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JP2022547053A - ユニバーサルドナー細胞 - Google Patents

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Abstract

複数の対象に適合する遺伝子改変細胞、例えばユニバーサルドナー細胞及び前記遺伝子改変細胞を作製する方法が本明細書で提供される。ユニバーサルドナー細胞は、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子内又はその近傍の少なくとも１つの遺伝子改変を含み、遺伝子改変は、免疫寛容原性因子をコードするポリペプチドの挿入を含む。ユニバーサルドナー細胞は、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする遺伝子内又はその近傍での少なくとも１つの遺伝子改変をさらに含み得、前記遺伝子改変は、第２の免疫寛容原性因子をコードするポリペプチドの挿入を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８９６，４７７号明細書及び２０２０年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９７９，７５６号明細書の利益を主張し、各々の開示は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組み込み
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式でＥＦＳ－Ｗｅｂにより提出された配列表を含み、これは、全体として参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年９月２日に作成されたＡＳＣＩＩの複製は、ＣＴ１２３－ＰＣＴ－１００８６７－６６６５１３－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、サイズが約５３，０００バイトである。
本発明は、遺伝子編集の分野に関し、いくつかの実施形態では、複数の対象に適合する細胞、例えばユニバーサルドナー細胞を作製する目的のための遺伝子改変に関する。
ＨＬＡ適合、抗体によりＴ細胞活性化を誘発する経路の遮断、免疫抑制剤のカクテルの使用及び自己細胞療法を含む、移植された細胞又は生着された細胞の同種拒絶を克服するために、様々な手法が提案されてきた。移植片拒絶を弱める別の戦略は、移植された細胞又は生着された細胞とレシピエントとの間の同種間相違の最小化を含む。６番染色体上のヒト主要組織適合抗原複合体に位置する遺伝子によってコードされる分子である、細胞表面に発現されるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、免疫拒絶の主要なメディエーターである。ドナーと対象との間の単一のＨＬＡ遺伝子の不一致は、強い免疫応答を引き起こし得る（Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｕｅｒ Ｋ．ｅｔ ａｌ．“Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ＨＬＡ－Ｂ４４”，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，１９９０，３２３：１８１８－１８２２）。ＨＬＡ遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）及びＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）に分類される。ＭＨＣ－Ｉ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）は、ほとんど全ての組織型において発現され、「非自己」の抗原がプロセシングされたペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示し、それにより細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞へのそれらの活性化を促進する。「非自己」ＭＨＣ－Ｉ分子を発現する移植された細胞又は生着された細胞は、これらの細胞に向けられる強い細胞性免疫応答を引き起こし、最終的に、活性化された細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞によるそれらの消滅をもたらす。ＭＨＣ－Ｉタンパク質は、本質的に、小胞体中のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と関連し、これは、細胞表面上で機能的ＭＨＣ－Ｉ分子を形成するために必須である。
ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の広範な細胞での発現とは対照的に、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現は、樹状細胞、マクロファージ及びＢ細胞などの抗原提示細胞に制限される。ＨＬＡ抗原遺伝子は、ヒトゲノムにおいて観察される最も多型の遺伝子である（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ Ｐ．，“ＨＬＡ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ－－ｈｏｗ ｍｕｃｈ ｉｓ ｅｎｏｕｇｈ？”Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，２００１，３４５：１８４２－１８４４）。いずれのＨＬＡ遺伝子型とも適合する「ユニバーサルドナー」細胞の作製は、免疫拒絶及び免疫回避のための既存の方法論の関連する経済的コストを解決し得る代替の戦略を提供する。
そのようなユニバーサルドナー細胞の系列を作製するために、先行する１つの手法は、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩクラス遺伝子の発現を機能的に破壊した。これは、例えば、ＭＨＣ－Ｉ軽鎖、Ｂ２Ｍをコードする両方の遺伝子アレルの遺伝子破壊により活性化され得る。得られたＢ２Ｍ欠損細胞株及びその派生体は、表面ＭＨＣ－Ｉの著しい減少、それにより同種のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する免疫原性の低減を呈すると予想されるであろう。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）で標的化する手法を使用して、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン２中の数ヌクレオチドの欠失によってＢ２Ｍ欠損ｈＥＳＣ株を作製してきた（Ｌｕ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ ２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ”，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ．２０１３，９：８０６－８１３）。Ｂ２Ｍ標的化ｈＥＳＣ株は、表面ＨＬＡ－Ｉ欠損であると思われたが、それらは、依然としてＢ２Ｍ及びＭＨＣ－Ｉに特異的なｍＲＮＡを含有することが見出された。Ｂ２Ｍ及びＭＨＣ－Ｉ ｍＲＮＡは、非標的化ｈＥＳＣのものと均等なレベルで発現された（両方とも構成的であり、且つＩＦＮ－ｇ誘導性である）。したがって、これらのＴＡＬＥＮ Ｂ２Ｍ標的化ｈＥＳＣ株は、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡも発現するＢ２Ｍ２／２マウス細胞で観察されたように、免疫拒絶を引き起こすのに十分であると考えられる残留細胞表面ＭＨＣ－Ｉを発現する可能性があるという懸念がある（Ｇｒｏｓｓ，Ｒ．ａｎｄ Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．“Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ”，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９３，９０：３９１３－３９１７）。ＴＡＬＥＮ Ｂ２Ｍ標的化ｈＥＳＣ株は、オフターゲット切断現象について試験されなかったが、ＴＡＬＥＮを使用する際の非特異的切断の発生は、それらの臨床使用に対して主要な安全性の懸念を強いると考えられる重大な問題のままである（Ｇｒａｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．“ＴＡＬＥＮｏｆｆｅｒ：ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＴＡＬＥＮ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ”，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１３，２９：２９３１－２９３２；Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．“Ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＤＮＡ－ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１４，１１：４２９－４３５）。さらに、別の報告では、第１のＢ２Ｍアレルをノックアウトし、且つ第２のＢ２ＭアレルでＨＬＡ－Ｅ遺伝子をノックインして、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃの表面発現がない状態でＨＬＡ－Ｅの二量体又は三量体の表面発現をもたらすことにより、同種認識を回避したＩＰＳ細胞を作製した（Ｇｏｒｎａｌｕｓｓｅ，Ｇ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，“ＨＬＡ－Ｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｓｃａｐｅ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｌｙｓｉｓ ｂｙ ＮＫ ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５，７６５－７７３）。
上記の戦略の一部の潜在的な制約は、ＭＨＣクラスＩ陰性細胞が、ＨＬＡ分子がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する主要なリガンド阻害剤として機能するため、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって溶解されやすいことである。宿主ＮＫ細胞は、移植又は生着されたＢ２Ｍ－／－ドナー細胞を除去することが示されており、同様の現象は、ＭＨＣクラスＩ陰性ヒト白血病株によりインビトロで発生する（Ｂｉｘ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ＭＨＣ－ｍａｔｃｈｅｄ ｍｉｃｅ”，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３４９，３２９－３３１；Ｚａｒｃｏｎｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｓ ａｓ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８７，４７，２６７４－２６８２）。したがって、先行する方法を改善して免疫応答を回避できるユニバーサルドナー細胞を作製する必要性及び生着後に生存できる細胞を作製する必要性が存在する。本明細書に記載されるとおり、生着後の細胞の生存は、同種拒絶に依存しない多くの他の経路、例えば低酸素、活性酸素種、栄養欠乏及び酸化ストレスによって媒介され得る。また、本明細書に記載されるとおり、生存因子（遺伝子及び／又はタンパク質）の遺伝的導入は、細胞が生着後に生存することを促進し得る。本明細書に記載されるとおり、ユニバーサルドナー細胞株は、同種拒絶及び生着後の生存の両方に対処する特性を兼ね備え得る。
いくつかの態様では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製するための方法を包含する。方法は、（ａ）生存因子をコードする遺伝子内又はその近傍の部位を標的化する部位特異的ヌクレアーゼ、並びに（ｂ）（ｉ）（ａ）の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）（ａ）の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列に隣接する、免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に送達することを含み、部位特異的ヌクレアーゼは、（ａ）の標的部位を切断し、（ｂ）の核酸は、（ａ）の部位と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその中に含有される部位で挿入され、それによりユニバーサルドナー細胞を作製し、ユニバーサルドナー細胞は、（ｂ）の核酸が挿入されていない細胞と比較して増加した細胞生存を有する。
いくつかの実施形態では、生存因子は、ＴＸＮＩＰ、ＺＮＦ１４３、ＦＯＸＯ１、ＪＮＫ又はＭＡＮＦであり、及び免疫寛容原性因子は、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４又はＣＤ４７である。特定の実施形態では、生存因子は、ＴＸＮＩＰであり、及び免疫原性寛容因子は、ＨＬＡ－Ｅである。部位特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系である実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はＶ型Ｃｆｐ１ヌクレアーゼであり、及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、少なくとも１つの核移行シグナルに連結される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１５～２４又は４５～５４から選択されるポリヌクレオチド配列を標的化し、及び（ｉ）配列番号２５のヌクレオチド配列から本質的になり、且つ（ｉｉ）配列番号３２のヌクレオチド配列から本質的になる。
いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子の１つ以上をコードする遺伝子内又はその近傍の部位を標的化する部位特異的ヌクレアーゼ、並びに（ｄ）（ｉｉｉ）（ｃ）の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、及び（ｉｖ）（ｃ）の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列に隣接する、免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に送達することをさらに含み、（ｄ）の免疫寛容原性因子は、免疫寛容原性因子（ｂ）と異なり、部位特異的ヌクレアーゼは、（ｃ）の標的部位を切断し、（ｄ）の核酸は、（ｃ）の部位と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその中に含有される部位で挿入され、ユニバーサルドナー細胞は、（ｄ）の核酸が挿入されていない細胞と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ若しくはＨＬＡ－Ｃから選択されるＭＨＣ－Ｉ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ若しくはＨＬＡ－ＤＲから選択されるＭＨＣ－ＩＩ遺伝子又はＢ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ若しくはＲＦＸＡＮＫから選択される遺伝子であり、及び免疫寛容原性因子は、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４又はＣＤ４７である。特定の実施形態では、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする遺伝子は、Ｂ２Ｍであり、及び免疫寛容原性因子は、ＰＤ－Ｌ１である。部位特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系である実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はＶ型Ｃｆｐ１ヌクレアーゼであり、及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、少なくとも１つの核移行シグナルに連結される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１～３又は３５～４４から選択されるポリヌクレオチド配列を標的化し、及び（ｉｉｉ）配列番号７のヌクレオチド配列から本質的になり、且つ（ｉｖ）配列番号１３のヌクレオチド配列から本質的になる。
いくつかの実施形態では、（ｂ）及び（ｄ）の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列は、外来プロモーターに作動可能に連結される。外来プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的又は細胞型特異的プロモーターから選択され得る。いくつかの実施形態では、外来プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ又はＵＢＣプロモーターである。特定の実施形態では、外来プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。
本開示は、本明細書で開示される方法によって作製されるユニバーサルドナー細胞も包含する。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（造血幹細胞（ＨＳＣ）とも呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、細胞は、分化細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、体細胞である。
一般に、本明細書で開示されるユニバーサルドナー細胞は、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、系列限定前駆細胞は、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、造血前駆細胞又は神経前駆細胞であり、及び完全に分化した体細胞は、膵ベータ細胞などの内分泌性細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞又は免疫系細胞である。いくつかの実施形態では、完全に分化した体細胞は、心筋細胞である。
本開示のさらなる態様は、治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、本明細書で開示されるとおりのユニバーサルドナー細胞を、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞への分化後に得るか又は得ていることと、対象に系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞を投与することとを含む方法を提供する。また、細胞であって、それを必要とする対象への投与のための細胞を得る方法であって、本明細書で開示されるとおりのユニバーサルドナー細胞を得るか又は得ていることと、ユニバーサルドナー細胞を、細胞が系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化するのに十分な時間にわたって且つ条件下で維持することとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象は、疾患を有するか、それを有することが疑われるか又はそのリスクがあるヒトである。いくつかの実施形態では、疾患は、遺伝的に受け継がれる疾患である。
本開示のさらに別の態様は、配列番号１５～２４又は４５～５４から選択されるポリヌクレオチド配列を標的化するｇＲＮＡを包含する。
本開示は、様々な改変形態及び代替形態が可能であるが、その特定の実施形態は、図面中の例を通して示され、本明細書で詳細に記載される。しかしながら、本明細書に示される図面及び詳細な説明は、本開示を、開示された特定の実施形態に限定することを意図したものではなく、逆に、添付の特許請求の範囲によって定義されるとおりの本開示の趣旨及び範囲内に入る全ての変更形態、均等物及び代替形態を包含することを意図していることが理解されるべきである。
本開示の他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して、本発明の実施形態の以下の詳細な説明において明らかになるであろう。
ＣｙＴ４９細胞におけるＢ２Ｍ ｇＲＮＡ切断のＴＩＤＥ分析を示す。Ｂ２Ｍ－１、Ｂ２Ｍ－２及びＢ２Ｍ－３ ｇＲＮＡが試験された。 ＷＴ ＣｙＴ４９細胞（図２Ａ）及びＢ２Ｍ ＫＯ ＣｙＴ４９細胞（図２Ｂ）におけるＩＦＮ－γあり及びなしの両方でのＢ２Ｍ発現のフローサイトメトリー評価を示す。 ＨＤＲのためのＢ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＰＤ－Ｌ１ドナーベクターのプラスミドマップを示す。 Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＣｙＴ４９幹細胞の多能性のフローサイトメトリー分析を示す。派生したクローンは、多能性に不可欠な２つの転写因子であるＯＣＴ４及びＳＯＸ２の＞９９％の二重陽性であった。ＩｇＧは、陰性対照として使用された。 ＷＴ ＣｙＴ４９（図５Ａ）及びＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ（図５Ｂ）に由来する幹細胞クローンのフローサイトメトリー分析を示す。ＷＴ細胞は、ＩＦＮγに応答するＢ２Ｍ発現を上方制御する。Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩクローンは、ＰＤ－Ｌ１を十分に発現し、ＩＦＮγ処理の有無に関わらずＢ２Ｍを発現しない。ＮＴ－１＝未処理。ＩＮＴＧ－１＝５０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγで４８時間処理された細胞。 野生型、ＣｙＴ４９、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ又はＢ２Ｍ ＫＯ ＣｙＴ４９細胞から分化した段階１（胚体内胚葉）細胞でのＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７に関するフローサイトメトリーを示す。 野生型、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ又はＢ２Ｍ ＫＯ細胞から分化した段階１（胚体内胚葉）細胞におけるＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７発現に関する定量的パーセンテージを示す。 野生型、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ又はＢ２Ｍ ＫＯ細胞から分化した段階４（ＰＥＣ）細胞におけるＣＨＧＡ、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１発現に関する定量的パーセンテージを示す。 段階４（ＰＥＣ）の細胞の不均一な集団を示す。 野生型、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ又はＢ２Ｍ ＫＯ細胞から分化した細胞における分化時間経過にわたる選択された遺伝子発現を示す。 野生型、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ又はＢ２Ｍ ＫＯ細胞から分化した細胞における分化時間経過にわたる選択された遺伝子発現を示す。図１１Ａは、野生型細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。図１１Ｂは、Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。図１１Ｃは、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。図１１Ｄは、野生型細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現を示す。図１１Ｅは、Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現を示す。図１１Ｆは、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現を示す。 野生型、ＰＤ－Ｌ１／Ｂ２Ｍ ＫＯ又はＢ２Ｍ ＫＯ細胞から分化した細胞におけるＰＥＣ段階でのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ発現を示す。図１２Ａは、野生型細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現を示す。図１２Ｂは、Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現を示す。図１２Ｃは、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現を示す。図１２Ｄは、野生型細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ ＰＤ－Ｌ１発現を示す。図１２Ｅは、Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ発現を示す。図１２Ｆは、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ発現を示す。 ＴＣ１１３３ ｈｉＰＳＣにおけるＴＸＮＩＰ ｇＲＮＡ切断のＴＩＤＥ分析を示す。ガイドＴ５は、エクソン１での切断に最も適しているように見えた。 ＨＤＲのためのＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＨＬＡ－Ｅドナーベクターのプラスミドマップを示す。 Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ ＣｙＴ４９幹細胞の多能性に関するフローサイトメトリー分析を示す。派生したクローンは、多能性に不可欠な２つの転写因子であるＯＣＴ４及びＳＯＸ２の＞９９％の二重陽性であった。クローンはまた、Ｂ２Ｍを発現しない。クローンは、ＭＨＣ－Ｉを発現しない。 Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ ＣｙＴ４９幹細胞の多能性に関するフローサイトメトリー分析を示す。派生したクローンは、段階６（未成熟細胞）までの分化を経た後にＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅを発現する。ＩｇＧは、陰性対照として使用された。 野生型、Ｂ２Ｍ ＫＯ、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ（Ｖ１Ａ）又はＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ（Ｖ１Ｂ）ｈＥＳＣから分化した段階４（ＰＥＣ）細胞におけるＣＨＧＡ、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１発現の定量的パーセンテージを示す。 ＴＸＮＩＰ ＫＯ細胞（図１８Ａ）又はＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ（Ｖ１Ｂ）（図１８Ｂ）細胞における分化時間経過にわたる選択された遺伝子発現を示す。 ＣＦＳＥ増殖アッセイを使用するＴ細胞活性化のためのフローサイトメトリー分析を示す。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＷＴ、Ｂ２Ｍ ＫＯ、Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ又はＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ＋ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ ＣｙＴ４９クローンに由来するＰＥＣと共インキュベートした（図１９Ａ）。図１９Ｂは、様々な細胞におけるＴ細胞活性化を要約する。対照として「ＣＦＳＥ－Ｔ単独」セットを伴う一方向ＡＮＯＶＡ（ダネット多重比較検定によるα＝０．０５）。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝非有意。 ＴＸＮＩＰ ＫＯ細胞から分化した細胞の分化時間経過にわたる選択された遺伝子発現を示す。 ＴＸＮＩＰ ＫＯ細胞から分化したＰＥＣ細胞におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１発現のフローサイトメトリー評価を示す。 段階６まで分化した後の野生型（「ＷＴ」）及び非切断ガイド対照（「ＮＣＧ＃１」）細胞と比較した様々なＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローン（「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－Ｈ９」、「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－３Ｂ１１」、「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－１Ｇ７」及び「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－３Ｃ２」）の形態を示す。 段階６までの分化後のクローンの選択された遺伝子発現を示す。図２３Ａは、例示的なＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローンから分化した細胞の分化時間経過にわたる選択された遺伝子発現を示す。図２３Ｂ－２３Ｆは、未分化Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローン（「ＥＳ－Ｖ１Ｂ－Ｈ９」）並びに対照としての野生型の島（「Ｉｓｌｅｔｓ」）とともに段階６まで分化された野生型細胞（「Ｓ６－Ｃｙｔ４９ ＷＴ」）、非切断ガイド対照（「Ｓ６－ＮＣＧ＃１」）細胞並びに様々なＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローン（「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－Ｈ９」、「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－３Ｂ１１」、「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－１Ｇ７」及び「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－３Ｃ２」）におけるＩＮＳ（図２３Ｂ）、ＮＫＸ６．１（図２３Ｃ）、ＧＣＧ（図２３Ｄ）、ＳＳＴ（図２３Ｅ）及びＧＣＫ（図２３Ｆ）の遺伝子発現を示す。 Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローンから分化された段階６の細胞におけるＩＮＳ及びＧＣＧの発現（図２４Ａ）並びにＩＮＳ及びＮＫＸ６．１の発現（図２４Ｂ）のフローサイトメトリー評価を示す。 野生型細胞（「Ｓ６－ＷＴ」）、非切断ガイド対照細胞（「Ｓ６－ＮＣＧ＃１」）並びに２つのＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローン（「Ｓ６－Ｖ１Ｂ００３」及び「Ｖ１Ｂ－Ｈ９」）から分化した段階６の細胞におけるＩＮＳの発現（図２５Ａ）及びＮＫＸ６．１の発現（図２５Ｂ）のパーセンテージを示す。 異なる播種密度を有するクローン１（Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ）から分化した段階４の細胞におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現のフローサイトメトリー評価を示す。 クローン１（Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ）細胞から分化した段階４の細胞におけるＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅの発現のためのフローサイトメトリー評価を示す。 ＰＥＣ段階まで分化した播種クローンの特徴付けの分析を示す。図２７Ａは、形態を示し、図２７Ｂは、分化時間経過にわたる選択された遺伝子発現を示し、図２７Ｃは、分化した集団におけるＣＨＧＡ-／ＮＫＸ６．１+／ＰＤＸ１+発現細胞のパーセンテージを示す。 ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローンから分化した細胞の分化時間経過にわたる選択された遺伝子発現を示す。
Ｉ．定義
欠失：本明細書で使用する場合、用語「遺伝子欠失」又は「ノックアウト」と互換的に使用され得る用語「欠失」は、一般に、ゲノムＤＮＡの部位又は領域が、任意の分子生物学的方法、例えば本明細書に記載される方法、例えばゲノムＤＮＡの部位にエンドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのｇＲＮＡを送達することによって除去される遺伝子改変を指す。任意の数のヌクレオチドが欠失され得る。いくつかの実施形態では、欠失は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個又は少なくとも２５個のヌクレオチドの除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、１０～５０、２５～７５、５０～１００、５０～２００又は１００を超えるヌクレオチドの除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、標的遺伝子全体、例えばＢ２Ｍ遺伝子の除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、標的遺伝子の部分、例えばＢ２Ｍ遺伝子のプロモーター及び／又はコード配列の全て又は部分の除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、転写調節因子、例えば標的遺伝子のプロモーター領域の除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、コード領域によって正常に発現される産物がもはや発現されないか、切断型として発現されるか又は低いレベルで発現されるようなコード領域の全て又は部分の除去を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、未改変細胞に対して遺伝子の発現の減少をもたらす。
エンドヌクレアーゼ：本明細書で使用する場合、用語「エンドヌクレアーゼ」は、一般に、ポリヌクレオチド内のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡポリヌクレオチド内のホスホジエステル結合を特異的に切断する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、メガヌクレアーゼ、ＭｅｇａＴＡＬ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。ある種の態様では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４若しくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ又はそのホモログ、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化バージョン若しくはその改変バージョン或いはその組み合わせである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）及び／又は１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し得る。
遺伝子改変：本明細書で使用する場合、用語「遺伝子改変」は、一般に、任意の分子生物学的方法、例えば本明細書に記載される方法を使用して、例えばゲノムＤＮＡの部位にエンドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのｇＲＮＡを送達することによって遺伝的に編集又は操作されたゲノムＤＮＡの部位を指す。遺伝子改変の例としては、挿入、欠失、重複、逆位及び転座並びにこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、挿入である。他の実施形態では、遺伝子改変は、標的遺伝子のリーディングフレームが移動されて、改変された遺伝子産物をもたらすか又は遺伝子産物をもたらさないような挿入－欠失変異（又はインデル）である。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）：本明細書で使用する場合、用語「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、一般に、エンドヌクレアーゼと相互作用、例えば結合でき、且つ標的ゲノム部位又は領域と結合又はハイブリダイズできる短いリボ核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、スペーサー伸長領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、一本鎖である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学修飾されたｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、化学修飾、例えば２’－Ｏ－メチル糖修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、修飾された核酸骨格を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル－ホスホロチオエート残基を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼと予め複合体を形成し得る。
挿入：本明細書で使用する場合、用語「遺伝子挿入」又は「ノックイン」と互換的に使用され得る用語「挿入」は、一般に、ポリヌクレオチドが、任意の分子生物学的方法、例えば本明細書に記載される方法、例えばゲノムＤＮＡの部位にエンドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのｇＲＮＡを送達することによってゲノムＤＮＡの部位又は領域に導入又は付加される遺伝子改変を指す。いくつかの実施形態では、挿入は、以前の遺伝子改変、例えば欠失又は挿入－欠失変異の部位であったゲノムＤＮＡの部位内又はその近傍で起こり得る。いくつかの実施形態では、挿入は、以前の遺伝子改変、例えば欠失又は挿入－欠失変異の部位と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその中に含有されるゲノムＤＮＡの部位で起こる。いくつかの実施形態では、挿入は、セーフハーバー座位で起こる。いくつかの実施形態では、挿入は、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入を含む。いくつかの実施形態では、挿入は、免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの導入を含む。いくつかの実施形態では、挿入は、生存因子をコードするポリヌクレオチドの導入を含む。いくつかの実施形態では、挿入は、外来プロモーター、例えば構成的プロモーター、例えばＣＡＧプロモーターの導入を含む。いくつかの実施形態では、挿入は、非コード遺伝子をコードするポリヌクレオチドの導入を含む。一般に、挿入されるポリヌクレオチドは、挿入の部位にあるか又はその近傍のゲノムＤＮＡと実質的な配列相同性を有する配列（例えば、ホモロジーアーム）と隣接する。
主要組織適合抗原複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）：本明細書で使用する場合、用語「主要組織適合抗原複合体クラスＩ」又は「ＭＨＣ－Ｉ」は、一般に、哺乳動物、例えばヒトを含む脊椎動物における全ての有核細胞の細胞表面に見出される生体分子のクラス；及び免疫応答を刺激するために、非自己又は外来抗原のペプチド、例えばタンパク質を、細胞内（すなわちサイトゾル）から細胞傷害性Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞に提示する機能を指す。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ生体分子は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子又はＭＨＣ－Ｉタンパク質である。ＭＨＣ－Ｉタンパク質のベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質との複合体形成は、全てのＭＨＣ－Ｉタンパク質の細胞表面発現のために必要とされる。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対してＭＨＣ－Ｉヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることは、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の発現における減少（又は低減）を含む。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対してＭＨＣ－Ｉヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることは、ＭＨＣ－Ｉタンパク質の細胞表面発現における減少（又は低減）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ生体分子は、ＨＬＡ－Ａ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１０５）、ＨＬＡ－Ｂ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１０６）、ＨＬＡ－Ｃ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１０７）又はＢ２Ｍ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：５６７）である。
主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）：本明細書で使用する場合、用語「主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ」又は「ＭＨＣ－ＩＩ」は、一般に、哺乳動物、例えばヒトを含む脊椎動物における抗原提示細胞の細胞表面に典型的に見出される生体分子のクラス；及び免疫応答を刺激するために、非自己又は外来抗原のペプチド、例えばタンパク質を、細胞の外部（細胞外）から細胞傷害性Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞に提示する機能を指す。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ又はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩ生体分子は、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子又はＭＨＣ－ＩＩタンパク質である。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対してＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることは、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現における減少（又は低減）を含む。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対してＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることは、ＭＨＣ－ＩＩタンパク質の細胞表面発現における減少（又は低減）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩ生体分子は、ＨＬＡ－ＤＰＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１３）、ＨＬＡ－ＤＰＢ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１５）、ＨＬＡ－ＤＭＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１０８）、ＨＬＡ－ＤＭＢ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１０９）、ＨＬＡ－ＤＯＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１１）、ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１２）、ＨＬＡ－ＤＱＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１７）、ＨＬＡ－ＤＱＢ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１１９）、ＨＬＡ－ＤＲＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１２２）又はＨＬＡ－ＤＲＢ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１２３）である。
ポリヌクレオチド：本明細書で使用する場合、用語「核酸」と互換的に使用され得る用語「ポリヌクレオチド」は、一般に、２個以上のヌクレオチドを含む生体分子を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも５００個又は任意の数のヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも約６００ヌクレオチド、少なくとも約７００ヌクレオチド、少なくとも約８００ヌクレオチド、少なくとも約９００ヌクレオチド、少なくとも約１０００ヌクレオチド、少なくとも約２０００ヌクレオチド、少なくとも約３０００ヌクレオチド、少なくとも約４０００ヌクレオチド、少なくとも約４５００ヌクレオチド又は少なくとも約５０００ヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子であり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡの部位又は領域である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、未改変細胞又はユニバーサルドナー細胞のゲノム内に含まれる内在性の遺伝子である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに組み込まれていない外来ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに組み込まれている外来ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、プラスミド又はアデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、環状又は線状分子である。
セーフハーバー座位：本明細書で使用する場合、用語「セーフハーバー座位」は、一般に、遺伝子挿入を、細胞に対する有害作用を伴わずにその位置、部位又は領域に収容できるゲノムＤＮＡの任意の位置、部位又は領域を指す。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、遺伝子内又は遺伝子外領域である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、典型的には、転写的にサイレントであるゲノムＤＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ又はＴＴＲ座位である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｕｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，Ｖｏｌ １２，ｐａｇｅｓ ５１－５８において記載される。
安全スイッチ：本明細書で使用する場合、用語「安全スイッチ」は、一般に、細胞にアポトーシスを起こさせる生体分子を指す。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、タンパク質又は遺伝子である。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、自殺遺伝子である。いくつかの実施形態では、安全スイッチ、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）は、プロドラッグ、例えばガンシクロビルを代謝することにより、細胞にアポトーシスを起こさせる。いくつかの実施形態では、自身に対する過剰発現された安全スイッチの存在が細胞にアポトーシスを起こさせる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、ｐ５３系分子、ＨＳＶ－ｔｋ又は誘導性カスパーゼ－９である。
対象：本明細書で使用する場合、用語「対象」は、哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類又は齧歯類である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、疾患又は障害を有するか、それを有することが疑われるか又はそのリスクがある。いくつかの実施形態では、対象は、疾患又は障害の１つ以上の症状を有する。
生存因子：本明細書で使用する場合、用語「生存因子」は、一般に、細胞において増加又は減少するとき、未改変細胞に対して、宿主対象への移植又は生着後に細胞、例えばユニバーサルドナー細胞がより高い生存率で生存することを可能にするタンパク質（例えば、本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチドによって発現される）を指す。いくつかの実施形態では、生存因子は、ヒト生存因子である。いくつかの実施形態では、生存因子は、細胞生存に関与する決定的な経路のメンバーである。いくつかの実施形態では、細胞生存に関与する決定的な経路は、低酸素、活性酸素種、栄養欠乏及び／又は酸化ストレスに対する影響を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの生存因子の遺伝子改変、例えば欠失又は挿入は、生着後に未改変細胞より長い期間、例えば少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍又は少なくとも５０倍長い期間にわたってユニバーサルドナー細胞が生存することを可能にする。いくつかの実施形態では、生存因子は、ＺＮＦ１４３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：７７０２）、ＴＸＮＩＰ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：１０６２８）、ＦＯＸＯ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：２３０８）、ＪＮＫ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：５５９９）又はＭＡＮＦ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：７８７３）である。いくつかの実施形態では、生存因子は、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞に挿入される。いくつかの実施形態では、生存因子は、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞から欠失される。いくつかの実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドの挿入は、未改変細胞に対して、宿主対象への移植又は生着後に細胞、例えばユニバーサルドナー細胞がより高い生存率で生存することを可能にする。いくつかの実施形態では、ＺＦＮ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１又はＪＮＫ遺伝子内又はその近傍での欠失又は挿入－欠失変異は、未改変細胞に対して、宿主対象への移植又は生着後に細胞、例えばユニバーサルドナー細胞がより高い生存率で生存することを可能にする。
免疫寛容原性因子：本明細書で使用する場合、用語「免疫寛容原性因子」は、一般に、細胞において増加又は減少するとき、未改変細胞に対して、宿主対象への移植又は生着後に細胞、例えばユニバーサルドナー細胞がより高い率で免疫拒絶を阻害又は回避することを可能にするタンパク質（例えば、本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチドによって発現される）を指す。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ヒト免疫寛容原性因子である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子の遺伝子改変（例えば、少なくとも１つの免疫寛容原性因子の挿入又は欠失）は、生着後に未改変細胞より少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍又は少なくとも５０倍高い率で細胞、例えばユニバーサルドナー細胞が免疫拒絶を阻害又は回避することを可能にする。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１３３）、ＨＬＡ－Ｇ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：３１３５）、ＣＴＬＡ－４（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：１４９３）、ＣＤ４７（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：９６１）又はＰＤ－Ｌ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：２９１２６）である。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞に挿入される。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞から欠失される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４７及び／又はＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入は、宿主対象への移植又は生着後に細胞、例えばユニバーサルドナー細胞が免疫拒絶を阻害又は回避することを可能にする。
ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子：本明細書で使用する場合、用語「ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子」は、一般に、ＭＨＣ－Ｉ及び／又はＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を調節する、例えば増加又は減少させる生体分子を指す。いくつかの実施形態では、生体分子は、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子又はタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、少なくとも１つのＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩタンパク質の細胞表面発現を増加又は減少させることになる。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、少なくとも１つのＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現を増加又は減少させることになる。いくつかの実施形態では、転写調節因子は、ＣＩＩＴＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：４２６１）又はＮＬＲＣ５（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：８４１６６）である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ又はＮＬＲＣ５の発現の欠失又は低減は、少なくとも１つのＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現を減少させる。
ユニバーサルドナー細胞：本明細書で使用する場合、用語「ユニバーサルドナー細胞」は、一般に、未改変細胞に対して、細胞移植中に同種拒絶になりにくく、且つ／又は移植後の生存の増加を実証する遺伝子改変細胞を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの遺伝子改変細胞は、ユニバーサルドナー細胞である。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、未改変細胞と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、未改変細胞と比較して増加した細胞生存を有する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（造血幹細胞（ＨＳＣ）とも呼ばれる）であり得る。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、分化細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、体細胞（例えば、免疫系細胞）であり得る。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、対象に投与される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、疾患を有するか、又は有することが疑われるか、又はそのリスクがある対象に投与される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、系列限定前駆細胞は、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、造血前駆細胞又は神経前駆細胞である。いくつかの実施形態では、完全に分化した体細胞は、膵ベータ細胞などの内分泌性細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞又は免疫系細胞である。いくつかの実施形態では、完全に分化した体細胞は、心筋細胞である。
未改変細胞：本明細書で使用する場合、用語「未改変細胞」は、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子、生存因子及び／又は免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子を含む遺伝子改変にかけられたことがない細胞を指す。いくつかの実施形態では、未改変細胞は、幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、未改変細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（造血幹細胞（ＨＳＣ）とも呼ばれる）であり得る。いくつかの実施形態では、未改変細胞は、分化細胞であり得る。いくつかの実施形態では、未改変細胞は、体細胞（例えば、免疫系細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞）から選択され得る。ユニバーサルドナー細胞が「未改変細胞に対して」比較される場合、ユニバーサルドナー細胞及び未改変細胞は、同じ細胞型であるか又は共通の親細胞株を共有し、例えば、ユニバーサルドナーｉＰＳＣは、未改変ｉＰＳＣに対して比較される。
遺伝子内又はその近傍：本明細書で使用する場合、用語「遺伝子内又はその近傍」は、前記遺伝子のイントロン又はエクストロン構成要素であるか又は前記遺伝子に隣接して位置するゲノムＤＮＡの部位又は領域を指す。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡの部位は、それが前記遺伝子のイントロン又はエクソンの少なくとも一部を含む場合、遺伝子内にある。いくつかの実施形態では、遺伝子の近傍に位置するゲノムＤＮＡの部位は、前記遺伝子の５’又は３’末端（例えば、前記遺伝子のコード領域の５’又は３’末端）にあり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子の近傍に位置するゲノムＤＮＡの部位は、前記遺伝子の発現を調節するプロモーター領域又はリプレッサー領域であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子の近傍に位置するゲノムＤＮＡの部位は、前記遺伝子と同じ染色体上にあり得る。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡの部位又は領域は、前記遺伝子の５’又は３’末端（例えば、前記遺伝子のコード領域の５’又は３’末端）に対して５０Ｋｂ、４０Ｋｂ、３０Ｋｂ、２０Ｋｂ、１０Ｋｂ、５Ｋｂ、１Ｋｂ以内又はそれより近傍にある場合、遺伝子の近傍にある。
ＩＩ．ゲノム編集方法
ゲノム編集は、一般に、ゲノムのヌクレオチド配列を好ましくは的確な又は既定の様式で改変するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのゲノム編集方法、例えばＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系を使用して、例えばユニバーサルドナー細胞を作製するために本明細書に記載されるとおりの細胞を遺伝子改変し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのゲノム編集方法、例えばＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系を使用して、例えば未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及び／若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成要素の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子内又はその近傍に少なくとも１つの遺伝子改変を導入し；未改変細胞に対して、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を増加させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入し；及び／又は未改変細胞に対して、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入するために、本明細書に記載されるとおりの細胞を遺伝子改変し得る。
本明細書に記載されるゲノム編集の方法の例は、ゲノム中の的確な標的位置でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を切断する部位特異的ヌクレアーゼを使用して、それによりゲノム内の特定の位置で一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ切断を作製する方法を含む。そのような切断は、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，２１（２），１２１－３１において記載されるとおり、相同組換え修復（ＨＤＲ）及び非相同末端連結（ＮＨＥＪ）などの天然の内在性細胞プロセスによって修復される場合があり、且つ規則的に修復される。これらの２つの主要なＤＮＡ修復プロセスは、代替の経路のファミリーからなる。ＮＨＥＪは、二本鎖切断の結果生じるＤＮＡ末端を直接的に結合するものであり、ヌクレオチド配列の欠損又は付加を伴うこともあり、遺伝子の発現を破壊又は増強し得る。ＨＤＲは、切断点で既定のＤＮＡ配列を挿入する鋳型として相同配列又はドナー配列を利用する。相同配列は、姉妹染色分体などの内在性のゲノム中に存在し得る。代わりに、ドナー配列は、ヌクレアーゼ切断座位と高い相同性の領域（例えば、左及び右ホモロジーアーム）を有するが、切断される標的座位に組み込まれ得る欠失を含む追加の配列又は配列変化も含有し得るプラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド又はウイルスなどの外来ポリヌクレオチドであり得る。第三の修復機構は、遺伝的な結果が、若干の欠損及び挿入が切断部位で生じ得る点でＮＨＥＪに類似する、「代替的ＮＨＥＪ」とも呼ばれるマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であり得る。ＭＭＥＪは、ＤＮＡ切断部位に隣接する数塩基対の相同配列を利用して、より好ましいＤＮＡ末端連結修復結果を促進でき、最近の報告は、このプロセスの分子メカニズムをさらに解明しており；例えば、Ｃｈｏ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５１８，１７４－７６；Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，２２（３）：２３０－７；Ｍａｔｅｏｓ－Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５１８，２５４－５７；Ｃｅｃｃａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５２８，２５８－６２を参照されたい。いくつかの場合、ＤＮＡ切断の部位での潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて修復結果を予測できる可能性がある。
これらのゲノム編集機構の各々を使用して、所望の遺伝子改変を作製できる。ゲノム編集プロセスにおける工程は、１つ又は２つのＤＮＡ切断を作製することであり得るが、後者は、意図した変異部位の近傍としての標的座位における二本鎖切断又は２つの一本鎖切断である。これは、本明細書に記載され、且つ示されるとおりのエンドヌクレアーゼの使用を介して達成され得る。
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ系
ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系は、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されてきた原核生物において天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ系としては、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩ型の系が挙げられる。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。他の態様では、ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｒｆ系である。ＣＲＩＳＰＲ系は、ＤＮＡの切断を標的化するＤＮＡヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９並びに２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依拠する。
ｃｒＲＮＡは、典型的には、標的ＤＮＡ中の約２０ヌクレオチド（ｎｔ）配列とのワトソン－クリック塩基対形成を介してＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ中の５’２０ｎｔの配列を変化させることにより、特定の座位へのＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体の標的化が可能になる。ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体は、単に、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）に続いている場合、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の最初の２０ｎｔに一致する配列を含有するＤＮＡ配列に結合する。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、エンドヌクレアーゼによって結合されて触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体を形成し、続いてこれにより標的ＤＮＡを切断できる。
ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、エンドヌクレアーゼ内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の３塩基上流のＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対（平滑末端）で終結する二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するが、他のＣａｓ９ホモログ、例えばＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３ Ｃａｓ９又はＴ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９が使用され得る。他の場合、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１、例えばＬ．バクテリウム（Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１又はアシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、野生型バリアントが使用され得る。いくつかの実施形態では、前述のエンドヌクレアーゼの改変バージョン（例えば、そのホモログ、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化又はその改変バージョン）が使用され得る。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、少なくとも１つの核移行シグナル（ＮＬＳ）に連結され得る。少なくとも１つのＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ末端の５０アミノ酸において又はそれ以内に位置し得、且つ／又は少なくとも１つのＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのカルボキシ末端の５０アミノ酸において又はそれ以内に位置し得る。
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｕａｌ－ＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ａｍｏｎｇ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，４２：２５７７－２５９０において公表されるとおりのＣａｓ９ポリペプチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子の命名法は、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、広範な書き直しを経てきた。Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ．ａｌ．も、様々な種に由来するＣａｓ９ポリペプチドのためのＰＡＭ配列を提供する。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに連結された操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインで構成されるモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは、二量体としてのみ機能するため、ＺＦＮの対は、触媒活性のあるＦｏｋＩ二量体の形成を可能にするために、反対側のＤＮＡ鎖上の同一標的「ハーフサイト」配列に正確な間隔で結合するように設計されなければならない。それ自体では配列特異性を有しないＦｏｋＩドメインが二量体化すると、ゲノム編集の開始ステップとしてＺＦＮのハーフサイト間にＤＮＡ二本鎖切断が生じる。
各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、通常、豊富なＣｙｓ２－Ｈｉｓ２構造の３～６個のジンクフィンガーで構成されており、各フィンガーは、主に標的ＤＮＡ配列の一本鎖上のヌクレオチドのトリプレットを認識するが、４番目のヌクレオチドとの鎖交差相互作用も重要であり得る。ＤＮＡと重要な接触を作る位置におけるフィンガーのアミノ酸の改変は、所与のフィンガーの配列特異性を改変する。したがって、４フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識することになり、標的配列は、各フィンガーによって与えられるトリプレット優先度で構成されるが、トリプレット優先度は、隣接するフィンガーによって様々な程度まで影響され得る。ＺＦＮの重要な態様は、それらが、個々のフィンガーを単に改変することにより、ほとんどのゲノムアドレスに容易に再標的化され得ることである。ＺＦＮの大部分の適用において、４～６個のフィンガーのタンパク質が使用され、それぞれ１２～１８ｂｐを認識する。したがって、ＺＦＮの対は、通常、ハーフサイト間に典型的な５～７ｂｐのスペーサーを含まない２４～３６ｂｐの組み合わされた標的配列を認識することになる。結合部位は、１５～１７ｂｐを含むより大きいスペーサーによりさらに分離され得る。この長さの標的配列は、ヒトゲノムの中で固有なものになると考えられ、設計プロセス中に反復した配列又は遺伝子ホモログが除外されると想定される。それにも関わらず、ＺＦＮのタンパク質－ＤＮＡの相互作用は、それらの特異性において絶対的なものではないため、２つのＺＦＮ間のヘテロ二量体として又は一方若しくは他方のＺＦＮのホモ二量体として、オフターゲットの結合及び切断現象が生じる。後者の可能性は、ＦｏｋＩドメインの二量体化インターフェースを操作して、互いに且つそれら自体ではなく単に二量体化できる絶対ヘテロ二量体バリアントとしても知られる「プラス」及び「マイナス」のバリアントを作ることによって効率的に排除された。絶対ヘテロ二量体を強制することにより、ホモ二量体の形成を妨げる。これにより、ＺＦＮだけでなく、これらのＦｏｋＩバリアントを採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性が大幅に増強された。
様々なＺＦＮに基づく系は、当技術分野において記載されており、その変更形態は、定期的に報告され、多数の参考文献は、ＺＦＮの設計を導くために使用される規則及びパラメーターを記載しており；例えば、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９９ ９６（６）：２７５８－６３；Ｄｒｅｉｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０００，３０３（４）：４８９－５０２；Ｌｉｕ Ｑ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７（６）：３８５０－６；Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０（４２）：３５５８８－９７；及びＤｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１，２７６（３１）：２９４６６－７８を参照されたい。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結され、ＴＡＬＥＮの対が直列に作動して標的化されるＤＮＡの切断を実現する、モジュラーヌクレアーゼの別の形式を表す。ＺＦＮとの主な違いは、ＤＮＥ結合ドメインの性質及び会合される標的ＤＮＡ配列認識の特性である。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥタンパク質に由来し、これは、植物の病原性微生物であるキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ）において最初に記載された。ＴＡＬＥは、３３～３５アミノ酸リピートの直列配列で構成され、各リピートは、典型的には、最大で２０ｂｐの長さの標的ＤＮＡ配列において一塩基対を認識し、最大で４０ｂｐの総標的配列長を与える。各リピートのヌクレオチド特異性は、１２位及び１３位での２つのアミノ酸を含む反復可変二残基（ＲＶＤ）によって決定される。塩基のグアニン、アデニン、シトシン及びチミンは、それぞれ４つのＲＶＤ：Ａｓｎ－Ａｓｎ、Ａｓｎ－Ｉｌｅ、Ｈｉｓ－Ａｓｐ及びＡｓｎ－Ｇｌｙによって主に認識される。これは、ジンクフィンガーよりもはるかに単純な認識コードとなり、したがってヌクレアーゼ設計においてジンクフィンガーよりも有利となる。それにも関わらず、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質－ＤＮＡ相互作用は、それらの特異性において絶対的ではなく、及びＴＡＬＥＮも、オフターゲット活性を低減するＦｏｋＩドメインの絶対ヘテロ二量体バリアントの使用から恩恵を得た。
触媒機能において不活性化されているＦｏｋＩドメインの追加のバリアントが作製されてきた。ＴＡＬＥＮ又はＺＦＮのいずれかの対の片方が、不活性なＦｏｋＩドメインを含有する場合、ＤＳＢではなく、標的部位で一本鎖ＤＮＡの切断（ニッキング）のみが生じることになる。この結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の「ニッカーゼ」変異体（Ｃａｓ９切断ドメインの１つが不活性化されている）の使用と同等である。ＤＮＡニックを使用して、ＨＤＲによるゲノム編集を駆動することができるが、ＤＳＢによるものより効率が低い。主な利点は、オフターゲットニックが、ＮＨＥＪに媒介される誤修復を起こしやすいＤＳＢと異なり、迅速且つ正確に修復されることである。
様々なＴＡＬＥＮに基づく系は、当技術分野において記載されており、その変更形態は、定期的に報告されており；例えば、Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９ ３２６（５９５９）：１５０９－１２；Ｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３５（６０６９）：７１６－９；及びＭｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２６（５９５９）：１５０１を参照されたい。「ゴールデンゲート」プラットフォーム又はクローニングスキームに基づくＴＡＬＥＮの使用は、複数のグループによって記載されており；例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１１，３９（１２）：ｅ８２；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１１，３９（１４）：６３１５－２５；Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．，２０１１，６（２）：ｅ１６７６５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１４，４１（６）：３３９－４７．；及びＣｅｒｍａｋ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１５ １２３９：１３３－５９を参照されたい。
ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４～４４塩基対）を有する配列特異的エンドヌクレアーゼであり、高い特異性で（ゲノム中の固有の部位である場合が多い）ＤＮＡを切断する。真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア及びファージを含む幅広い宿主に由来するＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈｉｓ－Ｃｉｓボックス、Ｈ－Ｎ－Ｈ、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫ及びＶｓｒ様を含むそれらの構造によって分類されるとおりの少なくとも６つの既知のＨＥのファミリーがある。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥを使用して、ゲノム編集における最初の工程として標的座位でＤＳＢを引き起こすことができる。加えて、いくつかの天然のＨＥ及び操作されたＨＥは、ＤＮＡの一本鎖のみを切断し、それにより部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの広い標的配列及びそれらが提供する特異性は、それらを部位特異的なＤＳＢを起こすための魅力的な候補にした。
様々なＨＥに基づく系は、当技術分野において記載されており、その変更形態は、定期的に報告されており；例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，２４（８）：６６３－８０；Ｂｅｌｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｏｎｏｃｏｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１４，１１２３：１－２６；及びＨａｆｅｚ ａｎｄ Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ，２０１２，５５（８）：５５３－６９による概説を参照されたい。
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ－ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッドヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォーム及びＴｅｖ－ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメイン及び触媒活性のあるＨＥの融合を使用し、ＴＡＬＥの調整可能なＤＮＡ結合及び特異性の両方並びにＨＥの切断配列特異性を利用し；例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１４，４２：２５９１－２６０１；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３，２０１４，４：１１５５－６５；及びＢｏｉｓｓｅｌ ａｎｄ Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，１２３９：１７１－９６を参照されたい。
さらなる変種において、ＭｅｇａＴｅｖ構造は、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）のＧＩＹ－ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ－ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）に由来するヌクレアーゼドメインとの融合物である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基質上で約３０ｂｐ離れた位置にあり、適合性のない付着末端を伴う２つのＤＳＢを生成し；例えば、Ｗｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１４，４２，８８１６－２９を参照されたい。既存のヌクレアーゼに基づく手法の他の組み合わせは、発展することになり、且つ本明細書に記載される標的化ゲノム改変を実現するのに有用であることが予想される。
ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ又はｄＣｐｆ１－Ｆｏｋ１及び他のヌクレアーゼ
上記のヌクレアーゼプラットフォームの構造的且つ機能的な特性を組み合わせることにより、固有の欠点のいくつかを克服できる可能性のあるゲノム編集のさらなる手法を提供する。例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集系は、通常、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してＤＳＢを引き起こす。標的化の特異性は、標的ＤＮＡとワトソン－クリック塩基対形成を起こすガイドＲＮＡ中の２０又は２４個のヌクレオチド配列（その上、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９の場合には隣接するＮＡＧ又はＮＧＧ ＰＡＭ配列中の追加の２塩基）によって促進される。そのような配列は、ヒトゲノムにおいて固有であるのに十分なほど長いが、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は、絶対的ではなく、特に標的配列の５’側の半分において著しい乱雑さが許容される場合があり、特異性を促進する塩基の数を効率的に低減する。これに対する１つの解決策は、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１の触媒機能を完全に不活性化し（ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合機能のみ保持する）、代わりに不活性化されたＣａｓ９にＦｏｋＩドメインを融合することであり；例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１４，３２：５６９－７６；及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０１４，３２：５７７－８２を参照されたい。ＦｏｋＩは、二量体化して、触媒的に活性にならなければならないため、２つのガイドＲＮＡが、二量体を形成し且つＤＮＡを切断するために、近位に２つのＦｏｋＩ融合物を繋ぎ止めるために必要となる。これにより、組み合わされた標的部位における塩基の数が本質的に２倍になり、それによりＣＲＩＳＰＲに基づく系による標的化の厳密さが高まる。
さらなる例として、Ｉ－ＴｅｖＩなどの触媒活性のあるＨＥへのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの融合は、オフターゲット切断がさらに低減され得るとの期待をもって、ＴＡＬＥの調整可能なＤＮＡ結合及び特異性の両方並びにＩ－ＴｅｖＩの切断配列特異性を利用する。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
本明細書で使用されるとおりのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ系は、野生型の例示的なエンドヌクレアーゼ、例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書の配列番号８又はＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３９（２１）：９２７５－９２８２（２０１１））と少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は少なくとも１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）と１０個の連続したアミノ酸にわたって少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９又は１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）と１０個の連続したアミノ酸にわたって最大７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９又は１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）とエンドヌクレアーゼのＨＮＨヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続したアミノ酸にわたって少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９又は１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）とエンドヌクレアーゼのＨＮＨヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続したアミノ酸にわたって最大７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９又は１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）とエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続したアミノ酸にわたって少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９又は１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）とエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続したアミノ酸にわたって最大７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９又は１００％の同一性を含み得る。
エンドヌクレアーゼは、野生型の例示的なエンドヌクレアーゼの改変形態を含み得る。野生型の例示的なエンドヌクレアーゼの改変形態は、エンドヌクレアーゼの核酸切断活性を低減する変異を含み得る。野生型の例示的なエンドヌクレアーゼの改変形態は、野生型の例示的なエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満又は１％未満を有し得る。エンドヌクレアーゼの改変形態は、実質的な核酸切断活性を有し得ない。エンドヌクレアーゼが、実質的な核酸切断活性を有しない改変形態であるとき、それは、「酵素活性のない」と本明細書で呼ばれる。
企図される変異は、置換、付加及び欠失又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。変異は、変異されるアミノ酸をアラニンに変換する。変異は、変異されるアミノ酸を別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン又はアルギニン）に変換する。変異は、変異されるアミノ酸を非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換する。変異は、変異されるアミノ酸をアミノ酸ミミック（例えば、ホスホミミック）に変換する。変異は、保存的変異であり得る。例えば、変異は、変異されるアミノ酸を、変異されるアミノ酸のサイズ、形状、電荷、極性、立体配座及び／又は回転異性体と類似するアミノ酸に変換する（例えば、システイン／セリン変異、リジン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）。変異は、リーディングフレームの移動及び／又は未成熟終止コドンの生成を引き起こす可能性がある。変異は、遺伝子の調節領域又は１つ以上の遺伝子の発現に影響を及ぼす座位に対する変化を引き起こす可能性がある。
ガイドＲＮＡ
本開示は、ポリヌクレオチド内の特定の標的部位に対して関連するエンドヌクレアーゼの活性を方向付けることができるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列及びＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含み得る。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系において、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系において、ｇＲＮＡは、二重鎖を形成するｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼに結合することができ、その結果、ｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼは、複合体を形成する。ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼとの会合のために複合体に対する標的特異性をもたらすことができる。したがって、ゲノム標的化核酸は、エンドヌクレアーゼの活性を方向付けることができる。
例示的なガイドＲＮＡとしては、１５～２００個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含み、ｇＲＮＡは、ＧＲＣｈ３８ヒトゲノムアセンブリに基づくゲノム位置を標的化する。当業者によって理解されるとおり、各ｇＲＮＡは、そのゲノム標的部位又は領域に相補的なスペーサー配列を含むように設計され得る。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７，８１６－８２１及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７１，６０２－６０７を参照されたい。
ｇＲＮＡは、二分子ガイドＲＮＡであり得る。ｇＲＮＡは、一分子ガイドＲＮＡであり得る。
二分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの二本の鎖を含み得る。第１の鎖は、５’から３’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含み得る。
一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含み得る。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに対する追加の機能性（例えば、安定性）に寄与する要素を含み得る。一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成することができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含み得る。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチドより長いスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で１７～３０ヌクレオチドを有する可変長スペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０又は２００個を超えるヌクレオチドの長さを有するスペーサー延長配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００個未満のヌクレオチドの長さを有するスペーサー延長配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列又はリボザイム）を含むスペーサー延長配列を含む。部分は、核酸を標的化する核酸の安定性を低減又は増大させることができる。部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち転写終結配列）であり得る。部分は、真核細胞において機能し得る。部分は、原核細胞において機能し得る。部分は、真核細胞及び原核細胞の両方において機能し得る。好適な部分の非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７ Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による安定性の調節並びに／又は接触性の調節を可能にする）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわちヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）に標的化する配列、追跡をもたらす修飾又は配列（例えば、蛍光分子への直接的なコンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）及び／又はタンパク質のための結合部位をもたらす修飾又は配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド中の配列にハイブリダイズするスペーサー配列を含む。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち塩基対形成）を介して配列特異的な様式で標的ポリヌクレオチドと相互作用することができる。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に依存して変化し得る。
ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系において、スペーサー配列は、系において使用されるエンドヌクレアーゼのＰＡＭの５’に位置する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計され得る。スペーサーは、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼは、それが標的ＤＮＡ中で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、配列５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列によって標的化される標的核酸配列の３’の直近にある）を含むＰＡＭを認識する。
標的ポリヌクレオチド配列は、２０個のヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、２０個未満のヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、２０個より多いポリヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、最大５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドの５’の直近に２０個の塩基を含み得る。
標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６個のヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有し得る。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ若しくは少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約８０ｎｔ、約６ｎｔ～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４５ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３５ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１９ｎｔ、約１０ｎｔ～約５０ｎｔ、約１０ｎｔ～約４５ｎｔ、約１０ｎｔ～約４０ｎｔ、約１０ｎｔ～約３５ｎｔ、約１０ｎｔ～約３０ｎｔ、約１０ｎｔ～約２５ｎｔ、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１９ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ又は約２０ｎｔ～約６０ｎｔであり得る。いくつかの例において、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドを含み得る。いくつかの例において、スペーサーは、１９個のヌクレオチドを含み得る。いくつかの例において、スペーサーは、１８個のヌクレオチドを含み得る。いくつかの例において、スペーサーは、２２個のヌクレオチドを含み得る。
いくつかの例において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は１００％である。いくつかの例において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、最大約３０％、最大約４０％、最大約５０％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９５％、最大約９７％、最大約９８％、最大約９９％又は１００％である。いくつかの例において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の６個の連続した５’の大部分のヌクレオチドにわたって１００％である。スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、約２０個の連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。スペーサー配列及び標的核酸の長さは、１～６個のヌクレオチドで異なり得、これは、１つ又は複数のバルジと考えられ得る。
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞中において最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズするヌクレオチドを含み得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、二重鎖、すなわち塩基対形成した二本鎖構造を形成し得る。合わせると、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピートは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合できる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズできる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は１００％相補的であり得る。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ又は約１５ｎｔ～約２５ｎｔ長であり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ９ヌクレオチド長であり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１２ヌクレオチドであり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、上記のＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．において記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ ｎｔ ２３～４８からなり得る。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一続きの少なくとも６、７又は８個の連続したヌクレオチドにわたって基準の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、野生型、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一続きの少なくとも６、７又は８個の連続したヌクレオチドにわたって基準の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一又は１００％同一であり得る。
最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、二重らせんを含み得る。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上のヌクレオチドを含み得る。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上のヌクレオチドを含み得る。
二重鎖は、ミスマッチを含み得る（すなわち、二重鎖の２本の鎖は、１００％相補的ではない）。二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４又は５個のミスマッチを含み得る。二重鎖は、最大約１、２、３、４又は５個のミスマッチを含み得る。二重鎖は、２個以下のミスマッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、約１ヌクレオチド～約４００ヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０又は２００個を超えるヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、約２０～約５０００個以上のヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００個未満の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０未満のヌクレオチド長を含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０～３０ヌクレオチド長であり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、３０～７０ヌクレオチド長であり得る。
ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、機能性部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含み得る。機能性部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち転写終結配列）を含み得る。機能性部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）～約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ若しくは約９０ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ又は約１５ｎｔ～約２５ｎｔの全長を有し得る。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、約３ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有するリンカー配列を含み得る。上記のＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．において、例えば単純な４ヌクレオチド「テトラループ」（－ＧＡＡＡ－）が使用された（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７（６０９６）：８１６－８２１）。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約９０ｎｔ、約３ｎｔ～約８０ｎｔ、約３ｎｔ～約７０ｎｔ、約３ｎｔ～約６０ｎｔ、約３ｎｔ～約５０ｎｔ、約３ｎｔ～約４０ｎｔ、約３ｎｔ～約３０ｎｔ、約３ｎｔ～約２０ｎｔ、約３ｎｔ～約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ～約５ｎｔ、約５ｎｔ～約１０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２５ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約３５ｎｔ、約３５ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ又は約９０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有し得る。一分子ガイド核酸のリンカーは、４～４０ヌクレオチドであり得る。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００又は７０００個以上のヌクレオチドであり得る。リンカーは、最大約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００又は７０００個以上のヌクレオチドであり得る。
リンカーは、様々な配列のいずれかを含み得るが、いくつかの例において、リンカーは、ガイドの他の機能性領域に支障をきたすであろう分子内結合を引き起こす可能性があるガイドＲＮＡの他の部分と相同性の広範な領域を有する配列を含まないことになる。上記のＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．において、単純な４ヌクレオチド配列－ＧＡＡＡ－が使用されたが（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７（６０９６）：８１６－８２１）、より長い配列を含む多数の他の配列が同様に使用され得る。
リンカー配列は、機能性部分を含み得る。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質－相互作用ヘアピン、タンパク質結合部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン又はエクソンを含む１つ以上の特徴を含み得る。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４又は５個以上の機能性部分を含み得る。いくつかの例において、リンカー配列は、最大約１、２、３、４又は５個以上の機能性部分を含み得る。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、例えば、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、例えば、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のウラシル（Ｕ）を含む。
ｓｇＲＮＡは、化学修飾され得る。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、化学修飾、例えば２’－Ｏ－メチル糖修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、修飾された核酸骨格を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル－ホスホロチオエート残基を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、当技術分野において記載されるとおり、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性又は程度を低減し、且つ／又は他の特質を増強する。
いくつかの実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、修飾された骨格、例えばホスホロチオエート、ホスホトリエステル、モルホリノ、メチルホスホネート、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式糖間結合を含み得る。
モルホリノ系化合物は、Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４）：４５０３－４５１０；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２００１，Ｖｏｌｕｍｅ ３０，Ｉｓｓｕｅ ３；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２４３：２０９－２１４；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２６：２１６－２２０；Ｌａｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７：９５９１－９５９６；及び１９９１年７月２３日に登録された米国特許第５，０３４，５０６号明細書において記載されている。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチドミメティックは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２：８５９５－８６０２において記載されている。
いくつかの実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、２’位において１つ以上の置換された糖部分、例えば以下の１つを含み得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ3、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ3、ＯＣＨ3Ｏ（ＣＨ2）ｎＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）ｎＮＨ2又はＯ（ＣＨ2）ｎＣＨ3（ｎは１～約１０である）；Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリール又はアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ3；ＯＣＦ3；Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アルケニル；ＳＯＣＨ3；ＳＯ2ＣＨ3；ＯＮＯ2；ＮＯ2；Ｎ3；ＮＨ2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；干渉物質；２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）；２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ3）；２’－プロポキシ（２’－ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）；及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）。同様の修飾は、ｇＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位でもなされ得る。いくつかの例において、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格は、新規の基で置き換えられ得る。
ガイドＲＮＡは、追加的に又は代替的に、核酸塩基（当技術分野において単に「塩基」と呼ばれる場合が多い）修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用する場合、「未修飾」又は「天然」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基としては、天然の核酸においてまれに又は一時的にのみ見出される核酸塩基、例えばヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に５－メチルシトシン（５－メチル－２’－デオキシシトシンとも呼ばれ、且つ当技術分野において５－Ｍｅ－Ｃと呼ばれる場合が多い）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＭＨＣ及びゲントビオシルＨＭＣ並びに合成核酸塩基、例えば２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニン又は他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン及び２，６－ジアミノプリンが挙げられる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７５－７７，１９８０；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，１５：４５１３。当技術分野において知られる「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンも含まれ得る。５－Ｍｅ－Ｃ置換は、０．６～１．２℃によって核酸二重鎖の安定性を増大させることが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、塩基置換の態様である。
修飾された核酸塩基は、５ーメチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル並びに他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル並びに他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（プソイド－ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル並びに他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル並びに他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルクアニン（７－ｍｅｔｈｙｌｑｕａｎｉｎｅ）及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンなどの他の合成並びに天然核酸塩基を含み得る。
ゲノム標的化核酸及びエンドヌクレアーゼの複合体
ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）と相互作用し、それにより複合体を形成する。ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼを標的ポリヌクレオチドに導く。
エンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、それぞれ細胞又は対象に別々に投与され得る。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１つ以上のガイドＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡと合わせた１つ以上のｃｒＲＮＡと予め複合体を形成し得る。次に、予め複合体を形成した材料が細胞又は対象に投与され得る。そのような予め複合体を形成した材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られる。ＲＮＰ中のエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核移行シグナル（ＮＬＳ）により、Ｎ末端、Ｃ末端又はＮ末端及びＣ末端の両方で隣接され得る。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳであるＮ末端に位置する１つ目のＮＬＳ及びＣ末端に位置する２つ目のＮＬＳによって隣接され得る。ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳなど、当技術分野において知られる任意のＮＬＳであり得る。ＲＮＰ中のゲノム標的化核酸とエンドヌクレアーゼのモル比は、約１：１～約１０：１の範囲であり得る。例えば、ＲＮＰ中のｓｇＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼとのモル比は、３：１であり得る。
核酸コード化系構成要素
本開示は、本開示のゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示のエンドヌクレアーゼ及び／又は本開示の方法の態様を実行するために必要な任意の核酸若しくはタンパク質性分子を提供する。コード化核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はその組み合わせであり得る。
本開示のゲノム標的化核酸をコードする核酸、本開示のエンドヌクレアーゼ及び／又は本開示の方法の態様を実行するために必要な任意の核酸若しくはタンパク質性分子は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含み得る。
用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ベクターの１つの型は、追加の核酸セグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、追加の核酸セグメントは、ウイルスゲノムにライゲートされ得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。
いくつかの例において、ベクターは、それらが作動可能に連結される核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」又はより単純には同じ機能を果たす「発現ベクター」と呼ばれる。
用語「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されていることを意味する。用語「調節配列」は、例えば、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、当技術分野においてよく知られており、例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０，１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡにおいて記載されている。調節配列としては、宿主細胞の多くの型においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、ある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、標的細胞の選択、所望される発現のレベルなどの要因に依存し得ることが当業者によって認識される。
企図される発現ベクターとしては、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス並びにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス及び乳癌ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）及び他の組換えベクターに基づくウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。真核生物の標的細胞のために企図される他のベクターとしては、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞と適合する限り、他のベクターを使用し得る。
いくつかの例において、ベクターは、１つ以上の転写及び／又は翻訳制御エレメントを含み得る。利用される宿主／ベクター系に依存して、構成的プロモーター及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むいくつかの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが発現ベクターにおいて使用され得る。ベクターは、ウイルス配列又はＣＲＩＳＰＲ機構若しくは他のエレメントの構成要素のいずれかを不活性化する自己不活性化ベクターであり得る。
好適な真核生物のプロモーター（すなわち真核細胞において機能するプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の末端反復配列（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子－１αプロモーター（ＥＦ１α）、ニワトリベータ－アクチンプロモーター（ＣＢＡ）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ニワトリベータ－アクチンプロモーターに融合されたサイトメガロウイルスエンハンサーを含むハイブリッドコンストラクト（ＣＡＧ）、プロモーター、第１エクソン及びニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１イントロンに融合されたサイトメガロウイルスエンハンサーを含むハイブリッドコンストラクト（ＣＡＧ又はＣＡＧＧＳ）、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１座位プロモーター（ＰＧＫ）及びマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターに由来するものが挙げられる。
プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーターなど）であり得る。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＣＡＧプロモーター）であり得る。いくつかの場合、プロモーターは、空間に制約されるプロモーター及び／又は時間に制約されるプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であり得る。
本開示の複合体、ポリペプチド及び核酸の細胞への導入は、ウイルス又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達などによって行われ得る。
ＩＩＩ．免疫応答を回避し、生存を増加させる戦略
本明細書では、遺伝子改変細胞、すなわちユニバーサルドナー細胞が対象への生着後にそれらの生存若しくは生存率を増加させ、且つ／又は免疫応答を回避することを可能にする戦略が記載される。いくつかの実施形態では、これらの戦略は、ユニバーサルドナー細胞が未改変細胞より高い成功率で生存し、且つ／又は免疫応答を回避することを可能にする。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子内又はその近傍への少なくとも１つの遺伝子改変の導入を含み、遺伝子改変は、免疫寛容原性因子をコードするポリペプチドの挿入を含む。ユニバーサルドナー細胞は、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする遺伝子内又はその近傍での少なくとも１つの遺伝子改変をさらに含み、前記遺伝子改変は、第２の免疫寛容原性因子をコードするポリペプチドの挿入を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子内又はその近傍での少なくとも１つの遺伝子改変；未改変細胞に対して、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を増加させる少なくとも１つの遺伝子改変；並びに未改変細胞に対して、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を改変する少なくとも１つの遺伝子改変の導入を含む。他の実施形態では、遺伝子改変細胞は、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を改変する少なくとも１つの遺伝子内又はその近傍での少なくとも１つの欠失又は挿入－欠失変異；並びに１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ ＨＬＡの発現を改変する遺伝子の欠失の部位と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその中に含有される部位での少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つの挿入を含む。さらに他の実施形態では、遺伝子改変細胞は、未改変細胞に対して、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を改変する少なくとも１つの遺伝子改変を含む。
主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）をコードする遺伝子は、ヒトＣｈｒ．６ｐ２１上に位置する。ＭＨＣ遺伝子によってコードされる結果としてのタンパク質は、細胞移植中のドナー適合性に必須である一連の表面タンパク質である。ＭＨＣ遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）及びＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）に分類される。ＭＨＣ－Ｉ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）は、ほとんど全ての組織型において発現され、「非自己」の抗原がプロセシングされたペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示し、それにより細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞へのそれらの活性化を促進する。「非自己」ＭＨＣ－Ｉ分子を発現する移植された細胞又は生着された細胞は、これらの細胞に向けられる強い細胞性免疫応答を引き起こし、最終的に、活性化された細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞によるそれらの消滅をもたらす。ＭＨＣ－Ｉタンパク質は、本質的に、小胞体中のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と関連し、これは、細胞表面上で機能的ＭＨＣ－Ｉ分子を形成するために必須である。加えて、免疫調節機能を有する３つの非古典的ＭＨＣ－Ｉｂ分子（ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ及びＨＬＡ－Ｇ）が存在する。ＭＨＣ－ＩＩ生体分子としては、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲが挙げられる。免疫応答におけるそれらの主要な機能に起因して、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ生体分子は、非宿主細胞の細胞生着、例えば再生医療を目的とする細胞生着後の免疫拒絶に寄与する。
ＭＨＣ－Ｉ細胞表面分子は、ＭＨＣにコードされる重鎖（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ）及びインバリアントなサブユニットベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）で構成される。したがって、細胞内でのＢ２Ｍ濃度の低減は、ＭＨＣ－Ｉ細胞表面分子の細胞表面発現を低減する効果的な方法を可能にする。
いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＨＣ－Ｉ及び／又はＭＨＣ－ＩＩの発現を調節する１つ以上のポリヌクレオチド配列の遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変は、本明細書に記載される方法を含むが、それらに限定されない任意の遺伝子編集方法を使用して実施される。
いくつかの実施形態では、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させることは、例えば、ＭＨＣ－Ｉ及び／又はＭＨＣ－ＩＩ遺伝子における直接的な少なくとも１つの塩基対の遺伝子欠失及び／又は挿入のための標的化によって達成される。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させることは、例えば、遺伝子欠失のためにＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化することによって達成される。いくつかの実施形態では、未改変細胞に対して、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させることは、例えば、遺伝子欠失のためにＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの少なくとも１つの転写調節因子を標的化することによって達成される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、ＮＬＲＣ５又はＣＩＩＴＡ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ－１及び／又はＴＡＰ１遺伝子である。
いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子の全体又は一部を欠失させるために改変されている。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子のプロモーター領域の全体又は一部を欠失させるために改変されている。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子をコードする遺伝子の全体又は一部を欠失させるために改変されている。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子をコードする遺伝子のプロモーター領域の全体又は一部を欠失させるために改変されている。
いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を減少させるために改変されている。Ｂ２Ｍは、全ての多型ＭＨＣクラスＩ重鎖の表面発現に必要となる共有のタンパク質サブユニットをコードする非多型遺伝子である。ＨＬＡ－Ｉタンパク質は、小胞体においてＢ２Ｍと直接的に会合し、これは、機能性の細胞表面で発現されるＨＬＡ－Ｉ分子を形成するために必須である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ－３’配列（配列番号１）を含むＢ２Ｍ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧ－３’配列（配列番号２）を含むＢ２Ｍ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡ－３’配列（配列番号３）を含むＢ２Ｍ遺伝子内の部位を標的化する。代替的な実施形態では、ｇＲＮＡは、以下の配列のいずれかを含むＢ２Ｍ遺伝子内の部位を標的化する：５’－ＴＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＣ－３’（配列番号３５）、５’－ＧＡＧＴＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡ－３’（配列番号３６）、５’－ＡＣＴＧＧＡＣＧＣＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧＣ－３’（配列番号３７）、５’－ＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧ－３’（配列番号３８）、５－ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号３９）、５’－ＧＣＣＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣ－３’（配列番号４０）、５’－ＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣ－３’（配列番号４１）、５’－ＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣ－３’（配列番号４２）、５’－ＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴ－３’（配列番号４３）又は５’－ＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧ－３’（配列番号４４）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３又は配列番号４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体は、Ｂ２Ｍ座位中の標的部位を標的化及び切断する。ＮＨＥＪによる二本鎖切断の修復は、少なくともヌクレオチド上の欠失及び／又は少なくとも１つのヌクレオチドの挿入をもたらす可能性があり、それによりＢ２Ｍの発現を破壊するか又は消失させる。代わりに、Ｂ２Ｍ座位は、それぞれ異なるｇＲＮＡを含む少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲ系によって標的化される場合があり、その結果、Ｂ２Ｍ座位中の２つの部位での切断が２つの切断間の配列の欠失をもたらし、それによりＢ２Ｍの発現を消失させる。
いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）の発現を減少させるために改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＧＡＡＧＣＧＴＧＴＣＴＴＣＡＴＡＧＣＧＣ－３’配列（配列番号１５）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＴＴＡＣＴＣＧＴＧＴＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴ－３’配列（配列番号１６）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣ－３’配列（配列番号１７）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＧＣＣＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧ－３’配列（配列番号１８）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＧＣＧＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＧＴＧＣＴＴ－３’配列（配列番号１９）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＴＣＣＧＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡ－３’配列（配列番号２０）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５－ＧＴＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＣ－３’配列（配列番号２１）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＣＣ－３’配列（配列番号２２）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＴＴＧＴＡＣＴＣＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣ－３’配列（配列番号２３）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＴ－３’配列（配列番号２４）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＧＡＡＧＣＧＴＧＴＣＴＴＣＡＴＡＧＣＧＣＡＧＧ－３’配列（配列番号４５）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＴＴＡＣＴＣＧＴＧＴＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴＡＧＧ－３’配列（配列番号４６）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧ－３’配列（配列番号４７）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＧＣＣＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＧＧ－３’配列（配列番号４８）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＧＣＧＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＧＧ－３’配列（配列番号４９）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＴＣＣＧＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＧＧ－３’配列（配列番号５０）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＧＴＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＧＧ－３’配列（配列番号５１）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＣＣＴＧＧ－３’配列（配列番号５２）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＴＴＧＴＡＣＴＣＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧ－３’配列（配列番号５３）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’－ＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＴＣＧＧ－３’配列（配列番号５４）を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１５～２４又は４５～５４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むＴＸＮＩＰ遺伝子内の部位を標的化する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を標的化する。ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体は、ＴＸＮＩＰ遺伝子座位中の標的部位を標的化及び切断する。ＮＨＥＪによる二本鎖切断の修復は、少なくともヌクレオチド上の欠失及び／又は少なくとも１つのヌクレオチドの挿入をもたらす可能性があり、それによりＴＸＮＩＰの発現を破壊するか又は消失させる。代わりに、ＴＸＮＩＰ遺伝子座位中への外来遺伝子をコードするポリヌクレオチドの挿入は、ＴＸＮＩＰの発現を破壊し得るか又は消失させ得る。
いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）の発現を減少させるために改変されている。ＣＩＩＴＡは、タンパク質のＬＲ又はヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと会合することによってＭＨＣ－ＩＩの転写を調節する。ＣＩＩＴＡの発現は、発生段階に応じてＢ細胞及び樹状細胞において誘導され、大部分の細胞型においてＩＦＮ－γによって誘導可能である。
いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＮＬＲファミリーであるＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５）の発現を減少させるために改変されている。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉ媒介性免疫応答の非常に重要な調節因子であり、ＣＩＩＴＡと同様に、ＮＬＲＣ５は、ＩＦＮ－γによって高度に誘導可能であり、核内に移動できる。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子のプロモーターを活性化し、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－Ｉ抗原提示に関与する関連遺伝子の転写を誘導する。
いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子を遺伝子改変細胞に挿入又は再挿入して、免疫特権のあるユニバーサルドナー細胞を作製することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるユニバーサルドナー細胞は、１つ以上の免疫寛容原性因子を発現するためにさらに改変されている。例示的な免疫寛容原性因子としては、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、ＣＤ４７、ＣＩ－阻害剤及びＩＬ－３５の１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの遺伝子改変、例えば挿入は、生着後に未改変細胞より少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍又は少なくとも５０倍高い率でユニバーサルドナー細胞が免疫拒絶を阻害又は回避することを可能にする。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４７及び／又はＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入は、宿主対象への移植又は生着後にユニバーサルドナー細胞が免疫拒絶を阻害又は回避することを可能にする。
免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドは、一般に、免疫寛容原性因子をコードする配列に隣接する左及び右ホモロジーアームを含む。ホモロジーアームは、標的化される挿入部位又はその近傍にあるゲノムＤＮＡと実質的な配列相同性を有する。例えば、左ホモロジーアームは、標的部位又は切断部位の左又は上流に位置する領域と相同なヌクレオチド配列であり得、右ホモロジーアームは、標的部位又は切断部位の右又は下流に位置する領域と相同なヌクレオチド配列であり得る。各ホモロジーアームの近位端は、切断部位に隣接するゲノムＤＮＡ配列と相同であり得る。代わりに、各ホモロジーアームの近位端は、切断部位から最大約１０、２０、３０、４０、５０、６０又は７０核酸塩基離れて位置するゲノムＤＮＡ配列と相同であり得る。そのため、免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドは、切断部位の約１０、２０、３０、４０、５０、６０又は７０塩基対以内の標的化される遺伝子座位に挿入され得、且つ切断部位に隣接する（及びホモロジーアームと相同性を有しない）さらなるゲノムＤＮＡは、欠失され得る。ホモロジーアームは、約５０ヌクレオチド～数千ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、約５００ヌクレオチド～約１０００ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。ホモロジーアームとゲノムＤＮＡとの間の実質的な配列相同性は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％であり得る。
いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、Ｂ２Ｍガイド（例えば、配列番号１～３、３５～４４のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ）とともに使用される。いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、Ｂ２Ｍ遺伝子の開始部位を除去することになる任意のＢ２Ｍガイドとともに使用されるように設計される。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍホモロジーアームは、配列番号７若しくは１３のポリヌクレオチド配列又は配列番号７若しくは１３のものと少なくとも８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得るか又はそれから本質的になり得る。いくつかの実施形態では、左Ｂ２Ｍホモロジーアームは、配列番号７又は配列番号７のものと少なくとも８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得るか又はそれから本質的になり得る。いくつかの実施形態では、右Ｂ２Ｍホモロジーアームは、配列番号１３又は配列番号１３のものと少なくとも８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得るか又はそれから本質的になり得る。
いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、ＴＸＮＩＰガイド（例えば、配列番号１５～２４のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ）とともに使用される。いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、ＴＸＮＩＰのエクソン１を標的化するいずれかのＴＸＮＩＰガイド（例えば、配列番号１５～２０のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ）とともに使用されるように設計される。いくつかの実施形態では、ＴＸＮＩＰホモロジーアームは、配列番号２５若しくは３２のポリヌクレオチド配列又は配列番号２５若しくは３２のものと少なくとも８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得るか又はそれから本質的になり得る。いくつかの実施形態では、左ＴＸＮＩＰホモロジーアームは、配列番号２５又は配列番号２５のものと少なくとも８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得るか又はそれから本質的になり得る。いくつかの実施形態では、右ＴＸＮＩＰホモロジーアームは、配列番号３２又は配列番号３２のものと少なくとも８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得るか又はそれから本質的になり得る。
少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、外来プロモーターに作動可能に連結され得る。外来プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的又は細胞型特異的プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、外来プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ又はＵＢＣプロモーターである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、セーフハーバー座位、例えばＡＡＶＳ１座位に挿入される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその中に含有される（すなわちその中又は近傍にある）ゲノムＤＮＡの部位又は領域に挿入される。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座位内又はその近傍の部位で挿入される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子若しくはプロモーターの全て又は部分の欠失と一致するか、又はそれに続くＢ２Ｍ遺伝子座位内又はその近傍にある部位で挿入される。ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、外来プロモーターに作動可能に連結される。外来プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座位内又はその近傍の部位で挿入される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子若しくはプロモーターの全て又は部分の欠失と一致するか、又はそれに続くＢ２Ｍ遺伝子座位内又はその近傍にある部位で挿入される。ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、外来プロモーターに作動可能に連結される。外来プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び／又は３０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５５のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座位内又はその近傍にある部位で挿入される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ若しくはＨＬＡ－Ｃ遺伝子又はプロモーターの欠失と一致するか、或いはそれに続くＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座位内又はその近傍にある部位で挿入される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子座位内又はその近傍の部位で挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子若しくはプロモーターの欠失と一致するか、又はそれに続くＣＩＩＴＡ遺伝子座位内又はその近傍にある部位で挿入される。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子座位内若しくは近傍の部位にあるＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドの挿入と一致するＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座位内又はその近傍の部位で挿入される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ベクターの一部として細胞に送達され得る。例えば、ベクターは、プラスミドベクターであり得る。様々な実施形態では、細胞に送達されるプラスミドベクターの量は、約０．５μｇ～約１０μｇ（約１０6細胞当たり）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、プラスミドの量は、約１μｇ～約８μｇ、約２μｇ～約６μｇ又は約３μｇ～約５μｇの範囲であり得る。特定の実施形態では、細胞に送達されるプラスミドの量は、約４μｇであり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の生存因子の発現の増加又は減少を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、生存因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列の挿入を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、さらなる生存因子の１つの欠失を含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変は、本明細書に記載される方法を含むが、それらに限定されない任意の遺伝子編集方法を使用して実施される。いくつかの実施形態では、細胞は、未改変細胞に対して、少なくとも１つの生存因子の発現の増加又は減少を含む。いくつかの実施形態では、生存因子は、細胞生存に関与するメンバー又は決定的な経路、例えば低酸素、活性酸素種、栄養欠乏及び／又は酸化ストレスである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの生存因子の遺伝子改変は、生着後に未改変細胞より長い期間、例えば少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍又は少なくとも５０倍長い期間にわたってユニバーサルドナー細胞が生存することを可能にする。いくつかの実施形態では、生存因子は、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、ＪＮＫ又はＭＡＮＦである。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドの挿入を含み、未改変細胞に対して、宿主対象への移植又は生着後にユニバーサルドナー細胞がより高い生存率で生存することを可能にする。いくつかの実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドは、セーフハーバー座位に挿入される。いくつかの実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドは、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子に属する遺伝子に挿入される。
いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１及び／又はＪＮＫ遺伝子の全体又は一部を欠失させるために改変されている。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１及び／又はＪＮＫ遺伝子のプロモーター領域の全体又は一部を欠失させるために改変されている。
いくつかの実施形態では、２つ以上の生存因子が細胞内で遺伝子改変される。
ある種の実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩ発現を有さず、且つＭＨＣ－Ｉの中程度の発現を有する細胞は、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩの表面発現を有しないように遺伝子改変される。別の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ／ＩＩの表面発現を有しない細胞は、ＰＤ－Ｌ１の発現、例えばＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入を有するようにさらに編集される。さらに別の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ／ＩＩの表面発現を有しない細胞は、ＰＤ－Ｌ１の発現、例えばＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入を有するようにさらに編集され、且つ未改変細胞に対して、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加又は減少させるようにも遺伝子改変される。
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、遺伝子改変による、生着後の免疫回避又は細胞生存のいずれかに必ずしも関係付けられない１つ以上のさらなる遺伝子の発現の増加又は減少をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞は、未改変細胞に対して、１つ以上の安全スイッチタンパク質の発現の増加をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞は、安全スイッチタンパク質をコードする１つ以上のさらなる遺伝子の発現の増加を含む。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、自殺遺伝子でもある。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、単純ヘルペスウイルス－１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）又は誘導性カスパーゼ－９である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの安全スイッチをコードするポリヌクレオチドは、ゲノム、例えばセーフハーバー座位に挿入される。いくつかの他の実施形態では、遺伝子改変される１つ以上のさらなる遺伝子は、コンストラクトとともに組み込まれた安全スイッチタンパク質；標的化モダリティー；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬学的に活性なタンパク質又はペプチド；薬物標的候補；並びにその生着、輸送、回遊、生存率、自己再生、持続及び／又は生存を促進するタンパク質の１つ以上をコードする。
本発明の一態様は、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞を作製する方法を提供し、ユニバーサルドナー細胞は、ゲノム中の１つ以上の選択された部位で少なくとも１つの標的化されたゲノム改変を含み、方法は、選択された部位での標的化された改変を可能にする１つ以上のコンストラクトを前記細胞に導入することにより、本明細書に記載されるとおりの細胞型を遺伝子操作することと；選択された部位認識が可能な１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位で１つ以上の二本鎖切断を前記細胞に導入することと；選択された部位での標的化された挿入又は欠失を生成するための内在性ＤＮＡ修復を可能にするように編集された細胞を培養し；それによりゲノム改変されたユニバーサルドナー細胞を得ることとを含む。ゲノム改変されたドナー細胞は、複数の部位が標的化及び改変されるように、連続的なラウンドのゲノム改変を経る場合がある。ゲノム改変された細胞は、当技術分野でよく知られる手法を使用して培養され、特徴付けられ、選択され、且つ増殖される。この方法によって作製されたユニバーサルドナー細胞は、少なくとも１つの機能的な標的化されたゲノム改変を含むことになり、ゲノム改変された細胞は、それらが幹細胞である場合、前駆細胞又は完全に分化した細胞に分化することができる。
いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７又はＰＤ－Ｌ１の少なくとも１つにおける導入又は増加された発現を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスＩＩ欠損である。いくつかの実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌル又は不十分なＢ２Ｍを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ及びＰＤ－Ｌ１の１つ以上をコードする組込み又は非組込み外来ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、導入された前記発現は、前記細胞中に含まれる、発現されないか又は不十分に発現される遺伝子のいずれかから発現が増加したものである。いくつかの実施形態では、非組込み外来ポリヌクレオチドは、センダイウイルス、ＡＡＶ、エピソーム又はプラスミドを使用して導入される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１の１つ以上の発現の導入及び少なくとも１つの安全スイッチタンパク質の発現の増加又は減少を伴う。別の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃヌルであり、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１及び少なくとも１つの安全スイッチタンパク質の１つ以上の発現の導入を伴う。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１の１つ以上の発現の導入及び少なくとも１つの生存因子、例えばＭＡＮＦの発現の増加又は減少を伴う。本明細書に記載される遺伝子改変細胞のいずれかを作製する方法は、本明細書に記載される遺伝子編集方法の少なくともいずれかを使用して実施されることが企図される。
ＩＶ．細胞型
本明細書に記載されるとおりの細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、任意の可能なクラスの細胞型に属し得る。いくつかの実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、哺乳動物細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、ヒト細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）であり得る。いくつかの実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（造血幹細胞（ＨＳＣ）とも呼ばれる）であり得る。いくつかの実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、分化細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（及び対応する未改変細胞）は、体細胞、例えば免疫系細胞又は収縮細胞、例えば骨格筋細胞であり得る。
本明細書に記載される細胞、例えばユニバーサルドナー幹細胞は、ＨＬＡ発現及びユニバーサル幹細胞株の免疫原性の評価を判断するために適切な細胞型に分化され得る。一般に、分化は、細胞が目的の分化細胞に分化するのに十分な期間にわたって且つ条件下で目的の細胞を維持することを含む。例えば、本明細書で開示されるユニバーサル幹細胞は、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）、低免疫原性心筋細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、内皮細胞（ＥＣ）、マクロファージ、肝細胞、ベータ細胞（例えば、膵ベータ細胞）、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、造血前駆細胞又は神経前駆細胞（ＮＰＣ）に分化され得る。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞又は成熟ベータ細胞に分化され得る。
幹細胞は、増殖及びさらなる前駆細胞を生じさせる能力の両方があり、これらは、分化した娘細胞又は分化可能な娘細胞を生じさせることができる多数の母細胞を生成する能力を有する。娘細胞自体は、増殖し、引き続いて１つ以上の成熟細胞型に分化する後代を生成するように誘導され得るが、親の発生潜在力を有する１つ以上の細胞も保持する。次に、用語「幹細胞」は、特定の状況下でさらに特定的な表現型又は分化した表現型に分化する能力又は潜在力を有し、且つ一定の状況下で実質的に分化することなく増殖する能力を保持する細胞を指す。一態様では、前駆細胞又は幹細胞という用語は、全般的な母細胞を指し、その子孫（後代）は、分化、例えば胚細胞及び組織の漸進的な多様化に見られるとおり、完全に個別の特徴を獲得することにより、多くの場合に異なる方向に特殊化する。細胞分化は、典型的には、多くの細胞分裂を介して起こる複雑なプロセスである。分化細胞は、それ自体が多能性細胞などに由来する多能性細胞に由来し得る。これらの多能性細胞の各々は、幹細胞であると考えられ得るが、各々が生じさせることができる細胞型の範囲は、非常に変動し得る。一部の分化細胞は、より高い発生潜在力を有する細胞を生じさせる能力も有する。そのような能力は、天然であり得るか、又は様々な因子による処理時に人工的に誘導され得る。多くの生物学的な例において、幹細胞は、それらが２つ以上の異なる細胞型の後代を生成できるため、「多能性」でもあり得るが、これは、「幹細胞性」に必要ではない。
「分化細胞」は、比較される細胞より発生経路がさらに進んだ細胞である。したがって、幹細胞は、系列限定前駆体細胞（筋細胞前駆細胞など）に分化することができ、これは、さらに進んだ経路の他の型の前駆細胞（筋細胞前駆体など）、続いて筋細胞などの最終段階の分化細胞に分化することができ、ある種の組織型において特徴的な役割を果たし、且つさらに増殖する能力を保持するか又は保持しない場合がある。いくつかの実施形態では、分化細胞は、膵ベータ細胞であり得る。
胚性幹細胞
本明細書に記載される細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）であり得る。ＥＳＣは、哺乳動物胚の未分化胚芽細胞に由来し、任意の細胞型に分化し、迅速に増殖することができる。ＥＳＣは、正常な核型を有するとも考えられ、高いテロメラーゼ活性を維持し、且つ顕著な長期間の増殖ポテンシャルを呈し、これらの細胞をユニバーサルドナー細胞としての使用のための優れた候補にする。
成体幹細胞
本明細書に記載される細胞は、成体幹細胞（ＡＳＣ）であり得る。ＡＳＣは、哺乳動物、例えばヒトにおいて見出され得る未分化細胞である。ＡＳＣは、それらの自己再生する、例えば未分化状態を維持しながら複数のラウンドの細胞複製を通して継代される能力及び複数の異なる細胞型、例えばグリア細胞に分化する能力によって定義される。成体幹細胞は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸管幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経冠幹細胞及び精巣細胞を包含し得る広範なクラスの幹細胞である。
人工多能性幹細胞
本明細書に記載される細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。ｉＰＳＣは、多能性に関与する決定的な転写因子、例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃＭＹＣ及びＫＬＦ４をコードする遺伝子を導入することによって成体ヒト細胞から直接的に作製され得る。ｉＰＳＣは、引き続く前駆細胞が投与される同じ対象に由来し得る。すなわち、体細胞は、対象から得られ、人工多能性幹細胞に初期化され、続いて対象に投与される前駆細胞（例えば、自己細胞）に再分化され得る。しかしながら、自己細胞の場合、生着後の免疫応答及び不十分な生存率のリスクが残存する。
ヒト造血幹細胞・前駆細胞
本明細書に記載される細胞は、ヒト造血幹細胞・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）であり得る。この幹細胞系列は、赤血球系（赤血球又は赤血球細胞（ＲＢＣ））、骨髄性（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球／血小板及び樹状細胞）及びリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血液細胞型を生じさせる。血液細胞は、自己再生によってそれ自体を補充する能力を有する非常に少数の多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）の増殖及び分化によって産生される。分化中、ＨＳＣの後代は、様々な中間の成熟段階を通して発達し、成熟に達する前に多分化能を有し、且つ系列に関係付けられた前駆細胞を生成する。骨髄（ＢＭ）は、ヒトにおける造血発生の主要な部位であり、通常の条件下では、ごく少数の造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）が末梢血液（ＰＢ）中に見出され得る。サイトカイン、癌治療において使用されるいくつかの骨髄抑制性薬物及び造血間質細胞とＢＭ間質細胞との間の相互作用を破壊する化合物による治療により、多数の幹細胞及び前駆細胞を血行に迅速に動員できる。
他の細胞型への細胞の分化
本開示の方法の別の工程は、分化細胞に細胞を分化させることを含み得る。分化させる工程は、当技術分野において知られる任意の方法に従って実施され得る。例えば、ヒトｉＰＳＣは、アクチビン及びＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む様々な処理を使用して胚体内胚葉に分化される。胚体内胚葉は、肝細胞にさらに分化され、処理は、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、オンコスタチンＭ、デキサメタゾンなどを含む（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１０；２８：６７４－６８６；Ｍａ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３；２：４０９－４１９）。別の実施形態では、分化させる工程は、Ｓａｗｉｔｚａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５；５：１３３２０に従って実施され得る。分化細胞は、哺乳動物、例えばヒトの任意の体細胞であり得る。いくつかの実施形態では、体細胞は、外分泌性上皮細胞（例えば、唾液腺粘液細胞、前立腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例えば、下垂体前葉細胞、腸管細胞、膵島）、角化上皮細胞（例えば、表皮角化細胞）、湿性重層化障壁上皮細胞、感覚変換細胞（例えば、光受容体）、自律神経性神経細胞、感覚器及び末梢ニューロン支持細胞（例えば、シュワン細胞）、中枢神経系ニューロン、グリア細胞（例えば、星状細胞、乏突起膠細胞）、レンズ細胞、脂肪細胞、腎細胞、バリア機能細胞（例えば、導管細胞）、細胞外マトリックス細胞、収縮細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞）、血液細胞（例えば、赤血球）、免疫系細胞（例えば、巨核球、ミクログリア細胞、好中球、マスト細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）、生殖細胞（例えば、精子細胞）、ナース細胞又は間質細胞であり得る。
一般に、本明細書で開示されるユニバーサルドナー細胞の集団は、挿入された１つ以上のヌクレオチド配列の発現を経時的に維持する。例えば、ユニバーサルドナー細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％は、１つ以上の免疫寛容原性因子を発現する。さらに、本明細書で開示されるユニバーサルドナー細胞に由来する系列限定細胞又は完全に分化した細胞の集団は、挿入された１つ以上のヌクレオチド配列の発現を経時的に維持する。例えば、系列限定細胞又は完全に分化した細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％は、１つ以上の免疫寛容原性因子を発現する。
Ｖ．製剤化及び投与
遺伝子編集のための製剤化及び送達
本明細書に記載されるとおりのガイドＲＮＡ、ポリヌクレオチド、例えば免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチド又はエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド及びエンドヌクレアーゼは、当技術分野において知られる任意の様式で製剤化され、細胞に送達され得る。
ガイドＲＮＡ及び／又はポリヌクレオチドは、特定の投与様式及び剤形に依存して、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化され得る。ガイドＲＮＡ及び／又はポリヌクレオチド組成物は、製剤化及び投与経路に依存して、生理学的に適合性のｐＨ及び約３のｐＨ～約１１のｐＨ、約３のｐＨ～約７のｐＨの範囲に達するように製剤化され得る。いくつかの場合、ｐＨは、約ｐＨ５．０～約ｐＨ８の範囲に調整され得る。いくつかの場合、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに、本明細書に記載されるとおりの治療有効量の少なくとも１つの化合物を含み得る。任意選択により、組成物は、本明細書に記載される化合物の組み合わせを含み得るか、又は細菌増殖の処置若しくは予防において有用な第２の活性成分（限定されないが、例えば抗細菌剤又は抗微生物剤）を含み得るか、又は本開示の試薬の組み合わせを含み得る。
好適な賦形剤としては、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などの巨大でゆっくりと代謝される高分子を含む担体分子が挙げられる。他の例示的な賦形剤としては、抗酸化剤（限定されないが、例えばアスコルビン酸）、キレート剤（限定されないが、例えばＥＤＴＡ）、炭水化物（限定されないが、例えばデキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース及びヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（限定されないが、例えば油、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール）、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを挙げることができる。
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）及び／又はエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）は、当技術分野において知られるウイルス性又は非ウイルス性送達ビヒクルによって送達され得る。代わりに、エンドヌクレアーゼポリペプチドは、エレクトロポレーション又は脂質ナノ粒子など、当技術分野において知られるウイルス性又は非ウイルス性送達ビヒクルによって送達され得る。さらなる代替的な態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のポリペプチドとして、単独で又は１つ以上のガイドＲＮＡ若しくはｔｒａｃｒＲＮＡと合わせた１つ以上のｃｒＲＮＡと予め複合体を形成して送達され得る。
ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正に荷電したペプチド、小分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー－ＲＮＡキメラ及びＲＮＡ－融合タンパク質複合体を含むが、これらに限定されない非ウイルス性ビヒクルによって送達され得る。いくつかの例示的な非ウイルス性送達ビヒクルは、Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，１８：１１２７－１１３３（他のポリヌクレオチドの送達にも有用であるｓｉＲＮＡのための非ウイルス性送達ビヒクルに焦点を当てている）において記載される。
本開示のポリヌクレオチドに関して、製剤化は、例えば、国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０６９６１０号明細書において教示されるもののいずれかから選択され得る。
ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞又は対象に送達され得る。
ＬＮＰは、１０００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、７５ｎｍ未満、５０ｎｍ未満又は２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。代わりに、ナノ粒子は、１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２５０ｎｍ、２５～２００ｎｍ、２５～１００ｎｍ、３５～７５ｎｍ又は２５～６０ｎｍのサイズの範囲であり得る。
ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性又は中性脂質から作製され得る。膜融合リン脂質ＤＯＰＥ又は膜成分コレステロールなどの中性脂質は、トランスフェクション活性及びナノ粒子安定性を増強する「ヘルパー脂質」としてＬＮＰ中に含まれ得る。カチオン性脂質の制約としては、不十分な安定性及び迅速なクリアランス並びに炎症性又は抗炎症性応答の発生に起因する低い有効性が挙げられる。
ＬＮＰは、疎水性脂質、親水性脂質又は疎水性脂質及び親水性脂質の両方でも構成され得る。
当技術分野において知られる任意の脂質又は脂質の組み合わせを使用して、ＬＮＰを生成することができる。ＬＮＰを生成するために使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ及びＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１及び７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ及びＳＭである。ＰＥＧ修飾脂質の例は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４及びＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０である。
脂質は、ＬＮＰを生成するために任意の数のモル比において組み合わされ得る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＬＮＰを生成するために広範なモル比において脂質と組み合わされ得る。
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、送達のために使用され得る。送達されるポリヌクレオチド、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルス機能を含む、パッケージ化されるＡＡＶゲノムが細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を生成するための手法は、当技術分野において標準的なものである。ｒＡＡＶの生成は、通常、次の成分が単一の細胞（本明細書でパッケージング細胞と表示される）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離された（すなわちその中にない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルス機能。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来することができ、本明細書に記載されるＡＡＶ血清型を含むが、これらに限定されないｒＡＡＶゲノムＩＴＲと異なるＡＡＶ血清型に由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際特許出願公開番号国際公開第０１／８３６９２号パンフレットにおいて開示される。
細胞、例えばユニバーサルドナー細胞の製剤化及び投与
本明細書に記載されるとおりの遺伝子改変細胞、例えばユニバーサルドナー細胞は、製剤化され、且つ当技術分野において知られる任意の様式によって対象に投与され得る。
用語「投与する」、「導入する」、「埋入する」、「生着する」及び「移植する」は、所望の部位での導入細胞の少なくとも部分的な局在をもたらす方法又は経路による細胞、例えば前駆細胞の対象への留置に関連して脈において互換的に使用される。細胞、例えば前駆細胞又はそれらの分化した後代は、埋入された細胞又は細胞の構成要素の少なくとも一部が生存したままである対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間（例えば、２４時間）の短い期間から数日、数年又はさらに対象の寿命（すなわち長期の生着）までであり得る。
本明細書に記載されるとおりの遺伝子改変細胞、例えばユニバーサルドナー細胞は、対象への投与後、未改変細胞のものより長い期間生存可能であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの細胞を含む組成物は、例えば、一定期間かけた大量投与として又は持続注入による静脈内投与を含み得る好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内又は髄腔内経路によって実施され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、固体形態、水性形態又は液体形態であり得る。いくつかの実施形態では、水性又は液体形態は、噴霧又は凍結乾燥され得る。いくつかの実施形態では、噴霧又は凍結乾燥形態は、水性又は液体溶液により再構成され得る。
細胞組成物は、乳化手順が細胞生存率に悪影響を及ぼさないことを条件として、リポソーム組成物としても乳化又は提示され得る。細胞及び任意の他の活性成分は、薬学的に許容され、且つ活性成分と適合性である賦形剤とともに、且つ本明細書に記載される治療方法における使用のために好適な量で混合され得る。
細胞組成物中に含まれる追加の薬剤は、その成分に薬学的に許容される塩を含み得る。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸又は酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基とともに形成される）を含む。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基にも由来し得る。
生理学的に許容できる担体は、当技術分野においてよく知られる。例示的な液体担体は、活性成分及び水に加えて材料を含有しないか、又はリン酸緩衝食塩水など、生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理食塩水若しくはその両方などの緩衝液を含有する滅菌水溶液である。さらに、水性担体は、２つ以上の緩衝液塩並びに塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール及び他の溶質を含有し得る。液体組成物は、水に加えて且つ水を除いて、液相も含有し得る。そのような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油及び水－油エマルションである。特定の障害又は状態の治療において有効である細胞組成物において使用される活性化合物の量は、障害又は状態の性質に依存する可能性があり、標準的な臨床手法によって決定され得る。
いくつかの実施形態では、細胞を含む組成物は、疾患を有するか、それを有することが疑われるか又はそのリスクがある対象、例えばヒト対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、疾患を有しないか、有すると疑われないか又はそのリスクがない対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、健康なヒトである。いくつかの実施形態では、遺伝的に受け継がれる疾患を有するか、それを有することが疑われるか又はそのリスクがある対象、例えばヒト対象。いくつかの実施形態では、対象は、疾患の症状に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、疾患は、糖尿病、例えばＩ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病である。
ＶＩ．本開示の特定の組成物及び方法
したがって、本開示は、特に、以下の非限定的な組成物及び方法に関する。
第１の組成物、組成物１において、本開示は、生存因子をコードする遺伝子内又はその近傍に挿入される、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含むユニバーサルドナー細胞を含む組成物であって、ユニバーサルドナー細胞は、免疫寛容原性因子を発現し、且つ生存因子の破壊された発現を有し、及びユニバーサルドナー細胞は、対照細胞と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する、組成物を提供する。
別の組成物、組成物２において、本開示は、対照細胞が、野生型細胞又は挿入されるヌクレオチド配列を含まない細胞である、組成物１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物３において、本開示は、生存因子の破壊された発現が、減少又は消失した発現を含む、組成物１又は２において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物４において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４又はＣＤ４７である、組成物１～３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物５において、本開示は、生存因子がＴＸＮＩＰ、ＺＮＦ１４３、ＦＯＸＯ１、ＪＮＫ又はＭＡＮＦである、組成物１～４のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物６において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅであり、及び生存因子がＴＸＮＩＰである、組成物請求項１～５のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物７において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、そのシグナルペプチドを伴わずにＨＬＡ－Ｅに融合されたＢ２Ｍ膜タンパク質に融合されたＨＬＡ－Ｇ提示ペプチドに融合されたＢ２Ｍシグナルペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含む、組成物５又は６において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物８において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列が配列番号５５から本質的になる、組成物７において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物９において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列が外来プロモーターに作動可能に連結される、組成物１～８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物１０において、本開示は、外来プロモーターがＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ又はＵＢＣプロモーターである、組成物９において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物１１において、本開示は、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする遺伝子内又はその近傍に挿入される、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ユニバーサルドナー細胞が免疫寛容原性因子を発現し、且つＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子の破壊された発現を有する、組成物請求項１～１０のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２において、本開示は、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子の破壊された発現が、減少又は消失した発現を含む、組成物１１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物１３において、本開示は、第２の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４又はＣＤ４７である、組成物１１又は１２において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物１４において、本開示は、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子がＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ又はＲＦＸＡＮＫである、組成物１１～１３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物１５において、本開示は、第２の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１であり、及びＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子がＢ２Ｍである、組成物１１～１４のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物１６において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列が配列番号１１から本質的になる、組成物１５において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物１７において、本開示は、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列が外来プロモーターに作動可能に連結される、組成物１１～１６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物１８において、本開示は、外来プロモーターがＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ又はＵＢＣプロモーターである、組成物１７において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物１９において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅであり、生存因子がＴＸＮＩＰであり、第２の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１であり、及びＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子がＢ２Ｍである、組成物１１～１８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物２０において、本開示は、細胞が幹細胞である、組成物１～１９のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物２１において、本開示は、幹細胞が胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞又は造血幹細胞である、組成物２０において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物２２において、本開示は、細胞が分化細胞又は体細胞である、組成物１～１９のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物２３において、本開示は、細胞が系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化することができる、組成物１～１９のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物２４において、本開示は、系列限定前駆細胞が膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、造血前駆細胞又は神経前駆細胞である、組成物２３において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物２５において、本開示は、完全に分化した体細胞が膵ベータ細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、心筋細胞又は免疫系細胞である、組成物２３において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物２６において、本開示は、組成物が複数のユニバーサルドナー細胞を含む、組成物１～２５のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物２７において、本開示は、組成物が、複数のユニバーサルドナー細胞に由来する系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞の集団で構成される、組成物２６において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物２８において、本開示は、系列限定前駆細胞が膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、造血前駆細胞又は神経前駆細胞であり、及び完全に分化した体細胞が膵ベータ細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、心筋細胞又は免疫系細胞である、組成物２７において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物２９において、本開示は、組成物が複数のユニバーサルドナー細胞を含む、組成物６又は１９において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物３０において、本開示は、組成物が、複数のユニバーサルドナー細胞に由来する系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞の集団で構成される、組成物２９において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１において、本開示は、系列限定前駆細胞が胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、未成熟ベータ細胞又は成熟ベータ細胞であり、及び完全に分化した体細胞が膵ベータ細胞である、組成物３０において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２において、本開示は、細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約７０％又は少なくとも約９０％が第１の免疫寛容原性因子、第２の免疫寛容原性因子又は第１及び第２の免疫寛容原性因子を発現する、組成物２６又は２９において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物３３において、本開示は、細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約７０％又は少なくとも約９０％が第１の免疫寛容原性因子、第２の免疫寛容原性因子又は第１及び第２の免疫寛容原性因子を発現する、組成物２７、２８、３０又は３１のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物３４において、本開示は、組成物２６の複数の細胞又は組成物２７若しくは２８の細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物３５において、本開示は、治療を、それを必要とする対象において行う際の使用のための、組成物３４において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物３６において、本開示は、対象が、疾患を有するか、それを有することが疑われるか又はそのリスクがある、組成物３５において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物３７において、本開示は、疾患が、遺伝的に受け継がれる疾患である、組成物３６において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物３８において、本開示は、組成物２９の複数の細胞又は組成物３０若しくは３１の細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物３９において、本開示は、糖尿病の治療を、それを必要とする対象において行うための、組成物３８において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物４０において、本開示は、対象がＩ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病を有する、組成物３９において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物４１において、本開示は、対象がヒトである、組成物３５～４０のいずれか１つにおいて提供されるとおりの組成物を提供する。
第１の方法、方法１において、本開示は、細胞であって、それを必要とする対象への投与のための細胞を得る方法であって、（ａ）組成物２６、２９又は３２のいずれか１つの複数のユニバーサルドナー細胞を得るか又は得ていることと、（ｂ）細胞の系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞への分化に十分な時間にわたって且つ条件下で複数のユニバーサルドナー細胞を維持することとを含む方法を提供する。
別の方法、方法２において、本開示は、治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ａ）組成物２６、２９又は３２のいずれか１つの複数のユニバーサルドナー細胞を、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞への分化後に得るか又は得ていることと；（ｂ）系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞を対象に投与することとを含む方法を提供する。
別の方法、方法３において、本開示は、投与することが、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞を含むデバイスを対象に埋入することを含む、方法２において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法４において、本開示は、系列限定前駆細胞が膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、造血前駆細胞又は神経前駆細胞であり、及び完全に分化した体細胞が膵ベータ細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、心筋細胞又は免疫系細胞である、方法１～３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法５において、本開示は、対象が、疾患を有するか、それを有することが疑われるか又はそのリスクがある、方法１～４のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法６において、本開示は、疾患が、遺伝的に受け継がれる疾患である、方法５において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法７において、本開示は、対象がヒトである、方法１～６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法８において、本開示は、糖尿病の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ａ）組成物２９又は３２の複数のユニバーサルドナー細胞を、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞への分化後に得るか又は得ていることと；（ｂ）膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞を対象に投与することとを含む方法を提供する。
別の方法、方法９において、本開示は、投与することが、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞を含むデバイスを対象に埋入することを含む、方法８において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１０において、本開示は、対象がＩ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病を有する、方法８又は９において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１１において、本開示は、対象がヒトである、方法８～１０のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の組成物、組成物４１において、本開示は、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）をコードする遺伝子内又はその近傍に挿入される、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列を含むユニバーサルドナー細胞を含む組成物であって、ユニバーサルドナー細胞がＨＬＡ－Ｅを発現し、且つＴＸＮＩＰの破壊された発現を有し、及びユニバーサルドナー細胞が対照と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する、組成物を提供する。
別の組成物、組成物４２において、本開示は、対照細胞が、野生型細胞又は挿入されるヌクレオチド配列を含まない細胞である、組成物４１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物４３において、本開示は、ＴＸＮＩＰの破壊された発現が、減少又は消失した発現を含む、組成物４１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物４４において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、そのシグナルペプチドを伴わずにＨＬＡ－Ｅに融合されたＢ２Ｍ膜タンパク質に融合されたＨＬＡ－Ｇ提示ペプチドに融合されたＢ２Ｍシグナルペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含む、組成物４１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物４５において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列が配列番号５５から本質的になる、組成物４４において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物４６において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が外来プロモーターに作動可能に連結される、組成物４１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物４７において、本開示は、外来プロモーターがＣＡＧプロモーターである、組成物４１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物４８において、本開示は、細胞が幹細胞である、組成物４１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物４９において、本開示は、幹細胞が胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞又は造血幹細胞である、組成物４８において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物５０において、本開示は、細胞が分化細胞又は体細胞である、組成物４１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物５１において、本開示は、細胞が系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化することができる、組成物４１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物５２において、本開示は、系列限定前駆細胞が胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、未成熟ベータ細胞又は成熟ベータ細胞であり、及び完全に分化した体細胞が膵ベータ細胞である、組成物５１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物５３において、本開示は、組成物４１において提供されるとおりの複数のユニバーサルドナー細胞を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物５４において、本開示は、細胞の少なくとも約５０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物５３において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物５５において、本開示は、細胞の少なくとも約７０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物５３において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物５６において、本開示は、細胞の少なくとも約９０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物５３において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物５７において、本開示は、組成物５３の複数のユニバーサルドナー細胞に由来する系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物５８において、本開示は、系列限定前駆細胞が胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、未成熟ベータ細胞又は成熟ベータ細胞であり、及び完全に分化した体細胞が膵ベータ細胞である、組成物５７において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物５９において、本開示は、細胞の少なくとも約５０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物５８において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物６０において、本開示は、細胞の少なくとも約７０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物５９において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物６１において、本開示は、細胞の少なくとも約９０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物５９において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物６２において、本開示は、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）の導入又は増加された発現及びチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）の破壊された発現を有する遺伝子改変細胞を含む組成物であって、遺伝子改変細胞が未改変細胞と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する、組成物を提供する。
別の組成物、組成物６３において、本開示は、ＴＸＮＩＰをコードする遺伝子内又はその近傍に挿入される、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含み、それによりＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する、組成物６２において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物６４において、本開示は、ＴＸＮＩＰの破壊された発現が、減少又は消失した発現を含む、組成物６２において提供されるとおりの組成物を提供する
別の方法、方法１２において、本開示は、糖尿病の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、組成物５３の複数のユニバーサルドナー細胞を、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞への分化後に得るか又は得ていることと；（ｂ）膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞を対象に投与することとを含む方法を提供する。
別の方法、方法１３において、本開示は、投与することが、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞を含むデバイスを対象に埋入することを含む、方法１２において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１４において、本開示は、対象がＩ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病を有する、方法１２において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１５において、本開示は、対象がヒトである、方法１２において提供されるとおりの方法を提供する。
別の組成物、組成物６５において、本開示は、（ａ）ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする遺伝子内又はその近傍に挿入される、プログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）をコードするヌクレオチド配列、及び（ｂ）チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）をコードする遺伝子内又はその近傍に挿入される、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列を含むユニバーサルドナー細胞を含む組成物であって、ユニバーサルドナー細胞がＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅを発現し、且つＢ２Ｍ及びＴＸＮＩＰの破壊された発現を有し、及びユニバーサルドナー細胞が対照と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する、組成物を提供する。
別の組成物、組成物６６において、本開示は、対照細胞が、野生型細胞又は挿入されるヌクレオチド配列を含まない細胞である、組成物６５において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物６７において、本開示は、Ｂ２Ｍの破壊された発現が、Ｂ２Ｍの減少又は消失した発現を含み、且つＴＸＮＩＰの破壊された発現が、ＴＸＮＩＰの減少又は消失した発現を含む、組成物６５において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物６８において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列が配列番号１１から本質的になる、組成物６５において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物６９において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、そのシグナルペプチドを伴わずにＨＬＡ－Ｅに融合されたＢ２Ｍ膜タンパク質に融合されたＨＬＡ－Ｇ提示ペプチドに融合されたＢ２Ｍシグナルペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含む、組成物６５において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物７０において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列が配列番号５５から本質的になる、組成物６９において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物７１において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列が外来プロモーターに作動可能に連結され、且つＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が外来プロモーターに作動可能に連結される、組成物６５において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物７２において、本開示は、外来プロモーターがＣＡＧプロモーターである、組成物７１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物７３において、本開示は、細胞が幹細胞である、組成物６５において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物７４において、本開示は、幹細胞が胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞又は造血幹細胞である、組成物７３において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物７５において、本開示は、細胞が分化細胞又は体細胞である、組成物６５において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物７６において、本開示は、細胞が系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化することができる、組成物６５において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物７７において、本開示は、系列限定前駆細胞が胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、未成熟ベータ細胞又は成熟ベータ細胞であり、及び完全に分化した体細胞が膵ベータ細胞である、組成物７６において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物７８において、本開示は、組成物６５において提供されるとおりの複数のユニバーサルドナー細胞を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物７９において、本開示は、細胞の少なくとも約５０％がＰＤ－Ｌ１を発現し、且つ／又は細胞の少なくとも約５０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物７８において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物８０において、本開示は、細胞の少なくとも約７０％がＰＤ－Ｌ１を発現し、且つ／又は細胞の少なくとも約７０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物７８において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物８１において、本開示は、細胞の少なくとも約９０％がＰＤ－Ｌ１を発現し、且つ／又は細胞の少なくとも約９０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物７８において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物８２において、本開示は、組成物７８において提供されるとおりの複数のユニバーサルドナー細胞に由来する系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物８３において、本開示は、系列限定前駆細胞が胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、未成熟ベータ細胞又は成熟ベータ細胞であり、及び完全に分化した体細胞が膵ベータ細胞である、組成物８２において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物８４において、本開示は、細胞の少なくとも約５０％がＰＤ－Ｌ１を発現し、且つ／又は細胞の少なくとも約５０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物８３において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物８５において、本開示は、細胞の少なくとも約７０％がＰＤ－Ｌ１を発現し、且つ／又は細胞の少なくとも約７０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物８３において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物８６において、本開示は、細胞の少なくとも約９０％がＰＤ－Ｌ１を発現し、且つ／又は細胞の少なくとも約９０％がＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物８３において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物８７において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅの導入又は増加された発現並びにＢ２Ｍ及びＴＸＮＩＰの破壊された発現を有する遺伝子改変細胞を含む組成物であって、遺伝子改変細胞が未改変細胞と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する、組成物を提供する。
別の組成物、組成物８８において、本開示は、Ｂ２Ｍをコードする遺伝子内又はその近傍に挿入される、ＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列を含み、それによりＢ２Ｍ遺伝子を破壊し、且つＴＸＮＩＰをコードする遺伝子内又はその近傍に挿入される、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含み、それによりＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する、組成物８７において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物８９において、本開示は、Ｂ２Ｍ及びＴＸＮＩＰの破壊された発現が、Ｂ２Ｍ及びＴＸＮＩＰの減少又は消失した発現を含む、組成物８７において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の方法、方法１６において、本開示は、糖尿病の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ａ）組成物７８の複数のユニバーサルドナー細胞を、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞への分化後に得るか又は得ていることと；（ｂ）膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞を対象に投与することとを含む方法を提供する。
別の方法、方法１７において、本開示は、投与することが、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞を含むデバイスを対象に埋入することを含む、方法１６において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１８において、本開示は、対象がＩ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病を有する、方法１６において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１９において、本開示は、対象がヒトである、方法１６において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法２０において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製するための方法であって、（ａ）生存因子をコードする遺伝子内又はその近傍の部位を標的化する第１の部位特異的ヌクレアーゼ；並びに（ｂ）（ｉ）（ａ）の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）（ａ）の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列に隣接する、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸を細胞に送達することを含み、第１の部位特異的ヌクレアーゼが（ａ）の標的部位を切断し、（ｂ）の第１の核酸が、（ａ）の部位と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその中に含有される部位で挿入され、それによりユニバーサルドナー細胞を作製し、ユニバーサルドナー細胞が、（ｂ）の核酸が挿入されていない細胞と比較して増加した細胞生存を有する、方法を提供する。
別の方法、方法２１において、本開示は、生存因子がＴＸＮＩＰ、ＺＮＦ１４３、ＦＯＸＯ１、ＪＮＫ又はＭＡＮＦである、方法２０において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法２２において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４又はＣＤ４７である、方法２０又は２１において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法２３において、本開示は、生存因子がＴＸＮＩＰである、方法２０～２２のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法２４において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅである、方法２３において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法２５において、本開示は、第１の部位特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ系である、方法２０～２４のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法２６において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＩＩ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はＶ型Ｃｆｐ１ヌクレアーゼであり、且つＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが少なくとも１つの核移行シグナルに連結される、方法２０～２５のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法２７において、本開示は、ｇＲＮＡが、配列番号１５～２４からなる標的配列に対応するスペーサー配列を含む、方法２０～２６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法２８において、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が配列番号２５から本質的になり、且つ（ｂ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が配列番号３２から本質的になる、方法２５～２７のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法２９において、本開示は、（ｃ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子の１つ以上をコードする遺伝子内又はその近傍の部位を標的化する第２の部位特異的ヌクレアーゼ；並びに（ｄ）（ｉｉｉ）（ｃ）の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、及び（ｉｖ）（ｃ）の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列に隣接する、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸を細胞に送達することをさらに含み、（ｄ）の第２の免疫寛容原性因子が第１の免疫寛容原性因子（ｂ）と異なり、第２の部位特異的ヌクレアーゼが（ｃ）の標的部位を切断し、（ｄ）の第２の核酸が、（ｃ）の部位と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその中に含有される部位で挿入され、ユニバーサルドナー細胞が、（ｄ）の第２の核酸が挿入されていない細胞と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する、方法２０～２８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法３０において、本開示は、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子がＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ又はＲＦＸＡＮＫである、方法２９において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法３１において、本開示は、第２の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４又はＣＤ４７である、方法２９又は３０において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法３２において、本開示は、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子がＢ２Ｍである、方法２９～３１のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法３３において、本開示は、第２の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１である、方法３２において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法３４において、本開示は、第２の部位特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系である、方法２９～３３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法３５において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＩＩ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はＶ型Ｃｆｐ１ヌクレアーゼであり、且つＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが少なくとも１つの核移行シグナルに連結される、方法３４において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法３６において、本開示は、ｇＲＮＡが、配列番号１～３又は３５～４４からなる標的配列に対応するスペーサー配列を含む、方法３４又は３５において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法３７において、本開示は、（ｄ）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が配列番号７から本質的になり、且つ（ｄ）（ｉｖ）のヌクレオチド配列が配列番号１３から本質的になる、方法３４～３６のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法３８において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡが１：３のモル比で存在する、方法２５～２８又は３４～３７のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法３９において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列が外来プロモーターに作動可能に連結され、且つ第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列が外来プロモーターに作動可能に連結される、方法２０～３８のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法４０において、本開示は、外来プロモーターが構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的又は細胞型特異的プロモーターであり、任意選択により、外来プロモーターがＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ又はＵＢＣプロモーターである、方法３９において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法４１において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製するための方法であって、（ａ）生存因子をコードする遺伝子内又はその近傍の部位を標的化する第１の部位特異的ヌクレアーゼ；（ｂ）（ｉ）（ａ）の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）（ａ）の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列に隣接する、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸（第１の部位特異的ヌクレアーゼは、（ａ）の標的部位を切断し、及び相同組換えのプロセスを通して、（ｂ）の第１の核酸は、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を、（ａ）の部位と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその中に含有される部位に挿入し、それにより（ａ）の遺伝子を破壊するための鋳型として利用される）；（ｃ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子の１つ以上をコードする遺伝子内又はその近傍の部位を標的化する第２の部位特異的ヌクレアーゼ；並びに（ｄ）（ｉｉｉ）（ｃ）の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、及び（ｉｖ）（ｃ）の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列に隣接する、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列（（ｄ）の免疫寛容原性因子は、免疫寛容原性因子（ｂ）と異なり、第２の部位特異的ヌクレアーゼは、（ｃ）の標的部位を切断し、及び相同組換えのプロセスを通して、（ｄ）の第２の核酸は、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を、（ｃ）の部位と部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその中に含有される部位に挿入し、それにより（ｃ）の遺伝子を破壊するための鋳型として利用される）を含む第２の核酸を細胞に送達し、それによりユニバーサルドナー細胞を作製することを含み、ユニバーサルドナー細胞は、（ｂ）の第１の核酸及び（ｄ）の第２の核酸が挿入されていない細胞と比較して増加した細胞生存を有する、方法を提供する。
別の方法、方法４２において、本開示は、生存因子がＴＸＮＩＰであり、第１の免疫寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅであり、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子がＢ２Ｍであり、及び第２の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１である、方法４１において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法４３において、本開示は、細胞が哺乳動物細胞であり、任意選択により、細胞がヒト細胞である、方法２０～４２のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法４４において、本開示は、細胞が幹細胞である、方法２０～４３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法４５において、本開示は、細胞が多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞又は造血幹細胞である、方法２０～４３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法４６において、本開示は、細胞が分化細胞又は体細胞である、方法２０～４３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法４７において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞が系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化することができる、方法２０～４３のいずれか１つにおいて提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法４８において、本開示は、系列限定前駆細胞が膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、造血前駆細胞又は神経前駆細胞である、方法４７において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法４９において、本開示は、完全に分化した体細胞が膵ベータ細胞などの内分泌性細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞又は免疫系細胞である、方法４７において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法４９Ａにおいて、本開示は、完全に分化した体細胞が心筋細胞又は免疫系細胞である、方法４７において提供されるとおりの方法を提供する。
別の組成物、組成物９０において、本開示は、方法２０～４９のいずれか１つによって作製される複数のユニバーサルドナー細胞を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物９１において、本開示は、細胞が分化を経るのに十分な時間にわたって且つ条件下で維持される、組成物９０において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物９２において、本開示は、治療を、それを必要とする対象において行う際の使用のための、組成物９０又は９１において提供されるとおりの組成物を提供する。
別の組成物、組成物９３において、本開示は、対象が、疾患を有するか、それを有することが疑われるか又はそのリスクがある、組成物９２によって提供されるとおりの組成物を提供する。
別の方法、方法５０において、本開示は、対象に組成物９０又は９１の複数のユニバーサルドナー細胞を投与することを含む方法を提供する。
別の方法、方法５１において、本開示は、治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ａ）組成物９０の複数のユニバーサルドナー細胞を、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞への分化後に得るか又は得ていることと；（ｂ）系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞を対象に投与することとを含む方法を提供する。
別の方法、方法５２において、本開示は、細胞であって、それを必要とする対象への投与のための細胞を得る方法であって、（ａ）請求項３１のユニバーサルドナー細胞を得るか又は得ていることと；（ｂ）細胞の系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞への分化に十分な時間にわたって且つ条件下でユニバーサルドナー細胞を維持することとを含む方法を提供する。
別の方法、方法５３において、本開示は、系列限定前駆細胞が膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、造血前駆細胞又は神経前駆細胞である、方法５１又は５２によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法５４において、本開示は、完全に分化した体細胞が膵ベータ細胞などの内分泌性細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞又は免疫系細胞である、方法５１又は５２によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法５４Ａにおいて、本開示は、完全に分化した体細胞が心筋細胞である、方法５１又は５２において提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法５５において、本開示は、対象が、疾患を有するか、それを有することが疑われるか又はそのリスクがあるヒトである、方法５０～５４によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法５６において、本開示は、疾患が、遺伝的に受け継がれる疾患である、方法５５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の組成物、組成物９３において、本開示は、配列番号１５～２４からなる標的配列に対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを提供する。
別の方法、方法５７において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製するためのインビトロでの方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ；（ｂ）チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座位中の標的部位を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｃ）核酸であって、（ｉ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２５から本質的になり且つ標的部位の左及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列；並びに（ｉｉｉ）配列番号３２から本質的になり且つ標的部位の右及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクター（（ｉ）は、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に隣接する）を幹細胞に送達することを含み、ＴＸＮＩＰ遺伝子座位が標的部位で切断され、且つ核酸がＴＸＮＩＰ遺伝子座位に挿入され、それによりＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊し、ユニバーサルドナー細胞を作製し、ユニバーサルドナー細胞が対照細胞と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する、方法を提供する。
別の方法、方法５７Ａにおいて、本開示は、核酸が標的部位の５０塩基対以内でＴＸＮＩＰ遺伝子座位に挿入される、方法５７によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法５８において、本開示は、対照細胞が、野生型細胞又は挿入される核酸を含まない細胞である、方法５７によって提供されるとおりの組成物を提供する。
別の方法、方法５９において、本開示は、破壊されたＴＸＮＩＰ遺伝子が、ＴＸＮＩＰの減少又は消失した発現を有する、方法５７によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法６０において、本開示は、ｇＲＮＡが、配列番号１５～２４からなる配列に対応するスペーサー配列を含む、方法５７によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法６１において、本開示は、ｇＲＮＡが、配列番号２０からなる配列に対応するスペーサー配列を含む、方法５７によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法６２において、本開示は、ベクターがプラスミドベクターである、方法５７によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法６３において、本開示は、免疫寛容原性因子がＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）である、方法５７によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法６４において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、そのシグナルペプチドを伴わずにＨＬＡ－Ｅに融合されたＢ２Ｍ膜タンパク質に融合されたＨＬＡ－Ｇ提示ペプチドに融合されたＢ２Ｍシグナルペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含む、方法６３によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法６５において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列が配列番号５５から本質的になる、方法６３によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法６６において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列が外来プロモーターに作動可能に連結される、方法６５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法６７において、本開示は、外来プロモーターがＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ又はＵＢＣプロモーターである、方法６６によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法６８において、本開示は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、方法５７によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法６９において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが少なくとも１つの核移行シグナルに連結される、方法６８によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法７０において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡが１：３のモル比で存在する、方法６９によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法７１において、本開示は、幹細胞が胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞又は造血幹細胞である、方法５７によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法７２において、本開示は、幹細胞がヒト肝細胞である、方法５７によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法７３において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製するためのインビトロでの方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ；（ｂ）チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座位中の標的部位を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｃ）核酸であって、（ｉ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）標的部位の左及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列；並びに（ｉｉｉ）標的部位の右及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクター（（ｉ）は、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に隣接し、且つベクターは、配列番号３４又は５６からなるヌクレオチド配列を含み、ＴＸＮＩＰ遺伝子座位は、標的部位で切断され、且つ核酸は、ＴＸＮＩＰ遺伝子座位に挿入され、それによりＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する）を幹細胞に送達し、ユニバーサルドナー細胞を作製することを含み、ユニバーサルドナー細胞が対照細胞と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する、方法を提供する。
別の方法、方法７３Ａにおいて、本開示は、核酸が標的部位の５０塩基対以内でＴＸＮＩＰ遺伝子座位に挿入される、方法７３によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法７４において、本開示は、対照細胞が、野生型細胞又は挿入される核酸を含まない細胞である、方法７３によって提供されるとおりの組成物を提供する。
別の方法、方法７５において、本開示は、破壊されたＴＸＮＩＰ遺伝子が、ＴＸＮＩＰの減少又は消失した発現を有する、方法７３によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法７６において、本開示は、ｇＲＮＡが、配列番号１５～２４からなる配列に対応するスペーサー配列を含む、方法７３によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法７７において、本開示は、ｇＲＮＡが、配列番号２０からなる配列に対応するスペーサー配列を含む、方法７３によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法７８において、本開示は、ベクターがプラスミドベクターである、方法７３によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法７９において、本開示は、免疫寛容原性因子がＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）である、方法７３によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法８０において、本開示は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、方法７３によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法８１において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが少なくとも１つの核移行シグナルに連結される、方法８０によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法８２において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡが１：３のモル比で存在する、方法８０によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法８３において、本開示は、幹細胞が胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞又は造血幹細胞である、方法７３によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法８４において、本開示は、幹細胞がヒト肝細胞である、方法７３によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法８５において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製するためのインビトロでの方法であって、（ａ）ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座位中の標的部位を標的化するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体；（ｂ）核酸であって、（ｉ）第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号７から本質的になり且つＢ２Ｍ遺伝子座位中の標的部位の左及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列；並びに（ｉｉｉ）配列番号１３から本質的になり且つＢ２Ｍ遺伝子座位中の標的部位の右及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含む第１のベクター（（ｉ）は、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に隣接し；Ｂ２Ｍ遺伝子座位は、標的部位で切断され、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、Ｂ２Ｍ遺伝子座位に挿入され、それによりＢ２Ｍ遺伝子を破壊する）；（ｃ）チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座位中の標的部位を標的化するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを含む第２のＲＮＰ複合体；並びに（ｄ）核酸であって、（ｉ）第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２５から本質的になり且つＴＸＮＩＰ遺伝子座位中の標的部位の左及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列；並びに（ｉｉｉ）配列番号３２から本質的になり且つＴＸＮＩＰ遺伝子座位中の標的部位の右及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含む第２のベクター（（ｉ）は、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に隣接し；ＴＸＮＩＰ遺伝子座位は、標的部位で切断され、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＴＸＮＩＰ遺伝子座位に挿入され、それによりＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する）を幹細胞に送達し、ユニバーサルドナー細胞を作製することを含み、ユニバーサルドナー細胞が対照細胞と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する、方法を提供する。
別の方法、方法８５Ａにおいて、本開示は、（ｂ）における核酸が標的部位の５０塩基対以内のＢ２Ｍ遺伝子座位に挿入され、且つ／又は（ｄ）における核酸が標的部位の５０塩基対以内のＴＸＮＩＰ遺伝子座位に挿入される、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法８６において、本開示は、対照細胞が、野生型細胞又は挿入される核酸を含まない細胞である、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法８７において、本開示は、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子が、Ｂ２Ｍの減少又は消失した発現を有し、及び破壊されたＴＸＮＩＰ遺伝子が、ＴＸＮＩＰの減少又は消失した発現を有する、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法８８において、本開示は、第１のＲＮＰ複合体のｇＲＮＡが、配列番号１～３又は３５～４４からなる配列に対応するスペーサー配列を含み、且つ第２のＲＮＰ複合体のｇＲＮＡが、配列番号１５～２４からなる配列に対応するスペーサー配列を含む、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法８９において、本開示は、第１のＲＮＰ複合体のｇＲＮＡが、配列番号２からなる配列に対応するスペーサー配列を含み、且つ第２のＲＮＰ複合体のｇＲＮＡが、配列番号２０からなる配列に対応するスペーサー配列を含む、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法９０において、本開示は、第１のベクターがプラスミドベクターであり、且つ第２のベクターがプラスミドベクターである、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法９１において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子がプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）であり、且つ第２の免疫寛容原性因子がＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）である、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法９２において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列が配列番号１１から本質的になる、方法９１によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法９３において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、そのシグナルペプチドを伴わずにＨＬＡ－Ｅに融合されたＢ２Ｍ膜タンパク質に融合されたＨＬＡ－Ｇ提示ペプチドに融合されたＢ２Ｍシグナルペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、且つＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列が配列番号５５から本質的になる、方法９１によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法９４において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列が外来プロモーターに作動可能に連結され、且つ第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列が外来プロモーターに作動可能に連結される、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法９５において、本開示は、外来プロモーターがＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ又はＵＢＣプロモーターである、方法９４によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法９６において、本開示は、第１のＲＮＰ複合体及び第２のＲＮＰ複合体の各々が、１：３のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとｇＲＮＡとのモル比を含む、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法９７において、本開示は、第１のＲＮＰ複合体及び第２のＲＮＰ複合体の各々のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法９８において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが少なくとも１つの核移行シグナルに連結される、方法９７によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法９９において、本開示は、幹細胞が胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞又は造血幹細胞である、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１００において、本開示は、幹細胞がヒト肝細胞である、方法８５によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１０１において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製するためのインビトロでの方法であって、（ａ）ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座位中の標的部位を標的化するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体；（ｂ）核酸であって、（ｉ）第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座位中の標的部位の左及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列；並びに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座位中の標的部位の右及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含む第１のベクター（（ｉ）は、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に隣接し、且つ第１のベクターは、配列番号３３からなるヌクレオチド配列を含み；Ｂ２Ｍ遺伝子座位は、標的部位で切断され、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、Ｂ２Ｍ遺伝子座位に挿入され、それによりＢ２Ｍ遺伝子を破壊する）；（ｃ）チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座位中の標的部位を標的化するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを含む第２のＲＮＰ複合体；並びに（ｄ）核酸であって、（ｉ）第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座位中の標的部位の左及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列；並びに（ｉｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座位中の標的部位の右及び５０核酸塩基内に位置するゲノム領域と配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含む第２のベクター（（ｉ）は、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に隣接し、且つ第２のベクターは、配列番号３４又は５６からなるヌクレオチド配列を含み、ＴＸＮＩＰ遺伝子座位は、標的部位で切断され、且つ第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＴＸＮＩＰ遺伝子座位に挿入され、それによりＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する）を幹細胞に送達し、ユニバーサルドナー細胞を作製することを含み、ユニバーサルドナー細胞が対照細胞と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有する、方法を提供する。
別の方法、方法１０１Ａにおいて、本開示は、（ｂ）における核酸が標的部位の５０塩基対以内のＢ２Ｍ遺伝子座位に挿入され、且つ／又は（ｄ）における核酸が標的部位の５０塩基対以内のＴＸＮＩＰ遺伝子座位に挿入される、方法１０１によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１０２において、本開示は、対照細胞が、野生型細胞又は挿入される核酸を含まない細胞である、方法１０１によって提供されるとおりの組成物を提供する。
別の方法、方法１０３において、本開示は、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子が、Ｂ２Ｍの減少又は消失した発現を有し、及び破壊されたＴＸＮＩＰ遺伝子が、ＴＸＮＩＰの減少又は消失した発現を有する、方法１０によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１０４において、本開示は、第１のＲＮＰ複合体のｇＲＮＡが、配列番号１～３又は３５～４４からなる配列に対応するスペーサー配列を含み、且つ第２のＲＮＰ複合体のｇＲＮＡが、配列番号１５～２４からなる配列に対応するスペーサー配列を含む、方法１０１によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１０５において、本開示は、第１のＲＮＰ複合体のｇＲＮＡが、配列番号２からなる配列に対応するスペーサー配列を含み、且つ第２のＲＮＰ複合体のｇＲＮＡが、配列番号２０からなる配列に対応するスペーサー配列を含む、方法１０１によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１０６において、本開示は、第１のベクターがプラスミドベクターであり、且つ第２のベクターがプラスミドベクターである、方法１０１によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１０７において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子がプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）であり、且つ第２の免疫寛容原性因子がＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）である、方法１０１によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１０８において、本開示は、第１のＲＮＰ複合体及び第２のＲＮＰ複合体の各々が、１：３のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとｇＲＮＡとのモル比を含む、方法１０１によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１０９において、本開示は、第１のＲＮＰ複合体及び第２のＲＮＰ複合体の各々のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、方法１０１によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１１０において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが少なくとも１つの核移行シグナルに連結される、方法１０９によって提供されるとおりの方法を提供する。
別の方法、方法１１１において、本開示は、幹細胞が胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞又は造血幹細胞である、方法１０１によって提供されるとおりの組成物を提供する。
別の方法、方法１１２において、本開示は、幹細胞がヒト肝細胞である、方法１０１によって提供されるとおりの方法を提供する。
第１のプロセス、プロセス１において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製するためのプロセスであって、（ａ）プログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）をコードするヌクレオチド配列を、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする遺伝子内又はその近傍に挿入することによって幹細胞を改変し、それによりＰＤ－Ｌ１陽性細胞を作製することと；（ｂ）ＰＤ－Ｌ１陽性細胞を濃縮することと；（ｃ）ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列を、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）をコードする遺伝子内又はその近傍に挿入することによって（ｂ）からのＰＤ－Ｌ１陽性細胞を改変し、それによりＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ二重陽性細胞を作製することと；（ｄ）ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ二重陽性細胞を濃縮することと；（ｅ）ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ二重陽性細胞を選択するために単一細胞ソーティングすることと；（ｆ）（ｅ）からの細胞をユニバーサルドナー細胞として特徴付けることと；（ｇ）長期間の保管のためにユニバーサルドナー細胞を凍結させることとを含むプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２において、本開示は、（ａ）での改変が、（１）Ｂ２Ｍ遺伝子座位中の標的部位を標的化するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、並びに（２）核酸であって、（ｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座位中の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座位中の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列を含む核酸を含む第１のベクター（Ｂ２Ｍ遺伝子座位は、標的部位で切断され、ＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、Ｂ２Ｍ遺伝子座位に挿入され、それによりＢ２Ｍ遺伝子を破壊する）を幹細胞に送達することを含む、プロセス１において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２Ａにおいて、本開示は、核酸が標的部位の５０塩基対以内のＢ２Ｍ遺伝子座位に挿入される、プロセス２によって提供されるとおりの方法を提供する。
別のプロセス、プロセス３において、本開示は、第１のＲＮＰ複合体のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼであり、且つ第１のＲＮＰ複合体のｇＲＮＡが、配列番号２からなる標的配列に対応するスペーサー配列を含む、プロセス２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが少なくとも１つの核移行シグナルに連結される、プロセス３において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス５において、本開示は、第１のＲＮＰが、３：１のｇＲＮＡ：ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのモル比を含む、プロセス２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス６において、本開示は、（ａ）（２）（ｉ）のヌクレオチド配列が配列番号７から本質的になり、且つ（ａ）（２）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が配列番号１３から本質的になる、プロセス２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス７において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列が配列番号１１から本質的になる、プロセス２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス８において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列がＣＡＧプロモーターに作動可能に連結される、プロセス２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス９において、本開示は、第１のベクターがプラスミドベクターであり、且つ配列番号３３からなるヌクレオチド配列を含む、プロセス２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス１０において、本開示は、（ａ）（１）及び（ａ）（２）の送達がエレクトロポレーションを含む、プロセス２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス１１において、本開示は、（ｂ）でのＰＤ－Ｌ１陽性細胞の濃縮が磁気支援細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）、単一細胞クローニング、前記ＰＤ－Ｌ１陽性細胞を増殖させること又はこれらの組み合わせを含む、プロセス１において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス１２において、本開示は、（ｃ）での改変が、（１）ＴＸＮＩＰ遺伝子座位中の標的部位を標的化するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを含む第２のＲＮＰ複合体、並びに（２）核酸であって、（ｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座位中の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座位中の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列を含む核酸を含む第２のベクター（ＴＸＮＩＰ遺伝子座位は、標的部位で切断され、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＴＸＮＩＰ遺伝子座位に挿入され、それによりＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する）をＰＤ－Ｌ１陽性細胞に送達することを含む、プロセス１において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス１２Ａにおいて、本開示は、核酸が標的部位の５０塩基対以内のＴＸＮＩＰ遺伝子座位に挿入される、プロセス１２によって提供されるとおりの方法を提供する。
別のプロセス、プロセス１３において、本開示は、第２のＲＮＰ複合体のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼであり、且つ第２のＲＮＰ複合体のｇＲＮＡが、配列番号２０からなる標的配列に対応するスペーサー配列を含む、プロセス１２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス１４において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが少なくとも１つの核移行シグナルに連結される、プロセス１３において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス１５において、本開示は、第２のＲＮＰが、３：１のｇＲＮＡ：ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのモル比を含む、プロセス１２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス１６において、本開示は、（ｃ）（２）（ｉ）のヌクレオチド配列が配列番号２５から本質的になり、且つ（ｃ）（２）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が配列番号３２から本質的になる、プロセス１２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス１７において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、そのシグナルペプチドを伴わずにＨＬＡ－Ｅに融合されたＢ２Ｍ膜タンパク質に融合されたＨＬＡ－Ｇ提示ペプチドに融合されたＢ２Ｍシグナルペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含む、プロセス１２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス１８において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列が配列番号５５から本質的になる、プロセス１７において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス１９において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列がＣＡＧプロモーターに作動可能に連結される、プロセス１２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２０において、本開示は、第２のベクターがプラスミドベクターであり、且つ配列番号３４又は５６からなるヌクレオチド配列を含む、プロセス１２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２１において、本開示は、（ｃ）（１）及び（ｃ）（２）の送達がエレクトロポレーションを含む、プロセス１２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２２において、本開示は、（ｄ）でのＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ二重陽性細胞の濃縮が磁気支援細胞ソーティング、単一細胞クローニング、前記ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ二重陽性細胞を増殖させること又はこれらの組み合わせを含む、プロセス請求項１において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２３において、本開示は、（ｅ）での単一細胞ソーティングが蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、単一細胞クローニング、前記単一細胞ソーティングされた細胞を増殖させること又はこれらの組み合わせを含む、プロセス１において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２４において、本開示は、（ｆ）での特徴付けが接合状態及び／又はインデルプロファイルについてのＤＮＡ分析を含む、プロセス１において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２５において、本開示は、（ｆ）での特徴付けが形態、生存能、核型分析、内毒素レベル、マイコプラズマレベル、オン／オフターゲット分析、ランダムベクター挿入、残留Ｃａｓ９、残留ベクター、多能性状態、分化能又はこれらの組み合わせについての細胞分析を含む、プロセス１において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２６において、本開示は、（ｆ）での特徴付け前に凍結させることをさらに含む、プロセス１において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２７において、本開示は、（ａ）において、作製されたＰＤ－Ｌ１陽性細胞を増殖させること、（ｃ）において、作製されたＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ二重陽性細胞を増殖させること、（ｅ）において、選択されたＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ二重陽性細胞を増殖させること又はこれらの組み合わせをさらに含む、プロセス１において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２８において、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製するためのプロセスであって、（ａ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩの構成要素若しくは転写調節因子をコードする遺伝子内又はその近傍において、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を挿入することによって幹細胞を改変し、それにより第１の免疫寛容原性因子陽性細胞を作製することと；（ｂ）第１の免疫寛容原性因子陽性細胞を濃縮することと；（ｃ）生存因子をコードする遺伝子内又はその近傍において、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を挿入することによって（ｂ）からの第１の免疫寛容原性因子陽性細胞を改変し、それにより第１の免疫寛容原性因子陽性／第２の免疫寛容原性因子陽性細胞を作製することと；（ｄ）第１の免疫寛容原性因子陽性／第２の免疫寛容原性因子陽性細胞を濃縮することと；（ｅ）第１の免疫寛容原性因子陽性／第２の免疫寛容原性陽性細胞を選択するために単一細胞ソーティングすることと；（ｆ）（ｅ）からの細胞をユニバーサルドナー細胞として特徴付けることと；（ｇ）長期間の保管のためにユニバーサルドナー細胞を凍結させることとを含むプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス２９において、本開示は、（ｂ）での第１の免疫寛容原性因子陽性細胞の濃縮が磁気支援細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）、単一細胞クローニング、前記第１の免疫寛容原性因子陽性細胞を増殖させること又はこれらの組み合わせを含む、プロセス２８において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス３０において、本開示は、（ｄ）での第１の免疫寛容原性因子陽性／第２の免疫寛容原性因子陽性細胞の濃縮が磁気支援細胞ソーティング、単一細胞クローニング、前記第１の免疫寛容原性因子陽性／第２の免疫寛容原性因子陽性細胞を増殖させること又はこれらの組み合わせを含む、プロセス２８又は２９において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス３１において、本開示は、（ａ）において作製された第１の免疫寛容原性因子陽性細胞を増殖させること、（ｃ）において作製された第１の免疫寛容原性因子陽性／第２の免疫寛容原性因子陽性細胞を増殖させること、（ｅ）において選択された第１の免疫寛容原性因子陽性／第２の免疫寛容原性因子陽性細胞を増殖させること又はこれらの組み合わせをさらに含む、プロセス２８～３０のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス３２において、本開示は、（ａ）での改変が、（１）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位中の標的部位を標的化する第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、並びに（２）第１の核酸であって、（ｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位中の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、（ｉｉ）第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位中の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列を含む第１の核酸を含む第１のベクターを幹細胞に送達することを含み、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位が標的部位で切断され、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸が、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位に挿入され、それによりＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子を破壊する、プロセス２８～３１のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス３２Ａにおいて、本開示は、核酸が、標的部位の５０塩基対以内のＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位に挿入される、プロセス３２によって提供されるとおりの方法を提供する。
別のプロセス、プロセス３３において、本開示は、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び第１のｇＲＮＡが第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、プロセス３２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス３４において、本開示は、（ａ）での改変が、（１）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位中の標的部位を標的化する第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、並びに（２）第１の核酸であって、（ｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位中の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、（ｉｉ）第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位中の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列を含む第１の核酸を含む第１のベクターを幹細胞に送達することを含み、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位が標的部位で切断され、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸が、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位に挿入され、それによりＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子を破壊する、プロセス２８～３３のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス３４Ａにおいて、本開示は、核酸が、標的部位の５０塩基対以内のＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子座位に挿入される、プロセス３４によって提供されるとおりの方法を提供する。
別のプロセス、プロセス３５において、本開示は、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子がＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ又はＲＦＸＡＮＫである、プロセス２８～３４のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス３６において、本開示は、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子遺伝子がＢ２Ｍである、プロセス２８～３５のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス３７において、本開示は、（ａ）（２）（ｉ）のヌクレオチド配列が配列番号７から本質的になり、且つ（ａ）（２）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が配列番号１３から本質的になる、プロセス３６において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス３８において、本開示は、第１のｇＲＮＡが、配列番号２からなる標的配列に対応するスペーサー配列を含む、プロセス３６又は３７において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス３９において、本開示は、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、プロセス３２～３８のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４０において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが少なくとも１つの核移行シグナルに連結される、プロセス３９において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４１において、本開示は、第１のＲＮＰが、３：１の第１のｇＲＮＡ：第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのモル比を含む、プロセス３２～４０のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４２において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４又はＣＤ４７である、プロセス２８～４１のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４３において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列が外来プロモーターに作動可能に連結される、プロセス２８～４２のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４４において、本開示は、外来プロモーターがＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ又はＵＢＣプロモーターである、プロセス４３において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４５において、本開示は、第１の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１である、プロセス２８～４４のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４６において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列が配列番号１１から本質的になる、プロセス４５において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４７において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列がＣＡＧプロモーターに作動可能に連結される、プロセス４６において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４８において、本開示は、第１のベクターが、配列番号３３からなるヌクレオチド配列を含む、プロセス４５～４７のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４９において、本開示は、（ｃ）での改変が、（１）生存因子遺伝子座位中の標的部位を標的化する第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、並びに（２）第２の核酸であって、（ｉ）生存因子遺伝子座位中の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、（ｉｉ）第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）生存因子遺伝子座位中の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む第２のベクター（生存因子遺伝子座位は、標的部位で切断され、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸は、生存因子遺伝子座位に挿入され、それにより生存因子遺伝子を破壊する）を幹細胞に送達することを含む、プロセス２８～４８のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス４９Ａにおいて、本開示は、核酸が標的部位の５０塩基対以内の生存因子遺伝子座位に挿入される、プロセス４９によって提供されるとおりの方法を提供する。
別のプロセス、プロセス５０において、本開示は、第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び第２のｇＲＮＡが第２のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、プロセス４９において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス５１において、本開示は、（ｃ）での改変が、（１）生存因子遺伝子座位中の標的部位を標的化する第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第２のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、並びに（２）第２の核酸であって、（ｉ）生存因子遺伝子座位中の標的部位の左に位置する領域と相同なヌクレオチド配列、（ｉｉ）第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）第２の生存因子遺伝子座位中の標的部位の右に位置する領域と相同なヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む第２のベクター（生存因子遺伝子座位は、標的部位で切断され、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸は、生存因子遺伝子座位に挿入され、それにより生存因子遺伝子を破壊する）を第１の免疫寛容原性因子陽性細胞に送達することを含む、プロセス２８～４８のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス５１Ａにおいて、本開示は、核酸が標的部位の５０塩基対以内の生存因子遺伝子座位に挿入される、プロセス５１によって提供されるとおりの方法を提供する。
別のプロセス、プロセス５２において、本開示は、生存遺伝子がＴＸＮＩＰ、ＺＮＦ１４３、ＦＯＸＯ１、ＪＮＫ又はＭＡＮＦである、プロセス２８～５１のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス５３において、本開示は、生存遺伝子がＴＸＮＩＰである、プロセス５２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス５４において、本開示は、第２のｇＲＮＡが、配列番号２０からなる標的配列に対応するスペーサー配列を含む、プロセス５３において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス５５において、本開示は、（ｃ）（２）（ｉ）のヌクレオチド配列が配列番号２５から本質的になり、且つ（ｃ）（２）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が配列番号３２から本質的になる、プロセス５２又は５３において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス５６において、本開示は、第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、プロセス４９～５５のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス５７において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが少なくとも１つの核移行シグナルに連結される、プロセス５６において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス５８において、本開示は、第２のＲＮＰが、３：１の第２のｇＲＮＡ：第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのモル比を含む、プロセス４９～５７のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス５９において、本開示は、第２の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４又はＣＤ４７である、プロセス４９～５８のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス６０において、本開示は、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列が外来プロモーターに作動可能に連結される、プロセス２８～５９のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス６１において、本開示は、外来プロモーターがＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ又はＵＢＣプロモーターである、プロセス６０において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス６２において、本開示は、第２の免疫寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅである、プロセス２８～６１のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス６３において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、そのシグナルペプチドを伴わずにＨＬＡ－Ｅに融合されたＢ２Ｍ膜タンパク質に融合されたＨＬＡ－Ｇ提示ペプチドに融合されたＢ２Ｍシグナルペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含む、プロセス６２において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス６４において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列が配列番号５５から本質的になる、プロセス６３において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス６５において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列がＣＡＧプロモーターに作動可能に連結される、プロセス６３又は６４において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス６６において、本開示は、第２のベクターが、配列番号３４又は５６からなるヌクレオチド配列を含む、プロセス６２～６５のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス６７において、本開示は、（ｅ）での単一細胞ソーティングが蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、単一細胞クローニング、前記単一細胞ソーティングされた細胞を増殖させること又はこれらの組み合わせを含む、プロセス２８～６６のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス６８において、本開示は、（ｆ）での特徴付けが接合状態及び／又はインデルプロファイルについてのＤＮＡ分析を含む、プロセス２８～６７のいずれか１つにおいて提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス６９において、本開示は、（ｆ）での特徴付けが形態、生存能、核型分析、内毒素レベル、マイコプラズマレベル、オン／オフターゲット分析、ランダムベクター挿入、残留Ｃａｓ９、残留ベクター、多能性状態、分化能又はこれらの組み合わせについての細胞分析を含む、プロセス２８～６８において提供されるとおりのプロセスを提供する。
別のプロセス、プロセス７０において、本開示は、（ｆ）での特徴付け前に凍結させることをさらに含む、プロセス２８～６９において提供されるとおりのプロセスを提供する。
下の実施例は、本開示による特定のユニバーサルドナー細胞の作製及び特徴付けを記載する。
実施例１：細胞維持及び増殖
ｈＥＳＣ／ｈｉＰＳＣの維持。ヒト胚性幹細胞株ＣｙＴ４９（専売のｈＥＳ細胞株、ＶｉａＣｙｔｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の細胞は、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４において記載されるとおりに維持され、培養され、継代され、増殖され、且つ蒔かれた。ＣｙＴ４９細胞は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ０７９２０又は等価物）を使用して解離された。
ＴＣ１１３３細胞株（Ｌｏｎｚａ）などのヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧ（ＢｉｏＬａｍｉｎａ Ｃａｔ＃ＣＴ５２１）でコーティングされた組織培養プレート上でＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ３３４９４０１）中において維持された。プレートは、ＤＰＢＳ中のＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ、カルシウム、マグネシウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１４０４０１３３）の１：１０又は１：２０希釈物により３７℃で２時間予めコーティングされた。細胞はＳｔｅｍＦｌｅｘ培地を毎日供給された。細胞の継代に関して、ＣｙＴ４９のためのものと同じ細胞密度が使用された。単一細胞として細胞を播種するために、細胞は、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮでコーティングされたプレート上でＳｔｅｍＦｌｅｘ中において１％ ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）補給物（１００×）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃Ａ２６４４５０１）とともに播種された。
ｈＰＳＣの単一細胞クローニング。単一細胞クローニングのために、ｈＰＳＣ（ｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣ）は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）による解離の３～４時間前にＲｅｖｉｔａｃｅｌｌ（１×Ｒｅｖｉｔａｃｅｌｌの最終濃度）とともにＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅを供給された。解離後、細胞は、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮでコーティングされた９６ウェル組織培養プレートの１ウェル当たり単一細胞としてソーティングされた。ＷＯＬＦ ＦＡＣＳソーター（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、単一細胞をウェルにソーティングした。プレートは、Ｒｅｖｉｔａｃｅｌｌとともに１００～２００μＬのＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅで予め充填された。細胞播種の３日後、細胞は、新鮮なＳｔｅｍＦｌｅｘを供給され、１００～２００μＬの培地が１日おきに供給され続けた。増殖の１０日後、細胞は、１２～１４日目までＳｔｅｍＦｌｅｘを毎日供給された。この時点で、プレートはＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で解離され、回収された細胞懸濁液は、１：２に分割され、半分は維持のために新しい９６ウェルプレートに入れられ、半分はＤＮＡ抽出溶液ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に入れられた。ＤＮＡ抽出後、ＰＣＲを実施して、標的化されたＤＮＡ座位での所望の遺伝子編集の有無を評価した。サンガー配列決定を使用して所望の編集を検証した。
単一細胞に由来するｈＰＳＣクローンの増殖。ＣｙＴ４９（ＶｉａＣｙｔｅ）に関して、順調に標的化されたクローンは、純粋な１０％ ＸＦ ＫＳＲ Ａ１０Ｈ１０培地を含む２４ウェルプレートであるがＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮでコーティングされたプレート上に継代された。２４ウェルの段階後、ＣｙＴ４９クローンは、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４において記載されるとおりに継代された。
ｈｉＰＳＣ（ＴＣ１１３３）に関して、細胞は、クローニング及び継代段階でのＲｅｖｉｔａｃｅｌｌを含むＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮでコーティングされたプレート上での定期的な維持プロセス全体にわたってＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ中で維持された。
実施例２：Ｂ２Ｍノックアウト（ＫＯ）ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の作製
ｈＰＳＣ中のＢ２ＭのためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）選択。３つのＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍコード配列のエクソン１を標的化するために設計された。これらのｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して配列相同性予測に基づいて予測される低いオフターゲットスコアを有した。ｇＲＮＡの標的配列は、表１において示される。ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列を含む。
Figure 2022547053000002
ｈＰＳＣにおけるそれらの切断効率を評価するために、ＣｙＴ４９細胞（ＶｉａＣｙｔｅ専売のｈＥＳ細胞株）は、１２５ｐｍｏｌ Ｃａｓ９及び３７５ｐｍｏｌ ｇＲＮＡの絶対値を有する３：１（ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９）のモル比のＣａｓ９タンパク質（Ｂｉｏｍａｙ）及びガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）（ｇＲＮＡ配列については表３を参照のこと）のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）混合物とともにＮｅｏｎエレクトロポレーター（Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ＭＰＫ５０００）を使用して電気穿孔された。ＲＮＰ複合体を形成するために、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９を、Ｒ－緩衝液（Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム １００μＬキット ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ＭＰＫ１００９６）を含む１つの容器中で合わせて、２５μＬの合計体積にし、室温で１５分間インキュベートした。細胞は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を使用して解離され、続いてＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１１３２００３３）中で再懸濁され、ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して計数され、遠心分離された。合計で１×１０6個の細胞がＲＮＰ複合体とともに再懸濁され、Ｒ－緩衝液が加えられて、１２５μＬの合計体積になった。次に、この混合物は、１１００Ｖにおいて３０秒間２パルスで電気穿孔された。エレクトロポレーション後、細胞は、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌを含むＳｔｅｍＦｌｅｘ培地で充填されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにピペットで移された。次に、この細胞懸濁液は、１：２０の希釈度のＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧで予めコーティングされた組織培養ディッシュに播種された。細胞は、正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ ＣＯ2）中で４８時間培養された。４８時間後、ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ；Ｃａｔ＃ＱＥ０９０５０）を使用して細胞から収集された。
標的Ｂ２Ｍ配列のためのＰＣＲが実施され、得られた増幅ＤＮＡは、ＴＩＤＥ分析によって切断効率について評価された。関連している領域のためのＰＣＲは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃１２５３２０１７６及びＣａｔ＃１１４９５０１７）を使用して実施された。ＰＣＲプライマーの配列は表２に示され；サイクル条件は表３において提供される。
Figure 2022547053000003
Figure 2022547053000004
得られた増幅産物をＰＣＲ精製及びサンガー配列決定にかけた。サンガー配列決定の結果は、ガイド配列とともにＴｓｕｎａｍｉソフトウェアに入力された。インデルのパーセンテージ及び同一性は、ソフトウェアによって計算された。次に、特定のｇＲＮＡがｈＰＳＣにおけるそれらのインデル頻度に基づいて選択された。図１は、Ｂ２Ｍ－１、Ｂ２Ｍ－２及びＢ２Ｍ－３ ｇＲＮＡの切断効率を示す。
選択されたｇＲＮＡのオフターゲットは、配列類似性が予測される部位のハイブリッド捕捉分析を使用して幹細胞に由来するＤＮＡにおいて評価された。Ｂ２Ｍ－２及びＢ２Ｍ－３ガイドは、検出可能なオフターゲット作用を示さなかった。Ｂ２Ｍ－２ ｇＲＮＡは、その高いオンターゲット活性及び検出不可能なオフターゲット活性に起因してさらなるクローン作製について選択された。
Ｂ２Ｍ ＫＯ ｈＰＳＣクローン作製及び特徴付け。Ｂ２Ｍ－２ ｇＲＮＡを使用して、ＣｙＴ４９ ｈＥＳＣ（ＶｉａＣｙｔｅ）は電気穿孔され、エレクトロポレーションの３日後、ＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ソーター（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用してＳｔｅｍＦｌｅｘ及びＲｅｖｉｔａｃｅｌｌを含むＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレートに単一細胞ソーティングされた。播種された単一細胞を、コロニーが単一細胞として再播種されるほど大きくなるまで、１日おきに培地を交換しながら正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ2）中で増殖させた。コンフルエントになったとき、試料を、維持及びゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。
クローンのＢ２Ｍ ＫＯ状態は、ＰＣＲ及びサンガー配列決定を介して確認された。標的Ｂ２Ｍ領域の得られたＤＮＡ配列は、インデル同一性及び接合状態を決定するためにＳｎａｐｇｅｎｅソフトウェアにおいて整列された。所望の編集を有するクローンが増殖され、Ｂ２Ｍ発現についてのフローサイトメトリー評価を介してさらに検証された（利用される抗体のリストについては表４を参照のこと）。クローンは、インターフェロン－ガンマ処理の有無で評価された（２５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２８５－ＩＦ）。図２Ａは、野生型細胞におけるＢ２Ｍ発現を示し、図２Ｂは、Ｂ２Ｍ ＫＯ細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。クローンの核型状態は、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓサービス（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を介して評価され、正常な核型が報告された。
Figure 2022547053000005
クローンは、多能性マーカーＯＣＴ４及びＳＯＸ２のための細胞内フローサイトメトリーにより多能性を保持することが確認された。確認された多能性クローンは、以前に確立された方法（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４）を使用して膵臓内分泌性前駆細胞に分化された。
実施例３：Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ノックイン（ＫＩ）ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の作製
Ｂ２Ｍ－ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ戦略の設計。ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）をＢ２Ｍ座位に挿入するためのプラスミド設計は、Ｂ２Ｍの開始コドンが、相同組換え修復（ＨＤＲ）を経た後に除去されて、ＰＤ－Ｌ１を挿入して、部分的なＢ２Ｍ発現の機会を無効にするようになされた。図３は、プラスミドの模式図を示し、表５はその中の要素及び位置を特定する。ドナープラスミドは、エクソン１の周りのＢ２Ｍ座位と同一な配列を有する８００塩基対ホモロジーアームに隣接するＰＤ－Ｌ１のＣＡＧＧＳプロモーター駆動ｃＤＮＡを含有した。プラスミドの完全な配列は、配列番号３３を含む。
Figure 2022547053000006
Ｂ２Ｍ－２ ｇＲＮＡは、標的化されたＢ２Ｍ座位でのＰＤ－Ｌ１導入遺伝子の挿入を容易にするために使用された。ＰＤ－Ｌ１ドナープラスミドは、Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質で構成されるＲＮＰ複合体とともに導入された。１００万個のＣｙＴ４９細胞（ＶｉａＣｙｔｅ）当たり、４μｇのプラスミドＤＮＡがＲＮＰとともに送達された。エレクトロポレーションは、実施例２において記載されるとおりに実施された。エレクトロポレーションの７日後、細胞は、ＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ソーター（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、ＰＤ－Ｌ１表面発現についてＲｅｖｉｔａｃｅｌｌとともにＳｔｅｍＦｌｅｘを含むＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレートにソーティングされた。ＦＡＣＳ－ソーティングに関して、未編集の細胞は、陰性対照として機能した。ＰＤ－Ｌ１陽性細胞は、ソーティング及び単一細胞クローニングのために選択された。
ＰＤ－Ｌ１表面発現を検出するために、抗ＰＤ－Ｌ１蛍光抗体が使用された（表４を参照のこと）。播種された単一細胞を、コロニーが単一細胞として再播種されるほど大きくなるまで、１日おきに培地を交換しながら正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ2）中で増殖させた。コンフルエントになったとき、試料を、維持及びゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。
正確に標的化されたクローンは、プラスミドのホモロジーアームの外側からＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ挿入物までの領域を増幅するプライマーを使用して、ＰＤ－Ｌ１ノックイン（ＫＩ）挿入物のためにＫＩ組込みＤＮＡのみの増幅を可能にするＰＣＲを介して同定された。オンターゲット挿入物は、ＰＣＲによって接合状態について試験されて、ＫＩがヘテロ接合性又はホモ接合性様式において生じたかどうかが評価された。ヘテロ接合性クローンが同定された場合、ＫＩ陰性アレルをサンガー配列決定に送って、それが非ＫＩアレルにおいてＢ２Ｍ－破壊インデルを含有したことを検証した。完全なＢ２Ｍ破壊を伴う正確なＫＩクローン（ＫＩ挿入物又はインデル形成のいずれかによる）は、３０００万個の細胞の集団サイズに達するまで、増加性の組織培養形式において増殖された。およそ１０個のクローンがこの様式で増殖され、細胞内フローサイトメトリーを介してＯＣＴ４及びＳＯＸ２について試験することによって多能性であると確認された（図４）。次に、上の試験を通過したクローンは、下記のとおりの核型分析（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）についてさらに試験された。さらに、クローンは、下記のとおりの確立されたプロトコル（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４）を介して膵臓内胚葉前駆細胞（ＰＥＣ）に分化するそれらの能力について試験された。Ｂ２Ｍの消失は、フローサイトメトリーを介してインターフェロン－ガンマ処理（２５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２８５－ＩＦ）の有無におけるＢ２Ｍの発現の欠如によってさらに確認された。図５Ａ及び５Ｂは、それぞれ野生型及びＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現を示す。
実施例４：編集されたクローンの核型分析
編集された胚性幹（ＥＳ）細胞のＧ－バンド核型分析。１００万個の編集されたＥＳ細胞は、培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ ＸｅｎｏフリーＫＳＲと１０ｎｇ／ｍＬアクチビン及び１０ｎｇ／ｍＬヘレグリン）を含むＴ－２５培養フラスコ中に継代された。一晩培養した後、３つのＴ２５培養フラスコは、核型分析；染色体１、１２、１７、２０のためのＦＩＳＨ分析；及び標準的な８×６０Ｋアレイによるアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）分析のために細胞遺伝学研究室（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）に送られた。非切断ガイド（「ＮＣＧ」）、Ｂ２Ｍ ＫＯクローン及びＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩクローン（「Ｖ１－Ａ」）とともに電気穿孔された、選択された細胞のＧ－バンディング結果は、表６において示される。
Figure 2022547053000007
実施例５：編集されたヒト胚性幹細胞の膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）への分化
編集されたヒト胚性幹細胞（ＥＳ）の維持。様々な継代数（Ｐ３８～４２）の編集されたヒト胚性幹細胞は、ｈＥＳＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ ＫＳＲ＋ １０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ及び１０ｎｇ／ｍＬヘレグリン）及び最終１０％のヒトＡＢ血清とともに、４日間の継代のために３３，０００細胞／ｃｍ2又は３日間の継代のために５０，０００細胞／ｃｍ2で播種された。
ＰＥＣ分化のための編集されたヒト胚性幹細胞の凝集。編集されたＥＳは、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で単一細胞に解離され、続いて遠心分離され、１ｍｌ当たり１００万個の細胞でＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の２％ ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｃａｔ＃Ａ１０００７０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）中において再懸濁され、合計で３５０～４００万個の細胞が、８ＲＰＭ±０．５ＲＰＭの回転速度により１つの８５０ｃｍ2のローターボトル（Ｃａｔ＃４３１１９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中に分化前の１８～２０時間播種された。編集されたヒト胚性幹細胞に由来するＥＳ凝集物は、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４において記載されるとおりにローターボトルを使用して膵臓系列に分化した。
実施例６：分化した膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）の特徴付け
段階１（ＤＥ）のＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７並びにＰＥＣ段階のＣＨＧＡ、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のためのフローサイトメトリー。ｈＥＳＣに由来する段階１の凝集物又はｈＥＳＣに由来する膵性凝集物を、ＰＢＳで洗浄し、続いてＡＣＣＵＭＡＸ（商標）（カタログ＃Ａ７０８９、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を使用して３７℃で酵素的に解離して、単一細胞懸濁液にした。ＭＡＣＳ分離緩衝液（Ｃａｔ＃１３０－０９１－２２１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｈｉｎｅ－Ｗｅｓｔｐｈａｌｉａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を加え、懸濁液を、４０μｍフィルターに通過させ、ペレットにした。細胞内マーカーの染色のために、細胞を、４％（ｗｔ／ｖ）パラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ3）中で洗浄し、続いて細胞を、氷上でＰｅｒｍ緩衝液（ＰＢＳ、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｃａｔ＃Ａ１６０４６、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ＭＡ）、５％（ｖ／ｖ）正常ロバ血清、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ3）により３０分間透過処理し、続いて洗浄緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗｔ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ3）で洗浄した。細胞を、ブロック緩衝液（ＰＢＳ、０．１％（ｖ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５％（ｖ／ｖ）正常ロバ血清、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ3）で希釈された一次抗体（表７）と４℃で一晩インキュベートした。細胞を、ＩＣ緩衝液中で洗浄し、続いて適切な二次抗体と４℃で６０分間インキュベートした。細胞をＩＣ緩衝液中で洗浄し、続いてＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄した。フローサイトメトリーデータは、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ）により得られた。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して分析された。無処置の細胞は、前方（低角度）及び側方（直交性、９０°）光散乱に基づいて同定された。バックグラウンドは、抗体対照及び未分化細胞を使用して推定された。図面において、代表的なフローサイトメトリープロットは、亜集団の１つについて示される。図面において報告される数は、無処置の細胞ゲートからの全細胞のパーセンテージを表す。
Figure 2022547053000008
ＤＥ段階では、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７二重陽性細胞の集団は、ＣｙＴ４９野生型分化細胞の全細胞の９０％を超えた。ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ及びＢ２Ｍ ＫＯ細胞は、野生型細胞と比較して同等のＤＥのパーセンテージを示した（図６及び図７）。
ＰＥＣ段階では、クロモグラニン（ＣＨＧＡ）、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のためのフローサイトメトリーが実施された。ＰＥＣ段階の不均一な集団は、膵臓前駆細胞及び初期内分泌を含む（図８）。不均一な集団の円グラフから（図９）、分化した編集細胞（ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ又はＢ２Ｍ ＫＯ）の細胞集団の分布は、野生型細胞と非常に類似していた。
ターゲットＲＮＡｓｅｑ。遺伝子発現分析のためのターゲットＲＮＡｓｅｑは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ及び１１１個の遺伝子を標的化するオリゴのカスタムパネルを使用して実施された。パネルは主に、膵臓分化中の発生段階のマーカーである遺伝子を含有した。各分化段階の最後において、１０μＬのＡＰＶ（凝集したペレットの体積）が回収され、オンカラムデオキシリボヌクレアーゼ処理を含む、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ又はＲＮｅａｓｙ ９６スピンカラムプロトコルを使用して抽出された。定量化及び品質管理は、Ｑｕｂｉｔと合わせたＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ又はＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｘｃｅｌのいずれかを使用して実施された。５０～２００ｎｇのＲＮＡは、Ｑｕｂｉｔと合わせたＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ又はＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｘｃｅｌのいずれかを使用する得られたｄｓＤＮＡライブラリーの定量化及び品質管理の前に、ｃＤＮＡ合成、カスタムオリゴプールのハイブリダイゼーション、結合オリゴの洗浄、伸長、ライゲーション、ライブラリーのＰＣＲ増幅及びライブラリーの精製からなるＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑライブラリー調製プロトコルに従って処理された。その後、ライブラリーは、４ｎＭの濃度に希釈され、プールされた後、変性、ＰｈｉＸ対照のスパイクイン及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシークエンサー上への添加の前に１０～１２ｐＭへのさらなる希釈が行われた。配列決定の実行後、最初のデータ分析は、ＢａｓｅＳｐａｃｅにより自動的に実施され、カスタムプローブの各々についての生のリードカウントを生成した。次に、各遺伝子に関して、これらのリードカウントは、１つのリードカウントを加えることにより（０による下流の除算を防ぐため）その遺伝子に対応する全てのプローブについて合計された。正規化は遺伝子ＳＦ３Ｂ２に対して実施され、リードは、通常、段階０に対する倍率変化として可視化された。データが主要な成分分析のために処理されたとき、正規化は、ＤＥｓｅｑ法を使用して実施された。
選択された遺伝子発現は、図１０において示された。ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ又はＢ２Ｍ ＫＯ細胞からのＦＯＸＡ２、ＣＨＧＡ、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の動的発現パターンは、野生型細胞と同様であった。
ＰＥＣ段階でのＢ２Ｍ及びＰＤ－Ｌ１発現の確認。ＰＥＣ段階では、分化した凝集物は、インターフェロン－ガンマ（５０ｎｇ／ｍｌ）の有無で４８時間処理された。凝集物を、ＰＢＳで洗浄し、続いてＡＣＣＵＭＡＸ（商標）（カタログ＃Ａ７０８９、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を使用して３７℃で酵素的に解離して、単一細胞懸濁液にした。ＭＡＣＳ分離緩衝液（Ｃａｔ＃１３０－０９１－２２１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｈｉｎｅ－Ｗｅｓｔｐｈａｌｉａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を加え、懸濁液を、４０μｍフィルターに通過させ、ペレットにした。表面マーカーの染色のために、解離した細胞を、ＭＡＣＳ分離緩衝液中に希釈された蛍光コンジュゲート抗体とともに２０分間インキュベートし、続いてＭＡＣＳ分離緩衝液中で洗浄した。細胞を、フロー取得のためにＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。フローサイトメトリーデータは、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーターにより得られた。図１１Ａ～１１Ｆで示されるとおり、Ｂ２Ｍ発現は、Ｂ２Ｍ ＫＯ（図１１Ｂ）又はＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ（図１１Ｃ）に由来する分化したＰＥＣにおいて検出限界未満であり、且つＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ（図１１Ｆ）に由来する分化したＰＥＣにおいて発現された。一般に、ＰＥＣの約９０％超はＰＤ－Ｌ１を発現し、細胞の同種集団を示した。多くの場合、遺伝子編集された幹細胞の分化後に経時的な導入遺伝子発現の消失がある（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１７，２５（１）：４４－５３）。
ＰＥＣ細胞の免疫表現型。ＰＥＣ段階では、分化した凝集物は、インターフェロン－ガンマ（５０ｎｇ／ｍｌ）の有無で４８時間処理された。凝集物は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ染色のために収集された。野生型又は編集された細胞（ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ及びＢ２Ｍ ＫＯ）に由来するＰＥＣ段階でＭＨＣクラスＩＩの発現はなかった（図１２Ｄ～１２Ｆ）。ＨＬＡ－ＡＢＣ（ＭＨＣクラスＩ）の発現は低く（野生型から１．３％）、それは、ＩＦＮ－γ刺激時に高度に調節された。しかしながら、ＨＬＡ－ＡＢＣは、編集された細胞（ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ／Ｂ２Ｍ ＫＯ及びＢ２Ｍ ＫＯ）においてＩＦＮ－γ刺激下でさえ発現しなかった（図１２Ａ～１２Ｃ）。
実施例７：ＴＸＮＩＰ ＫＯヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の作製
ＴＸＮＩＰのためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）選択。１０個のＴＸＮＩＰ標的化ｇＲＮＡは、ＴＸＮＩＰコード配列のエクソン１及びエクソン２を標的化するために設計された（表８）。ＰＡＭ配列は、表８に示される標的配列において太字フォントで示され、ガイド配列に対応するＤＮＡ配列は、表８に示される。これらのｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して配列相同性予測に基づいて予測される低いオフターゲットスコアを有した。
Figure 2022547053000009
ＴＸＮＩＰ ＫＯ ｈＰＳＣクローン作製及び特徴付け。ｈＰＳＣにおけるこれらのｇＲＮＡの切断効率を評価するために、ＴＣ１１３３ ｈｉＰＳＣ細胞は、１２５ｐｍｏｌのＣａｓ９及び３７５ｐｍｏｌのｇＲＮＡの絶対値を有する３：１（ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９）のモル比のＣａｓ９タンパク質（Ｂｉｏｍａｙ）及びガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）のＲＮＰ混合物とともにＮｅｏｎエレクトロポレーター（Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ＭＰＫ５０００）を使用して電気穿孔された。ＲＮＰ複合体を形成するために、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９を、Ｒ－緩衝液を含む１つの容器中で合わせて、２５μＬの合計体積にし、室温で１５分間インキュベートした。細胞は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を使用して解離され、続いてＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１１３２００３３）中で再懸濁され、ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して計数され、遠心分離された。合計で１×１０6個の細胞がＲＮＰ複合体とともに再懸濁され、Ｒ－緩衝液が加えられて、１２５μＬの合計体積になった。次に、この混合物は、パラメーター：２パルス、３０ｍｓ、１１００Ｖを使用して電気穿孔された。エレクトロポレーション後、細胞は、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌを含むＳｔｅｍＦｌｅｘ培地で充填されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにピペットで移された。次に、この細胞懸濁液は、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧで予めコーティングされた組織培養ディッシュに蒔かれた。細胞は、正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ ＣＯ2）中で４８時間培養された。４８時間後、ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔを使用して細胞から収集された。
標的ＴＸＮＩＰ配列のためのＰＣＲが実施され、得られた増幅ＤＮＡは、サンガー法により配列決定された。ＴＩＤＥ分析を使用して、Ｔｓｕｎａｍｉソフトウェアを使用するインデルパーセンテージのための出力配列決定データを分析した。図１３は、ＴＸＮＩＰ ｇＲＮＡに関する切断効率を示す。次に、ｇＲＮＡがｈＰＳＣにおけるそれらのインデル頻度に基づいて選択された。
最大の切断効率のｇＲＮＡのオフターゲットは、配列類似性が予測される部位でのハイブリッド捕捉分析を使用して幹細胞に由来するＤＮＡにおいて評価された。検出可能なオフターゲット効果を示さず、高いオンターゲット活性を示したため、ＴＸＮＩＰ ｇＲＮＡ Ｔ５によるさらなる実験が実施された。
ＴＸＮＩＰ ＫＯ ｈＰＳＣクローン作製及び特徴付け。ＴＸＮＩＰ ｇＲＮＡ Ｔ５を使用して、ＣｙＴ４９ ｈＥＳＣ（Ｖｉａｃｙｔｅ）は電気穿孔され、エレクトロポレーションの３日後、ＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ソーター（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用してＳｔｅｍＦｌｅｘ及びＲｅｖｉｔａｃｅｌｌを含むＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧ ９６ウェルプレートに単一細胞ソーティングされた。播種された単一細胞を、コロニーが単一細胞として再播種されるほど大きくなるまで、１日おきに培地を交換しながら正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ2）中で増殖させた。コンフルエントになったとき、試料を、維持及びゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。
クローンのＴＸＮＩＰ ＫＯ状態は、ＰＣＲ及びサンガー配列決定を介して確認された。標的ＴＸＮＩＰ領域の得られたＤＮＡ配列は、インデル同一性及び接合状態を決定するためにＳｎａｐｇｅｎｅソフトウェアにおいて整列された。所望の編集を有するクローンが増殖され、ＴＸＮＩＰ発現についてのフローサイトメトリー評価を介してさらに検証された。クローンの核型状態は、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓサービスを介して評価され、正常な核型が報告された（表９）。
Figure 2022547053000010
クローンは、多能性マーカーＯＣＴ４及びＳＯＸ２のための細胞内フローサイトメトリーにより多能性を保持することが確認された。確認された多能性クローンは、以前に確立された方法（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３７００４）を使用して膵臓内分泌性前駆細胞に分化された。
遺伝子発現分析のためのターゲットＲＮＡｓｅｑは、上記のとおりＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ及びオリゴのカスタムパネルを使用して実施された。選択された遺伝子発現は、図２０において示された。ＴＸＮＩＰ ＫＯ細胞からのＦＯＸＡ２、ＣＨＧＡ、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の動的発現パターンは、野生型細胞と同様であった。ＰＥＣ段階では、クロモグラニン（ＣＨＧＡ）、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のためのフローサイトメトリーも実施された。ＰＥＣ段階の不均一な集団は、３０．６％の膵臓前駆細胞（すなわちＣＨＧＡ-／ＮＫＸ６．１+／ＰＤＸ１+）を含んだ（図２１）。
実施例８：Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の作製
Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ戦略の設計。ＰＤ－Ｌ１コード配列がＢ２Ｍ座位に挿入され（それによりＢ２Ｍ遺伝子をノックアウトした）且つＨＬＡ－Ｅコード配列がＴＸＮＩＰ座位に挿入された（それによりＴＸＮＩＰ遺伝子をノックアウトした）細胞が作製された。
ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）をＢ２Ｍ座位に挿入するためのプラスミド設計は、実施例３に示された。ドナープラスミドは、エクソン１の周りのＢ２Ｍ座位と同一な配列を有する８００塩基対ホモロジーアームに隣接するＰＤ－Ｌ１のＣＡＧＧＳプロモーター駆動ｃＤＮＡを含有する。Ｂ２Ｍ－２ ｇＲＮＡは、標的化されたＢ２Ｍ座位でのＰＤ－Ｌ１導入遺伝子の挿入を容易にするために使用された。ＰＤ－Ｌ１ドナープラスミドは、Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質で構成されるＲＮＰ複合体とともに導入された。１００万個のＣｙＴ４９細胞（ＶｉａＣｙｔｅ）当たり、４μｇのプラスミドＤＮＡがＲＮＰとともに送達された。エレクトロポレーションは、実施例２において記載されるとおりに実施された。エレクトロポレーションの７日後、細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ試薬（抗マウスＩｇＧマイクロビーズＣａｔ＃１３０－０４８－４０１、ＬＳカラムＣａｔ＃１３０－０４２－４０１及びＭｉｄｉＭＡＣＳセパレーターＣａｔ＃１３０－０４２－３０２）又はＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ試薬（ＤｙｎａＭａｇ（商標）－１５マグネットＣａｔ＃１２３０１Ｄ、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）汎マウスＩｇＧキットＣａｔ＃１１５３１Ｄ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）汎マウスＩｇＧ Ｃａｔ＃１１０４２）を使用して、磁気支援細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を介してＰＤ－Ｌ１陽性細胞について濃縮された。
濃縮されたＰＤ－Ｌ１陽性集団が増殖された後、ＨＬＡ－Ｅ三量体ｃＤＮＡ導入遺伝子は、ＨＬＡ－Ｅ配列を含むドナープラスミドを使用してＣＲＩＳＰＲ誘導性ＨＤＲを介してＴＸＮＩＰゲノム座位に挿入された。ＨＬＡ－Ｅ三量体ｃＤＮＡは、そのシグナルペプチドを伴わずにＨＬＡ－Ｅタンパク質に融合されたＢ２Ｍ膜タンパク質に融合されたＨＬＡ－Ｇ提示ペプチドに融合されたＢ２Ｍシグナルペプチドで構成された。この三量体設計は以前に公開されている（Ｇｏｒｎａｌｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５（８）：７６５－７７２）。ＨＬＡ－Ｅ三量体コード配列（リンカーを含む）は、配列番号５５（すなわち配列番号２６～３１）である。ＨＬＡ－Ｅ送達のためのドナープラスミドは、エクソン１（図１４、表１０及び表１１）の周りのＴＸＮＩＰ座位と同一な配列を有する８００塩基対ホモロジーアームに隣接するＨＬＡ－Ｅ三量体のＣＡＧＧＳプロモーター駆動発現を含有する。いくつかの実施形態では、ドナープラスミドは、配列番号３４又は５６を含む。
Figure 2022547053000011
Figure 2022547053000012
ＴＸＮＩＰ－Ｔ５ ｇＲＮＡは、標的化されたＴＸＮＩＰ座位でのＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子の挿入を容易にするために使用された。ＨＬＡ－Ｅドナープラスミドは、ＴＸＮＩＰ－Ｔ５ ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質で構成されるＲＮＰ複合体とともに導入された。１００万個のＰＤ－Ｌ１＋細胞当たり、４μｇのＨＬＡ－ＥドナープラスミドＤＮＡ（配列番号５６）がＲＮＰとともに送達され。代わりに、ＨＬＡ－ＥドナープラスミドＤＮＡ（配列番号３４）が使用され得る。エレクトロポレーションは、実施例２において記載されるとおりに実施された。エレクトロポレーションの７日後、細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ試薬又はＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ試薬を使用してＭＡＣＳを介してＨＬＡ－Ｅ陽性細胞について濃縮された。ＨＬＡ－Ｅ濃縮後、細胞は、ＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ソーター（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、ＳｔｅｍＦｌｅｘ及びＲｅｖｉｔａｃｅｌｌを含むＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレートに単一細胞ソーティングされた。播種された単一細胞を、コロニーが単一細胞として再播種されるほど大きくなるまで、１日おきに培地を交換しながら正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ2）中で増殖させた。コンフルエントになったとき、試料を、維持及びゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＨＬＡ－Ｅ抗体（表４）は、ＭＡＣＳ濃縮並びにＨＬＡ－Ｅ及びＰＤ－Ｌ１二重陽性細胞のためのゲーティング設定を有する９６ウェルプレートにＦＡＣＳソーティングのために使用された。ＦＡＣＳ－ソーティングに関して、未編集の細胞は、陰性対照として機能した。
正確に標的化されたクローンは、プラスミドのホモロジーアームの外側からそれぞれＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ挿入物又はＨＬＡ－Ｅ ｃＤＮＡ挿入物までの領域を増幅するプライマーを使用して、ＰＤ－Ｌ１ＫＩ挿入物及びＨＬＡ－Ｅ ＫＩ挿入物のためにＫＩ組込みＤＮＡのみの増幅を可能にするＰＣＲを介して同定された。オンターゲット挿入物は、ＰＣＲによって接合状態について試験されて、ＫＩがヘテロ接合性又はホモ接合性様式において生じたかどうかが評価された。ヘテロ接合性クローンが同定された場合、ＫＩ陰性アレルをサンガー配列決定に送って、それがそれぞれＢ２Ｍ－破壊インデル又はＴＸＮＩＰ－破壊インデルを含有したことを検証した。完全なＢ２Ｍ及びＴＸＮＩＰ破壊（ＫＩ挿入物又はインデル形成のいずれかによる）を伴う正確なＫＩクローンは、３０００万個の細胞の集団サイズに達するまで、増加性の組織培養形式において増殖された。およそ１０個のクローンがこの様式で増殖され、細胞内フローサイトメトリーを介してＯＣＴ４及びＳＯＸ２について試験することによって多能性であると確認された（図１５）。
次に、上の試験を通過したクローンは、上記のとおりの核型分析（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）についてさらに試験された。選択されたＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ＋ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ（「Ｖ１－Ｂ」）クローンのＧ－バンディング結果は、表１２において示される。さらに、その後、Ｖ１－Ｂクローンは、膵臓内胚葉前駆細胞（ＰＥＣ）に分化するそれらの能力について試験された。
Figure 2022547053000013
ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅは、以前に報告された膵臓内分泌性プロトコルに従って段階６の細胞への分化後に発現され続けた（Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２（１１）：１１２１－１１３３）（図１６）。分化細胞の集団は、導入遺伝子の発現に関して均一であり、例えば細胞の９４．４％がＰＤ－Ｌ１を発現し、細胞の９７．０％がＨＬＡ－Ｅを発現する。図２２Ａは、野生型及び非切断ガイド対照細胞と比較して、段階６に分化した様々なクローン細胞（「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－Ｈ９」、「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－３Ｂ１１」、「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－１Ｇ７」及び「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－３Ｃ２」）の同様の形態を示す。Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローンの選択された遺伝子発現は、図２３Ａ～図２３Ｆに示される。Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローン細胞からのＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、ＧＣＫ、ＧＣＧ及びＳＳＴの動的発現パターンは、野生型細胞と同様であった（図２３Ａ）。様々な分化したＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローン（「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－Ｈ９」、「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－３Ｂ１１」、「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－１Ｇ７」及び「Ｓ６－Ｖ１Ｂ－３Ｃ２」）からの段階６のマーカーＩＮＳ（図２３Ｂ）、ＮＫＸ６．１（図２３Ｃ）、ＧＣＧ（図２３Ｄ）、ＳＳＴ（図２３Ｅ）及びＧＣＫ（図２３Ｆ）の発現レベルは、段階６の野生型細胞及び野生型の島におけるレベルと同様であった。未分化のＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローン（「ＥＳ－Ｖ１Ｂ－Ｈ９」）が陰性対照として使用された。
図２４Ａ～２４Ｂは、Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローンから分化された段階６の細胞におけるＩＮＳ及びＧＣＧの発現（図２４Ａ）並びにＩＮＳ及びＮＫＸ６．１の発現（図２４Ｂ）のフローサイトメトリー評価を示す。図２５Ａ～２５Ｂは、２つのＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローン（「Ｓ６－Ｖ１Ｂ００３」及び「Ｖ１Ｂ－Ｈ９」）から分化した段階６の細胞におけるＩＮＳの発現（図２５Ａ）及びＮＫＸ６．１の発現（図２５Ｂ）のパーセンテージを示す。両者の発現は、野生型及び非切断ガイド対照細胞のものと同様であった。
ＰＥＣ段階では、クロモグラニン（ＣＨＧＡ）、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のためのフローサイトメトリーが実施された。ＰＥＣ段階の不均一な集団は、膵臓前駆細胞、初期内分泌を含む（図１７）。遺伝子発現分析のためのターゲットＲＮＡｓｅｑは、上記のとおりに実施された。ＴＸＮＩＰ ＫＯクローンに関する選択された遺伝子発現は、図１８Ａに示され、Ｖ１－Ｂクローンに関する選択された遺伝子発現は、図１８Ｂに示される。Ｖ１－Ｂ又はＴＸＮＩＰ ＫＯクローン細胞からのＦＯＸＡ２、ＣＨＧＡ、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の動的発現パターンは、野生型細胞と同様であった。
配列番号５６のヌクレオチド配列を含むＨＬＡ－Ｅドナーベクターを使用して、ＨＬＡ－Ｅコード配列がＴＸＮＩＰ座位に挿入された（それによりＴＸＮＩＰ遺伝子をノックアウトした）細胞が作製された。遺伝子発現分析のためのターゲットＲＮＡｓｅｑは、上記のとおりに実施された。ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローンに関する選択された遺伝子発現は、図２８に示される。ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ細胞からのＦＯＸＡ２、ＣＨＧＡ、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の動的発現パターンは、野生型細胞と同様であった。
代わりに、配列番号３４のヌクレオチド配列を含むＨＬＡ－Ｅドナーベクターを使用して、ＨＬＡ－Ｅコード配列がＴＸＮＩＰ座位に挿入された細胞が作製された。大部分が編集された細胞はＰＥＣ段階に分化され、細胞の集団の少なくとも７５％においてＨＬＡ－Ｅを発現した（データは示さず）。ＴＸＮＩＰ ＫＯ細胞から分化したＰＥＣ細胞におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１発現のフローサイトメトリー評価は、野生型細胞から分化したＰＥＣ細胞と同様であった（データは示さず）。
実施例９：Ｔ細胞活性化／増殖アッセイ
ＰＥＣ分化細胞は、インビトロヒトＴ細胞活性化／増殖アッセイを介して免疫応答を誘発するそれらの能力について試験された。新鮮なドナーＰＢＭＣは、Ｈｅｍａｃａｒｅから購入され、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、汎Ｔ細胞単離キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｃａｔ＃１３０－０９６－５３５）を使用して精製された。単離されたＴ細胞は、製造業者の指示書によりＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キットプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃３４５５４）で標識され、分化したＰＥＣとともに５日間共インキュベートされた。Ｔ細胞増殖及び活性化のためのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ－アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃１１１６１Ｄ）は、Ｔ細胞を活性化する陽性対照として使用された。Ｔ細胞単独でＣＦＳＥにより標識され、陰性対照として使用された。ＣＤ３＋ ＣＦＳＥ＋細胞のパーセントは、Ｔ細胞増殖のパーセントを評価するために測定された（図１９Ａ～１９Ｂ）。ＷＴ ＰＥＣは、Ｔ細胞単独の対照を超えてＴ細胞増殖を誘発した。Ｂ２Ｍ ＫＯ、Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ及びＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ＋ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ ＣｙＴ４９に由来するＰＥＣは、Ｔ細胞のみの対照を超えてＴ細胞増殖を誘発しなかったが、これは編集された細胞の低免疫原性の性質を示している。
実施例１０：遺伝子標的化されたクローン株のインビボ有効性試験
膵臓内胚葉細胞は、以下の遺伝子改変を有するＣｙＴ４９に由来するクローンｈＥＳ細胞株から生成された：１）Ｂ２Ｍ発現の標的化された欠失及びＰＤ－Ｌ１の強制発現、２）Ｂ２Ｍ発現の標的化された欠失及びＨＬＡ－Ｅの強制発現、又は３）ＴＸＮＩＰの標的化された欠失。加えて、クローン未改変細胞株は、非切断ガイド－ＲＮＡ（ＮＣＧ）によるトランスフェクションから得られた。
標準的な手順に従って、指定のクローン株に由来する膵臓内胚葉凝集物を、穿孔デバイス（ＰＤ）中にロードして、試験又は対照物品を生成した。ＰＤは、皮下移植時に直接的な血管新生を可能にし、被包された膵臓前駆細胞は、グルコース反応性、インスリン産生細胞を含む機能的な膵臓内分泌性細胞にインビボで成熟する。
表１３において要約されるとおり、胸腺欠損ヌードラットの５つの群に、それぞれ上記の４つのクローン株の分化から得られたおよそ７×１０6個の膵臓内胚葉細胞又は野生型ＣｙＴ４９ ｈＥＳ（ＶｉａＣｙｔｅ）細胞を含有する２つの物品を皮下移植した。
Figure 2022547053000014
１２週目から、生存している全ての動物を、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）試験を介する有効性評価にかけた。血液試料は、３ｇ／ｋｇのグルコースの腹腔内投与前及び後に非絶食動物から得られた。ヒトＣ－ペプチドの血清濃度は、標準的な酵素結合免疫吸着測定法を介して決定された。
ＧＳＩＳ試験は、１２、１６及び２０週目に実施された。結果は、特に１２週の時点を過ぎて実験群間で実質的な相違がないことを示した。対照群（群１、＜４０ｐＭ～２．０ｎＭ、平均１．１ｎＭ）において検出されるＣ－ペプチドレベルと比較して、Ｃ－ペプチドレベルは、群３（ＴＸＮＩＰ ＫＯ、平均１．５ｎＭ）からの６頭の動物の２頭において上昇した。他の群、群２（ＮＣＧ、平均０．５ｎＭ）、群４（Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ、平均０．５ ｎＭ）及び群５（Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ、平均０．４ｎＭ）は、対照群と比較してＣ－ペプチドレベルの同様の範囲であったが、より多くの動物がその範囲の下端付近であったことを示した。しかしながら、これらの相違は、統計的に有意ではなかった。これらの結果は、導入された遺伝子改変もクローン株を作製するために必要な操作も、その細胞株がインビトロで膵臓内胚葉細胞に分化し、その後、インビボで機能的なベータ細胞を作製する能力に影響を及ぼさないことを示した。
２０週目で、ＧＳＩＳ試験後、動物は、安楽死され、移植された試験物品は、中性緩衝ホルマリン中で固定され、スライドに加工され、Ｈ＆Ｅ並びにインスリン及びグルカゴンのために免疫組織化学によって染色された。
ＧＳＩＳ試験によるインビボでの有効性評価は、未編集の対照物品と、各々が遺伝子改変のサブセットを有するクローン細胞株に由来する膵臓内胚葉細胞で構築された編集された試験物品との間で実質的な相違を示さなかった。結果は、個々の遺伝子改変及びそれらが導入されるプロセスがインビボで許容され得ることを示唆している。
実施例１１．Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ細胞株のインビボ有効性試験
４つのクローン株は、基本的に実施例８において上記のとおりに作製され、穿孔デバイスにロードされて、試験物品を形成した。対照物品は、未改変ＣｙＴ４９細胞（ＶｉａＣｙｔｅ）を含有した。約７×１０6個の膵臓内胚葉細胞を含む物品は、胸腺欠損ヌードラット（２物品／ラット、８ラット／群）に皮下移植された。
１２、１６、２０及び２４週目に、生存している全ての動物を、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）試験にかけた。血液試料は、３ｇ／ｋｇのグルコースの腹腔内投与前及び後に絶食動物から得られた。ヒトＣ－ペプチドの血清濃度は、標準的な酵素結合免疫吸着測定法を介して決定された。血清Ｃ－ペプチドは、移植後の１２週目に大部分の動物において検出された。移植後の１６、２０及び２４週目の血清Ｃ－ペプチドレベルは、表１４に示される。対照細胞に対して、遺伝子編集された細胞が移植された動物の群間で統計的に有意な相違は観察されなかった。
Figure 2022547053000015
２５週目に、生存している動物は、飼料を与えない状態で血中グルコースを減少させたことに応答する血清ヒトＣ－ペプチドの変化を評価するために、インスリンチャレンジ（インスリン耐性試験、ＩＴＴ）にかけられる。血液試料は、体重１ｋｇ当たり１単位のインスリンの腹腔内投与前及びその後の複数の時点（１５、３０、６０分）で絶食動物から得られる。ヒトＣ－ペプチドの血清濃度は、標準的な酵素結合免疫吸着測定法を介して決定される。
２６週目に、生存している動物は、安楽死され、移植された試験物品は、スライドに加工され、Ｈ＆Ｅ並びにインスリン及びグルカゴンのために免疫組織化学（ＩＨＣ）によって染色されて、ヒト膵臓内分泌性細胞を同定する。ヒトに特異的な核マーカーＮｕＭＡ１のための追加のＩＨＣは、試験物品移植片の内腔の外側の移植に由来する細胞の潜在的な位置を同定するために実施される。
実施例１２．Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ細胞株のインビボ有効性試験
Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ膵臓内胚葉細胞の凝集物（およそ７×１０6個の細胞を含む）は、試験物品に配合される。４６頭の胸腺欠損ヌードラットにそれぞれ２つの試験物品が皮下移植される。試験時の動物は、ＧＳＩＳ、ＩＴＴ及び非絶食時血中グルコース（ＮＦＢＧ）について評価される。１群当たり１０頭の動物は、１３、１７、２６及び３９週の予定された終了時点で安楽死される一方、６頭の追加の動物は、起こり得る予定外の早期の終了を考慮して試験される。各動物から、２頭の移植された試験物品は、組織学的評価又は総Ｃ－ペプチド含量評価のいずれかに無作為に割り当てられる。表１５は、試験設計を示す。
Figure 2022547053000016
１２、１６、２０、２４、３０及び３６週目に、生存している全ての動物は、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）試験を介する有効性評価にかけられる。血液試料は、３ｇ／ｋｇのグルコースの腹腔内投与前及び後に絶食動物から得られる。ヒトＣ－ペプチドの血清濃度は、標準的な酵素結合免疫吸着測定法を介して決定される。
２５及び３３週目に、生存している動物は、飼料を与えない状態で血中グルコースを減少させたことに応答する血清ヒトＣ－ペプチドの変化を評価するために、インスリンチャレンジ（インスリン耐性試験、ＩＴＴ）にかけられる。血液試料は、体重１ｋｇ当たり１単位のインスリンの腹腔内投与前及びその後の複数の時点（１５、３０、６０分）で絶食動物から得られる。ヒトＣ－ペプチドの血清濃度は、標準的な酵素結合免疫吸着測定法を介して決定される。
非絶食時血中グルコース（ＮＦＢＧ）は、およそ１２、１６、２０、２４、２５、３０、３３及び３６週目でＧＳＩＳ及びＩＴＴ試験のために絶食の開始前に測定される。
表１３において特定される予定された終点で、動物は安楽死される。安楽死は、ＣＯ2吸入後の両側開胸によって実施される。剖検は、全ての予定された終了及び予定外の終了時に実施され、肉眼での異常が記録される。
指定された移植片は、凍結された後、内腔内容物の均質化が行われる。ホモジネートの総Ｃ－ペプチド含量は、標準的な酵素結合免疫吸着測定法を介して決定される。移植片の総Ｃ－ペプチド含量は、臨床投薬を予測するために使用される。
指定される移植された試験物品は、中性緩衝ホルマリン中で固定され、スライドに加工され、Ｈ＆Ｅ並びにインスリン及びグルカゴンのために免疫組織化学（ＩＨＣ）によって染色されて、ヒト膵臓内分泌性細胞を同定する。ヒトに特異的な核マーカーＮｕＭＡ１のための追加のＩＨＣは、試験物品移植片の内腔の外側の移植に由来する細胞の潜在的な位置を同定するために実施される。
実施例１３：ヒトｉＰＳＣにおけるＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩの作製
ＰＤ－Ｌ１コード配列がＢ２Ｍ座位に挿入されたヒトｉＰＳＣ（ｉＰＳＣ ００２５）が作製された。ＲＮＰ複合体は、Ｂ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）及びＣａｓ９を３：１（ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９）のモル比で合わせることによって形成された。ＲＮＰ複合体を形成するために、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９を、Ｒ－緩衝液を含む１つの容器中で合わせて、２５μＬの合計体積にし、室温で１５分間インキュベートした。細胞は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を使用して解離され、続いてＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１１３２００３３）中で再懸濁され、ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して計数され、遠心分離された。合計で１×１０6個の細胞がＲＮＰ複合体とともに再懸濁された。４μｇのＢ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＰＤ－Ｌ１ドナープラスミド（配列番号３３）及びＲ－緩衝液が１２５μＬの総体積のために添加された。次に、この混合物は、パラメーター：２パルス、３０ｍｓ、１１００Ｖを使用して電気穿孔された。エレクトロポレーションの７日後、細胞は、基本的には実施例８において上記のとおりＭｉｌｔｅｎｙｉ試薬又はＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ試薬を使用してＭＡＣＳを介してＰＤ－Ｌ１陽性細胞について濃縮された。
濃縮されたＰＤ－Ｌ１陽性集団が増殖された後、細胞は、基本的には上記のとおり３：１（ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９）のモル比のＴＸＮＩＰ－Ｔ５ ｇＲＮＡ（配列番号２０）及びＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ複合体並びに４μｇのＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＨＬＡ－Ｅドナープラスミド２（配列番号５６）とともに電気穿孔された。エレクトロポレーションの７日後、細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ試薬又はＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ試薬を使用してＭＡＣＳを介してＨＬＡ－Ｅ陽性細胞について濃縮された。ＨＬＡ－Ｅ濃縮後、細胞は、ＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ソーター（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、ＳｔｅｍＦｌｅｘ及びＲｅｖｉｔａｃｅｌｌを含むＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレートに単一細胞ソーティングされた。播種された単一細胞を、コロニーが単一細胞として再播種されるほど大きくなるまで、１日おきに培地を交換しながら正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ2）中で増殖させた。コンフルエントになったとき、試料を、維持及びゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＨＬＡ－Ｅ抗体（表４）は、ＭＡＣＳ濃縮並びにＨＬＡ－Ｅ及びＰＤ－Ｌ１二重陽性細胞のためのゲーティング設定を有する９６ウェルプレートにＦＡＣＳソーティングのために使用された。ＦＡＣＳ－ソーティングに関して、未編集の細胞は、陰性対照として機能した。
正確に標的化されたクローンは、プラスミドのホモロジーアームの外側からそれぞれＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ挿入物又はＨＬＡ－Ｅ ｃＤＮＡ挿入物までの領域を増幅するプライマーを使用して、ＰＤ－Ｌ１ＫＩ挿入物及びＨＬＡ－Ｅ ＫＩ挿入物のためにＫＩ組込みＤＮＡのみの増幅を可能にするＰＣＲを介して同定された。オンターゲット挿入物は、ＰＣＲによって接合状態について試験されて、ＫＩがヘテロ接合性又はホモ接合性様式において生じたかどうかが評価された。ヘテロ接合性クローンが同定された場合、ＫＩ陰性アレルをサンガー配列決定に送って、それがそれぞれＢ２Ｍ－破壊インデル又はＴＸＮＩＰ－破壊インデルを含有したことを検証した。完全なＢ２Ｍ及びＴＸＮＩＰ破壊（ＫＩ挿入物又はインデル形成のいずれかによる）を伴う正確なＫＩクローンは、３０００万個の細胞の集団サイズに達するまで、増加性の組織培養形式において増殖された。選択されたクローンがこの様式で増殖され、細胞内フローサイトメトリーを介してＯＣＴ４及びＳＯＸ２について試験することによって多能性であると確認された。
４つの編集されたｈｉＰＳＣクローン（ＶＩ－Ｂ）は、Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｎｏｖ；３２（１１）：１１２１－３３）の膵臓内分泌性プロトコルを使用して分化された。段階４では、クロモグラニン（ＣＨＧＡ）、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のためのフローサイトメトリーが実施された。異なる代表的な密度で播種されたクローン（クローン１）のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１に関する結果は、図２６Ａに示される。ＣＨＧＡは、４つ全てのクローンについて陰性であった。ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅに関するフローサイトメトリーも実施された。クローン（クローン１）のＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅに関する結果は、図２６Ｂに示される。
実施例１４：Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）冷凍細胞バンクを製造するためのプロセス
ＣｙＴ４９ ｈＥＳＣ（ＶｉａＣｙｔｅ）は、３：１（ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９）のモル比のＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）及びＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ複合体並びに４μｇのＢ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＰＤ－Ｌ１ドナープラスミド（配列番号３３）とともに１１００Ｖにおいて３０ｍｓの２パルスで電気穿孔された。エレクトロポレーション後、細胞は、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌを含むＳｔｅｍＦｌｅｘ培地で充填されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにピペットで移された。次に、この細胞懸濁液は、１：２０の希釈度のＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧで予めコーティングされた組織培養ディッシュに播種された。細胞は、正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ ＣＯ2）中で培養された。
エレクトロポレーションの７日後、細胞は、Ａｌｅｘａ－４８８標識された抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び磁性ビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）汎マウスＩｇＧ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＭＡＣＳを介してＰＤ－Ｌ１陽性細胞について濃縮された。ＰＤ－Ｌ１陽性細胞は、ＸＦ－ＫＳＲ増殖培地（Ｇｉｂｃｏ）中で７日間培養することによって増殖された。
次に、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞は、３：１（ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９）のモル比のＴＸＮＩＰ－Ｔ５ ｇＲＮＡ（配列番号２０）及びＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ複合体並びに４μｇのＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＨＬＡ－Ｅドナープラスミド２（配列番号５６）とともに１１００Ｖにおいて３０ｍｓの２パルスで電気穿孔された。エレクトロポレーション後、細胞は、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌを含むＳｔｅｍＦｌｅｘ培地で充填されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにピペットで移された。次に、この細胞懸濁液は、１：２０の希釈度のＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧで予めコーティングされた組織培養ディッシュに播種された。細胞は、正常酸素圧インキュベーター（３７℃、８％ ＣＯ2）中で培養された。
エレクトロポレーションの７日後、細胞は、ＰＥ標識された抗ＨＬＡ－Ｅ抗体及び磁性ビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）汎マウスＩｇＧ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＭＡＣＳを介してＨＬＡ－Ｅ陽性細胞について濃縮された。ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅ二重陽性細胞は、ＸＦ－ＫＳＲ増殖培地（Ｇｉｂｃｏ）中で約５日間培養することによって増殖された。
ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅ二重陽性細胞は、単一細胞ソーティングされた。このために、細胞は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）による解離の３～４時間前にＲｅｖｉｔａｃｅｌｌ（１×Ｒｅｖｉｔａｃｅｌｌの最終濃度）とともにＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅを供給された。解離後、単一細胞は、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮでコーティングされた９６ウェル組織培養プレートの単一のウェルにソーティングされた。ＷＯＬＦ ＦＡＣＳソーター（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、上記の抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＨＬＡ－Ｅ抗体を使用して単一細胞をウェルにソーティングした。プレートは、Ｒｅｖｉｔａｃｅｌｌとともに１００～２００μＬのＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅで予め充填された。細胞播種の３日後、細胞は、新鮮なＳｔｅｍＦｌｅｘを供給され、１００～２００μＬの培地が１日おきに供給され続けた。増殖の１０日後、細胞は、１２～１４日目までＳｔｅｍＦｌｅｘを毎日供給された。この時点で、プレートはＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で解離され、回収された細胞懸濁液は、１：２に分割されて２つの９６ウェルプレートに入れられ、約４日間培養された。
一部の細胞は、視覚的分析（形態）及びＤＮＡ分析（接合状態分析及びインデルプロファイルについてのＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定）のために収集され、残りの細胞は培養され、Ｔ１７５フラスコ中で培養するために増殖された。培養の約２週間後、クローンは凍結のために選択された。細胞は、標準的な手順を使用して、形態、生存能、内毒素、マイコプラズマ、核型、多能性、分化能、オン／オフターゲット分析、ランダムプラスミド組込み、残留Ｃａｓ９／プラスミドのために凍結させる前及び後に特徴付けられた。細胞は、冷凍培地中で凍結され、－８０℃の冷凍バイアル又は液体窒素中で保管された。
特定のＢ２Ｍ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ＋ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩクローン（「シードクローン」）が製造され、前記プロセスによって単離された。シードクローンは、ＰＥＣ段階に分化され、特徴付けられた。図２７Ａは、ＰＥＣ段階のシードクローンの形態が野生型細胞と同様であったことを示す。図２７Ｂは、シードクローンから分化した細胞における分化時間経過にわたるＦＯＸＡ２、ＣＨＧＡ、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の動的発現パターンが野生型細胞と同様であったことを示す。図２７Ｃは、分化した集団におけるＣＨＧＡ-／ＮＫＸ６．１+／ＰＤＸ１+細胞のパーセンテージを示す。

Claims (52)

  1. 生存因子をコードする遺伝子内又はその近傍に挿入される、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含むユニバーサルドナー細胞であって、前記免疫寛容原性因子を発現し、且つ前記生存因子の破壊された発現を有し、及び対照細胞と比較して増加した免疫回避及び／又は細胞生存を有するユニバーサルドナー細胞。
  2. 前記対照細胞は、野生型細胞又は前記挿入されるヌクレオチド配列を含まない細胞である、請求項１に記載のユニバーサルドナー細胞。
  3. 前記生存因子の前記破壊された発現は、減少又は消失した発現を含む、請求項１又は２に記載のユニバーサルドナー細胞。
  4. 前記第１の免疫寛容原性因子は、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４又はＣＤ４７である、請求項１～３のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  5. 前記生存因子は、ＴＸＮＩＰ、ＺＮＦ１４３、ＦＯＸＯ１、ＪＮＫ又はＭＡＮＦである、請求項１～４のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  6. 前記第１の免疫寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅであり、及び前記生存因子は、ＴＸＮＩＰである、請求項１～５のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  7. ＨＬＡ－Ｅをコードする前記ヌクレオチド配列は、そのシグナルペプチドを伴わずにＨＬＡ－Ｅに融合されたＢ２Ｍ膜タンパク質に融合されたＨＬＡ－Ｇ提示ペプチドに融合されたＢ２Ｍシグナルペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含む、請求項５又は６に記載のユニバーサルドナー細胞。
  8. 前記ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする前記配列は、配列番号５５から本質的になる、請求項７に記載のユニバーサルドナー細胞。
  9. 前記第１の免疫寛容原性因子をコードする前記ヌクレオチド配列は、外来プロモーターに作動可能に連結される、請求項１～８のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  10. 前記外来プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ又はＵＢＣプロモーターである、請求項９に記載のユニバーサルドナー細胞。
  11. ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする遺伝子内又はその近傍に挿入される、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記免疫寛容原性因子を発現し、且つ前記ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又は前記ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の前記構成要素若しくは前記転写調節因子の破壊された発現を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  12. 前記ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又は前記ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の前記構成要素若しくは前記転写調節因子の前記破壊された発現は、減少又は消失した発現を含む、請求項１１に記載のユニバーサルドナー細胞。
  13. 前記第２の免疫寛容原性因子は、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４又はＣＤ４７である、請求項１１又は１２に記載のユニバーサルドナー細胞。
  14. 前記ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又は前記ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の前記構成要素若しくは前記転写調節因子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ又はＲＦＸＡＮＫである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  15. 前記第２の免疫寛容原性因子は、ＰＤ－Ｌ１であり、及び前記ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又は前記ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の前記構成要素若しくは前記転写調節因子は、Ｂ２Ｍである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  16. ＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１１から本質的になる、請求項１５に記載のユニバーサルドナー細胞。
  17. 前記第２の免疫寛容原性因子をコードする前記ヌクレオチド配列は、外来プロモーターに作動可能に連結される、請求項１１～１６のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  18. 前記外来プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ又はＵＢＣプロモーターである、請求項１７に記載のユニバーサルドナー細胞。
  19. 前記第１の免疫寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅであり、前記生存因子は、ＴＸＮＩＰであり、前記第２の免疫寛容原性因子は、ＰＤ－Ｌ１であり、及び前記ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又は前記ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の前記構成要素若しくは前記転写調節因子は、Ｂ２Ｍである、請求項１１～１８のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  20. 幹細胞である、請求項１～１９のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  21. 前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞又は造血幹細胞である、請求項２０に記載のユニバーサルドナー細胞。
  22. 分化細胞又は体細胞である、請求項１～１９のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  23. 系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化することができる、請求項１～１９のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー細胞。
  24. 前記系列限定前駆細胞は、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、造血前駆細胞又は神経前駆細胞である、請求項２３に記載のユニバーサルドナー細胞。
  25. 前記完全に分化した体細胞は、膵ベータ細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、心筋細胞又は免疫系細胞である、請求項２３に記載のユニバーサルドナー細胞。
  26. 請求項１～２５のいずれか一項に記載の複数のユニバーサルドナー細胞。
  27. 請求項２６に記載の複数のユニバーサルドナー細胞に由来する系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞の集団。
  28. 前記系列限定前駆細胞は、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、造血前駆細胞又は神経前駆細胞であり、及び前記完全に分化した体細胞は、膵ベータ細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、心筋細胞又は免疫系細胞である、請求項２７に記載の細胞の集団。
  29. 請求項６又は１９に記載の複数のユニバーサルドナー細胞。
  30. 請求項２９に記載の複数のユニバーサルドナー細胞に由来する系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞の集団。
  31. 前記系列限定前駆細胞は、胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、未成熟ベータ細胞又は成熟ベータ細胞であり、及び前記完全に分化した体細胞は、膵ベータ細胞である、請求項３０に記載の細胞の集団。
  32. 前記細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約７０％又は少なくとも約９０％は、前記第１の免疫寛容原性因子、前記第２の免疫寛容原性因子又は前記第１及び第２の免疫寛容原性因子を発現する、請求項２６又は２９に記載の複数の細胞。
  33. 前記細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約７０％又は少なくとも約９０％は、前記第１の免疫寛容原性因子、前記第２の免疫寛容原性因子又は前記第１及び第２の免疫寛容原性因子を発現する、請求項２７、２８、３０又は３１のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  34. 請求項２６に記載の複数の細胞又は請求項２７若しくは２８に記載の細胞の集団を含む組成物。
  35. 治療を、それを必要とする対象において行う際の使用のための、請求項３４に記載の組成物。
  36. 前記対象は、疾患を有するか、それを有することが疑われるか又はそのリスクがある、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記疾患は、遺伝的に受け継がれる疾患である、請求項３６に記載の組成物。
  38. 請求項２９に記載の複数の細胞又は請求項３０若しくは３１に記載の細胞の集団を含む組成物。
  39. 糖尿病の治療を、それを必要とする対象において行うための、請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記対象は、Ｉ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病を有する、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記対象は、ヒトである、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 細胞であって、それを必要とする対象への投与のための細胞を得る方法であって、
    （ａ）請求項２６、２９又は３２のいずれか一項に記載の複数のユニバーサルドナー細胞を得るか又は得ていることと、
    （ｂ）前記細胞が系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞に分化するのに十分な時間にわたって且つ条件下で前記複数のユニバーサルドナー細胞を維持することと
    を含む方法。
  43. 治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、
    （ａ）請求項２６、２９又は３２のいずれか一項に記載の複数のユニバーサルドナー細胞を、系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞への分化後に得るか又は得ていることと；
    （ｂ）前記系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞を前記対象に投与することと
    を含む方法。
  44. 投与することは、前記系列限定前駆細胞又は完全に分化した体細胞を含むデバイスを前記対象に埋入することを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記系列限定前駆細胞は、膵臓内胚葉前駆細胞、膵臓内分泌性前駆細胞、間葉系前駆細胞、筋肉前駆細胞、芽球細胞、造血前駆細胞又は神経前駆細胞であり、及び前記完全に分化した体細胞は、膵ベータ細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血液細胞、心筋細胞又は免疫系細胞である、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記対象は、疾患を有するか、それを有することが疑われるか又はそのリスクがある、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記疾患は、遺伝的に受け継がれる疾患である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記対象は、ヒトである、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 糖尿病の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、
    （ａ）請求項２９又は３２に記載の複数のユニバーサルドナー細胞を、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞への分化後に得るか又は得ていることと；
    （ｂ）前記膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞を前記対象に投与することと
    を含む方法。
  50. 投与することは、前記膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌性細胞、未成熟ベータ細胞、成熟ベータ細胞又は膵ベータ細胞を含むデバイスを前記対象に埋入することを含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記対象は、Ｉ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病を有する、請求項４９又は５０に記載の方法。
  52. 前記対象は、ヒトである、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法。
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