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JP2022512718A - インテインタンパク質及びその使用 - Google Patents

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JP2022512718A JP2021521008A JP2021521008A JP2022512718A JP 2022512718 A JP2022512718 A JP 2022512718A JP 2021521008 A JP2021521008 A JP 2021521008A JP 2021521008 A JP2021521008 A JP 2021521008A JP 2022512718 A JP2022512718 A JP 2022512718A
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Abstract

本発明は、有効な遺伝子療法、詳細には5Kbより大きい遺伝子の遺伝子療法を可能にするコンストラクト、ベクター、関連する宿主細胞及び医薬組成物に関する。

Description

技術分野
本発明は、有効な遺伝子療法、詳細にはコード配列(CDS)が5kbより大きい遺伝子の突然変異に起因する疾患に対する遺伝子療法を可能にするコンストラクト、ベクター、関連する宿主細胞及び医薬組成物に関する。
発明の背景
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる遺伝子療法は、ヒトにおいて安全且つ有効である。近年、米国及び欧州の両方で遺伝性代謝疾患及び失明病に対してAAVベースの遺伝子療法製剤が承認された一方、眼科学から血液学まで、筋骨格及び代謝障害までに及ぶ様々な治療領域の疾患に対するAAVベースの遺伝子療法手法についての臨床試験がかつてないほど増えている。
しかしながら、AAVベクターのカーゴ容量が限られていることは、5kbより大きいコード配列(CDS)を有する遺伝子(本明細書では大型遺伝子とも称される)の突然変異に起因する疾患に対するAAVベース療法の開発の妨げとなっている。
大型遺伝子の突然変異に起因する遺伝性疾患(以下の表1に挙げる)としては、とりわけ、DMD遺伝子の突然変異に起因するデュシェンヌ型筋ジストロフィー、CFTR遺伝子の突然変異に起因する嚢胞性線維症、F8遺伝子の突然変異に起因する血友病A、DYSF遺伝子の突然変異に起因するジスフェルリン異常症、PKD遺伝子の突然変異に起因する多発性嚢胞腎疾患、ATP7B遺伝子の突然変異に起因するウィルソン病、HTT遺伝子の突然変異に起因するハンチントン病、NPC1遺伝子の突然変異に起因するニーマン・ピック病C型が挙げられる。
Figure 2022512718000002
更に、以下の表2に挙げるとおり、幾つかの遺伝性網膜変性症(IRD)が大型遺伝子の突然変異に起因する。IRDは、欧州及び米国では約3000人に1人に発症する(58)。
最も頻度の高い重症型のIRDの中には、網膜色素変性症(RP)、レーベル先天黒内障(LCA)及びスタルガルト病(STGD)があり、これらは、ほとんどの場合に単一遺伝子病態として遺伝性であり、世界全体の有病率は、1/2,000人であり(1)、全世界的に失明の主な原因である。IRDを引き起こす突然変異の大多数は、網膜の神経細胞光受容体(PR)、桿体及び/又は錐体に発現する遺伝子に起こる(2)。
遺伝子療法は、IRDの治療に大いに有望である。遺伝による形態の失明に対する最初のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターベースの遺伝子療法製剤は、2017年12月に承認された(3)。加えて、幾つもの他のAAVベースの製剤が、稀な及び一般的な形態の失明の遺伝子療法に向けて現在臨床開発中である(4)。現在、AAVが網膜に対する最も効率的な遺伝子療法輸送手段に相当することがこれまでに十分に確立されているが(4、5)、その限られたカーゴ容量は、トランス遺伝子のみならず、その発現に不可欠なシス調節エレメントも含む、5kbを超えるサイズのDNA配列を送達する必要がある病態へのその使用を阻んでいる(6)。
以下の表2に、5kbを超えるサイズの疾患遺伝子の例をまとめる。
Figure 2022512718000003
スタルガルト病(STGD;MIM#248200)は、最も一般的な形態の遺伝性黄斑変性症であり、PR外節に位置するオールトランスレチナール輸送体をコードするABCA4遺伝子(CDS:6822bp)の突然変異によって引き起こされ(7);アッシャー症候群IB型(USH1B;MIM#276900)は、最も重症型のRP及び難聴であり、網膜内でPR及びRPEの両方に発現するアクチンベースのモーターである非従来型MYO7AをコードするMYO7A遺伝子(CDS:6648bp)(8)の突然変異によって引き起こされる(9~11)。
錐体桿体ジストロフィー3型、黄色斑眼底、加齢黄斑変性症2型、早期発症型重症網膜ジストロフィー及び網膜色素変性症19型もABCA4突然変異に関連する(本明細書ではABCA4関連疾患と称される)。
本発明者ら及び他の研究者らは、大型トランス遺伝子発現カセットのコード配列(CDS)の断片をそれぞれ含むデュアルAAVベクター(最大9kb)(6、12、13)又はトリプルAAVベクター(最大14kb)(14)のいずれかを使用することにより、この制約を克服し得ることを示している。デュアル及びトリプルAAVベクターでは、AAVゲノムのコンカテマー化及び組換えを利用して、複数のAAVベクターに共感染した細胞において完全長ゲノムを再構成する。しかしながら、多くの遺伝性網膜疾患の主な治療標的である光受容体では、デュアル又はトリプルのいずれのAAVベクターで実現するトランス遺伝子の発現効率もシングルAAVベクターで実現するより低い(6、14、15)。これは、正しいDNAコンカテマー形成、異種mRNAの安定性及びベクターの接合部にかけてのスプライシング効率を含め、効率的な形質導入に必要な様々な律速段階に起因する可能性がある。
本発明者らは、国際公開第2014/170480号及びColella et al(15)において、スプライシング(トランススプライシング)、相同組換え(オーバーラッピング)又はこれらの2つの組み合わせ(ハイブリッド)のいずれかによって大型遺伝子を再構成するデュアルAAVベクターを示しており、遺伝性網膜変性症の治療にデュアルトランススプライシングベクター及びハイブリッドベクターが特に効率的であることを見出している。更に、Maddalena et al.(14)は、最大14kbまでの遺伝子のためのトリプルAAVベクター手法を実証した。しかしながら、デュアル又はトリプルのいずれのAAVベクターで実現するトランス遺伝子の発現効率もシングルAAVベクターで実現するより低い(6、13、14)。これは、正しいDNAコンカテマー形成、異種mRNAの安定性及びベクターの接合部にかけてのスプライシング効率を含め、効率的な形質導入に必要な様々な律速段階に起因する可能性がある。更に、トリプルAAVベクター戦略で得られる遺伝子発現レベルは、治療手法に必要な閾値よりも低い。
従って、有効な遺伝子療法のための大型遺伝子発現の再構成に利用し得るコンストラクト及びベクターがなおも必要とされている。
ここで、本発明者らは、短いスプリットインテインが、隣接するレポータータンパク質又は大型治療用タンパク質のいずれかの断片の1つをそれぞれコードする複数のAAVベクターを送達すると、インビトロ及びインビボの両方でタンパク質トランススプライシング及び完全長タンパク質再構成が生じることを見出した。
インテインは、宿主タンパク質内で転写及び翻訳される遺伝要素であり、エネルギー供給、外因性の宿主特異的プロテアーゼ又は補因子がなくても、最終的なタンパク質産物中にアミノ酸修飾を残すことなく、タンパク質イントロンと同様に宿主タンパク質から自らを切り出す(16、17、27、28)。インテイン活性は、コンテクスト依存的であり、効率的なトランススプライシングが起こるのに必要な特定のペプチド配列がそのライゲーション接合部を取り囲んでおり(N-及びC-エクステインと呼ばれる)、そのうちの最も重要なものは、C-エクステイン中の1番目の残基としてのチオール基又はヒドロキシル基を含むアミノ酸(即ちCys、Ser又はThr)である(18)。スプリットインテインは、2つの宿主タンパク質の末端に2つの別個のポリペプチドとして発現するインテインのサブセットであり、それらのトランススプライシングを触媒して、より大きい単一のポリペプチドの生成をもたらす(19)。インテインは、スプリットインテインを含め、タンパク質精製及び標識工程(19、20)並びに広く使用されているCRISPR/Cas9ゲノム編集ヌクレアーゼの再構成(21、22)を含む生物工学的適用において広く使用されている。
インテインベースのタンパク質スプライシングを利用して、第VIII因子遺伝子を含めた治療用遺伝子の発現を再構成しようとする試みが幾つか行われており、ここで、シネコシスティス属種(Synechocystis sp)(Ssp)DnaBインテイン融合第VIII因子重鎖及び軽鎖遺伝子が第VIII因子の再構成につながることが細胞培養物及び動物モデルで実証された(23、24)。同様に、インビトロ及びインビボで高機能形態のジストロフィン遺伝子の発現が行われており、ここで、6.3kbのベッカー型ジストロフィン遺伝子が2つのAAVベクターに分けられ、シネコシスティス属種(Synechocystis sp.)PCC 6803(Ssp)DnaBインテイン又はロドサーマス・マリヌス(Rhodothermus marinus)(Rma)DnaBインテインから得られたスプリットインテインに各半分が融合された(25)。更に、スプリットインテイン(即ちN.パンクチフォルメ(N. punctiforme)DnaEスプリットインテイン)媒介性タンパク質トランススプライシング戦略が、心臓細胞で2つの別個の断片からL型カルシウムチャネルの大型膜孔形成サブユニットを再構成することが報告された(26)。米国特許第6,544,786号は、スプリットインテインを使用したジストロフィンミニ遺伝子の送達を更に報告している。
本発明者らは、スプリットインテインがタンパク質トランススプライシングを媒介する固有の能力を生かして、コード配列がシングルAAVベクターに収まる2つ又は3つのいずれかのスプリットインテイン隣接ポリペプチドに大型完全長タンパク質を断片化した後、再構成した。
従って、本発明は、スプリットインテインと融合された前記大型タンパク質の2つ以上の断片を標的細胞に提供して、インテイン媒介性トランススプライシングを促進し、且つ機能性タンパク質を再構成することにより、細胞性大型タンパク質の再構成を実現する。
発明の概要
本発明は、遺伝子、詳細にはコード領域が5kbを超える遺伝子の突然変異に起因する疾患に対するAAVベクターによる遺伝子療法を提供する。
本発明者らは、スプリットインテインによって媒介されるタンパク質トランススプライシングが単細胞生物によりタンパク質の再構成に用いられているという知見に基づき、短いスプリットインテインが、隣接するレポータータンパク質又は大型治療用タンパク質のいずれかの断片の1つをそれぞれコードする複数のAAVベクターを構築し、その結果、インビトロ及びインビボでタンパク質トランススプライシング及び完全長タンパク質再構成が生じた。
有利には、本発明によって実現したAAVベースのタンパク質トランススプライシングの媒介による疾患タンパク質の再構成により、当技術分野において公知のAAVをベースとする大型タンパク質向けの方法と比べて多い量の標的タンパク質の発現が得られた。これは、恐らく、正しいDNAコンカテマー形成、異種mRNAの安定性及びベクターの接合部にかけてのスプライシング効率を含めた、デュアルベクターベースのシステムの効率的な形質導入に必要とされる様々な律速段階が克服されることに起因する。
本発明は、細胞においてコード配列を発現するためのベクターシステムを提供し、前記コード配列は、第1の部分(CDS1)及び第2の部分(CDS2)並びに任意選択で第3の部分(CDS3)からなり、前記ベクターシステムは、
a)第1のベクターであって、
- 前記コード配列の前記第1の部分(CDS1)、
- N-インテインをコードする第1のインテインヌクレオチド配列であって、CDS1の3’末端に位置する第1のインテインヌクレオチド配列
を含む第1のベクターと;
b)第2のベクターであって、
- 前記コード配列の前記第2の部分(CDS2)、
- C-インテインをコードする第2のインテインヌクレオチド配列であって、CDS2の5’末端に位置する第2のインテインヌクレオチド配列
を含む第2のベクターと
を含み;
第1のベクター及び第2のベクターが細胞に挿入されると、そのコード配列のタンパク質産物は、タンパク質スプライシングによって産生されるか;又は
前記ベクターシステムは、
a’)第1のベクターであって、
- 前記コード配列の前記第1の部分(CDS1)、
- 第1のN-インテインをコードする第1のインテインヌクレオチド配列であって、CDS1の3’末端に位置する第1のインテインヌクレオチド配配列
を含む第1のベクターと;
b’)第2のベクターであって、
- 前記コード配列の前記第2の部分(CDS2)、
- 第1のC-インテインをコードする第2のインテインヌクレオチド配列であって、CDS2の5’末端に位置する第2のインテインヌクレオチド配列;
- 第2のN-インテインをコードする第3のインテインヌクレオチド配列であって、CDS2の3’末端に位置する第3のインテインヌクレオチド配列
を含む第2のベクターと;
c’)第3のベクターであって、
- 前記コード配列の前記第3の部分(CDS3)、
- 第2のC-インテインをコードする第4のインテインヌクレオチド配列であって、CDS3の5’末端に位置する第4のインテインヌクレオチド配列
を含む第3のベクターと
を含み、
第1のインテインヌクレオチド配列は、第3のインテインヌクレオチド配列と異なり、及び第2のインテイン配列は、第4のインテインヌクレオチド配列と異なり、第1のベクター、第2のベクター、第3のベクターが細胞に挿入されると、そのコード配列のタンパク質産物は、タンパク質トランススプライシングによって産生される。
好ましくは、本ベクターシステムでは、第1のインテイン、第2のインテイン、第3のインテイン及び第4のインテインは、スプリットインテインをコードし、好ましくは、前記スプリットインテインは、150アミノ酸の最大長さを有し、より好ましくは、前記スプリットインテインは、DnaE又はDnaBインテインである。
本発明によれば、インテインとは、タンパク質スプライシングとして知られる過程で自らを切り出して残りの部分(エクステイン)をペプチド結合でつなぎ合わせることが可能なタンパク質中のセグメントである。このようなセグメントは、内側のタンパク質配列について「インテイン」及び外側のタンパク質配列について「エクステイン」と呼ばれ、ここで、上流のエクステインは、「N-エクステイン」と称され、下流のエクステインは、「C-エクステイン」と呼ばれ、上流のインテインは、「N-インテイン」と呼ばれ、下流のインテインは、「C-インテイン」と呼ばれる。
従って、本発明との関連において、N-インテインは、第1のポリペプチドのN端に位置する(及びそれと融合した)インテイン断片であり、C-インテインは、第2のポリペプチドのC端に位置する(及びそれと融合した)インテイン断片であり、ここで、これらの2つのポリペプチドが発現すると、2つのインテイン断片がタンパク質トランススプライシングを起こし、つなぎ合わされて完全なインテインを形成し、且つ2つのポリペプチドがつなぎ合わされ、ここで、これらの2つのポリペプチドが完全長タンパク質を形成すると、前記完全長タンパク質が再構成される。
本発明によれば、第1のインテイン配列は、N-インテイン配列であり、及び第2のインテイン配列は、C-インテイン配列であり、前記N-インテインと前記C-インテインとは、好ましくは、同じインテイン又はスプリットインテイン遺伝子に由来する。代わりに、前記N-インテインと前記C-インテインとは、天然でトランススプライシング反応を起こすことが可能であるか又はそれを起こすように修飾されている2つの異なるインテイン遺伝子に由来する。従って、同じ遺伝子は、同じ生物又は異なる生物からのものであり得る。例えば、広く使用されているスプリットインテインは、異なる生物からのDnaE遺伝子に由来する。本発明によれば、目的タンパク質のコード配列が2つの部分に分断されるとき、N-インテインコード配列は、目的タンパク質のN端側部分をコードする配列とインフレームで融合され;C-インテインコード配列は、目的配列のC端側部分をコードする配列とインフレームで融合される。これらの2つの融合タンパク質前駆体が発現すると、インテインが自己触媒的な切り出しを起こし、ライゲートされたエクステイン、例えば再構成された目的タンパク質を形成する。
本発明によれば、目的タンパク質のコード配列は、3つの部分に分断され得る。従って、第1のインテイン配列は、N-インテイン配列であり、及び第2のインテイン配列は、C-インテイン配列であり、第1のインテインコード配列は、目的タンパク質のN部分をコードする配列とC端においてインフレームで融合され、及び第2のインテインコード配列は、目的タンパク質の中央部分をコードする配列のN端においてインフレームで融合される。従って、前記N-インテインと前記C-インテインとは、好ましくは、同じインテイン又はスプリットインテイン遺伝子に由来する。代わりに、前記N-インテインと前記C-インテインとは、天然でトランススプライシング反応を起こすことが可能であるか又はそれを起こすように修飾されている2つの異なるインテイン遺伝子に由来する。従って、同じ遺伝子は、同じ生物又は異なる生物からのものであり得る。本構成の範囲内では、第3のインテインは、目的タンパク質の中央部分のC端部をコードする配列とインフレームで融合したN-インテインコード配列であり、及び第4のインテインは、目的タンパク質のC部分のN端部をコードする配列とインフレームで融合したC-インテインコード配列である。従って、前記第3及び第4のインテインは、好ましくは、同じインテイン又はスプリットインテイン遺伝子に由来する。代わりに、前記N-インテインと前記C-インテインとは、天然でトランススプライシング反応を起こすことが可能であるか又はそれを起こすように修飾されている2つの異なるインテイン遺伝子に由来する。従って、同じ遺伝子は、同じ生物又は異なる生物からのものであり得る。本発明の範囲内では、前記第1及び第2のインテインと前記第3及び第4のインテインとは、異なるインテイン遺伝子に由来し、第1のインテインは、選択的に第2のインテインと結合する一方、第3のインテインは、選択的に第4のインテインと結合する。
本発明では、第1のベクター、第2のベクター及び任意選択で第3のベクターが細胞に挿入されると、少なくとも2つの融合タンパク質又は3つの融合タンパク質が形成され、前記2つの融合タンパク質又は3つの融合タンパク質を接触させると、そのコード配列のタンパク質産物が産生される。接触させるステップは、N-インテインがC-インテインに結合することを許容する条件下で実施される。
本発明では、第1のベクター、第2のベクター及び第3のベクターが細胞に挿入されると、3つの独立したポリペプチドが産生され、トランススプライシングを経て完全長タンパク質が産生される。3つのAAVインテインベクターの開発には、異なるインテイン、即ちDnaE及びDnaBの使用が極めて重要であるとされており、これらは、交差反応しないため、従って第1及び第3のベクターによって産生されるポリペプチド間での不適切なトランススプライシングが防止される。
本発明の好ましい実施形態によれば、細胞において目的遺伝子のコード配列を発現するためのベクターシステムは、2つのベクターを含み、各ベクターは、インテイン配列が隣接する前記コード配列の一部分を含み、ここで、前記コード配列の5’末端部には、3’端でN-インテインの配列が隣接し、及び目的遺伝子のコード配列の3’末端部には、C-インテインの配列が隣接し、そのため、細胞において両方のベクターが発現すると、2つの融合タンパク質が産生され、自発的なトランススプライシング反応の結果として完全長の目的タンパク質が生成される。
本発明の更なる好ましい実施形態によれば、細胞において目的遺伝子のコード配列を発現するためのベクターシステムは、3つのベクターを含み、各ベクターは、インテイン配列が隣接する前記コード配列の一部分を含み、ここで、コード配列は、3つの部分に分断されて、前記コード配列の5’末端部に3’端で第1のN-インテインの配列が隣接し;前記コード配列の中央部分に5’端で第1のC-インテイン及び3’端で第2のN-インテインが隣接し;前記コード配列の3’部分に5’端で第2のC-インテインが隣接することになり、そのため、細胞において3つ全てのベクターが発現すると、3つの融合タンパク質が産生され、第1のN-インテインが第1のC-インテインと反応し、且つ第2のN-インテインが第2のC-インテインと反応する自発的なトランススプライシング反応の結果として、完全長の目的タンパク質が生成される。
本発明のスプリットインテインは、1つの遺伝子によってコードされ得、次に、この遺伝子が、2つの別個のインテイン断片、例えばスプリットインテインをコードするように操作されるか;又は天然に存在するスプリットインテインは、2つの別個の遺伝子によってコードされ;例えばシアノバクテリアでは、DNAポリメラーゼIIIの触媒サブユニットαであるDnaEは、2つの別個の遺伝子dnaE-n及びdnaE-cによってコードされる。本発明の範囲内にある好ましいインテインは、インテインタンパク質に由来するインテイン(例えば、ミニインテイン)又はトランススプライシング反応を経てインテインタンパク質を形成するスプリットインテインであり、これらは、150aa長以下である。
本発明のスプリットインテインは、天然に存在するインテイン又は配列番号1~14(相同体)と100%同一、98%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%同一であり得、ここで、前記インテインは、トランススプライシング反応を起こす能力を保持している。トランススプライシング活性を保持している天然に存在する又は修飾されたインテインの断片又は変異体は、本発明の範囲内にある。
好都合には、本発明のスプリットインテインは、異なる生物から単離された同じ遺伝子に由来し得る。好ましいインテイン遺伝子は、DnaB及びDnaEである。
好ましい実施形態において、本発明のインテインは、ノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)(Npu)、シネコシスティス属種(Synechocystis sp.)PCC6803(Ssp)、フィスケレラ属種(Fischerella sp.)PCC 9605、スキトネマ・トリポトリコイデス(Scytonema tolypothrichoides)、シアノバクテリア菌(Cyanobacteria bacterium)SW_9_47_5、ノドゥラリア・スプミゲナ(Nodularia spumigena)、ノストック・フラゲリフォルメ(Nostoc flagelliforme)、クロコスフェラ・ワトソニイ(Crocosphaera watsonii)WH 8502、クロオコクシディオプシス・クバナ(Chroococcidiopsis cubana)CCALA 043、トリコデスミウム・エリトラエウム(Trichodesmium erythraeum)を含むシアノバクテリアからのDnaE遺伝子(例えばDNAポリメラーゼIIIサブユニットα)に由来するスプリットインテインであり;好ましくは、本発明のインテインは、ノストック・パンクチフォルメ(nostoc punctiforme)又はシネコシスティス属種(Synechocystis sp.)PCC6803から単離されたDna E遺伝子に由来する。
更に好ましい実施形態において、本発明のインテインは、例えば、(59)に記載される、R.マリヌス(R. marinus)(Rma)、シネコシスティス属種(Synechocystis sp.)PC6803(Ssp)、ポルフィラ・プルプレア(Porphyra purpurea)葉緑体(Ppu)を含むシアノバクテリアからのDnaB遺伝子に由来するスプリットインテインである。
好ましくは、
- 第1のインテインヌクレオチド配列は、配列番号1、3、5、7、9、11、13からなる群から選択されるインテイン又はその変異体、若しくはその断片、若しくはその相同体をコードし;
- 第2のインテインヌクレオチド配列は、配列番号2、4、6、8、10、12、14からなる群から選択されるインテイン又はその変異体、若しくはその断片、若しくはその相同体をコードし;
- 第3のインテインヌクレオチド配列は、配列番号1、3、5、7、9、11、13からなる群から選択されるインテイン又はその変異体、若しくはその断片、若しくはその相同体をコードし;
- 第4のインテインヌクレオチド配列は、配列番号2、4、6、8、10、12、14からなる群から選択されるインテイン又はその変異体、若しくはその断片、若しくはその相同体をコードする。
好ましくは、ここで、第1又は第3のインテインが配列番号1であるとき、第2又は第4は、配列番号2であるか;又は第1又は第3のインテインが配列番号3であるとき、第2又は第4のインテインは、配列番号4であるか;又は第1又は第3のインテインが配列番号5であるとき、第2又は第4は、配列番号6であるか;又は第1又は第3のインテインが配列番号7であるとき、第2又は第4は、配列番号8であるか;又は第1又は第3のインテインが配列番号9であるとき、第2又は第4は、配列番号10であるか;又は第1又は第3のインテインが配列番号11であるとき、第2又は第4は、配列番号12である。
好ましくは、第1のインテインが配列番号1であり、且つ第2のインテインが配列番号2であるとき、第3のインテインは、配列番号1でなく、且つ第4のインテインは、配列番号2でなく;好ましくは、第1のインテインが配列番号3であり、且つ第2のインテインが配列番号4であるとき、第3のインテインは、配列番号3でなく、且つ第4のインテインは、配列番号4でなく;好ましくは、第1のインテインが配列番号5であり、且つ第2のインテインが配列番号6であるとき、第3のインテインは、配列番号5でなく、且つ第4のインテインは、配列番号6でなく;好ましくは、第1のインテインが配列番号7であり、且つ第2のインテインが配列番号8であるとき、第3のインテインは、配列番号7でなく、且つ第4のインテインは、配列番号8でなく;好ましくは、第1のインテインが配列番号9であり、且つ第2のインテインが配列番号10であるとき、第3のインテインは、配列番号9でなく、且つ第4のインテインは、配列番号10でなく;好ましくは、第1のインテインが配列番号11であり、且つ第2のインテインが配列番号12であるとき、第3のインテインは、配列番号11でなく、且つ第4のインテインは、配列番号12でない。
詳細な実施形態において、第1のインテインは、配列番号1であり、第2のインテインは、配列番号2であり、第3のインテインは、配列番号3であり、第4のインテインは、配列番号4であるか;又は第1のインテインは、配列番号5であり、第2のインテインは、配列番号6であり、第3のインテインは、配列番号3であり、第4のインテインは、配列番号4である。
好ましい実施形態において、第1のベクター、第2のベクター及び第3のベクターは、コード配列の前記第1の部分(CDS1)、又はコード配列の前記第2の部分(CDS2)、又はコード配列の前記第3の部分(CDS3)の5’末端部分に作動可能に連結されたプロモーター配列を更に含む。
好ましいプロモーターは、転写プロモーター活性を保持しているその断片及び変異体を含めた、遍在性、人工的又は組織特異的プロモーターである。特に好ましいプロモーターは、光受容体特異的ヒトGタンパク質共役受容体キナーゼ1(GRK1)、光受容体間レチノイド結合タンパク質プロモーター(IRBP)、ロドプシンプロモーター(RHO)、卵黄様黄斑ジストロフィー2プロモーター(VMD2)、ロドプシンキナーゼプロモーター(RK)を含めた光受容体特異的プロモーターであり;更に特に好ましいプロモーターは、MCK、MYODIを含めた筋肉特異的プロモーター;サイロキシン結合グロブリン(TBG)、ハイブリッド肝特異的プロモーター(HLP)(67)を含めた肝特異的プロモーター;hSYN1、CaMKIIaを含めたニューロン特異的プロモーター;Ksp-カドヘリン16、NKCC2を含めた腎臓特異的プロモーターである。本発明に係る遍在性プロモーターは、例えば、遍在性サイトメガロウイルス(CMV)(32)及びショートCMV(33)プロモーターである。本発明の範囲内におけるより好ましいプロモーターは、GRK1、TBG、CaMKIIa、Ksp-カドヘリン16である。
なおも好ましい実施形態において、第1のベクター、第2のベクター及び第3のベクターは、5’末端反復(5’-TR)ヌクレオチド配列と、3’末端反復(3’-TR)ヌクレオチド配列とを更に含み、好ましくは、5’-TRは5’逆方向末端反復(5’-ITR)ヌクレオチド配列であり、及び3’-TRは、3’逆方向末端反復(3’-ITR)ヌクレオチド配列である。
なおも好ましい実施形態において、第1のベクター、第2のベクター及び第3のベクターは、ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列を更に含む。
なおも好ましい実施形態において、コード配列は、コードされるタンパク質産物の構造ドメイン又は機能ドメイン内に入らない求核性アミノ酸からなる位置で第1の部分及び第2の部分並びに任意選択で第3の部分に分断され、求核性アミノ酸は、セリン、スレオニン又はシステインから選択される。
好ましくは、第1のベクター、第2のベクター及び第3のベクターの少なくとも1つは、コード配列に作動可能に連結された少なくとも1つのエンハンサー又は調節ヌクレオチド配列を更に含む。
好ましいエンハンサー又は調節ヌクレオチド配列は、?-グロビンIgGキメライントロン、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントである。
任意選択で、第1のベクター、第2のベクター及び第3のベクターの少なくとも1つは、再構成されたインテインタンパク質の安定性を低下させるために少なくとも1つの分解シグナルを更に含む。
好ましくは、前記分解シグナルは、CL1デグロン又はPB29デグロンである。より好ましくは、前記分解シグナルは、ecDHFR又はその断片であり、好ましくは、ecDHFR分解シグナルは、本明細書に記載されるとおりの内部デグロンとして機能する変異体DHFRである。最も好ましくは、断片は、ecDHFRの分解特性、好ましくは内部デグロンとして機能する変異体DHFRの特性を保持しており、好ましくは、断片は、ミニecDHFRであり、ここで、このミニecDHFRは、内部デグロンとして機能する変異体である。
好ましくは、コード配列は、病的状態又は障害を修正することが可能なタンパク質をコードし、好ましくは、障害は、網膜変性症、代謝障害、血液障害、神経変性障害、難聴、チャネロパチー、肺疾患、ミオパチー、心疾患、筋ジストロフィーである。
なおも好ましくは、コード配列は、病的状態又は障害を修正することが可能なタンパク質をコードし、好ましくは、障害は、網膜変性症であり、好ましくは、網膜変性症は、遺伝性であり、好ましくは、病態又は疾患は、網膜色素変性症(RP)、レーベル先天黒内障(LCA)、スタルガルト病(STGD)、アッシャー病(USH)、アルストレーム症候群、先天性停止性夜盲(CSNB)、黄斑ジストロフィー、オカルト黄斑ジストロフィー、ABCA4遺伝子の突然変異によって引き起こされる疾患からなる群から選択される。より好ましくは、コード配列は、ABCA4、MYO7A、CEP290、CDH23、EYS、PCDH15、CACNA1、SNRNP200、RP1、PRPF8、RP1L1、ALMS1、USH2A、GPR98、HMCN1からなる群から選択される遺伝子又はその断片、若しくはそのオルソログ、若しくは5kbを超える長さのコード配列を有するそのミニ遺伝子、即ち1つ以上のエクソンと、遺伝子が野生型遺伝子断片と同じように自己発現するために不可欠な調節エレメントとを含む最小限の遺伝子断片のコード配列である。
更に好ましくは、コード配列は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、血友病A、ウィルソン病、フェニルケトン尿症、ジスフェルリン異常症、レット症候群、多発性嚢胞腎疾患、ニーマン・ピック病C型、ハンチントン病を修正することが可能なタンパク質をコードする。
より好ましくは、コード配列は、ABCA4、MYO7A、CEP290、CDH23、EYS、PCDH15、CACNA1、SNRNP200、RP1、PRPF8、RP1L1、ALMS1、USH2A、GPR98、HMCN1からなる群から選択される遺伝子又はその断片、若しくはそのオルソログ、若しくは5kbを超える長さのコード配列を有するそのミニ遺伝子、即ち1つ以上と、遺伝子が野生型遺伝子断片と同じように自己発現するために不可欠な制御領域とを含む最小限の遺伝子断片のコード配列である。
なおも好ましくは、コード配列は、DMD、CFTR、F8、ATP7B、PAH、DYSF、MECP2、PKD、NPC1、HTTからなる群から選択される遺伝子又はその断片、若しくはそのオルソログ、若しくは5kbを超える長さのコード配列を有するそのミニ遺伝子、即ち1つ以上と、遺伝子が野生型遺伝子断片と同じように自己発現するために不可欠な調節エレメントとを含む最小限の遺伝子断片のコード配列である。
本発明の特に好ましい実施形態において、コード配列は、ABCA4遺伝子をコードする。好ましくは、前記コード配列は、前記ABCA4タンパク質のaa Cys1150、Ser1168、Ser 1090に対応するヌクレオチドで分断され、及びスプリットインテインは、この分断点において挿入される。
更に好ましい実施形態において、コード配列は、CEP290遺伝子をコードする。好ましくは、前記コード配列は、aa Cys1076;Ser1275に対応するヌクレオチドで分断される。より好ましくは、前記コード配列は、前記CEP290タンパク質のaa Cys 929及び1474;Ser 453及びCys 1474に対応するヌクレオチド配列で分断され、及び2つのスプリットインテインは、これらの分断点において挿入される。
EGFP 配列番号15
配列内でc-エクステインの1番目のアミノ酸を強調表示する。
スプリットCys.71(太字)
Figure 2022512718000004
ABCA4 配列番号16
配列内でc-エクステインの1番目のアミノ酸を強調表示する。
スプリットセット1 Cys.1150(太字)
スプリットセット2 Ser.1168(下線)
スプリットセット3 Ser.1090(斜体)
Figure 2022512718000005
CFP290 配列番号17
配列内でc-エクステインの1番目のアミノ酸を強調表示する。
スプリットセット1 Cys.1076(太字)
スプリットセット2~3 Ser.1275(下線)
スプリットセット4 Cys.929及びCys.l474(斜体)
スプリットセット5 Ser.453及びCys.1474(二重下線)
Figure 2022512718000006
F8 配列番号18
配列内でc-エクステインの1番目のアミノ酸を強調表示する。
スプリットセット1 Cys.1312(下線)セット
スプリットセット2 Ser.984(太字)
Figure 2022512718000007
ecDHFR 配列番号19
Figure 2022512718000008
ミニecDHFR 配列番号20
Figure 2022512718000009
好ましい実施形態において、本発明のベクターシステムは、
a)第1のベクターであって、5’-3’方向に、
- 5’逆方向末端反復(5’-ITR)配列;
- プロモーター配列;
- コード配列の5’末端部分(CDS1)であって、前記プロモーターに作動可能に連結され、且つその制御下にある5’末端部分;
- N-インテインをコードする第1のインテインヌクレオチド配列;及び
- 3’逆方向末端反復(3’-ITR)配列
を含む第1のベクターと;
b)第2のベクターであって、5’-3’方向に、
- 5’逆方向末端反復(5’-ITR)配列;
- プロモーター配列;
- C-インテインをコードする第2のインテインヌクレオチド配列;
- コード配列の3’末端部分(CDS2);及び
- 3’逆方向末端反復(3’-ITR)配列
を含む第2のベクターと
を含むか;又は
a’)第1のベクターであって、5’-3’方向に、
- 5’逆方向末端反復(5’-ITR)配列;
- プロモーター配列;
- コード配列の5’末端部分(CDS1’)であって、前記プロモーターに作動可能に連結され、且つその制御下にある5’末端部分;
- 第1のN-インテインをコードする第1のインテインヌクレオチド配列;及び
- 3’逆方向末端反復(3’-ITR)配列
を含む第1のベクターと;
b’)第2のベクターであって、5’-3’方向に、
- 5’逆方向末端反復(5’-ITR)配列;
- プロモーター配列;
- 第1のC-インテインをコードする第2のインテインヌクレオチド配列;
- コード配列の第2の部分(CDS2’);及び
- 第2のN-インテインをコードする第3のインテインヌクレオチド配列;
- 3’逆方向末端反復(3’-ITR)配列
を含む第2のベクターと;
c’)第3のベクターであって、5’-3’方向に、
- 5’逆方向末端反復(5’-ITR)配列;
- プロモーター配列;
- 第2のC-インテインをコードする第4のインテインヌクレオチド配列;
- コード配列の第3の部分(CDS3’);及び
- 3’逆方向末端反復(3’-ITR)配列
を含む第3のベクターと
を含む。
好ましくは、前記第1、第2及び第3のベクターは、独立に、ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであり、好ましくは、前記第1、第2及び第3のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、同じ又は異なるAAV血清型から選択され、好ましくは、血清型は、血清型2型、血清型8型、血清型5型、血清型7型又は血清型9型、血清型7m8型、血清型sh10型;血清型2(quad Y-F)型から選択される。
本発明は、上記に定義するとおりのベクターシステムで形質転換された宿主細胞も提供する。
好ましくは、ベクターシステム又は宿主細胞は、医学的使用のためのもの、好ましくは遺伝子療法における使用のためのもの、好ましくは網膜変性症、代謝障害、血液障害、神経変性障害、難聴、チャネロパチー、肺疾患、ミオパチー、心疾患、筋ジストロフィーによって特徴付けられる病態又は疾患の治療及び/又は予防における使用のためのものである。
好ましくは、網膜変性症は、遺伝性であり、好ましくは、病態又は疾患は、網膜色素変性症(RP)、レーベル先天黒内障(LCA)、スタルガルト病(STGD)、アッシャー病(USH)、アルストレーム症候群、先天性停止性夜盲(CSNB)、黄斑ジストロフィー、オカルト黄斑ジストロフィー、ABCA4遺伝子の突然変異によって引き起こされる疾患からなる群から選択される。
好ましくは、ベクターシステム又は宿主細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、血友病A、ウィルソン病、フェニルケトン尿症、ジスフェルリン異常症、レット症候群、多発性嚢胞腎疾患、ニーマン・ピック病C型、ハンチントン病の予防及び/又は治療における使用のためのものである。
本発明は、本発明のベクターシステム又は宿主細胞と、薬学的に許容可能な媒体とを含む医薬組成物も提供する。
発明の詳細な説明
図面の簡単な説明
AAVインテインは、インビトロ並びにマウス及びブタ網膜の両方において、デュアルAAVよりも高い、シングルAAVで実現するに至るまでのレベルでEGFPを再構成する。(A)AAVインテイン媒介性タンパク質トランススプライシングの概略図。ITR:AAV2逆方向末端反復;CDS:コード配列;
Figure 2022512718000010

:3xflagタグ;ポリA:ポリアデニル化シグナル。(B)完全長又はAAVインテインCMV-EGFPプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたHEK293からのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。pEGFP:完全長EGFPプラスミド;pAAV I+II:AAV-EGFP I+IIインテインプラスミド;pAAV I:シングルAAV-EGFP Iインテインプラスミド;pAAV II:シングルAAV-EGFP IIインテインプラスミド;Neg:非トランスフェクト細胞。矢印は、両方とも完全長EGFPタンパク質(EGFP)、EGFPタンパク質のN端側及びC端側半分(それぞれB及びA)及び完全長EGFPタンパク質から切り出された再構成後のインテイン(C)を指す。WBは、n=3の独立した実験の代表例である。(C)シングル、インテイン又はデュアルAAV2/2-CMV-EGFPベクターのいずれかに感染させたHEK293からのライセートのWB分析。WBは、n=5の独立した実験の代表例である。(D)AAV2/8-CMV-EGFPインテインベクターを網膜下注射したC57BL/6Jマウスからの網膜凍結切片。スケールバー:50μm。RPE:網膜色素上皮;OS:外節;ONL:外顆粒層。(E~F)シングル、インテイン又はデュアルAAV2/8-GRK1-EGFPベクターのいずれかを網膜下注射したC57BL/6Jマウス(E)又はラージホワイトブタ(F)のいずれかからの網膜凍結切片。スケールバー:50μm(E);200μm(F)。OS:外節;ONL:外顆粒層。(G)293日間培養した時点におけるAAV2/2-GRK1-EGFP-インテインベクターに感染させた網膜オルガノイドの蛍光分析。スケールバー:100μm。
AAVインテインを最適化すると、大型ABCA4及びCEP290タンパク質の正しい再構成が可能になる。(A~B)異なるセットのAAV-shCMV-ABCA4又は-CEP290のいずれかのインテインプラスミド(それぞれセット1及びセット5)をトランスフェクトしたHEK293からのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。使用した種々のセットの概略図は、図16に示す。WBは、n=3の独立した実験の代表例である。(C~D)AAV-shCMV-ABCA4(C)又はAAV-shCMV-CEP290(D)のいずれかのインテインプラスミドをトランスフェクトしたHeLa細胞の免疫蛍光分析の代表的画像。pABCA4(C)又はpCEP290(D):完全長発現カセットを含むプラスミド;pAAVインテイン:AAV-インテインプラスミド(図2Cでは、セット1又は図2Dではセット5のいずれか);I+II+III:AAV I+II+IIIインテインプラスミド;I+II:AAV I+IIインテインプラスミド;I+III:AAV I+IIIインテインプラスミド;II+III:AAV II+IIIインテインプラスミド;I:シングルAAV Iインテインプラスミド;II:シングルAAV IIインテインプラスミド;III:シングルAAV IIIインテインプラスミド;Neg:非トランスフェクト細胞。図2Cでは、細胞は、3xFLAG及びVAP-B(小胞体マーカー)とTGN46(トランスゴルジ網マーカー)とのいずれかに関して染色するか、又は図2Dではアセチル化チューブリン(微小管のマーカー)に関して染色した。白色の矢印は、図18に高倍率で示す細胞を指している。 AAVインテインは、大型ABCA4及びCEP290タンパク質をデュアルAAVベクターよりも高い効率で再構成する。デュアル又はインテインAAV2/2-shCMV-ABCA4(A)又は-CEP290(B)ベクターのいずれかに感染させたHEK293細胞からのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。AAVインテイン:AAV-ABCA4(セット1、A)又は-CEP290(セット5、B)インテインベクター;I+II+III:AAV I+II+IIIインテインベクター;I+II:AAV I+IIインテインベクター;I+III:AAV I+IIIインテインベクター;II+III:AAV II+IIIインテインベクター;I:シングルAAV Iインテインベクター;II:シングルAAV IIインテインベクター;III:シングルAAV IIIインテインベクター;デュアルAAV:デュアルAAVベクター;Neg:AAV-EGFPベクター。(A)矢印は、完全長ABCA4タンパク質及びA:AAV Iに由来するタンパク質産物;B:AAV IIに由来するタンパク質産物を指す。翻訳後修飾が異なる可能性のあるタンパク質産物。(B)矢印は、完全長CEP290タンパク質及びA:AAV II+IIIに由来するタンパク質産物;B:AAV I+IIに由来するタンパク質産物;C:AAV IIに由来するタンパク質産物;D:AAV IIIに由来するタンパク質産物;E:AAV Iに由来するタンパク質産物を指す。WBは、n=3の独立した実験の代表例である。 AAVインテインは、マウス、ブタ及びヒト光受容体において大型タンパク質を治療レベルまで再構成する。(A~C)デュアル又はインテインAAV2/8-GRK1-ABCA4(A、C)又は-CEP290(B)ベクター(それぞれセット1及びセット5)のいずれかを注射した野生型マウス(A、B)又はラージホワイトブタ(C)のいずれかからの網膜ライセートのウエスタンブロット(WB)分析。AAVインテイン:AAVインテインベクター;デュアルAAV:デュアルAAVベクター;Neg:AAV-EGFPベクター又はPBSのいずれか。(D)AAV2/2-GRK1-ABCA4インテインベクターに感染させたヒトiPSC由来3D網膜オルガノイドからのライセートのWB分析。AAVインテイン:AAV-ABCA4インテインベクター;Neg:非感染オルガノイド;-/-:STGD1患者由来のオルガノイド。(A、C、D)矢印は、完全長ABCA4タンパク質(ABCA4)及びA:AAV Iに由来するタンパク質産物;B:AAV IIに由来するタンパク質産物を指す。翻訳後修飾が異なる可能性のあるタンパク質産物。(B)矢印は、両方とも完全長CEP290タンパク質(CEP290);A:AAV II+IIIに由来するタンパク質産物及びD:AAV IIIに由来するタンパク質産物を指す。 AAVインテインを網膜下投与すると、遺伝性網膜変性症のマウスモデルの網膜表現型が改善する。(A)AAVインテインで治療したAbca4-/-マウスのRPEにおいてリポフスチンが占める平均面積の定量化。各点は、各眼について測定された平均値を表す。グラフ中に各群のリポフスチン面積の平均値を示す。+/+又は+/-;対照を注射したAbca4+/+又は+/-眼(PBS);-/-:陰性対照を注射したAbca4-/-眼(AAV I ABCA4又はAAV II ABCA4又はPBS);-/-AAVインテイン:AAVインテインベクター(セット1)を注射したAbca4-/-眼。ANOVA p値<0.05;***ANOVA p値<0.001。(B)野生型未注射及びAAV2/8-GRK1-CEP290インテインベクター(AAVインテイン、セット5)を網膜下注射したか又は陰性対照(Neg;即ちAAV I+II又はAAV II+III又はPBS)を注射したかのいずれかのrd16マウスからの網膜切片の代表的画像。スケールバー:25μm。各画像において測定されたONLの厚さを黒色の縦線で示す。RPE:網膜色素上皮;ONL:外顆粒層;INL:内顆粒層;GCL:神経節細胞層。(C)野生型未注射及びAAV2/8-GRK1-CEP290インテインベクター(AAVインテイン、セット5)を網膜下注射したか又は陰性対照(Neg;即ちAAV I+II又はAAV II+III又はPBS)を注射したかのいずれかのrd16マウスからの眼の代表的画像。白い丸で囲んだ部分は瞳孔を画定する。 タンパク質トランススプライシングの媒介による大型タンパク質の再構成の概略図。大型遺伝子のコード配列(CDS)を、逆方向末端反復(ITR)が隣接した2つの半分部分(5’及び3’)に分断し、それらを2つのAAVカプシドに別々にパッケージングする。同じ細胞に共形質導入すると、種々の機構が探究されて2つの半分部分がタンパク質レベルでつなぎ合わされることにより完全長タンパク質発現が再構成される。5’-ベクターは、5’CDS、5’インテイン(n-インテイン)及びデグロンを含む一方、3’-ベクターは、3’CDS及び3’インテイン(c-インテイン)を含み;両方のベクターとも、プロモーター及びポリAを含む。2つの半分のポリペプチドの対形成は、インテインの自己認識によって媒介され;続いてインテインが宿主タンパク質から自らを切り出すことにより、完全長タンパク質再構成が生じる。デグロンは、この時点で切り出されたインテインの中に埋め込まれており、インテインは、急速にユビキチン化され、プロテアソームによって分解される。 分解シグナル有り及びなしでのAAVインテインベクターからのインビトロEGFP発現。ecDHFRを含む(+)か又は含まない(-)かのいずれかのAAVインテインプラスミドをトランスフェクトしたHEK293細胞からのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。矢印は、完全長EGFPタンパク質(EGFP)、デグロンを含む(DnaE+ecDHFR)又は含まない(DnaE)切り出されたインテインを指す。 分解シグナル有り及びなしでのAAVインテインベクターからのインビトロABCA4発現。ecDHFRを含む(+)か又は含まない(-)かのいずれかのAAVインテインプラスミドをトランスフェクトしたHEK293細胞からのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。矢印は、完全長ABCA4タンパク質(ABCA4)、デグロンを含む(DnaE+ecDHFR)又は含まない(DnaE)切り出されたインテインを指す。 インテインDnaE-ecDHFR発現は、TMP依存的である。ecDHFRを含む(pAAVインテイン+ecDHFR)か又は含まない(pAAVインテイン)かのいずれかのAAV_ABCA4インテインプラスミドをトランスフェクトし、且つ漸増用量のトリメトロフィン(Trimetrophin)(1~50?m)で処理したHEK293細胞からのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。矢印は、デグロンを含む(DnaE+ecDHFR)又は含まない(DnaE)切り出されたインテインを指す。 分解シグナル有り及びなしでのAAVインテインベクターからのインビトロEGFP発現。ミニecDHFRを含む(+)か又は含まない(-)かのいずれかのAAVインテインプラスミドをトランスフェクトしたHEK293細胞からのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。矢印は、完全長EGFPタンパク質(EGFP)、デグロンを含む(DnaE+ミニecDHFR)又は含まない(DnaE)切り出されたインテインを指す。 分解シグナル有り及びなしでのAAVインテインベクターからのインビトロABCA4発現。ミニecDHFRを含む(+)か又は含まない(-)かのいずれかのAAVインテインプラスミドをトランスフェクトしたHEK293細胞からのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。矢印は、完全長ABCA4タンパク質(ABCA4)、デグロンを含む(DnaE+ミニecDHFR)又は含まない(DnaE)切り出されたインテインを指す。 シングルAAV I又はAAV IIの場合にはないAAV I+IIインテインプラスミドをトランスフェクトしたHEK293細胞におけるEGFP蛍光。完全長又はインテインCMV-EGFPプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたHEK293細胞の蛍光分析。pEGFP:完全長EGFP発現カセットを含むプラスミド;pAAV I+II:AAV I+IIインテインプラスミド;pAAV I:シングルAAV Iインテインプラスミド;pAAV II:シングルAAV IIインテインプラスミド;Neg:非トランスフェクト細胞。スケールバー:100μm。 完全長タンパク質と比べたインテインは、種間で異なる。AAV-CMV-EGFP(A)又はAAV-GRK1-EGFPインテインベクター(B~C)のいずれかに感染させたHEK293細胞(A)、C57BL/6Jマウス(B)及びラージホワイトブタ網膜(C)からのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。AAVインテイン:AAVインテインベクターに感染させた細胞(A)又はそれを注射した眼(B、C);Neg:非感染細胞(A)又はPBSを注射した眼(B、C)。矢印は、両方とも完全長EGFPタンパク質(EGFP)及び切り出されたインテイン(DnaE)を指す。 ヒトiPSC由来3D網膜オルガノイドの特徴付け。(A)183日間培養した時点における網膜オルガノイドの光学顕微鏡分析。(B)成熟光受容体マーカーに対する抗体による免疫蛍光分析。スケールバー:100μm。(C)AAV2/2-CMV-EGFP及びAAV2/2-IRBP-DsRedベクターの両方に感染させた網膜オルガノイドの蛍光分析。スケールバー:100μm。(D)230日間培養した時点で網膜オルガノイドの表面から突出する外節様構造が観察された。挿入図は、放射状構成の外節(OS)様構造の存在を示す。NR:神経網膜;RPE:網膜色素上皮。(E)走査型電子顕微鏡分析により、内節(IS)、結合繊毛(CC)及び外節(OS)様構造の存在が明らかとなる。スケールバー:4μm。(F)電子顕微鏡分析により、外境界膜(*)、中心小体(C)、基底小体(BB)、結合繊毛(CC)及び外節のスケッチ(OS)の存在が明らかとなる。挿入図は、OSの無秩序な円板膜の存在を示す。スケールバー:500nm。D:培養日数。 ヒト3D網膜オルガノイドにおける完全長タンパク質と比べた低インテイン。AAV2/2-GRK1-EGFPインテインベクターに感染させたヒトiPSC由来3D網膜オルガノイドからのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。AAVインテイン:AAVインテインベクター;Neg:非感染オルガノイド。矢印は、両方とも完全長EGFPタンパク質(EGFP)及び切り出されたインテイン(DnaE)を指す。 AAV-ABCA4及び-CEP290インテインの様々なセットの概略図。(A)AAV-ABCA4-インテインコンストラクト。(コンストラクト別に例示されるとおりのセット1~2)n-DnaE:NpuのDnaEからのn-インテイン;c-DnaE:NpuのDnaEからのc-インテイン;(セット3)n-mDnaE:成熟したNpu(mNpu)のDnaEからのn-インテイン;c-mDnaE:mNpuのDnaEからのc-インテイン。(B)AAV-CEP290-インテインコンストラクト。(セット1)n-DnaE:NpuのDnaEからのn-インテイン;c-DnaE:NpuのDnaEからのc-インテイン;shポリA:短い合成ポリA;(セット2)n-DnaE:mNpuのDnaEからのn-インテイン;c-DnaE:mNpuのDnaEからのc-インテイン;(セット3)n-mDnaE:mNpuのDnaEからのn-インテイン;c-mDnaE:mNpuのDnaEからのc-インテイン;(セット4)n-DnaE:NpuのDnaEからのn-インテイン;c-DnaE:AAV IとAAV IIとの間にあるNpuのDnaEからのc-インテイン;n-DnaB:ロドサーマス・マリヌス(Rhodothermus marinus)(Rma)のDnaBからのN-インテイン;c-DnaB:AAV IIとAAV IIIとの間にあるRmaのDnaEからのc-インテイン;wpre:ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント。(セット5)n-mDnaE:mNpuのDnaEからのn-インテイン;c-mDnaE:AAV I
Figure 2022512718000011

とAAV IIとの間にあるmNpuのDnaEからのc-インテイン;n-DnaB:ロドサーマス・マリヌス(Rhodothermus marinus)(Rma)のDnaBからのn-インテイン;c-DnaB:AAV IIとAAV IIIとの間にあるRmaのDnaEからのc-インテイン;wpre:ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント。(A~B)ITR:AAV2逆方向末端反復;:3xflagタグ;プロモーター:インビトロ実験についてショートCMV及びインビボ実験についてヒトGタンパク質共役受容体(GRK1)プロモーター;ポリA:シミアンウイルス40ポリアデニル化シグナル(ABCA4について、A)及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(CEP290について、B)。図中に各セットの分断点のアミノ酸を示す。各AAVベクターの下に予測タンパク質分子量を示す。
異種N-及びC-インテインを組み合わせると、インビトロで検出可能なEGFPタンパク質再構成は生じない。完全長又はインテインAAV-CMV-EGFPプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたHEK293細胞の蛍光分析。N+C-DnaE:DnaEからのインテインに融合したAAV I+II;N+C-DnaB:DnaBからのインテインに融合したAAV I+II;N+C-mDnaE:mDnaEからのスプリットインテインに融合したAAV I+II;N-DnaE+C-DnaB:DnaEからのn-インテインに融合したAAV I及びDnaBからのc-インテインに融合したAAV II;N-DnaB+C-DnaE:DnaBからのn-インテインに融合したAAV I及びDnaEからのc-インテインに融合したAAV II;N-mDnaE+C-DnaB:mDnaEからのn-インテインに融合したAAV I及びDnaBからのc-インテインに融合したAAV II;N-DnaB+C-mDnaE:DnaBからのn-インテインに融合したAAV I及びmDnaEからのc-インテインに融合したAAV II;pEGFP:完全長EGFP発現カセットを含むプラスミド;Neg:非トランスフェクト細胞。スケールバー:100μm。 CEP290は微小管に沿って整列する。図2Dからの単一細胞の拡大像。完全長CEP290発現カセットを含むプラスミド(pCEP290)又はCEP290インテインプラスミド(セット5、pAAV I+II+III)のいずれかをトランスフェクトしたHeLa細胞の免疫蛍光分析。細胞は、3xFLAG及びアセチル化チューブリン(微小管のマーカー)に関して染色した。スケールバー:50μm。完全長プラスミド又はショートCMV-ABCA4(セット1、A)若しくは-CEP290(セット5、B)のいずれかをコードするAAVインテインプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたHEK293細胞からのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。(A)pABCA4:完全長ABCA4発現カセット;セット1:ABCA4(Cys.1150)-インテインプラスミド。(B)pCEP290:完全長CEP290発現カセット;セット5:CEP290(Ser.453及びCys.1474)-インテインプラスミド。Neg:AAV EGFPプラスミド。WBは、n=3の独立した実験の代表例である。 AAVインテインプラスミドをトランスフェクトすると、完全長発現カセットを含むシングルプラスミドをトランスフェクトするよりも少ない量のABCA4及びCEP290タンパク質が再構成される。完全長プラスミド又はショートCMV-ABCA4(A)若しくは-CEP290(B)のいずれかをコードするAAVインテインプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたHEK293細胞からのライセートのウエスタンブロット(WB)分析。(A)pABCA4:完全長ABCA4発現カセット;セット1:ABCA4(Cys.1150)-インテインプラスミド。(B)pCEP290:完全長CEP290発現カセット;セット5:CEP290(Ser.453及びCys.1474)-インテインプラスミド。Neg:AAV EGFPプラスミド。WBは、n=3の独立した実験の代表例である。 AAVインテインベクターを網膜下送達すると、マウス網膜にABCA4発現が生じる。デュアル又はインテインAAV2/8-GRK1-ABCA4ベクター(セット1)のいずれかを注射した野生型マウスからの網膜ライセートのウエスタンブロット(WB)分析。AAVインテイン:AAVインテインベクター;デュアルAAV:デュアルAAVベクター;Neg:AAV-EGFPベクター。 AAVインテインは、内因性Abca4の約10%を再構成する。AAV2/8-GRK1-ABCA4インテインベクター(セット1)を注射したAbca4+/-又はAbca4-/-マウスのいずれかからの網膜ライセートのウエスタンブロット(WB)分析。mAbca4:Abca4+/-網膜;AAVインテイン:AAVインテインを注射した網膜;Neg:注射していない網膜。ゲル#2及び#3にロードしたAbca4+/-からの網膜ライセートは同じものである。内因性に対するAAVインテインABCA4発現の割合を各レーンの下に示す。 AAVインテインは、ヒト網膜オルガノイドにおいて完全長ABCA4タンパク質を再構成する。AAV2/2-GRK1-ABCA4インテインベクター(セット1)に感染させたヒトiPSC由来3D網膜オルガノイドからのライセートのウエスタンブロット分析。AAVインテイン:AAVインテインベクター;Neg:非感染オルガノイド。-/-:STGD1患者由来のオルガノイド;+/+:健常ドナー由来のオルガノイド。 AAVインテインベクターを網膜下投与すると、Abca4-/-マウスのリポフスチン蓄積量の低下が生じる。野生型マウス及び陰性対照(Neg)又はAAVインテインベクター(セット1)のいずれかを注射したAbca4-/-マウスのRPEにおけるリポフスチン顆粒を示す透過電子顕微鏡分析の代表的画像である。白色の矢印は、リポフスチン顆粒を指す;M:ミトコンドリア。 マウスにおけるAAVインテインベクターの網膜下送達によってONL厚さが変化することはない。AAVインテインベクター、無関係のAAVベクター(AAV neg)又はPBSのいずれかを網膜下注射したC57BL/6Jマウス眼のスペクトル領域光干渉断層像分析。黒色のバーは、AAV-ABCA4インテインベクター(セット1)及びその対応する対照の注射後6ヵ月時点の眼を表し;白色のバーは、AAV-CEP290インテインベクター(セット5)及びその対応する対照の注射後4.5ヵ月時点の眼を表す。データは、平均値±s.e.として表す。対応するバーの上に平均値を示す。 AAVインテインベクターは、完全長野生型F8を送達することができた。A)シングルAAV Bドメイン欠失型変異体3第VIII因子(F8-V3)及びAAV F8インテインベクターの概略図。F8遺伝子のコード配列を、逆方向末端反復(ITR)が隣接する2つの半分部分(5’及び3’F8)に分断し、それらを2つのAAVカプシドに別々にパッケージングする。5’-ベクターは、5’F8及び5’インテイン(n-DnaE)を含む一方、3’-ベクターは、3’F8及び3’インテイン(c-DnaE)を含み;両方のベクターとも、HLPプロモーター及び合成ポリAを含む。V3、変異体3;SS、シグナル配列。B)F8インテインは、シングルオーバーサイズAAV F8-V3と異なり、定義付けられたベクターゲノムでAAVカプシドに正しくパッケージングされる。HLPプロモーターに特異的なプローブによるベクターのゲノム完全性のサザンブロット解析により、オーバーサイズAAV F8-V3には、トランケート型産物が示され、これは、AAV F8インテインベクターに存在しないものであった。Neg、陰性対照。C)AAV F8インテインベクターでは、注射後8週間で血友病Aノックアウトマウスの出血表現型に僅かな修正が見られる。AAV F8インテイン(両方の分断点)の注射後8週間時点における血友病Aノックアウトマウスの血漿試料のaPTT分析では、PBSを注射した対照群と比較して僅かな表現型の修正が見られる。aPTT、活性化部分トロンボプラスチン時間。
遺伝子療法
この10年間、何百件もの臨床試験で疾患の治療に遺伝子療法が適用されてきた。遺伝子をヒト細胞に送達するため、様々なツールが開発されており;その中でも、遺伝子操作されたウイルスは、アデノ随伴ウイルスを含め、現在、なかでも最も普及している遺伝子送達ツールである。大部分のシステムは、目的遺伝子を収容する能力を有するベクター並びにベクターを含有する感染性ウイルス粒子の生成を可能にするためのウイルス構造タンパク質及び酵素を提供し得るヘルパー細胞を含む。アデノ随伴ウイルスは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列、ゲノム構造、病原性及び宿主域に違いがあるウイルスファミリーである。この多様性により、様々な治療適用を開発するため様々な生物学的特性のウイルスを使用する機会がもたらされる。任意の送達ツールと同様に、遺伝子療法の適用を成功させるには、アデノ随伴ウイルスベースのシステムの効率、特定の組織又は細胞型を標的化する能力、目的遺伝子の発現及び安全性が重要である。近年、これらの研究分野には多大な労力が注がれてきた。遺伝子発現を改変し、送達を標的化し、ウイルス力価を改善し、且つ安全性を高めるため、アデノ随伴ウイルスベースのベクター及びヘルパー細胞に様々な改良が行われている。本発明は、それが単一のアデノ随伴ウイルスベースのベクターのカーゴ限界を超えるサイズの目的遺伝子を効率的に送達するように機能する点でこの設計プロセスの改善に相当する。ウイルスは論理上の遺伝子送達ツールである。ウイルスは細胞内で複製し、そのため細胞に侵入し、細胞機構を用いてその遺伝子を発現する機構が進化している。ウイルスベースの遺伝子送達の概念は、ウイルスを操作することにより、それが目的遺伝子を発現できるようにするというものである。具体的な適用及びウイルスの種類に応じて、ほとんどのウイルスベクターが、宿主において野生型ウイルスのように自在に複製するその能力を妨げる突然変異を含む。遺伝子送達用のウイルスベクターを作成するため、幾つかの異なるファミリーのウイルスが修飾されている。そうしたウイルスとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス及びアルファウイルスが挙げられる。本発明は、好ましくはアデノ随伴ウイルスを用いる。従って、ウイルスベースの遺伝子送達用ベクターとしては、限定なしに、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、シュードタイプAAVベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターが挙げられる。
理想的なアデノ随伴ウイルスベースの遺伝子送達用ベクターは、効率的で、細胞特異的で、調節されており、且つ安全でなければならない。送達効率は、それが療法の有効性を左右し得るため重要である。現在は、アデノ随伴ウイルスベクターによる細胞型特異的な感染及び遺伝子発現の実現に向けた努力がなされている。加えて、この療法は持続的な又は調節された発現を必要とし得るため、目的遺伝子の発現を調節するためのアデノ随伴ウイルスベクターが開発中である。ほとんどのウイルスが病原体であるか、又は病原となる可能性があるため、安全性がウイルス遺伝子送達の大きい課題である。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ヒト及び他の一部の霊長類種に感染する小さいウイルスである。AAVは現在のところ疾患を引き起こすことは知られておらず、従ってこのウイルスが引き起こす免疫応答は極めて弱い。AAVを使用した遺伝子療法ベクターは分裂細胞及び静止細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムへの組み込みなしに染色体外にある状態で存在し続ける。このような特徴から、AAVは遺伝子療法用のウイルスベクターの創出及び同質遺伝子のヒト疾患モデルの創出に極めて魅力的な候補である。
野生型AAVは、幾つもの特徴により、遺伝子療法研究者の大きい関心を集めている。その中でも、このウイルスに病原性がないように見えることは重要である。このウイルスは、非分裂細胞も感染させることができ、ヒト19番染色体の特異的部位(AAVS1と称される)で宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれる能力を有する。この特徴により、ランダムな挿入及び突然変異誘発の恐れがある、時にそれに癌の発症が続くレトロウイルスと比べて、このウイルスは幾らか予測性が高いものとなる。AAVゲノムは上述の部位に最も高頻度に組み込まれる一方、ゲノムへのランダムな取り込みが起こる頻度は無視できるほど低い。しかしながら、遺伝子療法ベクターとしてのAAVの開発では、ベクターのDNAからrep及びcapを除去することによりこの組み込み能力が取り除かれてきた。所望の遺伝子が、その遺伝子の転写をドライブするプロモーターと共に逆方向末端反復(ITR)の間に挿入され、これらのITRが、一本鎖ベクターDNAが宿主細胞DNAポリメラーゼ複合体によって二本鎖DNAに変換された後の核内でのコンカテマー形成を助ける。AAVベースの遺伝子療法ベクターは宿主細胞核内でエピソームコンカテマーを形成する。非分裂細胞では、これらのコンカテマーは宿主細胞の寿命にわたってインタクトなまま残る。分裂細胞では、エピソームDNAが宿主細胞DNAと共に複製されないため、AAV DNAは細胞分裂を通じて失われる。AAV DNAの宿主ゲノムへのランダムな組み込みは検出可能であるが、極めて低い頻度でのみ起こる。AAVは、中和抗体の生成に限られているように見える極めて低い免疫原性も呈する一方、AAVは、明確に定義付けられた細胞傷害性応答を誘発しない。この特徴が、静止細胞を感染させる能力と共に、ヒト遺伝子療法用のベクターとしてのアデノウイルスに優るその優位性をもたらす。
AAVゲノム、トランスクリプトーム及びプロテオーム
AAVゲノムは、プラス鎖又はマイナス鎖のいずれかの一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)で作られ、約4.7キロベース長である。このゲノムは、DNA鎖の両端にある逆方向末端反復(ITR)並びに2つのオープンリーディングフレーム(ORF):rep及びcapを含む。前者は、AAVライフサイクルに必要なRepタンパク質をコードする4つのオーバーラップ遺伝子で構成され、後者は、共に相互作用して正二十面体様対称のカプシドを形成するカプシドタンパク質:VP1、VP2及びVP3のオーバーラップヌクレオチド配列を含む。
ITR配列
逆方向末端反復(ITR)配列は、各145塩基を含む。これらは、AAVゲノムの効率的な増殖に必要であることが示されたその対称性からそのように名付けられた。これらの配列のもう1つの特性は、ヘアピンを形成するその能力であり、これは、プライマーゼ非依存的なDNA第2鎖合成を可能にする、いわゆる自己プライミングに寄与する。ITRは、宿主細胞ゲノム(ヒトの19番染色体)へのAAV DNAの組み込み及びそれからのレスキューの両方並びに完全にアセンブルされたデオキシリボヌクレアーゼ耐性AAV粒子の生成と併せたAAV DNAの効率的なキャプシド形成に必要であることも示された。
遺伝子療法に関しては、ITRが治療用遺伝子の隣にシスである必要がある唯一の配列であるように見える:構造(cap)及びパッケージング(rep)遺伝子はトランスで送達することができる。この仮定に基づいて、レポーター又は治療用遺伝子を含む組換えAAV(rAAV)ベクターを効率的に作製するための多くの方法が確立された。しかしながら、有効な複製及びキャプシド形成にシスで必要なエレメントはITRだけではないことも発表された。数組の研究グループが、rep遺伝子のコード配列の内部にシス作用性Rep依存性エレメント(CARE)と命名された配列を同定している。CAREは、シスで存在するとき複製及びキャプシド形成を増強することが示された。
AAV血清型
現在までのところ、数十個の異なるAAV変異体(血清型)が同定され、分類されている(60)。公知の血清型は全て、複数の多様な組織型の細胞を感染させることができる。組織特異性はカプシド血清型によって決まり、療法におけるその使用には、その向性範囲を変えるためのAAVベクターのシュードタイピングが重要になるものと思われる。シュードタイプ化したAAVベクターは、1つのAAV血清型のゲノムを第二のAAV血清型のカプシド内に含むものであり;例えば、AAV2/8ベクターは、AAV8カプシドとAAV2ゲノムとを含む(61)。このようなベクターはキメラベクターとしても知られる。
血清型2型
血清型2型(AAV2)は、これまでに最も広範な調査がなされているものである。AAV2は、天然で骨格筋、ニューロン、血管平滑筋細胞及び肝細胞に向性を示す。AAV2については、3つの細胞受容体:ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)、aβインテグリン及び線維芽細胞成長因子受容体1(FGFR-1)が記載されている。最初のものは一次受容体として機能する一方、後者2つは共受容体活性を有し、AAVが受容体介在性エンドサイトーシスによって細胞に侵入するのを可能にする。これらの研究結果については、Qiu, Handa, et al.により議論されている。HSPGは一次受容体として機能し、しかし、これは、細胞外マトリックスに多量にあるため、AAV粒子が掃去され、感染効率が損なわれ得る。
諸研究が示すところによれば、このウイルスの血清型2型(AAV-2)は、見たところ健常細胞に損傷を与えることなく癌細胞を死滅させるようである。ペンシルベニア州立大学医学部(Penn State College of Medicine in Pennsylvania)の免疫学及び微生物学教授Craig Meyersは、「我々の結果は、人口の大半に感染するものの悪影響は知られていないアデノ随伴ウイルス2型が、複数の種類の癌細胞を死滅させるが、しかし、健常細胞に何ら影響を及ぼさないことを示唆している」と述べている。これは新規抗癌剤につながる可能性がある。
他の血清型
AAV2が様々なAAVベースの研究に最もよく用いられる血清型であるが、遺伝子送達ベクターとしては他の血清型がより有効であり得ることが示されている。例えば、AAV6は、気道上皮細胞を感染させるのにはるかに良好であるように見え、AAV7は、極めて高いマウス骨格筋細胞の形質導入率を(AAV1及びAAV5と同様に)示し、AAV8は肝細胞及び光受容体の形質導入に優れており、AAV1及び5は血管内皮細胞への遺伝子送達に極めて効率的であることが示された。脳では、ほとんどのAAV血清型がニューロン向性を示す一方、AAV5は、星状膠細胞も形質導入する。AAV1とAAV2とのハイブリッドであるAAV6は、AAV2より低い免疫原性も示す。
血清型は、それが結合する受容体の点で異なり得る。例えばAAV4及びAAV5形質導入は可溶性シアル酸(これらの血清型毎に異なる形態の)によって阻害することができ、AAV5は、血小板由来成長因子受容体から細胞に侵入することが示された。四重チロシン突然変異体又はAAV2/7m8などの新規AAV変異体は、小動物モデルで硝子体から網膜外側を形質導入することが示された(62、63)。ShH10と名付けられた別のAAV突然変異体は、硝子体内投与後の神経膠向性が向上したAAV6変異体である(64)。網膜に特に有利な向性を有する更なるAAV突然変異体が、AAV2(quad Y-F)である(65)。
本発明の遺伝子送達媒体は、患者に投与され得る。前記投与は、「インビボ」投与又は「エキソビボ」投与であり得る。当業者であれば、適切な投薬量率を決定することができるであろう。用語「投与される」には、ウイルス技法又は非ウイルス技法による送達が含まれる。ウイルス送達機構としては、限定はされないが、上記に記載されるとおりのアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びバキュロウイルスベクター等が挙げられる。
非ウイルス送達システムとしては、電気穿孔などのDNAトランスフェクション、脂質媒介性トランスフェクション、コンパクト化DNA媒介性トランスフェクション;リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性表面両親媒性物質(CFA)及びこれらの組み合わせが挙げられる。
本発明に係るベクターシステムによる1つ以上の治療用遺伝子の送達は、単独で又は他の治療若しくは治療の構成成分と組み合わせて用いることができる。
医薬組成物
本発明は、遺伝子療法によって個体を治療するための医薬組成物も提供し、ここで、本組成物は、1つ以上の送達可能な治療用及び/又は診断用トランス遺伝子又はそれによって産生される若しくはそれから入手されるウイルス粒子を含む本発明のベクター/コンストラクト又は宿主細胞の治療有効量を含む。本医薬組成物は、ヒト又は動物への使用向けであり得る。典型的には、医師が個々の対象に最も好適となり得る実際の投薬量を決定することになり、それは、特定の個体の年齢、体重及び反応によって異なることになる。本組成物は、任意選択で、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含み得る。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な薬学実践の点で選択することができる。本医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として -又はそれに加えて -、任意の好適な1つ又は複数の結合剤、1つ又は複数の滑沢剤、1つ又は複数の懸濁剤、1つ又は複数のコーティング剤、1つ又は複数の可溶化剤及び標的部位へのウイルスの侵入を助け得る又は増加させ得る他の担体薬剤(例えば脂質送達システムなど)を含み得る。適切な場合、本医薬組成物は、吸入による投与、坐薬若しくはペッサリーの形態での投与、ローション、溶液、クリーム、軟膏若しくは散布剤の形態での局所投与、皮膚パッチの使用による投与、デンプン若しくはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形態での経口投与又は単剤若しくは賦形剤との混和剤のいずれかでのカプセル若しくは膣座薬での投与又は香味剤若しくは着色剤を含有するエリキシル剤、溶液若しくは懸濁液の形態での投与の任意の1つ以上によって投与することができ;好ましくは、本医薬組成物は、例えば、海綿体内、静脈内、筋肉内又は皮下に非経口的に注射することができる。非経口投与については、本組成物は滅菌水溶液の形態で使用することが最良であり得、これは、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩類又は単糖類を含有し得る。頬側又は舌下投与については、本組成物は錠剤又はトローチ剤の形態で投与され得、これは、従来の方式で製剤化することができる。
好ましい製剤は、ベクターシステムが結膜嚢に又は結膜下に局所的に投与される場合、好ましくは1日1~10回、好ましくは1日~6ヵ月間、好ましくは1日~30日間にわたって投与される場合である。
好ましい投与は、前房への投与、硝子体内注射、網膜下注射、傍球及び/又は球後注射、基質内角膜注射である。
好ましくは、本発明の医薬組成物は眼への局所使用向けであり、従って眼科用組成物である。
本発明に係るベクターシステムは、任意の好都合な経路によって投与することができ、しかしながら、好ましい投与経路は眼表面への局所経路、特に角膜への局所経路である。更により好ましい経路は結膜嚢への滴下注入である。
本発明の特別な目的は、医学的使用のため眼に局所投与される眼科用組成物を生産するためのベクターシステムの使用である。
より一般的には、本発明の好ましい一実施形態は、眼及び/又は眼の付属器の局所的、表面的又は限局的範囲に対する局所適用向けに製剤化された、ベクターシステムを任意選択で1つ以上の薬学的に許容可能な添加剤(希釈剤又は担体など)と共に含む組成物である。
本明細書で使用されるとき、用語「媒体」、「希釈剤」、「担体」及び「添加剤」は同義的である。
本発明の眼科用組成物は、薬学的に許容可能で眼耐容性の、且つ有効成分と適合性のある眼科用担体を共に含む溶液、エマルション又は懸濁液(洗眼液)、軟膏、ゲル、エアロゾル、ミスト又はリニメント剤の形態であり得る。
また、例えば、結膜嚢又はコンタクトレンズに置かれる眼内浸食性インサート又は高分子膜「リザーバ」システムのような遅延放出用の特定の眼内投与経路も本発明の範囲内にある。
本発明の眼科用組成物は局所投与され得、例えば、本組成物は、眼及び/又は眼の付属器に送達され、それと直接接触する。
本発明のベクターシステムを少なくとも含む本医薬組成物は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, edited by E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Pa.に記載されるとおりの任意の従来技術により調製され得る。
一実施形態において本組成物は、それが液体であるように製剤化され、ここで、ベクターシステムは、溶液中又は懸濁液中にあり得る。本組成物は、セルロースエーテル(例えばメチルセルロース)などの液体担体を含む点眼剤、人工涙液、眼洗浄液又はコンタクトレンズ吸着剤など、局所適用に好適な任意の液体形態で製剤化され得る。
好ましくは、液体は、水性液体である。更に、液体は無菌であることが好ましい。無菌性は、任意の従来方法、例えば、ろ過、照射又は加熱によるか、又は製造工程を無菌条件下で行うことにより付与され得る。
液体は1つ以上の親脂肪性媒体を含み得る。
本発明の一実施形態において、本組成物は軟膏として製剤化される。好ましくは軟膏中の1つの担体はワセリン担体であり得る。
薬学的に許容可能な媒体は、一般に、任意の従来用いられている薬学的に許容可能な媒体であり得、これは、具体的な製剤、意図される投与経路等に応じて選択されなければならない。更に、薬学的に許容可能な媒体は、例えばインターネットアドレスhttp://www.fda.gov/cder/drug/iig/default.htmで利用可能なFDA「添加物一覧」にある任意の一般に認められている添加剤であり得る。
少なくとも1つの薬学的に許容可能な希釈剤又は担体は緩衝液であり得る。目的によっては、多くの場合に組成物が緩衝液を含むことが望ましく、緩衝液は、溶液を5~9の範囲のpH、例えばpH5~6、pH6~8又はpH7~7.5に緩衝する能力を有するものである。
しかしながら、本発明の他の実施形態において本医薬組成物は、緩衝液を全く含まないか又はマイクロモル濃度量の緩衝液のみを含み得る。緩衝液は、例えば、トリス、酢酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩及びトリエタノールアミン緩衝液からなる群から選択され得る。従って、緩衝液は、K2HPO4、Na2HPO4又はクエン酸ナトリウムであり得る。
好ましい実施形態において緩衝液はトリス緩衝液である。トリス緩衝液は、様々な他の名称、例えば、トロメタミンUSPを含めたトロメタミン、THAM、Trizma、Trisamine、トリスアミノ及びトロメタモールで知られている。トリスという呼称は前述の呼称全てを包含する。
緩衝液は、更には、特に医薬製剤が非経口使用向けの場合、例えば非経口使用向けのUSP適合緩衝液から選択され得る。例えば、緩衝液は、酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸及び乳酸などの一塩基酸、アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸及び酒石酸などの二塩基酸、クエン酸及びリン酸などの多塩基酸並びにアンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン及びトリスなどの塩基からなる群から選択され得る。
本組成物は、チメロサール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム又はクロルヘキシジンなどの保存剤、リン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩及びクエン酸塩などの緩衝剤並びにB. F. Goodrich Chemical Companyの商標であるCarbopolの商品名で販売されているものなどの高分子量カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシメチルセルロース及びポリビニルアルコールなどの増粘剤(全て先行技術のとおり)を含有し得る。
本発明の一部の実施形態において、薬学的に許容可能な添加剤は安定剤を含む。安定剤は、例えば、洗浄剤、アミノ酸、脂肪酸、ポリマー、多価アルコール、金属イオン、還元剤、キレート剤又は抗酸化剤であり得るが、しかしながら、任意の他の好適な安定剤も本発明で使用され得る。例えば、安定剤は、ポロキサマー、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、Brij、金属イオン、アミノ酸、ポリエチレングリコール、Triton及びアスコルビン酸からなる群から選択され得る。
更には、安定剤は、グリシン、アラニン、アルギニン、ロイシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸などのアミノ酸、ポリソルベート20、ポリソルベート80及びポロキサマー407などの界面活性剤、ホスファチジルコリンエタノールアミン及びアセチルトリプトファネートなどの脂肪酸、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドンなどのポリマー、ソルビトール、マンニトール、グリセリン、スクロース、グルコース、プロピレングリコール、エチレングリコール、ラクトース及びトレハロースなどの多価アルコール、アスコルビン酸、システインHCL、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール及びグルタチオンなどの抗酸化剤、幾つかのチオール類などの還元剤、EDTA塩、グルタミン酸及びアスパラギン酸などのキレート剤からなる群から選択され得る。
薬学的に許容可能な添加剤は、等張塩、高張塩、低張塩、緩衝液及び安定剤からなる群から選択される1つ以上を含み得る。
好ましい実施形態において、保存剤などの他の医薬賦形剤が存在する。一実施形態において、前記保存剤は、限定はされないが、パラヒドロキシ安息香酸メチル又はパラヒドロキシ安息香酸プロピルなどのパラベンである。
本発明の一部の実施形態において、薬学的に許容可能な添加剤は、粘液溶解剤(例えばN-アセチルシステイン)、ヒアルロン酸、シクロデキストリン、石油を含む。
眼又は付属器組織への局所組成物の経皮送達を容易且つ円滑にするため本発明の医薬組成物に配合し得る例示的化合物としては、限定はされないが、アルコール(エタノール、プロパノール及びノナノール)、脂肪アルコール(ラウリルアルコール)、脂肪酸(吉草酸、カプロン酸及びカプリン酸)、脂肪酸エステル(ミリスチン酸イソプロピル及びn-ヘキサン酸イソプロピル)、アルキルエステル(酢酸エチル及び酢酸ブチル)、ポリオール(プロピレングリコール、プロパンジオン及びヘキサントリオール)、スルホキシド(ジメチルスルホキシド及びデシルメチルスルホキシド)、アミド(尿素、ジメチルアセトアミド及びピロリドン誘導体)、界面活性剤(ラウリル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ポロキサマー、span、tween、胆汁酸塩及びレシチン)、テルペン(d-リモネン、α-テルピネオール、1,8-シネオール及びメントン)及びアルカノン(N-ヘプタン及びN-ノナン)が挙げられる。更に、局所投与組成物は、限定はされないが、カドヘリンアンタゴニスト、セレクチンアンタゴニスト及びインテグリンアンタゴニストを含めた表面接着分子調節剤を含み得る。
また、点眼液は、結膜嚢における医薬の滞留性を改善するため、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの増粘剤を含有し得る。
ある実施形態において、本発明に係る使用のためのベクターシステムは、水性で無菌の眼科用懸濁液又は溶液を形成するため、眼科学的に許容可能な保存剤、界面活性剤、粘度増強剤、透過促進剤、緩衝液、塩化ナトリウム及び水と組み合わされ得る。点眼液は、ベクターシステムの溶解を助けるため、眼科学的に許容可能な界面活性剤を更に含み得る。点眼液製剤は、ベクターシステムを生理学的に許容可能な等張性水性緩衝液に溶解させることにより調製され得る。
無菌眼軟膏製剤を調製するため、ベクターシステムは、鉱油、液体ラノリン又は白色ワセリンなどの適切な媒体中に保存剤と組み合わされ得る。無菌眼科用ゲル製剤は、例えばカルボポール-940など、類似の眼科用調合剤用の既発表の製剤に従う組み合わせから調製された親水性基剤にベクターシステムを懸濁することにより調製され得;保存剤及び等張化剤を配合することができる。
好ましくは、本発明の製剤は、治療有効量の局所治療用ベクターシステムと;前記組成物の水に可溶性の誘導体の量と前記組成物の局所適用時のベクターシステムに伴う不快感を低減するのに有効な前記組成物の0.05重量/体積%との間の量で存在するキサンチン誘導体であって、テオフィリン、カフェイン、テオブロミン及びこれらの混合物からなる群から選択されるキサンチン誘導体と;眼科用保存剤と;等張性で水性の非刺激性眼科用組成物を提供するための緩衝液とを含む、眼に対する局所適用向けの水性で非刺激性の眼科用組成物である。
薬物送達装置
一実施形態において、本発明は、少なくともベクターシステムと、薬学的に適合性のあるポリマーとからなる薬物送達装置を含む。例えば、本組成物が前記ポリマーに配合されるか、又はそれにコーティングされる。本組成物はポリマーに化学的に結合するか、又は物理的に混入されるかのいずれかである。ポリマーは疎水性又は親水性のいずれかである。ポリマー装置は複数の物理的構成を含む。ポリマー装置の例示的な物理的形態としては、限定はされないが、フィルム、スキャフォールド、チャンバ、スフェア、マイクロスフェア、ステント又は他の構造体が挙げられる。ポリマー装置は内表面と外表面とを有する。本装置は1つ以上の内部チャンバを有する。これらのチャンバが1つ以上の組成物を収容する。本装置は1つ以上の化学的に区別可能なモノマーのポリマーを含有する。装置のサブユニット又はモノマーはインビトロ又はインビボで重合する。
好ましい実施形態において、本発明は、ポリマーと、前記ポリマーの中又はその上に配合された生物活性組成物とを含む装置を含み、ここで、前記組成物は、ベクターシステムを含み、ここで、前記装置は、眼表面組織、眼表面組織と接触している付属器組織、体液によって満たされた眼腔若しくは付属器腔又は眼腔若しくは付属器腔に植え込まれるか又は注入される。
本装置を形成し得る例示的粘膜付着性ポリアニオン系天然又は半合成ポリマーとしては、限定はされないが、ポリガラクツロン酸、ヒアルロン酸、カルボキシメチルアミロース、カルボキシメチルキチン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸及びメソグリカンが挙げられる。一実施形態において、本装置は、任意選択で全部又は部分的に生分解性であり得る生体適合性ポリマーマトリックスを含む。ヒドロゲルは、好適なポリマーマトリックス材料の一例である。ヒドロゲルを形成し得る材料の例としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、PLGAポリマー、アルギン酸塩及びアルギン酸塩誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、天然及び合成多糖類、ポリペプチド類などのポリアミノ酸類、特にポリ(リジン)、ポリヒドロキシブチラート及びポリ-ε-カプロラクトンなどのポリエステル類、ポリ無水物類;ポリホスファジン類、ポリビニルアルコール)類、ポリ(アルキレンオキシド)類、特にポリ(エチレンオキシド)類、ポリ(アリルアミン)類(PAM)、ポリ(アクリレート)類、ポリ(4-アミノメチルスチレン)などの変性スチレンポリマー類、プルロニックポリオール類、ポロキサマー類、ポリ(ウロン酸)類、ポリ(ビニルピロリドン)及びグラフト共重合体を含めた上記の共重合体が挙げられる。別の実施形態において、スキャフォールドは、限定はされないが、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、アガロース及びラミニンリッチゲルなど、種々の合成ポリマー及び天然に存在するポリマーで製造され得る。
ヒドロゲルに好ましい1つの材料は、アルギン酸塩又は修飾アルギン酸塩材料である。アルギン酸塩分子は、比率及びポリマー鎖に沿った配列分布が様々な(1-4)結合β-D-マンヌロン酸(M単位)及びL-グルロン酸(G単位)モノマーで構成される。アルギン酸塩多糖類は高分子電解質系であり、二価カチオン(例えばCa+2、Mg+2、Ba+2)に強力な親和性を有して、これらの分子に曝露されたとき安定ヒドロゲルを形成する。
本装置は、局所的に、結膜下に又は強膜外隙に、皮下に又は導管内に投与される。具体的には、本装置は、眼組織の表面上又はその直下に置かれる。代わりに、本装置は涙管内又は涙腺内に置かれる。ポリマー中又はその上に配合された本組成物は、本装置から放出されるか又はそこから拡散する。
一実施形態において、本組成物は、コンタクトレンズ又は薬物送達装置中に配合されるか、又はその上にコーティングされ、そうしたレンズ若しくは装置から1つ以上の分子が拡散して広がるか、又は時間的に制御された方法で放出される。この実施形態において、コンタクトレンズ組成物は、例えばレンズが視力矯正に必要な場合に眼表面上に留まるか、又はコンタクトレンズは時間とともに溶解して、同時に密接に並んで位置する組織に組成物を放出するかのいずれかである。同様に、様々な実施形態において本薬物送達装置は任意選択で生分解性であるか、又は永久留置型である。
例えば、本組成物は前記レンズ中に配合されるか、又はその上にコーティングされる。本組成物はコンタクトレンズポリマーに化学的に結合するか、又は物理的に混入される。代わりに、着色添加剤がポリマー組成物に化学的に結合するか、又は物理的に混入され、それが治療用薬物組成物と同じ速度で放出されて、そのため着色添加剤の強度の変化が、ポリマー中に結合又は混入して残っている治療用薬物組成物の量又は用量の変化の指標となる。代わりに又は加えて、紫外線(UV)吸収剤がコンタクトレンズポリマー中に化学的に結合するか、又は物理的に混入される。コンタクトレンズは疎水性又は親水性のいずれかである。
本発明の組成物の送達手段を備える疎水性レンズの製造に使用される例示的材料としては、限定はされないが、アメフォコンA、アムシルフォコンA、アキラフォコンA、アルフォコンA、カブフォコンA、カブフォコンB、カルボシルフォコンA、クリルフォコンA、クリルフォコンB、ジメフォコンA、エンフルフォコンA、エンフロフォコンB、エリフォコンA、フルロフォコンA、フルシルフォコンA、フルシルフォコンB、フルシルフォコンC、フルシルフォコンD、フルシルフォコンE、ヘキサフォコンA、ホフォコンA、ヒブフォコンA、イタビスフルオロフォコンA、イタフルオロフォコンA、イタフォコンA、イタフォコンB、コルフォコンA、コルフォコンB、コルフォコンC、コルフォコンD、ロチフォコンA、ロチフォコンB、ロチフォコンC、メラフォコンA、ミガフォコンA、ネフォコンA、ネフォコンB、ネフォコンC、オンシフォコンA、オプリフォコンA、オキシフルフロコンA、パフルフォコンB、パフルフォコンC、パフルフォコンD、パフルフォコンE、パフルフォコンF、パシフォコンA、パシフォコンB、パシフォコンC、パシフォコンD、パシフォコンE、ペムフォコンA、ポロフォコンA、ポロフォコンB、ロフルフォコンA、ロフルフォコンB、ロフルフォコンC、ロフルフォコンD、ロフルフォコンE、ロシルフォコンA、サタフォコンA、シフルフォコンA、シラフォコンA、ステラフォコンA、スルフォコンA、スルフォコンB、テラフォコンA、チシルフォコンA、トロフォコンA、トリフォコンA、ユニフォコンA、ビナフォコンA及びウィロフォコンAが挙げられる。本発明の組成物の送達手段を備える親水性レンズの製造に使用される例示的材料としては、限定はされないが、アバフィルコンA、アコフィルコンA、アコフィルコンB、アクアフィルコンA、アロフィルコンA、アルファフィルコンA、アムフィルコンA、アスチフィルコンA、アトラフィルコンA、バラフィルコンA、ビスフィルコンA、ブフィルコンA、コムフィルコンA、クロフィルコンA、シクロフィルコンA、ダルフィルコンA、デルタフィルコンA、デルタフィルコンB、ジメフィルコンA、ドロクスフィルコンA、エラストフィルコンA、エプシルフィルコンA、エステリフィルコンA、エタフィルコンA、フォコフィルコンA、ガリフィルコンA、ゲンフィルコンA、ゴバフィルコンA、ヘフィルコンA、ヘフィルコンB、ヘフィルコンC、ヒラフィルコンA、ヒラフィルコンB、ヒオキシフィルコンA、ヒオキシフィルコンB、ヒオキシフィルコンC、ヒドロフィルコンA、レネフィルコンA、リクリフィルコンA、リクリフィルコンB、リドフィルコンA、リドフィルコンB、ロトラフィルコンA、ロトラフィルコンB、マフィルコンA、メサフィルコンA、メタフィルコンB、ミパフィルコンA、ネルフィルコンA、ネトラフィルコンA、オクフィルコンA、オクフィルコンB、C、オクフィルコンD、オクフィルコンE、オフィルコンA、オマフィルコンA、オキシフィルコンA、ペンタフィルコンA、ペルフィルコンA、ペバフィルコンA、フェムフィルコンA、ポリマコン、セノフィルコンA、シラフィルコンA、シロキシフィルコンA、スルフィルコンA、テフィルコンA、テトラフィルコンA、トリフィルコンA、ビフィルコンA、ビフィルコンB及びキシロフィルコンAが挙げられる。
ゲル又はゲル様物質、クリーム又は粘性エマルションとして製剤化される組成物は、本発明の範囲内にある。前記組成物は、少なくとも1つのゲル化成分、ポリマー又はその他の、組成物の粘度を高める好適な薬剤を含むことが好ましい。治療下の範囲に有害作用を及ぼさない、且つ皮膚、眼又は粘膜への局所投与向けの組成物及び医薬組成物の製剤として適用可能な、当業者に公知の任意のゲル化成分を使用することができる。例えば、ゲル化成分は、アクリル酸、カルボマー、カルボキシポリメチレン、B. F. Goodrichによって商標Carbopolで販売されているような材料(例えばCarbopol 940)、ポリエチレン-ポリプロピレングリコール、BASFによって商標Poloxamerで販売されているような材料(例えばPoloxamer 188)、セルロース誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチレンセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ポリビニルピロリドン、ビーガム(ケイ酸アルミウニムマグネシウム)、ペミュレン、シムルゲル(シムルゲル600、シムルゲルEG及びシムルゲルNSなど)、キャピゲル、コラファクス、プラスドン類など、及びこれらの混合物の群から選択され得る。
本発明に係るゲル又はゲル様物質は、例えば、10%w/w未満の水、例えば20%w/w未満の水、例えば少なくとも20%w/wの水、少なくとも30%w/wの水など、例えば少なくとも40%w/wの水、少なくとも50%w/wの水など、例えば少なくとも75%w/wの水、少なくとも90%w/wの水など、例えば少なくとも95%w/wの水を含む。好ましくは、前記水は、脱イオン水である。
本発明のゲル様物質には、水中又は他の水性媒体中の分散体として形成されるコロイド状ゲルであるヒドロゲルが含まれる。従って、ヒドロゲルはコロイドの形成時に形成され、ここで、分散相(そのコロイド)が連続相(即ち水)と合わさって粘性のゼリー状生成物;例えば凝固ケイ酸を生じる。ヒドロゲルは、化学的結合又は物理的結合のいずれかで架橋した親水性ポリマー鎖の三次元網目構造である。ポリマー鎖の親水性の性質のため、ヒドロゲルは水を吸収して膨潤する。膨潤過程は非架橋親水性ポリマーの溶解と同じである。定義上、水はヒドロゲルの総重量(又は総体積)の少なくとも10%を占める。
ヒドロゲルの例としては、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル及び化学的に又は物理的に架橋したポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリエチレンオキシド及び加水分解ポリアクリロニトリルなどの合成ポリマーが挙げられる。有機ポリマーであるヒドロゲルの例としては、アルギン酸の多価金属塩などの共有結合型又はイオン架橋型多糖系ヒドロゲル、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸塩及びヒドロゲル類であって、キチン、キトサン、プルラン、ジェラン及びキサンタン由来のヒドロゲル類が挙げられる。本発明者らの実験で使用した詳細なヒドロゲル類は、セルロース化合物(即ちヒドロキシプロピルメチルセルロース[HPMC])及び高分子量ヒアルロン酸(HA)であった。
ヒアルロン酸は、多様々な生体組織によって作られる多糖である。米国特許第5,166,331号は、眼内液の代用物として且つ局所眼科用薬物担体として使用されるヒアルロン酸の様々な画分の精製について考察している。ヒアルロン酸の眼への使用について考察している他の米国特許出願としては、米国特許出願第11/859,627号;同第11/952,927号;同第10/966,764号;同第11/741,366号;及び同第11/039,192号が挙げられる。眼内使用向けの高分子の製剤は公知であり、例えば、米国特許出願第11/370,301号;同第11/364,687号;米国仮特許出願第60/721,600号;米国特許出願第11/116,698号及び米国仮特許出願第60/567,423号;米国特許出願第11/695,527号を参照されたい。様々な活性薬剤の使用は、高粘度ヒアルロン酸は、公知である。例えば、米国特許出願第10/966,764号;同第11/091,977号;同第11/354,415号;米国仮特許出願第60/519,237号;同第60/530,062号及び米国特許出願第11/695,527号を参照されたい。
国際公開第2010048086号に記載されるとおりの徐放性製剤は、本発明の範囲内にある。
当業者は、ポリヌクレオチド又はベクターを宿主細胞に取り込むための標準的な方法、例えば、トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、ウイルス感染、熱ショック、膜の化学的透過処理後の形質転換又は細胞融合について十分に認識している。
本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞又は遺伝子操作された宿主細胞」は、先述のコンストラクト又はベクターによって形質導入、形質転換又はトランスフェクトされている宿主細胞に関する。
適切な宿主細胞の代表例としては、大腸菌(E. coli)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、Sf9などの昆虫細胞、CHO又はCOSなどの動物細胞、植物細胞等を挙げることができる。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると見なされる。好ましくは、前記宿主細胞は動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。本発明は、本明細書に記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を更に提供する。宿主細胞は培養細胞又は初代細胞、即ち生物、例えばヒトから直接単離されたものであり得る。宿主細胞は接着細胞又は浮遊細胞、即ち懸濁液中で成長する細胞であり得る。好適な宿主細胞は当技術分野において公知であり、例えば、DH5α、大腸菌(E. coli)細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルVERO細胞、COS細胞、HEK293細胞などが挙げられる。
エキソビボ遺伝子療法の場合、宿主細胞は、患者から単離された細胞、例えば造血幹細胞であり得、これは、トランス遺伝子の導入時に、それを必要としている前記患者に再導入される。
AAVベースのウイルス送達システム
AAVベクターの構築は、当業者に公知の手順に従い及びそうした技法を用いて行うことができる。アデノ随伴ウイルスベクター構築及び療法における使用の理論及び実践は、幾つかの科学文献及び特許文献に例示されている(以下の参考文献一覧が本明細書において参照により援用される:Flotte TR. Adeno-associated virus-based gene therapy for inherited disorders. Pediatr Res. 2005 Dec;58(6):1143-7;Goncalves MA. Adeno-associated virus: from defective virus to effective vector, Virol J. 2005 May 6;2:43;Surace EM, Auricchio A. Adeno-associated viral vectors for retinal gene transfer. Prog Retin Eye Res. 2003 Nov;22(6):705-19;Mandel RJ, Manfredsson FP, Foust KD, Rising A, Reimsnider S, Nash K, Burger C. Recombinant adeno-associated viral vectors as therapeutic agents to treat neurological disorders. Mol Ther. 2006 Mar;13(3):463-83)。
AAVベクターを含む医薬組成物の好適な投与形態としては、限定はされないが、注射用溶液又は懸濁液、点眼薬及び眼軟膏が挙げられる。好ましい実施形態において、AAVベクターは髄腔内注射により投与される。特に好ましい実施形態において、AAVベクターは網膜下注射により前房に又は球後腔及び硝子体内に投与される。好ましくは、ウイルスベクターは、網膜下手法(Bennicelli J, et al Mol Ther. 2008 Jan 22; Reversal of Blindness in Animal Models of Leber Congenital Amaurosis Using Optimized AAV2-mediated Gene Transferに記載されるとおり)によって送達される。
療法に用いるウイルスの用量は、投与経路、疾患の重症度、患者の全般的な状態及び他の臨床パラメータに応じてケースバイケースで決定するものとする。一般に、好適な投薬量は、10~1013vg(ベクターゲノム)/眼まで異なり得る。
インテイン
インテインとは、タンパク質スプライシングとして知られる過程で自らを切り出して残りの部分(エクステイン)をペプチド結合でつなぎ合わせることが可能なタンパク質中のセグメントである。このようなセグメントは、内側のタンパク質配列について「インテイン」及び外側のタンパク質配列について「エクステイン」と呼ばれ、ここで、上流のエクステインは、「N-エクステイン」と称され、下流のエクステインは、「C-エクステイン」と呼ばれる。タンパク質スプライシング過程の産物は、2つの安定タンパク質:成熟タンパク質及びインテインである。
インテインは、2つの別個に転写及び翻訳される遺伝子によってコードされる2つの断片としても存在し得、本明細書では「スプリットインテイン」と名付けられる。
本発明のインテインには、限定なしに、(66)に開示されるNew England Biolabsインテインデータベースに挙げられるスプリットインテインが含まれる。
スプリットインテインの産生は、インテインから出発して、初めにホーミングエンドヌクレアーゼドメイン配列を除去してミニインテインを産生することにより得る。次に、既知の結晶構造のインテインとのタンパク質配列アラインメントを通じて設計された1つ以上の部位で前記ミニインテインを分断してスプリットインテインを生じさせ得、これを、本開示に含まれるプロトコルに従い、トランススプライシング活性に関してアッセイし得る。
スプリットインテインは、合理的設計に基づくインテイン配列の部位特異的突然変異誘発又は修飾を通じて、及び/又は機能選択、ファージディスプレイ及びリボソームディスプレイのような方法を用いた定向進化を通じて、活性、効率、汎用性及び安定性を含めた望ましい特徴を更に向上させ得る。
スプリットインテインの例は、シアノバクテリアにおけるDNAポリメラーゼIIIの触媒サブユニットであるDnaEに由来するインテインであり、これらは2つの別個の遺伝子dnaE-n及びdnaE-cによってコードされる。dnaE-n遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書では「N-インテイン」と称される。dnaE-c遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書では「C-インテイン」と称される。概して、スプリットインテインのN部分が「N-インテイン」と称され、スプリットインテインのC部分が「C-インテイン」と称される。スプリットインテインは自己会合してタンパク質スプライシング活性をトランスで触媒する(本明細書では「トランススプライシング」)。
本発明のスプリットインテインの更なる例は、以下の表3にNpu-DnaE-nヌクレオチド配列によってコードされる配列番号1及びNpu-DnaE-cヌクレオチド配列によってコードされる配列番号2として示されるノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)(Npu)からのDnaEのインテイン(27、28));以下の表にRma-DnaB-nヌクレオチド配列によってコードされる配列番号4及びRma-DnaB-cヌクレオチド配列によってコードされる配列番号5として示されるロドサーマス・マリヌス(Rhodothermus marinus)(Rma)からのDnaBのインテイン(29);それぞれN-インテインがNpuのDnaE(配列番号5)からのものであり、及びC-インテインがシネコシスティス属(Synechocystis)種PCC6803株(Ssp(配列番号6)からのものである突然変異型N-及びC-インテイン(30)(シネコシスティス属(Synechocystis)種PCC6803株N-インテイン及びC-インテインは、それぞれ以下の表に配列番号13及び14として含まれる)を含む。他のインテインシステムがまた使用され得る。例えば、dnaEインテイン、Cfa-N及びCfa-Cインテイン対をベースとする合成ファストインテインが記載されている(例えば、(31)及び国際公開第2017/132580号、参照により本明細書に援用される)。米国特許第8,394,604号には、Ssp GyrBインテイン、Ssp DnaXインテイン、Ter DnaE3インテイン、Ter ThyXインテイン及びCne Prp8インテインを含め、追加的なインテインが記載されている。本発明の範囲内にある更なるインテインは、国際公開第2018071868号に開示されるインテインであり、第1のインテイン対は、以下の表に挙げられ、配列番号9(N-インテイン)及び配列番号10(C-インテイン)として名前が挙げられ;第2のインテイン対は、例えば、配列番号11及び配列番号12として挙げられる。
代わりに、インテインシステムは、リガンド(例えば、4-ヒドロキシタモキシフェンなどの小分子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、アミノ酸及びヌクレオチド)が存在しない場合にはタンパク質スプライシング活性を全く呈しないか又は最小限のみ呈するリガンド依存性インテインであり得る。リガンド依存性インテインとしては、例えば、米国特許出願公開第2014/0065711 A1号(参照により本明細書に援用される)に記載されるものが挙げられる。
Figure 2022512718000012
Figure 2022512718000013
Figure 2022512718000014
本明細書に記載されるとおり、トランススプライシング活性を保持している、異なる生物からの同じ遺伝子に由来するインテインが、本発明の範囲内にある。非限定的な例として、DNA-Eスプリットインテインは、ノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)(Npu)、シネコシスティス属種(Synechocystis sp.)PCC6803(Ssp)、フィスケレラ属種(Fischerella sp.)PCC 9605、スキトネマ・トリポトリコイデス(Scytonema tolypothrichoides)、シアノバクテリア菌(Cyanobacteria bacterium)SW_9_47_5、ノドゥラリア・スプミゲナ(Nodularia spumigena)、ノストック・フラゲリフォルメ(Nostoc flagelliforme)、クロコスフェラ・ワトソニイ(Crocosphaera watsonii)WH 8502、クロオコクシディオプシス・クバナ(Chroococcidiopsis cubana)CCALA 043、トリコデスミウム・エリトラエウム(Trichodesmium erythraeum)を含めたシアノバクテリアのスプリットインテインDnaE遺伝子(例えばDNAポリメラーゼIIIサブユニットα)に由来し得る。更なる例として、DNA-Bスプリットインテインは、R.マリヌス(R. marinus)(Rma)、シネコシスティス属種(Synechocystis sp.)PC6803(Ssp)、ポルフィラ・プルプレア(Porphyra purpurea)葉緑体(Ppu)(これらは例えば(59)に記載されている)を含めたシアノバクテリアのDnaB遺伝子に由来し得る。
従って、本発明のスプリットインテインは、天然に存在するインテインと100%同一、98%、80%、75%、70%、65%、50%同一であり得、ここで、前記インテインは、トランススプライシング反応を起こす能力を保持している。トランススプライシング活性を保持している天然に存在する又は修飾されたインテインの断片は、本発明の範囲内にある。
例えば、Npu(ノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme))DnaEとシネコシスティス属種(Synechocystis sp.)PCC6803 N-インテインとのアラインメント:
Figure 2022512718000015

及びNpu(ノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme))DnaEとシネコシスティス属種(Synechocystis sp.)PCC6803 C-インテインとのアラインメント:
Figure 2022512718000016

を参照されたい。
従って、トランススプライシング活性を保持している本発明のインテインのスプリットインテイン変異体及び断片も本発明の範囲内にある。
興味深いことに、インテインは、そのスプライシング活性を保証する保存された機能的特徴を有することが報告されている。詳細には、4つのインテインモチーフが同定されている(そのコンセンサス配列については以下を参照されたい):ブロックA~H(Pietrokovski 1994及びPerler 1997)及びブロックN2及びN4(Pietrokovski 1998)。インテインブロックA、N2、B、N4、F及びGは、タンパク質スプライシングに関与する。ブロックC、D、E、Hは、スプリットインテインに存在しないエンドヌクレアーゼドメインにある。従って、スプリットインテインは、トランススプライシング活性に不可欠な保存モチーフを保持している(インテインデータベース、[Perler, F. B. (2002). InBase, the Intein Database. Nucleic Acids Res. 30, 383-384]に開示される)。
Figure 2022512718000017
しかし、インバリアントな残基は1つもなく、ブロックAのSer及びCys、ブロックBのHis、ブロックGのHis、Asn及びSer/Cys/Thrが、スプライシングモチーフにおいて最も保存されている残基である。
本発明のインテインのアラインメント:
挙げられる全てのN-インテインのCLUSTAL Wアラインメント:
Figure 2022512718000018

挙げられる全てのC-インテインのCLUSTAL 2.1多重配列アラインメント
Figure 2022512718000019
要約すれば、インテイン活性はコンテクスト依存的で、効率的なトランススプライシングが起こるのに必要な特定のペプチド配列がそのライゲーション接合部を取り囲んでおり(N-及びC-エクステインと呼ばれる)、そのうちの最も重要なものは、C-エクステイン中の1番目の残基としての求核性チオール基又はヒドロキシル基を含むアミノ酸(即ちCys、Ser又はThr)である。
本発明者らは、インビボで大型タンパク質を再構成するために、インテイン媒介性タンパク質トランススプライシングを用いた。インテイン遺伝子配列によってコードされるスプリットインテインは前駆体ポリペプチドとして産生され、これらはその構造的相補性により再集合し、タンパク質トランススプライシング反応を触媒することができる。
タンパク質トランススプライシングの文脈では、N-インテイン遺伝子は、目的タンパク質のN端側部分をコードする配列とインフレームで融合され;C-インテイン遺伝子は、目的配列のC端側部分をコードする配列とインフレームで融合される。これらの2つの融合タンパク質前駆体が発現すると、インテインが自己触媒的な切り出しを起こし、ライゲートされたエクステイン、例えば、再構成された目的タンパク質を形成する。
従って、目的タンパク質の再構成には、前記タンパク質を2つ又は3つの断片に分断し、それらのコード配列を別々にAAVベクターに、N-又はC-インテインと融合して、且つプロモーターの制御下にクローニングする必要がある。各タンパク質の分断点は、接合点におけるアミノ酸の要件(例えば、C-エクステイン中の1番目の残基としての求核性チオール基又はヒドロキシル基を含むアミノ酸(即ちCys、Ser又はThr)の存在並びに正しいタンパク質の折り畳み及び各インテイン-ポリペプチド前駆体ポリペプチド及び結果として生じる再構成タンパク質の安定性に有利となるようにするための、決定的に重要なタンパク質ドメインの完全性の維持を考慮して選択される。
特に注目すべきことに、本発明者らは、2つの目的タンパク質の範囲内で接合点を選択した:タンパク質ABCA4はアミノ酸Cys1150、Ser1168、Ser1090で分断し、これらの分断点にスプリットインテインを挿入する。CEP290タンパク質はaa Cys1076、Ser1275、Cys929及び1474;Ser 453及びCys 1474で分断する。
分解シグナル
調節されたタンパク質分解は、誤って折り畳まれた、凝集した又はその他異常なタンパク質から細胞を保護し、また、インビボで短命となるように進化したタンパク質のレベルも制御し、大部分がユビキチン(Ub)-プロテアソームシステム(UPS)及びオートファジー-リソソーム経路(分子シャペロンが両システムの一部である)によって媒介される。分解シグナルは、タンパク質分解経路の標的となるタンパク質の特徴であり、その結果タンパク質は半減期が減少することになる。詳細には、N-デグロン及びC-デグロンは、細胞タンパク質のそれぞれN末端及びC末端残基をその主な決定因子とする分解シグナルである。N-デグロン及びC-デグロンは様々な程度の隣接配列モチーフを含み、またポリユビキチン化部位として機能する内部リジン残基も含む。
本発明の意味の範囲内では、内部デグロンとは、N末端でもなく、C末端でもなく、タンパク質配列の中に位置する分解シグナルであって、その機能的に不可欠なエレメントがN末端残基又はC末端残基のいずれも含まずタンパク質分解を媒介する分解シグナルとして定義される。
デグロン経路は、N-若しくはC-デグロン又は内部デグロンを含むタンパク質を認識する能力であって、それにより26Sプロテアソーム又はオートファジーによるそうしたタンパク質の分解を生じさせるその能力をその統一的な特徴とするタンパク質分解システムの集合を含む。
大腸菌(E. coli)ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ecDHFR)は159残基の酵素であり、原核生物の一次代謝における幾つかの段階に不可欠な補因子であるテトラヒドロ葉酸へのジヒドロ葉酸の還元を触媒する。数多くのDHFR阻害薬が薬物として開発されており、かかる阻害薬の1つであるトリメトプリム(TMP)は、ecDHFRを哺乳類DHFRよりもはるかに強力に阻害する。この広い治療域により、TMPは哺乳類細胞において「生物学的にサイレント」になる。ecDHFR-TMP相互作用の特異性が、TMPの市販品の入手し易さ及び魅力的な薬理学的特性と相まって、このタンパク質-リガンド対を分解システムとしての開発に理想的なものにする(69)。従って、タンパク質内にDHFRアミノ酸配列、好ましくはecDHFRアミノ酸配列が存在すると、それがプロテアソームシステムの標的シグナルとしての役割を果たし、その結果、タンパク質分解が生じる。TMPの存在下において、前記タンパク質は、安定化する。
好都合には、Iwamoto et al.により開発された点突然変異を持つecDHFR由来のデグロンシグナルは、N-末端又は内部位置の範囲内に置かれたときに限り機能的活性(例えば融合タンパク質の分解)を付与する3つのアミノ酸突然変異R12Y、Y100I及びG67S(69)を含む。
本発明者らによってecDHFR由来のデグロンの更なる改良が行われ、本発明者らは最も短い活性ペプチドを同定した。好都合には、短い配列ほど、同じAAVベクターの中に一層長いコード配列をフィットさせることが可能になる。
本発明の範囲内では、ecDHFR由来のデグロンが、インテインのうち、それが不活性なN端に融合された。タンパク質トランススプライシングの後、デグロンは再構成されたインテインの中に位置してその分解を媒介する。
本発明のecDHFRは、WT ecDHFR、突然変異体DHFR、完全長ecDHFR、より短いscDHFRである。
DHFRは105~159aa長であり得、ここで、短縮は、C端側末端で行われる。
ecDHFR 大腸菌(E. Coli)由来、野生型
ヌクレオチド配列:(623nt)配列番号27
Figure 2022512718000020

アミノ酸配列:
159aa-WT 配列番号28
Figure 2022512718000021
ecDHFR 大腸菌(E. Coli)由来、内部デグロン突然変異体(159aa)
突然変異位置は太字- 配列番号29
Figure 2022512718000022
ecDHFR 大腸菌(E. Coli)由来、野生型、最小限の活性断片
ヌクレオチド配列:配列番号30
Figure 2022512718000023

アミノ酸配列 配列番号31
Figure 2022512718000024
ecDHFR 大腸菌(E. Coli)由来、内部デグロン突然変異体pe、最小限の活性断片(104aa)
(突然変異位置は太字)配列番号32
Figure 2022512718000025
配列
本発明のコード配列は、哺乳類細胞、好ましくは哺乳類網膜細胞、特に光受容細胞又は肝細胞、筋細胞、心臓細胞、神経細胞、腎細胞、内皮細胞においてその発現を調節することが可能な、任意選択でイントロン配列が後に続くプロモーター配列に作動可能に連結され得る。例示的プロモーターとしては、光受容体特異的ヒトGタンパク質共役受容体キナーゼ1(GRK1)、光受容体間レチノイド結合タンパク質プロモーター(IRBP)、ロドプシンプロモーター(RHO)、卵黄様黄斑ジストロフィー2プロモーター(VMD2)、ロドプシンキナーゼプロモーター(RK)を含めた光受容体特異的プロモーター;MCK、MYODIを含めた筋肉特異的プロモーター;サイロキシン結合グロブリン(TBG)、ハイブリッド肝特異的プロモーター(HLP)(67)を含めた肝特異的プロモーター;hSYN1、CaMKIIaを含めたニューロン特異的プロモーター;Ksp-カドヘリン16、NKCC2を含めた腎臓特異的プロモーターなど、転写プロモーター活性を保持しているその断片及び変異体を含め、限定なしに、遍在性、人工的又は組織特異的プロモーターが挙げられる。本発明に係る遍在性プロモーターは、例えば、遍在性サイトメガロウイルス(CMV)(32)及びショートCMV(33)プロモーターである。
任意選択で、プロモーター配列は、?-グロビンIgGキメライントロンなどのエンハンサー配列を含む。
本発明の目的上、好ましくは本明細書に含まれる配列からそれぞれ選択されるEGFP(YP_009062989)、ABCA4及びCEP290のコード配列又は遺伝子コードの縮重に起因して同じアミノ酸配列をコードする配列は、哺乳類網膜細胞、特に光受容細胞においてその発現を調節することが可能なプロモーター配列に機能的に連結される。
例示的ポリアデニル化シグナルとしては、限定なしに、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(bGHpA)、ヒトβグロビンポリアデニル化シグナル又は短い合成バージョン(68)、SV40ポリアデニル化シグナル又は他の天然に存在する若しくは人工的なポリアデニル化シグナルが挙げられる。
本発明は、再構成されたインテインタンパク質の安定性を低下させるための分解シグナルのヌクレオチド配列の使用を提供する。好都合には、最大限の効果を保持するため1つ以上の配列が繰り返され得る。
好適な分解シグナルとしては、本発明によれば、(i)誤って折り畳まれたタンパク質と構造的類似性を共有する、従ってユビキチン化システムによって認識されるC末端不安定化ペプチドであるショートデグロンCL1、(ii)ドナータンパク質のN端におけるその融合が直接的なタンパク質分解又はN末端規則経路を経る分解の両方を媒介するユビキチン、(iii)CL1デグロンと同様に、ユビキチン化経路の酵素によって認識される構造に折り畳まれると予想される9アミノ酸長ペプチドであるN端側PB29デグロン、本明細書及び(69)に記載されるとおりのその変異体ecDHFR及び断片、特に、N末端又は内部位置の範囲内に置かれたときに限り機能的活性(例えば、融合タンパク質の分解)を付与する3つのアミノ酸突然変異R12Y、Y100I及びG67Sを含む点突然変異を持つecDHFR由来デグロンシグナルが挙げられる。
例示的分解シグナルについては、国際公開第201613932号(参照により本明細書に援用される)に記載されている。
当業者は容易に理解するとおり、当業者によって実験室で人工的に作り出され得る変異体に加えて、天然に見られるタンパク質の変異体配列が幾つもあり得る。主題の発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本明細書に具体的に例示されるもの、並びにその任意の天然変異体、並びに人工的に作り出され得る任意の変異体を、そうした変異体が所望の機能的活性を保持している限りは包含する。また、ポリペプチドの配列内にあるアミノ酸置換、付加又は欠失を除いて本明細書に例示されるポリペプチドの同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも、本明細書に具体的に例示されるポリペプチドと実質的に同じ関連性のある機能的活性をそうした変異ポリペプチドが保持している限りは主題の発明の範囲内にある。例えば、ポリペプチドの機能に影響を与えないポリペプチド内の保存的アミノ酸置換であれば、主題の発明の範囲内にあることになる。従って、本明細書に開示されるポリペプチドには、上記で考察したとおりの具体的に例示される配列の変異体及び断片が含まれることが理解されなければならない。主題の発明は、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含む。これらのヌクレオチド配列は、本明細書に提供されるタンパク質及びアミノ酸配列の情報を持つ当業者が容易に構築することができる。当業者によれば理解されるであろうとおり、遺伝子コードの縮重により、当業者は、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードする種々のヌクレオチド配列を構築することが可能になる。特定のヌクレオチド配列の選択は、例えば、特定の発現系又は宿主細胞のコドン使用に依存し得る。主題のポリペプチドに具体的に例示されるもの以外のアミノ酸の置換を有するポリペプチドも本発明の範囲内にあると企図される。例えば、置換されたアミノ酸を有するポリペプチドがアミノ酸の置換されていないポリペプチドと実質的に同じ活性を保持している限りは、本発明のポリペプチドのアミノ酸を非天然アミノ酸に置換することができる。非天然アミノ酸の例としては、限定はされないが、オルニチン、シトルリン、ヒドロキシプロリン、ホモセリン、フェニルグリシン、タウリン、ヨードチロシン、2,4-ジアミノ酪酸、a-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、γ-アミノ酪酸、ε-アミノヘキサン酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、ノルロイシン、ノルバリン、サルコシン、ホモシトルリン、システイン酸、τ-ブチルグリシン、τ-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、β-メチルアミノ酸、C-メチルアミノ酸、N-メチルアミノ酸など、及び一般にアミノ酸類似体が挙げられる。非天然アミノ酸としては、誘導体化された側基を有するアミノ酸も挙げられる。更に、タンパク質中のアミノ酸のいずれかがD(右旋性)型又はL(左旋性)型であり得る。アミノ酸は、概して以下のクラス:非極性、非荷電極性、塩基性及び酸性に分類することができる。あるクラスのアミノ酸を有するポリペプチドが同じクラスの別のアミノ酸に置き換えられる保存的置換は、置換を有するポリペプチドが置換を有しないポリペプチドとなおも実質的に同じ生物学的活性を保持している限りは、本発明の範囲内に入る。表4は、各クラスに属するアミノ酸の例の一覧表を提供する。
Figure 2022512718000026
ポリヌクレオチドの配列の範囲内にあるヌクレオチド置換、付加又は欠失を除いて本明細書に例示されるポリヌクレオチドの同じヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも、本明細書に具体的に例示されるポリヌクレオチドと実質的に同じ関連性のある機能的活性をそれらの変異体ポリヌクレオチドが保持している(例えば、例示されるポリヌクレオチドによってコードされるのと同じアミノ酸配列又は同じ機能的活性を有するタンパク質をそれらがコードする)限り、本発明の範囲内にある。従って、本明細書に開示されるポリヌクレオチドには、上記で考察したとおりの、具体的に例示される配列の変異体及び断片が含まれることが理解されなければならない。
本発明は、標準的なストリンジェント条件及び標準的な方法の下でのその配列とのハイブリダイゼーション(Maniatis, T. et al, 1982)を許容するのに十分な本発明のポリヌクレオチド配列との相同性がある配列を有するポリヌクレオチド分子も企図する。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、本明細書に例示されるものとのより詳細な同一性及び/又は類似性範囲の点で定義することもできる。配列同一性は典型的には60%より高く、好ましくは75%より高く、より好ましくは80%より高く、更により好ましくは90%より高いことになり、95%より高いことができる。配列の同一性及び/又は類似性は、本明細書に例示される配列と比較したとき49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%又はそれ以上であり得る。特に指定されない限り、本明細書で使用されるとき、2つの配列のパーセント配列同一性及び/又は類似性は、Karlin and Altschul (1993)にあるとおり修正された、Karlin and Altschul (1990)のアルゴリズムを用いて決定することができる。かかるアルゴリズムは、Altschul et al. (1990)のNBLAST及びXBLASTプログラムに取り込まれている。BLAST検索は、所望のパーセント配列同一性の配列を得るため、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12で実施することができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るには、Altschul et al. (1997)に記載されるとおりのGapped BLASTを使用することができる。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用するときは、それぞれのプログラム(NBLAST及びXBLAST)のデフォルトパラメータを使用することができる。NCBI/N1Hウェブサイトを参照されたい。
Figure 2022512718000027
Figure 2022512718000028
Figure 2022512718000029
EGFP
p915_pAAV2.1-TBG-5’EGFPインテイン(配列番号33)
5’ITR:破線下線(配列の5’側始端の配列A)
TBGプロモーター:太字(配列B)
5’EGFP:下線(配列C)
N-インテインNpu DnaE:二重下線(配列D)
3xflag:斜体(配列E)
WPRE:斜体下線(配列F)
Bgh ポリA:太字下線(配列G)
3’ITR:破線下線(配列の3’末端の配列H)
Figure 2022512718000030
p917_pAAV2.1-TBG-3’EGFPインテイン
5’ITR(配列A)
TBGプロモーター(配列B)
C-インテインNpu DnaE(配列I)配列番号34
Figure 2022512718000031

3’EGFP(配列L)配列番号35
Figure 2022512718000032

3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p914_pAAV2.1-CMV-5’EGFPインテイン
5’ITR(配列A)
CMVプロモーター(配列M)配列番号36
Figure 2022512718000033

5’EGFP(配列C)
N-インテインNpu DnaE(配列D)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p916_pAAV2.1-CMV-3’EGFPインテイン
5’ITR(配列A)
CMVプロモーター(配列M)
C-インテインNpu DnaE(配列I)
3’EGFP(配列L)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p932_pAAV2.1-GRK1-5’EGFPインテイン
5’ITR(配列A)
GRK1プロモーター(配列N)配列番号37
Figure 2022512718000034

5’EGFP(配列C)
N-インテインNpu DnaE(配列D)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p933_pAAV2.1-GRK1-3’EGFPインテイン
5’ITR(配列A)
GRK1プロモーター(配列N)
C-インテインNpu DnaE(配列I)
3’EGFP(配列L)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p36 pAAV2.1-CMV-5’EGFPインテイン_ecDHFR
5’ITR(配列A)
CMVプロモーター(配列M)
5’EGFP(配列C)
N-インテインNpu DnaE(配列D)
3xflag(配列E)
ecDHFR(配列O)配列番号38
Figure 2022512718000035

WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p37 pAAV2.1-CMV-5’EGFPインテイン_ミニecDHFR
5’ITR(配列A)
CMVプロモーター(配列M)
5’EGFP(配列C)
N-インテインNpu DnaE(配列D)
3xflag(配列E)
ミニecDHFR(配列P)配列番号39
Figure 2022512718000036

WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p902_pAAV2.1-CMV-5’EGFPインテインDnaB
5’ITR(配列A)
CMVプロモーター(配列M)
5’EGFP(配列C)
N-インテイン RmaDnaB(配列Q)配列番号40
Figure 2022512718000037

N-インテインNpu DnaE(配列D)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p903_pAAV2.1-CMV-3’EGFPインテインDnaB
5’ITR(配列A)
CMVプロモーター(配列M)
C-インテインRma DnaB(配列R)配列番号41
Figure 2022512718000038

3’EGFP(配列L)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1256_pAAV2.1-CMV-5’EGFPインテインmDnaE
5’ITR(配列A)
CMVプロモーター(配列M)
5’EGFP(配列C)
N-インテインmDnaE(配列S)配列番号42
Figure 2022512718000039

3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1257 pAAV2.1-CMV-3’EGFPインテインmDnaE
5’ITR(配列A)
CMVプロモーター(配列M)
C-インテインmDnaE(配列T)配列番号43
Figure 2022512718000040

3’EGFP(配列L)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
CEP290
p1005 pAAV2.1-CMV260-5’CEP290インテイン(セット1)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)配列番号44
Figure 2022512718000041

5’CEP290:配列番号45
Figure 2022512718000042

Figure 2022512718000043

N-インテインDnaE(配列D)
3xflag(配列E)
shポリA(配列V)配列番号46
aattcaataaaagatctttattttcattagatctgtgtgttggttttttgtgtgcggcc
3’ITR(配列H)
p1093 pAAV2.1-CMV260-3’CEP290インテイン(セット1)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
3’CEP290:配列番号47
Figure 2022512718000044

Figure 2022512718000045

Figure 2022512718000046

C-インテインDnaE(配列I)
3xflag(配列E)
shポリA(配列V)
3’ITR(配列H)
p1065 pAAV2.1-CMV260-5’CEP290インテイン(セット2)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
5’CEP290:配列番号48
Figure 2022512718000047
Figure 2022512718000048
Figure 2022512718000049
N-インテインDnaE(配列D)
3xflag(配列E)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1067 pAAV2.1-CMV260-3’CEP290インテイン(セット2)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
3’CEP290:配列番号49
Figure 2022512718000050
Figure 2022512718000051
Figure 2022512718000052
C-インテインDnaE(配列I)
3xflag(配列E)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1087 pAAV2.1-CMV260-5’CEP290インテイン(セット3)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
5’CEP290:配列番号50
Figure 2022512718000053
Figure 2022512718000054
N-インテインmDnaE(配列S)
3xflag(配列E)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1088 pAAV2.1-CMV260-3’CEP290インテイン(セット3)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
3’CEP290:配列番号51
Figure 2022512718000055
Figure 2022512718000056
C-インテインmDnaE(配列T)
3xflag(配列E)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1182 pAAV2.1-CMV260-5’CEP290インテイン(セット4)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
5’CEP290:配列番号52
Figure 2022512718000057
Figure 2022512718000058
N-インテインDnaE(配列D)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1183 pAAV2.1-CMV260-CEP290本体インテイン(セット4)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
C-インテインDnaE(配列I)
CEP290本体:配列番号53
Figure 2022512718000059
N-インテインRma DnaB(配列Q)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1181 pAAV2.1-CMV260-3’CEP290インテイン(セット4/set5)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
C-インテインRma DnaB(配列R)
3’CEP290:配列番号54
Figure 2022512718000060
Figure 2022512718000061
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1179 pAAV2.1-CMV260-5’CEP290インテイン(セット5)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
5’CEP290:配列番号55
Figure 2022512718000062
N-インテインmDnaE(配列S)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1180 pAAV2.1-CMV260-CEP290本体インテイン(セット5)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
C-インテインmDnaE(配列T)
CEP290本体:配列番号56
Figure 2022512718000063
Figure 2022512718000064
N-インテインRma DnaB(配列Q)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1152 pAAV2.1-GRK1-5’CEP290インテイン(セット5)
5’ITR(配列A)
GRK1プロモーター(配列N)
5’CEP290:配列番号57
Figure 2022512718000065
N-インテインmDnaE(配列S)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
p1153 pAAV2.1-GRK1-CEP290本体インテイン(セット5)
5’ITR(配列A)
GRK1プロモーター(配列N)
C-インテインmDnaE(配列T)
CEP290本体:配列番号58
Figure 2022512718000066
Figure 2022512718000067
N-インテインRma DnaB(配列Q)
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
P1156 pAAV2.1-GRK1-3’CEP290インテイン(セット5)
5’ITR(配列A)
GRK1プロモーター(配列N)
C-インテインRma DnaB(配列R)
3’CEP290:配列番号59
Figure 2022512718000068
Figure 2022512718000069
3xflag(配列E)
WPRE(配列F)
BghポリA(配列G)
3’ITR(配列H)
pzac-GRK1-5’ABCA4インテイン(セット1)配列番号60
5’ITR(配列A)
GRK1:太字
5’ABCA4:下線
N-インテインNpu DnaE:二重下線
3xflag:斜体
SV40:太字下線
3’ITR(配列H)
Figure 2022512718000070
Figure 2022512718000071
pzac-GRK1-3’ABCA4インテイン(セット1)配列番号61
5’ITR(配列A)
GRK1:太字
3’ABCA4:下線
C-インテインNpu DnaE:二重下線
3xflag:斜体
SV40:太字下線
3’ITR(配列H)
Figure 2022512718000072
Figure 2022512718000073
Figure 2022512718000074
pzac-CMV260-5’ABCA4インテイン(セット1)配列番号62
5’ITR(配列A)
CMV260:太字
5’ABCA4:下線
N-インテインNpu DnaE:二重下線
3xflag:斜体
SV40:太字下線
3’ITR(配列H)
Figure 2022512718000075
Figure 2022512718000076
Figure 2022512718000077
pzac-CMV260-3’ABCA4インテイン(セット1)配列番号63
5’ITR(配列A)
CMV260:太字
3’ABCA4:下線
C-インテインNpu DnaE:二重下線
3xflag:斜体
SV40:太字下線
3’ITR(配列H)
Figure 2022512718000078
Figure 2022512718000079
Figure 2022512718000080
p38 pAAV2.1-CMV260-5’ABCA4インテイン_ecDHFR(セット1)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
5’ABCA4(セット1から)
N-インテインNpu DnaE(配列D)
3xflag(配列E)
ecDHFR(配列O)
WPRE(配列F)
SV40ポリA(配列W)
3’ITR(配列H)
p39 pAAV2.1-CMV260-5’ABCA4インテイン_ミニecDHFR(セット1)
5’ITR(配列A)
CMV260(配列U)
5’ABCA4(セット1から)
N-インテインNpu DnaE(配列D)
3xflag(配列E)
ミニecDHFR(配列P)
WPRE(配列F)
SV40ポリA(配列W)
3’ITR(配列H)
p40 pAAV2.1-GRK1-5’ABCA4インテイン_ecDHFR(セット1)
5’ITR(配列A)
GRK1(配列N)
5’ABCA4(セット1から)
N-インテインNpu DnaE(配列D)
3xflag(配列E)
ecDHFR(配列O)
WPRE(配列F)
SV40ポリA(配列W)
3’ITR(配列H)
p41 pAAV2.1-GRK1-5’ABCA4インテイン_ミニecDHFR(セット1)配列番号64
5’ITR(配列A)
GRK1:太字
5’ABCA4:下線
N-インテインNpu DnaE:二重下線
3xflag:斜体
ミニecDHFR:太い下線
SV40:太字下線
3’ITR(配列H)
Figure 2022512718000081
Figure 2022512718000082
pzac-CMV260-5’ABCA4インテイン(セット2)配列番号65
5’ITR(配列A)
CMV260:太字
5’ABCA4:下線
N-インテインNpu DnaE:二重下線
3xflag:斜体
SV40:太字下線
3’ITR(配列H)
Figure 2022512718000083
Figure 2022512718000084
Figure 2022512718000085
pzac-CMV260-3’ABCA4インテイン(セット2)配列番号66
5’ITR(配列A)
CMV260:太字
3’ABCA4:下線
C-インテインNpu DnaE:二重下線
3xflag:斜体
SV40:太字下線
3’ITR(配列H)
Figure 2022512718000086
Figure 2022512718000087
Figure 2022512718000088
pzac-CMV260-5’ABCA4インテイン(セット3)配列番号67
5’ITR(配列A)
CMV260:太字
5’ABCA4:下線
N-インテインNpu DnaE:二重下線
3xflag:斜体
SV40:太字下線
3’ITR(配列H)
Figure 2022512718000089
Figure 2022512718000090
Figure 2022512718000091
pzac-CMV260-3’ABCA4インテイン(セット3)配列番号68
5’ITR(配列A)
CMV260:太字
3’ABCA4:下線
C-インテインNpu DnaE:二重下線
3xflag:斜体
SV40:太字下線
3’ITR(配列H)
Figure 2022512718000092
Figure 2022512718000093
Figure 2022512718000094
p836(IRBP_DsRed)配列番号69
5’ITR(配列A)
IRBP 太字
WPRE:斜体下線
DsRed 下線
BghpA:太字下線
3’ITR(配列H)
Figure 2022512718000095
P1232 pAAV2.1_HLP_5’F8インテイン(セット1)
5’ITR(配列A)
HLPプロモーター(配列J)配列番号70
Figure 2022512718000096
F8シグナル配列(配列K)配列番号71
Figure 2022512718000097
5’F8:配列番号72
Figure 2022512718000098
Figure 2022512718000099
Figure 2022512718000100
N-インテインNpu DnaE(配列D)
3xflag(配列E)
shポリA(配列V)
3’ITR(配列H)
p1389 pAAV2.1_HLP_3’F8インテイン(セット1)
5’ITR(配列A)
HLPプロモーター(配列J)
F8シグナル配列(配列K)
C-インテインNpu DnaE(配列I)
3’F8:配列番号73
Figure 2022512718000101
Figure 2022512718000102
Figure 2022512718000103
3xflag(配列E)
shポリA(配列V)
3’ITR(配列H)
p1207 pAAV2.1_HLP_5’F8インテイン(セット2)
5’ITR(配列A)
HLPプロモーター(配列J)
F8シグナル配列(配列K)
5’F8(セット2):配列番号74
Figure 2022512718000104
Figure 2022512718000105
N-インテインNpu DnaE(配列D)
3xflag(配列E)
shポリA(配列V)
3’ITR(配列H)
p1388 pAAV2.1_HLP_3’F8インテイン(セット2)
5’ITR(配列A)
HLPプロモーター(配列J)
F8シグナル配列(配列K)
C-インテインNpu DnaE(配列I)
3’F8:配列番号75
Figure 2022512718000106
Figure 2022512718000107
3xflag(配列E)
shポリA(配列V)
3’ITR(配列H)
ここで、本発明を非限定的な例を用いて説明する。
材料及び方法
AAVベクタープラスミドの作成
AAVベクターの作製に使用したプラスミドは、AAV血清型2型のITRを含むpAAV2.1(36)又はpZac(37)のいずれかのプラスミドから得た。AAVインテインプラスミドは図1A及び図S5に詳述するとおり設計した。EGFPタンパク質はアミノ酸(a.a.)C71で分断した。ABCA4タンパク質は大型細胞質ドメインCD1(34、35)中のa.a.C1150(セット1)、a.a.S1168(セット2)及びa.a.C1090(セット3)で分断した。a.a.C1150(セット1)及びS1168(セット2)は、既知のABCA4機能に関連しない領域内にあるが、C1090は、a.a.929からa.a.1148にわたるABCA4ヌクレオチド結合ドメインに含まれる。全てのCEP290分断点がコイルドコイルドメインに入っている(36):CEP290を2つのポリペプチドに分断したとき、これはa.a.C1076(セット1)又はS1275(セット2~3)のいずれかに現れ、それを3つのポリペプチドに分断したとき、これはa.a.C929及びC1474(セット4)又はa.a.S453及びC1474(セット5)のいずれかにあった。
プラスミドに含まれるインテインは、ノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)(Npu)からのDnaEのインテイン(27、28)又はそれぞれNpu及びシネコシスティス属種(Synechocystis sp.)PCC6803株(Ssp)のDnaEからの突然変異型N-及びC-インテインで構成されるインテイン(30)又はロドサーマス・マリヌス(Rhodothermus marinus)(Rma)からのDnaBのインテイン(29)のいずれかであった。本研究に使用したプラスミドは、遍在性サイトメガロウイルス(CMV)(38)及びショートCMV(39)プロモーター又は光受容体特異的ヒトGタンパク質共役受容体キナーゼ1(GRK1)40プロモーターのいずれかの制御下にあった。EGFP及びCEP290をコードするプラスミドはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(bGHpA)を含んだ一方、ABCA4をコードするプラスミドはシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化シグナルを含んだ。
AAVベクターの作製及び特徴付け
TIGEM AAV Vector Coreにより、既述のとおり(14、41)のHEK293細胞の三重トランスフェクションによってAAVベクターが作製された。AAVベクターがインテイン配列を含むか否かの間でベクター収率に差は認められなかった。
細胞のトランスフェクション及びAAV感染
HEK293細胞を維持し、既述のとおり(14)のリン酸カルシウム法(6ウェルプレートフォーマットで1μgの各プラスミド/ウェル)を用いてトランスフェクトした。図S9に説明する実験については、完全長遺伝子をコードするプラスミドの量は、1μgのAAVインテインプラスミドに含まれるのと同じ数の分子に対応する量を使用した。必要に応じてスクランブルプラスミドを加えることにより、各ウェルにおけるトランスフェクトしたDNAの総量を同じに保った。
図2C及び図2Dの実験に使用するHeLa細胞をLipofectamine LTX(Invitrogen)を使用してトランスフェクトした(24ウェルプレートフォーマットで1μg又は0.5μgのいずれかの各プラスミド/ウェル)。既述のとおり(14)AAV感染を実施した。
iPSC及び網膜分化培養
(42)に記載される方法を用いて皮膚生検から培養した線維芽細胞からヒト人工多能性幹細胞(iPSC)を誘導した。STGD1細胞株は、(43)にも記載されるABCA4化合物ヘテロ接合変異体c.4892T>C及びc.4539+2001G>A又は化合物ヘテロ接合変異体c.[2919-?_3328+?del;4462T>C]及びc.5196+1137G>Aのいずれかを担持する。c.[2919-?_3328+?del;4462T>C]は2つのバリエーションからなるアレルである。c.2919-?3328+?delは、エクソン20、21及び22の欠失並びにイントロン19及び22の未知のセグメントを構成する。この欠失は、c.4462T>Cとシス配置で見られた。iPSCは、マトリゲル(品番354277、Corning(登録商標)Matrigel(登録商標)hESC適格マトリックス;Corning、NY)をコートした6ウェルプレートにmTeSR(商標)培地(品番85850;Stem cell technologies)を入れて維持した。細胞は約80%コンフルエンスで、0.5mM EDTA(品番AM9260G;Ambion)を2~6分間使用して継代した。網膜分化は、以前記載されたプロトコル(44、45)の組み合わせに基づいた。簡潔に言えば、iPSCをRevitaCell Supplement(品番A-2644501;Gibco、ThermoFisher)及び1%マトリゲルが入ったV字底96ウェルプレートに播いて(9,000細胞/ウェル)、凝集体の形成を誘導した。次に、(46)に報告されるとおり、凝集体を培養して3D網膜オルガノイドを作成した。
ウエスタンブロット分析及びELISA
試料(HEK293細胞、網膜及び網膜オルガノイド)をRIPA緩衝液に溶解させてEGFP、ABCA4及びCEP290タンパク質を抽出した。溶解緩衝液には、プロテアーゼ阻害薬(完全プロテアーゼ阻害薬カクテル錠;Roche、Basel, Switzerland)及び1mMフェニルメチルスルホニルを補足した。溶解後、ABCA4試料は、2M尿素を補足した1×レムリ試料緩衝液中37℃で15分間変性させた。EGFP及びCEP290試料は、1×レムリ試料緩衝液中99℃で5分間変性させた。ライセートを12%(EGFP試料について)又は6%(ABCA4及びCEP290試料について)のいずれかのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。免疫ブロッティングに使用した抗体は以下のとおりである:EGFP、ABCA4及びCEP290タンパク質の検出用の抗3xflag(1:1000、A8592;Sigma-Aldrich、Saint Louis, MO, USA);ABCA4の検出用の抗ABCA4(1:500、LS-C87292;LifeSpan BioSciences, Inc.、Seattle, USA);抗フィラミンA(1:1000、品番4762;Cell Signaling Technology、Danvers, MA, USA);フィラミンAの検出用の抗β-アクチン(1:1000、NB600-501;Novus Biological LLC、Littleton, CO, USA)、β-アクチンをインビトロ実験のローディング対照として使用した;インビボ実験のローディング対照として使用したジスフェリンの検出用の抗ジスフェリン(1:500、ジスフェリン、クローンHam1/7B6、MONX10795;Tebu-bio、Le Perray-en-Yveline, France)。ウエスタンブロットによって検出されたEGFP、ABCA4及びCEP290バンドの定量化は、ImageJソフトウェア(http://rsbweb.nih.gov/ij/においてフリーダウンロード可能である)を使用して実施した。
図21に示される実験については、AAVインテインベクターを注射したAbca4-/-マウス及び対照同腹仔Abca4+/-マウスの両方からの網膜ライセートを上記に記載のとおり30?の溶解緩衝液に溶解させて、それぞれ25又は5??のライセートを、抗ABCA4抗体(LS-C87292;エピトープ保存:ヒトABCA4について100%;マウスAbca4について86%)を使用したウエスタンブロットに使用した。次に、ImageJソフトウェアを使用したバンド強度の定量化により測定した網膜ライセート中のABCA4の量を、アクリルアミドゲルにロードした網膜ライセートの容積で正規化した。図9の実験については、この図に報告されるとおりの漸増用量のトリメトプリム(T7883、Sigma-Aldrich)でHEK293細胞を毎日処理した。
細胞又はマウス及びブタ網膜ライセートのいずれかに対し、Max Discovery緑色蛍光タンパク質キットELISA(Bioo Scientific Corporation、Austin, TX, USA)を使用してELISAを実施した。
rAAVベクターDNAのサザンブロット分析
1.5~6×1010個のウイルス粒子(GCとして測定した)からDNAを抽出した。パッケージングされなかったゲノムを消化するため、ベクター溶液を、50mMトリス、pH7.5及び1mM MgClを含有する300μlの総容積中30μlのDNアーゼ(Roche)と共に37℃で2時間インキュベートした。次にDNアーゼを50mM EDTAで不活性化し、続いてプロテイナーゼK及び2.5%N-ラウリルサルコシル溶液と共に50℃で1時間インキュベートしてカプシドを溶解させた。DNAをフェノールクロロホルムで2回抽出し、2容量のエタノール100%及び10%酢酸ナトリウム(3M)及び1?のグリコーゲン(20?g)で沈殿させた。アルカリアガロースゲル電気泳動を以前に記載のとおり実施した(Sambrook, J., and Russell, D.W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA. 999 pp)。pF8-V3をSmalで二重消化することによりマーカーを生じさせると、5102bpのバンドが生じた。HLPプロモーターに特異的なプローブを使用した。
活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)
9部の血液を後眼窩採血により1部の緩衝クエン酸三ナトリウム0.109M(BD、Franklin Lakes, NJ, USA)の中に採取した。試料を13000rpmで15分間遠心することにより血漿を単離した。
Coatron M4(Teco、Buende, Germany)で製造者のマニュアルに従いaPTTプログラムを用いてaPTTを測定した。
免疫沈降及び液体クロマトグラフィー/マススペクトロメトリー分析
細胞を100mmプレートに播き(1×10細胞/プレート)、リン酸カルシウム法を用いてAAV-EGFP又はABCA4インテインプラスミドのいずれかを懸濁液中でトランスフェクトした(20μgの各プラスミド/プレート)。トランスフェクション後72時間で細胞を回収し、抗flag M2磁気ビーズ(M8823;Sigma-Aldrich)を製造者の指示に従い使用してEGFP及びABCA4の両方のタンパク質を免疫沈降させた。4M尿素を補足した試料緩衝液中において37℃で15分間インキュベートすることにより、ビーズからタンパク質を溶出させた。次に12%(EGFPについて)又は6%(ABCA4について)SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にタンパク質をロードした。クマシーブルーで染色した後に切り出した26本及び30本のタンパク質バンド(AAV-EGFP及びABCA4インテインプラスミドをそれぞれ独立に2回及び3回トランスフェクトしたHEK293細胞から)を使用してタンパク質シーケンシングを行った(Creative proteomics、Shirley, NY)。簡潔に言えば、3つのゲルスライドを以下の酵素:トリプシン、キモトリプシン、Glu-C、Arg-C、Asp-N及びLys-Nの各々による消化に使用した。加えてペプシンを使用してABCA4を消化した。得られたペプチドを、ナノスケール液体クロマトグラフィー結合タンデム型マススペクトロメトリー(ナノLC-MS/MS)分析を用いて同定し、定量化した。入手されたマススペクトロメトリーデータをPEAKS STUDIO 8.5を用いて分析した。本発明者らは、EGFP及びABCA4の両方のタンパク質について100%のタンパク質シーケンスカバレッジを達成した。
動物モデル
動物はTIGEM動物施設(Naples)で飼育し、12時間の明/暗サイクル下に維持した。C57BL/6JマウスはEnvigo(Italy)から購入した。
BALB/cマウス(Rpe65 Leu450に関してホモ接合)との連続的な交雑及び戻し交雑によりアルビノAbca4-/-マウスを生じさせ、近交系を維持した。BXD24/TyJ-Cep290rd16/J(rd16と称される)マウスをThe Jackson Laboratory(JAXストック番号000031)から輸入した。rd16マウスは、エクソン35~39を包含する897bpのインフレーム欠失を保有している(46)。ホモ接合の雌をホモ接合の雄と交雑することによりマウスを維持した。血友病マウスB6;129S-F8tm1Kaz/J(F8tm1と称される)をThe Jackson Laboratory(JAXストック番号004424)から輸入した。F8tm1マウスは、エクソン16の3’末端部の7bp及びイントロン16の5’末端部の286bpを含む293bpの配列を置き換えるネオマイシン耐性カセットを有する。ホモ接合の雌を半接合の雄と交雑することによりマウスコロニーを維持した。
本研究に使用したラージホワイト雌ブタ(Azienda Agricola Pasotti、Imola, Italy)は、Italian National Pig Breeders’AssociationのLWHerd Bookに純血種として登録されていたものであり、Centro di Biotecnologie A.O.R.N. Antonio Cardarelli(Naples, Italy)において飼育し、12時間の明/暗サイクル下に維持した。
マウス及びブタにおけるAAVベクターの網膜下注射
本研究は、視覚と眼科学研究協会会議(Association for Research in Vision and Ophthalmology)の眼科学と視覚研究における動物の使用に関する声明(Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)及びイタリア保健省の動物処置規則に従い行った。マウスに関する全ての処置は、イタリア保健省;公衆衛生・動物衛生・栄養食品安全局(Department of Public Health, Animal Health, Nutrition and Food Safety)から2015年3月6日付けで承認された。
マウス及びブタにおける網膜下注射は、以前に(例えば14に)記載されたとおり実施した。マウス眼には1μl又は0.5μl(rd16子マウスについて)のいずれかのベクター溶液を注射した。AAV2/8用量は、「結果」の節に記載するとおり、マウス実験間で異なった。ブタ眼には100μlのAAV2/8ベクター溶液の2つの隣接する網膜下ブレブを注射した。AAV2/8用量は2×1011GCの各ベクター/眼であり、従って2つのAAVベクターの同時注入により総用量は4×1011GC/眼となった。
組織学、光学及び蛍光顕微鏡法
組織切片、網膜オルガノイドにおけるEGFP発現を評価するため、既述のとおりC57BL/6Jマウス及びラージホワイトブタの両方からの眼を固定し、切片化した。DAPIを含むVectashield(Vector Lab Inc.、Peterborough, UK)でマウントしたEGFP陽性凍結切片を共焦点LSM-700顕微鏡(Carl Zeiss、Oberkochen, Germany)下で適切な励起及び検出セッティングを用いて分析し、40倍の倍率で取得した。赤緑色盲の有病率から、赤色と緑色とが一緒に存在することを避けるため、図14では元の画像の色を変更した。
AAV CEP290インテインベクターを注射したrd16マウスの外顆粒層の厚さを評価するため、眼を4%パラホルムアルデヒド(PFA)に一晩固定し、続いて連続的なエタノールで脱水し、次にパラフィンブロックに包埋した。rd16マウスから水平経線に沿って連続横断切片(10μm)を切り出し、スライドに順次分配し、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色した。次に、切片を顕微鏡(Leica Microsystems GmbH;DM5000)下で分析し、20倍の倍率で取得した。分析には、眼の中心領域におけるスライスの耳側注入サイドからの画像を各眼につき1枚使用した。各画像において、遺伝子型/治療群を知らされない操作者がImageJソフトウェアの「フリーハンド線」ツールを用いて3つのONL厚さ測定値を取った。
免疫蛍光分析
ABCA4又はCEP290 AAVインテインプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたHeLa細胞をトランスフェクション後24時間で4%PFAに10分間固定した。細胞をブロッキング緩衝液(0.05%サポニン、0.5%BSA、50mM NHCl、PBS中0.02%NaN、pH7.2)で30分間ブロッキングし、次に以下のとおりインキュベートした:
- 抗FLAG M2抗体(F1804、Sigma-Aldrich)と共に1時間インキュベートしてABCA4タンパク質を検出した;抗VAP-B抗体[Antonella De Matteis lab((47)で作製された]と共にインキュベートして、小胞体を染色し、且つTGN46(AHP-499、Serotech)と共にインキュベートしてトランスゴルジ網を染色した。PBSで洗浄後、細胞を二次抗体と共に30分間インキュベートした:それぞれ抗FLAG、抗VAP-B及び抗TGN46抗体に対するヤギ抗マウスAlexa Fluor 568;ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488、ロバ抗ヒツジAlexa Fluor 633。
- 抗FLAG抗体(F7425、Sigma-Aldrich)と共に一晩インキュベートしてCEP290タンパク質を検出し、且つ抗アセチル化チューブリン抗体(T6793、Sigma-Aldrich)と共にインキュベートして微小管を染色した。PBSで洗浄後、細胞を適切な二次抗体と共に1時間インキュベートした:それぞれ抗FLAG及び抗アセチル化チューブリン抗体に対するヤギ抗ウサギAlexa Fluor 594及びロバ抗マウスAlexa Fluor 488。
核をDAPIで染色した。赤緑色盲の有病率から、赤色と緑色とが一緒に存在することを避けるため、図2C~図2D及び図18の両方で元の画像の色を変更している。
ヒト網膜オルガノイドの免疫蛍光法に使用した抗体は以下のとおりである:
抗ヒト錐体アレスチン(CAR)(50、51)(1:10000、「Luminaire founders」hCAR;Cheryl M. Craft博士、ドヘニー眼研究所(Doheny Eye Institute)、Los Angeles, CA, USAからの供与);抗オプシン、赤/緑(1:200、AB5405;Merck Millipore、Darmstadt, Germania);抗リカバリン(1:500、AB5585;Merck Millipore);抗CRX(A-9、1:250、sc377138;Santa Cruz Biotechnology、Dallas, Texas, USA);抗ロドプシン(1D4、1:200、ab5417、Abeam、Cambridge, MA, USA)。
透過型及び走査型電子顕微鏡分析
電子顕微鏡(EM)分析のため、AAV網膜下注射後3ヵ月の時点でAbca4-/-マウスを一晩暗順応させて、次に眼を摘出した。眼を0.1M PHEM緩衝液pH6.9中0.2%グルタルアルデヒド(GA)-2%PFAに18時間固定し、次に0.1M PHEM緩衝液でリンスした。次に眼を光学顕微鏡下で解剖して眼杯の耳側注入領域を選択した。続いて眼杯のこの部分を、2.3Mスクロースを注入した12%ゼラチンに包埋した。凍結切片(60nm)を液体窒素に凍結し、Leica Ultramicrotome EM FC7(Leica Microsystems)を用いて切り出した。様々な実験群に帰されるデータ属性のバイアスを回避するため、網膜色素上皮においてリポフスチン顆粒が占める面積の測定は、遺伝子型/治療群を知らされていない操作者がiTEMソフトウェア(Olympus SYS、Hamburg, Germany)を用いて実施した。各視野における各リポフスチン顆粒の面積は、少なくとも20枚の異なる画像(25μm面積)でiTEMソフトウェアの「フリーハンド多角形」ツールを用いて測定した。
走査型電子顕微鏡(SEM)分析のため、網膜オルガノイドをGAに固定し、OsO4で染色し、エタノールで脱水し、臨界点乾燥手順を用いて乾燥させた。次に、乾燥させた標本をSEM標本スタブにマウントし、金の薄層で覆った。標本の表面三次元構成を分析し、JEOL 6700F走査型電子顕微鏡(日本電子株式会社、東京、日本)を使用して画像を取得した。
超微細構造分析のため、網膜オルガノイドを0.2M PHEM緩衝液pH7.3中の2%PFA及び1%GAの混合物で一晩固定した。固定後、標本を以前に記載のとおり後固定した。次にそれらの標本を脱水し、エポキシ樹脂に包埋し、60℃で72時間重合させた。Leica EM UC7ミクロトームで60nm連続薄切片を切り出した。
VELETTA CCDデジタルカメラ(FEI、Eindhoven, The Netherlands)を備えたFEI Tecnai-12電子顕微鏡を使用してEM画像を取得した。
電気生理学的記録及びスペクトル領域光干渉断層撮影法
機能的及び形態学的分析を既述のとおり実施した(14)。
瞳孔対光反応
電荷結合素子NikonD1Hデジタルカメラ(Topcon Biomedical Systems、Oakland, NJ)に接続したTRC-50IX網膜カメラを使用して、暗条件でrd16マウスからの瞳孔対光反応を記録した。マウスに10ルクスの光刺激を約10秒間当て、IMAGEnetソフトウェア(Topcon Biomedical Systems)を使用して各眼につき1枚の写真を取得した。眼毎に瞳孔径を眼の直径(耳側から鼻側まで)で正規化した。
統計的分析
一元配置ANOVA検定(パラメトリック検定)又はクラスカル・ワリス順位和検定(ノンパラメトリック検定)を実施して、独立変数の2つ以上の群間で従属変数に関して統計的に有意な差があるかどうかを決定した。P値は以下のとおりである:EGFPタンパク質定量化のためのELISAアッセイ、インビトロでの定量化(p クラスカル・ワリス=0.006036)、マウス網膜における定量化(p ANOVA=0.00585)及びブタ網膜における定量化(p クラスカル・ワリス=0.009005);図5A(p ANOVA=0.00585);図5B(p クラスカル・ワリス=5.547E-5);図5C(p ANOVA=5.81E-10);ERG分析(a波振幅及びb波振幅の両方について分析した全ての輝度で、p ANOVA又はp クラスカル・ワリス>0.05);図S14のOCT分析(ABCA4についてp ANOVA=0.52及びCEP290についてp ANOVA=0.965)。群平均値間の多重対比較で決定した群間の統計的に有意な差は以下である:EGFPタンパク質定量化のためのELISAアッセイ、インビトロでの定量化(シングルAAV対デュアルAAV=0.012;AAVインテイン対デュアルAAV=0.012;シングルAAV対AAVインテイン=0.222)、マウス網膜における定量化(シングルAAV対デュアルAAV=0.0044;AAVインテイン対デュアルAAV=0.3754;シングルAAV対AAVインテイン=0.0561)及びブタ網膜における定量化(シングルAAV対デュアルAAV=0.012;AAVインテイン対デュアルAAV=0.012;シングルAAV対AAVインテイン=0.841);図5A:+/+対-/-AAVインテイン=0.4530;+/+対-/-=0.0002;図5B:野生型対rd16 AAVインテイン=0.00131;図5C:野生型対rd16 AAVインテイン1E-07;野生型対rd16 neg<1E-06。
実施例1.AAV-EGFPインテインはインビトロで完全長タンパク質を再構成する
本発明者らは、網膜におけるインテイン媒介性タンパク質トランススプライシングの効率を試験した;ノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)[Npu 図1A]由来のDnaEスプリットインテインのN端側及びC端側半分にそれぞれ融合したレポーターEGFPタンパク質のN端側又はC端側半分のいずれかをそれぞれコードする2つのAAVベクターを作成した。EGFPタンパク質はアミノ酸(a.a.)C71で分断した。各AAVベクターに適切な調節エレメント(即ちプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(bGHpA)及び三重flagタグ(3xflag)を含めることにより、両方の半分部分並びに完全長の再構成されたEGFPタンパク質の検出を可能にした(図1A)。
AAV-EGFP Dna Eインテインプラスミドを使用してヒト胎児腎臓293(HEK293)細胞をトランスフェクトし、単一のN端側及びC端側半分並びに完全長EGFPタンパク質の産生を評価した。図12に示されるとおり、完全長EGFPをコードするシングルAAVプラスミドをトランスフェクトした細胞で観察されるものと比較して、AAV-EGFPインテインプラスミドをコトランスフェクトした細胞ではEGFP蛍光が検出されが、シングルN端側及びC端側AAV-EGFPインテインプラスミドでは検出されなかった。図1Bに示されるとおり、HEK293細胞ライセートのウエスタンブロット(WB)分析により、両方のAAV-EGFPインテインプラスミドのコトランスフェクション後にのみ、予想されたサイズ(約28kDa)のトランススプライシングされたEGFPタンパク質の存在が、成熟タンパク質からスプライスアウトされたDnaEインテイン(約17kDa)と共に確認された。加えて、バンド強度の定量化から、AAVインテインプラスミドからのEGFPタンパク質量は、シングルAAVプラスミドから観察された量の76±37%(n=3つの独立した実験)であったことが示された。タンパク質再構成の正確さを定義付けるため、AAV-EGFPインテインプラスミドをトランスフェクトしたHEK293細胞からEGFPを免疫精製し、液体クロマトグラフィー・マススペクトロメトリー(LC-MS)分析を実施してそのタンパク質配列を定義付けた。この試料のタンパク質分解消化から得られた3539個のペプチド(そのうちの7個が分断点を含んだ(表5))は全タンパク質を網羅しており、AAVインテインプラスミドによって再構成されたEGFPのアミノ酸配列が野生型EGFPに正確に対応することが確認された。
Figure 2022512718000108
実施例2.AAV-EGFPインテインはインビトロでデュアルAAVベクターよりも効率が高い
AAVインテインベクターからのEGFPタンパク質の再構成を確認するため、HEK293細胞をAAV2/2-CMV-EGFP DnaEインテイン又は同じ発現カセットを含むシングル及びデュアルAAVベクターのいずれかに感染させた。感染多重度(m.o.i)、5×10ゲノムコピー(GC)/細胞の各ベクター、これはつまり、デュアルベクターが完全なDNA又はタンパク質組換えを起こすと仮定して3つのシステム間で同程度の用量であることを意味する。EGFP量を精密に定量化するため、感染後72時間で細胞ライセートを回収した。EGFP発現をWB及び酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の両方により評価した:図1Cに示されるとおり、AAVインテインベクターで達成されたEGFP発現は、シングルAAVで実現したもののおよそ半分であり(シングルAAV=0.735±0.2ng EGFP/μgライセート総量、n=5つの独立した実験;AAVインテイン=0.403±0.04ng EGFP/μgライセート総量、n=5つの独立した実験)及びデュアルAAVベクターで達成されたものと比べて10倍高かった(デュアルAAV=0.046±0.01ng EGFP/μgライセート総量、n=5つの独立した実験)。更に、切り出されたインテインと比べた完全長EGFPの強度をWBにより定量化した;その相対的な存在量は1:0.2であることが分かった(n=6つの独立した実験、図13A)。
実施例3.AAV-EGFPインテインベクターの網膜下投与により、マウス及びブタ網膜において効率的な完全長タンパク質再構成が生じる
AAVインテイン媒介性トランススプライシングが網膜において完全長タンパク質発現を再構成するかどうかを調べるため、4週齢C57BL/6JマウスにAAV2/8-CMV-EGFP DNA Eインテインベクター(各ベクターの用量/眼:5.8×10GC)を網膜下注射した。1ヵ月後に眼を摘出し、顕微鏡分析により分析した。全ての眼で網膜色素上皮及び最も重要なことに光受容体にEGFP蛍光が検出された(図1D)。光受容体におけるAAVインテインからのトランス遺伝子発現をシングル及びデュアルAAVと比較するため、光受容体特異的ヒトGタンパク質共役受容体キナーゼ1(GRK1)プロモーターの制御下でEGFPをコードするAAV2/8ベクターを4週齢C57BL/6Jマウスに網膜下注射した(各ベクターの用量/眼:5×10GC)。注射後1ヵ月で眼を摘出し、蛍光顕微鏡法、ELISA又はWBのいずれかにより分析した。
図1Eに見られるとおり、いずれのベクターセットを注射した眼においても光受容細胞層にEGFP蛍光が検出された。ELISAによるEGFPタンパク質量の精密な定量化により、AAVインテインはEGFPタンパク質をシングルAAVよりも低い効率及びデュアルAAVよりも約3倍高い効率で再構成したことが確認された(シングルAAV=8.41±2.48ng EGFP/網膜、n=5個の眼;AAVインテイン=3.72±0.85ng EGFP/網膜、n=7個の眼;デュアルAAV=1.38±0.43ng EGFP/網膜、n=7個の眼)。WBバンド強度を定量化した後の完全長EGFPの切り出されたインテインとの相対量は1:3であった(分析したn=14個の眼、図13B)。
次に本発明者らは、そのサイズ及び構成上、ウイルスベクター形質導入の評価に優れた前臨床モデルであるブタ網膜で、光受容体の形質導入におけるAAVインテインベクターの効率を評価した((48)。従って、ラージホワイトブタに、シングル、インテイン及びデュアルAAV2/8-GRK1-EGFPベクターを網膜下注射した(各ベクターの用量/眼:2×1011GC、2つの隣接する網膜下ブレブから送達した)。注射後1ヵ月で眼を摘出し、蛍光顕微鏡法、ELISA又はWBのいずれかにより分析した。注目すべきことに、AAVインテインの媒介による光受容細胞層におけるEGFPタンパク質再構成は、EGFP蛍光により判定したとき、デュアルAAVによって媒介されるものと比べて高く、シングルAAVベクターと区別がつかないものであった(図1F)。網膜ライセートにおけるEGFPの精密な定量化により、AAVインテインがシングルAAVで実現するのと同程度及びデュアルAAVベクターで達成されるよりも約3倍多い量のタンパク質を再構成することが確認された(シングルAAV=247.5±45.1ng EGFP/網膜、n=5個の眼;AAVインテイン=227.0±15.7ng EGFP/網膜、n=5個の眼;デュアルAAV=82.3±9.6ng EGFP/網膜、n=5個の眼)。WBバンド強度を定量化した後の完全長EGFPの切り出されたインテインとの相対量は1:2であった(n=8個の眼、図13C)。
実施例4.3Dヒト網膜オルガノイドにおいてAAV媒介性タンパク質トランススプライシングにより完全長EGFPが再構成される。
ヒト網膜を代表する更なる前臨床モデルとして、本発明者らは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から3D網膜オルガノイドを作成した((49、50)。6ヵ月齢オルガノイド(図14A)は、図14Bに示されるとおり成熟光受容体マーカーによって染色される細胞を含んだ;図14Cに蛍光分析により示されるとおり、光受容体特異的プロモーターを含むAAV2ベクター、即ちAAV2/2 CMV EGFP及びAAV2/2 IRBP DsRedベクターによってこれらのオルガノイドを形質導入することに成功した。光学顕微鏡法(図14D)及び電子顕微鏡法(図14E~図14F)では、光受容体外節の芽体の存在が見られる。AAV-GRK1-EGFPインテインベクター(各ベクターの用量/オルガノイド:1×1012GC)と共に30日間インキュベートした9ヵ月齢3Dヒト網膜オルガノイドはEGFP蛍光を示す(図1G)。網膜オルガノイドライセートのWB分析(図15)により、バンド強度定量化(n=4個のオルガノイド)後に完全長EGFP発現が切り出されたインテインと比べて約5倍多いことが確認される。
実施例5.インテインの媒介による大型タンパク質のトランススプライシング(効率的なAAVインテイン媒介性タンパク質トランススプライシングには、最適なABCA4及びCEP90分断点を同定する必要がある)
タンパク質トランススプライシングを大型治療用タンパク質の再構成機構として開発できるかどうかを試験するため、本発明者らはAAV-ABCA4及び-CEP290インテインベクターを開発した。
ABCA4及びCEP290を2つの断片(AAV I、AAV II)又は3つの断片(AAV I、AAV II、AAV III)のいずれかに分断し、図16に示されるとおり、そのコード配列を別々にシングルAAVベクターに、スプリットインテインN端部及びC端部のコード配列と融合してクローニングした。AAVインテインベクターは遍在性ショートCMVプロモーター[(shCMV)、全てのセットについて]又はGRK1プロモーター(ABCA4についてセット1及びCEP290についてセット5)のいずれかを含んだ。
各タンパク質の分断点は、効率的なタンパク質トランススプライシングのための接合点におけるアミノ酸残基の要件18、51)並びに決定的に重要なタンパク質ドメインの完全性の維持(これは各独立したポリペプチドの正しい折り畳み及び安定性に有利に作用するはずである)、従って最終的に再構成されるタンパク質の完全性の維持を考慮して選択した。追加的なスプリットインテインも検討した。トランス遺伝子発現を増加させるためウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント[WPRE、(52)]を含めることが可能となるように、タンパク質を3つのポリペプチドに分断したCEP290セット(セット4及び5、図16B)を作成した。完全長タンパク質の生成量を低下させる可能性のあるAAV IとAAV IIIとの間の望ましくないトランススプライシングを防ぐため、セット4及び5には2つの分断接合部に2つの異なるスプリットインテイン、具体的には、本発明者らが交差反応しないことを示している(図17)ロドサーマス・マリヌス(Rhodothermus marinus)からのDnaBインテイン及び野生型又は突然変異型のいずれかのDnaEインテインを含めた。
本発明者らは、AAVインテインプラスミドの各セットがHEK293細胞のトランスフェクション後にABCA4及びCEP290を再構成する能力を比較した。トランスフェクション後72時間での細胞ライセートのWB分析により、AAVインテインプラスミドの各セットから予想されたサイズ(それぞれ約250kDa及び約290kDa)の完全長ABCA4及びCEP290タンパク質が再構成されたことが示され、しかし、効率は、様々であった(図2A~図2B)。ABCA4及びCEP290タンパク質の再構成には、それぞれセット1及び5が最も効率が高いことが見出され、従ってこれらを続く全ての実験に使用した。
タンパク質再構成の正確さを定義付けるため、本発明者らは、セット1をトランスフェクトしたHEK293細胞からABCA4を免疫精製し、LC-MS分析を実施してそのタンパク質配列を定義付けた。この試料のタンパク質分解消化から得られた3108個のペプチド(そのうちの22個が分断点を含んだ(表6))は全タンパク質を網羅しており、AAVインテインプラスミドによって再構成されたABCA4のアミノ酸配列が野生型ABCA4に正確に対応することが確認された。AAVインテインによって再構成されたABCA4のアミノ酸配列は野生型ABCA4のアミノ酸配列と一致する。野生型ABCA4配列とAAVインテインから再構成されたABCA4の液体クロマトグラフィー・マススペクトロメトリー分析で同定されたペプチドとの間のアラインメントを実施した。
Figure 2022512718000109
Figure 2022512718000110
次に本発明者らは、様々なインテイン含有プラスミドのタンパク質産物の細胞内局在性について、それらを完全長タンパク質の局在性と比較して判定した。完全長ABCA4は、培養細胞株で発現させたとき小胞体(ER)に局在することが公知である(53、54)。セット1からの2つのABCA4ポリペプチドがERに共局在することが認められた一方、トランスゴルジ網に共局在化は認められなかった(図2C)。両方のAAVインテインプラスミドをコトランスフェクトした細胞並びに完全長ABCA4タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトした細胞で同様の局在性が観察され、従って細胞株で外因的に発現させたABCA4のERにおける優勢な局在性が確認された)。
CEP290に関しては、完全長タンパク質が優勢な点状パターンと少数の繊維状パターンとの混合型の分布パターンを示すことが報告されている(55)。CEP290の細胞内ターゲティングに関与するドメインの解析により、N端側ドメイン(a.a.1~362)が、その膜との相互作用能力のおかげでタンパク質を小胞構造に標的化させる一方、タンパク質のミオシン尾部相同ドメインの大部分を包含するCEP290のC端近傍領域は微小管結合を媒介し(a.a.580~2479)及びトランケート型として発現したとき、アセチル化チューブリン(Ac-Tub))に符合する顕著な繊維状の分布を有することが示された)。Drivas et al.と一致して、AAV I、II又はIIIインテインプラスミドのいずれかを単独でトランスフェクトするか、又はAAV I+II、AAV I+III及びAAV II+IIIをコトランスフェクトしたHeLa細胞に関する免疫蛍光分析により、AAV I及びAAV IIからの産物が優勢な点状パターンを有する一方、AAV III(タンパク質のミオシン尾部相同ドメインを包含する)からの産物は繊維状パターンを示し、Ac-tubに完全に共局在する唯一のものであることが示された(図2D)。従って、AAV I+IIからの産物は優勢な点状パターンを有する一方、AAV I+III及びAAV II+IIIからの産物は微小管繊維状及び点状組み合わせパターンを有する。3つのAAV CEP290インテインプラスミドをコトランスフェクトした細胞は、完全長CEP290タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトした細胞で観察されるシグナルと同等の、微小管に沿って部分的に整列した優勢な点状シグナルを示した(図2D及び図18)。
次に本発明者らは、AAV-ABCA4及び-CEP290インテインプラスミドの最良のセットで得られたタンパク質の量を、対応する完全長タンパク質をコードするシングルAAVプラスミドから得られた量と比較した。この目的で、HEK293細胞に同じ等モル量のシングル又はAAVインテインプラスミドのいずれかをトランスフェクトし、トランスフェクション後72時間で細胞ライセートをWBにより分析した(図19)。バンド強度の定量化により、AAVインテインプラスミドからのABCA4及びCEP290発現量が、それぞれ対応するシングルAAVプラスミドで観察された発現量の61±4%(n=3つの独立した実験)及び58±4%(n=3つの独立した実験)であったことが示された。
実施例6.AAVインテインベクターはインビトロで及び網膜において大型治療用タンパク質の発現を媒介する
本発明者らは、インビトロ並びにマウス及びブタ網膜の両方でAAVインテイン媒介性大型タンパク質再構成の効率をデュアルAAVベクターと比較した。ABCA4(セット1)又はCEP290(セット5)のいずれかをコードするAAV2/2デュアル又はインテインベクターのいずれかをHEK293細胞に感染させて(m.o.i:5×10GC/細胞の各ベクター)、72時間後に細胞ライセートをWBにより分析した。図3A及び図3Bに示されるとおり、AAV-ABCA4及び-CEP290インテインベクターは両方とも、大型タンパク質再構成をデュアルAAVベクターよりも高い効率で媒介した。予想どおり、完全長タンパク質に加えて、シングルAAVインテインベクター(ABCA4及びCEP290の両方の場合)に由来するか、又はAAV IIとAAV IIIとの間で起こるトランススプライシング(CEP290の場合)に由来するかのいずれかの、より短いポリペプチドが観察された(図3A及び図3B)。
更に、4週齢野生型マウスに、デュアルベクターとの比較でAAV-GRK1-ABCA4又は-CEP290インテイン(それぞれセット1及び5)を網膜下注射した(各ABCA4ベクターの用量/眼:3.3×10GC、各CEP290ベクターの用量/眼:1.1×10GC)。注射後4~7週間で動物を犠牲死させて、網膜ライセートのタンパク質発現をWBにより評価した。AAV-ABCA4インテイン注射眼の11個中10個(91%)(図4A及び図20)及びAAV-CEP290インテイン注射眼の10個中5個(50%)(図4B)に完全長タンパク質が検出された。逆に、ABCA4及びCEP290デュアルAAVベクターを注射した眼では、完全長タンパク質発現が明らかであるのは、それぞれ9個中5個(56%)及び5個中0個であった。インビトロで観察されたものと同様に、シングルAAVインテインベクター(ABCA4及びCEP290の両方の場合)及びAAV IIとAAV IIIとの間で起こるトランススプライシング(CEP290の場合)に由来するポリペプチドが検出された(図4A及び図4B)。
内因性との相対でのAAVインテインによって媒介されるタンパク質再構成の効率を調べるため、1~4ヵ月齢Abca4-/-マウスにAAV-GRK1-ABCA4インテインベクター(セット1)(各ABCA4ベクターの用量/眼:5.5×10GC)を網膜下注射した。1ヵ月後、非罹患マウス及びAAVインテインを注射したAbca4-/-マウスからの網膜ライセートのABCA4発現について、マウス及びヒトの両方のABCA4を認識する抗体を使用してWBにより分析した(図21)。AAVインテインABCA4発現量は内因性ABCA4の8.6±1.3%であることが分かった。
臨床的に関連性のあるブタ網膜での効率的な大型タンパク質再構成を確認するため、ラージホワイトブタにAAV2/8-GRK1-ABCA4インテイン(セット1)又はデュアルベクターのいずれか(各ベクターの用量/眼:2×1011GC、2つの隣接する網膜下ブレブから送達した)を網膜下注射し、注射後1ヵ月でタンパク質発現をWBにより分析した。注目すべきことに、AAVインテインは完全長ABCA4タンパク質をデュアルAAVベクターよりも高い効率で再構成することが分かった(図4C)。
最後に、121日間培養した時点[光受容体成熟が始まったとき(20)]における健常な個体又はSTGD1患者のいずれかのiPSCからのヒト網膜オルガノイドにAAV2/2-GRK1-ABCA4インテインベクター(セット1)(各ベクターの用量/オルガノイド:1×1012GC)を感染させた。オルガノイドを感染後20~40日の間に溶解させて、WBにより分析した。感染させた全てのオルガノイドで予想されたサイズのABCA4が検出された(図4D及び図22;n=3及びn=4、それぞれ正常対照及びSTGD1オルガノイドから)。
実施例7.AAVインテインベクターの網膜下投与はSTGD1及びLCA10マウスモデルの網膜表現型を改善する
AAVインテインベクターで達成される光受容体の形質導入が治療上意味のあるものであり得るかどうかを決定するため、STGD1(Abca4-/-)及びLCA10(rd16)のマウスモデルの網膜でそれらのベクターを試験した。
1ヵ月齢Abca4-/-マウスにAAV2/8-GRK1-ABCA4インテインベクター(セット1)(各ベクターの用量/眼:4.3~4.8×10GC)を網膜下注射した。3ヵ月後、眼を摘出し、網膜超薄切片の透過電子顕微鏡分析を実施して、Abca4-/-マウスの網膜色素上皮(RPE)に蓄積するリポフスチンの量を測定した(56、57)。注目すべきことに、RPEリポフスチン蓄積は、AAVインテインベクターを注射したAbca4-/-眼で有意に低下したが、陰性対照を注射した眼では低下しなかった(p値=0.0163;図5A及び図23)。
並行して、4~6日齢rd16マウスにAAV2/8-GRK1-CEP290インテインベクター(セット5)(各ベクターの用量/眼:5.5×10GC)を網膜下注射した。注射後1ヵ月での網膜切片の顕微鏡分析から、進行性網膜変性症の結果として(55)、野生型マウスと比較してrd16マウスでは光受容体核を含む外顆粒層(ONL)の厚さが有意に低下したことが示された(p値=0.00048;図5B)。注目すべきことに、AAVインテインベクターを注射したrd16網膜のONL厚さは陰性対照を注射したrd16網膜よりも有意に厚かった(約60%、p値=0.00281)(図5B)。従って、瞳孔対光反応(PLR)に基づく網膜機能検査では、AAVインテインベクターを注射したrd16マウスは、陰性対照を注射したrd16眼よりも有意に大きい瞳孔収縮を示した(約20%、p値=0.00073)(図5C)。
更に、本発明者らは、網膜におけるAAVインテインベクターの安全性を調べた。この目的で、野生型C57BL/6JマウスにAAV2/8-GRK1-ABCA4又は-CEP290インテインベクター(それぞれセット1及び5)(各ABCA4ベクターの用量/眼:4.3×10GC;各CEP290ベクターの用量/眼:l.1×10GC)のいずれかを網膜下注射し、それぞれ注射後6ヵ月及び4.5ヵ月で全視野網膜電図(ERG)により網膜の電気的活動を測定した。いずれの研究においても、a波及びb波振幅は、AAVインテインベクターを注射したマウス眼(ABCA4及びCEP290について、それぞれn=14~15及びn=11)と、陰性対照AAVベクター(ABCA4及びCEP290について、それぞれn=8及びn=5)又はPBS(ABCA4及びCEP290について、それぞれn=6~7及びn=6)を注射した眼との間で同程度であった。同様に、光干渉断層撮影法により測定されたONLの厚さも、AAVインテイン注射眼、陰性対照注射眼及びPBS注射眼の間で同程度であった(図24)。
実施例8.安全なAAVインテイン媒介性大型遺伝子送達
AAVインテインを注射した野生型マウスに明らかな毒性徴候は認められなかったが、本発明者らは、切り出されたインテインの中に埋め込まれると融合タンパク質の急速なユビキチン化及び続くプロテアソーム破壊につながるデグロンをトランススプライシングシステムに含めることについて評価した(図6)。記載されているデグロンの大部分はN端又はC端位置で機能性であり(即ちCL1、SMN、CIITA、ODC)、これらのデグロンは、単一の宿主タンパク質の分解につながり、従ってタンパク質トランススプライシング(PTS)反応に関与する必要のあるポリペプチドを取り去ることになるため、N-インテイン又はC-インテインに融合することができない。従って本発明者らは、N位置又は内部位置でのみ機能的活性を付与する3つのアミノ酸突然変異R12Y、Y100I及びG67Sを含む突然変異型の大腸菌(E. coli)由来ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ecDHFR)(69)を選択した。
ecDHFRが切り出されたインテインの量を低下させる効率を試験するため、本発明者らは、Npu DnaEのN端側半分及びecDHFRに融合したEGFPのN端側半分をコードするAAVベクター(pAAV2.1-CMV-5’EGFPインテイン_ecDHFR)を作成した。従って、このデグロンはC端側末端にあることになり、そこでデグロンは不活性なはずである。AAV-EGFP-ecDHFRインテインプラスミドをベクターII(Npu DnaEのC端側半分に融合したEGFPのC端側半分をコードする(pAAV2.1-CMV-3’EGFPインテイン))と組み合わせて使用してHEK293細胞をトランスフェクトし、完全長EGFPタンパク質及び切り出されたインテインの産生を評価した。WB分析により、トランススプライシングされたEGFPタンパク質がAAVインテインと比較して同程度のタンパク質レベルであることが検出された。加えて、AAV-EGFP-ecDHFRインテインプラスミドのコトランスフェクション後のHEK293細胞ライセートでは、切り出されたインテインの量が大幅に減少していた(図7)。次に、本発明者らは、同じ戦略を大型ABCA4タンパク質に適用することにした(pAAV2.1-CMV260-5’ABCA4インテイン_ecDHFR)。EGFPに関しては、AAV-ABCA4-ecDHFRインテインプラスミドからの完全長ABCA4の量はAAV-ABCA4-インテインと比較して同程度であることが分かった(図8A)。重要なことに、切り出されたインテインの完全な消失が認められた(図8B)。
本発明者らがecDHFR媒介性DnaE分解を観察していることを証明するため、細胞をトリメトプリム(TMP)で処理した。TMPは、ecDHFRに結合してこのタンパク質の分解を防ぐことができる抗生物質であり、これにより融合タンパク質が分解を免れることが可能になる(69)。AAV-ABCA4-ecDHFRインテインプラスミドをコトランスフェクトしたHEK293細胞を漸増用量のTMPで処理したところ、DnaEインテインはそれ以上分解されず、TMPがecDHFRを用量依存的に安定化させることが分かり、これはつまり、DnaEインテインの減少がecDHFRによって媒介されるものであることを意味する(図9)。
ベクターにデグロンを(インテインに加えて)含める上での制約の1つは、AAVのクローニング容量が更に低下し、従って適用によってはオーバーサイズAAVベクターとなることである。実際、ecDHFRは159aa長である。従って、本発明者らは、N位置又は内部位置でその活性に決定的に重要であると報告されているアミノ酸を保持している105aaのより短いecDHFR変異体を設計した。本発明者らはこのミニecDHFRをEGFP及びABCA4インテインプラスミド(pAAV2.1-CMV-5’EGFPインテイン_ミニecDHFR;pAAV2.1-CMV260-5’ABCA4インテイン_ミニcDHFR)の両方で試験した。AAV-EGFP-又はABCA4-ミニecDHFRインテインプラスミドのいずれかをコトランスフェクトすると、AAVインテインプラスミドと比較して同程度の完全長タンパク質発現(図10及び図11A)及びDnaEインテインの強力な減少(図10及び図11B)が見出された。
これらの結果から、PTSシステムにecDHFR又はミニecDHFRのいずれかを含めると、タンパク質トランススプライシング及び治療用タンパク質産生の有効性に重大な影響が及ぶことなく選択的なインテイン分解が媒介されることが示唆された。
実施例9.肝臓におけるインテイン媒介性タンパク質トランススプライシング
肝臓におけるインテイン媒介性タンパク質トランススプライシングの効率を試験するため、ノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)由来のDnaEスプリットインテインのN端側半分及びC端側半分に融合したレポーターEGFPタンパク質のN端側半分又はC端側半分のいずれかをそれぞれコードする2つのAAVベクターを作成した。
5週齢C57/BL6マウスに肝特異的ヒトサイロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーターを含むAAV2/8ベクター(各ベクターの用量/kg:5×1011GC)を後眼窩注射した。注射後4週間で肝臓を摘出し、ウエスタンブロットによる分析のため抗3xflag抗体と共に溶解させてEGFP-3xflag及びインテイン-3xflagを検出した。EGFPバンド強度の定量化により、AAVインテインがデュアルAAVよりも高い効率で肝臓を形質導入し、タンパク質量が約6~7倍多くなることが示された。
実施例10.AAVインテインベクターを使用して血友病Aにおいて影響を受ける大型F8遺伝子を送達することができる
血友病Aで突然変異するF8遺伝子は、その野生型コンホメーションでは大き過ぎる(約7kb)ためシングルAAVによっては送達できない。そのため、AAV遺伝子療法のコンテクストでは、この遺伝子のBドメイン欠失型(BDD)コンホメーションのみが採用されている。最近では、BDD-F8及びショート肝特異的プロモーターとポリAシグナルとの両方を含む5kb発現カセットがAAV5にパッケージングされており、マウス及びカニクイザル(70)並びにHemA患者(71)において治療レベルのFVIIIをもたらすことが示されている。しかしながら、このベクターのゲノムは、ややオーバーサイズであり、異種トランケート型ゲノムのライブラリとしてAAVカプシドにパッケージングされ、それが標的細胞で再構成されると有効な形質導入が生じる。オーバーサイズAAVベクターの効率は普通サイズと比較して低く、異種トランケート型ゲノムを有するかかる産物の品質は、商業化に向けたその更なる開発の妨げとなり得る。
AAVカーゴ容量の制約を克服するため、スプリットNpu DnaEインテインが隣接した大型FVIIIタンパク質の2つの半分部分をそれぞれコードする普通サイズのゲノムを有する2つの別個のAAVベクターが関わるタンパク質トランススプライシング戦略を設計した。
野生型F8遺伝子をBドメイン内の2つの異なる分断点、即ちセット1及びセット2に分けた。短い合成ポリAと共に肝特異的ハイブリッド肝プロモーター(HLP)下にあるF8インテインベクターを作製した(図25A)。このベクターゲノムは、サザンブロットによって示されるとおり、そのオーバーサイズAAV BDD-F8対照と異なりAAVカプシドに適切にパッケージングされた(図25B)。
この戦略の治療への適合性を決定するため、AAV2/8 F8インテインベクターを7~8週齢血友病Aノックアウトマウスに後眼窩注入(各ベクターの用量/動物:4~5×1011GC)で全身注射した。注射後8週間の血漿のaPTT(活性化部分トロンボプラスチン時間)分析では、オーバーサイズシングルAAV BDD-F8対照と同じレベルではないものの、出血表現型の僅かな修正が見られた(図25C)。
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Claims (23)

  1. 細胞においてコード配列を発現するためのベクターシステムであって、前記コード配列は、第1の部分(CDS1)及び第2の部分(CDS2)並びに任意選択で第3の部分(CDS3)からなり、前記ベクターシステムは、
    a)第1のベクターであって、
    - 前記コード配列の前記第1の部分(CDS1)、
    - N-インテインをコードする第1のインテインヌクレオチド配列であって、CDS1の3’末端に位置する第1のインテインヌクレオチド配列
    を含む第1のベクターと;
    b)第2のベクターであって
    - 前記コード配列の前記第2の部分(CDS2)、
    - C-インテインをコードする第2のインテインヌクレオチド配列であって、CDS2の5’末端に位置する第2のインテインヌクレオチド配列
    を含む第2のベクターと
    を含み;
    前記第1のベクター及び前記第2のベクターが細胞に挿入されると、前記コード配列のタンパク質産物は、タンパク質スプライシングによって産生されるか;又は
    前記ベクターシステムは、
    a’)第1のベクターであって
    - 前記コード配列の前記第1の部分(CDS1)、
    - 第1のN-インテインをコードする第1のインテインヌクレオチド配列であって、CDS1の3’末端に位置する第1のインテインヌクレオチド配列
    を含む第1のベクターと;
    b’)第2のベクターであって、
    - 前記コード配列の前記第2の部分(CDS2)、
    - 第1のC-インテインをコードする第2のインテインヌクレオチド配列であって、CDS2の5’末端に位置する第2のインテインヌクレオチド配列;
    - 第2のN-インテインをコードする第3のインテインヌクレオチド配列であって、CDS2の3’末端に位置する第3のインテインヌクレオチド配列
    を含む第2のベクターと;
    c’)第3のベクターであって、
    - 前記コード配列の前記第3の部分(CDS3)、
    - 第2のC-インテインをコードする第4のインテインヌクレオチド配列であって、CDS3の5’末端に位置する第4のインテインヌクレオチド配列
    を含む第3のベクターと
    を含み、
    前記第1のインテインヌクレオチド配列は、前記第3のインテインヌクレオチド配列と異なり、及び前記第2のインテイン配列は、前記第4のインテインヌクレオチド配列と異なり、前記第1のベクター、前記第2のベクター、前記第3のベクターが細胞に挿入されると、前記コード配列のタンパク質産物は、タンパク質スプライシングによって産生される、ベクターシステム。
  2. 前記第1のインテイン、前記第2のインテイン、前記第3のインテイン及び前記第4のインテインは、スプリットインテインをコードし、好ましくは、前記スプリットインテインは、150アミノ酸の最大長さを有し、より好ましくは、前記スプリットインテインは、DnaE又はDnaBインテインである、請求項1に記載のベクターシステム。
  3. - 前記第1のインテインヌクレオチド配列は、配列番号1、3、5、7、9、11、13からなる群から選択されるインテイン又はその変異体、若しくはその断片、若しくはその相同体をコードし;
    - 前記第2のインテインヌクレオチド配列は、配列番号2、4、6、8、10、12、14からなる群から選択されるインテイン又はその変異体、若しくはその断片、若しくはその相同体をコードし;
    - 前記第3のインテインヌクレオチド配列は、配列番号1、3、5、7、9、11、13からなる群から選択されるインテイン又はその変異体、若しくはその断片、若しくはその相同体をコードし;
    - 前記第4のインテインヌクレオチド配列は、配列番号2、4、6、8、10、12、14からなる群から選択されるインテイン又はその変異体、若しくはその断片、若しくはその相同体をコードする、請求項1又は2に記載のベクターシステム。
  4. 前記第1のベクター、前記第2のベクター及び前記第3のベクターは、前記コード配列の前記第1の部分(CDS1)、又は前記コード配列の前記第2の部分(CDS2)、又は前記コード配列の前記第3の部分(CDS3)の5’末端部分に作動可能に連結されたプロモーター配列を更に含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  5. 前記第1のベクター、前記第2のベクター及び前記第3のベクターは、5’末端反復(5’-TR)ヌクレオチド配列と、3’末端反復(3’-TR)ヌクレオチド配列とを更に含み、好ましくは、前記5’-TRは、5’逆方向末端反復(5’-ITR)ヌクレオチド配列であり、及び前記3’-TRは、3’逆方向末端反復(3’-ITR)ヌクレオチド配列である、請求項1~4のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  6. 前記第1のベクター、前記第2のベクター及び前記第3のベクターは、ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列を更に含み、及び/又は前記第1のベクター、若しくは前記第2のベクター、若しくは前記第3のベクターの少なくとも1つは、分解シグナルをコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項1~5のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  7. 前記分解シグナルは、CL1、PB29、SMN、CIITA、ODc、ecDHFR又はその断片からなる群から選択される、請求項6に記載のベクターシステム。
  8. 前記コード配列は、前記コードされるタンパク質産物の構造ドメイン又は機能ドメイン内に入らない求核性アミノ酸からなる位置で前記第1の部分、前記第2の部分及び任意選択で前記第3の部分に分断され、前記求核性アミノ酸は、セリン、スレオニン又はシステインから選択される、請求項1~7のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  9. 前記第1のベクター、前記第2のベクター及び前記第3のベクターの少なくとも1つは、前記コード配列に作動可能に連結された少なくとも1つのエンハンサー又は調節ヌクレオチド配列を更に含む、請求項1~8のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  10. 前記コード配列は、病的状態又は障害を修正することが可能なタンパク質をコードし、好ましくは、前記障害は、網膜変性症、代謝障害、血液障害、神経変性障害、難聴、チャネロパチー、肺疾患、ミオパチー、心疾患である、請求項1~9のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  11. 前記コード配列は、病的状態又は障害を修正することが可能なタンパク質をコードし、好ましくは、前記障害は、網膜変性症であり、好ましくは、前記網膜変性症は、遺伝性であり、好ましくは、前記病態又は疾患は、網膜色素変性症(RP)、レーベル先天黒内障(LCA)、スタルガルト病(STGD)、アッシャー病(USH)、アルストレーム症候群、先天性停止性夜盲(CSNB)、黄斑ジストロフィー、オカルト黄斑ジストロフィー、ABCA4遺伝子の突然変異によって引き起こされる疾患からなる群から選択される、請求項1~10のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  12. 前記コード配列は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、血友病A、ウィルソン病、フェニルケトン尿症、ジスフェルリン異常症、レット症候群、多発性嚢胞腎疾患、ニーマン・ピック病C型、ハンチントン病を修正することが可能なタンパク質をコードする、請求項1~10のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  13. 前記コード配列は、ABCA4、MYO7A、CEP290、CDH23、EYS、PCDH15、CACNA1、SNRNP200、RP1、PRPF8、RP1L1、ALMS1、USH2A、GPR98、HMCN1からなる群から選択される遺伝子のコード配列である、請求項1~11のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  14. 前記コード配列は、DMD、CFTR、F8、ATP7B、PAH、DYSF、MECP2、PKD、NPC1、HTTからなる群から選択される遺伝子のコード配列である、請求項1~12のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  15. a)第1のベクターであって、5’-3’方向に、
    - 5’逆方向末端反復(5’-ITR)配列;
    - プロモーター配列;
    - コード配列の5’末端部分(CDS1)であって、前記プロモーターに作動可能に連結され、且つその制御下にある5’末端部分;
    - N-インテインをコードする第1のインテインヌクレオチド配列;及び
    - 3’逆方向末端反復(3’-ITR)配列
    を含む第1のベクターと;
    b)第2のベクターであって、5’-3’方向に、
    - 5’逆方向末端反復(5’-ITR)配列;
    - プロモーター配列;
    - C-インテインをコードする第2のインテインヌクレオチド配列;
    - 前記コード配列の3’末端部分(CDS2);及び
    - 3’逆方向末端反復(3’-ITR)配列
    を含む第2のベクターと
    を含むか;又は
    a’)第1のベクターであって、5’-3’方向に、
    - 5’逆方向末端反復(5’-ITR)配列;
    - プロモーター配列;
    - コード配列の5’末端部分(CDS1’)であって、前記プロモーターに作動可能に連結され、且つその制御下にある5’末端部分;
    - 第1のN-インテインをコードする第1のインテインヌクレオチド配列;及び
    - 3’逆方向末端反復(3’-ITR)配列
    を含む第1のベクターと;
    b’)第2のベクターであって、5’-3’方向に、
    - 5’逆方向末端反復(5’-ITR)配列;
    - プロモーター配列;
    - 第1のC-インテインをコードする第2のインテインヌクレオチド配列;
    - 前記コード配列の第2の部分(CDS2’);及び
    - 第2のN-インテインをコードする第3のインテインヌクレオチド配列;
    - 3’逆方向末端反復(3’-ITR)配列
    を含む第2のベクターと;
    c’)第3のベクターであって、5’-3’方向に、
    - 5’逆方向末端反復(5’-ITR)配列;
    - プロモーター配列;
    - 第2のC-インテインをコードする第4のインテインヌクレオチド配列;
    - 前記コード配列の第3の部分(CDS3’);及び
    - 3’逆方向末端反復(3’-ITR)配列
    を含む第3のベクターと
    を含む、請求項1~14のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  16. 前記コード配列は、前記ABCA4遺伝子をコードし、好ましくは、前記コード配列は、前記ABCA4タンパク質のaa Cys1150、Ser1168、Ser1090に対応するヌクレオチドで分断され、及びスプリットインテインは、前記分断点において挿入されるか、又は前記コード配列は、前記CEP290遺伝子をコードし、好ましくは、前記コード配列は、前記CEP290タンパク質のaa Cys1076;Ser1275に対応するヌクレオチドで分断され、好ましくは、前記CEP290遺伝子をコードする前記コード配列は、前記CEP290タンパク質のaa Cys 929及び1474;Ser 453及びCys 1474に対応するヌクレオチド配列で分断され、及び2つのスプリットインテインは、前記分断点において挿入される、請求項1~15のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  17. 前記第1、第2及び第3のベクターは、独立に、ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであり、好ましくは、前記第1、第2及び第3のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、同じ又は異なるAAV血清型から選択され、好ましくは、前記血清型は、血清型2型、血清型8型、血清型5型、血清型7型又は血清型9型、血清型7m8型、血清型sh10型;血清型2(quad Y-F)型から選択される、請求項1~16のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  18. 請求項1~17のいずれか一項に記載のベクターシステムで形質転換された宿主細胞。
  19. 医学的使用のための、請求項1~17のいずれか一項に記載のベクターシステム又は請求項18に記載の宿主細胞。
  20. 遺伝子療法における使用のための、好ましくは網膜変性症、代謝障害、血液障害、神経変性障害、難聴、チャネロパチー、肺疾患、ミオパチー、心疾患によって特徴付けられる病態又は疾患の治療及び/又は予防における使用のための、請求項1~19のいずれか一項に記載のベクターシステム又は請求項18に記載の宿主細胞。
  21. 前記網膜変性症は、遺伝性であり、好ましくは、前記病態又は疾患は、網膜色素変性症(RP)、レーベル先天黒内障(LCA)、スタルガルト病(STGD)、アッシャー病(USH)、アルストレーム症候群、先天性停止性夜盲(CSNB)、黄斑ジストロフィー、オカルト黄斑ジストロフィー、ABCA4遺伝子の突然変異によって引き起こされる疾患からなる群から選択される、請求項20に記載の使用のためのベクターシステム又は宿主細胞。
  22. デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、血友病A、ウィルソン病、フェニルケトン尿症、ジスフェルリン異常症、レット症候群、多発性嚢胞腎疾患、ニーマン・ピック病C型、ハンチントン病の予防及び/又は治療における使用のための、請求項20に記載の使用のためのベクターシステム又は宿主細胞。
  23. 請求項1~17のいずれか一項に記載のベクターシステム又は請求項18に記載の宿主細胞と、薬学的に許容可能な媒体とを含む医薬組成物。
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