Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN116925239B - 双载体系统表达Otof基因的组合物和方法 - Google Patents

双载体系统表达Otof基因的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116925239B
CN116925239B CN202310874589.7A CN202310874589A CN116925239B CN 116925239 B CN116925239 B CN 116925239B CN 202310874589 A CN202310874589 A CN 202310874589A CN 116925239 B CN116925239 B CN 116925239B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion polypeptide
seq
nucleic acid
acid construct
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310874589.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116925239A (zh
Inventor
柴人杰
谈方志
齐洁玉
蒋璐璐
张李燕
余朝荣
陈�田
张善中
谭畅
陆玲
崔志平
宋怀恩
孙思睫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Xingaotuowei Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Xingaotuowei Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Xingaotuowei Biotechnology Co ltd filed Critical Suzhou Xingaotuowei Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310874589.7A priority Critical patent/CN116925239B/zh
Publication of CN116925239A publication Critical patent/CN116925239A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116925239B publication Critical patent/CN116925239B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及双载体系统表达Otof基因的组合物和方法，具体提供融合多肽，包含otoferlin蛋白的部分和内含肽系统的部分。本发明通过重组AAV双载体系统，将编码Otof的基因传递到细胞中。

Description

双载体系统表达Otof基因的组合物和方法
技术领域
本发明涉及生物分子领域，尤其涉及一种双载体系统中融合多肽的剪接方法及应用。
背景技术
听力损失是最常见的人类感官缺陷性疾病之一，可能是由环境因素和遗传因素造成的。有些人可能出生时出现听力损失，而其他人可能会随着时间的推移慢慢失去听力。听力损失影响全球超过15亿人，约占全球人数的五分之一，其中有4.7亿人患有致残性听力损失(中度及以上的听力障碍)，其中有3400万儿童患有耳聋或听力损失。预计到2050年，可能有超过7亿人患有致残性听力损失。我国听力障碍人数约占人口总数的16％，致残性听力障碍患者约占总人口的5％。耳聋在我国新生儿中的发病率为1％～3.47％，即每1000名新生儿就有1-3名聋儿，每年新生约3万聋儿。听力损失的环境原因主要是与使用耳毒性药物、孕期感染、新生儿缺氧及放射线照射等多种环境因素或某些并发症相关。而遗传因素主要是因为个体耳聋基因缺陷，导致不同程度听力下降，致病基因会通过不同的遗传方式传递给下一代，并且可以在任何年龄发生，由遗传因素导致的耳聋约占60％，目前已发现了200多个基因与耳聋相关，涉及1500多种致病变异，至今临床上尚无任何可用于治疗遗传性耳聋的药物。遗传性耳聋根据是否伴有耳外组织异常或病变分为综合征性耳聋(SHL)和非综合征性耳聋(NSHI)。综合征性耳聋约占遗传性耳聋的30％，除听力障碍外，还伴有其他许多表现。非综合征性耳聋约占遗传性耳聋的70％～80％，只有听力受损症状，其他器官无遗传性损害。
遗传性非综合征型耳聋主要为单基因遗传病，按其遗传方式又分为常染色体显性遗传(autosomal dominant deafness，DFNA)、常染色体隐性遗传(autosomal recessivedeafness，DFNB)、X-连锁遗传(X-linked deafness，DFNX)、Y-连锁遗传(Y-linkeddeafness，DFNY)、线粒体遗传以及表观遗传等。DFNA约占遗传性耳聋的18％，DFNB约占80％，DFNX约占1％，线粒体遗传<1％，DFNY和表观遗传仅见个案报道。据报道已鉴定的非综合征型聋相关基因有110个，其中DFNA相关基因45个，DFNB相关基因70个，10个同时与DFNA和DFNB相关(CLOL11A2、GJB2、GJB6、MYO3A、MYO6、MYO7A、PTPRQ、TCB1D24、TECTA、TMC1)，DFNX相关基因5个。每种类型按耳聋基因的命名原则描述，例如DFNA1是第一个发现的常染色体显性耳聋类型。
DFNB9听力障碍是先天性遗传耳聋的常见形式，患有DFNB9耳聋的患者通常都是重度感音性耳聋，由Otof基因编码耳畸蛋白otoferlin的基因突变引起的。Otof基因编码otoferlin蛋白为跨膜蛋白，属于Ferlin蛋白家族，Otoerlin蛋白包含6个钙离子结合域和两个Fer结构域，在细胞膜离子交换、信号转导和神经递质释放等方面起重要作用。Otof基因是最早发现的与非综合征型听神经病谱系障碍(auditory neurophy spectrumdisorder，ANDS)有关的基因。听神经病谱系障碍也称为听神经病。Otoferlin蛋白是一种在内毛细胞突触传递声音信息中起关键作用的蛋白质，超过56％的非综合征ANSD是由Otof基因突变所导致，全世界大约有20万人受此影响。目前Otof基因突变患者只能从传统助听获益且临床治疗效果不佳，目前也尚无获批的药物治疗方案。
Otof基因变异可引起先天性语前重度遗传性耳聋，遗传方式为常染色体隐形遗传。Otof基因突变的患者常常从一出生起就患有严重的双侧耳聋，且听觉脑干反应(ABR)缺失或高度异常，是目前我们最常见的听力损失原因。目前解决耳聋的方法大多为使用助听器、振动声桥及人工耳蜗等物理方法，虽然患者可以获得不同程度的听功能改善，但是个体差异较大，也有很大的局限和弱点。例如治疗效果有限、频率敏感性、言语分辨及噪声环境下的感知困难及装置需要小心使用等。全世界大约有30万患者接受了人工耳蜗植入，但这仅占所有耳聋患者的一小部分，对于大部分患者仍迫切需要根本性的有效的药物治疗途径，且至今还没有批准的治疗方法，是一个严重未满足需求的领域。
发明内容
本发明提供了一种双载体系统，目的在于通过双载体将Otof基因转到耳蜗内毛细胞中，表达正常的功能性otoferlin蛋白，以治疗Otof介导的听力损失。
本发明第一方面提供融合多肽，包含otoferlin蛋白的部分和内含肽系统的部分。
在一个或多个实施方案中，所述otoferlin蛋白如SEQ ID NO:1或与其具有至少90％相同性的序列所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合多肽是第一融合多肽或第二融合多肽。
在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽包含SEQ ID NO:1所示的otoferlin蛋白的第1至第n位氨基酸和内含肽的N端片段(N-intein)或由其组成，其中n是750至1250任意整数，优选n是790至1200的任意整数，更优选n是797至1169的任意整数。
在一个或多个实施方案中，所述第二融合多肽包含SEQ ID NO:1所示的otoferlin蛋白的第(n+1)至第1997位氨基酸和内含肽的C端片段(C-intein)或由其组成，其中n是750至1250的任意整数，优选n是790至1200的任意整数，更优选n是797至1169的任意整数。
在一个或多个实施方案中，n是797、819、844、854、866、872、878、882、887、900、904、918、926、950、970、976、977、980、992、994、995、1001、1003、1005、1040、1050、1064、1083、1161、1169中任一个或多个。
在一个或多个实施方案中，所述内含肽的N端片段(N-intein)是分裂内含肽-N，如SEQ ID NO:2序列所示。
在一个或多个实施方案中，所述内含肽的C端片段(C-intein)是分裂内含肽-C，如SEQ ID NO:3序列所示。
在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽具有SEQ ID NO:5-16中任一项所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。
在一个或多个实施方案中，所述第二融合多肽具有SEQ ID NO:17-28中任一项所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。
本发明还提供一种多肽组合物，包含本发明第一方面中所记载的第一融合多肽和第二融合多肽。
本发明还提供多核苷酸，包含选自以下的序列：
(1)编码本文任一实施方案所述的融合多肽或多肽组合物的核酸序列，
(2)与(1)具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同性的变体，
(3)(1)或(2)的互补序列。
在一个或多个实施方案中，编码第一融合多肽的多核苷酸具有SEQ ID NO:29-40中任一项所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一个或多个实施方案中，编码第二融合多肽的多核苷酸具有SEQ ID NO:41-52中任一项所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。
本发明还提供一种核酸构建物，所述核酸构建物：
(1)表达本文任一实施方案所述的融合多肽或多肽组合物，和/或
(2)包含本文所述的多核苷酸的序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是一表达框，编码第一融合多肽和第二融合多肽的多核苷酸均位于该表达框中。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是两表达框，分别包含编码第一融合多肽和第二融合多肽的多核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体。例如克隆载体、整合载体、表达载体。优选AAV载体。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是两AAV载体，分别包含编码第一融合多肽和第二融合多肽的多核苷酸，以及位于所述多核苷酸侧翼的一个或更多个末端反向重复(ITR)序列。多核苷酸可以是单链(ss)或自身互补(sc)AAV核酸载体的形式，例如是单链或自身互补重组病毒基因组的形式。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包括用于表达其上所含多核苷酸的元件。在一个或多个实施方案中，在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸与组成型启动子可操作地连接。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物具有SEQ ID NO:4所示的序列。
本发明还提供一种rAAV载体系统，包含两AAV载体和编码AAV病毒所需基因的核酸构建物，所述两AAV载体分别包含编码第一融合多肽和第二融合多肽的多核苷酸，所述第一融合多肽和第二融合多肽如本发明第一方面中所记载。
在一个或多个实施方案中，AAV病毒所需基因包括选自以下的一种或多种：Rep、Cap、E2A、E4和VA基因。
在一个或多个实施方案中，所述AAV载体系统包含Anc80L65质粒、helper质粒和所述AAV载体。
本发明还提供一种rAAV病毒颗粒，包含本发明任一实施方案所述的多核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述rAAV病毒颗粒选自rAAV1、rAAV2、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12、rAAV13、rAAVPHP.B或rAAVrh74中的一种或多种。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞：
(1)包含、表达和/或分泌本文所述的融合多肽或多肽组合物，
(2)包含本文任一实施方案所述的多核苷酸、核酸构建物或AAV载体系统，
(3)染色体中整合有本文任一实施方案所述的多核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是HEK293细胞。
本发明第三方面提供一种制备otoferlin蛋白的方法，包括在适合进行内含肽剪接的条件下使第一融合多肽和第二融合多肽接触，所述第一融合多肽和第二融合多肽如本发明第一方面中所记载。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括步骤：在适合进行内含肽剪接的条件下孵育本文任一实施方案所述的宿主细胞。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将本文任一实施方案所述的AAV载体系统导入细胞，在适合第一融合多肽和第二融合多肽表达的条件下孵育所述宿主细胞。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是动物细胞，优选HEK293细胞。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括内含肽介导蛋白质的反式剪接的步骤。
本发明还提供本文任一实施方案所述的融合多肽、多肽组合物、多核苷酸、核酸构建物、宿主细胞在制备用于治疗由Otof基因缺陷引起的疾病的药物中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述疾病是DFNB9听力障碍。
本发明还提供一种药物组合物，包含药学上可接受的辅料，和选自以下的一种或多种：本发明任一实施方案所述的融合多肽、多肽组合物、多核苷酸、核酸构建物、rAAV载体系统、rAAV病毒颗粒、宿主细胞。
本发明还提供一种治疗遗传性耳聋疾病的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的融合多肽、多肽组合物、多核苷酸、核酸构建物、宿主细胞或药物组合物。优选地，所述遗传性耳聋疾病为DFNB9遗传性耳聋。
本发明的有益效果：
本发明将Otoferlin基因的5'-端和3'-端分别构建进两个不同的rAAV载体，通过重组AAV双载体系统，将编码Otof的转基因传递到耳蜗内毛细胞，最终实现毛细胞中Otoferlin蛋白的表达，以治疗Otof介导的听力损失。这意味着基因替代治疗能够在预防或治疗因Otoferlin突变造成的遗传性耳聋中发挥作用。
附图说明
图1显示了使用反向末端重复序列、启动子和多腺苷酸化序列的双AAV内含肽介导的OTOF蛋白反式剪接的示意图。
图2显示了双载体系统中载体骨架元件，其中ITR序列为1-141，CMV Promoter序列为169-752，Kozak序列为792-797，EGFP序列为801-1517，WPRE序列为1536-2124，SV40PolyA序列为2131-2252，ITR序列为2290-2430，f1 Ori序列为2505-2960，kana抗性序列为3242-4156，Ori序列为4327-4515。
图3显示了OTOF全长蛋白分割成两个AAV载体的切分位点示意图，应用WB蛋白质印迹法以供在体外完成筛选验证。
图4显示了部分用编码otoferlin蛋白的N-末端部分(N-Otof)和C-末端部分(C-Otof)两者共转染的HEK-293T细胞导致全长OTOF的表达。A-D，不同切分位点的全长otoferlin蛋白的表达情况。
图5是接受治疗的成年Otof-/-敲除小鼠模型的听性脑干反应(ABR)结果，显示接受治疗的成年Otof-/-敲除小鼠模型，ABR阈值降低，听力部分频段显著恢复，与WT小鼠听力阈值接近。
图6是接受治疗的成年Otof-/-敲除小鼠模型的免疫荧光结果。测听后处死小鼠取耳蜗进行基底膜铺片染色，免疫荧光结果显示本申请的双AAV系统均不同程度实现了小鼠耳蜗内otoferlin蛋白的表达。本申请的双AAV系统实现了小鼠耳蜗内otoferlin蛋白的表达，恢复了内耳毛细胞中突触囊泡的释放并使双耳听力得到恢复。
具体实施方式
除非另有定义，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987版及其定期更新版本)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction(Mullis等编辑，1994)；A Practical Guide to MolecularCloning(Perbal Bernard V.，1988)；Phage Display：A Laboratory Manual(Barbas等，2001)。
术语“疾病和/或状况”是指与本文所述疾病和/或状况相关联的受试者的身体状态。
术语“受试者”或“患者”可指接受本发明药物组合物以治疗、预防、改善和/或缓解本发明疾病或状况的患者或其他动物，尤其是哺乳动物，例如人、狗，猴子、牛、马等。
融合多肽
本发明首先提供一种融合多肽，包括包含otoferlin蛋白的部分和内含肽系统的部分。
本文中，术语内含肽是位于宿主蛋白质中的一段插入序列，内含肽基因不是一个独立的基因，必须插入于外显肽基因才能复制转录，可从前体蛋白中切除并将两侧外显肽连接起来成为成熟蛋白质。其对应的核苷酸序列嵌合在宿主蛋白对应的核酸序列之中，与宿主蛋白基因存在于同一开放阅读框架(open reading frame，ORF)内，并与宿主蛋白质基因进行同步转录和翻译，当翻译形成蛋白质前体后，内含肽从宿主蛋白质中切除，从而形成成熟的具有活性的蛋白质。编码剪接供体的氨基酸序列(例如,内含肽(N-intein)的N端片段，也称为分裂内含肽-N)如SEQ ID NO:2所示。编码剪接受体的氨基酸序列(例如,内含肽(C-intein)的C端片段,也称为分裂内含肽-C)如SEQ ID NO:3所示。
本文中宿主蛋白是otoferlin蛋白，如SEQ ID NO:1所示。因此，所述融合多肽包括第一融合多肽或第二融合多肽。所述第一融合多肽包含SEQ ID NO:1所示的otoferlin蛋白的第1至第n位氨基酸和内含肽的N端片段(N-intein)或由其组成，其中n是750至1250的任意整数，优选n是790至1200的任意整数，更优选n是797至1169的任意整数。所述第二融合多肽包含SEQ ID NO:1所示的otoferlin蛋白的第(n+1)至第1997位氨基酸和内含肽的C端片段(C-intein)或由其组成，其中n是750至1250的任意整数，优选n是790至1200的任意整数，更优选n是797至1169的任意整数。在示例性实施方案中，在一个或多个实施方案中，n是797、819、844、854、866、872、878、882、887、900、904、918、926、950、970、976、977、980、992、994、995、1001、1003、1005、1040、1050、1064、1083、1161、1169中任一个或多个。在一个或多个实施方案中，n是797、844、854、866、872、882、900、926、950、970、977、980、992、994、1003、1064、1161、1169中任一个或多个。
本发明还提供多肽组合物，包含所述第一融合多肽和第二融合多肽。在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽包含SEQ ID NO:1所示的otoferlin蛋白的第1至第n位氨基酸和内含肽的N端片段(N-intein)或由其组成，其中n是750至1250的任意整数，优选n是790至1200的任意整数，更优选n是797至1169的任意整数。所述第二融合多肽包含SEQ IDNO:1所示的otoferlin蛋白的第(n+1)至第1997位氨基酸和内含肽的C端片段(C-intein)或由其组成，其中n是750至1250的任意整数，优选n是790至1200的任意整数，更优选n是797至1169的任意整数。在示例性实施方案中，在一个或多个实施方案中，n是797、819、844、854、866、872、878、882、887、900、904、918、926、950、970、976、977、980、992、994、995、1001、1003、1005、1040、1050、1064、1083、1161、1169中任一个或多个。在一个或多个实施方案中，n是797、844、854、866、872、882、900、926、950、970、977、980、992、994、1003、1064、1161、1169中任一个或多个。在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽具有SEQ ID NO:5所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ ID NO:17所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽具有SEQ ID NO:6所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ ID NO:18所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽具有SEQ ID NO:7所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ ID NO:19所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽具有SEQ ID NO:8所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ ID NO:20所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽具有SEQ ID NO:9所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ ID NO:21所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽具有SEQ ID NO:10所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ ID NO:22所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽具有SEQ ID NO:11所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ ID NO:23所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽具有SEQ IDNO:12所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ IDNO:24所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。所述第一融合多肽具有SEQ IDNO:13所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ IDNO:25所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽具有SEQ ID NO:14所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ ID NO:26所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。所述第一融合多肽具有SEQ ID NO:15所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ ID NO:27所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一个或多个实施方案中，所述第一融合多肽具有SEQ ID NO:16所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述第二融合多肽具有SEQ ID NO:28所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。
在一些实施方案中，本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明还包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
核苷酸序列
本发明提供多核苷酸，其包括：编码本文所述的融合多肽或多肽组合物的核酸序列或其互补序列。
在一个或多个实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列是编码目的蛋白的N-末端部分的核苷酸序列与剪接供体序列N-intein序列(例如N-Otof-N-intein)。优选地，其核酸序列如SEQ ID NO:29-40中任一项所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。
在一个或多个实施方案中，编码第二融合多肽的核酸序列是编码目的蛋白的C-末端部分的核苷酸序列与剪接供体序列C-intein序列(例如C-intein-C-Otof)。优选地，其核酸序列如SEQ ID NO:41-52中任一项所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。
在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:29所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQ ID NO:41所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:30所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQ ID NO:42所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:31所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQ ID NO:43所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:6832示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQ ID NO:44所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:33所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQ ID NO:45所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:34所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQ ID NO:46所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQ IDNO:35所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQ IDNO:47所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:36所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQ ID NO:48所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:37所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQ ID NO:49所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQID NO:38所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQID NO:50所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:39所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQ ID NO:51所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。在一些实施方案中，编码第一融合多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:40所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，编码第二融合多肽具有SEQ ID NO:52所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。
如本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，它们全部编码本发明的融合多肽。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的核酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还提供包含至少一个上述核苷酸的核酸构建物(例如表达框或载体)。核酸构建物中含有启动子、编码融合多肽序列，还可含有其它表达所需的元件，包括但不限于poly A信号序列等。
在核苷酸序列已知的情况下，可采用本领域常规的方法制备得到各核苷酸分子，并构建相应的载体。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建重组载体，参见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory)、Ausubel等(1989,Short Protocols in Molecular Biology,Wiley)或其他标准教科书中描述的技术。替代地，可将所述多核苷酸和载体重建成用于递送到靶细胞的脂质体。含有本发明的多核苷酸的载体可通过熟知的方法转移至宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电转可用于其它细胞宿主，可参见Sambrook等(见上)。
本文所述载体含有本文所述的多核苷酸或表达框。载体可以是质粒、粘粒、病毒、病毒载体。载体包括克隆载体、整合载体、也可以是表达载体。除本发明所述的核苷酸分子外，表达载体中通常还含有载体通常所含的其它元件，例如多克隆位点、抗性基因、复制起始位点等。在一个或多个实施方案中，所述重组表达载体采用AAV系列载体作为骨架。
表达载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的蛋白的核酸的多连接子区和可选标记元件。
载体可任选地含有“标签”编码序列，即位于融合多肽的5'或3'末端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码聚组氨酸(诸如6His)或另一种“标签”，诸如FLAG、HA或myc。此标签在表达多肽时典型地与多肽融合，且可充当用于从宿主细胞亲和力纯化或检测蛋白的一种方式。亲和力纯化例如可通过使用针对此标签的抗体作为亲和力基质的柱色谱法来完成。标签任选地可随后通过诸如使用某些用于裂解的肽酶的各种方式从经过纯化的蛋白除去。
侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即，来自除宿主细胞物种或菌株以外的物种)、杂合的(即，来自一种以上来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。同样地，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或无脊椎动物生物体或任何植物，条件是侧翼序列在宿主细胞机制中起作用且可由宿主细胞机制活化。
可选的标记基因编码对于在选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和生长而言必要的一种蛋白质。典型的选择标记基因编码(a)赋予对于抗生素或其它毒素(例如，对于原核宿主细胞而言为氨苄青霉素、四环素或卡那霉素)的抗性；(b)补足细胞的营养缺陷型；或(c)提供无法从复合物或确定的培养基获得的重要营养素的蛋白质。特异性的可选标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利的是，新霉素抗性基因也可以用于在原核和真核宿主细胞中进行选择。
本发明的表达和克隆载体将典型地含有由宿主生物体识别并与编码蛋白或多肽的分子可操作性连接的启动子。启动子是位于控制结构基因转录的结构基因(通常在约100至1000bp以内)的起始密码子上游的非转录序列。本领域也熟知在各种宿主中使用的合适启动子。例如，与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适启动子包括但不限于由诸如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、B型肝炎病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)的病毒基因组获得的启动子。其它合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
在一些实施方案中，本发明的融合多肽通过重组AAV(rAAV)载体系统表达。本文所用的术语“腺相关病毒”或“AAV”包括与该名称相关的病毒类别的成员，该病毒类别属于Dependoparvovirus属，Parvoviridae科。腺相关病毒是一种单链DNA病毒，它只在细胞中生长，其中某些功能是由共同感染的辅助病毒提供的。AAV的一般信息和综述可参见例如Carter,1989,Handbook of Parvoviruses,第1卷，第169-228页。已知该病毒的多种血清型适于基因递送，各种血清型在结构上和功能上密切相关。所有AAV血清型显然都表现出非常相似的由同源rep基因介导的复制特性；并且都携带三种相关的衣壳蛋白。至少13种顺序编号的AAV血清型是本领域已知的。可用于本文所公开方法的非限制性示例性血清型包括13种血清型中的任一种，例如AAV2、AAV8、AAV9。AAV颗粒包含下列三种主要病毒蛋白，基本上由下列三种主要病毒蛋白组成，或由下列三种主要病毒蛋白组成：VP1、VP2和VP3。在一个或多个实施方案中，AAV指血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVPHP.B或AAVrh74。
本文所用的“AAV载体”指包含一个或多个本文融合多肽的编码序列和一个或多个AAV反向末端重复(ITR)、基本上由其组成或由其组成的载体。当存在于提供rep和cap基因产物功能性的宿主细胞中时，这种AAV载体可被复制并包装到感染性病毒颗粒中；例如通过转染宿主细胞。在一个或多个实施方案中，AAV载体含有启动子、编码至少一种蛋白质或RNA的至少一种核酸、和/或包装到感染性AAV颗粒的侧翼ITR内的增强子和/或终止子。含有AAV载体的质粒也可含有用于制备用途的元件，例如抗生素抗性基因等。
如本文所用，术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指病毒颗粒的蛋白质外壳或衣壳。衣壳的功能是包壳、保护、转运病毒基因组，并将其释放到宿主细胞中。衣壳通常由蛋白质的寡聚结构亚基(“衣壳蛋白”)组成。如本文所用，术语“包壳”是指被包含在病毒衣壳内。AAV的病毒衣壳由三种病毒衣壳蛋白的混合物组成：VP1、VP2和VP3。
“AAV病毒颗粒”或“AAV颗粒”指由至少一种AAV衣壳蛋白和包壳的多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。因此，AAV颗粒的生产必然包括AAV载体的生产，因为这样的载体包含在AAV颗粒中。
如本文所用，关于病毒或质粒的术语“辅助者(helper)”是指用于提供本文公开的任一种AAV载体复制和包装所必需的额外组分的病毒或质粒。辅助病毒编码的组分可以包括病毒粒子组装、包壳、基因组复制和/或包装所需的任何基因。例如，辅助病毒或质粒可编码病毒基因组复制所必需的酶。适合与AAV构建体一起使用的辅助病毒和质粒的非限制性实例包括pHELPer(质粒)、腺病毒(病毒)或疱疹病毒(病毒)。
产生和使用rAAV载体的方法是本领域中已知的。产生rAAV颗粒和异源核酸的方法也是本领域中已知的并且是市售的(参见例如US 2007/0015238和US2012/0322861，其通过引用整体并入本文)。例如，可将包含异源核酸序列的质粒与一种或更多种辅助质粒(例如包含rep基因(例如编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和cap基因(编码VP1、VP2和/或VP3)组合并转染或永久整合到生产细胞系中，使得rAAV颗粒可包装并随后纯化。
在一些实施方案中，一种或更多种辅助质粒包括包含rep基因和cap基因的第一辅助质粒和包含E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因的第二辅助质粒。在一些实施方案中，rep基因是源自AAV2的rep基因，并且cap基因源自AAV44.9。辅助质粒和制备这样的质粒的方法是本领域中已知的并且是市售可得的。
宿主细胞
本发明还包括表达本文所述融合多肽，或者包含本文所述核苷酸或核酸构建物的宿主细胞。宿主细胞可用作载体的受主。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，其指外源性核酸转染或转导到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。本文所用的术语“工程改造的”和“重组的”细胞或宿主细胞往往指其中已经导入外源性核酸序列，例如载体的细胞。因此，重组细胞可与不含导入的重组核酸的天然存在的细胞相区分。
适当的宿主细胞如前文所述，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)等。
如本文所用，包装细胞(或辅助细胞)是用于产生病毒载体的细胞。生产重组AAV病毒载体需要反式提供的Rep和Cap蛋白以及来自腺病毒的帮助AAV复制的基因序列。在一些方面，包装/辅助细胞含有稳定整合到细胞基因组中的质粒。在其它方面，包装细胞可以被瞬时转染。通常，包装细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞。在一个或多个实施方案中，用于产生病毒载体的细胞是HEK293细胞，包括HEK293T、HEK293H、HEK293F、HEK293S、HEK293T/17、HEK293T/17SF、HEK293FT、HEK293SG、HEK293E、HEK293-6E、HEK293FTM、HEK293SGGD细胞。
可将本发明的核酸构建物/重组表达载体转入感兴趣的细胞中。转入的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述核酸构建物或重组表达载体。当培养在适当的条件下培养宿主细胞，使其合成融合蛋白，融合蛋白随后可从培养基收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生其的宿主细胞中收集(如果不分泌的话)。
蛋白制备方法
本发明还提供一种制备otoferlin蛋白的方法，包括在适合进行内含肽剪接的条件下使第一融合多肽和第二融合多肽接触。在一个或多个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将本文任一实施方案所述的AAV载体系统导入细胞，在适合第一融合多肽和第二融合多肽表达的条件下孵育所述宿主细胞。所述内含肽剪接或孵育的时长不受限制，可由本领域技术人员根据经验和需要确定，例如至少0.5h，优选0.5h-15天。所述内含肽剪接或孵育的温度不受限制，只要适合免疫效应细胞生存的温度均可，例如25-37℃。所述内含肽剪接或孵育还可在0-20％(v/v)的环境CO2下进行。
制备AAV病毒载体的方法
多种方法可用于制备AAV病毒载体。在一个或多个实施方案中，通过使用辅助病毒或辅助质粒和细胞系实现包装。辅助病毒或辅助质粒含有促进病毒载体产生的元件和序列。在一些实施方案中，辅助质粒被稳定地整合到包装细胞系的基因组中，使得包装细胞系不需要用辅助质粒进行额外的转染。
在一个或多个实施方案中，细胞是包装细胞系或辅助细胞系。在一个或多个实施方案中，辅助细胞系是真核细胞；例如，HEK 293细胞或293T细胞。在一个或多个实施方案中，辅助细胞是酵母细胞或昆虫细胞。
辅助质粒可以包含，例如，至少一种病毒辅助DNA序列，其衍生自编码包装复制失能的AAV所需的反式全病毒粒子蛋白的复制失能的病毒基因组，和用于产生能够以高滴度包装复制失能的AAV而不产生复制失能的AAV的病毒粒子蛋白。
用于包装AAV的辅助质粒是本领域已知的，参见例如美国专利公开号2004/0235174A1，其以引用的方式并入本文中。如文中所述，作为非限制性实例，AAV辅助质粒可含有由各自的原始启动子或异源启动子控制的Ad5基因E2A、E4和VA作为辅助病毒DNA序列。AAV辅助质粒可另外含有表达盒，用于表达标记蛋白如荧光蛋白，以允许容易地单检测所需靶细胞的转染。
本文提供了产生AAV颗粒的方法，包括用本文公开的AAV辅助质粒中的任一种；以及本文公开的AAV载体中的任一种来转染包装细胞系。在一些实施方案中，AAV辅助质粒和AAV载体共转染到包装细胞系中。在一些实施方案中，细胞系是哺乳动物细胞系，例如人胚肾(HEK)293细胞系。本文提供了包含本文公开的AAV载体和/或AAV颗粒中的任一种的细胞。
本问还提供了将目标基因导入受试者细胞的方法，包括使细胞与有效量的本文任一种AAV病毒颗粒接触，其中所述颗粒含有本文任一种包含融合多肽编码序列的AAV载体。
药物组合物
本文还提供包含本文所述AAV载体和/或AAV颗粒中的药物组合物。通常，施用AAV颗粒以用于疗法。
如本文所述，药物组合物可通过药理学领域已知或开发的任何方法配制，所述方法包括但不限于使活性成分(例如病毒颗粒或重组载体)与赋形剂或其它辅助成分接触，将产物划分或包装为剂量单位。本文的病毒颗粒可以配制为具有期望的特征，例如增加的稳定性、增加的细胞转染、持续或延迟的释放、生物分布或向性、体内编码蛋白的调节或增强的翻译、以及体内编码蛋白的释放特征谱。
因此，药物组合物可以进一步包含盐水、类脂质、脂质体、脂质纳米粒子、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米粒子、肽、蛋白质、用病毒载体转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)、纳米粒子模拟物或其组合。在一些实施方案中，药物组合物被配制为纳米粒子。在一些实施方案中，纳米粒子是自组装的核酸纳米粒子。
根据本文的药物组合物可以以单一单位剂量和/或以多个单一单位剂量制备、包装和/或散装销售。活性成分的量通常等于将被施用给受试者的活性成分的剂量和/或这样的剂量的合宜比率，例如这样的剂量的一半或三分之一。本发明的制剂可以包括一种或多种赋形剂，各赋形剂的量一起增加病毒载体的稳定性，增加细胞转染或病毒载体转导，增加病毒载体编码的蛋白质的表达，和/或改变病毒载体编码的蛋白质的释放特征谱。在一些实施方案中，药物组合物包含赋形剂。赋形剂的非限制性实例包括溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂或其组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含冷冻保护剂。术语“冷冻保护剂”是指能够在冷冻期间减少或消除对物质的损害的试剂。冷冻保护剂的非限制性实例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、右旋糖、棉子糖和/或甘露醇。
治疗方法
本公开提供了预防或治疗病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述病症是遗传性耳聋疾病。优选地，所述遗传性耳聋疾病为DFNB9遗传性耳聋。
本文所用“治疗”包括对疾病或病理状况的症状或病变的任何有益或需要的效果，并且可包括治疗中的疾病或病症(例如，遗传性耳聋疾病)的一种或多种可测量标记物的甚至很小的减少。治疗可任选地包括疾病或病症的症状的减少或缓解，或者疾病或病症进展的延迟。“治疗”不一定表示疾病或病症或其相关症状的完全根除或治愈。如本文所用，受试者中疾病的“治疗”是指(1)预防受试者中发生的症状或疾病，所述受试者易患或尚未表现出疾病的症状；(2)抑制疾病或阻止其发展；或(3)改善或引起疾病或疾病症状的消退。如本领域所理解的，“治疗”是用于获得有益或期望结果的方法，包括临床结果。有益或期望的结果可以包括一种或多种，但不限于，减轻或改善无论可检测的还是不可检测的一种或多种症状、减轻病状(包括疾病)的程度、病状(包括疾病)的稳定(即，不恶化)状态、延缓或减缓病状(包括疾病)、进展、改善或减轻病状(包括疾病)、状态和缓解(无论部分或全部)。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”涵盖任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，如油/水或水/油乳液，及各种类型的润湿剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的实例，参见Martin(1975)Remington'sPharm.Sci.第15版(Mack Publ.Co.,Easton)。
诊断或治疗的“受试者”是细胞或动物，例如哺乳动物或人。受试者不限于特定物种，包括接受诊断或治疗的非人动物和接受感染或动物模型的那些动物，包括但不限于猿、鼠、大鼠、犬或兔类物种，以及其它家畜、运动类动物或宠物。在一些实施方案中，所述受试者是人。
本文所用术语“有效量”旨在意指足以达到所需效果的量。在治疗或预防应用的情况下，有效量将取决于所讨论的病症的类型和严重性以及个体受试者的特征，例如一般健康、年龄、性别、体重和对药物组合物的耐受性。在基因疗法的背景下，在一些实施方案中，有效量是足以导致在受试者中缺陷的基因恢复部分或全部功能的量。在其它一些实施方案中，AAV病毒颗粒的有效量是足以导致基因在受试者中表达的量。在一些实施方案中，所述有效量是在有需要的受试者中增加半乳糖代谢所需的量。熟练的技术人员将能够根据这些和其它因素确定合适的量。
在一些实施方案中，有效量将取决于所讨论的应用的大小和性质。它还取决于目标受试者的性质和敏感性以及使用的方法。本领域技术人员将能够基于这些和其它考虑来确定有效量。根据实施方案，有效量可以包括组合物的一次或多次施用、基本上由组合物的一次或多次施用组成或由组合物的一次或多次施用组成。
如本文所用，术语“施用”旨在表示将物质递送至受试者，诸如动物或人。施用可以在整个治疗过程中以一个剂量、连续或间歇地进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗目的以及被治疗的受试者的年龄、健康或性别而变化。可以进行单次或多次施用，剂量水平和模式由治疗医师选择，或者在宠物和其它动物的情况下，由治疗兽医选择。
剂量和施用
确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗的目的和被治疗的受试者而变化。可以进行单次或多次施用，剂量水平和模式由治疗医师选择。剂量可能受施用途径的影响。合适的剂量制剂和施用所述试剂的方法是本领域已知的。这种合适剂量的非限制性实例可以是每次施用低至10E9个载体基因组至至多10E17个载体基因组。
在本文所述方法的实施方案中，施用给受试者的病毒颗粒(例如AAV)的数量范围为约10E9个至约10E17个。在特定的一些实施方案中，给受试者施用约10E10至约10E12、约10E11至约10E13、约10E11至约10E12、约10E11至约10E14、约5×l0E11至约5×10E12或约10E12至约10E13个病毒颗粒。
在一些实施方案中，AAV颗粒修复受试者的基因缺陷。在一些实施方案中，在成功治疗的细胞、组织、器官或受试者中修复的靶多核苷酸(例如DFNB9)或多肽与未修复的靶多核苷酸或多肽的比率为至少约1.5:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约20:1、约50:1、约100:1、约1000:1、约10,000:1、约100,000:1或约1,000,000:1。修复的靶多核苷酸或多肽的量或比率可以通过本领域已知的任何方法来确定，包括但不限于Western印迹、Northern印迹、Southern印迹、PCR、测序、质谱、流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、荧光原位杂交、测序、免疫印迹和ELISA。
在一些实施方案中，通过静脉内、鞘内、脑内、心室内、鼻内、气管内、耳内、眼内或眼周、口服、直肠、透粘膜、吸入、经皮、肠胃外、皮下、皮内、肌内、胸膜内、局部、淋巴内、脑池内将病毒颗粒引入受试者；这样的引入也可以是动脉内、心脏内、心室下、硬膜外、大脑内、脑室内、视网膜下、玻璃体内、关节内、腹膜内、子宫内或其任何组合。在一些实施方案中，病毒颗粒的递送是全身性的。
为了眼内治疗耳科疾病，存在本领域技术人员已知的多种施用模式，包括但不限于：圆窗途径、耳蜗开窗术、前庭及内淋巴囊入路、半规管入路等，例如双侧、单侧圆窗注射。
本公开的AAV载体、AAV颗粒或组合物的施用可以在整个治疗过程中以一个剂量、连续或间歇地实现。在一些实施方案中，本公开的AAV载体、AAV颗粒或组合物通过注射、输注或植入进行肠胃外施用。本公开的AAV颗粒和组合物可与用于治疗的病症的其它已知治疗组合施用。
试剂盒
在一些实施方案中，本文所述的试剂、载体或组合物可以组装成药物或诊断或研究试剂盒以促进它们在治疗、诊断或研究应用中的使用。在一些实施方案中，本公开的试剂盒包括本文所述的AAV载体、AAV颗粒、宿主细胞、多肽组合物或药物组合物中的任一种。
在一些实施方案中，试剂盒还包括使用说明书。具体地，这样的试剂盒可以包括一种或多种本文所述的试剂，以及描述这些试剂的预期应用和正确使用的说明书。在一些实施方案中，试剂盒可以包括关于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并施用于受试者的说明书。在一些实施方案中，试剂盒中的试剂是适合于特定应用和试剂的施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的试剂盒可以含有用于进行各种实验的适当浓度或量的组分。
试剂盒可以设计成便于使用本文所述的方法，并且可以采取许多形式。在适用的情况下，试剂盒的每种组合物可以以液体形式(例如，在溶液中)或以固体形式(例如，干粉)提供。在某些情况下，一些组合物可以是可构成的或另外可加工的(例如，加工成活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其它物质(例如，水或细胞培养基)，其可以或可以不与试剂盒一起提供。在一些实施方案中，组合物可以在保存溶液(例如，冷冻保存溶液)中提供。保存溶液的非限制性实例包括DMSO、多聚甲醛。在一些实施方案中，保存溶液含有一定量的金属蛋白酶抑制剂。
在一些实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中含有本文所述的任何一种或多种组分。因此，在一些实施方案中，试剂盒可以包括容纳本文所述的试剂的容器。所述试剂可以是液体、凝胶或固体(粉末)的形式。所述试剂可以无菌制备，包装在注射器中并冷冻运输。或者，它们可以容纳在小瓶或其它容器中以便储存。第二容器可以具有无菌制备的其它试剂。或者，试剂盒可以包括预混合的活性剂，并在注射器、小瓶、管或其它容器中运输。试剂盒可以具有将试剂施用于受试者所需的一种或多种或所有组分，例如注射器、局部施用装置或IV针管和袋。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
实施例
实施例1：Otoferlin全长蛋白在HEK-293T细胞中切分位点的筛选
使用双反式剪接载体系统，第一个载体在编码N-Otof序列(即Otof的N端部分)后连接剪接供体序列(C-intein序列)，第二个载体在其相应的剪接受体序列(N-intein序列)，后紧接C-Otof编码序列(即Otof的C端部分)，且具有C端HA标签。其双载体序列在pAAV-CMV-EGFP-WPRE-SV40质粒骨架上(图2)改造，使用EcoRI和EcoRV双酶切将EGFP报告基因序列更换为所需目的序列，目的序列合成及载体构建委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，得到N-Otof和C-Otof-HA载体。将选择的几组切分位点按照相同摩尔比分别共转染于HEK-293T细胞。为了证实内含肽介导的反式剪接和加工效率，转染48小时后通过蛋白质印迹分析全长OTOF的表达。
1.1细胞转染
1)接种HEK-293T细胞至70-90％密度时准备转染；
2)A管：125μL无血清培养基+8μL Lipofectamine 3000reagent，充分混匀；
3)B管：125μL无血清培养基+DNA+8μL P3000 reagent，充分混匀；
每组切分点对应如下(与wb泳道编号相对应)，以相同摩尔数2.72517E-10转染细胞。
其中，第1、6、10、13、17、18、19、20、23、27、29、30组的含剪接供体序列的第一融合多肽的序列如SEQ ID NO:5-16所示；这些组的含剪接受体序列的第二融合多肽的序列如SEQ ID NO:17-28所示；
4)将B管混合物加到A管中，轻轻充分混匀；
5)室温静置10-15min；
6)加入DNA-脂质体复合物至细胞中；
7)37℃、95％空气和5％的CO2孵育，转染48小时后收样。
1.2蛋白提取
1)去除培养基，加1mL PBS洗2-3遍；
2)再用1mL PBS轻轻吹散细胞，将细胞悬液收集至离心管，700g离心5min后去上清液；
3)再加120μL(六孔板单孔)的RIPA裂解液(用之前加Cocktail(100×))冰上裂解30min，每10min涡旋一下，使细胞沉淀充分重悬于裂解液中；
4)最后，12000rpm离心15min收集上清(不要吸到沉淀)；
5)上清液加5×Sample Loading Buffer(金斯瑞)，混合均匀，放入75℃金属浴中，孵育15min。12000rpm离心2分钟即可上样(每次上样量为15μL，15孔胶)。
1.3Western Blot
1.3.1电泳
1)1x running buffer配制：950ml ddH2O+50ml 20x running buffer；
2)安装好电泳装置，倒入1x running buffer，检查是否漏水；
3)小心拔掉梳子，点样,100v恒压1h(碧云天4-12％，hepes体系)。
1.3.2转膜
1)提前配制1x transfer buffer，预冷；
1x transfer buffe配制：700ml水+200ml乙醇+100ml 10x transfer buffer
2)将胶卸下，用铲子分开两块玻璃，将上层胶切去；
3)将下层胶放入transfer buffer中平衡；
4)将pvdf膜用甲醇泡过后(活化3min)，放入transfer buffer中；
5)将转膜夹子黑色面朝下，按照：海绵—1层滤纸—胶—pvdf膜—1层滤纸—海绵的顺序排放，用铲子排出空气，并夹紧(不要有气泡)；
6)安装好后转膜装置后，将transfer buffer倒入电泳槽中；
7)冰上恒流300mA恒流转膜90min。
1.3.3洗膜
1)卸开装置，将pvdf膜取出；按目的蛋白大小裁膜，做好标记；
2)将裁好的pvdf膜放入孵育盒中，5％脱脂牛奶(利用TBST配制)，摇床室温封闭1h；
1.3.4抗体孵育
1)加入一抗，抗otoferlin(sc-271092)鼠IgG1抗体(Santa Cruz,1：500)；β-Actin(8H10D10)Mouse mAb抗体(CST,1：20000),摇床上4℃孵育过夜；
2)回收抗体，用TBST洗3遍，每次10-15min
3)加入二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(1：5000)，摇床上室温孵育1-2h
4)回收抗体，TBST洗3次，每次10-15min。
1.3.5利用诺唯赞显影液显影，在Western成像系统中观察结果并进行拍照。
结果如图4所示：对照为未转染的HEK-293T细胞；Western印迹显示泳道1、3、4、5、6、8、10、13、14、15、17、18、19、20、23、27、29、30中有全长otoferlin蛋白的表达。
实施例2：Otof基因敲除小鼠听觉功能分析和耳蜗形态学分析
2.1Otof基因敲除小鼠的听觉功能检测
通过听力脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)检测Otof敲除小鼠(赛业生物科技有限公司订购)和同窝的野生型小鼠整体的听觉功能差异。
1)称取小鼠体重，按照适当质量与体积比腹腔注射1％戊巴比妥钠。
2)待小鼠麻醉后，放入TDT工作站的隔音箱中，电极的正极插入小鼠大脑中线皮下，负极插入小鼠耳后皮下，地线插入小鼠大腿肌肉。检查电极指示灯，确认连接正常。
3)电脑打开测试文件，测试频率选择4-32kHz，记录噪音之上的临界阈值。
通过检测小鼠对4KHz、8KHz、12KHz、16KHz、24KHz、32KHz短纯音(tone burst)听力阈值，短纯音延续时间为10ms。从而分析小鼠的听力敏感性，从整体上判断小鼠从毛细胞到大脑皮层有无正常的听觉功能。ABR和DPOAE可以很好地反映了耳蜗毛细胞的完整性和耳蜗功能。
2.2Otof基因敲除小鼠毛细胞的电生理功能检测
通过膜片钳技术，采用全细胞-胞外记录方法，记录Otof基因敲除小鼠耳蜗内毛细胞的电化学变化，从而检测Otof基因敲除小鼠毛细胞的电生理功能变化情况。
2.3Otof基因敲除小鼠毛细胞数目检测
耳畸蛋白在小鼠耳蜗内毛细胞中高度表达，但在外毛细胞中低表达。通过免疫荧光染色检测在P0、P7、P14、P30等不同时间点Otof基因敲除小鼠内耳毛细胞存活的数量。
1)剪取小鼠整个耳部组织放入1×HBSS中，显微镜下解剖出颞骨，放入4％PFA中，使用镊子轻轻在颞骨顶端打孔，并用注射器反复吹进PFA，摇床震荡1-2h。
2)将颞骨放入0.5M EDTA中脱钙：P0-P7，脱钙3-4小时；P8-P15，脱钙1天；P15-P30，脱钙2天。
3)1×PBST反复冲洗3次。
4)将颞骨放入1×HBSS中，显微镜下解剖出耳蜗。
5)Cell-tak涂好盖玻片放入装有耳蜗的皿中，将耳蜗粘附在玻片上(正面朝上)。
6)粘附好的玻片放入4孔皿中(之前已加入3mL PBS)，待所有粘附好的玻片放入4孔皿后，加入1mL 16％PFA。
7)室温固定1h，PBST洗3次。
8)每个well加100μL blocking medium封闭1h。
9)使用PBT-1按比例稀释一抗，每个well 80-100μL，4℃过夜。
10)1×PBST洗3次，每次5min。
11)使用PBT-2按比例稀释二抗，每个well 80-100μL，室温避光孵育1h。
12)1×PBST洗3次，每次5min。
13)将玻片夹出放于载玻片上，每个玻片加6μL DAKO，盖上新玻片，指甲油封片，观察并拍照。
实施例3：效果验证
选择验证的表达量较高的切分位点，如1、6、10、13、17、18、19、20、23、27、29、30切分位点(图4，D)构建双AAV病毒。
1)准备HEK-293T细胞：按1：3传代，在150mm无菌皿中培养至8盘，细胞密度为80％-90％。
2)准备：DMEM、PEI、实施例1中的N-Otof和C-Otof-HA质粒、Anc80L65质粒(GenBank:KT235804.1)、helper质粒(GenBank:AF369965.1)。
3)准备3个无菌的15ml EP管，第一个标记为A管，A管中加入DMEM 3.444ml、PEI(1μg/μl)0.756ml，静置5分钟。
4)剩余2管标记为B1、B2，在其中分别加入N-Otof或C-Otof-HA质粒质粒7μg、Anc80L65质粒9μg、helper质粒14μg，加DMEM至2.1ml。
5)将A管中液体分别加入至B1、B2管中，逐滴加入，每管2.1ml，室温静置20-25分钟将混合液加入至准备好的HEK-293T细胞中。
6)12h后将培液吸取弃去，每盘加入293T细胞转染培养基20ml。48h后收集上清至无菌瓶中，4℃保存，大皿中每盘加入293T转染培养基20ml。
7)再48h后将细胞及上清收集至前述无菌瓶中行病毒纯化并进行滴度检测，滴度测定由病毒反向末端重复特异性qPCR确定。
病毒纯化步骤如下：
1)将收取上清和细胞置于50mL离心管(抗氯仿)中离心7min,11000r，4℃，吸取上清，留部分重悬沉淀细胞。加入1/10体积的氯仿，37℃，220r摇3h。
2)11000r，4℃，20min，收集上清，与上一步收集的上清混合在一起。
3)加入固体NaCL至浓度1mol/L，加PEG8000至终浓度10％(w/v)，完全溶解，4℃静置过夜。
4)11000r，4℃离心20min，去掉大部分上清，留1-2mL重悬所有沉淀，将剩余沉淀转移到多个新的2mL EP管，再将装有沉淀的2mL EP管进行离心，12000r/min离心7min。
5)向沉淀中加入700μl酶解液(含DnaseⅠ和Rnase)，37℃水浴1h，期间可以进行多次吹打混匀。
6)加等体积氯仿，剧烈摇晃，12000r/min离心7min，取上清。
7)加入等体积病毒溶解液(20％ PEG8000+2M Nacl+0.002％ F68+PBS)，4℃过夜。
8)12000r/mim离心7min，弃上清，再离心3min，弃上清。
9)用含有DnaseⅠ和Rnase的溶液溶解沉淀，加入适量酶解液溶解，然后再过氯仿取上清就是最后的病毒。
10)将装有病毒的1.5ml EP管开口室温放置30min后，可暂时放4°冰箱进行后续滴度检测。
滴度检测步骤如下：
1)消化基因组DNA和质粒DNA，孵育37℃，20min；95℃，10min，体系如下：
(37℃消化基因组DNA和质粒DNA；95℃热处理失活DNaseI)
2)加入等体积的lysis buffer(10μl)和2μl 20mg/ml proteinase K，孵育55℃，30min；95℃，10min。(lysis buffer:10mM Tris-HCl pH8.0+5mM EDTA+100ug/mlproteinase K)(室温放置)
PCR产物取4μl，用ddH2O稀释100倍至400μl，用2μl作为RT-QPCR的模板，体系如下：
程序如下：95℃，5min；95℃，10s；58℃，30s(40X)；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s；
计算滴度公式：y＝38.71-3.54x；y＝CT；tittering＝1000000*power(10,x)
通过耳蜗后半规管注射AAV-Otof-NT和AAV-Otof-CT重组载体病毒(8.5e12+8.5e12vg/mL(配比1:1，病毒总量3.4x1010 vg))到P30左右的成年的Otof-/-小鼠的左耳蜗中，成年鼠使用注射1％戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉后进行耳周处脱毛，耳后切口以暴露半规管，将半规管打孔后用玻璃微量移液管手动进行注射。注射后，用组织胶水粘合皮肤切口。然后将注射的小鼠置于37℃加热垫上进行恢复。手术后成年鼠在约30分钟左右完全康复后放回鼠笼中。手术后采用标准的术后护理。在两周后对小鼠进行ABR检测，评估注射后对小鼠整体听力的影响情况。
为了确定使用AAV载体的双载体系统由编码带有N-Intein的N-Otof和带有C-Intein的C-Otof的序列是否能够恢复听力损失以及恢复听力损失的程度，采用听力脑干反应(ABR)检测接受基因治疗后的不同年龄小鼠的听觉功能恢复状况。并对进行测听后的Otof-/-病毒注射侧耳蜗的感觉上皮进行显微切割并对otoferlin(内毛细胞)和Myosin7a(毛细胞)进行免疫标记，研究外源Otof基因在ko小鼠耳蜗细胞中的重组表达情况；
1)剪取小鼠整个耳部组织放入1×HBSS中，显微镜下解剖出颞骨，放入4％PFA中，使用镊子轻轻在颞骨顶端打孔，并用注射器反复吹进PFA，室温下固定1-2h。
2)将颞骨放入0.5M EDTA中浸泡脱钙：P0-P7，脱钙3-4小时；P8-P15，脱钙1天；P15-P60，脱钙2天。
3)1×PBST反复冲洗3次。
4)将颞骨放入1×HBSS中，显微镜下解剖出耳蜗。将整个感觉上皮细胞分成三段，且长度相等，分别标记为耳蜗的顶部、中部和底部，保存在HBSS中直至染色。
5)Cell-tak涂好盖玻片放入装有耳蜗的皿中，将耳蜗粘附在玻片上(正面朝上)。
6)粘附好的玻片放入4孔皿中(之前已加入3mL PBS)，待所有粘附好的玻片放入4孔皿后，在室温下用含有1％ Triton X-100和10％驴血清的PBS透化并封闭1小时。
7)使用PBT-1按比例稀释一抗，otoferlin抗体(ab53233,1:200,Abcam)，Myosin7a抗体(256790,1:1000,Proteus)，每个孔80-100μl，4℃过夜。
8)1×PBST洗3次，每次5min。
9)使用PBT-2按比例稀释相对应的二抗，每个well 80-100μl，室温避光孵育1h。
10)1×PBST洗3次，每次5min。
11)将玻片夹出放于载玻片上，每个玻片加6μl DAKO，盖上新玻片，指甲油封片，观察并拍照。
为了探索Otof基因在小鼠内耳发育过程中所起到的作用，我们首先需要检测Otof在内耳中的表达情况。Otof在内耳具有丰富的表达。为了进一步检测Otof在内耳基底膜中的具体表达部位以及表达的时间谱，我们对不同时间点的野生型小鼠进行了免疫荧光染色。并通过耳蜗基底膜铺片对Otof在内耳中的表达定位进行免疫荧光染色。用Myosin7a作为毛细胞的标记物。我们选取了P0，P7，P14，P30这三个发育不同时期的时间点，在毛细胞层面，在这三个发育不同时间点，在基底膜铺片中OTOF均和Myosin7a共定位，说明OTOF在毛细胞的细胞质表达。以上实验表明OTOF在内耳中有着丰富的表达，并且主要表达在毛细胞中内毛细胞表达。
从赛业生物科技有限公司订购了Otof敲除小鼠进行繁殖。为了确保Otof敲除小鼠内耳中的Otof蛋白确实已经被敲除，我们首先通过基因型鉴定的方法筛选出纯合、杂合以及野生型小鼠。我们首先通过免疫荧光染色对这一目的进行检测。我们用了P0、P7、P14、P30等不同时间点的WT和Otof-/-小鼠，免疫荧光染色结果显示在野生型小鼠中，Otof在毛细胞表皮板层面中都有着丰富的表达，但是在Otof-/-小鼠内耳毛细胞表皮板层面中已经检测不到OTOF的表达。这说明我们后面所使用的Otof-/-小鼠内耳中OTOF蛋白都是已经被彻底敲除的。
接着检测Otof敲除小鼠的听力状况，首先我们通过ABR的听力学检测方法对出生后30天的纯合敲除小鼠以及同窝野生型对照小鼠进行测听，ABR主要用来检测声音传输过程中所有部位的功能是否正常。结果如图5所示，接受治疗的成年Otof-/-敲除小鼠模型，从注射后两周后，ABR阈值降低，听力部分频段显著恢复；ABR结果显示敲除Otof基因后，小鼠的听力阈值在低频、中频和高频都出现明显升高，说明Otof对小鼠的听力起到重要作用。本申请的双AAV系统实现了小鼠耳蜗内otoferlin蛋白的表达，恢复了内耳毛细胞中突触囊泡的释放并使双耳听力得到恢复。以上实验结果表明，Otof基因对小鼠的听觉具有重要的调控作用，尤其是对内毛细胞的功能。
对接受治疗的成年Otof-/-敲除小鼠模型，在2周后取耳蜗进行基底膜铺片染色，结果如图6所示。免疫荧光结果显示双AAV系统均不同程度实现了小鼠耳蜗的otoferlin蛋白的表达。

Claims (23)

1.一种融合多肽，由otoferlin蛋白的部分和内含肽系统的部分组成，
其中，所述融合多肽是第一融合多肽或第二融合多肽，
所述第一融合多肽从N端至C端由SEQ ID NO:1所示的otoferlin蛋白的第1至第n位氨基酸和内含肽的N端片段组成，
所述第二融合多肽从N端至C端由内含肽的C端片段和SEQ ID NO:1所示的otoferlin蛋白的第(n+1)至第1997位氨基酸组成，
其中n选自以下任意整数：797、872、900、926、977、980、992、994、1003、1064、1161、1169，
所述内含肽的N端片段如SEQ ID NO:2所示，所述内含肽的C端片段如SEQ ID NO:3所示。
2.如权利要求1所述的融合多肽，其中，
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:5所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:17所示，或
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:6所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:18所示，或
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:7所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:19所示，或
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:8所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:20所示，或
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:9所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:21所示，或
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:10所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:22所示，或
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:11所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:23所示，或
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:12所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:24所示，或
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:13所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:25所示，或
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:14所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:26所示，或
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:15所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:27所示，或
所述第一融合多肽如SEQ ID NO:16所示，所述第二融合多肽如SEQ ID NO:28所示。
3.一种多肽组合物，由权利要求1-2中任一项所记载的第一融合多肽和第二融合多肽组成。
4.一种多核苷酸，包含以下序列：编码权利要求1-2中任一项所述的融合多肽或权利要求3所述的多肽组合物的核酸序列。
5. 如权利要求4所述的多核苷酸，其中，编码第一融合多肽的多核苷酸如SEQ ID NO:29-40中任一项所示，和/或，编码第二融合多肽的多核苷酸如SEQ ID NO:41-52中任一项所示。
6.一种核酸构建物，所述核酸构建物：
（1）表达权利要求1-2中任一项所述的融合多肽或权利要求3所述的多肽组合物，和/或
（2）包含权利要求4或5所述的多核苷酸的序列。
7.如权利要求6所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是载体。
8.如权利要求7所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物为AAV载体。
9.如权利要求6-8任一项所述的核酸构建物，其特征在于，
所述核酸构建物包含一表达框，编码第一融合多肽和第二融合多肽的多核苷酸均位于该表达框中，或者
所述核酸构建物包含两表达框，分别包含编码第一融合多肽和第二融合多肽的多核苷酸。
10.如权利要求9所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是两AAV载体，分别包含编码第一融合多肽和第二融合多肽的多核苷酸，以及位于所述多核苷酸侧翼的一个或更多个末端反向重复序列。
11.如权利要求10所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物还包括用于表达其上所含多核苷酸的元件。
12. 如权利要求11所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有SEQ ID NO:4所示的序列。
13.一种rAAV载体系统，包含两AAV载体和编码AAV病毒所需基因的核酸构建物，所述两AAV载体分别包含编码第一融合多肽和第二融合多肽的多核苷酸，所述第一融合多肽和第二融合多肽如权利要求1或2中所记载。
14.如权利要求13所述的rAAV载体系统，其特征在于，AAV病毒所需基因选自以下的一种或多种：Rep、Cap、E2A、E4和VA基因。
15.如权利要求14所述的rAAV载体系统，其特征在于，所述AAV载体系统包含Anc80L65质粒、helper质粒和所述AAV载体。
16.一种rAAV病毒颗粒，包含权利要求4或5所述的多核苷酸。
17.如权利要求16所述的rAAV病毒颗粒，其特征在于，所述rAAV病毒颗粒选自rAAV1、rAAV2、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12、rAAV13、rAAVPHP.B或rAAVrh74中的一种或多种。
18.一种宿主细胞，所述宿主细胞：
（1）包含、表达和/或分泌权利要求1-2中任一项所述的融合多肽或权利要求3所述的多肽组合物，
（2）包含权利要求4或5所述的多核苷酸、权利要求6-12中任一项所述的核酸构建物或权利要求13-15所述的AAV载体系统，或
（3）染色体中整合有权利要求4或5所述的多核苷酸。
19.如权利要求18所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是HEK293细胞。
20.一种制备otoferlin蛋白的方法，包括在适合进行内含肽剪接的条件下使第一融合多肽和第二融合多肽接触，所述第一融合多肽和第二融合多肽如权利要求1-2中任一项所记载。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：在适合进行内含肽剪接的条件下孵育权利要求18或19所述的宿主细胞。
22.权利要求1-2中任一项所述的融合多肽、权利要求3所述的多肽组合物、权利要求4或5所述的多核苷酸、权利要求6-12中任一项所述的核酸构建物、权利要求18或19所述的宿主细胞在制备用于治疗由Otof基因缺陷引起的疾病的药物中的应用，其中，所述疾病是DFNB9听力障碍。
23.一种药物组合物，包含药学上可接受的辅料，和选自以下的一种或多种：权利要求1-2中任一项所述的融合多肽、权利要求3所述的多肽组合物、权利要求4或5所述的多核苷酸、权利要求6-12中任一项所述的核酸构建物、权利要求13-15所述的rAAV载体系统、权利要求16或17所述的rAAV病毒颗粒、权利要求18或19所述的宿主细胞。
CN202310874589.7A 2023-07-17 2023-07-17 双载体系统表达Otof基因的组合物和方法 Active CN116925239B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310874589.7A CN116925239B (zh) 2023-07-17 2023-07-17 双载体系统表达Otof基因的组合物和方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310874589.7A CN116925239B (zh) 2023-07-17 2023-07-17 双载体系统表达Otof基因的组合物和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116925239A CN116925239A (zh) 2023-10-24
CN116925239B true CN116925239B (zh) 2024-10-18

Family

ID=88393470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310874589.7A Active CN116925239B (zh) 2023-07-17 2023-07-17 双载体系统表达Otof基因的组合物和方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116925239B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023064388A2 (en) * 2021-10-12 2023-04-20 Decibel Therapeutics, Inc. Stereocilin promoters and uses thereof

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4445701A (en) * 2000-03-24 2001-10-03 Centre National De La Recherche Scientifique-Cnrs Multiple human and mouse otoferlin isoforms
CA2979120A1 (en) * 2015-03-03 2016-09-09 Fondazione Telethon Multiple aav vector system for expressing genes over 5 kilobases, comprising at least one degradation signal and uses thereof
CN110225975A (zh) * 2016-08-23 2019-09-10 阿库斯股份有限公司 用于治疗人受试者中非年龄相关的听力损害的组合物和方法
EP3635100A4 (en) * 2017-05-05 2021-03-24 University of Florida Research Foundation, Incorporated COMPOSITIONS AND METHOD OF EXPRESSION OF OTOFERLIN
DE102018103924A1 (de) * 2018-02-21 2019-08-22 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin Gentherapeutische Behandlung von Schwerhörigkeit
WO2019165292A1 (en) * 2018-02-22 2019-08-29 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
US11660353B2 (en) * 2018-04-27 2023-05-30 Decibel Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating sensorineural hearing loss using otoferlin dual vector systems
KR20210104661A (ko) * 2018-10-15 2021-08-25 폰다지오네 텔레톤 인테인 단백질 및 이의 용도
US20210395778A1 (en) * 2018-11-01 2021-12-23 University Of Florida Research Foundation, Incorporated A codon optimized otoferlin aav dual vector gene therapy
DK3911354T5 (da) * 2019-01-18 2024-08-05 Pasteur Institut AVV-formidlet genterapi, der genskaber otoferlin-genet
AU2020357740A1 (en) * 2019-09-30 2022-04-28 Eli Lilly And Company Adeno-associated virus (AAV) systems for treatment of genetic hearing loss
CN115066432A (zh) * 2019-10-30 2022-09-16 分贝治疗公司 使用耳畸蛋白双载体系统治疗感觉神经性听力损失的组合物和方法
CN115052989B (zh) * 2019-11-04 2024-08-13 分贝治疗公司 耳蜗内毛细胞启动子及其用途
BR112022015601A2 (pt) * 2020-02-07 2022-10-11 Childrens Medical Ct Corp Grandes vetores genéticos e dispensação e usos dos mesmos
JP2023520488A (ja) * 2020-04-01 2023-05-17 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド Ｕｓｈ１ｂの処置のための安全性が改善されたデュアルａａｖ－ｍｙｏ７ａベクター
CA3197592A1 (en) * 2020-11-06 2022-05-12 Steven Pennock Variant adeno-associated virus (aav)capsid polypeptides and gene therapeutics thereof for treatment of hearing loss
EP4333905A2 (en) * 2021-05-05 2024-03-13 Decibel Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating sensorineural hearing loss using stereocilin dual vector systems
CA3231374A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-16 Saaid SAFIEDDINE Dual recombinant aav8 vector system encoding isoform 5 of otoferlin and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023064388A2 (en) * 2021-10-12 2023-04-20 Decibel Therapeutics, Inc. Stereocilin promoters and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN116925239A (zh) 2023-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11781145B2 (en) Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
JP7408228B2 (ja) ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物及び方法
US20240252679A1 (en) Recombinant adeno-associated virus having variant capsid, and application thereof
KR20210008561A (ko) 합성 간-향성 아데노-연관 바이러스 캡시드 및 그의 용도
US11807867B2 (en) Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
US20240190929A1 (en) Compositions and methods of treating usher syndrome iii
US20050281786A1 (en) AAV mediated gene delivery to cochlear cells
WO2020010491A1 (zh) 编码人nadh脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用
JP2023551533A (ja) 前庭神経鞘腫関連症状を治療するための抗ｖｅｇｆ抗体構築物及び関連する方法
CN116925239B (zh) 双载体系统表达Otof基因的组合物和方法
WO2023198050A1 (zh) 一种融合型腺相关病毒及其应用
WO2020000641A1 (zh) 编码人nadh脱氢酶亚单位蛋白的核酸及其应用
US20240067989A1 (en) Compositions and Methods for Treating Retinal Disorders
CN112063625A (zh) 编码arl2bp的核酸及其应用
CN117947098A (zh) 用于改善眼部疾病的基因治疗载体及其应用
CN114521214A (zh) 视紫红质转录体特异性反式剪接核酶及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant