 3.3e-006 678 (42.5%)
與改組序列比較產生之模體
6 1.2e-048 1.5e-047 1597 (100.0%)
7 1.2e-048 1.5e-047 1597 (100.0%)
8 1.3e-042 1.6e-041 1377 (86.2%)
9 2.1e-040 2.7e-039 1483 (92.9%)
表 56 ：前 1597 個 抑制子域之蛋白質序列模體之序列
模體ID 模體中之位置 模體中呈現 ＞5% 的 胺基酸殘基 模體ID 模體中之位置 模體中呈現 ＞5% 的 胺基酸殘基
與陰性訓練組比較產生之模體    與改組序列比較產生之模體
1 1 P    6 1 L
2 A、D、E、N    2 Y
3 L、V    3 K、R
4 I、V    4 D、E
5 S、T、F    5 V
6 H、K、L、Q、R、W    6 M
7 L、M    7 L、Q、R
8 E    8 E
9 G、K、Q、R    9 N、T
2 1 L、V    10 F、Y
2 A、G、L、T、V    11 A、E、G、Q、R、S
3 A、F、S    12 H、L、N
4 L、V    13 L、V
5 G    14 A、G、I、L、T、V
6 C、F、H、I、L、Y    15 A、F、S
7 A、C、P、Q、S    7 1 F
8 A、F、G、I、S、V    2 A、E、G、K、R
9 A、P、S、T    3 D
10 K、R    4 V
3 1 Q    5 A、S、T
2 K、R    6 I、V
3 A、D、E、G、N、S、T    7 D、E、N、Y
4 L    8 F
5 Y    9 S、T
6 R    10 E、L、P、Q、R、W
7 D、E、S    11 D、E
8 V    12 E
9 M    13 W
10 L、R    14 A、E、G、Q、R
4 1 A、L、P、S    8 1 K、R
2 L、V    2 P
3 S、T    3 A、D、E、N
4 F    4 I、L、M、V
5 A、E、G、K、R    5 I、V
6 D    6 F、S、T
7 V    7 H、K、L、Q、R、W
8 A、T    8 L
9 I、V    9 E
10 D、E、N、Y    10 K、Q、R
11 F    11 E、G、R
12 S、T    12 D、E、K
13 E、P、Q、R、W    13 A、D、E
14 E、N    14 L、P
15 E、Q    15 C、W
5 1 E、G、R    9 1 C、H、L、Q、W
2 E、K    2 L
3 A、D、E    3 D、G、N、R、S
4 P    4 L、P、S、T
5 C、W    5 A、S、T
6 I、K、L、M、T、V    6 Q
7 I、L、P、V    7 K、R
8 D、E、K、V    8 A、D、E、K、N、S、T
9 E、G、K、P、R            
10 A、D、R、G、K、Q、V            
11 D、E、G、I、L、R、S、V            
值得注意的是，模體6及7存在於100%的前1597個抑制子域中。已知模體6中之許多高度保守位置(例如胺基酸殘基L1、Y2、V5、M6及E8)與Trim28 (亦稱為Kap1)形成界面，後者負責向基因座募集轉錄抑制機制。類似地，模體7中之殘基(D3、V4、E11、E12)皆有助於Trim28募集。咸信許多經鑑別富集於靠前抑制子域中之胺基酸殘基增強Trim28募集。值得注意的是，通常使用之KRAB域中缺乏此等殘基中之一些。特定言之，在ZNF10中匹配模體6之部位中，第一位置處之殘基為纈胺酸而非白胺酸。在ZIM3中匹配模體7之部位中，位置11處之殘基為甘胺酸而非麩胺酸。上述許多並非存在於所有KRAB域中之其他模體，可能代表對與KRAB域具有同源性之抑制子域的序列群集具有特異性的額外新穎的抑制機制。
總之，本文所描述之實驗已識別出在dXR分子之情形下有效促進轉錄抑制的一系列非人類轉錄抑制子域。此等域抑制轉錄之程度比ZNF10及ZIM3大。最後，鑑別與為最強轉錄抑制子之域相關的蛋白質序列模體。 實例 18 ：前 95 個 抑制子域之成員增加 LTRP5 活性
如實例17中所描述，鑑別在dXR構築體之情形下可產生增強型抑制的非人類抑制子域。此處，進行實驗以測試實例17中鑑別之增強型抑制子域在LTRP5之情形下是否亦為優良轉錄抑制子。 材料及方法：
將實例17中識別且確定為表現最佳的95個抑制子(表65)之成員的代表性抑制子域選殖至不含DNMT3A ADD域之LTRP5構築體中(圖1)。除SV40 NLS存在於抑制子域之下游以外，如實例13中所描述構築LTRP5構築體(表45)。將具有ZIM3 KRAB域的LTRP5分子用作對照。將單獨之質體用於編碼具有靶向 B2M基因座之間隔子7.165 (UCCCUAUGUCCUUGCUGUUU；SEQ ID NO: 3114)的引導骨架316 (SEQ ID NO:1746)。其他對照包括具有ZIM3 KRAB域之dXR分子與具有骨架316及間隔7.165之gRNA，及LTRP5及具有ZIM3 KRAB之dXR分子及非靶向gRNA。選擇間隔子7.165，因為已知其為相對低效間隔子，因此其將增加分析之動態範圍以辨別所測試之各種LTRP分子之間的差異。
除細胞經各50 ng的編碼LTRP構築體之質體及編碼sgRNA之質體轉染以外，如實例14中所描述轉染HEK293T細胞。藉由如實例13中所描述經由HLA免疫染色繼之以流式細胞測量術分析B2M蛋白表現來進行抑制分析。在一個實驗中一起評估95個靠前抑制子域中之72個，其中在轉染之後7、14、19及26天量測B2M表現，且資料顯示於表57至表60中。對於第二實驗中評估之剩餘24個抑制子域，在轉染之後6、13、20及27天量測B2M表現，且資料顯示於表61至表64中。亦包括編碼與靶向 B2M之間隔子7.37 (SEQ ID NO: 3137)配對之催化活性CasX 491之構築體作為對照。 結果：
B2M分析之結果提供於下表57至表64中。 表 57. 轉染後 7 天量化的由具有各種抑制子域之 dXR 及 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平
抑制子構築體 抑制子域 間隔子 平均HLA 陰性細胞% 標準偏差 樣品大小
dXR ZIM3 NT 7.347 1.955 15
LTRP5 ZIM3 NT 5.619 2.520 15
dXR ZIM3 7.165 6.334 1.335 14
LTRP5 域_11029 7.165 33.467 1.290 3
LTRP5 域_4968 7.165 30.133 2.804 3
LTRP5 域_27811 7.165 22.633 0.643 3
LTRP5 域_5066 7.165 37.833 1.026 3
LTRP5 域_15126 7.165 30.333 0.306 3
LTRP5 域_17358 7.165 27.767 3.062 3
LTRP5 域_8503 7.165 29.700 0.889 3
LTRP5 域_11486 7.165 36.667 1.320 3
LTRP5 域_28803 7.165 30.367 0.902 3
LTRP5 域_17317 7.165 25.933 0.586 3
LTRP5 域_24125 7.165 32.667 1.290 3
LTRP5 域_8853 7.165 48.100 4.458 3
LTRP5 域_19949 7.165 31.967 2.511 3
LTRP5 域_737 7.165 41.467 3.258 3
LTRP5 域_16444 7.165 36.367 1.704 3
LTRP5 域_11386 7.165 35.633 1.677 3
LTRP5 域_27506 7.165 39.467 1.504 3
LTRP5 域_10331 7.165 38.300 1.308 3
LTRP5 域_13539 7.165 40.800 2.307 3
LTRP5 域_2380 7.165 41.100 1.277 3
LTRP5 域_18258 7.165 29.133 0.777 3
LTRP5 域_23723 7.165 33.400 2.170 3
LTRP5 域_16806 7.165 35.667 1.450 3
LTRP5 域_18216 7.165 41.400 0.819 3
LTRP5 域_17432 7.165 43.967 0.907 3
LTRP5 域_4806 7.165 36.767 1.747 3
LTRP5 域_25379 7.165 46.467 3.868 3
LTRP5 域_16643 7.165 41.133 1.206 3
LTRP5 域_21603 7.165 34.367 0.404 3
LTRP5 域_21247 7.165 37.867 2.219 3
LTRP5 域_28640 7.165 39.900 1.277 3
LTRP5 ZIM3 7.165 31.940 1.637 15
LTRP5 域_14659 7.165 37.933 1.767 3
LTRP5 域_6248 7.165 36.000 2.352 3
LTRP5 域_11348 7.165 38.433 1.286 3
LTRP5 域_19229 7.165 33.967 0.321 3
LTRP5 域_17759 7.165 43.233 0.924 3
LTRP5 域_24663 7.165 39.433 6.048 3
LTRP5 域_18137 7.165 44.033 0.404 3
LTRP5 域_13331 7.165 38.700 2.163 3
LTRP5 域_6807 7.165 39.500 0.436 3
LTRP5 域_16688 7.165 41.800 0.265 3
LTRP5 域_26322 7.165 42.767 4.661 3
LTRP5 域_6802 7.165 45.767 1.888 3
LTRP5 域_22270 7.165 32.500 1.100 3
LTRP5 域_7255 7.165 43.567 0.451 3
LTRP5 域_5463 7.165 32.533 0.404 3
LTRP5 域_12631 7.165 40.300 0.624 3
LTRP5 域_9960 7.165 43.967 2.363 3
LTRP5 域_6445 7.165 45.667 2.730 3
LTRP5 域_23394 7.165 40.733 2.285 3
LTRP5 域_10948 7.165 42.733 0.924 3
LTRP5 域_19804 7.165 42.067 1.914 3
LTRP5 域_5290 7.165 43.400 1.136 3
LTRP5 域_24458 7.165 43.567 1.332 3
LTRP5 域_19896 7.165 43.600 0.624 3
LTRP5 域_21755 7.165 38.667 1.498 3
LTRP5 域_8790 7.165 34.900 0.608 3
LTRP5 域_881 7.165 43.533 1.858 3
LTRP5 域_14755 7.165 37.350 0.071 2
LTRP5 域_20505 7.165 45.367 0.569 3
LTRP5 域_9114 7.165 43.267 1.501 3
LTRP5 域_13468 7.165 43.700 1.572 3
LTRP5 域_11683 7.165 40.267 0.153 3
LTRP5 域_22153 7.165 46.833 0.643 3
LTRP5 域_25289 7.165 38.533 0.945 3
LTRP5 域_17905 7.165 36.933 1.447 3
LTRP5 域_221 7.165 43.433 0.751 3
LTRP5 域_7694 7.165 52.400 0.436 3
LTRP5 域_15507 7.165 44.067 0.907 3
LTRP5 域_29304 7.165 51.700 1.400 3
LTRP5 域_10123 7.165 47.833 0.666 3
LTRP5 域_30173 7.165 53.900 0.100 3
表 58. 轉染後 14 天量化的由具有各種抑制子域之 dXR 及 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平
抑制子構築體 抑制子域 間隔子 平均HLA 陰性細胞% 標準偏差 樣品大小
dXR ZIM3 NT 1.768 0.862 15
LTRP5 ZIM3 NT 2.902 0.966 15
dXR ZIM3 7.165 3.397 3.091 15
LTRP5 域_11029 7.165 14.667 1.620 3
LTRP5 域_4968 7.165 18.933 1.557 3
LTRP5 域_27811 7.165 15.100 0.854 3
LTRP5 域_5066 7.165 21.133 1.286 3
LTRP5 域_15126 7.165 18.767 2.060 3
LTRP5 域_17358 7.165 16.667 1.815 3
LTRP5 域_8503 7.165 17.367 1.582 3
LTRP5 域_11486 7.165 21.567 2.401 3
LTRP5 域_28803 7.165 20.533 0.666 3
LTRP5 域_17317 7.165 18.833 1.358 3
LTRP5 域_24125 7.165 23.767 0.321 3
LTRP5 域_8853 7.165 25.250 0.212 2
LTRP5 域_19949 7.165 23.633 1.767 3
LTRP5 域_737 7.165 26.767 2.589 3
LTRP5 域_16444 7.165 25.267 0.862 3
LTRP5 域_11386 7.165 26.800 1.868 3
LTRP5 域_27506 7.165 26.267 1.501 3
LTRP5 域_10331 7.165 25.733 1.286 3
LTRP5 域_13539 7.165 28.700 2.152 3
LTRP5 域_2380 7.165 27.533 1.858 3
LTRP5 域_18258 7.165 21.967 0.777 3
LTRP5 域_23723 7.165 23.333 1.501 3
LTRP5 域_16806 7.165 26.367 2.060 3
LTRP5 域_18216 7.165 27.667 1.358 3
LTRP5 域_17432 7.165 29.433 0.462 3
LTRP5 域_4806 7.165 25.500 2.272 3
LTRP5 域_25379 7.165 29.450 2.051 2
LTRP5 域_16643 7.165 26.333 1.890 3
LTRP5 域_21603 7.165 31.367 4.219 3
LTRP5 域_21247 7.165 29.467 0.651 3
LTRP5 域_28640 7.165 28.133 1.350 3
LTRP5 ZIM3 7.165 25.287 1.914 15
LTRP5 域_14659 7.165 28.167 2.676 3
LTRP5 域_6248 7.165 25.433 0.115 3
LTRP5 域_11348 7.165 29.433 2.501 3
LTRP5 域_19229 7.165 25.367 1.656 3
LTRP5 域_17759 7.165 29.867 1.250 3
LTRP5 域_24663 7.165 30.500 1.323 3
LTRP5 域_18137 7.165 28.967 0.839 3
LTRP5 域_13331 7.165 29.333 1.701 3
LTRP5 域_6807 7.165 28.133 0.208 3
LTRP5 域_16688 7.165 29.667 0.153 3
LTRP5 域_26322 7.165 30.033 8.565 3
LTRP5 域_6802 7.165 30.900 1.670 3
LTRP5 域_22270 7.165 26.967 2.967 3
LTRP5 域_7255 7.165 31.500 2.536 3
LTRP5 域_5463 7.165 24.167 1.358 3
LTRP5 域_12631 7.165 31.967 2.108 3
LTRP5 域_9960 7.165 31.900 1.493 3
LTRP5 域_6445 7.165 34.533 1.484 3
LTRP5 域_23394 7.165 25.767 0.666 3
LTRP5 域_10948 7.165 34.267 1.750 3
LTRP5 域_19804 7.165 32.567 2.212 3
LTRP5 域_5290 7.165 34.967 2.810 3
LTRP5 域_24458 7.165 30.433 1.762 3
LTRP5 域_19896 7.165 32.200 0.954 3
LTRP5 域_21755 7.165 27.867 3.630 3
LTRP5 域_8790 7.165 25.033 0.058 3
LTRP5 域_881 7.165 27.533 0.987 3
LTRP5 域_14755 7.165 29.867 0.404 3
LTRP5 域_20505 7.165 35.733 1.150 3
LTRP5 域_9114 7.165 34.467 0.981 3
LTRP5 域_13468 7.165 28.633 1.721 3
LTRP5 域_11683 7.165 32.333 0.757 3
LTRP5 域_22153 7.165 34.533 3.592 3
LTRP5 域_25289 7.165 30.467 2.495 3
LTRP5 域_17905 7.165 32.800 0.529 3
LTRP5 域_221 7.165 33.233 1.012 3
LTRP5 域_7694 7.165 42.367 1.531 3
LTRP5 域_15507 7.165 34.600 2.600 3
LTRP5 域_29304 7.165 42.067 2.948 3
LTRP5 域_10123 7.165 39.667 2.984 3
LTRP5 域_30173 7.165 49.167 1.266 3
表 59. 轉染後 19 天量化的由具有各種抑制子域之 dXR 及 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平
抑制子構築體 抑制子域 間隔子 平均HLA 陰性細胞% 標準偏差 樣品大小
dXR ZIM3 NT 7.326 4.796 15
LTRP5 ZIM3 NT 6.060 4.855 15
dXR ZIM3 7.165 10.038 10.782 15
LTRP5 域_11029 7.165 10.257 1.970 3
LTRP5 域_4968 7.165 14.333 2.579 3
LTRP5 域_27811 7.165 13.200 1.212 3
LTRP5 域_5066 7.165 15.800 0.781 3
LTRP5 域_15126 7.165 17.133 1.097 3
LTRP5 域_17358 7.165 22.700 2.364 3
LTRP5 域_8503 7.165 12.267 2.285 3
LTRP5 域_11486 7.165 16.600 2.138 3
LTRP5 域_28803 7.165 15.200 0.300 3
LTRP5 域_17317 7.165 17.267 1.026 3
LTRP5 域_24125 7.165 19.700 1.652 3
LTRP5 域_8853 7.165 21.333 3.842 3
LTRP5 域_19949 7.165 16.600 1.082 3
LTRP5 域_737 7.165 19.367 1.168 3
LTRP5 域_16444 7.165 20.433 2.026 3
LTRP5 域_11386 7.165 19.333 0.924 3
LTRP5 域_27506 7.165 23.300 1.970 3
LTRP5 域_10331 7.165 22.800 2.007 3
LTRP5 域_13539 7.165 24.267 2.150 3
LTRP5 域_2380 7.165 25.067 3.668 3
LTRP5 域_18258 7.165 21.467 2.344 3
LTRP5 域_23723 7.165 20.367 3.329 3
LTRP5 域_16806 7.165 22.267 1.656 3
LTRP5 域_18216 7.165 22.200 2.193 3
LTRP5 域_17432 7.165 25.967 0.404 3
LTRP5 域_4806 7.165 20.133 2.593 3
LTRP5 域_25379 7.165 26.400 4.583 3
LTRP5 域_16643 7.165 24.733 2.205 3
LTRP5 域_21603 7.165 24.500 5.186 3
LTRP5 域_21247 7.165 23.667 1.002 3
LTRP5 域_28640 7.165 26.767 3.880 3
LTRP5 ZIM3 7.165 22.520 3.682 15
LTRP5 域_14659 7.165 26.067 3.386 3
LTRP5 域_6248 7.165 26.833 4.140 3
LTRP5 域_11348 7.165 24.400 2.476 3
LTRP5 域_19229 7.165 23.133 1.858 3
LTRP5 域_17759 7.165 27.667 0.902 3
LTRP5 域_24663 7.165 26.667 5.493 3
LTRP5 域_18137 7.165 23.967 1.206 3
LTRP5 域_13331 7.165 23.367 1.626 3
LTRP5 域_6807 7.165 23.700 0.265 3
LTRP5 域_16688 7.165 26.367 1.930 3
LTRP5 域_26322 7.165 25.367 8.700 3
LTRP5 域_6802 7.165 45.967 33.520 3
LTRP5 域_22270 7.165 21.133 0.709 3
LTRP5 域_7255 7.165 30.267 2.103 3
LTRP5 域_5463 7.165 18.033 1.893 3
LTRP5 域_12631 7.165 29.100 2.516 3
LTRP5 域_9960 7.165 29.067 3.134 3
LTRP5 域_6445 7.165 31.267 2.040 3
LTRP5 域_23394 7.165 25.267 2.957 3
LTRP5 域_10948 7.165 29.400 1.473 3
LTRP5 域_19804 7.165 26.400 1.442 3
LTRP5 域_5290 7.165 29.133 1.021 3
LTRP5 域_24458 7.165 25.600 2.500 3
LTRP5 域_19896 7.165 28.600 1.997 3
LTRP5 域_21755 7.165 30.233 1.185 3
LTRP5 域_8790 7.165 20.733 0.723 3
LTRP5 域_881 7.165 34.400 3.378 3
LTRP5 域_14755 7.165 25.000 1.700 3
LTRP5 域_20505 7.165 33.800 2.095 3
LTRP5 域_9114 7.165 28.533 0.961 3
LTRP5 域_13468 7.165 31.333 3.580 3
LTRP5 域_11683 7.165 29.533 2.219 3
LTRP5 域_22153 7.165 32.167 3.383 3
LTRP5 域_25289 7.165 31.233 1.890 3
LTRP5 域_17905 7.165 40.933 5.052 3
LTRP5 域_221 7.165 33.933 1.662 3
LTRP5 域_7694 7.165 38.067 2.003 3
LTRP5 域_15507 7.165 31.633 3.609 3
LTRP5 域_29304 7.165 36.900 4.424 3
LTRP5 域_10123 7.165 45.250 0.212 2
LTRP5 域_30173 7.165 42.200 1.414 2
表 60. 轉染後 26 天量化的由具有各種抑制子域之 dXR 及 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平
抑制子構築體 抑制子域 間隔子 平均HLA 陰性細胞% 標準偏差 樣品大小
dXR ZIM3 NT 3.113 3.228 15
LTRP5 ZIM3 NT 4.327 3.294 15
dXR ZIM3 7.165 6.341 4.981 15
LTRP5 域_11029 7.165 8.727 0.401 3
LTRP5 域_4968 7.165 9.963 0.616 3
LTRP5 域_27811 7.165 10.480 1.753 3
LTRP5 域_5066 7.165 11.633 1.790 3
LTRP5 域_15126 7.165 11.897 2.133 3
LTRP5 域_17358 7.165 12.700 2.022 3
LTRP5 域_8503 7.165 13.000 1.480 3
LTRP5 域_11486 7.165 13.300 2.762 3
LTRP5 域_28803 7.165 13.433 1.626 3
LTRP5 域_17317 7.165 14.333 2.346 3
LTRP5 域_24125 7.165 14.967 0.961 3
LTRP5 域_8853 7.165 15.333 1.531 3
LTRP5 域_19949 7.165 15.600 1.082 3
LTRP5 域_737 7.165 16.600 1.127 3
LTRP5 域_16444 7.165 17.067 0.833 3
LTRP5 域_11386 7.165 17.633 1.270 3
LTRP5 域_27506 7.165 17.667 1.450 3
LTRP5 域_10331 7.165 18.033 2.055 3
LTRP5 域_13539 7.165 18.100 2.390 3
LTRP5 域_2380 7.165 18.133 0.723 3
LTRP5 域_18258 7.165 18.200 1.852 3
LTRP5 域_23723 7.165 18.667 1.290 3
LTRP5 域_16806 7.165 18.800 2.718 3
LTRP5 域_18216 7.165 19.333 2.802 3
LTRP5 域_17432 7.165 19.367 1.626 3
LTRP5 域_4806 7.165 19.400 2.022 3
LTRP5 域_25379 7.165 19.667 5.994 3
LTRP5 域_16643 7.165 19.833 1.550 3
LTRP5 域_21603 7.165 20.033 3.482 3
LTRP5 域_21247 7.165 20.067 0.473 3
LTRP5 域_28640 7.165 20.500 2.587 3
LTRP5 ZIM3 7.165 20.607 4.413 15
LTRP5 域_14659 7.165 20.633 2.371 3
LTRP5 域_6248 7.165 20.867 1.193 3
LTRP5 域_11348 7.165 21.367 3.811 3
LTRP5 域_19229 7.165 21.533 1.266 3
LTRP5 域_17759 7.165 21.567 0.833 3
LTRP5 域_24663 7.165 21.633 1.701 3
LTRP5 域_18137 7.165 21.833 1.097 3
LTRP5 域_13331 7.165 21.900 1.153 3
LTRP5 域_6807 7.165 21.900 1.735 3
LTRP5 域_16688 7.165 22.200 2.265 3
LTRP5 域_26322 7.165 22.233 11.832 3
LTRP5 域_6802 7.165 22.433 1.150 3
LTRP5 域_22270 7.165 22.533 2.084 3
LTRP5 域_7255 7.165 22.867 4.271 3
LTRP5 域_5463 7.165 22.900 2.516 3
LTRP5 域_12631 7.165 23.433 2.641 3
LTRP5 域_9960 7.165 23.500 3.996 3
LTRP5 域_6445 7.165 23.633 3.308 3
LTRP5 域_23394 7.165 23.900 1.127 3
LTRP5 域_10948 7.165 23.900 2.166 3
LTRP5 域_19804 7.165 24.133 1.966 3
LTRP5 域_5290 7.165 24.233 2.139 3
LTRP5 域_24458 7.165 24.367 1.531 3
LTRP5 域_19896 7.165 24.633 1.361 3
LTRP5 域_21755 7.165 25.333 1.097 3
LTRP5 域_8790 7.165 25.567 1.320 3
LTRP5 域_881 7.165 26.367 0.208 3
LTRP5 域_14755 7.165 26.867 1.563 3
LTRP5 域_20505 7.165 27.467 3.101 3
LTRP5 域_9114 7.165 28.100 0.872 3
LTRP5 域_13468 7.165 28.100 2.663 3
LTRP5 域_11683 7.165 28.300 1.300 3
LTRP5 域_22153 7.165 28.500 3.716 3
LTRP5 域_25289 7.165 28.600 3.579 3
LTRP5 域_17905 7.165 30.367 0.839 3
LTRP5 域_221 7.165 31.433 3.707 3
LTRP5 域_7694 7.165 32.833 2.517 3
LTRP5 域_15507 7.165 32.933 3.011 3
LTRP5 域_29304 7.165 32.933 4.409 3
LTRP5 域_10123 7.165 35.500 4.814 3
LTRP5 域_30173 7.165 41.967 2.318 3
表 61. 轉染後 6 天量化的由具有各種抑制子域之 dXR 及 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平
構築體 抑制子域 間隔子 平均HLA 陰性細胞% 標準偏差 樣品大小
dXR ZIM3 7.165 7.165 2.389 6
dXR ZIM3 NT 3.625 0.408 6
LTRP5 ZIM3 NT 5.888 0.976 6
LTRP5 域_31643 7.165 15.633 0.551 3
LTRP5 域_19460 7.165 17.133 0.231 3
LTRP5 域_26732 7.165 21.333 0.751 3
LTRP5 域_18563 7.165 21.700 1.100 3
LTRP5 域_19892 7.165 21.967 0.569 3
LTRP5 域_21317 7.165 25.633 0.416 3
LTRP5 域_9114 7.165 23.233 0.907 3
LTRP5 域_10277 7.165 22.900 0.361 3
LTRP5 域_27060 7.165 26.533 0.666 3
LTRP5 域_12452 7.165 26.900 1.510 3
LTRP5 域_21336 7.165 23.533 0.961 3
LTRP5 域_30661 7.165 24.867 1.801 3
LTRP5 域_12292 7.165 30.700 0.436 3
LTRP5 域_8853 7.165 31.167 0.987 3
LTRP5 域_9538 7.165 29.800 1.952 3
LTRP5 域_19821 7.165 26.200 1.652 3
LTRP5 ZIM3 7.165 23.083 3.178 6
LTRP5 域_26070 7.165 29.433 2.272 3
LTRP5 域_19476 7.165 27.867 0.808 3
LTRP5 域_4687 7.165 30.133 0.808 3
LTRP5 域_25405 7.165 33.467 1.097 3
LTRP5 域_10577 7.165 28.933 0.473 3
LTRP5 域_2942 7.165 30.633 1.429 3
LTRP5 域_27604 7.165 28.700 1.300 3
LTRP5 域_7694 7.165 36.633 0.666 3
LTRP5 域_29304 7.165 34.933 0.289 3
LTRP5 域_9331 7.165 37.733 0.321 3
LTRP5 域_30173 7.165 33.900 0.794 3
LTRP5 域_26749 7.165 40.467 0.945 3
LTRP5 域_27385 7.165 35.933 0.473 3
CasX 491 N/A 7.37 76.167 0.808 3
表 62. 轉染後 13 天量化的由具有各種抑制子域之 dXR 及 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平
構築體 抑制子域 間隔子 平均HLA 陰性細胞% 標準偏差 樣品大小
dXR ZIM3 7.165 7.258 14.130 6
dXR ZIM3 NT 1.218 0.144 6
LTRP5 ZIM3 NT 1.712 0.328 6
LTRP5 域_31643 7.165 6.800 0.786 3
LTRP5 域_19460 7.165 9.690 0.147 3
LTRP5 域_26732 7.165 10.800 0.173 3
LTRP5 域_18563 7.165 12.100 1.587 3
LTRP5 域_19892 7.165 12.900 0.458 3
LTRP5 域_21317 7.165 13.967 0.513 3
LTRP5 域_9114 7.165 13.767 1.504 3
LTRP5 域_10277 7.165 15.333 1.150 3
LTRP5 域_27060 7.165 13.867 1.457 3
LTRP5 域_12452 7.165 15.700 1.562 3
LTRP5 域_21336 7.165 14.267 0.651 3
LTRP5 域_30661 7.165 14.933 1.537 3
LTRP5 域_12292 7.165 17.967 0.666 3
LTRP5 域_8853 7.165 18.600 0.361 3
LTRP5 域_9538 7.165 18.733 1.102 3
LTRP5 域_19821 7.165 15.867 2.237 3
LTRP5 ZIM3 7.165 18.267 3.578 6
LTRP5 域_26070 7.165 18.233 1.960 3
LTRP5 域_19476 7.165 20.100 1.323 3
LTRP5 域_4687 7.165 19.767 0.961 3
LTRP5 域_25405 7.165 22.100 1.609 3
LTRP5 域_10577 7.165 21.133 1.266 3
LTRP5 域_2942 7.165 21.633 2.101 3
LTRP5 域_27604 7.165 24.700 2.364 3
LTRP5 域_7694 7.165 26.900 0.436 3
LTRP5 域_29304 7.165 25.367 0.462 3
LTRP5 域_9331 7.165 27.133 0.681 3
LTRP5 域_30173 7.165 25.400 0.656 3
LTRP5 域_26749 7.165 27.700 0.608 3
LTRP5 域_27385 7.165 27.733 0.808 3
CasX 491 N/A 7.37 81.167 0.945 3
表 63. 轉染後 20 天量化的由具有各種抑制子域之 dXR 及 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平
構築體 抑制子域 間隔子 平均HLA 陰性細胞% 標準偏差 樣品大小
dXR ZIM3 7.165 1.120 0.345 6
dXR ZIM3 NT 1.425 1.093 6
LTRP5 ZIM3 NT 2.412 2.055 6
LTRP5 域_31643 7.165 6.147 1.909 3
LTRP5 域_19460 7.165 8.290 0.460 3
LTRP5 域_26732 7.165 7.950 1.171 3
LTRP5 域_18563 7.165 10.163 1.163 3
LTRP5 域_19892 7.165 11.800 1.249 3
LTRP5 域_21317 7.165 12.833 2.581 3
LTRP5 域_9114 7.165 12.467 0.681 3
LTRP5 域_10277 7.165 13.633 0.635 3
LTRP5 域_27060 7.165 12.400 1.375 3
LTRP5 域_12452 7.165 13.233 0.451 3
LTRP5 域_21336 7.165 12.733 0.503 3
LTRP5 域_30661 7.165 13.633 0.379 3
LTRP5 域_12292 7.165 14.300 0.100 3
LTRP5 域_8853 7.165 16.200 2.524 3
LTRP5 域_9538 7.165 16.200 1.100 3
LTRP5 域_19821 7.165 14.233 1.790 3
LTRP5 ZIM3 7.165 17.033 4.457 6
LTRP5 域_26070 7.165 16.467 1.401 3
LTRP5 域_19476 7.165 17.133 0.569 3
LTRP5 域_4687 7.165 16.700 0.755 3
LTRP5 域_25405 7.165 19.300 1.114 3
LTRP5 域_10577 7.165 18.167 0.551 3
LTRP5 域_2942 7.165 18.567 2.001 3
LTRP5 域_27604 7.165 21.533 1.850 3
LTRP5 域_7694 7.165 22.467 0.709 3
LTRP5 域_29304 7.165 22.033 1.365 3
LTRP5 域_9331 7.165 22.800 1.510 3
LTRP5 域_30173 7.165 24.800 3.936 3
LTRP5 域_26749 7.165 24.633 1.290 3
LTRP5 域_27385 7.165 23.633 1.935 3
CasX 491 N/A 7.37 83.633 3.443 3
表 64. 轉染後 27 天量化的由具有各種抑制子域之 dXR 及 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平
構築體 抑制子域 間隔子 平均HLA 陰性細胞% 標準偏差 樣品大小
dXR ZIM3 7.165 1.845 1.522 6
dXR ZIM3 NT 2.463 2.385 6
LTRP5 ZIM3 NT 3.022 2.959 6
LTRP5 域_31643 7.165 3.687 0.562 3
LTRP5 域_19460 7.165 5.853 0.416 3
LTRP5 域_26732 7.165 6.647 0.985 3
LTRP5 域_18563 7.165 7.660 0.939 3
LTRP5 域_19892 7.165 8.920 0.596 3
LTRP5 域_21317 7.165 9.640 0.487 3
LTRP5 域_9114 7.165 10.167 2.191 3
LTRP5 域_10277 7.165 10.237 0.446 3
LTRP5 域_27060 7.165 10.377 1.046 3
LTRP5 域_12452 7.165 10.473 0.654 3
LTRP5 域_21336 7.165 10.767 0.404 3
LTRP5 域_30661 7.165 11.133 1.790 3
LTRP5 域_12292 7.165 11.833 0.252 3
LTRP5 域_8853 7.165 11.967 1.401 3
LTRP5 域_9538 7.165 12.100 1.000 3
LTRP5 域_19821 7.165 12.200 1.868 3
LTRP5 ZIM3 7.165 12.483 2.585 6
LTRP5 域_26070 7.165 13.533 2.401 3
LTRP5 域_19476 7.165 13.900 1.153 3
LTRP5 域_4687 7.165 13.900 1.970 3
LTRP5 域_25405 7.165 14.467 1.387 3
LTRP5 域_10577 7.165 15.233 1.301 3
LTRP5 域_2942 7.165 15.433 2.255 3
LTRP5 域_27604 7.165 18.600 2.307 3
LTRP5 域_7694 7.165 19.067 1.021 3
LTRP5 域_29304 7.165 19.167 1.935 3
LTRP5 域_9331 7.165 19.333 0.808 3
LTRP5 域_30173 7.165 20.133 0.764 3
LTRP5 域_26749 7.165 20.467 0.493 3
LTRP5 域_27385 7.165 21.000 1.411 3
CasX 491 N/A 7.37 80.933 0.451 3
如表57至表64中所示，相比於使用LTRP5-ZIM3構築體達成之抑制水平，用含有增強抑制子域之大部分LTRP5構築體(與含有間隔子7.165之gRNA配對)處理產生更高水平之B2M抑制。來自此等實驗之資料用於使用以下準則鑑別前9個候選抑制子域。首先，在以上實驗中之所有四個時間點，如藉由B2M基因減量所量測之平均抑制活性相比於藉由LTRP5-ZIM3對照展現之平均抑制活性顯示出至少20%增加，由此產生三個抑制子域的選擇。為鑑別更多候選抑制子域，至少在兩個時間點(優先考慮較晚的時間點)上比LTRP5-ZIM3對照表現出的平均活性至少增加20%的域；以及第三，從75個群集(在實例17中論述)中選擇表現最佳的域，以保持胺基酸序列的多樣性，或排除與先前識別的人類抑制子域序列一致性＞90%的域(Tycko, J.等人, High-Throughput Discovery and Characterization of Human Transcriptional Effectors Cell. 183(7):2020-2035 (2020))。所識別之九個最有效抑制子域為域_7694、域_10123、域_15507、域_17905、域_20505、域_26749、域_27604、域_29304及域_30173，且其序列列於表65中。 表 65. 前 9 個 及前 95 個最有效抑制子域的清單
域ID 描述 SEQ ID NO
前 9 個抑制子域
域_7694 野鴿抑制子域 130
域_10123 褐家鼠抑制子域 131
域_15507 巴拿馬卷尾猴抑制子域 132
域_17905 黑猩猩抑制子域 133
域_20505 西非綠猴抑制子域 134
域_26749 眼鏡王蛇抑制子域 135
域_27604 大熊貓抑制子域 136
域_29304 東方鹿鼠抑制子域 137
域_30173 蒼白矛鼻蝠抑制子域 138
前95 個抑制子域中的剩餘抑制子域
域_737 倭黑猩猩抑制子域 139
域_10331 東非安哥拉黑白疣猴抑制子域 140
域_10948 東非安哥拉黑白疣猴抑制子域 141
域_11029 鬼狒抑制子域 142
域_17358 印度牛x歐洲牛抑制子域 143
域_17759 家貓抑制子域 144
域_18258 抹香鯨抑制子域 145
域_19804 北方海狗抑制子域 146
域_221 倭黑猩猩抑制子域 147
域_881 倭黑猩猩抑制子域 148
域_2380 紅毛猩猩抑制子域 149
域_2942 長臂猿抑制子域 150
域_4687 狨猴抑制子域 151
域_4806 狨猴抑制子域 152
域_4968 狨猴抑制子域 153
域_5066 狨猴抑制子域 154
域_5290 梟猴抑制子域 155
域_5463 梟猴抑制子域 156
域_6248 亞馬遜松鼠猴抑制子域 157
域_6445 揚子江鱷抑制子域 158
域_6802 玉米蛇抑制子域 159
域_6807 非洲爪蟾抑制子域 160
域_7255 單色蚯蚓抑制子域 161
域_8503 田鼷鼠抑制子域 162
域_8790 美洲旱獺抑制子域 163
域_8853 金倉鼠抑制子域 164
域_9114 東方鹿鼠抑制子域 165
域_9331 東方鹿鼠抑制子域 166
域_9538 小家鼠抑制子域 167
域_9960 八齒鼠抑制子域 168
域_10277 奧氏更格盧鼠抑制子域 169
域_10577 東非安哥拉黑白疣猴抑制子域 170
域_11348 西非綠猴抑制子域 171
域_11386 家山羊抑制子域 172
域_11486 野犛牛抑制子域 173
域_11683 白頰長臂猿抑制子域 174
域_12292 野豬抑制子域 175
域_12452 長江江豚抑制子域 176
域_12631 長尾獼猴抑制子域 177
域_13331 長尾獼猴抑制子域 178
域_13468 無尾熊抑制子域 179
域_13539 大猩猩抑制子域 180
域_14659 獵豹抑制子域 181
域_14755 巴拿馬卷尾猴抑制子域 182
域_15126 白鬢狨抑制子域 183
域_16444 獵豹抑制子域 184
域_16688 白鱀豚抑制子域 185
域_16806 黑帽懸猴抑制子域 186
域_17317 小耳大嬰猴抑制子域 187
域_17432 小耳大嬰猴抑制子域 188
域_18137 負鼠抑制子域 189
域_18216 抹香鯨抑制子域 190
域_18563 梟猴抑制子域 191
域_19229 阿拉斯加海獺抑制子域 192
域_19460 負鼠抑制子域 193
域_19476 梟猴抑制子域 194
域_19821 川金絲猴抑制子域 195
域_19892 北極熊抑制子域 196
域_19896 綿羊抑制子域 197
域_19949 北方海狗抑制子域 198
域_21247 美洲水鼬抑制子域 199
域_21317 馬來大狐蝠抑制子域 200
域_21336 家馬抑制子域 201
域_21603 白鱀豚抑制子域 202
域_21755 家馬抑制子域 203
域_22153 加州海獅抑制子域 204
域_22270 倭黑猩猩抑制子域 205
域_23394 小羊駝抑制子域 206
域_23723 菲律賓眼鏡猴抑制子域 207
域_24125 亞馬遜松鼠猴抑制子域 208
域_24458 伊比利亞猞猁抑制子域 209
域_24663 布氏鼠耳蝠抑制子域 210
域_25289 北極熊抑制子域 211
域_25379 黑帽懸猴抑制子域 212
域_25405 吸血蝠抑制子域 213
域_26070 連加蓬蚓螈抑制子域 214
域_26322 連加蓬蚓螈抑制子域 215
域_26732 野生火雞抑制子域 216
域_27060 沙漠龜抑制子域 217
域_27385 八齒鼠抑制子域 218
域_27506 野犛牛抑制子域 219
域_27811 白鬢狨抑制子域 220
域_28640 山齒鶉抑制子域 221
域_28803 負鼠抑制子域 222
域_30661 抹香鯨抑制子域 223
域_31643 南美珊瑚蛇抑制子域 224
因此，本文所描述之實驗證實，使用實例17中識別之增強型抑制子域在LTRP構築體之情形下產生改良之轉錄抑制水平。 實例 19 ：識別增強型抑制子域的替代共通蛋白序列模體
在先前實例17中，使用以下方法為前1597個增強型抑制子域生成九個蛋白質序列模體(圖57A至圖57I)：1)將前1597個抑制子域之胺基酸序列與p值小於0.01且log 2(變化倍數)值小於0的1506個抑制子域的陰性訓練組進行比較；及2)將前1597個域的胺基酸序列與衍生自1597個序列的改組序列進行比較。在此實例中，藉由比較前1597個抑制子域之胺基酸序列與含有人類ZIM3 (SEQ ID NO: 128)及ZNF10 KRAB域(SEQ ID NO: 129)之胺基酸序列的陰性訓練組，來產生五個或更多個替代共通蛋白序列模體。此等所得五個模體之標識提供於圖58A至圖58E中。下表66提供五個替代模體中之各者的前1597個抑制子域的未調節p值及匹配模體之序列之數目與百分比，如藉由STREME所計算。表67提供各模體之序列，顯示存在於模體內之各位置(自N端至C端)處的胺基酸殘基。 表 66 ： 當與含有 ZIM3 及 ZNF10 之陰性訓練組相比時 ， 產生的前 1597 個增強型抑制子域之替代共通蛋白序列模體的特徵。
替代模體ID 未調節之 P 值 1597 個 增強域中匹配模體之部位的數目及百分比
1 1.7E-001 1432 (89.7%)
2 2.1E-001 1236 (77.4%)
3 2.7E-001 1058 (66.2%)
4 4.2E-001 1554 (97.3%)
5 4.3E-001 679 (42.5%)
表 67 ： 1597 個增強型抑制子域之替代共通蛋白序列模體的特徵。
模體ID 模體中之位置 模體中呈現 ＞5% 的 胺基酸殘基
1 1 D
2 V
3 A
4 V
5 Y
6 F
7 S
8 P
9 E
10 E
11 W
12 G
13 C
14 L
2 1 A、D、G、N、R、S
2 P、S、T
3 A、S、T
4 Q
5 K、R
6 A、D、K、N、S、T
7 L
8 Y
3 1 A、P、S
2 K
3 P
4 A、D、E
5 L、M、V
6 I、V
7 F、S、T
8 H、K L、Q、R、W
4 1 L
2 E
3 E、K、Q、R
4 E、G、R
5 A、D、E、K
6 A、D、E
7 L、P
8 C、W
5 1 D、E
2 V
3 M
4 L
5 E
6 N、T
7 Y
8 A、E、G、Q、R、S
9 H、N
10 L、M、V
11 A、L、V
12 S
13 L、V
14 A、G、V
15 C、F、L
如此實例中所描述使用之方法產生與1597個抑制子域相關之替代模體，該等抑制子域經鑑別為實例17中之最強轉錄抑制子。值得注意的是，替代模體1、2、3及5未在ZIM3或ZNF10中發現，而實際上獨特地在大部分1597個最高抑制子域中發現。此外，替代模體1之每個胺基酸位置似乎高度保守且在近90%的1597個域中均有發現；咸信此序列在調節Trim28之募集及涉及轉錄及表觀遺傳抑制之下游因子方面至關重要。對於所識別的其他替代共通模體，此等模體可表示對某些抑制子域群集具有特異性的額外新型抑制機制。 實例 20 ： 使用 DNMT1 抑制劑證實由 LTRP 分子介導之目標基因座之沉默可逆
進行實驗以證實由LTRP分子介導的目標基因座之持久抑制可逆，使得用DNMT1抑制劑處理將移除甲基標記物以再活化目標基因之表現。 材料及方法：
此實驗中使用含有ZIM3-KRAB域之LTRP #5 (其如實例13中所描述而產生)及CasX變異體491。此實驗中使用具有含有間隔子7.37 (SEQ ID NO: 3137)之骨架174的靶向 B2M之gRNA或含有間隔子0.0 (SEQ ID NO: 3232)的非靶向gRNA。 HEK293T細胞之轉染：
用100 ng質體轉染HEK293T細胞，該質體含有編碼CasX 491或含有ZIM3-KRAB域之LTRP #5與具有靶向B2M之gRNA或非靶向gRNA的構築體，且培養58天。隨後以約30,000個細胞/96孔盤之孔再接種此等經轉染HEK293T細胞，且用濃度範圍在0 µM至20 µM內的DNMT1抑制劑5-氮雜-2'-去氧胞苷(5-azadC)處理。在用5-azadC處理後六天，收集細胞以在轉染後第5天、第12天及第21天用於B2M沉默分析。簡言之，藉由如實例13中所描述經由HLA免疫染色繼之以流式細胞測量術分析B2M蛋白表現來進行抑制分析。重複三次進行各實驗條件的各劑量之5-azadC的處理。 結果：
圖59中之圖表顯示用指定濃度之表現B2M蛋白之5-azadC處理的經轉染HEK293T細胞之百分比。資料證實，經編碼LTRP5-ZIM3與靶向 B2M之gRNA的質體轉染的細胞的5-azadC處理引起 B2M基因之再活化(圖59)。特定言之，與25%細胞在0 µM濃度下具有B2M表現相比，約75%經20 µM 5-azadC處理之細胞展現B2M表現(圖59)。此外，經編碼CasX 491與靶向B2M之gRNA之的質體轉染的細胞之5-azadC處理並未展現 B2M基因之再活化。圖60為並列示出5-azadC處理後的B2M抑制活性與基因再活化的圖表。資料顯示經CasX 491或LTRP5-ZIM3與靶向 B2M之gRNA之轉染後的B2M抑制，在第58天引起約75%之B2M表現抑制；然而，B2M表現在5-azadC處理後增加(圖60)。如所預期，經CasX 491或LTRP5-ZIM3與非靶向gRNA轉染之細胞的5-azadC處理未展現抑制或再活化(圖59至圖60)。
實驗證實LTRP介導的目標基因座抑制之可逆性。藉由使用DNMT1抑制劑移除LTRP分子形成之甲基標記，再活化沉默目標基因以誘導目標蛋白之表現。 實例 21 ： LTRP 融合蛋白之例示性序列
表68提供組態1、4或5的例示性全長LTRP融合蛋白，其具有ADD域(圖2)，具有人類ZIM3或ZNF10 KRAB域或以下前九個最有效抑制子域之一：域_7694、域_10123、域_15507、域_17905、域_20505、域_26749、域_27604、域_29304及域_30173。在表68中，組分按自N端至C端次序列出。 實例 68 ： LTRP 融合蛋白之例示性蛋白序列
LTRP # 組分 域 胺基酸序列 SEQ ID NO
具有ADD域之LTRP1 起始密碼子+ NLS +緩衝序列 3269
起始密碼子+ DNMT3A ADD域 3270
DNMT3A催化域 126
連接子(L2) 122
DNMT3L相互作用域 127
連接子(L1) 123
連接子(L3A) +緩衝序列 3271
dCasX491 4
緩衝序列+連接子(L3B) 3272
抑制子域1 人類ZIM3 3240
人類ZNF10 3239
野鴿抑制子域(域_7694) 130
褐家鼠抑制子域(域_10123) 131
巴拿馬卷尾猴抑制子域(域_15507) 132
黑猩猩抑制子域(域_17905) 133
西非綠猴抑制子域(域_20505) 134
眼鏡王蛇抑制子域(域_26749) 135
大熊貓抑制子域(域_27604) 136
東方鹿鼠抑制子域(域_29304) 137
蒼白矛鼻蝠抑制子域(域_30173) 138
緩衝序列+ NLS 3273
具有ADD域之LTRP4 起始密碼子+ NLS +緩衝序列 3269
抑制子域1 人類ZIM3 3240
人類ZNF10 3239
野鴿抑制子域(域_7694) 130
褐家鼠抑制子域(域_10123) 131
巴拿馬卷尾猴抑制子域(域_15507) 132
黑猩猩抑制子域(域_17905) 133
西非綠猴抑制子域(域_20505) 134
眼鏡王蛇抑制子域(域_26749) 135
大熊貓抑制子域(域_27604) 136
東方鹿鼠抑制子域(域_29304) 137
蒼白矛鼻蝠抑制子域(域_30173) 138
連接子(L3A) +緩衝序列 3271
起始密碼子+ DNMT3A ADD域 3270
DNMT3A催化域 126
連接子(L2) 122
DNMT3L相互作用域 127
連接子(L1) 123
dCasX491 4
緩衝序列+連接子(L3B) 3272
NLS 30
具有ADD域之LTRP5 起始密碼子+ NLS +緩衝序列 3269
起始密碼子+ DNMT3A ADD域 3270
DNMT3A催化域 126
連接子(L2) 122
DNMT3L相互作用域 127
連接子(L3A) 124
抑制子域1 人類ZIM3 3240
人類ZNF10 3239
野鴿抑制子域(域_7694) 130
褐家鼠抑制子域(域_10123) 131
巴拿馬卷尾猴抑制子域(域_15507) 132
黑猩猩抑制子域(域_17905) 133
西非綠猴抑制子域(域_20505) 134
眼鏡王蛇抑制子域(域_26749) 135
大熊貓抑制子域(域_27604) 136
東方鹿鼠抑制子域(域_29304) 137
蒼白矛鼻蝠抑制子域(域_30173) 138
連接子(L1) 123
dCasX491 4
緩衝序列+連接子(L3B) 3272
NLS 30
表69提供LTRP構築體之組分之例示性胺基酸序列。在表69中，展示無起始甲硫胺酸之蛋白質域。 表 69 ： LTRP 構築體之組分之例示性蛋白質序列。
組分 胺基酸序列SEQ ID NO
DNMT3A催化域(CD) 126
DNMT3L相互作用域 127
dCasX491 4
連接子1 (L1) 123
連接子2 (L2) 122
連接子3A (L3A) 124
連接子3B (L3B) 120
NLS 30
DNMT3A ADD域 125
實例 22 ： 初步評估使用 LTRP 分子及靶向 PCSK9 之 gRNA 抑制 PCSK9 基因座以活體外減少 PCSK9 分泌之全基因體轉錄組效應
進行實驗以確定使用LTRP分子與靶向gRNA抑制人類細胞 PCSK9基因座以及減少PCSK9分泌水平的能力。特定言之，評估全基因體轉錄組效應以測定用LTRP5-ADD-ZIM3及所選靶向 PCSK9之間隔子處理細胞的脫靶效應的程度。 材料及方法： 人類 Huh7 細胞 之轉染：
編碼以下分子之mRNA遵循如實例2中所描述之類似方法由IVT產生：1)催化活性CasX 676 (如實例5中所描述)、2) dXR1 (如實例2中所描述)及3) LTRP5-ADD-ZIM3 (如實例2中所描述)。CasX 676之DNA及mRNA序列展示於表21及表22中；dXR1之DNA及mRNA序列展示於表11及表12中；LTRP5-ADD-ZIM3之DNA及mRNA序列展示於表18及表19中。
使用gRNA骨架316設計含有靶向 PCSK9基因座之所選NHP保守間隔子的gRNA且使用v1修飾概況(如實例7中所描述)以化學方式合成。鑒於如實例3所示此等NHP保守間隔子在持續PCSK9抑制方面展現至少36天的功效，因此選擇了此等NHP保守間隔子，其為TG-06-154、TG-06-167、TG-06-133、TG-06-146及TG-06-352，TG-06-138 (關於SEQ ID NO參見表17)用於與dXR1以及LTRP5-ADD-ZIM3配對，且間隔子TG-06-001(亦稱為間隔子6.1；SEQ ID NO: 1834)用於與CasX 676配對。非靶向間隔子用作實驗對照。
用編碼催化活性CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA及具有骨架316及靶向 PCSK9基因座之間隔子的gRNA轉染所接種之Huh7細胞。轉染後6天及26天收集細胞，且隨後溶解且儲存於DNA/RNA Shield (Zymo Research)中。作為額外對照，亦收集未經處理之原始細胞。使用Quick-DNA/Miniprep Plus套組(Zymo Research)對所收集之樣品進行gDNA/RNA提取。RNA樣品用於總RNA定序(RNA-seq)，其由第三方進行。接收原始FASTQ檔案且用FASTQC處理，且使用Trim Galore修整銜接子。接著使用鮭魚針對hg38基因體量化轉錄物表現以產生各基因之標準化計數(轉錄物/百萬，或TPM)。使用DESeq2進行差異表現分析。所有樣品中具有少於10個計數之基因自分析省略，且進行所有逐對的比較(例如未經處理及處理條件下兩個時間點的差異基因表現分析)，其中顯著性臨限值為|log2FC| ＞ 2及經調節之p值＜0.001。 結果：
用編碼CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA及靶向 PCSK9之gRNA轉染Huh7細胞，且轉染後6天及26天收集以用於RNA-seq分析。針對各實驗條件測定標準化 PCSK9讀段計數之定量，且計算比較各實驗條件及未經處理條件之標準化 PCSK9轉錄物計數的log2變化倍數(表70)。RNA-seq分析揭露當與LTRP5-ADD-ZIM3配對時，間隔子TG-06-154、TG-06-167以及TG-06-133的使用可有利地抑制 PCSK9的表現直至第26天(表70)。此外，儘管使用非靶向間隔子與LTRP5-ADD-ZIM3似乎減少PCSK9表現，但與用間隔子TG-06-154、TG-06-167及TG-06-133達成之抑制水平相比，此抑制水平並不高。如所預期，使用間隔子TG-06-138與dXR1引起 PCSK9基因座之短暫沉默，但出乎意料地，當使用與CasX 676配對之間隔子6.1時， PCSK9的下調在第26天減弱(表70)。 表 70 ： 各指定實驗條件下之標準化 PCSK9 讀段計數之 Log2FC 與未經處理之條件下的比較。
分子 間隔子 PCSK9 讀段計數之Log2FC - 第 6 天 PCSK9 讀段計數之Log2FC - 第 26 天
CasX 676 NT 0.022 -0.001
CasX 676 6.1 -1.826 -0.818
dXR1 NT 0.016 0.068
dXR1 TG-06-138 -4.291 -0.266
LTRP5-ADD-ZIM3 NT -0.700 -1.094
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-138 -4.254 -1.861
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-154 -5.202 -4.283
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-167 -3.404 -2.856
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-133 -3.342 -2.773
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-146 -3.709 -1.755
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-352 -3.330 -1.981
藉由比較各實驗條件與未經處理之對照來進行差異基因表現分析，以確定在處理之後6天及26天偵測之上調及下調基因之數目。差異表現之基因的定量展示於表71中。示出LTRP5-ADD-ZIM3與非靶向間隔子、LTRP5-ADD-ZIM3與間隔子TG-06-154及LTRP5-ADD-ZIM3與間隔子TG-06-133之差異基因表現分析的代表性火山圖分別展示於圖65A至圖65B、圖66A至圖66B及圖67A至圖67B。選擇TG-06-154、TG-06-133及TG-06-167係基於其抑制PCSK9表現至第26天之能力。資料表明此等三種靶向PCSK9之間隔子中，在與LTRP5-ADD-ZIM3一起評估時，使用間隔子TG-06-133產生的差異調節之脫靶基因數目最少。同時，使用間隔子TG-06-154或TG-06-167產生更多數目之經差異調節之脫靶基因，尤其在轉染後26天之較晚時間點處(表71)。此外，使用dXR1及間隔子TG-06-138之短暫抑制在第26天引起最小轉錄組變化。 表 71 ： 在兩個指定時間點各治療條件之經差異調節之脫靶基因的數目與未經處理之對照的比較。 應用之統計顯著性臨限值為 |log2FC| ＞2 且經調節之 p 值 ＜0.001 。
分子 間隔子 差異表現之基因# ( 脫靶) - 第6 天 差異表現之基因# ( 脫靶) - 第26 天
下調 上調 下調 上調
CasX 676 NT 0 0 0 0
CasX 676 6.1 0 0 0 0
dXR1 NT 0 0 0 0
dXR1 TG-06-138 3 14 0 1
LTRP5-ADD-ZIM3 NT 0 0 9 35
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-138 2 0 0 0
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-154 2 0 6 10
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-167 2 0 18 21
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-133 2 0 0 0
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-146 1 7 0 0
LTRP5-ADD-ZIM3 TG-06-352 2 1 0 0
此等實驗展示使用LTRP分子及靶向PCSK9之gRNA抑制人類細胞 PCSK9基因座之全基因體轉錄組效應的初步分析。來自此等實驗之資料展示分析此等全基因體轉錄組效應將有助於識別靶向 PCSK9基因座之候選間隔子。 實例 23 ： 評估 PCSK9 間隔子與 LTRP5-ADD 分子配對時在人類肝細胞中的實現情況
進行實驗，以全面評估與含有ADD域之組態#5 LTRP分子(LTRP5；如圖2所示)配對的具有TTC識別模體之靶向 PCSK9之間隔子。簡言之，進行活體外實驗以評估誘導人類 PCSK9基因座持久抑制以及引起PCSK9分泌之實質性減少的間隔子。 材料及方法：
如實例3中所描述執行計算篩選，其識別69個TTC間隔子以供後續實驗評估。在此等69個TTC間隔子中，使用如隨後方法中所描述之基於細胞之分析對61個間隔子進行進一步活體外篩選。除61個間隔子以外，在獨立計算篩選中鑑別出另外四個間隔子，該篩選使用與實例3中所描述類似的方法，但添加一個準則：亦即排除與次要對偶基因頻率(MAF)＞0.05的SNP重疊的TTC間隔子。因此，總共65個間隔子使用描述於以下方法中之基於細胞之分析以經受活體外實驗。表72中列出在此實驗中所測試之65個靶向 PCSK9之間隔子中的61個，且表17中列出對應SEQ ID NO。獨立識別之四個額外間隔子展示於表73中。 表 72 ： 在此實例中評估之 65 個靶向 PCSK 9 之間隔子中的 61 個的清單。
間隔子ID 間隔子ID 間隔子ID
TG-06-342    TG-06-142    TG-06-002
TG-06-117    TG-06-144    TG-06-343
TG-06-118    TG-06-143    TG-06-167
TG-06-119    TG-06-146    TG-06-168
TG-06-120    TG-06-145    TG-06-169
TG-06-122    TG-06-147    TG-06-170
TG-06-123    TG-06-149    TG-06-344
TG-06-121    TG-06-150    TG-06-345
TG-06-124    TG-06-151    TG-06-346
TG-06-125    TG-06-152    TG-06-347
TG-06-127    TG-06-153    TG-06-348
TG-06-128    TG-06-154    TG-06-171
TG-06-131    TG-06-155    TG-06-349
TG-06-132    TG-06-157    TG-06-249
TG-06-135    TG-06-159    TG-06-250
TG-06-133    TG-06-158    TG-06-251
TG-06-134    TG-06-160    TG-06-350
TG-06-138    TG-06-161    TG-06-351
TG-06-139    TG-06-004    TG-06-172
TG-06-140    TG-06-001   
TG-06-141    TG-06-005   
表 73 ： 靶向人類 PCSK9 基因座之四個額外 TTC 間隔子的 RNA 序列。
間隔子ID 間隔子RNA 序列 SEQ ID NO:
TG-06-126 CCUUUUCAUCCUCCUGCCUG 2672
TG-06-129 UUUUACACACCAUGUUCAAG 2675
TG-06-148 GCCGGGCCCACCUUUUCAGU 2694
TG-06-1046 UCUCUUACAUGGGGGGAAAC 2714
針對 65 個靶向 PCSK9 之間隔子評估 PCSK9 分泌水平：
使用與實例2中所描述類似之方法藉由IVT產生編碼LTRP5-ADD-ZIM3分子之mRNA。LTRP5-ADD-ZIM3之DNA及mRNA序列展示於表18及表19中。
使用gRNA骨架316設計含有65個靶向 PCSK9之間隔子(表72至表73)中之各者的gRNA且使用v1修飾概況(如實例7中所描述)以化學方式合成。此外，非靶向gRNA用作非靶向對照。
為評估PCSK9分泌，使用脂染胺3000用編碼LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA及具有骨架316及靶向 PCSK9基因座之間隔子的gRNA轉染所接種之Huh7細胞。使用2:1質量比之mRNA與gRNA之兩種劑量的總RNA輸入來進行篩選：50 ng mRNA:25 ng gRNA以及25 ng mRNA:12.5 ng gRNA。轉染後6天收穫培養基上清液以藉由ELISA評估PCSK9分泌之水平(表74)。PCSK9分泌之水平相對於總細胞計數標準化。作為額外對照，亦在自經編碼mScarlet的mRNA轉染之細胞之培養基上清液中量測PCSK9分泌。
在轉染後13、20及27天進一步取樣培養基上清液，且藉由如上文所描述之ELISA量測PCSK9分泌之水平。 結果：
在第6天時間點經編碼LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA與靶向 PCSK9之gRNA轉染的Huh7細胞的PCSK9分泌水平展示於表74中。特定言之，表74提供用具有間隔子中之各者之gRNA轉染的細胞中的分泌之PCSK9水平(ng/mL)、相對於用非靶向gRNA轉染之對照的PCSK9分泌之百分比減少及各靶向序列之鹼基對至 PCSK9轉錄起始部位(TSS)之距離。表中亦提供各間隔子各劑量的PCSK9分泌減少的平均百分比，且在表中用粗體標出兩種劑量的平均PCSK9分泌減少超過50%的構築體中的間隔子。 表 74 ： 評估 65 個靶向 PCSK9 之間隔子在與 LTRP5-ADD-ZIM3 配對時對 PCSK9 分泌水平之功能作用的 ELISA 分析結果 *
間隔子 ID 與 TSS 之距離 (bp) 50ng mRNA: 25ng gRNA 25ng mRNA: 12.5ng gRNA PCSK9 分泌之平均減少百分比
分泌之 PCSK9 (ng/mL) PCSK9 分泌之減少百分比 分泌之 PCSK9 (ng/mL) PCSK9 分泌之減少百分比
TG-06-342 -1086 51.55 37.34 75.23 5.6 15.87
TG-06-117 -917 68.98 16.16 98.05 37.62 10.73
TG-06-118 -860 35.5 56.86 54.78 23.11 39.99
TG-06-119 -858 70.37 14.47 84.54 18.66 2.1
TG-06-120 -843 21.43 73.95 47.97 32.67 53.31
TG-06-122 -800 79.36 3.54 86.06 20.79 8.63
TG-06-123 -789 30.49 62.95 51.32 27.97 45.46
TG-06-121 -787 28.33 65.57 37.13 47.89 56.73
TG-06-124 -786 16.54 79.9 30.59 57.06 68.48
TG-06-125 -767 24.93 69.7 46.11 35.28 52.49
TG-06-126 -707 23.48 71.46 44.82 37.09 54.27
TG-06-127 -699 22.57 72.56 49.1 31.08 51.82
TG-06-128 -664 42.21 48.7 62.29 12.57 30.63
TG-06-129 -646 59.93 27.16 90.82 27.47 0.16
TG-06-131 -644 28.4 65.48 57.89 18.74 42.11
TG-06-132 -621 56.68 31.11 75.01 5.29 12.91
TG-06-135 -601 25.66 68.82 44.59 37.42 53.12
TG-06-133 -596 29.45 64.21 42.13 40.86 52.53
TG-06-134 -589 43.79 46.77 57.45 19.37 33.07
TG-06-138 -527 18.99 76.92 30.87 56.67 66.79
TG-06-139 -463 15.03 81.73 25.45 64.28 73.01
TG-06-140 -408 61.68 25.04 59.94 15.87 20.45
TG-06-141 -383 13.86 83.16 12.58 82.34 82.75
TG-06-142 -379 30.87 62.48 27.27 61.73 62.1
TG-06-144 -351 23.42 71.53 29 59.29 65.41
TG-06-143 -337 38.69 52.97 22.33 68.66 60.81
TG-06-146 -316 40.84 50.36 20.34 71.45 60.9
TG-06-145 -299 15.8 80.8 18.54 73.98 77.39
TG-06-147 -291 53.6 34.85 37.43 47.46 41.15
TG-06-148 -273 71.46 13.15 44.77 37.16 25.15
TG-06-149 -177 21.18 74.26 38.33 46.21 60.23
TG-06-150 -148 18.33 77.73 39.59 44.42 61.08
TG-06-151 -145 53.44 35.05 66.42 6.77 20.91
TG-06-152 -126 36.95 55.09 57.43 19.39 37.24
TG-06-153 -76 73.23 10.99 86.58 21.52 5.27
TG-06-154 -13 6.87 91.65 24.48 65.64 78.64
TG-06-155 18 29.45 64.21 56.36 20.89 42.55
TG-06-157 70 12.32 85.03 32.4 54.53 69.78
TG-06-159 169 53.15 35.4 80.84 13.47 10.97
TG-06-158 175 9.39 88.59 31.72 55.48 72.03
TG-06-160 182 20.63 74.93 48.67 31.69 53.31
TG-06-161 204 29.55 64.08 53.16 25.38 44.73
TG-06-004 448 54.83 33.35 73.05 2.54 15.41
TG-06-001 451 18.21 77.86 32.86 53.88 65.87
TG-06-005 464 67.08 18.47 76.37 7.19 5.64
TG-06-002 503 81.95 0.4 83.15 16.71 8.16
TG-06-1046 592 78.9 4.1 76.27 7.05 1.48
TG-06-343 598 62.8 23.67 75.55 6.04 8.82
TG-06-167 751 39.55 51.93 66.61 6.51 29.22
TG-06-168 768 19.1 76.78 50.96 28.47 52.62
TG-06-169 781 66.39 19.3 62.55 12.2 15.75
TG-06-170 786 64.19 21.98 72.96 2.41 9.79
TG-06-344 851 82.29 0.01 76.43 7.28 3.64
TG-06-345 859 81.22 1.28 85.68 20.26 9.49
TG-06-346 861 77.02 6.39 81.63 14.58 4.09
TG-06-347 869 26.55 67.73 51.83 27.24 47.49
TG-06-348 878 23.14 71.88 35.55 50.1 60.99
TG-06-171 889 52.41 36.3 55.95 21.46 28.88
TG-06-349 908 91.34 11.02 87.55 22.89 16.95
TG-06-249 949 87.36 6.18 82.36 15.61 10.89
TG-06-250 959 86.92 5.64 80.42 12.87 9.26
TG-06-251 985 36.8 55.28 44.62 37.37 46.32
TG-06-350 1063 71.25 13.4 67.87 4.74 9.07
TG-06-351 1074 56.34 31.52 62.93 11.67 21.6
TG-06-172 1097 44.44 45.99 59.31 16.75 31.37
非靶向 - 82.28 0 71.24 0 0
mScarlet mRNA - 84.85 3.12 - - -
*資料捨入至最接近之百分位展示。
表74中呈現之資料表明具有大部分測試間隔子之構築體在轉染後6天產生降低水平之PCSK9分泌。間隔子在TSS上游1086個鹼基對至下游1097個鹼基對的區域中與 PCSK9基因座互補，且在整個測試區域中發現有效間隔子，其中許多最有效的間隔子聚集在TSS及TSS上游約500個鹼基對之間。
具有TG-06-141間隔子之構築體在第6天時間點處總體上最有效，其中分泌之PCSK9水平平均減少82.75%。具有間隔子TG-06-154、TG-06-145、TG-06-139、TG-06-158、TG-06-157、TG-06-124、TG-06-138、TG-06-001及TG-06-144的構築體亦高度有效，其中各自使分泌之PCSK9水平平均降低65%以上。
進一步評估轉染後13、20及27天的時間點，以便識別在較長時間段內支持PCSK9抑制及分泌之PCSK9水平降低之間隔子。
此等結果證明遞送編碼具有ADD域的LTRP分子之mRNA與適當的靶向gRNA可引起基於細胞之分析中 PCSK9基因座之抑制，從而減少PCSK9分泌。 實例 24 ： 對使用 CpG 減少或耗竭之 gRNA 骨架對 CasX 介導之編輯活性的影響的額外評估
如以上實例12中所論述，未甲基化CpG模體充當有效地觸發不合需要之免疫活化的PAMP。因此，設計及產生置換AAV構築體(包括編碼引導骨架變異體235及316之構築體)中之天然CpG模體之核苷酸取代。此處，進行實驗以進一步評估使用此等所得CpG減少或耗竭之gRNA骨架對CasX介導之編輯活性的作用。 材料及方法：
在下文所描述之三個活體外實驗中評估CpG減少或耗竭之骨架320-341；骨架320-341之序列列於表42中。另外，亦評估兩種新的經工程改造之gRNA骨架，骨架382及392 (序列列於表75中)。作為基準比較，亦包括骨架174、235及316 (表9及表75中所列之序列)用於評估。 表 75 ：在此實例中測試之額外 gRNA 骨架之序列
骨架 ID DNA 序列 DNA SEQ ID NO: RNA 序列 RNA SEQ ID NO:
骨架382 ACTGGCGCTTCTATCTGATTACTCTGAGCCGCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCTCCCTCTTCGGAGGGAGCATCAGAG 3448 ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAG 3451
骨架392 ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCCGCTTACGGACTTCGGTCCGTAAGAGGCATCAGAG 3449 ACUGGGCCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGGCCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAG 3452
骨架174 ACTGGCGCTTTTATCTGATTACTTTGAGAGCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCTCCCTCTTCGGAGGGAGCATCAAAG 3450 ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAG 1744
如先前實例12中所描述來設計及產生AAV構築體。在兩種不同AAV主鏈中測試CpG減少或耗竭之gRNA骨架。特定言之，對於涉及如下文所描述之HEK293細胞之脂質轉染的實驗，在除AAV2 ITR之外的CpG耗竭之AAV載體中測試骨架235及320至341，如先前實例12中所描述。簡言之，CpG耗竭之AAV主鏈構築體編碼以下元件之CpG耗竭型式：U1A啟動子、CasX 491、bGH聚(A)信號序列及U6啟動子。對於如下文所描述之涉及人類誘導神經元(iN)及HEK293細胞之AAV轉導的實驗，在CpG未耗竭之AAV主鏈(序列參見表76)中測試骨架174、235、316、320至341、382及392 (序列參見表9、表42及表75)。此外，在下文所描述之涉及HEK293細胞之兩個實驗中使用靶向 B2M基因座之間隔子7.37：脂質轉染及AAV轉導。在下文所描述之涉及人類iN之實驗中使用靶向 AAVS1基因座之間隔子31.63。下表77列出在CpG未耗竭之AAV載體之情況下測試的AAV構築體及評估此等構築體之實驗條件。 表 76 ： 表 75 中之其中選殖 gRNA 骨架之基礎 AAV 質體的編碼序列
組分名稱 DNA 序列 SEQ ID NO
5' ITR CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 3233
緩衝序列 GCGGCCTCTAGACTCGAGGCGTT 3453
U1A啟動子 AATGGAGGCGGTACTATGTAGATGAGAATTCAGGAGCAAACTGGGAAAAGCAACTGCTTCCAAATATTTGTGATTTTTACAGTGTAGTTTTGGAAAAACTCTTAGCCTACCAATTCTTCTAAGTGTTTTAAAATGTGGGAGCCAGTACACATGAAGTTATAGAGTGTTTTAATGAGGCTTAAATATTTACCGTAACTATGAAATGCTACGCATATCATGCTGTTCAGGCTCCGTGGCCACGCAACTCATACT 3454
緩衝序列 CTCTGGCTAACTACCGGT 3455
Kozak GCCACC N.D.
起始密碼子+ c-MYC NLS ATGGCCCCAGCGGCCAAACGGGTGAAGCTGGAC 3456
連接子 TCTAGA N.D.
CasX 515 CAAGAGATCAAGAGAATCAACAAGATCAGAAGGAGACTGGTCAAGGACAGCAACACAAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCATGAAAACCCTGCTCGTCAGAGTGATGACCCCTGACCTGAGAGAGCGGCTGGAAAACCTGAGAAAGAAGCCCGAGAACATCCCTCAGCCTATCAGCAACACCAGCAGGGCCAACCTGAACAAGCTGCTGACCGACTACACCGAGATGAAGAAAGCCATCCTGCACGTGTACTGGGAAGAGTTCCAGAAAGACCCCGTGGGCCTGATGAGCAGAGTTGCTCAGCCTGCCAGCAAGAAGATCGACCAGAACAAGCTGAAGCCCGAGATGGACGAGAAGGGCAATCTGACCACAGCCGGCTTTGCCTGCTCTCAGTGTGGCCAGCCTCTGTTCGTGTACAAGCTGGAACAGGTGTCCGAGAAAGGCAAGGCCTACACCAACTACTTCGGCAGATGTAACGTGGCCGAGCACGAGAAGCTGATTCTGCTGGCCCAGCTGAAACCTGAGAAGGACTCTGATGAGGCCGTGACCTACAGCCTGGGCAAGTTTGGACAGAGAGCCCTGGACTTCTACAGCATCCACGTGACCAAAGAAAGCACACACCCCGTGAAGCCCCTGGCTCAGATCGCCGGCAATAGATACGCCTCTGGACCTGTGGGCAAAGCCCTGTCCGATGCCTGCATGGGAACAATCGCCAGCTTCCTGAGCAAGTACCAGGACATCATCATCGAGCACCAGAAGGTGGTCAAGGGCAACCAGAAGAGACTGGAAAGCCTGAGGGAGCTGGCCGGCAAAGAGAACCTGGAATACCCCAGCGTGACCCTGCCTCCTCAGCCTCACACAAAAGAAGGCGTGGACGCCTACAACGAAGTGATCGCCAGAGTGAGAATGTGGGTCAACCTGAACCTGTGGCAGAAGCTGAAACTGTCCAGGGACGACGCCAAGCCTCTGCTGAGACTGAAGGGCTTCCCTAGCTTCCCTCTGGTGGAAAGACAGGCCAATGAAGTGGATTGGTGGGACATGGTCTGCAACGTGAAGAAGCTGATCAACGAGAAGAAAGAGGATGGCAAGGTTTTCTGGCAGAACCTGGCCGGCTACAAGAGACAAGAAGCCCTGAGGCCTTACCTGAGCAGCGAAGAGGACCGGAAGAAGGGCAAGAAGTTCGCCAGATACCAGCTGGGCGACCTGCTGCTGCACCTGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACTGGGGCAAAGTGTACGATGAGGCCTGGGAGAGAATCGACAAGAAGGTGGAAGGCCTGAGCAAGCACATTAAGCTGGAAGAGGAAAGAAGGAGCGAGGACGCCCAATCTAAAGCCGCTCTGACCGATTGGCTGAGAGCCAAGGCCAGCTTTGTGATCGAGGGCCTGAAAGAGGCCGACAAGGACGAGTTCTGCAGATGCGAGCTGAAGCTGCAGAAGTGGTACGGCGATCTGAGAGGCAAGCCCTTCGCCATTGAGGCCGAGAACAGCATCCTGGACATCAGCGGCTTCAGCAAGCAGTACAACTGCGCCTTCATTTGGCAGAAAGACGGCGTCAAGAAACTGAACCTGTACCTGATCATCAATTACTTCAAAGGCGGCAAGCTGCGGTTCAAGAAGATCAAACCCGAGGCCTTCGAGGCTAACAGATTCTACACCGTGATCAACAAAAAGTCCGGCGAGATCGTGCCCATGGAAGTGAACTTCAACTTCGACGACCCCAACCTGATTATCCTGCCTCTGGCCTTCGGCAAGAGACAGGGCAGAGAGTTCATCTGGAACGATCTGCTGAGCCTGGAAACCGGCTCTCTGAAGCTGGCCAATGGCAGAGTGATCGAGAAAACCCTGTACAACAGGAGAACCAGACAGGACGAGCCTGCTCTGTTTGTGGCCCTGACCTTCGAGAGAAGAGAGGTGCTGGACAGCAGCAACATCAAGCCCATGAACCTGATCGGCGTGGACCGGGGCGAGAATATCCCTGCTGTGATCGCCCTGACAGACCCTGAAGGATGCCCACTGAGCAGATTCAAGGACTCCCTGGGCAACCCTACACACATCCTGAGAATCGGCGAGAGCTACAAAGAGAAGCAGAGGACAATCCAGGCCAAGAAAGAGGTGGAACAGAGAAGAGCCGGCGGATACTCTAGGAAGTACGCCAGCAAGGCCAAGAATCTGGCCGACGACATGGTCCGAAACACCGCCAGAGATCTGCTGTACTACGCCGTGACACAGGACGCCATGCTGATCTTCGAGAATCTGAGCAGAGGCTTCGGCCGGCAGGGCAAGAGAACCTTTATGGCCGAGAGGCAGTACACCAGAATGGAAGATTGGCTCACAGCTAAACTGGCCTACGAGGGACTGCCCAGCAAGACCTACCTGTCCAAAACACTGGCCCAGTATACCTCCAAGACCTGCAGCAATTGCGGCTTCACCATCACCAGCGCCGACTACGACAGAGTGCTGGAAAAGCTCAAGAAAACCGCCACCGGCTGGATGACCACCATCAACGGCAAAGAGCTGAAGGTTGAGGGCCAGATCACCTACTACAACAGGTACAAGAGGCAGAACGTCGTGAAGGATCTGAGCGTGGAACTGGACAGACTGAGCGAAGAGAGCGTGAACAACGACATCAGCAGCTGGACAAAGGGCAGATCAGGCGAGGCTCTGAGCCTGCTGAAGAAGAGGTTTAGCCACAGACCTGTGCAAGAGAAGTTCGTGTGCCTGAACTGCGGCTTCGAGACACACGCCGATGAACAGGCTGCCCTGAACATTGCCAGAAGCTGGCTGTTCCTGAGAAGCCAAGAGTACAAGAAGTACCAGACCAACAAGACCACCGGCAACACCGACAAGAGGGCCTTTGTGGAAACCTGGCAGAGCTTCTACAGAAAAAAGCTGAAAGAAGTCTGGAAGCCCGCCGTG 3457
連接子 GGATCC N.D.
c-MYC NLS CCAGCCGCGAAGCGAGTGAAACTGGAC 3458
終止密碼子 TAA N.D.
緩衝序列 GAATTCCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGA 3459
bGH聚(A)信號序列 CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGAGAATAGCAGGCATGCTGGGGA 3460
緩衝序列 GGTACCGT N.D.
U6啟動子 GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGAC 3461
緩衝序列 GAAACACC N.D.
骨架變異體 參見表 9 、表 42 及表 75 中所列之序列 參見表 9 、表 42 及表 75 中所列之序列
B2M間隔子(間隔子7.37) GGCCGAGATGTCTCGCTCCG 3137
AAVS1間隔子(間隔子31.63) CAAGAGGAGAAGCAGTTTGG 3462
非靶向間隔子(間隔子0.0) CGAGACGTAATTACGTCTCG 3232
緩衝序列 TTTTTTTTGGCGGCCGC 3463
3' ITR AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 3238
表 77 ： 在 CpG 未耗竭之 AAV 載體中測試的 AAV 構築體及骨架變異體的清單 ( 序列參見表 76) 以及評估此等構築體之實驗條件。
AAV 構築體ID 骨架變異體 間隔子 實驗條件
262 235 31.63 於iN中之AAV轉導
263 328 31.63 於iN中之AAV轉導
264 329 31.63 於iN中之AAV轉導
265 382 31.63 於iN中之AAV轉導
266 174 31.63 於iN中之AAV轉導
267 335 31.63 於iN中之AAV轉導
268 325 31.63 於iN中之AAV轉導
269 330 31.63 於iN中之AAV轉導
270 327 31.63 於iN中之AAV轉導
271 334 31.63 於iN中之AAV轉導
272 339 31.63 於iN中之AAV轉導
273 337 31.63 於iN中之AAV轉導
274 235 非靶向 於iN中之AAV轉導
275 331 7.37 於HEK293中之AAV轉導
276 335 7.37 於HEK293中之AAV轉導
277 316 7.37 於HEK293中之AAV轉導
278 392 7.37 於HEK293中之AAV轉導
279 325 7.37 於HEK293中之AAV轉導
280 334 7.37 於HEK293中之AAV轉導
281 324 7.37 於HEK293中之AAV轉導
282 336 7.37 於HEK293中之AAV轉導
283 330 7.37 於HEK293中之AAV轉導
284 320 7.37 於HEK293中之AAV轉導
285 332 7.37 於HEK293中之AAV轉導
286 321 7.37 於HEK293中之AAV轉導
287 339 7.37 於HEK293中之AAV轉導
288 235 7.37 於HEK293中之AAV轉導
289 235 非靶向 於HEK293中之AAV轉導
使用實例12中所描述之方法產生AAV。對於如下文所描述之涉及HEK293細胞之脂質轉染的實驗，根據實例12中所描述之方法進行AAV滴定。對於如下文所描述之涉及人類iN或HEK293細胞之AAV轉導的兩個實驗，藉由ddPCR進行AAV滴定。 基於細胞之分析評估使用CpG耗竭或減少之gRNA骨架對編輯活性的影響：
在一個實驗中，在轉染之前24小時將每孔約20,000個HEK293細胞接種在96孔盤中。接著用含有各種型式之引導骨架(骨架320至341)的CpG耗竭之AAV質體轉染所接種之細胞。轉染後5天，收集細胞以藉由經由HLA免疫染色繼之以流式細胞測量術進行B2M蛋白表現分析。具有骨架變異體235之CpG耗竭之AAV質體充當實驗對照。具有驅動mCherry表現之CMV啟動子的AAV質體用作轉染對照，且觀測到約41%轉染率。來自此實驗之結果顯示於圖68中。
在第二實驗中，在轉導之前7天將每孔約20,000個誘導神經元(iN)細胞接種於塗佈有基質膠之96孔盤上。在神經元塗鋪培養基中稀釋含有各種型式之引導骨架之表現CasX:gRNA系統的AAV (AAV構築體ID #262-274；參見表77)且在塗鋪後7天添加至細胞中。細胞以三種MOI (3E4、1E4或3E3 vg/細胞)轉導。轉導後7天，細胞用於提取gDNA，以使用NGS分析 AAVS1基因座處之編輯。來自此實驗之結果顯示於圖69A至圖69C中。
在第三個實驗中，在轉染之前24小時將每孔約10,000個HEK293細胞接種在96孔盤中。接著用含有各種型式之引導骨架之表現CasX:gRNA系統的AAV (AAV構築體ID #275-289；參見表77)轉導所接種之細胞。細胞以三種MOI (1E4、3E3或1E3 vg/細胞)轉導。轉染後5天，收集細胞以經由HLA免疫染色繼之以流式細胞測量術進行B2M蛋白表現分析。來自此實驗之結果顯示於圖70A至圖70C中。 結果：
進行實驗以進一步評估使用CpG減少或耗竭之gRNA骨架對CasX介導之編輯活性的作用。在第一實驗(N=1)中，HEK293細胞用含有各種型式之gRNA骨架(骨架320-341，序列參見表42)之CpG耗竭之AAV質體進行脂質轉染。隨後分析B2M蛋白表現，且分析結果展示於圖68中。資料表明，使用骨架320至341並未改良目標 B2M基因座處之編輯活性，因為相對於使用含有骨架235之AAV構築體時達成之水平，使用此等骨架產生較低百分比之具有B2M -之細胞。此等結果並未再現實例12中所描述的結果(參見圖28至圖31)。
在第二個實驗(N=1)中，用含有各種型式之引導骨架之表現CasX:gRNA系統的AAV顆粒(AAV構築體ID #262-274)轉導人類iN。分析AAVS1基因座處之編輯，且分析結果展示於圖69A至圖69C中。資料表明，在所測試之骨架變異體中，與使用骨架235相比，骨架變異體329及382之使用似乎改良 AAVS1基因座處之編輯，尤其在1E4及3E3 vg/細胞之MOI下。此外，觀測到以劑量依賴性方式對編輯活性之影響。
在第三個實驗(N=1)中，用含有各種型式之引導骨架之表現CasX:gRNA系統的AAV顆粒(AAV構築體ID #275-289)轉導HEK293細胞。隨後分析B2M蛋白表現，且分析結果展示於圖70A至圖70C中。資料表明，在所測試之骨架變異體中，與使用骨架235整體相比，骨架316、392及332之使用似乎改良 B2M基因座處之編輯。具體而言，在1E4及3E3 vg/細胞之較高MOI下，在使用骨架316、392及332下觀測到略微改良之編輯(圖70A至圖70B)，而在1E3 vg/細胞之較低MOI下觀測到更強的編輯改良(圖70C)。值得注意地，骨架332及392均包括假結莖(區域1；圖27A至圖27B)中之CG＞GC突變，與骨架235相比，有效地減少CpG之總數，從而可能促成編輯活性之增加。此外，骨架316及332兩者與骨架235相比具有截短之延伸莖，移除泡及CG二核苷酸(區域3；圖27A至圖27B)，從而亦可能促成所觀測到的編輯活性之增加。尤其在較低MOI下，進行其他實驗，以解決個別CpG突變對編輯效力之影響的錯綜複雜的問題。
來自本文所描述之實驗的結果表明，使用具有不同CpG耗竭水平之引導骨架可產生不同的由CasX:gRNA系統介導之編輯水平，且所得編輯水平可因遞送方法(例如質體轉染對比AAV轉導)而異。
本發明之新穎特徵細緻闡述於隨附申請專利範圍中。將參考闡述利用本發明原理之說明性實施例及其隨附圖式的以下詳細描述來獲得對本發明之特徵及優點的較佳理解：
圖1示出長期抑制子蛋白(LTRP，在本文中亦稱為「抑制子融合蛋白」)融合蛋白之五種組態之示意圖，其中抑制子分子連接至催化失活CasX。D3A及D3L分別表示DNA甲基轉移酶3α (DNMT3A)及DNMT3A樣蛋白(DNMT3L)。L1至L4為連接子。NLS為核定位信號。
圖2示出併入有DNMT3A ADD域之LTRP融合蛋白之各種組態的示意圖。「D3A ADD」、「D3A CD」及「D3L ID」分別表示DNMT3A之ADD域、DNMT3A之催化域及DNMT3L之相互作用域。L1至L3為連接子。NLS為核定位信號。
圖3為點陣圖，其顯示經LTRP短暫轉染之人類肝細胞中分泌之PCSK9蛋白與PCSK9 mRNA水平之間的相關性，如實例1中所描述。將PCSK9 mRNA水平相對於管家基因RPLP0標準化。將分泌之PCSK9蛋白水平相對於分泌之人類血清白蛋白(HSA)標準化。將樣品相對於非靶向(NT)對照標準化。
圖4為條形圖，其顯示用與指定靶向 PCSK9之gRNA配對之dXR1或LTRP1-ZIM3 mRNA處理的小鼠Hepa1-6細胞之百分比，該等細胞在第6天對細胞內PCSK9呈染色陰性，如實例2中所描述。靶向人類 PCSK9基因座之間隔子6.7充當非靶向對照。
圖5為時程圖，其顯示用與指定靶向 PCSK9之gRNA配對之dXR1 mRNA處理、在遞送後第6天、第13天及第25天對細胞內PCSK9呈染色陰性的小鼠Hepa1-6細胞之百分比，如實例2中所描述。靶向人類 PCSK9基因座之間隔子6.7充當非靶向對照，且水處理充當陰性對照。
圖6為時程圖，其顯示用與指定靶向 PCSK9之gRNA配對之LTRP1-ZIM3 mRNA處理、在遞送後第6天、第13天及第25天對細胞內PCSK9呈染色陰性的小鼠Hepa1-6細胞之百分比，如實例2中所描述。靶向人類 PCSK9基因座之間隔子6.7充當非靶向對照，且水處理充當陰性對照。
圖7為時程圖，其顯示用與指定靶向 PCSK9之gRNA配對的IVT產生之LTRP1-ZIM3與LTRP5-ZIM5 mRNA處理、在遞送後指示時間點對細胞內PCSK9呈染色陰性的小鼠Hepa1-6細胞之百分比，如實例2中所描述。
圖8為時程圖，其顯示用與指定靶向 PCSK9之gRNA配對的第三方產生之LTRP1-ZIM3與dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L mRNA處理、在遞送後指示時間點對細胞內PCSK9呈染色陰性的小鼠Hepa1-6細胞之百分比，如實例2中所描述。
圖9為條形圖，其顯示在用mRNA脂質轉染之Huh7細胞中在轉染後第6天、第18天、第36天及第87天時的分泌之PCSK9水平的定量，該mRNA編碼與指定靶向gRNA配對的CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3，如實例3中所描述。分泌之PCSK9水平相對於總細胞計數標準化。原始、未經處理之細胞充當實驗對照。
圖10A為時程圖，其顯示用與具有間隔子27.88之靶向 PCSK9之gRNA配對之LTRP5-ZIM3或LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA處理、在遞送後第4天、第12天、第18天、第24天、第41天及第53天對細胞內PCSK9呈染色陰性的小鼠Hepa1-6細胞之百分比，如實例4中所描述。非靶向(NT)間隔子用作實驗對照。
圖10B為時程圖，其顯示用與具有間隔子27.94之靶向 PCSK9之gRNA配對之LTRP5-ZIM3或LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA處理、在遞送後第4天、第12天、第18天、第24天、第41天及第53天對細胞內PCSK9呈染色陰性的小鼠Hepa1-6細胞之百分比，如實例4中所描述。非靶向(NT)間隔子用作實驗對照。
圖11A為條形圖，其顯示在用mRNA脂質轉染之HepG2細胞中在轉染後第4天時的標準化分泌之PCSK9水平的定量，該mRNA編碼與指定靶向gRNA配對的CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3，如實例5中所描述。分泌之PCSK9水平相對於總細胞計數標準化。原始、未經處理之細胞充當實驗對照。
圖11B為條形圖，其顯示在用mRNA脂質轉染之Huh7細胞中在轉染後第4天時的標準化分泌之PCSK9水平的定量，該mRNA編碼與指定靶向gRNA配對的CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3，如實例5中所描述。分泌之PCSK9水平相對於總細胞計數標準化。原始、未經處理之細胞充當實驗對照。
圖11C為條形圖，其顯示在用mRNA脂質轉染之Hep3B細胞中在轉染後第4天時的標準化分泌之PCSK9水平的定量，該mRNA編碼與指定靶向gRNA配對的CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3，如實例5中所描述。分泌之PCSK9水平相對於總細胞計數標準化。原始、未經處理之細胞充當實驗對照。
圖12為條形圖，其顯示在用mRNA脂質轉染之Huh7細胞中在轉染後第4天、第14天及第27天時的分泌之PCSK9水平的定量，該mRNA編碼與指定靶向gRNA配對的CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3，如實例5中所描述。所分泌之PCSK9水平之的定量與在第4天時間點在原始、未經處理之細胞中所偵測到的分泌水平相對比。
圖13為小提琴曲線圖，其展示經CasX 676 mRNA #2及具有指定靶向 PCSK9之間隔子的gRNA轉染的HepG2細胞中之分泌之PCSK9水平的分佈，如實例6中所描述。原始、未經處理之細胞及僅經CasX 676 mRNA轉染之細胞充當實驗對照。
圖14為一對代表性西方墨點，其展示經CasX 676 mRNA及具有指定靶向 PCSK9之間隔子之gRNA轉染的HepG2細胞中的原PCSK9 (pro-PCSK9)及經處理PCSK9蛋白質(頂部西方墨點圖)之水平，如實例6中所描述。原始、未經處理之細胞及僅經CasX 676 mRNA轉染之細胞充當實驗對照。來自不表現PCSK9蛋白質之HEK293T細胞及食蟹獼猴重組PCSK9蛋白質對照物的溶解物用作西方墨點法對照物。底部西方墨點圖展示總蛋白質內參考物。
圖15為顯示當與CasX 676 mRNA轉染至HepG2細胞中時所評估之指定間隔子中之各者的原PCSK9、經處理PCSK9及總PCSK9水平之西方墨點法定量的條形圖，如實例6中所描述。原始、未經處理之細胞及僅經CasX 676 mRNA轉染之細胞充當實驗對照。將PCSK9水平相對於未經處理狀態下的PCSK9總水平標準化。
圖16A為示出如實例7中所描述之對gRNA骨架變異體235進行的化學修飾之型式1至3的示意圖。結構模體突出顯示。標準核糖核苷酸描繪為空心圓，且2'OMe-修飾之核糖核苷酸描繪為黑色圓。硫代磷酸酯鍵在鍵下方或鍵旁邊用*指示。對於v2概況，在相關圓圈中用「U」標註三個3'尿嘧啶(3'UUU)的添加。
圖16B為示出如實例7中所描述之對gRNA骨架變異體235進行的化學修飾之型式4至6的示意圖。結構模體突出顯示。標準核糖核苷酸描繪為空心圓，且2'OMe-修飾之核糖核苷酸描繪為黑色圓。硫代磷酸酯鍵在鍵下方或鍵旁邊用*指示。
圖17為曲線圖，其示出經100 ng CasX 491 mRNA及指定劑量之含間隔子7.37的經末端修飾(v1)或未經修飾之(v0)靶向 B2M之gRNA共轉染的HepG2細胞中 B2M之基因剔除百分比的定量，如實例7中所描述。藉由流式細胞測量術測定編輯水平，因為在 B2M基因座處成功編輯的細胞群體損失HLA複合物之表面呈現。
圖18為示出如實例7中所描述之對gRNA骨架變異體316進行的化學修飾之型式7至9的示意圖。結構模體突出顯示。標準核糖核苷酸描繪為空心圓，且2'OMe-修飾之核糖核苷酸描繪為黑色圓。硫代磷酸酯鍵在鍵下方或鍵旁邊用*指示。
圖19A為如實例7中所描述之gRNA骨架變異體174 (SEQ ID NO: 1744)之示意圖。結構模體突出顯示。
圖19B為如實例7中所描述之gRNA骨架變異體235 (SEQ ID NO: 1745)之示意圖。突出顯示的結構模體與圖19A相同。變異體174與變異體235之間的差異在於延伸莖模體及若干單核苷酸變化(用星號指示)。變異體316維持來自變異體174之較短延伸莖，但具有在骨架235中發現的四個取代。
圖19C為如實例7中所描述之gRNA骨架變異體316 (SEQ ID NO: 1746)之示意圖。突出顯示的結構模體與圖19A相同。變異體316維持來自變異體174之較短延伸莖(圖19A)，但具有在骨架235中發現的四個取代(圖19B)。
圖20為顯示在HepG2細胞中經藉由下一代定序(NGS)所量測之 PCSK9基因座之插入/缺失率(描繪為編輯分數) (x軸)與藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)偵測之分泌的PCSK9水平(ng/mL) (y軸)之間的相關性的圖，該細胞經CasX 491 mRNA及含有指定骨架變異體及間隔子組合的靶向 PCSK9的gRNA進行脂質轉染，如實例7中所描述。
圖21A為描繪編輯分析之結果的圖，該編輯分析之結果經量測為經指定劑量之LNP處理之HepG2細胞中在人類 B2M基因座處藉由NGS偵測之插入/缺失率，該等LNP經CasX 491 mRNA及指定靶向 B2M之gRNA調配，如實例7中所描述。
圖21B為示出用指定劑量之LNP處理之HepG2細胞中B2M基因剔除百分比之定量的圖，該等LNP經CasX 491 mRNA及指定靶向 B2M之gRNA調配，如實例7中所描述。藉由流式細胞測量術測定編輯水平，因為在 B2M基因座處成功編輯的細胞群體不具有HLA複合物之表面呈現。
圖22A為描繪編輯分析之結果的圖，該編輯分析之結果量測為在經指定劑量之LNP處理之Hepa1-6細胞中在小鼠 ROSA26基因座處藉由NGS偵測之插入/缺失率，該等LNP經CasX 676 mRNA #2及具有v1或v5修飾概況的指定靶向 ROSA26之gRNA調配，如實例7中所描述。
圖22B為示出編輯百分比定量之圖，該編輯百分比經量測為在經LNP處理之小鼠中在 ROSA26基因座處藉由NGS偵測之插入/缺失率，該等LNP經CasX 676 mRNA #2及指定經化學修飾之靶向 ROSA26之gRNA調配，如實例7中所描述。
圖23為顯示編輯分析之結果的條形圖，該編輯分析之結果經量測為經LNP處理之小鼠中在小鼠 PCSK9基因座處藉由NGS偵測之插入/缺失率，該等LNP經CasX 676 mRNA #1及指定經化學修飾之靶向 PCSK9的gRNA調配，如實例7中所描述。未經處理之小鼠充當實驗對照。
圖24為示出如實例7中所描述之對gRNA骨架變異體316進行的化學修飾之型式1至3的示意圖。結構模體突出顯示。標準核糖核苷酸描繪為空心圓，且2'OMe-修飾之核糖核苷酸描繪為黑色圓。硫代磷酸酯鍵在鍵下方或鍵旁邊用*指示。
圖25為示出如實例7中所描述之對gRNA骨架變異體316進行的化學修飾之型式4至6的示意圖。結構模體突出顯示。標準核糖核苷酸描繪為空心圓，且2'OMe-修飾之核糖核苷酸描繪為黑色圓。硫代磷酸酯鍵在鍵下方或鍵旁邊用*指示。
圖26為示出經量測為在Hepa1-6小鼠中在小鼠 PCSK9基因座處藉由NGS偵測之插入/缺失率的編輯百分比定量的條形圖，該等細胞經指定經工程改造之CasX mRNA及靶向間隔子轉染且在轉染後20小時收集，如實例8中所描述。
圖27A為引導RNA骨架235 (SEQ ID NO: 1745)之二級結構之圖，其中注意具有CpG模體之區域，如實例12中所描述。結構上標記(1)假結莖、(2)骨架莖、(3)延伸莖泡、(4)延伸莖及(5)延伸莖環中之CpG模體。
圖27B為如實例12中所描述之引入至引導RNA骨架之編碼序列之五個區域中之各者中的CpG-減少突變的圖式。來自骨架174之取代物泡具有AGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCA (SEQ ID NO: 3442)之序列。
圖28提供編輯實驗之結果，其中具有各種CpG-減少或CpG-耗竭之引導RNA骨架之AAV載體用於編輯誘導神經元中之 B2M基因座，如實例12中所描述。AAV載體係以4e3之感染倍率(MOI)投與。條形柱展示每個樣品兩個複本之平均值±SD。「No Tx」未指示未轉導之對照，且「NT」指示具有非靶向間隔子之對照。
圖29提供編輯實驗之結果，其中具有各種CpG-減少或CpG-耗竭之引導RNA骨架之AAV載體用於編輯誘導神經元中之 B2M基因座，如實例12中所描述。AAV載體係以3e3之MOI投與。條形柱展示每個樣品兩個複本之平均值±SD。「No Tx」未指示未轉導之對照。
圖30提供編輯實驗之結果，其中具有各種CpG-減少或CpG-耗竭之引導RNA骨架之AAV載體用於編輯誘導神經元中之 B2M基因座，如實例12中所描述。AAV載體係以1e3之MOI投與。條形柱展示每個樣品兩個複本之平均值±SD。「No Tx」未指示未轉導之對照。
圖31提供編輯實驗之結果，其中具有各種CpG-減少或CpG-耗竭之引導RNA骨架之AAV載體用於編輯誘導神經元中之 B2M基因座，如實例12中所描述。AAV載體係以MOI=3e2之MOI投與。條形柱展示每個樣品兩個複本之平均值±SD。「No Tx」未指示未轉導之對照。
圖32A呈現時程實驗之結果，該時程實驗對LTRP蛋白第1號至第3號之β-2-微球蛋白(B2M)抑制活性(表示為HLA陰性細胞之百分比)進行比較，如實例13中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。
圖32B呈現圖32A中所示之相同時程實驗之結果，但繪示以相同實驗對照為基準，含有ZIM3-KRAB域之LTRP蛋白第1號至第3號之B2M抑制活性，如實例13中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。
圖33A呈現時程實驗之結果，該時程實驗對LTRP蛋白#1、#4及#5之B2M沉默活性(表示為HLA陰性細胞之百分比)進行比較，如實例13中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。
圖33B呈現圖33A中所示之相同時程實驗之結果，但繪示以相同實驗對照為基準，含有ZIM3-KRAB域之LTRP蛋白#1、#4及#5之B2M沉默活性，如實例13中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。
圖34為實例13中所描述的各指定實驗條件下 B2M基因座之轉錄起始部位周圍的CpG部位之CpG甲基化百分比的小提琴圖。
圖35為點圖，顯示以催化活性CasX 491及dCas9-ZNF10-DNMT3A/L為基準的LTRP蛋白#1至#3的相對活性(第21天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天量化的 B2M基因座處之脫靶CpG甲基化百分比)，如實例13中所描述。
圖36為實例13中所描述的各指定實驗條件下 VEGFA基因座之轉錄起始部位下游的CpG部位之CpG甲基化百分比的小提琴圖。
圖37A為在實例13中所描述的評估LTRP #1、#4及#5與靶向 B2M之間隔子之各指定實驗條件下， VEGFA基因座之轉錄起始部位周圍的CpG部位之CpG甲基化百分比的小提琴圖。
圖37B為在實例13中所描述的評估LTRP #1、#4及#5與非靶向間隔子之各指定實驗條件下， VEGFA基因座之轉錄起始部位周圍的CpG部位之CpG甲基化百分比的小提琴圖。
圖38為散佈圖，顯示具有ZNF10-KRAB域或ZIM-KRAB域的LTRP蛋白#1至#5號的相對活性(第21天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天量化之 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之中值百分比)，且該等LTRP蛋白以催化活性CasX 491及dCas9-ZNF10-DNMT3A/L為基準，如實例13中所描述。
圖39呈現時程實驗之結果，該時程實驗對指定LTRP-ZIM3及其變異體與使用間隔子7.37之靶向 B2M之gRNA的B2M抑制活性(表示為HLA陰性細胞之百分比)進行比較，如實例14中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。CD=DNMT3A之催化域。
圖40呈現圖39中所示之相同時程實驗之結果，但顯示指定LTRP-ZIM3變異體與使用間隔子7.160之靶向 B2M之gRNA的B2M抑制活性，如實例14中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。
圖41呈現圖39中所示之相同時程實驗之結果，但顯示指定LTRP-ZIM3變異體與使用間隔子7.165之靶向 B2M之gRNA的B2M抑制活性，如實例14中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。
圖42呈現圖39中所示之相同時程實驗之結果，但顯示指定LTRP-ZIM3變異體與非靶向gRNA之B2M抑制活性，如實例14中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。
圖43為針對三種靶向 B2M之gRNA及非靶向gRNA，各指定LTRP-ZIM3變異體之 VEGFA基因座之轉錄起始部位下游的CpG部位之CpG甲基化百分比的小提琴圖，如實例14中所描述。
圖44為散佈圖，其顯示指定LTRP5-ZIM3變異體的相對活性(對於間隔子7.160，第21天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(對於間隔子7.160，第7天量化的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化百分比)，如實例14中所描述。
圖45繪示各種LTRP #5架構之示意圖，其中併入額外DNMT3A域，如實例14中所描述。額外DNMT3A域為DNMT3A之ADD域(「D3A ADD」)及DNMT3A之PWWP域(「D3A PWWP」)。「D3A endo」編碼DNMT3A PWWP與ADD域之間出現之內源序列。「D3A CD」及「D3L ID」分別表示DNMT3A之催化域及DNMT3L之相互作用域。「L1至L3」為連接子。「NLS」為核定位信號。例示性序列參見表12。
圖46繪示實例15中所測試的LTRP組態#1、#4及#5的含ADD域LTRP分子之一般架構的示意圖。「D3A ADD」、「D3A CD」及「D3L ID」分別表示DNMT3A之ADD域、DNMT3A之催化域及DNMT3L之相互作用域，如實例15中所描述。「L1至L4」為連接子。「NLS」為核定位信號。例示性序列參見表17。
圖47A呈現時程實驗之結果，該時程實驗對在與含間隔子7.160之靶向 B2M之gRNA配對時，具有ZIM3-KRAB域、具有含或不含DNMT3A ADD域之組態#1、#4或#5的LTRP之B2M抑制活性(表示為HLA陰性細胞之百分比)進行比較，如實例15中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。
圖47B為曲線圖，其顯示圖47A中所示之相同時程實驗之結果，但繪示LTRP #5之B2M抑制活性，該LTRP #5具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有或不具有DNMT3A ADD域、與具有間隔子7.160之靶向 B2M之gRNA配對，如實例15中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。
圖47C為曲線圖，其顯示圖47A中所示之相同時程實驗之結果，但繪示具有或不具有DNMT3A ADD域、與具有指定間隔子之靶向 B2M之gRNA配對的LTRP5-ZIM3之B2M抑制活性，如實例15中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。
圖48A為下圖，其針對指定gRNA繪示LTRP在轉染後第27天的B2M抑制活性結果，該等LTRP具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#1、具有或不具有DNMT3A ADD域，如實例15中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。
圖48B為下圖，其針對指定gRNA繪示LTRP在轉染後第27天的B2M抑制活性結果，該等LTRP具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#4、具有或不具有DNMT3A ADD域，如實例15中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。
圖48C為下圖，其針對指定gRNA繪示LTRP在轉染後第27天的B2M抑制活性結果，該等LTRP具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#5、具有或不具有DNMT3A ADD域，如實例15中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。
圖49A為下圖，其繪示對於LTRP，在轉染後第5天，用於確定 VEGFA基因座處之脫靶甲基化的亞硫酸氫鹽定序之結果，該等LTRP針對指定gRNA具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#1、具有或不具有DNMT3A ADD域，如實例15中所描述。資料呈現為 VEGFA基因座附近之CpG部位之CpG甲基化的平均百分比；亦呈現平均值之標準誤差；N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。
圖49B為下圖，其繪示對於LTRP，在轉染後第5天，用於確定 VEGFA基因座處之脫靶甲基化的亞硫酸氫鹽定序之結果，該等LTRP針對指定gRNA具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#4、具有或不具有DNMT3A ADD域，如實例15中所描述。資料呈現為 VEGFA基因座附近之CpG部位之CpG甲基化的平均百分比；亦呈現平均值之標準誤差；N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。
圖49C為下圖，其繪示對於LTRP，在轉染後第5天，用於確定 VEGFA基因座處之脫靶甲基化的亞硫酸氫鹽定序之結果，該等LTRP針對指定gRNA具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#5、具有或不具有DNMT3A ADD域，如實例15中所描述。資料呈現為 VEGFA基因座附近之CpG部位之CpG甲基化的平均百分比；亦呈現平均值之標準誤差；N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。
圖50A為點圖，其顯示針對具有間隔子7.160之靶向 B2M之gRNA，具有ZIM3-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天量化的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例15中所描述。
圖50B為點圖，其顯示針對具有間隔子7.160之靶向 B2M之gRNA，具有ZNF10-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天量化的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例15中所描述。
圖51A為點圖，其顯示針對具有間隔子7.37之靶向 B2M之gRNA，具有ZIM3-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天量化的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例15中所描述。
圖51B為點圖，其顯示針對具有間隔子7.37之靶向 B2M之gRNA，具有ZNF10-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天量化的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例15中所描述。
圖52A為點圖，其顯示針對具有間隔子7.165之靶向 B2M之gRNA，具有ZIM3-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天量化的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例15中所描述。
圖52B為點圖，其顯示針對具有間隔子7.165之靶向 B2M之gRNA，具有ZNF10-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天量化的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例15中所描述。
圖53顯示經以下轉導之細胞的白喉毒素滴定之劑量反應結果：催化活性CasX編輯劑與靶向編碼結合肝素之EGF樣生長因子(Heparin Binding EGF-like Growth Factor；HBEGF)之基因之gRNA (亦即CasX-34.19及CasX-34.21)；催化失活CasX (dCasX)蛋白連接至抑制子域作為靶向 HBEGF之融合蛋白(dXR融合蛋白，亦即dXR1-34.28)；或非靶向dXR分子(CasX-NT或dXR-NT)，如實例16中所描述。資料表示兩個生物複本之平均值及標準偏差。
圖54提供小提琴圖，顯示對其支持 HBEGF基因座之dXR抑制的能力進行選擇之前及之後，序列之log 2(變化倍數)，如實例17中所描述。該圖顯示整個庫、序列之陰性對照集合、已知KRAB抑制子之陽性對照集合、以log 2(變化倍數)＞2及p值＜0.01測試的前1597個增強型域及所測試之前95個增強型域。
圖55顯示具有各種抑制子域之dXR蛋白的 B2M沉默活性(表示為HLA陰性細胞之百分比)，如實例17中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。
圖56顯示具有各種抑制子域之dXR蛋白的 B2M沉默活性(表示為HLA陰性細胞之百分比)，如實例17中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。
圖57A提供抑制子域模體1之標誌，如實例17中所描述。
圖57B提供抑制子域模體2之標誌，如實例17中所描述。
圖57C提供抑制子域模體3 (SEQ ID NO: 1727)之標誌，如實例17中所描述。
圖57D提供抑制子域模體4 (SEQ ID NO: 1728)之標誌，如實例17中所描述。
圖57E提供抑制子域模體5之標誌，如實例17中所描述。
圖57F提供抑制子域模體6 (SEQ ID NO: 1729)之標誌，如實例17中所描述。
圖57G提供抑制子域模體7 (SEQ ID NO: 1730)之標誌，如實例17中所描述。
圖57H提供抑制子域模體8之標誌，如實例17中所描述。
圖57I提供抑制子域模體9之標誌，如實例17中所描述。
圖58A提供替代抑制子域模體1 (SEQ ID NO: 2945)之標誌，如實例19中所描述。
圖58B提供替代抑制子域模體2之標誌，如實例19中所描述。
圖58C提供替代抑制子域模體3之標誌，如實例19中所描述。
圖58D提供替代抑制子域模體4之標誌，如實例19中所描述。
圖58E提供替代抑制子域模體5 (SEQ ID NO: 2946)之標誌，如實例19中所描述。
圖59為下圖，其繪示經編碼指定CasX或LTRP:gRNA構築體之質體轉染、在用不同濃度之DNMT1抑制劑5-azadC處理後六天表現B2M的HEK293T細胞之百分比，如實例20中所描述。
圖60為下圖，其並列示出經編碼指定CasX或LTRP:gRNA構築體之質體轉染且培養58天的HEK293T細胞之B2M抑制的量化，以及在用5-azadC處理經轉染細胞之後的B2M再活化之量化，如實例20中所描述。
圖61為曲線圖，其示出來自BJE批次之初代食蟹獼猴(CM)肝細胞在處理後4天時相對於基線PCSK9分泌水平標準化之分泌的PCSK9的百分比。用指定劑量之LNP處理CM肝細胞，該等LNP用CasX 515或LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA及具有間隔子6.1之靶向 PCSK9之gRNA調配，如實例10中所描述。虛線表示定量下限(LLOQ)。
圖62為曲線圖，其示出來自VDU批次之初代CM肝細胞在處理後4天時相對於基線PCSK9分泌水平標準化之分泌的PCSK9的百分比。用指定劑量之LNP處理CM肝細胞，該等LNP用CasX 515或LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA及具有間隔子6.1之靶向 PCSK9之gRNA調配，如實例10中所描述。虛線表示定量下限(LLOQ)。
圖63為曲線圖，其示出來自BJE批次之初代CM肝細胞在處理後11天時相對於基線PCSK9分泌水平標準化之分泌的PCSK9的百分比。用指定劑量之LNP處理CM肝細胞，該等LNP用CasX 515或LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA及具有間隔子6.1之靶向 PCSK9之gRNA調配，如實例10中所描述。虛線表示定量下限(LLOQ)。
圖64為曲線圖，其示出來自VDU批次之初代CM肝細胞在處理後11天時相對於基線PCSK9分泌水平標準化之分泌的PCSK9的百分比。用指定劑量之LNP處理CM肝細胞，該等LNP用CasX 515或LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA及具有間隔子6.1之靶向 PCSK9之gRNA調配，如實例10中所描述。虛線表示定量下限(LLOQ)。
圖65A為火山圖，其顯示在轉染後6天，比較與非靶向(NT)間隔子配對之LTRP5-ADD-ZIM3與未經處理之對照的差異基因表現分析(讀段計數之log2倍數變化(log2FC))。水平虛線顯示經調節之p＜0.001。
圖65B為火山圖，其顯示在轉染後26天，比較與非靶向(NT)間隔子配對之LTRP5-ADD-ZIM3與未經處理之對照的差異基因表現分析(讀段計數之log2FC)。水平虛線顯示經調節之p＜0.001，且垂直線顯示|log2FC| ＞2臨限值。黑色點為在應用兩個顯著性臨限值之後經識別的受差異調節之脫靶基因。
圖66A為火山圖，其顯示在轉染後6天，比較與間隔子TG-06-154配對之LTRP5-ADD-ZIM3與未經處理之對照的差異基因表現分析(讀段計數之log2FC)。水平虛線顯示經調節之p＜0.001，且垂直線顯示|log2FC| ＞2臨限值。黑色點(除 PCSK9外)為在應用兩個顯著性臨限值之後經識別的受差異調節之脫靶基因。
圖66B為火山圖，其顯示在轉染後26天，比較與間隔子TG-06-154配對之LTRP5-ADD-ZIM3與未經處理之對照的差異基因表現分析(讀段計數之log2FC)。水平虛線顯示經調節之p＜0.001，且垂直線顯示|log2FC| ＞2臨限值。黑色點(除 PCSK9外)為在應用兩個顯著性臨限值之後經識別的受差異調節之脫靶基因。
圖67A為火山圖，其顯示在轉染後6天，比較與間隔子TG-06-133配對之LTRP5-ADD-ZIM3與未經處理之對照的差異基因表現分析(讀段計數之log2FC)。水平虛線顯示經調節之p＜0.001，且垂直線顯示|log2FC| ＞2臨限值。黑色點(除 PCSK9外)為在應用兩個顯著性臨限值之後經識別的受差異調節之脫靶基因。
圖67B為火山圖，其顯示在轉染後26天，比較與間隔子TG-06-133配對之LTRP5-ADD-ZIM3與未經處理之對照的差異基因表現分析(讀段計數之log2FC)。水平虛線顯示經調節之p＜0.001，且垂直線顯示|log2FC| ＞2臨限值。黑色點(除 PCSK9外)為在應用兩個顯著性臨限值之後經識別的受差異調節之脫靶基因。
圖68為顯示在用含有指定gRNA骨架以及間隔子7.37的CpG-耗竭之AAV質體轉染之HEK293細胞中B2M基因剔除百分比之定量的條形圖，如實例24中所描述。虛線指示約41%轉染效率。
圖69A為顯示在以3E4個vg/細胞之MOI經表現使用指定gRNA骨架之CasX:gRNA系統的AAV (AAV構築體ID# 262-274)轉導之人類誘導神經元(iN)中在 AAVS1基因座處之編輯百分比的條形圖，如實例24中所描述。
圖69B為顯示在以1E4個vg/細胞之MOI經表現使用指定gRNA骨架之CasX:gRNA系統的AAV (AAV構築體ID# 262-274)轉導之人類iN中在 AAVS1基因座處之編輯百分比的條形圖，如實例24中所描述。
圖69C為顯示在以3E3個vg/細胞之MOI經表現使用指定gRNA骨架之CasX:gRNA系統的AAV (AAV構築體ID# 262-274)轉導之人類iN中在 AAVS1基因座處之編輯百分比的條形圖，如實例24中所描述。
圖70A為顯示在以1E4個vg/細胞之MOI經含有指定gRNA骨架以及間隔子7.37的CpG-耗竭之AAV質體(AAV構築體ID# 275-289)轉染之HEK293細胞中B2M基因剔除百分比之定量的條形圖，如實例24中所描述。
圖70B為顯示在以3E3個vg/細胞之MOI經含有指定gRNA骨架以及間隔子7.37的CpG-耗竭之AAV質體(AAV構築體ID# 275-289)轉染之HEK293細胞中B2M基因剔除百分比之定量的條形圖，如實例24中所描述。
圖70C為顯示在以1E3個vg/細胞之MOI經含有指定gRNA骨架以及間隔子7.37的CpG-耗竭之AAV質體(AAV構築體ID# 275-289)轉染之HEK293細胞中B2M基因剔除百分比之定量的條形圖，如實例24中所描述。
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Claims (147)

  1. 一種包含抑制子融合蛋白及引導核糖核酸(gRNA)之系統，其中該抑制子融合蛋白包含： (a)    催化失活CRISPR蛋白； (b)    抑制子域(RD1)； (c)    DNA甲基轉移酶(DNMT) 3A ATRX-DNMT3-DNMT3L域(ADD)； (d)    DNMT3A催化域(DNMT3A)；及 (e)    DNMT3L相互作用域(DNMT3L)； 其中該gRNA包含與前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型( proprotein convertase subtilisin/kexin Type 9 ， PCSK9)基因目標核酸序列互補之靶向序列，且 其中該抑制子融合蛋白能夠與該gRNA形成核糖核蛋白(RNP)。
  2. 如請求項1之系統，其中該RNP能夠結合至該 PCSK9基因目標核酸序列。
  3. 如請求項1或請求項2之系統，其中該RNP能夠在結合至該 PCSK9基因目標核酸序列時抑制該 PCSK9基因之轉錄。
  4. 如請求項1至3中任一項之系統，其中該ADD融合至該DNMT3A之N端。
  5. 如請求項1至4中任一項之系統，其中該抑制子融合蛋白自N端至C端包含： (a)    該RD1； (b)    該ADD； (c)    該DNMT3A； (d)    該DNMT3L；及 (e)    該催化失活CRISPR蛋白。
  6. 如請求項1至4中任一項之系統，其中該抑制子融合蛋白自N端至C端包含： (a)    該ADD； (b)    該DNMT3A； (c)    該DNMT3L； (d)    該RD1；及 (e)    該催化失活CRISPR蛋白。
  7. 如請求項1至6中任一項之系統，其中該催化失活CRISPR蛋白為催化失活1類CRISPR蛋白或催化失活2類CRISPR蛋白。
  8. 如請求項7之系統，其中該催化失活2類CRISPR蛋白為催化失活II型蛋白、催化失活V型蛋白或催化失活VI型蛋白。
  9. 如請求項8之系統，其中該催化失活II型蛋白為催化失活Cas9蛋白。
  10. 如請求項8之系統，其中該催化失活V型蛋白係選自由以下組成之群：催化失活Cas12a (Cpf1)、催化失活Cas12b (C2c1)、催化失活Cas12c (C2c3)、催化失活Cas12d (CasY)、催化失活Cas12e (CasX)、催化失活Cas12f、催化失活Cas12g、催化失活Cas12h、催化失活Cas12i、催化失活Cas12j、催化失活Cas12k、催化失活Cas14及催化失活CasΦ。
  11. 如請求項10之系統，其中該催化失活V型蛋白為催化失活CasX (dCasX)。
  12. 如請求項11之系統，其中該dCasX包含選自由SEQ ID NO: 4-29組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  13. 如請求項11之系統，其中該dCasX包含SEQ ID NO: 3281-3441或3444-3446的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列，且其中該序列包含RuvC域，該RuvC域包含一或多個使該RuvC域之裂解活性不活化的突變。
  14. 如請求項13之系統，其中該一或多個突變包含對應於序列SEQ ID NO: 2之D659A、E756A及/或D922A取代。
  15. 如請求項11之系統，其中該dCasX包含SEQ ID NO: 4之序列。
  16. 如請求項1至15中任一項之系統，其中該RD1包含選自由以下組成之群的胺基酸序列模體： (a)    PX 1X 2X 3X 4X 5X 6EX 7，其中 i)  X 1為A、D、E或N， ii) X 2為L或V， iii) X 3為I或V， iv) X 4為S、T或F， v) X 5為H、K、L、Q、R或W， vi) X 6為L或M，及 vii)    X 7為G、K、Q或R； (b)    X 1X 2X 3X 4GX 5X 6X 7X 8X 9，其中 i)  X 1為L或V， ii) X 2為A、G、L、T或V， iii) X 3為A、F或S， iv) X 4為L或V， v) X 5為C、F、H、I、L或Y， vi) X 6為A、C、P、Q或S， vii)    X 7為A、F、G、I、S或V， viii)   X 8為A、P、S或T，及 ix) X 9為K或R； (c)    QX 1X 2LYRX 3VMX 4(SEQ ID NO: 1727)，其中 i)  X 1為K或R， ii) X 2為A、D、E、G、N、S或T， iii) X 3為D、E或S，及 iv) X 4為L或R； (d)    X 1X 2X 3FX 4DVX 5X 6X 7FX 8X 9X 10X 11(SEQ ID NO: 1728)，其中 i)  X 1為A、L、P或S， ii) X 2為L或V， iii) X 3為S或T， iv) X 4為A、E、G、K或R， v) X 5為A或T， vi) X 6為I或V， vii)    X 7為D、E、N或Y， viii)   X 8為S或T， ix) X 9為E、P、Q、R或W， x) X 10為E或N，及 xi) X 11為E或Q； (e)    X 1X 2X 3PX 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10，其中 i)  X 1為E、G或R， ii) X 2為E或K， iii) X 3為A、D或E， iv) X 4為C或W， v) X 5為I、K、L、M、T或V， vi) X 6為I、L、P或V， vii)    X 7為D、E、K或V， viii)   X 8為E、G、K、P或R， ix) X 9為A、D、R、G、K、Q或V，及 x) X 10為D、E、G、I、L、R、S或V； (f)    LYX 1X 2VMX 3EX 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10(SEQ ID NO: 1729)，其中 i)  X 1為K或R， ii) X 2為D或E， iii) X 3為L、Q或R， iv) X 4為N或T， v) X 5為F或Y， vi) X 6為A、E、G、Q、R或S， vii)    X 7為H、L或N， viii)   X 8為L或V， ix) X 9為A、G、I、L、T或V，及 x) X 10為A、F或S， (g)    FX 1DVX 2X 3X 4FX 5X 6X 7EWX 8(SEQ ID NO: 1730)，其中 i)  X 1為A、E、G、K或R， ii) X 2為A、S或T， iii) X 3為I或V， iv) X 4為D、E、N或Y， v) X 5為S或T， vi) X 6為E、L、P、Q、R或W， vii)    X 7為D或E，及 viii)   X 8為A、E、G、Q或R； (h)    X 1PX 2X 3X 4X 5X 6LEX 7X 8X 9X 10X 11X 12，其中 i)  X 1為K或R， ii) X 2為A、D、E或N， iii) X 3為I、L、M或V， iv) X 4為I或V， v) X 5為F、S或T， vi) X 6為H、K、L、Q、R或W， vii)    X 7為K、Q或R， viii)   X 8為E、G或R， ix) X 9為D、E或K， x) X 10為A、D或E， xi) X 11為L或P，及 xii)    X 12為C或W；及 (i)    X 1LX 2X 3X 4QX 5X 6，其中 i)  X 1為C、H、L、Q或W， ii) X 2為D、G、N、R或S， iii) X 3為L、P、S或T， iv) X 4為A、S或T， v) X 5為K或R，及 vi) X 6為A、D、E、K、N、S或T。
  17. 如請求項16之系統，其中該RD1包含第一及第二胺基酸序列模體，其中： (a)    該第一胺基酸序列模體包含LYX 1X 2VMX 3EX 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10(SEQ ID NO: 1729)，其中 i)  X 1為K或R， ii) X 2為D或E， iii) X 3為L、Q或R， iv) X 4為N或T， v) X 5為F或Y， vi) X 6為A、E、G、Q、R或S， vii)    X 7為H、L或N， viii)   X 8為L或V， ix) X 9為A、G、I、L、T或V，及 x) X 10為A、F或S；及 (b)    該第二胺基酸序列模體包含FX 1DVX 2X 3X 4FX 5X 6X 7EWX 8(SEQ ID NO: 1730)，其中 i)  X 1為A、E、G、K或R， ii) X 2為A、S或T， iii) X 3為I或V， iv) X 4為D、E、N或Y， v) X 5為S或T， vi) X 6為E、L、P、Q、R或W， vii)    X 7為D或E，及 viii)   X 8為A、E、G、Q或R。
  18. 如請求項1至15中任一項之系統，其中該RD1包含選自由以下組成之群的胺基酸序列模體： (a)    DVAVYFSPEEWGCL (SEQ ID NO: 2945)； (b)    X 1X 2X 3QX 4X 5LY，其中 i)  X 1為A、D、G、N、R或S， ii) X 2為P、S或T， iii) X 3為A、S或T， iv) X 4為K或R，及 v) X 5為A、D、K、N、S或T； (c)    X 1KPX 2X 3X 4X 5X 6，其中 i)  X 1為A、P或S， ii) X 2為A、D或E， iii) X 3為L、M或V， iv) X 4為I或V， v) X 5為F、S或T，及 vi) X 6為H、K、L、Q、R或W； (d)    LEX 1X 2X 3X 4X 5X 6，其中 i)  X 1為E、K、Q或R， ii) X 2為E、G或R， iii) X 3為A、D、E或K， iv) X 4為A、D或E， v) X 5為L或P，及 vi) X 6為C或W；及 (e)    X 1VMLEX 2YX 3X 4X 5X 6SX 7X 8X 9(SEQ ID NO: 2946)，其中 i)  X 1為D或E， ii) X 2為N或T， iii) X 3為A、E、G、Q、R或S， iv) X 4為H或N， v) X 5為L、M或V， vi) X 6為A、L或V， vii)    X 7為L或V， viii)   X 8為A、G或V，及 ix) X 9為C、F或L。
  19. 如請求項1至18中任一項之系統，其中該RD1包含選自由SEQ ID NO: 130-1726組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  20. 如請求項1至18中任一項之系統，其中該RD1包含選自由SEQ ID NO: 130-224組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  21. 如請求項1至18中任一項之系統，其中該RD1包含選自由SEQ ID NO: 130-138組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  22. 如請求項1至18中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 135之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  23. 如請求項1至18中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 131之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  24. 如請求項1至15中任一項之系統，其中該RD1包含Krüppel相關盒(KRAB)域。
  25. 如請求項24之系統，其中該KRAB域為ZIM3 KRAB域或ZNF10 KRAB域。
  26. 如請求項25之系統，其中該ZIM3 KRAB域包含SEQ ID NO: 128之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  27. 如請求項25之系統，其中該ZNF10 KRAB域包含SEQ ID NO: 129之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  28. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該ADD包含SEQ ID NO: 125之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  29. 如請求項1至28中任一項之系統，其中該DNMT3A包含SEQ ID NO: 126之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  30. 如請求項1至29中任一項之系統，其中該DNMT3L包含SEQ ID NO: 127之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  31. 如請求項6至30中任一項之系統，其中 (a)    該RD1包含選自由SEQ ID NO: 128、129、131及135組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列；且 (b)    該催化失活CRISPR蛋白為dCasX。
  32. 如請求項1至31中任一項之系統，其中該抑制子融合蛋白包含一或多種連接子肽。
  33. 如請求項32之系統，其中該一或多種連接子肽中之至少一者包含選自由SEQ ID NO: 98-124組成之群的序列。
  34. 如請求項32之系統，其中該一或多種連接子肽中之至少一者包含選自由SEQ ID NO: 120及122-124組成之群的序列。
  35. 如請求項1至34中任一項之系統，其中該抑制子融合蛋白包含一或多個核定位信號(NLS)。
  36. 如請求項35之系統，其中該一或多個NLS中之至少一者包含選自由SEQ ID NO: 30-97組成之群的序列。
  37. 如請求項35之系統，其中該一或多個NLS中之至少一者為猿猴病毒40 (SV40) NLS。
  38. 如請求項37之系統，其中該SV40 NLS包含SEQ ID NO: 30之序列。
  39. 如請求項6至38中任一項之系統，其中該抑制子融合蛋白自N端至C端包含 (a)    第一NLS； (b)    該ADD； (c)    該DNMT3A； (d)    第一肽連接子； (e)    該DNMT3L； (f)    第二肽連接子； (g)    該RD1； (h)    第三肽連接子； (i)    該催化失活CRISPR蛋白； (j)    第四肽連接子；及 (k)    第二NLS。
  40. 如請求項39之系統，其中該第一連接子包含SEQ ID NO: 122之序列，該第二連接子及該第四連接子包含SEQ ID NO: 124之序列，且該第三連接子包含SEQ ID NO: 123之序列。
  41. 如請求項1至40中任一項之系統，其中該 PCSK9基因目標核酸序列係： (a)    在該 PCSK9基因中之轉錄起始部位(TSS)的1千鹼基(kb)內； (b)    在該 PCSK9基因之強化子的1 kb內； (c)    在該 PCSK9基因之5'非轉譯區內； (d)    在該 PCSK9基因之3'非轉譯區內；或 (e)    在該 PCSK9基因之外顯子內。
  42. 如請求項41之系統，其中該 PCSK9基因目標核酸序列在該 PCSK9基因之外顯子1內。
  43. 如請求項1至42中任一項之系統，其中該gRNA之該靶向序列包含選自由SEQ ID NO: 1824-2944組成之群的序列，或與其具有至少約65%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%一致性的序列。
  44. 如請求項1至42中任一項之系統，其中該gRNA之該靶向序列包含選自由SEQ ID NO: 1824-2944組成之群的序列。
  45. 如請求項1至42中任一項之系統，其中該gRNA之該靶向序列包含SEQ ID NO: 1824-2944之序列，其中1、2、3、4或5個核苷酸自該序列之該3'端移除。
  46. 如請求項1至42中任一項之系統，其中該gRNA之該靶向序列包含選自由SEQ ID NO: 1824-1890、1910、1925、2672、2675、2694及2714組成之群的序列，或與其具有至少約65%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%一致性的序列。
  47. 如請求項1至42中任一項之系統，其中該gRNA之該靶向序列包含選自由SEQ ID NO: 1824-1890、1910、1925、2672、2675、2694及2714組成之群的序列。
  48. 如請求項1至47中任一項之系統，其中該gRNA為單分子gRNA (sgRNA)且包含骨架莖環，該骨架莖環包含CCAGCGACUAUGUCGUAGUGG (SEQ ID NO: 1822)之序列或與其具有至少1、2、3、4或5個錯配之序列。
  49. 如請求項1至48中任一項之系統，其中該gRNA包含骨架，該骨架包含選自由SEQ ID NO: 1744-1821組成之群的序列，或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性的序列。
  50. 如請求項49之系統，其中該gRNA包含骨架，該骨架包含選自由SEQ ID NO: 1744-1821組成之群的序列。
  51. 如請求項1至49中任一項之系統，其中該gRNA為嵌合gRNA。
  52. 如請求項51之系統，其中該gRNA包含有包含SEQ ID NO: 1746之骨架序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性之序列。
  53. 如請求項52之系統，其中該gRNA包含有包含SEQ ID NO: 1746之骨架序列。
  54. 如請求項1至53中任一項之系統，其中該gRNA經化學修飾。
  55. 如請求項54之系統，其中該gRNA之該化學修飾包含向該gRNA之一或多個核苷酸添加2'O-甲基。
  56. 如請求項54或請求項55之系統，其中該gRNA之該化學修飾包含該gRNA之兩個或更多個核苷之間的硫代磷酸酯鍵的取代。
  57. 如請求項54至56中任一項之系統，其中該經化學修飾之gRNA包含選自由SEQ ID NO:2968-2976組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性的序列。
  58. 如請求項57之系統，其中該經化學修飾之gRNA包含SEQ ID NO: 2968之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性的序列。
  59. 如請求項57或請求項58之系統，其中該經化學修飾之gRNA序列用與該 PCSK9基因之目標核酸互補的20個核苷酸靶向序列取代該gRNA之該3'端的該等20個核苷酸。
  60. 一種包含抑制子融合蛋白之系統，其包含： (a)    能夠結合至 PCSK9基因目標核酸序列之DNA結合蛋白； (b)    DNA甲基轉移酶(DNMT) 3A ATRX-DNMT3-DNMT3L域(ADD)；及 (c)    DNMT3A催化域(DNMT3A)。
  61. 如請求項60之系統，其中該ADD融合至該DNMT3A之該N端。
  62. 如請求項60或請求項61之系統，其中該抑制子融合蛋白包含： (a)    抑制子域(RD1)； (b)    DNMT3L相互作用域(DNMT3L)；及 (c)    一或多種連接子肽。
  63. 如請求項62之系統，其中該抑制子融合蛋白自N端至C端包含： (a)    該RD1； (b)    該ADD； (c)    該DNMT3A； (d)    該DNMT3L；及 (e)    該DNA結合蛋白。
  64. 如請求項62之系統，其中該抑制子融合蛋白自N端至C端包含： (a)    該ADD； (b)    該DNMT3A； (c)    該DNMT3L； (d)    該RD1；及 (e)    該DNA結合蛋白。
  65. 如請求項62至64中任一項之系統，其中該一或多種連接子序列係選自由SEQ ID NO: 122-124組成之群且連接任何兩種選自以下之組分：該RD1、該ADD、該DNMT3A、該DNMT3L及該DNA結合蛋白。
  66. 如請求項60至64中任一項之系統，其中該DNA結合蛋白包含鋅指(ZF)域。
  67. 如請求項60至64中任一項之系統，其中該DNA結合蛋白包含轉錄活化子樣效應子(TALE)域。
  68. 如請求項60至64中任一項之系統，其中該DNA結合蛋白包含催化失活1類CRISPR蛋白或催化失活2類CRISPR蛋白。
  69. 如請求項68之系統，其包含引導核糖核酸(gRNA)，其中該gRNA包含與 PCSK9基因目標核酸序列互補之靶向序列。
  70. 如請求項69之系統，其中該gRNA能夠與該抑制子融合蛋白形成核糖核蛋白(RNP)複合物。
  71. 如請求項70之系統，其中該RNP能夠結合至該 PCSK9基因目標核酸序列。
  72. 如請求項60至71中任一項之系統，其中該抑制子融合蛋白能夠在結合至該 PCSK9基因目標核酸序列時抑制該 PCSK9基因之轉錄。
  73. 如請求項68至72中任一項之系統，其中該催化失活2類CRISPR蛋白為催化失活2類II型蛋白、催化失活2類V型蛋白或催化失活2類VI型蛋白。
  74. 如請求項73之系統，其中該催化失活2類II型蛋白為催化失活Cas9蛋白。
  75. 如請求項73之系統，其中該催化失活2類V型蛋白為催化失活Cas12a (Cpf1)、催化失活Cas12b (C2c1)、催化失活Cas12c (C2c3)、催化失活Cas12d (CasY)、催化失活Cas12e (CasX)、催化失活Cas12f、催化失活Cas12g、催化失活Cas12h、催化失活Cas12i、催化失活Cas12j、催化失活Cas12k、催化失活Cas14或催化失活CasΦ。
  76. 如請求項73之系統，其中該催化失活2類V型蛋白為催化失活CasX變異體(dCasX)。
  77. 如請求項76之系統，其中該dCasX包含選自由SEQ ID NO: 4-29組成之群的序列，或與其具有至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性的序列，其中包含該dCasX之該抑制子融合蛋白保留與gRNA形成RNP的能力。
  78. 如請求項76之系統，其中該dCasX包含SEQ ID NO: 3281-3441或3444-3446的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列，且其中該序列包含RuvC域，該RuvC域包含一或多個使該RuvC域之裂解活性不活化的突變。
  79. 如請求項78之系統，其中該一或多個突變包含對應於序列SEQ ID NO: 2之D659A、E756A及/或D922A取代。
  80. 如請求項76之系統，其中該dCasX包含SEQ ID NO: 4之序列。
  81. 如請求項62至80中任一項之系統，其中該RD1包含選自由以下組成之群的胺基酸序列模體： (a)    PX 1X 2X 3X 4X 5X 6EX 7，其中 i)  X 1為A、D、E或N， ii) X 2為L或V， iii) X 3為I或V， iv) X 4為S、T或F， v) X 5為H、K、L、Q、R或W， vi) X 6為L或M，及 vii)    X 7為G、K、Q或R； (b)    X 1X 2X 3X 4GX 5X 6X 7X 8X 9，其中 i)  X 1為L或V， ii) X 2為A、G、L、T或V， iii) X 3為A、F或S， iv) X 4為L或V， v) X 5為C、F、H、I、L或Y， vi) X 6為A、C、P、Q或S， vii)    X 7為A、F、G、I、S或V， viii)   X 8為A、P、S或T，及 ix) X 9為K或R； (c)    QX 1X 2LYRX 3VMX 4(SEQ ID NO: 1727)，其中 i)  X 1為K或R， ii) X 2為A、D、E、G、N、S或T， iii) X 3為D、E或S，及 iv) X 4為L或R； (d)    X 1X 2X 3FX 4DVX 5X 6X 7FX 8X 9X 10X 11(SEQ ID NO: 1728)，其中 i)  X 1為A、L、P或S， ii) X 2為L或V， iii) X 3為S或T， iv) X 4為A、E、G、K或R， v) X 5為A或T， vi) X 6為I或V， vii)    X 7為D、E、N或Y， viii)   X 8為S或T， ix) X 9為E、P、Q、R或W， x) X 10為E或N，及 xi) X 11為E或Q； (e)    X 1X 2X 3PX 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10，其中 i)  X 1為E、G或R， ii) X 2為E或K， iii) X 3為A、D或E， iv) X 4為C或W， v) X 5為I、K、L、M、T或V， vi) X 6為I、L、P或V， vii)    X 7為D、E、K或V， viii)   X 8為E、G、K、P或R， ix) X 9為A、D、R、G、K、Q或V，及 x) X 10為D、E、G、I、L、R、S或V； (f)    LYX 1X 2VMX 3EX 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10(SEQ ID NO: 1729)，其中 i)  X 1為K或R， ii) X 2為D或E， iii) X 3為L、Q或R， iv) X 4為N或T， v) X 5為F或Y， vi) X 6為A、E、G、Q、R或S， vii)    X 7為H、L或N， viii)   X 8為L或V， ix) X 9為A、G、I、L、T或V，及 x) X 10為A、F或S， (g)    FX 1DVX 2X 3X 4FX 5X 6X 7EWX 8(SEQ ID NO: 1730)，其中 i)  X 1為A、E、G、K或R， ii) X 2為A、S或T， iii) X 3為I或V， iv) X 4為D、E、N或Y， v) X 5為S或T， vi) X 6為E、L、P、Q、R或W， vii)    X 7為D或E，及 viii)   X 8為A、E、G、Q或R； (h)    X 1PX 2X 3X 4X 5X 6LEX 7X 8X 9X 10X 11X 12，其中 i)  X 1為K或R， ii) X 2為A、D、E或N， iii) X 3為I、L、M或V， iv) X 4為I或V， v) X 5為F、S或T， vi) X 6為H、K、L、Q、R或W， vii)    X 7為K、Q或R， viii)   X 8為E、G或R， ix) X 9為D、E或K， x) X 10為A、D或E， xi) X 11為L或P，及 xii)    X 12為C或W；及 (i)    X 1LX 2X 3X 4QX 5X 6，其中 i)  X 1為C、H、L、Q或W， ii) X 2為D、G、N、R或S， iii) X 3為L、P、S或T， iv) X 4為A、S或T， v) X 5為K或R，及 vi) X 6為A、D、E、K、N、S或T。
  82. 如請求項81之系統，其中該RD1包含第一及第二胺基酸序列模體，其中： (a)    該第一胺基酸序列模體包含LYX 1X 2VMX 3EX 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10(SEQ ID NO: 1729)，其中 i)  X 1為K或R， ii) X 2為D或E， iii) X 3為L、Q或R， iv) X 4為N或T， v) X 5為F或Y， vi) X 6為A、E、G、Q、R或S， vii)    X 7為H、L或N， viii)   X 8為L或V， ix) X 9為A、G、I、L、T或V，及 x) X 10為A、F或S；及 (b)    該第二胺基酸序列模體包含FX 1DVX 2X 3X 4FX 5X 6X 7EWX 8(SEQ ID NO: 1730)，其中 i)  X 1為A、E、G、K或R， ii) X 2為A、S或T， iii) X 3為I或V， iv) X 4為D、E、N或Y， v) X 5為S或T， vi) X 6為E、L、P、Q、R或W， vii)    X 7為D或E，及 viii)   X 8為A、E、G、Q或R。
  83. 如請求項62至80中任一項之系統，其中該RD1包含選自由以下組成之群的胺基酸序列模體： (a)    DVAVYFSPEEWGCL (SEQ ID NO: 2945)； (b)    X 1X 2X 3QX 4X 5LY，其中 i)  X 1為A、D、G、N、R或S， ii) X 2為P、S或T， iii) X 3為A、S或T， iv) X 4為K或R，及 v) X 5為A、D、K、N、S或T； (c)    X 1KPX 2X 3X 4X 5X 6，其中 i)  X 1為A、P或S， ii) X 2為A、D或E， iii) X 3為L、M或V， iv) X 4為I或V， v) X 5為F、S或T，及 vi) X 6為H、K、L、Q、R或W； (d)    LEX 1X 2X 3X 4X 5X 6，其中 i)  X 1為E、K、Q或R， ii) X 2為E、G或R， iii) X 3為A、D、E或K， iv) X 4為A、D或E， v) X 5為L或P，及 vi) X 6為C或W；及 (e)    X 1VMLEX 2YX 3X 4X 5X 6SX 7X 8X 9(SEQ ID NO: 2946)，其中 i)  X 1為D或E， ii) X 2為N或T， iii) X 3為A、E、G、Q、R或S， iv) X 4為H或N， v) X 5為L、M或V， vi) X 6為A、L或V， vii)    X 7為L或V， viii)   X 8為A、G或V，及 ix) X 9為C、F或L。
  84. 如請求項81至83中任一項之系統，其中該RD1包含選自由SEQ ID NO: 130-1726組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  85. 如請求項81至83中任一項之系統，其中該RD1包含選自由SEQ ID NO: 130-224組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  86. 如請求項81至83中任一項之系統，其中該RD1包含選自由SEQ ID NO: 130-138組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。
  87. 如請求項81至83中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 135之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
  88. 如請求項81至83中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 131之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
  89. 如請求項60至88中任一項之系統，其中該ADD包含SEQ ID NO: 125之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
  90. 如請求項60至89中任一項之系統，其中該DNMT3A包含SEQ ID NO: 126之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
  91. 如請求項60至90中任一項之系統，其中該DNMT3L包含SEQ ID NO: 127之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
  92. 一種核酸，其包含編碼如請求項1至59中任一項之gRNA的序列。
  93. 一種核酸，其包含編碼如請求項1至91中任一項之抑制子融合蛋白質的序列。
  94. 如請求項93之核酸，其中編碼該抑制子融合蛋白之該序列係經密碼子最佳化的。
  95. 如請求項94之核酸，其中編碼該抑制子融合蛋白之該序列經密碼子最佳化以表現於人類細胞中。
  96. 如請求項93至95中任一項之核酸，其中編碼該抑制子融合蛋白之該序列包含一或多個選自由SEQ ID NO: 3105、3116-3124及3127-3128組成之群的序列，或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、或至少約95%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%序列一致性的序列。
  97. 如請求項93至96中任一項之核酸，其中該核酸為信使RNA (mRNA)。
  98. 如請求項97之核酸，其中該mRNA序列之至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%的尿苷核苷經N1-甲基假尿苷置換。
  99. 如請求項97或請求項98之核酸，其包含5'非轉譯區(UTR)。
  100. 如請求項97至99中任一項之核酸，其包含3'非轉譯區(UTR)。
  101. 一種脂質奈米顆粒(LNP)，其包含如請求項97至100中任一項之核酸。
  102. 一種脂質奈米顆粒(LNP)，其包含如請求項1至59中任一項之gRNA。
  103. 一種脂質奈米顆粒(LNP)，其包含 (a)    如請求項1至59中任一項之gRNA； (b)    如請求項93至97中任一項之核酸；或 (c)    (a)與(b)之組合。
  104. 如請求項101至103中任一項之LNP，其中該LNP包含一或多種選自由以下組成之群的組分：可離子化脂質、輔助磷脂、經聚乙二醇(PEG)修飾之脂質及膽固醇或其衍生物。
  105. 如請求項104之LNP，其中該LNP包含可離子化脂質、輔助磷脂、經聚乙二醇(PEG)修飾之脂質及膽固醇或其衍生物。
  106. 如請求項101至105中任一項之LNP，其中該LNP包含有包含pKa為5至8之陽離子脂質。
  107. 一種載體，其包含如請求項92至97中任一項之核酸。
  108. 如請求項107之載體，其中該載體係選自由以下組成之群：反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、單純疱疹病毒(HSV)載體、質體、微環、奈米質體、DNA載體及RNA載體。
  109. 一種宿主細胞，其包含如請求項107或請求項108之載體。
  110. 如請求項109之宿主細胞，其中該宿主細胞係選自由以下組成之群：幼倉鼠腎纖維母細胞(BHK)細胞、人類胚胎腎293 (HEK293)細胞、人類胚胎腎293T (HEK293T)細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、融合瘤細胞、NIH3T3細胞、CV-1 (猿猴)SV40遺傳物質來源(COS)細胞、希拉細胞(HeLa cell)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞及酵母細胞。
  111. 一種醫藥組合物，其包含： (a)    如請求項1至91中任一項之系統； (b)    如請求項92至100中任一項之核酸； (c)    如請求項101至106中任一項之LNP；或 (d)    如請求項107或請求項108之載體， 及一或多種醫藥學上適合之賦形劑。
  112. 一種醫藥組合物，其包含複數個如請求項101至106中任一項之脂質奈米顆粒及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  113. 如請求項112之醫藥組合物，其中該複數個脂質奈米顆粒之平均直徑在約20 nm與約200 nm之間。
  114. 如請求項111至113中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物經調配以用於選自由以下組成之群的投與途徑：靜脈內、動脈內、門靜脈內注射、腹膜內、肌內、腦室內、腦池內、鞘內、顱內、腰髓內、眼內、皮下及經口途徑。
  115. 一種抑制細胞群體中之 PCSK9基因之轉錄之方法，該方法包含向該群體之細胞中引入： (a)    如請求項1至91中任一項之系統； (b)    如請求項92至100中任一項之核酸； (c)    如請求項101至106中任一項之LNP； (d)    如請求項107或請求項108之載體； (e)    如請求項111至114中任一項之醫藥組合物；或 (f)    (a)至(d)中之兩者或更多者之組合， 其中該 PCSK9基因之轉錄係藉由該抑制子融合蛋白質進行抑制。
  116. 如請求項115之方法，其中至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、或至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或更多的該群體之該等細胞之該 PCSK9基因的轉錄經抑制。
  117. 如請求項115或請求項116之方法，其中在該群體之該等細胞中抑制該 PCSK9基因之轉錄，使得PCSK9蛋白的表現與其中該 PCSK9基因之轉錄尚未經抑制之細胞相比，減少至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少99%。
  118. 如請求項115至117中任一項之方法，其中該群體之該等細胞之該 PCSK9基因之轉錄經抑制，以使得至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%之該群體之該等細胞不表現可偵測量之PCSK9蛋白。
  119. 如請求項115至117中任一項之方法，其中該群體之該等細胞之該 PCSK9基因之轉錄的抑制係可遺傳的。
  120. 如請求項119之方法，其中該PCKS9基因之該抑制持續至少1、2、3、4、5或6次或更多次細胞分裂。
  121. 如請求項115至120中任一項之方法，其中當在活體外分析中分析時，該群體之該等細胞之該 PCSK9基因之轉錄的抑制持續至少約8小時、至少約1天、至少約7天、至少2週、至少約3週、至少約1個月或至少約2個月。
  122. 如請求項115至121中任一項之方法，其中該等細胞為真核細胞。
  123. 如請求項122之方法，其中該等真核細胞選自由以下組成之群：嚙齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞及非人類靈長類動物細胞。
  124. 如請求項122之方法，其中該等真核細胞為人類細胞。
  125. 如請求項115至124中任一項之方法，其中該等真核細胞選自由以下組成之群：肝細胞、腸細胞、腎細胞、中樞神經系統細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、視網膜細胞及動脈內皮細胞。
  126. 如請求項115至124中任一項之方法，其中該等真核細胞係選自由以下組成之群：胚胎幹細胞、誘導型多能幹細胞、生殖細胞、纖維母細胞、寡樹突神經膠質細胞、膠細胞、造血幹細胞、神經元祖細胞、神經元、星形膠質細胞、肌肉細胞、骨細胞、肝細胞、胰臟細胞、視網膜細胞、癌細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、胚胎心肌細胞、肌纖維母細胞、間充質幹細胞、自體移植擴增之心肌細胞、脂肪細胞、全能細胞、多能細胞、血液幹細胞、肌母細胞、骨髓細胞、間充質細胞、實質細胞、上皮細胞、內皮細胞、間皮細胞、纖維母細胞、骨母細胞、軟骨細胞、造血幹細胞、骨髓衍生之祖細胞、心肌細胞、骨骼細胞、胚胎細胞、未分化細胞、多能祖細胞、單能祖細胞、單核球、心肌母細胞、骨骼肌母細胞、巨噬細胞、毛細管內皮細胞、異種細胞、同種異體細胞或出生後幹細胞。
  127. 如請求項115至126中任一項之方法，其中該細胞群體之該 PCSK9基因之轉錄的該抑制在活體外或離體發生。
  128. 如請求項115至126中任一項之方法，其中該細胞群體之該 PCSK9基因之轉錄的該抑制在個體中活體內發生。
  129. 如請求項128之方法，其中該個體選自由以下組成之群：嚙齒動物、小鼠、大鼠及非人類靈長類動物。
  130. 如請求項128之方法，其中該個體為人類。
  131. 如請求項115至130中任一項之方法，其中該抑制在一或多次細胞分裂中保持穩定。
  132. 如請求項115至131中任一項之方法，其中該抑制為可逆的。
  133. 如請求項132之方法，其中該抑制藉由向該群體之細胞中引入DNA甲基轉移酶抑制劑而為可逆的。
  134. 如請求項133之方法，其中該DNA甲基轉移酶抑制劑為胞苷類似物。
  135. 如請求項133或請求項134之方法，其中該DNA甲基轉移酶抑制劑係選自由以下組成之群：阿紮胞苷(azacytidine)、地西他濱(decitabine)、氯法拉濱(clofarabine)及澤布拉林(zebularine)。
  136. 一種治療有需要之個體之 PCSK9相關疾病或病症的方法，其包含使該個體之細胞與治療有效劑量之以下接觸： (a)    如請求項1至91中任一項之系統； (b)    如請求項92至100中任一項之核酸； (c)    如請求項101至106中任一項之LNP； (d)    如請求項107或請求項108之載體； (e)    如請求項111至114中任一項之醫藥組合物；或 (f)    (a)至(d)中之兩者或更多者之組合， 其中該 PCSK9基因之轉錄係藉由該抑制子融合蛋白質在所接觸之細胞中進行抑制。
  137. 如請求項136之方法，其中該等細胞與治療有效劑量之該LNP接觸。
  138. 如請求項137之方法，其中該LNP係藉由選自由靜脈內、動脈內、門靜脈內注射、腹膜內、肌內、腦室內、腦池內、鞘內、顱內、腰髓內、眼內、皮下及經口途徑組成之群的投與途徑進行投與。
  139. 如請求項136至138中任一項之方法，其中該個體用增加肝LDL受體(LDLR)表現之治療劑預處理。
  140. 如請求項139之方法，其中該治療劑係選自以下組成之群：依洛尤單抗(evolocumab)、因利司然(inclisiran)、阿利庫單抗(alirocumab)及MK-0616。
  141. 如請求項136至140中任一項之方法，其中該 PCSK9相關疾病為常染色體顯性高膽固醇血症(ADH)、高膽固醇血症、總膽固醇水平升高、高血脂病、低密度脂蛋白(LDL)水平升高、LDL-膽固醇水平升高、高密度脂蛋白水平降低、肝臟脂肪變性、冠心病、缺血、中風、周邊血管疾病、血栓形成、2型糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、肥胖症、主動脈狹窄、PCSK9水平升高或其組合。
  142. 如請求項136至141中任一項之方法，其中該方法使得至少一個選自由以下組成之群的臨床相關終點得到改善：LDL-膽固醇相對於基線之變化、斑塊動脈粥瘤體積之減少、冠狀動脈斑塊之減少、動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)之減少、心臟血管死亡、非致命心肌梗塞、缺血性中風、非致命中風、冠狀動脈血管再形成、不穩定型心絞痛及視力。
  143. 如請求項136至141中任一項之方法，其中該方法使得至少兩個選自由以下組成之群的臨床相關終點得到改善：LDL-膽固醇相對於基線之變化、斑塊動脈粥瘤體積之減少、冠狀動脈斑塊之減少、動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)之減少、心臟血管死亡、非致命性心肌梗塞、缺血性中風、非致命性中風、冠狀動脈血管再形成、不穩定型心絞痛及視力。
  144. 如請求項1至91中任一項之系統、如請求項92至100中任一項之核酸、如請求項101至106中任一項之LNP、如請求項107或請求項108之載體、如請求項111至114中任一項之醫藥組合物或其組合，其用於製造供治療 PCSK9相關疾病用之藥劑。
  145. 如請求項1至91中任一項之系統、如請求項92至100中任一項之核酸、如請求項101至106中任一項之LNP、如請求項107或請求項108之載體、如請求項111至114中任一項之醫藥組合物或其組合，其用於抑制細胞群體中之 PCSK9目標核酸序列或治療 PCSK9相關疾病。
  146. 一種套組，其包含如請求項1至91中任一項之系統、如請求項92至100中任一項之核酸、如請求項101至106中任一項之LNP、如請求項107或請求項108之載體、如請求項111至114中任一項之醫藥組合物或其組合以及適合容器。
  147. 如請求項146之套組，其包含緩衝劑、賦形劑、核酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、脂質體、治療劑、標記、標記觀測試劑、使用說明書或前述之任何組合。
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