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CN114364791A - 通用供体细胞 - Google Patents

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CN114364791A
CN114364791A CN202080062262.4A CN202080062262A CN114364791A CN 114364791 A CN114364791 A CN 114364791A CN 202080062262 A CN202080062262 A CN 202080062262A CN 114364791 A CN114364791 A CN 114364791A
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cell
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hla
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CN202080062262.4A
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A·雷扎尼亚
R·拉莫斯-扎亚斯
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CRISPR Therapeutics AG
Original Assignee
CRISPR Therapeutics AG
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Abstract

本文提供了与多名受试者相容的经遗传修饰的细胞，例如通用供体细胞；以及产生所述经遗传修饰的细胞的方法。这些通用供体细胞包含在编码存活因子的至少一种基因内或附近的至少一种遗传修饰，其中该遗传修饰包括编码致耐受性因子的多核苷酸的插入。这些通用供体细胞可进一步包含在编码一种或多种MHC‑I或MHC‑II人白细胞抗原或者MHC‑I或MHC‑II复合体的组分或转录调控因子的基因内或附近的至少一种遗传修饰，其中所述遗传修饰包括编码第二致耐受性因子的多核苷酸的插入。

Description

通用供体细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月5日提交的美国临时申请号62/896,477和于2020年2月21日提交的美国临时申请号62/979,756的权益，它们各自的披露内容特此通过援引以其全文并入。
通过引用并入序列表
本申请包含经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并且特此通过援引以其全文并入。2020年9月2日创建的ASCII副本被命名为CT123-PCT-100867-666513-Sequence-Listing_ST25.txt，并且大小为约53,000字节。
技术领域
本发明涉及基因编辑领域，并且在一些实施例中，涉及用于产生与多名受试者相容的细胞(例如，通用供体细胞)的目的的遗传修饰。
背景技术
已经提出了多种方法来克服移植或植入细胞的同种异体排斥，包括HLA匹配、用抗体阻断触发T细胞激活的途径、使用免疫抑制药物混合物以及自体细胞疗法。抑制移植物排斥的另一种策略涉及最小化移植或植入细胞与受体之间的同种异体差异。细胞表面表达的人白细胞抗原(HLA)，即由位于6号染色体上人主要组织相容性复合体中的基因编码的分子是免疫排斥的主要介体。供体与受试者之间单个HLA基因的错配可能引起稳健的免疫应答(Fleischhauer K.等人“Bone marrow-allograft rejection by T lymphocytesrecognizing a single amino acid difference in HLA-B44[通过T淋巴细胞识别HLA-B44中的单个氨基酸差异进行的骨髓同种异体移植物排斥],”N Engl J Med.[新英格兰医学杂志],1990,323:1818-1822)。HLA基因分为MHC I类(MHC-I)和MHC II类(MHC-II)。MHC-I基因(HLA-A、HLA-B和HLA-C)在几乎所有组织细胞类型中均表达，向CD8+T细胞呈递“非自身”抗原处理的肽，从而促进其激活为溶细胞性CD8+T细胞。表达“非自身”MHC-I分子的移植或植入细胞将引起针对这些细胞的稳健的细胞免疫应答，最终通过激活的溶细胞性CD8+T细胞导致这些细胞的死亡。MHC-I蛋白与内质网中的β-2-微球蛋白(B2M)密切相关，该β-2-微球蛋白对于在细胞表面形成功能性MHC-I分子至关重要。
与MHC-I基因的广泛细胞表达相反，MHC-II基因的表达限于抗原呈递细胞，如树突细胞、巨噬细胞和B细胞。HLA抗原基因是在人类基因组中观察到的最具多态性的基因(Rubinstein P.,“HLA matching for bone marrow transplantation--how much isenough？[用于骨髓移植的HLA匹配--到什么程度是足够的？]”N Engl J Med.[新英格兰医学杂志],2001,345:1842-1844)。与任何HLA基因型相容的“通用供体”细胞的产生提供了可以解决免疫排斥和针对免疫逃避的当前方法的相关经济成本的替代策略。
为了产生这种或此类通用供体细胞系，一种先前方法是在功能上破坏MHC-I和MHC-II类基因的表达。这可以通过例如编码MHC-I轻链B2M的两个遗传等位基因的遗传破坏来实现。预期所得的B2M-null细胞系及其衍生物将展现出大大减少的表面MHC-I，从而展现出对同种异体CD8+T细胞的降低的免疫原性。转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)靶向方法已被用于通过缺失B2M基因外显子2中的一些核苷酸来产生B2M缺陷型hESC系(Lu,P.等人,“Generating hypoimmunogenic human embryonic stem cells by the disruptionof beta 2-microglobulin[通过破坏β2-微球蛋白产生低免疫原性人胚胎干细胞],”StemCell Rev.[干细胞综述]2013,9:806-813)。尽管靶向B2M的hESC系似乎是表面HLA-I缺陷的，但发现它们仍然含有对B2M和MHC-I特异性的mRNA。B2M和MHC-I mRNA以与非靶向hESC(组成型和IFN-g诱导)的水平相当的水平表达。因此，存在如下担心：这些TALEN B2M靶向性hESC系可能表达将足以引起免疫排斥的残留细胞表面MHC-I，例如在也表达B2M mRNA的B2M2/2小鼠细胞的情况下已经观察到的(Gross,R.和Rappuoli,R.“Pertussis toxinpromoter sequences involved in modulation[参与调控的百日咳毒素启动子序列],”Proc Natl Acad Sci[美国国家科学院院刊],1993,90:3913-3917)。尽管未检查TALEN B2M靶向性hESC系的脱靶裂解事件，但在使用TALEN时非特异性裂解的发生仍然是一个重大问题，该问题将给其临床使用带来重大的安全性问题(Grau,J.等人“TALENoffer:genome-wide TALEN off-target prediction[TALENoffer：全基因组TALEN脱靶预测],”Bioinformatics[生物信息学],2013,29:2931-2932；Guilinger J.P.等人“Broadspecificity profiling of TALENs results in engineered nucleases with improvedDNA-cleavage specificity[TALEN的广泛特异性谱分析产生具有改善的DNA裂解特异性的工程化核酸酶],”Nat Methods[自然·方法]2014,11:429-435)。此外，另一个报告产生了通过以下方式而逃避了同种异体识别的IPS细胞：敲除第一B2M等位基因并在第二B2M等位基因处敲入HLA-E基因，从而导致在不存在HLA-A、HLA-B或HLA-C的表面表达的情况下HLA-E二聚体或三聚体的表面表达(Gornalusse,G.G.等人,“HLA-E-expressing pluripotentstem cells escape allogeneic responses and lysis by NK cells[表达HLA-E的多能干细胞逃避同种异体反应和NK细胞的裂解],”Nature Biotechnology[自然·生物技术],2017,35,765-773)。
一些以上策略的潜在局限性在于，MHC I类阴性细胞易受自然杀伤(NK)细胞的裂解，因为HLA分子充当自然杀伤(NK)细胞的主要配体抑制剂。已显示宿主NK细胞可消除移植或植入的B2M-/-供体细胞，并且在MHC I类阴性人白血病细胞系的情况下在体外发生了类似现象(Bix,M.等人,“Rejection of class I MHC-deficient haemopoietic cells byirradiated MHC-matched mice[被辐照的MHC匹配的小鼠对I类MHC缺陷型造血细胞的排斥],”Nature[自然],1991,349,329-331；Zarcone,D.等人,“Human leukemia-derivedcell lines and clones as models for mechanistic analysis of natural killercell-mediated cytotoxicity[作为用于自然杀伤细胞介导的细胞毒性的机理分析的模型的人白血病源细胞系和克隆],”Cancer Res.[癌症研究]1987,47,2674-2682)。因此，存在改善先前方法以产生能够逃避免疫应答的通用供体细胞的需要，以及产生可以在植入后存活的细胞的需要。如本文所述，植入后细胞存活可以由宿主的独立于同种异体排斥的其他途径(例如，缺氧、活性氧、营养剥夺和氧化应激)来介导。另外如本文所述，存活因子(基因和/或蛋白)的遗传引入可以有助于细胞在植入后存活。如本文所述，通用供体细胞系可以将解决同种异体排斥和植入后存活两者的特性组合。
发明内容
在一些方面，本披露涵盖用于产生通用供体细胞的方法。该方法包括向细胞递送(a)靶向编码存活因子的基因内或附近的位点的定点核酸酶，和(b)包含编码致耐受性因子的核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列的侧翼是(i)与位于(a)的靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列和(ii)与位于(a)的靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中该定点核酸酶切割(a)的靶位点，并且(b)的核酸被插入在与(a)的位点部分重叠、完全重叠或包含在该位点内的位点处，从而产生通用供体细胞，其中该通用供体细胞与其中未插入(b)的核酸的细胞相比具有增加的细胞存活。
在一些实施例中，存活因子是TXNIP、ZNF143、FOXO1、JNK或MANF，并且致耐受性因子是PD-L1、HLA-E、HLA-G、CTLA-4或CD47。在具体的实施例中，存活因子是TXNIP并且致耐受性因子是HLA-E。在其中该定点核酸酶是包含CRISPR核酸酶和引导RNA(gRNA)的CRISPR系统的实施例中，该CRISPR核酸酶是II型Cas9核酸酶或V型Cfp1核酸酶，并且该CRISPR核酸酶连接到至少一个核定位信号。在一些实施例中，gRNA靶向以下的多核苷酸序列：选自SEQ IDNO:15-24或45-54，和(i)基本上由SEQ ID NO:25的核苷酸序列组成，以及(ii)基本上由SEQID NO:32的核苷酸序列组成。
在一些实施例中，该方法进一步包括向该细胞递送(c)靶向编码MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子中的一种或多种的基因内或附近的位点的定点核酸酶，和(d)包含编码致耐受性因子的核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列的侧翼是(iii)与位于(c)的该靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列和(iv)与位于(c)的该靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中(d)的该致耐受性因子不同于(b)的该致耐受性因子，其中该定点核酸酶切割(c)的该靶位点，并且(d)的该核酸被插入在与(c)的位点部分重叠、完全重叠或包含在该位点内的位点，其中该通用供体细胞与其中未插入(d)的核酸的细胞相比具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
在一些实施例中，编码该一种或多种MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者该MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子的该基因是选自HLA-A、HLA-B或HLA-C的MHC-I基因，选自HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ或HLA-DR的MHC-II基因，或选自B2M、NLRC5、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK的基因，并且该致耐受性因子是PD-L1、HLA-E、HLA-G、CTLA-4或CD47。在具体的实施例中，编码该一种或多种MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者该MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子的该基因是B2M，并且该致耐受性因子是PD-L1。在其中该定点核酸酶是包含CRISPR核酸酶和gRNA的CRISPR系统的实施例中，该CRISPR核酸酶是II型Cas9核酸酶或V型Cfp1核酸酶，并且该CRISPR核酸酶连接到至少一个核定位信号。在一些实施例中，gRNA靶向以下的多核苷酸序列：选自SEQ ID NO:1-3或35-44，和(iii)基本上由SEQ ID NO:7的核苷酸序列组成，以及(iv)基本上由SEQ ID NO:13的核苷酸序列组成。
在一些实施例中，编码(b)和(d)的致耐受性因子的核苷酸序列可操作地连接到外源启动子。外源启动子可选自组成型启动子、诱导型启动子、时间特异性启动子、组织特异性启动子或细胞类型特异性启动子。在一些实施例中，外源启动子是CMV、EFla、PGK、CAG或UBC启动子。在具体的实施例中，外源启动子是CAG启动子。
本披露还涵盖通过本文披露的方法产生的通用供体细胞。在一些实施例中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，该细胞是人细胞。在一些实施例中，该细胞是干细胞。在一些实施例中，该细胞是多能干细胞(PSC)、胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞(ASC)、诱导多能干细胞(iPSC)或造血干细胞和祖细胞(HSPC)(也称为造血干细胞(HSC))。在一些实施例中，该细胞是分化细胞。在一些实施例中，该细胞是体细胞。
通常，本文披露的通用供体细胞能够分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞。在一些实施例中，这些谱系限制性祖细胞是胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、间充质祖细胞、肌肉祖细胞、母细胞、造血祖细胞或神经祖细胞，并且这些完全分化体细胞是内分泌分泌细胞，诸如胰腺β细胞、上皮细胞、内胚层细胞、巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、血细胞或免疫系统细胞。在一些实施例中，这些完全分化体细胞是心肌细胞。
本披露的另一方面提供了用于治疗有需要的受试者的方法，其中该方法包括获得或已经获得分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞后的如本文披露的通用供体细胞，以及向该受试者施用这些谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞。还提供了获得用于向有需要的受试者施用的细胞的方法，该方法包括获得或已经获得如本文披露的通用供体细胞，以及在足以使这些细胞分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞的时间和条件下维持这些通用供体细胞。在一些实施例中，该受试者是患有疾病、怀疑患有疾病或有疾病风险的人。在一些实施例中，该疾病是在遗传上可遗传的疾病。
本发明的另一方面涵盖靶向选自SEQ ID NO:15-24或45-54的多核苷酸序列的gRNA。
虽然本披露易有多种修饰和替代形式，但其具体的实施例在附图中通过举例的方式显示并将在本文中详细描述。然而，应该理解的是，本文给出的附图和具体实施方式并非旨在将本披露限制于所披露的特定实施例，而是恰恰相反，其旨在覆盖落入如由所附权利要求限定的本披露的精神和范围内的所有修饰、等同物和替代物。
参考附图，在下文的本发明的实施例的具体实施方式中，本披露的其他特征和优点将变得清楚。
附图说明
图1示出了CyT49细胞中B2M gRNA切割的TIDE分析。测试了B2M-1、B2M-2和B2M-3gRNA。
图2A-2B示出了在WT CyT49细胞(图2A)和B2M KO CyT49细胞(图2B)中在使用和不使用IFN-γ的情况下B2M表达的流式细胞术评估。
图3示出了用于HDR的B2M-CAGGS-PD-L1供体载体的质粒图谱。
图4示出了对B2M KO/PD-L1 KI CyT49干细胞的多能性的流式细胞术分析。衍生出的克隆针对OCT4和SOX2(对于多能性至关重要的两种转录因子)呈>99％双阳性。使用IgG作为阴性对照。
图5A-5B示出了WT CyT49(图5A)和B2M KO/PD-L1KI(图5B)衍生的干细胞克隆的流式细胞术分析。WT细胞响应于IFNγ上调B2M表达。B2M KO/PD-L1 KI克隆完全表达PD-L1，并且在使用或不使用IFNγ处理的情况下均不表达B2M。NT-1＝未处理。INTG-1＝50ng/mL IFNγ处理48小时的细胞。
图6示出了在从野生型CyT49、PD-L1 KI/B2M KO或B2M KO CyT49细胞分化的第1阶段(定形内胚层)细胞中FOXA2和SOX17的流式细胞术。
图7示出了在从野生型、PD-L1 KI/B2M KO或B2M KO细胞分化的第1阶段(定形内胚层)细胞中FOXA2和SOX17表达的定量百分比。
图8示出了在从野生型、PD-L1 KI/B2M KO或B2M KO细胞分化的第4阶段(PEC)细胞中CHGA、PDX1和NKX6.1表达的定量百分比。
图9示出了在第4阶段(PEC)的异质细胞群。
图10示出了从野生型、PD-L1 KI/B2M KO或B2M KO细胞分化的细胞在分化时程中的所选择的基因表达。
图11A-11F示出了从野生型、PD-L1 KI/B2M KO或B2M KO细胞分化的细胞在分化时程中的所选择的基因表达。图11A示出了在野生型细胞中的B2M表达。图11B示出了在B2M KO细胞中的B2M表达。图11C示出了在PD-L1 KI/B2M KO细胞中的B2M表达。图11D示出了在野生型细胞中的PD-L1表达。图11E示出了在B2M KO细胞中的PD-L1表达。图11F示出了在PD-L1KI/B2M KO细胞中的PD-L1表达。
图12A-12F示出了在从野生型、PD-L1 KI/B2M KO或B2M KO细胞分化的细胞中在PEC阶段的MHC I类和II类表达。图12A示出了在野生型细胞中的MHC I类表达。图12B示出了在B2M KO细胞中的MHC I类表达。图12C示出了在PD-L1 KI/B2M KO细胞中的MHC I类表达。图12D示出了在野生型细胞中的MHC II类PD-L1表达。图12E示出了在B2M KO细胞中的MHCII类表达。图12F示出了在PD-L1 KI/B2M KO细胞中的MHC II类表达
图13示出了TC1133 hiPSC中TXNIP gRNA切割的TIDE分析。引导T5似乎在外显子1处的切割是最佳的。
图14示出了用于HDR的TXNIP-CAGGS-HLA-E供体载体的质粒图谱。
图15示出了对B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI CyT49干细胞的多能性的流式细胞术分析。衍生出的克隆针对OCT4和SOX2(对于多能性至关重要的两种转录因子)呈>99％双阳性。这些克隆也不表达B2M。这些克隆不表达MHC-I。
图16示出了对B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI CyT49干细胞的多能性的流式细胞术分析。衍生出的克隆在分化至第6阶段(未成熟β细胞)后表达PD-L1和HLA-E。使用IgG作为阴性对照。
图17示出了在从野生型、B2M KO、PD-L1 KI/B2M KO(V1A)或TXNIP KO/HLA-E KI(V1B)hESC分化的第4阶段(PEC)细胞中CHGA、PDX1和NKX6.1表达的定量百分比。
图18A-18B示出了TXNIP KO细胞(图18A)或TXNIP KO/HLA-E KI(V1B)(图18B)细胞在分化时程中的所选择的基因表达。
图19A-19B示出了使用CFSE增殖测定对T细胞激活的流式细胞术分析。将人原代CD3+T细胞与衍生自WT、B2M KO、B2M KO/PD-L1 KI或B2M KO/PD-L1 KI+TXNIP KO/HLA-E KICyT49克隆的PEC共孵育(图19A)。图19B汇总了在各种细胞中的T细胞激活。以“单独CFSE-T”集作为对照进行的单因素方差分析(α＝0.05，使用邓尼特(Dunnett's)多重比较检验)。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。n.s.＝不显著。
图20示出了从TXNIP KO细胞分化的细胞在分化时程中的所选择的基因表达。
图21示出了从TXNIP KO细胞分化的PEC细胞中PDX1和NKX6.1表达的流式细胞术评估。
图22示出了与野生型(“WT”)和非切割向导对照(“NCG#1”)细胞相比在分化至第6阶段后的各种B2M KO/PD-L1KI和TXNIP KO/HLA-E KI克隆(“S6-V1B-H9”、“S6-V1B-3B11”、“S6-V1B-1G7”和“S6-V1B-3C2”)的形态学。
图23A-23F示出了在分化至第6阶段后克隆的所选择的基因表达。图23A示出了从示例性B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI克隆分化的细胞在分化时程中的所选择的基因表达。图23B-23F示出了在分化至第6阶段的野生型细胞(“S6-Cyt49 WT”)、非切割向导对照(“S6-NCG#1”)细胞以及各种B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI克隆(“S6-V1B-H9”、“S6-V1B-3B11”、“S6-V1B-1G7”和“S6-V1B-3C2”)中INS(图23B)、NKX6.1(图23C)、GCG(图23D)、SST(图23E)和GCK(图23F)的基因表达，其中未分化的B2M KO/PD-L1 KI和TXNIPKO/HLA-E KI克隆(“ES-V1B-H9”)和野生型胰岛(“胰岛”)作为对照。
图24A-24B示出了从B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI克隆分化的第6阶段细胞中INS和GCG表达(图24A)以及INS和NKX6.1表达(图24B)的流式细胞术评估。
图25A-25B示出了从野生型细胞(“S6-WT”)、非切割向导对照细胞(“S6-NCG#1”)和两种B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI克隆(“S6-V1B003”和“V1B-H9”)分化的第6阶段细胞中INS表达(图25A)和NKX6.1表达(图25B)的百分比。
图26A示出了从具有不同接种密度的克隆1(B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-EKI)细胞分化的第4阶段细胞中PDX1和NKX6.1表达的流式细胞术评估。
图26B示出了从克隆1(B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI)细胞分化的第4阶段细胞中PD-L1和HLA-E表达的流式细胞术评估。
图27A-27C示出了分化至PEC阶段的种子克隆的特征分析。图27A示出了形态学，图27B示出了在分化时程中的所选择的基因表达，并且图27C示出了分化群体中表达CHGA-/NKX6.1+/PDX1+的细胞的百分比。
图28示出了从TXNIP KO/HLA-E KI克隆分化的细胞在分化时程中的所选择的基因表达。
具体实施方式
I.定义
缺失：如本文所用，可以与术语“遗传缺失”或“敲除”互换使用的术语“缺失”通常是指以下遗传修饰，其中通过任何分子生物学方法，例如本文所述的方法，例如通过将内切核酸酶和至少一种gRNA递送至基因组DNA的位点来去除基因组DNA的位点或区域。可以缺失任何数量的核苷酸。在一些实施例中，缺失涉及去除至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少十个、至少十五个、至少二十个或至少25个核苷酸。在一些实施例中，缺失涉及去除10-50、25-75、50-100、50-200或超过100个核苷酸。在一些实施例中，缺失涉及去除整个靶基因，例如B2M基因。在一些实施例中，缺失涉及去除靶基因的一部分，例如B2M基因的启动子和/或编码序列的全部或一部分。在一些实施例中，缺失涉及去除靶基因的转录调控因子，例如启动子区。在一些实施例中，缺失涉及去除编码区的全部或一部分，使得通常由编码区表达的产物不再表达、表达为截短形式或以降低的水平表达。在一些实施例中，缺失导致基因的表达相对于未经修饰的细胞减少。
内切核酸酶：如本文所用，术语“内切核酸酶”通常是指切割多核苷酸内的磷酸二酯键的酶。在一些实施例中，内切核酸酶特异性切割DNA多核苷酸内的磷酸二酯键。在一些实施例中，内切核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢内切核酸酶(HE)、大范围核酸酶、MegaTAL或CRISPR相关内切核酸酶。在一些实施例中，内切核酸酶是RNA引导的内切核酸酶。在某些方面，RNA引导的内切核酸酶是CRISPR核酸酶，例如II型CRISPR Cas9内切核酸酶或V型CRISPR Cpf1内切核酸酶。在一些实施例中，内切核酸酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1内切核酸酶、或其同源物、其天然存在的分子的重组、其密码子优化型式或其修饰型式、或其组合。在一些实施例中，内切核酸酶可以将一个或多个单链断裂(SSB)和/或一个或多个双链断裂(DSB)引入。
遗传修饰：如本文所用，术语“遗传修饰”通常是指已经使用任何分子生物学方法，例如本文所述的方法，例如通过将内切核酸酶和至少一种gRNA递送至基因组DNA的位点进行遗传编辑或操纵的基因组DNA位点。示例性遗传修饰包括插入、缺失、重复、倒位和易位及其组合。在一些实施例中，遗传修饰是缺失。在一些实施例中，遗传修饰是插入。在其他实施例中，遗传修饰是插入-缺失突变(或插缺(indel))，使得靶基因的阅读框移位，从而导致基因产物改变或无基因产物。
引导RNA(gRNA)：如本文所用，术语“引导RNA”或“gRNA”通常是指可以与内切核酸酶相互作用，例如与内切核酸酶结合，并且与靶基因组位点或区域结合或杂交的短核糖核酸。在一些实施例中，gRNA是单分子引导RNA(sgRNA)。在一些实施例中，gRNA可以包含间隔子延伸区。在一些实施例中，gRNA可以包含tracrRNA延伸区。在一些实施例中，gRNA是单链的。在一些实施例中，gRNA包含天然存在的核苷酸。在一些实施例中，gRNA是经化学修饰的gRNA。在一些实施例中，经化学修饰的gRNA是包含具有化学修饰(例如，2′-O-甲基糖修饰)的至少一个核苷酸的gRNA。在一些实施例中，经化学修饰的gRNA包含经修饰的核酸骨架。在一些实施例中，经化学修饰的gRNA包含2'-O-甲基-硫代磷酸酯残基。在一些实施例中，gRNA可以与DNA内切核酸酶预复合。
插入：如本文所用，可以与术语“遗传插入”或“敲入”互换使用的术语“插入”通常是指以下遗传修饰，其中通过任何分子生物学方法，例如本文所述的方法，例如通过将内切核酸酶和至少一种gRNA递送至基因组DNA的位点来将多核苷酸引入或添加至基因组DNA的位点或区域中。在一些实施例中，插入可以发生在基因组DNA的已经是先前遗传修饰(例如，缺失或插入-缺失突变)的位点的位点内或附近。在一些实施例中，插入发生在基因组DNA的与先前遗传修饰(例如，缺失或插入-缺失突变)的位点部分重叠、完全重叠或包含在该先前遗传修饰的位点内的位点处。在一些实施例中，插入发生在安全港基因座处。在一些实施例中，插入涉及将编码目的蛋白的多核苷酸引入。在一些实施例中，插入涉及引入编码致耐受性因子的多核苷酸。在一些实施例中，插入涉及引入编码存活因子的多核苷酸。在一些实施例中，插入涉及引入外源启动子，例如组成型启动子(例如，CAG启动子)。在一些实施例中，插入涉及引入编码非编码基因的多核苷酸。通常，待插入的多核苷酸侧接有与插入位点处或附近的基因组DNA具有显著的序列同源性的序列(例如，同源臂)。
主要组织相容性复合体I类(MHC-I)：如本文所用，术语“主要组织相容性复合体I类”或“MHC-I”通常是指这样的一类生物分子，该类生物分子在脊椎动物(包括哺乳动物，例如人)中的所有有核细胞的细胞表面上发现；并且功能是从细胞内(即细胞溶质)向细胞毒性T细胞(例如，CD8+T细胞)展示非自身或外来抗原(例如，蛋白)的肽，以便刺激免疫应答。在一些实施例中，MHC-I生物分子是MHC-I基因或MHC-I蛋白。MHC-I蛋白与β-2微球蛋白(B2M)的复合是所有MHC-I蛋白的细胞表面表达所需的。在一些实施例中，相对于未经修饰的细胞减少MHC-I人白细胞抗原(HLA)的表达涉及MHC-I基因表达的减少(或降低)。在一些实施例中，相对于未经修饰的细胞减少MHC-I人白细胞抗原(HLA)的表达涉及MHC-I蛋白的细胞表面表达的减少(或降低)。在一些实施例中，MHC-I生物分子是HLA-A(NCBI基因ID号：3105)、HLA-B(NCBI基因ID号：3106)、HLA-C(NCBI基因ID号：3107)或B2M(NCBI基因ID号：567)。
主要组织相容性复合体II类(MHC-II)：如本文所用，术语“主要组织相容性复合体II类”或“MHC-II”通常是指这样的一类生物分子，该类生物分子通常在脊椎动物(包括哺乳动物，例如人)中的抗原呈递细胞的细胞表面上发现；并且功能是从细胞的外部(细胞外)向细胞毒性T细胞(例如，CD8+T细胞)展示非自身或外来抗原(例如，蛋白)的肽，以便刺激免疫应答。在一些实施例中，抗原呈递细胞是树突细胞、巨噬细胞或B细胞。在一些实施例中，MHC-II生物分子是MHC-II基因或MHC-II蛋白。在一些实施例中，相对于未经修饰的细胞减少MHC-II人白细胞抗原(HLA)的表达涉及MHC-II基因表达的减少(或降低)。在一些实施例中，相对于未经修饰的细胞减少MHC-II人白细胞抗原(HLA)的表达涉及MHC-II蛋白的细胞表面表达的减少(或降低)。在一些实施例中，MHC-II生物分子是HLA-DPA(NCBI基因ID号：3113)、HLA-DPB(NCBI基因ID号：3115)、HLA-DMA(NCBI基因ID号：3108)、HLA-DMB(NCBI基因ID号：3109)、HLA-DOA(NCBI基因ID号：3111)、HLA-DOB(NCBI基因ID号：3112)、HLA-DQA(NCBI基因ID号：3117)、HLA-DQB(NCBI基因ID号：3119)、HLA-DRA(NCBI基因ID号：3122)或HLA-DRB(NCBI基因ID号：3123)。
多核苷酸：如本文所用，可以与术语“核酸”互换使用的术语“多核苷酸”通常是指包含两个或更多个核苷酸的生物分子。在一些实施例中，多核苷酸包含至少两个、至少五个、至少十个、至少二十个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少250个、至少500个或任何数量的核苷酸。例如，多核苷酸可包括至少500个核苷酸、至少约600个核苷酸、至少约700个核苷酸、至少约800个核苷酸、至少约900个核苷酸、至少约1000个核苷酸、至少约2000个核苷酸、至少约3000个核苷酸、至少约4000个核苷酸、至少约4500个核苷酸或至少约5000个核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA分子或杂合DNA/RNA分子。多核苷酸可以是单链的或双链的。在一些实施例中，多核苷酸是基因组DNA的位点或区域。在一些实施例中，多核苷酸是包含在未经修饰的细胞或通用供体细胞的基因组内的内源基因。在一些实施例中，多核苷酸是未整合到基因组DNA中的外源多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是整合到基因组DNA中的外源多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是质粒或腺相关病毒载体。在一些实施例中，多核苷酸是环状或线性分子。
安全港基因座：如本文所用，术语“安全港基因座”通常是指基因组DNA的这样的任何位置、位点或区域，该位置、位点或区域可以能够容纳向所述位置、位点或区域中的遗传插入而对细胞没有不利影响。在一些实施例中，安全港基因座是基因内或基因外区域。在一些实施例中，安全港基因座是基因组DNA的通常转录沉默的区域。在一些实施例中，安全港基因座是AAVS1(PPP1 R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF或TTR基因座。在一些实施例中，安全港基因座描述于Sadelain,M.等人,“Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome[用于在人类基因组中整合新DNA的安全港],”Nature Reviews Cancer[自然·癌症评论],2012,第12卷,第51-58页。
安全开关：如本文所用，术语“安全开关”通常是指导致细胞经历凋亡的生物分子。在一些实施例中，安全开关是蛋白或基因。在一些实施例中，安全开关是自杀基因。在一些实施例中，安全开关(例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk))通过代谢前药(例如，更昔洛韦)导致细胞经历凋亡。在一些实施例中，安全开关的过表达存在独自导致细胞经历凋亡。在一些实施例中，安全开关是基于p53的分子、HSV-tk或诱导型半胱天冬酶-9。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物。在一些实施例中，受试者是非人灵长类动物或啮齿动物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者患有疾病或障碍、怀疑患有疾病或障碍或有疾病或障碍风险。在一些实施例中，受试者具有疾病或障碍的一种或多种症状。
存活因子：如本文所用，术语“存活因子”通常是指这样的蛋白(例如，由如本文所述的多核苷酸表达)，该蛋白当在细胞中增加或减少时使得细胞(例如，通用供体细胞)在移植或植入宿主受试者中后能够以相对于未经修饰的细胞更高的存活率存活。在一些实施例中，存活因子是人存活因子。在一些实施例中，存活因子是参与细胞存活的关键途径的成员。在一些实施例中，参与细胞存活的关键途径与缺氧、活性氧、营养剥夺和/或氧化应激有关系。在一些实施例中，至少一种存活因子的遗传修饰(例如，缺失或插入)使得通用供体细胞在植入后能够存活比未经修饰的细胞更长的时间段，例如长至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍的时间段。在一些实施例中，存活因子是ZNF143(NCBI基因ID号：7702)、TXNIP(NCBI基因ID号：10628)、FOXO1(NCBI基因ID号：2308)、JNK(NCBI基因ID号：5599)或MANF(NCBI基因ID号：7873)。在一些实施例中，将存活因子插入细胞(例如，通用供体细胞)中。在一些实施例中，将存活因子从细胞(例如，通用供体细胞)中缺失。在一些实施例中，编码MANF的多核苷酸的插入使得细胞(例如，通用供体细胞)在移植或植入宿主受试者中后能够以相对于未经修饰的细胞更高的存活率存活。在一些实施例中，ZNF143、TXNIP、FOXO1或JNK基因内或附近的缺失或插入-缺失突变使得细胞(例如，通用供体细胞)在移植或植入宿主受试者中后能够以相对于未经修饰的细胞更高的存活率存活。
致耐受性因子：如本文所用，术语“致耐受性因子”通常是指这样的蛋白(例如，由如本文所述的多核苷酸表达)，该蛋白当在细胞中增加或减少时使得细胞(例如，通用供体细胞)在移植或植入宿主受试者中后能够以相对于未经修饰的细胞更高的比率抑制或逃避免疫排斥。在一些实施例中，致耐受性因子是人致耐受性因子。在一些实施例中，至少一种致耐受性因子的遗传修饰(例如，至少一种致耐受性因子的插入或缺失)使得细胞(例如，通用供体细胞)在植入后能够以比未经修饰的细胞高至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍的比率抑制或逃避免疫排斥。在一些实施例中，致耐受性因子是HLA-E(NCBI基因ID号：3133)、HLA-G(NCBI基因ID号：3135)、CTLA-4(NCBI基因ID号：1493)、CD47(NCBI基因ID号：961)或PD-L1(NCBI基因ID号：29126)。在一些实施例中，将致耐受性因子插入细胞(例如，通用供体细胞)中。在一些实施例中，将致耐受性因子从细胞(例如，通用供体细胞)中缺失。在一些实施例中，编码HLA-E、HLA-G、CTLA-4、CD47和/或PD-L1的多核苷酸的插入使得细胞(例如，通用供体细胞)在移植或植入宿主受试者中后能够抑制或逃避免疫排斥。
MHC-I或MHC-II的转录调控因子：如本文所用，术语“MHC-I或MHC-II的转录调控因子”通常是指调控(例如，增加或减少)MHC-I和/或MHC-II人白细胞抗原的表达的生物分子。在一些实施例中，生物分子是多核苷酸(例如，基因)或蛋白。在一些实施例中，MHC-I或MHC-II的转录调控因子将增加或减少至少一种MHC-I或MHC-II蛋白的细胞表面表达。在一些实施例中，MHC-I或MHC-II的转录调控因子将增加或减少至少一种MHC-I或MHC-II基因的表达。在一些实施例中，转录调控因子是CIITA(NCBI基因ID号：4261)或NLRC5(NCBI基因ID号：84166)。在一些实施例中，CIITA或NLRC5表达的缺失或降低减少了至少一种MHC-I或MHC-II基因的表达。
通用供体细胞：如本文所用，术语“通用供体细胞”通常是指相对于未经修饰的细胞，在细胞移植过程中较不易发生同种异体排斥和/或在移植后展示出增加的存活的经遗传修饰的细胞。在一些实施例中，如本文所述的经遗传修饰的细胞是通用供体细胞。在一些实施例中，与未经修饰的细胞相比，通用供体细胞具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。在一些实施例中，与未经修饰的细胞相比，通用供体细胞具有增加的细胞存活。在一些实施例中，通用供体细胞可以是干细胞。在一些实施例中，通用供体细胞可以是胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞(ASC)、诱导多能干细胞(iPSC)或造血干细胞或祖细胞(HSPC)(也称为造血干细胞(HSC))。在一些实施例中，通用供体细胞可以是分化细胞。在一些实施例中，通用供体细胞可以是体细胞(例如，免疫系统细胞)。在一些实施例中，将通用供体细胞施用至受试者。在一些实施例中，将通用供体细胞施用至患有疾病、怀疑患有疾病或有疾病风险的受试者。在一些实施例中，通用供体细胞能够分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞。在一些实施例中，谱系限制性祖细胞是胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、间充质祖细胞、肌肉祖细胞、母细胞、造血祖细胞或神经祖细胞。在一些实施例中，完全分化体细胞是内分泌细胞如胰腺β细胞、上皮细胞、内胚层细胞、巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、血细胞或免疫系统细胞。在一些实施例中，这些完全分化体细胞是心肌细胞。
未经修饰的细胞：如本文所用，术语“未经修饰的细胞”是指尚未经受涉及编码MHC-I、MHC-I、MHC-I或MHC-II的转录调控因子、存活因子和/或致耐受性因子的多核苷酸或基因的遗传修饰的细胞。在一些实施例中，未经修饰的细胞可以是干细胞。在一些实施例中，未经修饰的细胞可以是胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞(ASC)、诱导多能干细胞(iPSC)或造血干细胞或祖细胞(HSPC)(也称为造血干细胞(HSC))。在一些实施例中，未经修饰的细胞可以是分化细胞。在一些实施例中，未经修饰的细胞可以选自体细胞(例如，免疫系统细胞，例如T细胞，例如CD8+T细胞)。如果将通用供体细胞“相对于未经修饰的细胞”进行比较，则该通用供体细胞和该未经修饰的细胞是相同的细胞类型或具有共同的亲本细胞系，例如，将通用供体iPSC相对于未经修饰的iPSC进行比较。
在基因内或附近：如本文所用，术语“在基因内或附近”是指基因组DNA的作为所述基因的内含子或外显子组分或位于所述基因近侧的位点或区域。在一些实施例中，如果基因组DNA的位点包含基因的内含子或外显子的至少一部分，则该基因组DNA的位点在所述基因内。在一些实施例中，基因组DNA的位于基因附近的位点可以在所述基因的5’或3’端(例如，所述基因的编码区的5’或3’端)。在一些实施例中，基因组DNA的位于基因附近的位点可以是调控所述基因的表达的启动子区或阻遏子区。在一些实施例中，基因组DNA的位于基因附近的位点可以与所述基因在同一染色体上。在一些实施例中，如果基因组DNA的位点或区域在基因的5’或3’端(例如，所述基因的编码区的5’或3’端)的50Kb、40Kb、30Kb、20Kb、10Kb、5Kb、1Kb内或更接近，则该基因组DNA的位点或区域在所述基因附近。
II.基因组编辑方法
基因组编辑通常是指优选以精确或预定的方式修饰基因组核苷酸序列的过程。在一些实施例中，如本文所述的基因组编辑方法(例如，CRISPR-内切核酸酶系统)可以用于如本文所述的对细胞进行遗传修饰，例如以产生通用供体细胞。在一些实施例中，如本文所述的基因组编辑方法(例如，CRISPR-内切核酸酶系统)可以用于如本文所述的对细胞进行遗传修饰，例如以在至少一种基因内或附近引入相对于未经修饰的细胞减少一种或多种MHC-I和/或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的其他组分的表达的至少一种遗传修饰；以引入相对于未经修饰的细胞增加编码致耐受性因子的至少一种多核苷酸的表达的至少一种遗传修饰；和/或以引入相对于未经修饰的细胞增加或减少编码存活因子的至少一种基因的表达的至少一种遗传修饰。
本文所述的基因组编辑方法的实例包括使用定点核酸酶在基因组中的精确靶位置处切割脱氧核糖核酸(DNA)，从而在基因组内的特定位置处产生单链或双链DNA断裂的方法。此类断裂可以且有规律地通过天然的内源细胞过程(如同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ))进行修复，如在Cox等人,“Therapeutic genome editing:prospects andchallenges[治疗性基因组编辑：前景与挑战],”,Nature Medicine[自然·医学],2015,21(2),121-31中所述的。这两个主要的DNA修复过程由一系列替代途径组成。NHEJ直接连接由于双链断裂而产生的DNA末端，有时会丢失或添加核苷酸序列，这可以破坏或增强基因表达。HDR利用同源序列或供体序列作为模板，以在断点处插入确定的DNA序列。同源序列可以在内源基因组(如姐妹染色单体)中。替代性地，供体序列可以是外源多核苷酸，如质粒、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、双链体寡核苷酸或病毒，该外源多核苷酸具有与核酸酶裂解的基因座有高度同源性的区域(例如，左同源臂和右同源臂)，但是还可以含有另外的序列或序列变化(包括可掺入经裂解的靶基因座中的缺失)。第三种修复机制可以是微同源介导的末端连接(MMEJ)，也称为“替代NHEJ”，其遗传结果与NHEJ相似，因为在切割位点可以发生小的缺失和插入。MMEJ可以利用侧翼于DNA断裂位点的几个碱基对的同源序列来驱动更有利的DNA末端连接修复结果，并且最近的报道进一步阐明了此过程的分子机制；参见例如Cho和Greenberg,Nature[自然],2015,518,174-76；Kent等人,Nature Structural andMolecular Biology[自然·结构与分子生物学],2015,22(3):230-7；Mateos-Gomez等人,Nature[自然],2015,518,254-57；Ceccaldi等人,Nature[自然],2015,528,258-62。在一些情况下，可以基于对DNA断裂位点处潜在的微同源性的分析来预测可能的修复结果。
这些基因组编辑机制中的每一个均可以用于产生所需的遗传修饰。基因组编辑过程中的一个步骤可以是在预期突变位点的附近的靶基因座中产生一个或两个DNA断裂，后者为双链断裂或两个单链断裂。如本文所述和所示，这可以通过使用内切核酸酶来实现。
CRISPR内切核酸酶系统
CRISPR-内切核酸酶系统是原核生物中天然存在的防御机制，该防御机制已被重新用作用于基因编辑的RNA引导的DNA靶向平台。CRISPR系统包括I、II、III、IV、V和VI型系统。在一些方面，CRISPR系统是II型CRISPR/Cas9系统。在其他方面，CRISPR系统是V型CRISPR/Cprf系统。CRISPR系统依赖于DNA内切核酸酶(例如，Cas9)和两种非编码RNA(crisprRNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA))来靶向DNA的裂解。
crRNA通过通常与靶DNA中的约20个核苷酸(nt)序列的沃森-克里克碱基配对来驱动CRISPR-内切核酸酶复合体的序列识别和特异性。改变crRNA中5’20nt的序列允许将CRISPR-内切核酸酶复合体靶向特定基因座。如果靶序列后面是特定的短DNA基序(序列为NGG)(称为原型间隔子相邻基序(PAM))，则CRISPR-内切核酸酶复合体仅结合含有与单引导RNA(sgRNA)的前20nt序列匹配的DNA序列。
TracrRNA与crRNA的3’端杂交以形成RNA双链体结构，该双链体结构与内切核酸酶结合以形成具有催化活性的CRISPR-内切核酸酶复合体，该复合体然后可以切割靶DNA。
一旦CRISPR-内切核酸酶复合体在靶位点处与DNA结合，内切核酸酶内的两个独立的核酸酶结构域便各自在PAM位点上游三个碱基处切割DNA链之一，从而留下双链断裂(DSB)，在这里DNA的两条链以碱基对(平末端)终止。
在一些实施例中，内切核酸酶是Cas9(CRISPR相关蛋白9)。在一些实施例中，Cas9内切核酸酶来自酿脓链球菌，但是可以使用其他Cas9同源物，例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)Cas9、嗜热链球菌(S.thermophilus)CRISPR l Cas9、嗜热链球菌CRISPR 3Cas9或齿垢密螺旋体(T.denticola)Cas9。在其他情况下，CRISPR内切核酸酶是Cpf1，例如毛螺旋菌科细菌(L.bacterium)ND2006 Cpfl或氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)BV3L6 Cpfl。在一些实施例中，内切核酸酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1内切核酸酶。在一些实施例中，可以使用野生型变体。在一些实施例中，可以使用前述内切核酸酶的修饰形式(例如，其同源物、其天然存在的分子的重组、其密码子优化或其修饰形式)。
CRISPR核酸酶可以连接到至少一个核定位信号(NLS)。该至少一个NLS可以位于CRISPR核酸酶的氨基末端的50个氨基酸处或内，和/或至少一个NLS可以位于CRISPR核酸酶的羧基末端的50个氨基酸处或内。
示例性CRISPR/Cas多肽包括如Fonfara等人,“Phylogeny of Cas9 determinesfunctional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type IICRISPR-Cas systems[Cas9的系统发育决定了双RNA和Cas9在直系同源II型CRISPR-Cas系统中的功能可交换性],”Nucleic Acids Research[核酸研究],2014,42:2577-2590中公开的Cas9多肽。自从发现Cas基因以来，CRISPR/Cas基因命名系统已经进行了广泛的重写。Fonfara等人还提供了来自各种物种的Cas9多肽的PAM序列。
锌指核酸酶
锌指核酸酶(ZFN)是模块化蛋白，由与II型内切核酸酶FokI的催化结构域连接的经工程化的锌指DNA结合结构域构成。由于FokI仅作为二聚体起作用，因此必须对一对ZFN进行工程化以使其与相反DNA链上的同源靶“半位点”序列结合，并且它们之间的精确间隔使得能够形成具有催化活性的FokI二聚体。在本身没有序列特异性的FokI结构域的二聚化之后，ZFN半位点之间会产生DNA双链断裂，作为基因组编辑的起始步骤。
每个ZFN的DNA结合结构域通常由丰富的Cys2-His2架构的3-6个锌指构成，每个指主要识别靶DNA序列的一条链上的核苷酸三联体，尽管与第四个核苷酸的跨链相互作用也可能很重要。与DNA进行关键接触的位置中的指的氨基酸的改变会改变给定指的序列特异性。因此，四指锌指蛋白将选择性识别12bp的靶序列，其中该靶序列是每个指贡献的三联体偏好的合成物，但是三联体偏好可能会不同程度受到相邻指的影响。ZFN的一个重要方面在于，只需修饰单个指即可轻松将ZFN重新靶向至几乎任何基因组地址。在ZFN的大多数应用中，使用4-6指的蛋白，分别识别12-18bp。因此，一对ZFN通常将识别24-36bp的组合靶序列(不包括半位点之间的典型5-7bp间隔子)。结合位点可以用更大的间隔子(包括15-17bp)进一步隔开。假设在设计过程中排除了重复序列或基因同源物，则该长度的靶序列在人类基因组中可能是唯一的。然而，ZFN蛋白-DNA相互作用在其特异性上并不是绝对的，因此脱靶结合和切割事件的确会发生，要么是两个ZFN之间的异二聚体，要么是ZFN中的一个或另一个的同二聚体。通过对FokI结构域的二聚化界面进行工程化以产生“正”和“负”变体(也称为专性异二聚体变体，它们只可以与彼此二聚化，而不可以与自身二聚化)，有效地消除了后者的可能性。促成专性异二聚体阻止了同二聚体的形成。这大大提高了ZFN以及采用这些FokI变体的任何其他核酸酶的特异性。
在本领域中已经描述了多种基于ZFN的系统，定期报告其修改，并且大量参考文献描述了用于指导ZFN设计的规则和参数；参见例如Segal等人,Proc Natl Acad Sci[美国国家科学院院刊],1999 96(6):2758-63；Dreier B等人,J Mol Biol.[分子生物学杂志],2000,303(4):489-502；Liu Q等人,J Biol Chem.[生物化学杂志],2002,277(6):3850-6；Dreier等人,J Biol Chem.[生物化学杂志],2005,280(42):35588-97；以及Dreier等人,JBiol Chem.[生物化学杂志]2001,276(31):29466-78。
转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)
TALEN代表模块化核酸酶的另一种形式，其中与ZFN一样，经工程化的DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域连接，并且一对TALEN串联作用以实现靶向DNA切割。与ZFN的主要区别在于DNA结合结构域的性质以及相关的靶DNA序列识别特性。TALEN DNA结合结构域源自TALE蛋白，这些蛋白最初在植物细菌病原体黄单胞菌属物种(Xanthomonas sp.)中有描述。TALE由33-35个氨基酸重复序列的串联阵列组成，每个重复序列识别靶DNA序列中的单个碱基对，该序列通常长达20bp，从而使总靶序列长度达到40bp。通过重复可变双残基(RVD)确定每个重复序列的核苷酸特异性，该重复可变双残基仅在位置12和13处包括两个氨基酸。鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱基主要被四个RVD识别：分别为Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp和Asn-Gly。这构成了比锌指要简单得多的识别码，因此在核酸酶设计方面比锌指具有优势。然而，与ZFN一样，TALEN的蛋白-DNA相互作用在其特异性上也不是绝对的，并且TALEN还受益于使用FokI结构域的专性异二聚体变体来降低脱靶活性。
已经产生了在其催化功能方面失活的FokI结构域的另外的变体。如果TALEN或ZFN对中的一半含有失活的FokI结构域，则在靶位点处只会发生单链DNA切割(产生切口)，而不会发生DSB。其结果与使用CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1“切口酶”突变体(其中Cas9切割结构域之一已失活)相当。DNA切口可以用于驱动通过HDR进行基因组编辑，但是效率要比DSB低。与DSB不同，主要益处在于脱靶切口被快速而准确地修复，而DSB容易受到NHEJ介导的错误修复。
在本领域中已经描述了多种基于TALEN的系统，并且定期报告其修改；参见例如Boch,Science[科学],2009 326(5959):1509-12；Mak等人,Science[科学],2012,335(6069):716-9；以及Moscou等人,Science[科学],2009,326(5959):1501。已经有多个小组描述了基于“金门(Golden Gate)”平台或克隆方案的TALEN的使用；参见例如Cermak等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],2011,39(12):e82；Li等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],2011,39(14):6315-25；Weber等人,PLoS One.[公共科学图书馆·综合],2011,6(2):e16765；Wang等人,J Genet Genomics[遗传学与基因组学杂志],2014,41(6):339-47.；以及Cermak T等人,Methods Mol Biol.[分子生物学方法],2015 1239:133-59。
归巢内切核酸酶
归巢内切核酸酶(HE)是具有长的识别序列(14-44个碱基对)并且通常在基因组中唯一的位点处以高特异性切割DNA的序列特异性内切核酸酶。至少有六个按其结构分类的已知HE家族，包括GIY-YIG、His-Cis框、H-N-H、PD-(D/E)xK和类Vsr，它们源自多种宿主，包括真核生物、原生生物、细菌、古细菌、蓝细菌和噬菌体。与ZFN和TALEN一样，HE可以用于在靶基因座处产生DSB，作为基因组编辑的起始步骤。另外，一些天然的和经工程化的HE仅切割DNA的单链，从而作为位点特异性切口酶起作用。HE的较大的靶序列以及HE提供的特异性使它们成为产生位点特异性DSB的有吸引力的候选物。
在本领域中已经描述了多种基于HE的系统，并且定期报告其修改；参见例如以下文献的综述：Steentoft等人,Glycobiology[糖生物学],2014,24(8):663-80；Belfort和Bonocora,Methods Mol Biol.[分子生物学方法],2014,1123:1-26；以及Hafez和Hausner,Genome[基因组],2012,55(8):553-69。
MegaTAL/Tev-mTALEN/MegaTev
作为杂合核酸酶另外的实例，MegaTAL平台和Tev-mTALEN平台利用TALE DNA结合结构域和具有催化活性的HE的融合，同时利用TALE的可调DNA结合和特异性两者、以及HE的切割序列特异性；参见例如Boissel等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],2014,42:2591-2601；Kleinstiver等人,G3,2014,4:1155-65；以及Boissel和Scharenberg,MethodsMol.Biol.[分子生物学方法],2015,1239:171-96。
在另一种变型中，MegaTev架构是大范围核酸酶(Mega)与源自GIY-YIG归巢内切核酸酶I-TevI(Tev)的核酸酶结构域的融合。这两个活性位点在DNA底物上相距约30bp，并产生两个具有不相容粘性末端的DSB；参见例如Wolfs等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],2014,42,8816-29。可以预见，现有基于核酸酶的方法的其他组合将会发展，并可用于实现本文所述的靶向基因组修饰。dCas9-FokI或dCpf1-Fok1和其他核酸酶
结合上述核酸酶平台的结构和功能特性提供了一种另外的基因组编辑的方法，该方法可能克服一些固有缺陷。例如，CRISPR基因组编辑系统通常使用单一Cas9内切核酸酶产生DSB。靶向的特异性由引导RNA中的20或24个核苷酸的序列驱动，该序列与靶DNA进行沃森-克里克碱基配对(在来自酿脓链球菌的Cas9的情况下，加上相邻的NAG或NGG PAM序列中的另外2个碱基)。这种序列足够长以至于在人类基因组中是唯一的，然而，RNA/DNA相互作用的特异性不是绝对的，有时可以耐受明显的混杂，尤其是在靶序列的5’一半处，这有效地减少了驱动特异性的碱基的数目。对此的一种解决方案是使Cas9或Cpf1催化功能完全失活(仅保留RNA引导的DNA结合功能)，而将FokI结构域与失活的Cas9融合；参见例如Tsai等人,Nature Biotech[自然·生物技术],2014,32:569-76；以及Guilinger等人,NatureBiotech.[自然·生物技术],2014,32:577-82。由于FokI必须二聚化才能变得有催化活性，因此需要两种引导RNA来将两种FokI融合物拴系在紧密接近的位置，以形成二聚体并切割DNA。这本质上使组合靶位点中的碱基数目加倍，从而提高被基于CRISPR的系统靶向的严格性。
作为另一实例，TALE DNA结合结构域与具有催化活性的HE(如I-TevI)的融合利用TALE的可调DNA结合和特异性，以及I-TevI的切割序列特异性，预期可以进一步减少脱靶切割。
RNA引导的内切核酸酶
如本文所用的RNA引导的内切核酸酶系统可以包含与野生型示例性内切核酸酶(例如，来自酿脓链球菌的Cas9，US2014/0068797序列ID No.8或Sapranauskas等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],39(21):9275-9282(2011))具有至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。内切核酸酶可以包含与野生型内切核酸酶(例如，来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在10个连续氨基酸上至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。内切核酸酶可以至多包含：与野生型内切核酸酶(例如，来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在10个连续氨基酸上至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。内切核酸酶可以至少包含：与野生型内切核酸酶(例如，来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在内切核酸酶的HNH核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。内切核酸酶可以至多包含：与野生型内切核酸酶(例如，来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在内切核酸酶的HNH核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。内切核酸酶可以至少包含：与野生型内切核酸酶(例如，来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在内切核酸酶的RuvC核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。内切核酸酶可以至多包含：与野生型内切核酸酶(例如，来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在内切核酸酶的RuvC核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。
内切核酸酶可以包括野生型示例性内切核酸酶的修饰形式。野生型示例性内切核酸酶的修饰形式可以包含降低内切核酸酶的核酸切割活性的突变。野生型示例性内切核酸酶的修饰形式可以具有小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的野生型示例性内切核酸酶(例如，来自酿脓链球菌的Cas9，同上)的核酸裂解活性。内切核酸酶的修饰形式可以不具有显著的核酸切割活性。当内切核酸酶是不具有显著核酸切割活性的修饰形式时，在本文中将其称为“酶促失活的”。
设想的突变可以包括取代、添加和缺失或其任何组合。突变将突变的氨基酸转化为丙氨酸。突变将突变的氨基酸转化为另一种氨基酸(例如，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸或精氨酸)。突变将突变的氨基酸转化为非天然氨基酸(例如，硒代甲硫氨酸)。突变将突变的氨基酸转化为氨基酸模拟物(例如，磷酸模拟物(phosphomimic))。突变可以是保守突变。例如，突变将突变的氨基酸转化为类似于突变氨基酸的大小、形状、电荷、极性、构象和/或旋转异构体的氨基酸(例如，半胱氨酸/丝氨酸突变、赖氨酸/天冬酰胺突变、组氨酸/苯丙氨酸突变)。突变可以引起阅读框的移位和/或提前终止密码子的产生。突变可以引起影响一种或多种基因表达的基因或基因座的调控区的改变。
引导RNA
本披露提供了引导RNA(gRNA)，这些引导RNA可以将相关内切核酸酶的活性指向多核苷酸内的特定靶位点。引导RNA可以包含与目的靶核酸序列杂交的至少一个间隔子序列、和CRISPR重复序列。在II型CRISPR系统中，gRNA还包含称为tracrRNA序列的第二RNA。在II型CRISPR引导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交以形成双链体。在V型CRISPR系统中，gRNA包含形成双链体的crRNA。在一些实施例中，gRNA可以结合内切核酸酶，使得gRNA和内切核酸酶形成复合体。gRNA可以由于其与内切核酸酶缔合而为复合体提供靶标特异性。因此，靶向基因组的核酸可以指导内切核酸酶的活性。
示例性引导RNA包括包含15-200个核苷酸的间隔子序列，其中gRNA靶向基于GRCh38人类基因组组装的基因组位置。如本领域普通技术人员所理解的，每种gRNA可以设计成包括与其基因组靶位点或区域互补的间隔子序列。参见Jinek等人,Science[科学],2012,337,816-821和Deltcheva等人,Nature[自然],2011,471,602-607。
gRNA可以是双分子引导RNA。gRNA可以是单分子引导RNA。
双分子引导RNA可以包含两条RNA链。第一条链在5'至3'方向上包含任选的间隔子延伸序列、间隔子序列和最小CRISPR重复序列。第二条链可以包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。
单分子引导RNA(sgRNA)在5'至3'方向上可以包含任选的间隔子延伸序列、间隔子序列、最小CRISPR重复序列、单分子引导接头、最小tracrRNA序列、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸序列可以包含为引导RNA贡献另外的功能(例如，稳定性)的元件。单分子引导接头可以将最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列连接起来以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸可以包含一个或多个发夹。
在一些实施例中，sgRNA在sgRNA序列的5’端包含20个核苷酸的间隔子序列。在一些实施例中，sgRNA在sgRNA序列的5’端包含少于20个核苷酸的间隔子序列。在一些实施例中，sgRNA在sgRNA序列的5’端包含超过20个核苷酸的间隔子序列。在一些实施例中，sgRNA在sgRNA序列的5’端包含具有17-30个核苷酸的可变长度的间隔子序列。在一些实施例中，sgRNA包含长度超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200个核苷酸的间隔子延伸序列。在一些实施例中，sgRNA包含长度少于3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个核苷酸的间隔子延伸序列。
在一些实施例中，sgRNA包含含有另一部分(例如，稳定性控制序列、内切核糖核酸酶结合序列或核酶)的间隔子延伸序列。该部分可以减少或增加靶向核酸的核酸的稳定性。该部分可以是转录终止子区段(即，转录终止序列)。该部分可以在真核细胞中起作用。该部分可以在原核细胞中起作用。该部分可以在真核细胞和原核细胞两者中起作用。合适的部分的非限制性实例包括：5'帽(例如，7-甲基鸟苷酸帽(m7 G))，核糖开关序列(例如，允许蛋白和蛋白复合体调控稳定性和/或调控可及性)，形成dsRNA双链体的序列(即，发夹)，将RNA靶向亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列，提供跟踪的修饰或序列(例如，直接与荧光分子缀合、与促进荧光检测的部分缀合、允许进行荧光检测的序列等)，和/或为蛋白(例如，作用于DNA的蛋白，包括转录激活因子、转录阻遏因子、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基化酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰化酶等)提供结合位点的修饰或序列。
在一些实施例中，sgRNA包含与靶多核苷酸中的序列杂交的间隔子序列。gRNA的间隔子可以经由杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶多核苷酸相互作用。间隔子的核苷酸序列可以根据目的靶核酸的序列而变化。
在CRISPR-内切核酸酶系统中，间隔子序列可以设计成与位于系统中使用的内切核酸酶的PAM的5'的靶多核苷酸杂交。间隔子可以与靶序列完全匹配或可以有错配。每种内切核酸酶(例如，Cas9核酸酶)都有特定的PAM序列，使得该内切核酸酶识别靶DNA。例如，酿脓链球菌Cas9识别包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由间隔子序列靶向的靶核酸序列的3'。
靶多核苷酸序列可以包含20个核苷酸。靶多核苷酸可以包含少于20个核苷酸。靶多核苷酸可以包含超过20个核苷酸。靶多核苷酸可以包含至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶多核苷酸可以包含至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶多核苷酸序列可以包含紧邻PAM的第一核苷酸的5'的20个碱基。
与靶多核苷酸杂交的间隔子序列可以具有至少约6个核苷酸(nt)的长度。间隔子序列可以是至少约6nt、至少约10nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt、从约6nt至约80nt、从约6nt至约50nt、从约6nt至约45nt、从约6nt至约40nt、从约6nt至约35nt、从约6nt至约30nt、从约6nt至约25nt、从约6nt至约20nt、从约6nt至约19nt、从约10nt至约50nt、从约10nt至约45nt、从约10nt至约40nt、从约10nt至约35nt、从约10nt至约30nt、从约10nt至约25nt、从约10nt至约20nt、从约10nt至约19nt、从约19nt至约25nt、从约19nt至约30nt、从约19nt至约35nt、从约19nt至约40nt、从约19nt至约45nt、从约19nt至约50nt、从约19nt至约60nt、从约20nt至约25nt、从约20nt至约30nt、从约20nt至约35nt、从约20nt至约40nt、从约20nt至约45nt、从约20nt至约50nt或从约20nt至约60nt。在一些实例中，间隔子序列可以包含20个核苷酸。在一些实例中，间隔子可以包含19个核苷酸。在一些实例中，间隔子可以包含18个核苷酸。在一些实例中，间隔子可以包含22个核苷酸。
在一些实例中，间隔子序列与靶核酸之间的百分比互补性是至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在一些实例中，间隔子序列与靶核酸之间的百分比互补性是至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％或100％。在一些实例中，间隔子序列与靶核酸之间的百分比互补性在靶核酸互补链的靶序列的六个连续最5'核苷酸上为100％。间隔子序列与靶核酸之间的百分比互补性在约20个连续核苷酸上可以是至少60％。间隔子序列和靶核酸的长度可以相差1至6个核苷酸，这可以被认为是一个或多个突起。
tracrRNA序列可以包含与细胞中的最小CRISPR重复序列杂交的核苷酸。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复序列可以形成双链体，即碱基配对的双链结构。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复序列可以一起结合RNA引导的内切核酸酶。最小tracrRNA序列的至少一部分可以与最小CRISPR重复序列杂交。最小tracrRNA序列可以与最小CRISPR重复序列具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％的互补性。
最小tracrRNA序列可以具有从约7个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，最小tracrRNA序列的长度可以是从约7个核苷酸(nt)至约50nt、从约7nt至约40nt、从约7nt至约30nt、从约7nt至约25nt、从约7nt至约20nt、从约7nt至约15nt、从约8nt至约40nt、从约8nt至约30nt、从约8nt至约25nt、从约8nt至约20nt、从约8nt至约15nt、从约15nt至约100nt、从约15nt至约80nt、从约15nt至约50nt、从约15nt至约40nt、从约15nt至约30nt或从约15nt至约25nt。最小tracrRNA序列的长度可以是大约9个核苷酸。最小tracrRNA序列可以是大约12个核苷酸。最小tracrRNA可以由Jinek等人(同上)中描述的tracrRNA nt 23-48组成。
最小tracrRNA序列可以与参考最小tracrRNA(例如，来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)序列在一段至少6、7、或8个连续核苷酸上具有至少约60％的同一性。例如，最小tracrRNA序列可以与参考最小tracrRNA序列在一段至少6、7、或8个连续核苷酸上具有至少约65％的同一性、约70％的同一性、约75％的同一性、约80％的同一性、约85％的同一性、约90％的同一性、约95％的同一性、约98％的同一性、约99％的同一性或100％的同一性。
最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体包含双螺旋。最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体可以包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。
双链体可以包含错配(即，双链体的两条链不是100％互补)。双链体可以包含至少约1、2、3、4或5个或错配。双链体可以包含至多约1、2、3、4或5个或错配。双链体可以包含不超过2个错配。
在一些实施例中，tracrRNA可以是3'tracrRNA。在一些实施例中，3’tracrRNA序列可以包含与参考tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的tracrRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％序列同一性的序列。
在一些实施例中，gRNA可以包含tracrRNA延伸序列。tracrRNA延伸序列可以具有从约1个核苷酸至约400个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有从约20至约5000个或更多个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有少于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列的长度可以包含少于10个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以是10-30个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以是30-70个核苷酸。
tracrRNA延伸序列可以包含功能部分(例如，稳定性控制序列、核酶、内切核糖核酸酶结合序列)。功能部分可以包含转录终止子区段(即，转录终止序列)。功能部分可以具有从约10个核苷酸(nt)至约100个核苷酸、从约10nt至约20nt、从约20nt至约30nt、从约30nt至约40nt、从约40nt至约50nt、从约50nt至约60nt、从约60nt至约70nt、从约70nt至约80nt、从约80nt至约90nt、或从约90nt至约100nt、从约15nt至约80nt、从约15nt至约50nt、从约15nt至约40nt、从约15nt至约30nt或从约15nt至约25nt的总长度。
在一些实施例中，sgRNA可以包含长度为从约3个核苷酸至约100个核苷酸的接头序列。在Jinek等人(同上)中，例如，使用简单的4个核苷酸的“四环”(-GAAA-)(Jinek等人,Science[科学],2012,337(6096):816-821)。说明性接头具有从约3个核苷酸(nt)至约90nt、从约3nt至约80nt、从约3nt至约70nt、从约3nt至约60nt、从约3nt至约50nt、从约3nt至约40nt、从约3nt至约30nt、从约3nt至约20nt、从约3nt至约10nt的长度。例如，接头可以具有约3个nt至约5个nt、约5个nt至约10个nt、约10个nt至约15个nt、约15个nt至约20个nt、约20个nt至约25个nt、约25个nt至约30个nt、约30个nt至约35个nt、约35个nt至约40个nt、约40个nt至约50个nt、约50个nt至约60个nt、约60个nt至约70个nt、约70个nt至约80个nt、约80个nt至约90个nt或约90个nt至约100个nt的长度。单分子引导核酸的接头可以在4与40个核苷酸之间。接头可以是至少约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。接头可以是至多约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。
接头可以包含多种序列中的任一种，但在一些实例中，接头将不含与引导RNA的其他部分具有同源性的广泛区域的序列，否则可能引起可以干扰该向导的其他功能区域的分子内结合。在Jinek等人(同上)中，使用简单的4个核苷酸的序列-GAAA-(Jinek等人,Science[科学],2012,337(6096):816-821)，但是同样可以使用许多其他序列，包括更长的序列。
接头序列可以包含功能部分。例如，接头序列可以包含一个或多个特征，包括适体、核酶、蛋白相互作用发夹、蛋白结合位点、CRISPR阵列、内含子或外显子。接头序列可以包含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。在一些实例中，接头序列可以包含至多约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。
在一些实施例中，sgRNA例如在sgRNA序列的3’端不包含尿嘧啶。在一些实施例中，sgRNA例如在sgRNA序列的3’端包含一个或多个尿嘧啶。在一些实施例中，sgRNA在sgRNA序列的3’端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个尿嘧啶(U)。
可以对sgRNA进行化学修饰。在一些实施例中，经化学修饰的gRNA是包含具有化学修饰(例如，2′-O-甲基糖修饰)的至少一个核苷酸的gRNA。在一些实施例中，经化学修饰的gRNA包含经修饰的核酸骨架。在一些实施例中，经化学修饰的gRNA包含2'-O-甲基-硫代磷酸酯残基。在一些实施例中，化学修饰增强稳定性，降低先天性免疫应答的可能性或程度，和/或增强其他属性，如本领域中所述的。
在一些实施例中，经修饰的gRNA可以包含经修饰的骨架，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、吗啉代、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或者短链杂原子或杂环糖间键。
基于吗啉代的化合物在以下文献中有描述：Braasch和David Corey,Biochemistry[生物化学],2002,41(14):4503-4510；Genesis[创世纪],2001,第30卷,第3期；Heasman,Dev.Biol.[发育生物学],2002,243:209-214；Nasevicius等人,Nat.Genet.[自然·遗传学],2000,26:216-220；Lacerra等人,Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊],2000,97:9591-9596.；以及1991年7月23日发布的美国专利号5,034,506。
环己烯基核酸寡核苷酸模拟物在Wang等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志],2000,122:8595-8602中有描述。
在一些实施例中，经修饰的gRNA可以在2'位置处包含一个或多个经取代的糖部分，例如以下之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3，其中n是从1至约10；C1至C10低级烷基、烷氧基烷氧基、经取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2 CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；经取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报告基团；嵌入剂；2'-O-(2-甲氧基乙基)；2'-甲氧基(2'-O-CH3)；2'-丙氧基(2'-OCH2 CH2CH3)；以及2'-氟(2'-F)。类似的修饰也可以在gRNA的其他位置进行，特别是3'末端核苷酸上的糖的3'位置以及5'末端核苷酸的5'位置。在一些实例中，核苷酸单元的糖和核苷间键(即，骨架)两者均可以被新型基团替代。
引导RNA还可以另外地或替代性地包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未经修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括仅很少或瞬时发现于天然核酸中的核碱基，例如次黄嘌呤，6-甲基腺嘌呤，5-甲基嘧啶特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2'脱氧胞嘧啶并且通常在本领域中称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC，以及合成的核碱基，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg,A.,DNA Replication[DNA复制],旧金山W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.,San Francisco),第75-77页,1980；Gebeyehu等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究]1997,15:4513。也可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。已显示5-Me-C取代使核酸双链体稳定性提高0.6℃-1.2℃。(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,Antisense Research and Applications[反义研究与应用],波卡拉顿CRC出版社(CRCPress,Boca Raton),1993,第276-278页)是碱基取代的方面。
经修饰的核碱基可以包括其他合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
靶向基因组的核酸和内切核酸酶的复合体
gRNA与内切核酸酶(例如，RNA引导的核酸酶，如Cas9)相互作用，从而形成复合体。gRNA将内切核酸酶引导至靶多核苷酸。
内切核酸酶和gRNA可以各自分别施用至细胞或受试者。在一些实施例中，内切核酸酶可以与一种或多种引导RNA、或者一种或多种crRNA以及tracrRNA预复合。然后可以将预复合材料施用至细胞或受试者。这种预复合材料称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。RNP中的内切核酸酶可以是例如Cas9内切核酸酶或Cpf1内切核酸酶。内切核酸酶可以在N末端、C末端或N末端和C末端两者侧接有一个或多个核定位信号(NLS)。例如，Cas9内切核酸酶可以侧接有两个NLS，一个NLS位于N末端并且第二NLS位于C末端。NLS可以是本领域已知的任何NLS，如SV40 NLS。RNP中靶向基因组的核酸与内切核酸酶的摩尔比可在约1:1至约10:1的范围内。例如，RNP中sgRNA与Cas9内切核酸酶的摩尔比可以是3:1。
编码系统组分的核酸
本披露提供了包含编码本披露的靶向基因组的核酸、本披露的内切核酸酶、和/或进行本披露的方法的各方面所必需的任何核酸或蛋白分子的核苷酸序列的核酸。编码核酸可以是RNA、DNA或其组合。
编码本披露的靶向基因组的核酸、本披露的内切核酸酶、和/或进行本披露的方法的各方面所必需的任何核酸或蛋白分子的核酸可以构成载体(例如，重组表达载体)。
术语“载体”是指能够转运它所连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以连接另外的核酸区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的核酸区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。
在一些实例中，载体可以能够指导它们可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”，或更简单地“表达载体”，其具有等效功能。
术语“可操作地连接”意指目的核苷酸序列以允许该核苷酸序列表达的方式与一个或多个调控序列连接。术语“调控序列”旨在包括例如启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调控序列是本领域众所周知的并且描述于例如Goeddel；Gene Expression Technology:Methods in Enzymology[基因表达技术：酶学方法],1990,185,加利福尼亚州圣地亚哥学术出版社(Academic Press,San Diego,CA)。调控序列包括那些在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的调控序列以及那些仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域技术人员将认识到，表达载体的设计可以取决于诸如靶细胞的选择、所需表达水平等因素。
所考虑的表达载体包括但不限于基于痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、逆转录病毒(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒，以及衍生自逆转录病毒(如劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈维肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽类白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)的载体)的病毒载体和其他重组载体。所考虑的用于真核靶细胞的其他载体包括但不限于载体pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(法玛西亚公司(Pharmacia))。可以使用其他载体，只要它们与宿主细胞相容即可。
在一些实例中，载体可以包含一个或多个转录和/或翻译控制元件。取决于所利用的宿主/载体系统，可以在表达载体中使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。载体可以是使病毒序列或CRISPR机器的组分或其他元件失活的自失活载体。
合适的真核启动子(即，在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性实例包括那些来自巨细胞病毒(CMV)即刻早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)、人类延伸因子-1α启动子(EF1α)、鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)、泛素C启动子(UBC)、包含与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的巨细胞病毒增强子的杂合构建体、包含与鸡β-肌动蛋白基因的启动子(CAG或CAGGS)、第一外显子和第一内含子融合的巨细胞病毒增强子的杂合构建体、鼠干细胞病毒启动子(MSCV)、磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子(PGK)和小鼠金属硫蛋白-I启动子的启动子。
启动子可以是诱导型启动子(例如，热激启动子、四环素调控启动子、类固醇调控启动子、金属调控启动子、雌激素受体调控启动子等)。启动子可以是组成型启动子(例如，CMV启动子、UBC启动子、CAG启动子)。在一些情况下，启动子可以是空间受限和/或时间受限的启动子(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)。
将本披露的复合体、多肽和核酸引入细胞中可以通过以下方式发生：病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、基因枪技术、磷酸钙沉淀、直接微量注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。
III.用于逃避免疫应答和增加存活率的策略
本文描述了使得经遗传修饰的细胞(即，通用供体细胞)能够增加它们在植入受试者后的存活或活力和/或逃避免疫应答的策略。在一些实施例中，这些策略使得通用供体细胞能够以与未经修饰的细胞相比更高的成功率存活和/或逃避免疫应答。在一些实施例中，经遗传修饰的细胞包含在编码存活因子的至少一种基因内或附近的至少一种遗传修饰的引入，其中该遗传修饰包括编码致耐受性因子的多核苷酸的插入。这些通用供体细胞可进一步包含在编码一种或多种MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子的基因内或附近的至少一种遗传修饰，其中所述遗传修饰包括编码第二致耐受性因子的多核苷酸的插入。
在一些实施例中，经遗传修饰的细胞包含在至少一种基因内或附近的相对于未经修饰的细胞减少一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原的表达的至少一种遗传修饰的引入；相对于未经修饰的细胞增加编码致耐受性因子的至少一种多核苷酸的表达的至少一种遗传修饰；以及相对于未经修饰的细胞改变编码存活因子的至少一种基因的表达的至少一种遗传修饰。在其他实施例中，经遗传修饰的细胞包含在至少一种基因内或附近的相对于未经修饰的细胞改变一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原的表达的至少一个缺失或插入-缺失突变；以及在与改变一种或多种MHC-I和MHC-II HLA的表达的基因缺失的位点部分重叠、完全重叠或包含在该位点内的位点处的编码至少一种致耐受性因子的多核苷酸的至少一个插入。在又其他实施例中，经遗传修饰的细胞包含相对于未经修饰的细胞改变编码存活因子的至少一种基因的表达的至少一种遗传修饰。
编码主要组织相容性复合体(MHC)的基因位于人类染色体6p21上。由MHC基因编码的所得蛋白是一系列表面蛋白，这些表面蛋白在细胞移植过程中对供体相容性至关重要。MHC基因分为MHC I类(MHC-I)和MHC II类(MHC-II)。MHC-I基因(HLA-A、HLA-B和HLA-C)在几乎所有组织细胞类型中均表达，向CD8+T细胞呈递“非自身”抗原处理的肽，从而促进其激活为溶细胞性CD8+T细胞。表达“非自身”MHC-I分子的移植或植入细胞将引起针对这些细胞的稳健的细胞免疫应答，最终通过激活的溶细胞性CD8+T细胞导致这些细胞的死亡。MHC-I蛋白与内质网中的β-2-微球蛋白(B2M)密切相关，该β-2-微球蛋白对于在细胞表面形成功能性MHC-I分子至关重要。另外，存在具有免疫调控功能的三种非典型MHC-Ib分子(HLA-E、HLA-F和HLA-G)。MHC-II生物分子包括HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。由于它们在免疫应答中的主要功能，MHC-I和MHC-II生物分子有助于在非宿主细胞的细胞植入(例如，用于再生医学目的的细胞植入)后的免疫排斥。
MHC-I细胞表面分子由MHC编码的重链(HLA-A、HLA-B或HLA-C)和不变亚基β-2-微球蛋白(B2M)构成。因此，细胞内B2M浓度的降低实现了降低MHC-I细胞表面分子的细胞表面表达的有效方法。
在一些实施例中，细胞包含一个或多个MHC-I或MHC-II基因的基因组修饰。在一些实施例中，细胞包含调控MHC-I和/或MHC-II的表达的一个或多个多核苷酸序列的基因组修饰。在一些实施例中，本披露的遗传修饰使用任何基因编辑方法(包括但不限于本文所述的那些方法)来进行。
在一些实施例中，相对于未经修饰的细胞减少一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原的表达是通过在MHC-I和/或MHC-II基因中直接靶向例如进行至少一个碱基对的遗传缺失和/或插入来实现的。在一些实施例中，相对于未经修饰的细胞减少一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原的表达是通过靶向CIITA基因例如进行遗传缺失来实现的。在一些实施例中，相对于未经修饰的细胞减少一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原的表达是通过靶向MHC-I或MHC-II的至少一种转录调控因子例如进行遗传缺失来实现的。在一些实施例中，MHC-I或MHC-II的转录调控因子是NLRC5或CIITA基因。在一些实施例中，MHC-I或MHC-II的转录调控因子是RFX5、RFXAP、RFXANK、NFY-A、NFY-B、NFY-C、IRF-1和/或TAP1基因。
在一些实施例中，细胞的基因组已经修饰为缺失HLA-A、HLA-B和/或HLA-C基因的全部或一部分。在一些实施例中，细胞的基因组已经修饰为缺失HLA-A、HLA-B和/或HLA-C基因的启动子区的全部或一部分。在一些实施例中，细胞的基因组已经修饰为缺失编码MHC-I或MHC-II的转录调控因子的基因的全部或一部分。在一些实施例中，细胞的基因组已经修饰为缺失编码MHC-I或MHC-II的转录调控因子的基因的启动子区的全部或一部分。
在一些实施例中，细胞的基因组已经修饰为减少β-2-微球蛋白(B2M)的表达。B2M是编码所有多态性MHC I类重链表面表达所需的共同蛋白亚基的非多态性基因。HLA-I蛋白与内质网中的B2M密切相关，该B2M对于形成功能性细胞表面表达的HLA-I分子至关重要。在一些实施例中，gRNA靶向B2M基因内的包含5’-GCTACTCTCTCTTTCTGGCC-3’序列(SEQ ID NO:1)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向B2M基因内的包含5’-GGCCGAGATGTCTCGCTCCG-3’序列(SEQ ID NO:2)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向B2M基因内的包含5’-CGCGAGCACAGCTAAGGCCA-3’序列(SEQ ID NO:3)的位点。在替代性实施例中，gRNA靶向B2M基因内的包含以下序列中的任一个的位点：5’-TATAAGTGGAGGCGTCGCGC-3’(SEQ ID NO:35)、5’-GAGTAGCGCGAGCACAGCTA-3’(SEQ ID NO:36)、5’-ACTGGACGCGTCGCGCTGGC-3’(SEQ IDNO:37)、5’-AAGTGGAGGCGTCGCGCTGG-3’(SEQ ID NO:38)、5-GGCCACGGAGCGAGACATCT-3’(SEQID NO:39)、5’-GCCCGAATGCTGTCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:40)、5’-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC-3’(SEQ ID NO:41)、5’-TCCTGAAGCTGACAGCATTC-3’(SEQ ID NO:42)、5’-TTCCTGAAGCTGACAGCATT-3’(SEQ ID NO:43)或5’-ACTCTCTCTTTCTGGCCTGG-3’(SEQ ID NO:44)。在一些实施例中，gRNA包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44中任一个的多核苷酸序列。gRNA/CRISPR核酸酶复合体靶向并裂解B2M基因座中的靶位点。通过NHEJ修复双链断裂可能导致至少一个核苷酸的缺失和/或至少一个核苷酸的插入，从而破坏或消除B2M的表达。替代性地，B2M基因座可以通过至少两种CRISPR系统靶向，每种CRISPR系统包含不同的gRNA，使得在B2M基因座中的两个位点处的裂解导致两个切口之间的序列的缺失，从而消除B2M的表达。
在一些实施例中，细胞的基因组已经修饰为减少硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)的表达。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-GAAGCGTGTCTTCATAGCGC-3’序列(SEQ ID NO:15)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-TTACTCGTGTCAAAGCCGTT-3’序列(SEQ ID NO:16)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-TGTCAAAGCCGTTAGGATCC-3’序列(SEQ ID NO:17)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-GCCGTTAGGATCCTGGCTTG-3’序列(SEQID NO:18)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-GCGGAGTGGCTAAAGTGCTT-3’序列(SEQ ID NO:19)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-TCCGCAAGCCAGGATCCTAA-3’序列(SEQ ID NO:20)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-GTTCGGCTTTGAGCTTCCTC-3’序列(SEQ ID NO:21)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-GAGATGGTGATCATGAGACC-3’序列(SEQID NO:22)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-TTGTACTCATATTTGTTTCC-3’序列(SEQ ID NO:23)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-AACAAATATGAGTACAAGTT-3’序列(SEQ ID NO:24)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-GAAGCGTGTCTTCATAGCGCAGG-3’序列(SEQ ID NO:45)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-TTACTCGTGTCAAAGCCGTTAGG-3’序列(SEQ ID NO:46)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-TGTCAAAGCCGTTAGGATCCTGG-3’序列(SEQ ID NO:47)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-GCCGTTAGGATCCTGGCTTGCGG-3’序列(SEQ ID NO:48)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-GCGGAGTGGCTAAAGTGCTTTGG-3’序列(SEQ IDNO:49)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-TCCGCAAGCCAGGATCCTAACGG-3’序列(SEQ ID NO:50)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-GTTCGGCTTTGAGCTTCCTCAGG-3’序列(SEQ ID NO:51)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-GAGATGGTGATCATGAGACCTGG-3’序列(SEQ IDNO:52)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-TTGTACTCATATTTGTTTCCAGG-3’序列(SEQ ID NO:53)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含5’-AACAAATATGAGTACAAGTTCGG-3’序列(SEQ ID NO:54)的位点。在一些实施例中，gRNA靶向TXNIP基因内的包含SEQ ID NO:15-24或45-54中任一个的多核苷酸序列的靶位点。在一些实施例中，gRNA靶向SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中任一个的多核苷酸序列。gRNA/CRISPR核酸酶复合体靶向并切割TXNIP基因座中的靶位点。通过NHEJ修复双链断裂可能导致至少一个核苷酸的缺失和/或至少一个核苷酸的插入，从而破坏或消除TXNIP的表达。替代性地，将编码外源基因的多核苷酸插入TXNIP基因座中可破坏或消除TXNIP的表达。
在一些实施例中，细胞的基因组已经修饰为减少II类反式激活因子(CIITA)的表达。CIITA是LR或核苷酸结合结构域(NBD)富含亮氨酸重复序列(LRR)蛋白家族的成员，并通过与MHC增强体缔合来调控MHC-II的转录。CIITA的表达在B细胞和树突细胞中根据发育阶段而诱导，并且在大多数细胞类型中可被IFN-γ诱导。
在一些实施例中，细胞的基因组已经修饰为减少NLR家族含CARD结构域5(NLRC5)的表达。NLRC5是MHC-I介导的免疫应答的关键调控因子，并且与CIITA相似，NLRC5可被IFN-γ高度诱导并且可以易位进入细胞核中。NLRC5激活MHC-I基因的启动子并诱导MHC-I以及参与MHC-I抗原呈递的相关基因的转录。
在一些实施例中，可以将致耐受性因子插入或重新插入经遗传修饰的细胞中以产生免疫赦免的通用供体细胞。在一些实施例中，本文披露的通用供体细胞已经进一步修饰为表达一种或多种致耐受性因子。示例性致耐受性因子包括但不限于HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、CI抑制剂和IL-35中的一种或多种。在一些实施例中，编码至少一种致耐受性因子的至少一种多核苷酸的遗传修饰(例如，插入)使得通用供体细胞在植入后能够以比未经修饰的细胞高至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍的比率抑制或逃避免疫排斥。在一些实施例中，编码HLA-E、HLA-G、CTLA-4、CD47和/或PD-L1的多核苷酸的插入使得通用供体细胞在移植或植入宿主受试者中后能够抑制或逃避免疫排斥。
编码致耐受性因子的多核苷酸通常包含位于编码致耐受性因子的序列侧翼的左同源臂和右同源臂。同源臂与所靶向插入位点处或附近的基因组DNA具有显著的序列同源性。例如，左同源臂可以是与位于靶位点或切割位点的左侧或上游的区域同源的核苷酸序列，并且右同源臂可以是与位于靶位点或切割位点的右侧或下游的区域同源的核苷酸序列。每个同源臂的近侧端可以与邻接切割位点的基因组DNA序列同源。替代性地，每个同源臂的近侧端可以与定位成远离切割位点多达约10、20、30、40、50、60或70个核碱基的基因组DNA序列同源。这样，可以将编码致耐受性因子的多核苷酸在切割位点的约10、20、30、40、50、60或70个碱基对内插入所靶向基因座中，并且可以缺失邻接切割位点(并且与同源臂没有同源性)的另外的基因组DNA。同源臂的长度范围可以是从约50个核苷酸至数千个核苷酸。在一些实施例中，同源臂的长度范围可以是从约500个核苷酸至约1000个核苷酸。同源臂与基因组DNA之间的显著的序列同源性可以是至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
在一些实施例中，将同源臂与B2M向导(例如，包含SEQ ID NO:1-3、35-44的核苷酸序列的gRNA)一起使用。在一些实施例中，同源臂被设计成与将消除B2M基因的起始位点的任何B2M向导一起使用。在一些实施例中，B2M同源臂可以包含SEQ ID NO:7或13的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:7或13的多核苷酸序列具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的多核苷酸序列，或基本上由其组成。在一些实施例中，左B2M同源臂可以包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7的多核苷酸序列具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的多核苷酸序列，或基本上由其组成。在一些实施例中，右B2M同源臂可以包含SEQ ID NO:13或与SEQ IDNO:13的多核苷酸序列具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的多核苷酸序列，或基本上由其组成。
在一些实施例中，将同源臂与TXNIP向导(例如，包含SEQ ID NO:15-24的核苷酸序列的gRNA)一起使用。在一些实施例中，同源臂被设计为与靶向TXNIP的外显子1的任何TXNIP向导(例如，包含SEQ ID NO:15-20的核苷酸序列的gRNA)一起使用。在一些实施例中，TXNIP同源臂可以包含SEQ ID NO:25或32的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:25或32的多核苷酸序列具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的多核苷酸序列，或基本上由其组成。在一些实施例中，左TXNIP同源臂可以包含SEQ ID NO:25或与SEQ ID NO:25的多核苷酸序列具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的多核苷酸序列，或基本上由其组成。在一些实施例中，右TXNIP同源臂可以包含SEQ ID NO:32或与SEQ ID NO:32的多核苷酸序列具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的多核苷酸序列，或基本上由其组成。
编码至少一种致耐受性因子的该至少一种多核苷酸可以可操作地连接到外源启动子。外源启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、时间特异性启动子、组织特异性启动子或细胞类型特异性启动子。在一些实施例中，外源启动子是CMV、EFla、PGK、CAG或UBC启动子。
在一些实施例中，将编码至少一种致耐受性因子的该至少一种多核苷酸插入安全港基因座(例如，AAVS 1基因座)中。在一些实施例中，将编码至少一种致耐受性因子的该至少一种多核苷酸插入基因组DNA的以下位点或区域中，该位点或区域与MHC-I基因、MHC-II基因或者MHC-I或MHC-II的转录调控因子部分重叠、完全重叠或包含在MHC-I基因、MHC-II基因或者MHC-I或MHC-II的转录调控因子内(即，在其内或附近)。
在一些实施例中，将编码PD-L1的多核苷酸插入在B2M基因座内或附近的位点处。在一些实施例中，与缺失B2M基因或启动子的全部或一部分同时或在其之后，将编码PD-L1的多核苷酸插入在B2M基因座内或附近的位点处。编码PD-L1的多核苷酸可操作地连接到外源启动子。外源启动子可以是CMV启动子。在一些实施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
在一些实施例中，将编码HLA-E的多核苷酸插入在B2M基因座内或附近的位点处。在一些实施例中，与缺失B2M基因或启动子的全部或一部分同时或在其之后，将编码HLA-E的多核苷酸插入在B2M基因座内或附近的位点处。编码HLA-E的多核苷酸可操作地连接到外源启动子。外源启动子可以是CMV启动子。在一些实施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO:26、27、28、29、30和/或30的核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO:55的核苷酸序列。
在一些实施例中，将编码HLA-G的多核苷酸插入在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座内或附近的位点处。在一些实施例中，与缺失HLA-A、HLA-B或HLA-C基因或启动子同时或在其之后，将编码HLA-G的多核苷酸插入在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座内或附近的位点处。
在一些实施例中，将编码CD47的多核苷酸插入在CIITA基因座内或附近的位点处。在一些实施例中，与缺失CIITA基因或启动子同时或在其之后，将编码CD47的多核苷酸插入在CIITA基因座内或附近的位点处。
在一些实施例中，与在CIITA基因座内或附近的位点处插入编码CD47的多核苷酸同时，将编码HLA-G的多核苷酸插入在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座内或附近的位点处。
在一些实施例中，编码至少一种致耐受性因子的至少一种多核苷酸可作为载体的一部分递送至细胞。例如，载体可以是质粒载体。在各种实施例中，递送至细胞的质粒载体的量可在约0.5μg至约10μg(每约106个细胞)的范围内。在一些实施例中，质粒的量可在约1μg至约8μg、约2μg至约6μg或约3μg至约5μg的范围内。在具体实施例中，递送至细胞的质粒的量可以是约4μg。
在一些实施例中，细胞包含一种或多种存活因子的增加或减少的表达。在一些实施例中，细胞包含编码存活因子的一种或多种多核苷酸序列的插入。在一些实施例中，细胞包含一种或多种存活因子的缺失。在一些实施例中，本披露的遗传修饰使用任何基因编辑方法(包括但不限于本文所述的那些方法)来进行。在一些实施例中，相对于未经修饰的细胞，细胞包含至少一种存活因子的增加或减少的表达。在一些实施例中，存活因子是参与细胞存活的成员或关键途径，例如缺氧、活性氧、营养剥夺和/或氧化应激。在一些实施例中，至少一种存活因子的遗传修饰使得通用供体细胞在植入后能够存活比未经修饰的细胞更长的时间段，例如长至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍的时间段。在一些实施例中，存活因子是ZNF143、TXNIP、FOXO1、JNK或MANF。
在一些实施例中，细胞包含编码MANF的多核苷酸的插入，该插入使得通用供体细胞在移植或植入宿主受试者中后能够以相对于未经修饰的细胞更高的存活率存活。在一些实施例中，将编码MANF的多核苷酸插入安全港基因座中。在一些实施例中，将编码MANF的多核苷酸插入属于MHC-I、MHC-II或者MHC-I或MHC-II的转录调控因子的基因中。
在一些实施例中，细胞的基因组已经修饰为缺失ZNF143、TXNIP、FOXO1和/或JNK基因的全部或一部分。在一些实施例中，细胞的基因组已经修饰为缺失ZNF143、TXNIP、FOXO1和/或JNK基因的启动子区的全部或一部分。
在一些实施例中，在细胞内对超过一种存活因子进行遗传修饰。
在某些实施例中，将没有MHC-II表达和具有MHC-I的中等表达的细胞遗传修饰为没有MHC-I或MHC-II的表面表达。在另一个实施例中，将没有MHC-I/II的表面表达的细胞进一步编辑为具有PD-L1表达，例如插入编码PD-L1的多核苷酸。在又另一个实施例中，将没有MHC-I/II的表面表达的细胞进一步编辑为具有PD-L1的表达，例如插入编码PD-L1的多核苷酸，并且还将其遗传修饰为相对于未经修饰的细胞增加或减少编码存活因子的至少一种基因的表达。
在一些实施例中，这些细胞进一步包含不一定与植入后免疫逃避或细胞存活有牵连的一种或多种另外的基因的增加或减少的表达(例如，通过遗传修饰)。在一些实施例中，相对于未经修饰的细胞，这些细胞进一步包含一种或多种安全开关蛋白的增加的表达。在一些实施例中，这些细胞包含编码安全开关蛋白的一种或多种另外的基因的增加的表达。在一些实施例中，安全开关也是自杀基因。在一些实施例中，安全开关是单纯疱疹病毒-1胸苷激酶(HSV-tk)或诱导型半胱天冬酶-9。在一些实施例中，将编码至少一种安全开关的多核苷酸插入基因组中，例如插入安全港基因座中。在一些其他实施例中，经遗传修饰的该一种或多种另外的基因编码以下一种或多种：安全开关蛋白；靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；药物活性蛋白或肽；药物靶标候选物；以及与构建体整合的促进其植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活的蛋白。
本发明的一个方面提供了产生基因组工程化的通用供体细胞的方法，其中通用供体细胞在基因组中的一个或多个所选择的位点处包含至少一种靶向基因组修饰，该方法包括通过以下方式来遗传工程化如本文所述的细胞类型：向所述细胞中引入一种或多种构建体以实现在所选择的位点处的靶向修饰；使用能够识别所选择的位点的一种或多种内切核酸酶向所述细胞中引入在这些所选择的位点处的一个或多个双链断裂；以及培养这些经编辑的细胞以允许内源DNA修复在这些所选择的位点处产生靶向插入或缺失；从而获得基因组修饰的通用供体细胞。基因组修饰的通用供体细胞可经历连续轮的基因组修饰，使得多个位点被靶向和修饰。使用本领域众所周知的技术培养、表征、选择和扩增基因组修饰的细胞。通过该方法产生的通用供体细胞将包含至少一种功能性靶向基因组修饰，并且其中基因组修饰的细胞(如果它们是干细胞的话)然后能够分化成祖细胞或完全分化细胞。
在一些其他实施例中，基因组工程化的通用供体细胞包含HLA-E、HLA-G、CD47或PD-L1中的至少一种的引入或增加的表达。在一些实施例中，基因组工程化的通用供体细胞是HLA I类和/或II类缺陷的。在一些实施例中，基因组工程化的通用供体细胞包含无效或低B2M。在一些实施例中，基因组工程化的通用供体细胞包含编码HLA-E、HLA-G和PD-Ll蛋白中的一种或多种的整合或非整合外源多核苷酸。在一些实施例中，所述引入的表达是来自所述细胞中包含的非表达或低表达基因的增加的表达。在一些实施例中，使用仙台病毒、AAV、附加体或质粒将非整合外源多核苷酸引入。在一些实施例中，通用供体细胞是B2M无效的，并具有HLA-E、HLA-G、PD-L1中的一种或多种的引入的表达，以及至少一种安全开关蛋白的增加或减少的表达。在另一个实施例中，通用供体细胞是HLA-A、HLA-B和HLA-C无效的，并具有HLA-E、HLA-G、PD-L1和至少一种安全开关蛋白中的一种或多种的引入的表达。在一些实施例中，通用供体细胞是B2M无效的，并具有HLA-E、HLA-G、PD-L1中的一种或多种的引入的表达，以及至少一种存活因子(例如，MANF)的增加或减少的表达。设想使用本文所述的基因编辑方法中的至少任一种进行产生本文所述的任何经遗传修饰的细胞的方法。
IV.细胞类型
如本文所述的细胞(例如，通用供体细胞)(和相应的未经修饰的细胞)可以属于任何可能种类的细胞类型。在一些实施例中，细胞(例如，通用供体细胞)(和相应的未经修饰的细胞)可以是哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞(例如，通用供体细胞)(和相应的未经修饰的细胞)可以是人细胞。在一些实施例中，细胞(例如，通用供体细胞)(和相应的未经修饰的细胞)可以是干细胞。在一些实施例中，细胞(例如，通用供体细胞)(和相应的未经修饰的细胞)可以是多能干细胞(PSC)。在一些实施例中，细胞(例如，通用供体细胞)(和相应的未经修饰的细胞)可以是胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞(ASC)、诱导多能干细胞(iPSC)或造血干细胞或祖细胞(HSPC)(也称为造血干细胞(HSC))。在一些实施例中，细胞(例如，通用供体细胞)(和相应的未经修饰的细胞)可以是分化细胞。在一些实施例中，细胞(例如，通用供体细胞)(和相应的未经修饰的细胞)可以是体细胞，例如免疫系统细胞或收缩细胞(例如，骨骼肌细胞)。
可以使本文所述的细胞(例如，通用供体干细胞)分化成相关细胞类型以评估HLA表达，以及评价通用干细胞系的免疫原性。通常，分化包括在足以使细胞分化成目的分化细胞的时间段和条件下维持目的细胞。例如，可以使本文披露的通用干细胞分化成间充质祖细胞(MPC)、低免疫原性心肌细胞、肌肉祖细胞、母细胞、内皮细胞(EC)、巨噬细胞、肝细胞、β细胞(例如，胰腺β细胞)、胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、造血祖细胞或神经祖细胞(NPC)。在一些实施例中，通用供体细胞可分化成定形内胚层细胞、原肠管细胞、后前肠细胞、胰腺内胚层细胞(PEC)、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞或成熟β细胞。
干细胞既能增殖又能产生更多的祖细胞，这些祖细胞反过来又具有产生大量母细胞的能力，这些母细胞反过来又能产生分化的或可分化的子细胞。子细胞本身可以被诱导增殖并产生后代，这些后代随后分化成一种或多种成熟细胞类型，同时还保留了一种或多种具有亲代发育潜能的细胞。因此，术语“干细胞”是指在特定情况下具有分化成更专门化或更分化的表型的能力或潜力，并且在某些情况下在无实质分化的情况下仍保持增殖的能力的细胞。在一个方面，术语祖细胞或干细胞是指广义的母细胞，该母细胞的子代(后代)通常在不同的方向上通过如在胚胎细胞和组织的逐渐多样化中发生的分化(例如，通过获取完全独立的特征)而专门化。细胞分化是通常通过许多细胞分裂发生的复杂过程。分化细胞可以源自多潜能细胞，该多潜能细胞本身也源自多潜能细胞等。虽然这些多潜能细胞中的每一个都可以被认为是干细胞，但每个多潜能细胞所能产生的细胞类型范围却可能变化很大。一些分化细胞也具有产生更大发展潜力的细胞的能力。这种能力可以是天然的，或者也可以在用各种因素处理后被人工诱导。在许多生物学实例中，干细胞也可以是“多潜能的”，因为它们可以产生超过一种不同细胞类型的后代，但是这不是“干性”所必需的。
“分化细胞”是比与之比较的细胞在发育途径中进一步发展的细胞。因此，干细胞可以分化成谱系限制性前体细胞(如，肌细胞祖细胞)，这些前体细胞反过来又可以分化成沿途径进一步分化的其他类型的前体细胞(如，肌细胞前体)，然后分化成终末期分化细胞(如肌细胞)，该终末期分化细胞在某些组织类型中起特定作用，并且可以保留或可以不保留进一步增殖的能力。在一些实施例中，分化细胞可以是胰腺β细胞。
胚胎干细胞
本文所述的细胞可以是胚胎干细胞(ESC)。ESC源自哺乳动物胚胎的胚细胞，并且能够分化成任何细胞类型并快速增殖。据信ESC也具有正常的核型，保持高端粒酶活性，并展现出显著的长期增殖潜力，从而使这些细胞成为用作通用供体细胞的优异候选物。
成体干细胞
本文所述的细胞可以是成体干细胞(ASC)。ASC是可以在哺乳动物(例如，人)中发现的未分化细胞。ASC通过其自我更新(例如，通过若干轮细胞复制传代同时保持其未分化状态)的能力和分化成若干种不同细胞类型(例如，神经胶质细胞)的能力来定义。成体干细胞是一类广泛的干细胞，其可以包括造血干细胞、乳腺干细胞、肠干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉成体干细胞、神经嵴干细胞和睾丸细胞。
诱导多能干细胞
本文所述的细胞可以是诱导多能干细胞(iPSC)。通过引入编码参与多能性的关键转录因子的基因(例如，OCT4、SOX2、cMYC和KLF4)，可以直接从成体人细胞产生iPSC。iPSC可以源自待施用后续祖细胞的同一受试者。也就是说，可以从受试者获得体细胞，将其重编程为诱导多能干细胞，然后再分化成待施用至受试者的祖细胞(例如，自体细胞)。然而，在自体细胞的情况下，仍然存在植入后免疫应答和活力差的风险。
人造血干细胞和祖细胞
本文所述的细胞可以是人造血干细胞和祖细胞(hHSPC)。该干细胞谱系产生所有血细胞类型，包括红系细胞(红细胞(erythrocyte)或红细胞(RBC))、骨髓细胞(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞/血小板和树突细胞)和淋巴样细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)。血细胞由非常小的多能造血干细胞(HSC)群的增殖和分化产生，这些多能造血干细胞也具有通过自我更新以补充自身的能力。在分化过程中，HSC的后代在达到成熟前经历各种中间成熟阶段，产生多潜能祖细胞和谱系定向祖细胞。骨髓(BM)是人体内血细胞生成的主要部位，并且在正常条件下，仅有少量造血干细胞和祖细胞(HSPC)可见于外周血(PB)。用细胞因子、用于癌症治疗的一些骨髓抑制药物以及破坏造血细胞与BM基质细胞之间的相互作用的化合物进行处理可快速动员大量干细胞和祖细胞进入循环。
细胞向其他细胞类型的分化
本披露的方法的另一个步骤可以包括使细胞分化成分化细胞。可以根据本领域已知的任何方法来进行分化步骤。例如，使用包括激活素和B27补充剂(生命技术公司(LifeTechnologies))在内的各种处理使人iPSC分化成定形内胚层。使定形内胚层进一步分化成肝细胞，处理包括：FGF4、HGF、BMP2、BMP4、抑瘤素M、地塞米松等(Duan等人,Stem Cells[干细胞],2010；28:674-686；Ma等人,Stem Cells Translational Medicine[干细胞转化医学],2013；2:409-419)。在另一个实施例中，可以根据Sawitza等人,Sci Rep.[科技报告]2015；5:13320进行分化步骤。分化细胞可以是哺乳动物(例如，人)的任何体细胞。在一些实施例中，体细胞可以是外分泌上皮细胞(例如，唾液腺粘液细胞、前列腺细胞)、激素分泌细胞(例如，垂体前叶细胞、肠道细胞、胰岛细胞)、角化上皮细胞(例如，表皮角质形成细胞)、湿分层屏障上皮细胞、感觉转导细胞(例如，光感受器)、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞(例如，施万(Schwann)细胞)、中枢神经系统神经元、神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞、少突胶质细胞)、晶状体细胞、脂肪细胞、肾细胞、屏障功能细胞(例如，导管细胞)、细胞外基质细胞、收缩细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞)、血细胞(例如，红细胞)、免疫系统细胞(例如，巨核细胞、小神经胶质细胞、中性粒细胞、肥大细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞)、生殖细胞(例如，精子细胞)、营养细胞或间质细胞。
通常，本文披露的通用供体细胞群体随时间保持插入的一个或多个核苷酸序列的表达。例如，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的通用供体细胞表达一种或多种致耐受性因子。此外，源自本文披露的通用供体细胞的谱系限制性或完全分化细胞群体随时间保持插入的一个或多个核苷酸序列的表达。例如，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的谱系限制性或完全分化细胞表达一种或多种致耐受性因子。
V.配制与施用
针对基因编辑的配制和递送
可以将如本文所述的引导RNA、多核苷酸(例如，编码致耐受性因子的多核苷酸或编码内切核酸酶的多核苷酸)和内切核酸酶以本领域已知的任何方式配制并递送至细胞。
根据特定的施用方式和剂型，将引导RNA和/或多核苷酸与药学上可接受的赋形剂(诸如载剂、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等)一起配制。可以将引导RNA和/或多核苷酸组合物配制以达到生理相容的pH，并且根据配制和施用途径，其范围是从约3的pH至约11的pH、约pH 3至约pH 7。在一些情况下，可以将pH调节到从约pH 5.0至约pH 8的范围。在一些情况下，组合物可以包含治疗有效量的至少一种如本文所述的化合物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。任选地，组合物可以包含本文所述的化合物的组合，或者可以包括可用于治疗或预防细菌生长的第二活性成分(例如但不限于抗菌剂或抗微生物剂)，或者可以包括本披露的试剂的组合。
合适的赋形剂包括例如载剂分子，这些载剂分子包括大的、缓慢代谢的大分子(如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒颗粒)。其他示例性赋形剂可以包括抗氧化剂(例如但不限于抗坏血酸)、螯合剂(例如但不限于EDTA)、碳水化合物(例如但不限于糊精、羟烷基纤维素和羟烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如但不限于油、水、盐水、甘油和乙醇)、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物来递送引导RNA多核苷酸(RNA或DNA)和/或一种或多种内切核酸酶多核苷酸(RNA或DNA)。替代性地，可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物(如电穿孔或脂质纳米颗粒)来递送一种或多种内切核酸酶多肽。在另外的替代性方面，DNA内切核酸酶可以作为一种或多种多肽单独地或与一种或多种引导RNA、或一种或多种crRNA与tracrRNA一起预复合地递送。
多核苷酸可以通过非病毒递送媒介物来递送，这些非病毒递送媒介物包括但不限于纳米颗粒、脂质体、核糖核蛋白、带正电荷的肽、小分子RNA-缀合物、适体-RNA嵌合体和RNA-融合蛋白复合体。一些示例性非病毒递送媒介物在Peer和Lieberman,Gene Therapy[基因疗法],2011,18:1127-1133(其重点是用于siRNA的非病毒递送媒介物也可用于递送其他多核苷酸)中有描述。
对于本披露的多核苷酸，配制品可以选自例如在国际申请PCT/US 2012/069610中教导的那些中的任一种。
通过脂质纳米颗粒(LNP)，可以将多核苷酸(诸如引导RNA、sgRNA和编码内切核酸酶的mRNA)递送至细胞或受试者。
LNP是指直径小于1000nm、500nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm或25nm的任何颗粒。替代性地，纳米颗粒的大小范围可以是从1-1000nm、1-500nm、1-250nm、25-200nm、25-100nm、35-75nm或25-60nm。
LNP可以由阳离子、阴离子或中性脂质制成。中性脂质(如融合磷脂DOPE或膜组分胆固醇)可以作为“辅助脂质”包括在LNP中，以增强转染活性和纳米颗粒的稳定性。阳离子脂质的局限性包括由于稳定性差和快速清除、以及炎性反应或消炎反应的产生而导致的功效低下。
LNP也可以由疏水性脂质、亲水性脂质或疏水性和亲水性脂质两者构成。
本领域已知的任何脂质或脂质组合均可以用于产生LNP。用于产生LNP的脂质的实例是：DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的实例是：98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1和7C1。中性脂质的实例是：DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。PEG修饰的脂质的实例是：PEG-DMG、PEG-CerC14和PEG-CerC20。
脂质能以任何数量的摩尔比组合以产生LNP。另外，该一种或多种多核苷酸能以宽范围的摩尔比与一种或多种脂质组合以产生LNP。
可以使用重组腺相关病毒(AAV)载体用于递送。用于产生rAAV颗粒的技术(其中向细胞提供待包装的AAV基因组(其包括待递送的多核苷酸、rep和cap基因以及辅助病毒功能))在本领域是标准的。rAAV的产生通常要求单个细胞(在本文中称为包装细胞)内存在以下组分：rAAV基因组，与rAAV基因组分开(即不在其中)的AAV rep和cap基因，以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自任何AAV血清型(从该AAV血清型中可以衍生重组病毒)，并且可以来自不同的AAV血清型而不是rAAV基因组ITR，包括但不限于本文所述的AAV血清型。假型rAAV的产生在例如国际专利申请公开号WO 01/83692中有披露。
细胞(例如，通用供体细胞)的配制与施用
如本文所述的经遗传修饰的细胞(例如，通用供体细胞)可以通过本领域已知的任何方式配制并施用至受试者。
术语“施用”、“引入”、“植入(implanting)”、“植入(engrafting)”和“移植”在将细胞(例如，祖细胞)放置(通过导致所引入的细胞在所需位点至少部分定位的方法或途径)到受试者中的背景下可互换地使用。可以通过任何适当的途径施用细胞(例如，祖细胞)或其分化的后代，该任何适当的途径导致递送至受试者中所需的位置，在该位置中至少一部分植入的细胞或细胞组分保持活力。在施用至受试者后，细胞的活力期可以短至数小时(例如，二十四小时)、几天，长达数年，或甚至受试者的寿命(即，长期植入)。
如本文所述的经遗传修饰的细胞(例如，通用供体细胞)可以在施用至受试者比未经修饰的细胞更长的时段之后是有活力的。
在一些实施例中，包含如本文所述的细胞的组合物可以通过合适的途径来施用，该合适的途径可以包括静脉内施用，例如作为推注或通过在一段时间内的连续输注。在一些实施例中，静脉内施用可以通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内或鞘内途径来进行。在一些实施例中，组合物可以呈固体形式、水性形式或液体形式。在一些实施例中，水性或液体形式可以是雾化或冻干的。在一些实施例中，雾化或冻干的形式可以用水性或液体溶液重构。
细胞组合物也可以被乳化或作为脂质体组合物呈现，其条件是乳化过程不会对细胞活力产生不利影响。可以将细胞和任何其他活性成分与药学上可接受的并且与活性成分相容的赋形剂混合，并以适用于本文所述的治疗方法的量混合。
细胞组合物中所含的另外的试剂可以包括其中的组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基基团形成)。与游离羧基基团形成的盐也可以源自无机碱(如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)以及有机碱(如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。
生理上可耐受的载剂是本领域众所周知的。示例性液体载剂是无菌水溶液，这些无菌水溶液除了活性成分和水外不含任何材料，或者含有缓冲液(如生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者，如磷酸盐缓冲盐水)。更进一步，水性载剂可以含有超过一种缓冲盐，以及盐(如氯化钠和氯化钾)、右旋糖、聚乙二醇和其他溶质。除了并排除水之外，液体组合物还可以含有液相。此类另外的液相的实例是甘油、植物油(如棉籽油)和水油乳剂。在细胞组合物中使用的有效治疗特定障碍或病症的活性化合物的量可以取决于障碍或病症的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。
在一些实施例中，可以将包含细胞的组合物施用至患有疾病、怀疑患有疾病或有疾病风险的受试者(例如，人类受试者)。在一些实施例中，可以将组合物施用至没有患有疾病、没有怀疑患有疾病或没有疾病风险的受试者。在一些实施例中，受试者是健康的人。在一些实施例中，受试者(例如，人类受试者)患有在遗传上可遗传的疾病、怀疑患有在遗传上可遗传的疾病或有在遗传上可遗传的疾病风险。在一些实施例中，受试者正在遭受或有风险患上指示疾病的症状。在一些实施例中，疾病是糖尿病，例如I型糖尿病或II型糖尿病。
VI.本披露的具体组合物和方法
因此，本披露特别涉及以下非限制性组合物和方法。
在第一组合物即组合物1中，本披露提供了包含通用供体细胞的组合物，该通用供体细胞包含插入编码存活因子的基因内或附近的编码第一致耐受性因子的核苷酸序列，其中该通用供体细胞表达该致耐受性因子并且具有破坏的该存活因子的表达，并且该通用供体细胞与对照细胞相比具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
在另一种组合物即组合物2中，本披露提供了如组合物1中所提供的组合物，其中该对照细胞是野生型细胞或不包含该插入的核苷酸序列的细胞。
在另一种组合物即组合物3中，本披露提供了如组合物1或2中所提供的组合物，其中该破坏的存活因子的表达包括降低或消除的表达。
在另一种组合物即组合物4中，本披露提供了如组合物1至3中任一项中所提供的组合物，其中该第一致耐受性因子是PD-L1、HLA-E、HLA-G、CTLA-4或CD47。
在另一种组合物即组合物5中，本披露提供了如组合物1至4中任一项中所提供的组合物，其中该存活因子是TXNIP、ZNF143、FOXO1、JNK或MANF。
在另一种组合物即组合物6中，本披露提供了如组合物权利要求1至5中任一项中所提供的组合物，其中该第一致耐受性因子是HLA-E并且该存活因子是TXNIP。
在另一种组合物即组合物7中，本披露提供了如组合物5或6中所提供的组合物，其中编码HLA-E的该核苷酸序列包含编码HLA-E三聚体的序列，该HLA-E三聚体包含与HLA-G呈递肽融合的B2M信号肽，该HLA-G呈递肽与B2M膜蛋白融合，该B2M膜蛋白与HLA-E融合而无其信号肽。
在另一种组合物即组合物8中，本披露提供了如组合物7中所提供的组合物，其中编码该HLA-E三聚体的该序列基本上由SEQ ID NO:55组成。
在另一种组合物即组合物9中，本披露提供了如组合物1至8中任一项中所提供的组合物，其中编码该第一致耐受性因子的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子，
在另一种组合物即组合物10中，本披露提供了如组合物9中所提供的组合物，其中该外源启动子是CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC启动子。
在另一种组合物即组合物11中，本披露提供了如组合物权利要求1至10中任一项中所提供的组合物，该组合物进一步包含插入编码MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子的基因内或附近的编码第二致耐受性因子的核苷酸序列，其中该通用供体细胞表达该致耐受性因子并且具有破坏的该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子的表达。
在另一种组合物即组合物12中，本披露提供了如组合物11中所提供的组合物，其中该破坏的MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子的表达包括降低或消除的表达。
在另一种组合物即组合物13中，本披露提供了如组合物11或12中所提供的组合物，其中该第二致耐受性因子是PD-L1、HLA-E、HLA-G、CTLA-4或CD47。
在另一种组合物即组合物14中，本披露提供了如组合物11至13中任一项中所提供的组合物，其中该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者该MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、NLRC5、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK
在另一种组合物即组合物15中，本披露提供了如组合物11至14中任一项中所提供的组合物，其中该第二致耐受性因子是PD-L1并且该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子是B2M。
在另一种组合物即组合物16中，本披露提供了如组合物15中所提供的组合物，其中编码PD-L1的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:11组成。
在另一种组合物即组合物17中，本披露提供了如组合物11至16中任一项中所提供的组合物，其中编码该第二致耐受性因子的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子，
在另一种组合物即组合物18中，本披露提供了如组合物17中所提供的组合物，其中该外源启动子是CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC启动子。
在另一种组合物即组合物19中，本披露提供了如组合物11至18中任一项中所提供的组合物，其中该第一致耐受性因子是HLA-E，该存活因子是TXNIP，该第二致耐受性因子是PD-L1，并且该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者该MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子是B2M。
在另一种组合物即组合物20中，本披露提供了如组合物1至19中任一项中所提供的组合物，其中该细胞是干细胞。
在另一种组合物即组合物21中，本披露提供了如组合物20中所提供的组合物，其中该干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。
在另一种组合物即组合物22中，本披露提供了如组合物1至19中任一项中所提供的组合物，其中该细胞是分化细胞或体细胞。
在另一种组合物即组合物23中，本披露提供了如组合物1至19中任一项中所提供的组合物，其中该细胞能够分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞。
在另一种组合物即组合物24中，本披露提供了如组合物23中所提供的组合物，其中这些谱系限制性祖细胞是胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、间充质祖细胞、肌肉祖细胞、母细胞、造血祖细胞或神经祖细胞。
在另一种组合物即组合物25中，本披露提供了如组合物23中所提供的组合物，其中这些完全分化体细胞是胰腺β细胞、上皮细胞、内胚层细胞、巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、血细胞、心肌细胞或免疫系统细胞。
在另一种组合物即组合物26中，本披露提供了如组合物1至25中任一项中所提供的组合物，其中该组合物包含多种通用供体细胞。
在另一种组合物即组合物27中，本披露提供了如组合物26中所提供的组合物，其中该组合物包含源自该多种通用供体细胞的谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞的群体。
在另一种组合物即组合物28中，本披露提供了如组合物27中所提供的组合物，其中这些谱系限制性祖细胞是胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、间充质祖细胞、肌肉祖细胞、母细胞、造血祖细胞或神经祖细胞，并且这些完全分化体细胞是胰腺β细胞、上皮细胞、内胚层细胞、巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、血细胞、心肌细胞或免疫系统细胞。
在另一种组合物即组合物29中，本披露提供了如组合物6或19中所提供的组合物，其中该组合物包含多种通用供体细胞。
在另一种组合物即组合物30中，本披露提供了如组合物29中所提供的组合物，其中该组合物包含源自该多种通用供体细胞的谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞的群体。
在另一种组合物即组合物31中，本披露提供了如组合物30中所提供的组合物，其中这些谱系限制性祖细胞是定形内胚层细胞、原肠管细胞、后前肠细胞、胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、未成熟β细胞或成熟β细胞，并且这些完全分化体细胞是胰腺β细胞。
在另一种组合物即组合物32中，本披露提供了如组合物26或29中所提供的组合物，其中至少约50％、至少约70％或至少约90％的这些细胞表达该第一致耐受性因子、该第二致耐受性因子、或该第一致耐受性因子和该第二致耐受性因子。
在另一种组合物即组合物33中，本披露提供了如组合物27、28、30或31中任一项中所提供的组合物，其中至少约50％、至少约70％或至少约90％的这些细胞表达该第一致耐受性因子、该第二致耐受性因子、或该第一致耐受性因子和该第二致耐受性因子。
在另一种组合物即组合物34中，本披露提供了一种组合物，该组合物包含组合物26的多种细胞或组合物27或28的细胞群体。
在另一种组合物即组合物35中，本披露提供了如组合物34中所提供的组合物，该组合物用于治疗有需要的受试者。
在另一种组合物即组合物36中，本披露提供了如组合物35中所提供的组合物，其中该受试者患有疾病、疑似患有疾病或有疾病风险。
在另一种组合物即组合物37中，本披露提供了如组合物36中所提供的组合物，其中该疾病是在遗传上可遗传的疾病。
在另一种组合物即组合物38中，本披露提供了一种组合物，该组合物包含组合物29的多种细胞或组合物30或31的细胞群体。
在另一种组合物即组合物39中，本披露提供了如组合物38中所提供的组合物，该组合物用于治疗有需要的受试者中的糖尿病。
在另一种组合物即组合物40中，本披露提供了如组合物39中所提供的组合物，其中该受试者患有I型糖尿病或II型糖尿病。
在另一种组合物即组合物41中，本披露提供了如组合物35至40中任一项中所提供的组合物，其中该受试者是人。
在第一方法即方法1中，本披露提供了获得用于向有需要的受试者施用的细胞的方法，该方法包括：(a)获得或已经获得组合物26、29或32中任一项的多种通用供体细胞，以及(b)在足以使这些细胞分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞的时间和条件下维持该多种通用供体细胞。
在另一种方法即方法2中，本披露提供了用于治疗有需要的受试者的方法，该方法包括：(a)获得或已经获得分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞后的组合物26、29或32中任一项的多种通用供体细胞；以及(b)向该受试者施用这些谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞。
在另一种方法即方法3中，本披露提供了如方法2中所提供的方法，其中施用包括将包含这些谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞的装置植入该受试者中。
在另一种方法即方法4中，本披露提供了如方法1至3中任一项中所提供的方法，其中这些谱系限制性祖细胞是胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、间充质祖细胞、肌肉祖细胞、母细胞、造血祖细胞或神经祖细胞，并且这些完全分化体细胞是胰腺β细胞、上皮细胞、内胚层细胞、巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、血细胞、心肌细胞或免疫系统细胞。
在另一种方法即方法5中，本披露提供了如方法1至4中任一项中所提供的方法，其中该受试者患有疾病、疑似患有疾病或有疾病风险。
在另一种方法即方法6中，本披露提供了如方法5中所提供的方法，其中该疾病是在遗传上可遗传的疾病。
在另一种方法即方法7中，本披露提供了如方法1至6中任一项中所提供的方法，其中该受试者是人。
在另一种方法即方法8中，本披露提供了用于治疗有需要的受试者中的糖尿病的方法，该方法包括：(a)获得或已经获得分化成胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞后的组合物29或32的多种通用供体细胞；以及(b)向该受试者施用这些胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞。
在另一种方法即方法9中，本披露提供了如方法8中所提供的方法，其中施用包括将包含这些胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞的装置植入该受试者中。
在另一种方法即方法10中，本披露提供了如方法8或9中所提供的方法，其中该受试者患有I型糖尿病或II型糖尿病。
在另一种方法即方法11中，本披露提供了如方法8至10中任一项中所提供的方法，其中该受试者是人。
在另一种组合物即组合物41中，本披露提供了包含通用供体细胞的组合物，该通用供体细胞包含插入编码硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)的基因内或附近的编码HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA-E)的核苷酸序列，其中该通用供体细胞表达HLA-E并且具有破坏的TXNIP表达，并且该通用供体细胞与对照相比具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
在另一种组合物即组合物42中，本披露提供了如组合物41中所提供的组合物，其中该对照细胞是野生型细胞或不包含插入的核苷酸序列的细胞。
在另一种组合物即组合物43中，本披露提供了如组合物41中所提供的组合物，其中该破坏的TXNIP表达包括降低的或消除的表达。
在另一种组合物即组合物44中，本披露提供了如组合物41中所提供的组合物，其中编码HLA-E的该核苷酸序列包含编码HLA-E三聚体的序列，该HLA-E三聚体包含与HLA-G呈递肽融合的B2M信号肽，该HLA-G呈递肽与B2M膜蛋白融合，该B2M膜蛋白与HLA-E融合而无其信号肽。
在另一种组合物即组合物45中，本披露提供了如组合物44中所提供的组合物，其中编码该HLA-E三聚体的该序列基本上由SEQ ID NO:55组成。
在另一种组合物即组合物46中，本披露提供了如组合物41中所提供的组合物，其中编码HLA-E的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子，
在另一种组合物即组合物47中，本披露提供了如组合物41中所提供的组合物，其中该外源启动子是CAG启动子。
在另一种组合物即组合物48中，本披露提供了如组合物41中所提供的组合物，其中该细胞是干细胞。
在另一种组合物即组合物49中，本披露提供了如组合物48中所提供的组合物，其中该干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。
在另一种组合物即组合物50中，本披露提供了如组合物41中所提供的组合物，其中该细胞是分化细胞或体细胞。
在另一种组合物即组合物51中，本披露提供了如组合物41中所提供的组合物，其中该细胞能够分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞。
在另一种组合物即组合物52中，本披露提供了如组合物51中所提供的组合物，其中这些谱系限制性祖细胞是定形内胚层细胞、原肠管细胞、后前肠细胞、胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、未成熟β细胞或成熟β细胞，并且这些完全分化体细胞是胰腺β细胞。
在另一种组合物即组合物53中，本披露提供了一种组合物，该组合物包含如组合物41中所提供的多种通用供体细胞。
在另一种组合物即组合物54中，本披露提供了如组合物53中所提供的组合物，其中至少约50％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物55中，本披露提供了如组合物53中所提供的组合物，其中至少约70％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物56中，本披露提供了如组合物53中所提供的组合物，其中至少约90％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物57中，本披露提供了一种组合物，该组合物包含源自组合物53的多种通用供体细胞的谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞的群体。
在另一种组合物即组合物58中，本披露提供了如组合物57中所提供的组合物，其中这些谱系限制性祖细胞是定形内胚层细胞、原肠管细胞、后前肠细胞、胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、未成熟β细胞或成熟β细胞，并且这些完全分化体细胞是胰腺β细胞。
在另一种组合物即组合物59中，本披露提供了如组合物58中所提供的组合物，其中至少约50％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物60中，本披露提供了如组合物59中所提供的组合物，其中至少约70％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物61中，本披露提供了如组合物59中所提供的组合物，其中至少约90％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物62中，本披露提供了包含经遗传修饰的细胞的组合物，该经遗传修饰的细胞具有引入的或增加的HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA-E)表达和破坏的硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)表达，其中与未经修饰的细胞相比，该经遗传修饰的细胞具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
在另一种组合物即组合物63中，本披露提供了如组合物62中所提供的组合物，该组合物包含插入编码TXNIP的基因内或附近的编码HLA-E的核苷酸序列，从而破坏该TXNIP基因。
在另一种组合物即组合物64中，本披露提供了如组合物62中所提供的组合物，其中该破坏的TXNIP表达包括降低的或消除的表达
在另一种方法即方法12中，本披露提供了用于治疗有需要的受试者中的糖尿病的方法，该方法包括：获得或已经获得分化成胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞后的组合物53的多种通用供体细胞；以及(b)向该受试者施用这些胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞。
在另一种方法即方法13中，本披露提供了如方法12中所提供的方法，其中施用包括将包含这些胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞的装置植入该受试者中。
在另一种方法即方法14中，本披露提供了如方法12中所提供的方法，其中该受试者患有I型糖尿病或II型糖尿病。
在另一种方法即方法15中，本披露提供了如方法12中所提供的方法，其中该受试者是人。
在另一种组合物即组合物65中，本披露提供了包含通用供体细胞的组合物，该通用供体细胞包含(a)插入编码β-2微球蛋白(B2M)的基因内或附近的编码程序性死亡配体1(PD-L1)的核苷酸序列和(b)插入编码硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)的基因内或附近的编码HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA-E)的核苷酸序列，其中该通用供体细胞表达PD-L1和HLA-E并且具有破坏的B2M和TXNIP表达，并且该通用供体细胞与对照细胞相比具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
在另一种组合物即组合物66中，本披露提供了如组合物65中所提供的组合物，其中该对照细胞是野生型细胞或不包含插入的核苷酸序列的细胞。
在另一种组合物即组合物67中，本披露提供了如组合物65中所提供的组合物，其中该破坏的B2M表达包括降低或消除的B2M表达，并且该破坏的TXNIP表达包括降低或消除的TXNIP表达。
在另一种组合物即组合物68中，本披露提供了如组合物65中所提供的组合物，其中编码PD-L1的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:11组成。
在另一种组合物即组合物69中，本披露提供了如组合物65中所提供的组合物，其中编码HLA-E的该核苷酸序列包含编码HLA-E三聚体的序列，该HLA-E三聚体包含与HLA-G呈递肽融合的B2M信号肽，该HLA-G呈递肽与B2M膜蛋白融合，该B2M膜蛋白与HLA-E融合而无其信号肽。
在另一种组合物即组合物70中，本披露提供了如组合物69中所提供的组合物，其中编码该HLA-E三聚体的该序列基本上由SEQ ID NO:55组成。
在另一种组合物即组合物71中，本披露提供了如组合物65中所提供的组合物，其中编码PD-L1的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子，并且编码HLA-E的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子。
在另一种组合物即组合物72中，本披露提供了如组合物71中所提供的组合物，其中该外源启动子是CAG启动子。
在另一种组合物即组合物73中，本披露提供了如组合物65中所提供的组合物，其中该细胞是干细胞。
在另一种组合物即组合物74中，本披露提供了如组合物73中所提供的组合物，其中该干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。
在另一种组合物即组合物75中，本披露提供了如组合物65中所提供的组合物，其中该细胞是分化细胞或体细胞。
在另一种组合物即组合物76中，本披露提供了如组合物65中所提供的组合物，其中该细胞能够分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞。
在另一种组合物即组合物77中，本披露提供了如组合物76中所提供的组合物，其中这些谱系限制性祖细胞是定形内胚层细胞、原肠管细胞、后前肠细胞、胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、未成熟β细胞或成熟β细胞，并且这些完全分化体细胞是胰腺β细胞。
在另一种组合物即组合物78中，本披露提供了一种组合物，该组合物包含如组合物65中所提供的多种通用供体细胞。
在另一种组合物即组合物79中，本披露提供了如组合物78中所提供的组合物，其中至少约50％的这些细胞表达PD-L1以及/或者至少约50％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物80中，本披露提供了如组合物78中所提供的组合物，其中至少约70％的这些细胞表达PD-L1以及/或者至少约70％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物81中，本披露提供了如组合物78中所提供的组合物，其中至少约90％的这些细胞表达PD-L1以及/或者至少约90％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物82中，本披露提供了一种组合物，该组合物包含源自如组合物78中所提供的多种通用供体细胞的谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞的群体。
在另一种组合物即组合物83中，本披露提供了如组合物82中所提供的组合物，其中这些谱系限制性祖细胞是定形内胚层细胞、原肠管细胞、后前肠细胞、胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、未成熟β细胞或成熟β细胞，并且这些完全分化体细胞是胰腺β细胞。
在另一种组合物即组合物84中，本披露提供了如组合物83中所提供的组合物，其中至少约50％的这些细胞表达PD-L1以及/或者至少约50％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物85中，本披露提供了如组合物83中所提供的组合物，其中至少约70％的这些细胞表达PD-L1以及/或者至少约70％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物86中，本披露提供了如组合物83中所提供的组合物，其中至少约90％的这些细胞表达PD-L1以及/或者至少约90％的这些细胞表达HLA-E。
在另一种组合物即组合物87中，本披露提供了包含经遗传修饰的细胞的组合物，该经遗传修饰的细胞具有引入的或增加的PD-L1和HLA-E表达和破坏的B2M和TXNIP表达，其中与未经修饰的细胞相比，该经遗传修饰的细胞具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
在另一种组合物即组合物88中，本披露提供了如组合物87中所提供的组合物，该组合物包含插入编码B2M的基因内或附近的编码PD-L1的核苷酸序列，从而破坏该B2M基因，以及插入编码TXNIP的基因内或附近的编码HLA-E的核苷酸序列，从而破坏该TXNIP基因。
在另一种组合物即组合物89中，本披露提供了如组合物87中所提供的组合物，其中该破坏的B2M和TXNIP表达包括降低或消除的B2M和TXNIP表达。
在另一种方法即方法16中，本披露提供了用于治疗有需要的受试者中的糖尿病的方法，该方法包括：(a)获得或已经获得分化成胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞后的组合物78的多种通用供体细胞；以及(b)向该受试者施用这些胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞。
在另一种方法即方法17中，本披露提供了如方法16中所提供的方法，其中施用包括将包含这些胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞的装置植入该受试者中。
在另一种方法即方法18中，本披露提供了如方法16中所提供的方法，其中该受试者患有I型糖尿病或II型糖尿病。
在另一种方法即方法19中，本披露提供了如方法16中所提供的方法，其中该受试者是人。
在另一种方法即方法20中，本披露提供了用于产生通用供体细胞的方法，该方法包括向细胞递送：(a)靶向编码存活因子的基因内或附近的位点的第一定点核酸酶；和(b)包含编码第一致耐受性因子的核苷酸序列的第一核酸，该核苷酸序列的侧翼是(i)与位于(a)的靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列和(ii)与位于(a)的该靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中该第一定点核酸酶切割(a)的该靶位点，并且(b)的该第一核酸被插入在与(a)的该位点部分重叠、完全重叠或包含在该位点内的位点处，从而产生通用供体细胞，其中该通用供体细胞与其中未插入(b)的该核酸的细胞相比具有增加的细胞存活。
在另一种方法即方法21中，本披露提供了如方法20中所提供的方法，其中该存活因子是TXNIP、ZNF143、FOXO1、JNK或MANF。
在另一种方法即方法22中，本披露提供了如方法20或21中所提供的方法，其中该第一致耐受性因子是PD-L1、HLA-E、HLA-G、CTLA-4或CD47。
在另一种方法即方法23中，本披露提供了如方法20至22中任一项中所提供的方法，其中该存活因子是TXNIP。
在另一种方法即方法24中，本披露提供了如方法23中所提供的方法，其中该第一致耐受性因子是HLA-E。
在另一种方法即方法25中，本披露提供了如方法20至24中任一项中所提供的方法，其中该第一定点核酸酶是包含CRISPR核酸酶和引导RNA(gRNA)的CRISPR系统。
在另一种方法即方法26中，本披露提供了如方法20至25中任一项中所提供的方法，其中该CRISPR核酸酶是II型Cas9核酸酶或V型Cfp1核酸酶，并且该CRISPR核酸酶连接到至少一个核定位信号。
在另一种方法即方法27中，本披露提供了如方法20至26中任一项中所提供的方法，其中该gRNA包含对应于由SEQ ID NO:15-24组成的靶序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法28中，本披露提供了如方法25至27中任一项中所提供的方法，其中(b)(i)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:25组成，并且(b)(ii)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:32组成。
在另一种方法即方法29中，本披露提供了如方法20至28中任一项中所提供的方法，其中该方法进一步包括向该细胞递送：(c)靶向编码MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子中的一种或多种的基因内或附近的位点的第二定点核酸酶；和(d)包含编码第二致耐受性因子的核苷酸序列的第二核酸，该核苷酸序列的侧翼是(iii)与位于(c)的该靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列和(iv)与位于(c)的该靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中(d)的该第二致耐受性因子不同于(b)的该第一致耐受性因子，其中该第二定点核酸酶切割(c)的该靶位点，并且(d)的该第二核酸被插入在与(c)的该位点部分重叠、完全重叠或包含在该位点内的位点处，其中该通用供体细胞与其中未插入(d)的该第二核酸的细胞相比具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
在另一种方法即方法30中，本披露提供了如方法29中所提供的方法，其中该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者该MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、NLRC5、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK。
在另一种方法即方法31中，本披露提供了如方法29或30中所提供的方法，其中该第二致耐受性因子是PD-L1、HLA-E、HLA-G、CTLA-4或CD47。
在另一种方法即方法32中，本披露提供了如方法29至31中任一项中所提供的方法，其中该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者该MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子是B2M。
在另一种方法即方法33中，本披露提供了如方法32中所提供的方法，其中该第二致耐受性因子是PD-L1。
在另一种方法即方法34中，本披露提供了如方法29至33中任一项中所提供的方法，其中该第二定点核酸酶是包含CRISPR核酸酶和gRNA的CRISPR系统。
在另一种方法即方法35中，本披露提供了如方法34中所提供的方法，其中该CRISPR核酸酶是II型Cas9核酸酶或V型Cfp1核酸酶，并且该CRISPR核酸酶连接到至少一个核定位信号。
在另一种方法即方法36中，本披露提供了如方法34或35中所提供的方法，其中该gRNA包含对应于由SEQ ID NO:1-3或35-44组成的靶序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法37中，本披露提供了如方法34至36中任一项中所提供的方法，其中(d)(iii)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:7组成，并且(d)(iv)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:13组成。
在另一种方法即方法38中，本披露提供了如方法25至28或34至37中任一项中所提供的方法，其中该CRISPR核酸酶和该gRNA以1:3的摩尔比存在。
在另一种方法即方法39中，本披露提供了如方法20至38中任一项中所提供的方法，其中编码该第一致耐受性因子的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子，并且编码该第二致耐受性因子的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子。
在另一种方法即方法40中，本披露提供了如方法39中所提供的方法，其中该外源启动子是组成型启动子、诱导型启动子、时间特异性启动子、组织特异性启动子或细胞类型特异性启动子，任选地其中该外源启动子是CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC启动子。
在另一种方法即方法41中，本披露提供了用于产生通用供体细胞的方法，该方法包括向细胞递送：(a)靶向编码存活因子的基因内或附近的位点的第一定点核酸酶；(b)包含编码第一致耐受性因子的核苷酸序列的第一核酸，该核苷酸序列的侧翼是(i)与位于(a)的靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列和(ii)与位于(a)的该靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中该第一定点核酸酶切割(a)的该靶位点，并且通过同源重组过程，(b)的该第一核酸被用作模板，用于将编码该第一致耐受性因子的该核苷酸序列插入到与(a)的该位点部分重叠、完全重叠或包含在该位点内的位点中，从而破坏(a)的该基因；(c)靶向编码MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子中的一种或多种的基因内或附近的位点的第二定点核酸酶；和(d)包含编码第二致耐受性因子的核苷酸序列的第二核酸，该核苷酸序列的侧翼是(iii)与位于(c)的该靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列和(iv)与位于(c)的该靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中(d)的该致耐受性因子不同于(b)的该致耐受性因子，其中该第二定点核酸酶切割(c)的该靶位点，并且通过同源重组过程，(d)的该第二核酸被用作模板，用于将编码该第二致耐受性因子的该核苷酸序列插入到与(c)的该位点部分重叠、完全重叠或包含在该位点内的位点中，从而破坏(c)的该基因，从而产生通用供体细胞，其中该通用供体细胞与其中未插入(b)的该第一核酸和(d)的该第二核酸的细胞相比具有增加的细胞存活。
在另一种方法即方法42中，本披露提供了如方法41中所提供的方法，其中该存活因子是TXNIP，该第一致耐受性因子是HLA-E，该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者该MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子是B2M，并且该第二致耐受性因子是PD-L1。
在另一种方法即方法43中，本披露提供了如方法20至42中任一项中所提供的方法，其中该细胞是哺乳动物细胞，任选地其中该细胞是人细胞。
在另一种方法即方法44中，本披露提供了如方法20至43中任一项中所提供的方法，其中该细胞是干细胞。
在另一种方法即方法45中，本披露提供了如方法20至43中任一项中所提供的方法，其中该细胞是多能干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。
在另一种方法即方法46中，本披露提供了如方法20至43中任一项中所提供的方法，其中该细胞是分化细胞或体细胞。
在另一种方法即方法47中，本披露提供了如方法20至43中任一项中所提供的方法，其中该通用供体细胞能够分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞。
在另一种方法即方法48中，本披露提供了如方法47中所提供的方法，其中这些谱系限制性祖细胞是胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、间充质祖细胞、肌肉祖细胞、母细胞、造血祖细胞或神经祖细胞。
在另一种方法即方法49中，本披露提供了如方法47中所提供的方法，其中这些完全分化体细胞是内分泌细胞诸如胰腺β细胞、上皮细胞、内胚层细胞、巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、血细胞或免疫系统细胞。
在另一种方法即方法49A中，本披露提供了如方法47中所提供的方法，其中这些完全分化体细胞是心肌细胞或免疫系统细胞。
在另一种组合物即组合物90中，本披露提供了一种组合物，该组合物包含通过方法20至49中任一项产生的多种通用供体细胞。
在另一种组合物即组合物91中，本披露提供了如组合物90所提供的组合物，在足以使这些细胞经历分化的时间和条件下维持该组合物。
在另一种组合物即组合物92中，本披露提供了如组合物90或91所提供的组合物，该组合物用于治疗有需要的受试者。
在另一种组合物即组合物93中，本披露提供了如组合物92所提供的组合物，其中该受试者是患有疾病、疑似患有疾病或有疾病风险的人。
在另一种方法即方法50中，本披露提供了一种方法，该方法包括向受试者施用组合物90或91的多种通用供体细胞。
在另一种方法即方法51中，本披露提供了用于治疗有需要的受试者的方法，该方法包括：(a)获得或已经获得分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞后的组合物90的多种通用供体细胞；以及(b)向该受试者施用这些谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞。
在另一种方法即方法52中，本披露提供了获得用于向有需要的受试者施用的细胞的方法，该方法包括：(a)获得或已经获得如权利要求31所述的通用供体细胞；以及(b)在足以使这些细胞分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞的时间和条件下维持这些通用供体细胞。
在另一种方法即方法53中，本披露提供了如方法51或52所提供的方法，其中这些谱系限制性祖细胞是胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、间充质祖细胞、肌肉祖细胞、母细胞、造血祖细胞或神经祖细胞。
在另一种方法即方法54中，本披露提供了如方法51或52所提供的方法，其中这些完全分化体细胞是内分泌细胞如胰腺β细胞、上皮细胞、内胚层细胞、巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、血细胞或免疫系统细胞。
在另一种方法即方法54A中，本披露提供了如方法51或52中所提供的方法，其中这些完全分化体细胞是心肌细胞。
在另一种方法即方法55中，本披露提供了如方法50至54所提供的方法，其中该受试者是患有疾病、怀疑患有疾病或有疾病风险的人。
在另一种方法即方法56中，本披露提供了如方法55所提供的方法，其中该疾病是在遗传上可遗传的疾病。
在另一种组合物即组合物93中，本披露提供了包含对应于由SEQ ID NO:15-24组成的靶序列的间隔子序列的引导RNA。
在另一种方法即方法57中，本披露提供了用于产生通用供体细胞的体外方法，该方法包括向干细胞递送：(a)RNA引导的核酸酶；(b)靶向硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)；和(c)包含核酸的载体，该核酸包含：(i)编码致耐受性因子的核苷酸序列；(ii)基本上由SEQ ID NO:25组成并且与位于该靶位点的左侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iii)基本上由SEQID NO:32组成并且与位于该靶位点的右侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中(i)的侧翼是(ii)和(iii)；其中该TXNIP基因座在该靶位点处被切割并且该核酸被插入该TXNIP基因座中，从而破坏该TXNIP基因并且产生通用供体细胞，其中该通用供体细胞与对照细胞相比具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
在另一种方法即方法57A中，本披露提供了如方法57所提供的方法，其中将该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该TXNIP基因座中。
在另一种方法即方法58中，本披露提供了如方法57所提供的方法，其中该对照细胞是野生型细胞或不包含该插入的核酸的细胞。
在另一种方法即方法59中，本披露提供了如方法57所提供的方法，其中该破坏的TXNIP基因具有降低或消除的TXNIP表达。
在另一种方法即方法60中，本披露提供了如方法57所提供的方法，其中该gRNA包含对应于由SEQ ID NO:15-24组成的序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法61中，本披露提供了如方法57所提供的方法，其中该gRNA包含对应于由SEQ ID NO:20组成的序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法62中，本披露提供了如方法57所提供的方法，其中该载体是质粒载体。
在另一种方法即方法63中，本披露提供了如方法57所提供的方法，其中该致耐受性因子是HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA-E)。
在另一种方法即方法64中，本披露提供了如方法63所提供的方法，其中编码HLA-E的该核苷酸序列包含编码HLA-E三聚体的序列，该HLA-E三聚体包含与HLA-G呈递肽融合的B2M信号肽，该HLA-G呈递肽与B2M膜蛋白融合，该B2M膜蛋白与HLA-E融合而无其信号肽。
在另一种方法即方法65中，本披露提供了如方法63所提供的方法，其中编码该HLA-E三聚体的该序列基本上由SEQ ID NO:55组成。
在另一种方法即方法66中，本披露提供了如方法65所提供的方法，其中编码该HLA-E三聚体的该序列可操作地连接到外源启动子。
在另一种方法即方法67中，本披露提供了如方法66所提供的方法，其中该外源启动子是CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC启动子。
在另一种方法即方法68中，本披露提供了如方法57所提供的方法，其中该RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶。
在另一种方法即方法69中，本披露提供了如方法68所提供的方法，其中该Cas9核酸酶连接到至少一个核定位信号。
在另一种方法即方法70中，本披露提供了如方法69所提供的方法，其中该Cas9核酸酶和该gRNA以1:3的摩尔比存在。
在另一种方法即方法71中，本披露提供了如方法57所提供的方法，其中该干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。
在另一种方法即方法72中，本披露提供了如方法57所提供的方法，其中该干细胞是人干细胞。
在另一种方法即方法73中，本披露提供了用于产生通用供体细胞的体外方法，该方法包括向干细胞递送：(a)RNA引导的核酸酶；(b)靶向硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)，和(c)包含核酸的载体，该核酸包含：(i)编码致耐受性因子的核苷酸序列；(ii)与位于该靶位点的左侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iii)与位于该靶位点的右侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中(i)的侧翼是(ii)和(iii)，并且该载体包含由SEQ ID NO:34或56组成的核苷酸序列；其中该TXNIP基因座在该靶位点处被切割并且该核酸被插入该TXNIP基因座中，从而破坏该TXNIP基因并且产生通用供体细胞，其中该通用供体细胞与对照细胞相比具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
在另一种方法即方法73A中，本披露提供了如方法73所提供的方法，其中将该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该TXNIP基因座中。
在另一种方法即方法74中，本披露提供了如方法73所提供的方法，其中该对照细胞是野生型细胞或不包含该插入的核酸的细胞。
在另一种方法即方法75中，本披露提供了如方法73所提供的方法，其中该破坏的TXNIP基因具有降低或消除的TXNIP表达。
在另一种方法即方法76中，本披露提供了如方法73所提供的方法，其中该gRNA包含对应于由SEQ ID NO:15-24组成的序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法77中，本披露提供了如方法73所提供的方法，其中该gRNA包含对应于由SEQ ID NO:20组成的序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法78中，本披露提供了如方法73所提供的方法，其中该载体是质粒载体。
在另一种方法即方法79中，本披露提供了如方法73所提供的方法，其中该致耐受性因子是HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA-E)。
在另一种方法即方法80中，本披露提供了如方法73所提供的方法，其中该RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶。
在另一种方法即方法81中，本披露提供了如方法80所提供的方法，其中该Cas9核酸酶连接到至少一个核定位信号。
在另一种方法即方法82中，本披露提供了如方法80所提供的方法，其中该Cas9核酸酶和该gRNA以1:3的摩尔比存在。
在另一种方法即方法83中，本披露提供了如方法73所提供的方法，其中该干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。
在另一种方法即方法84中，本披露提供了如方法73所提供的方法，其中该干细胞是人干细胞。
在另一种方法即方法85中，本披露提供了用于产生通用供体细胞的体外方法，该方法包括向干细胞递送：(a)包含RNA引导的核酸酶和靶向β-2微球蛋白(B2M)基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)的第一核糖核蛋白(RNP)复合体；(b)包含核酸的第一载体，该核酸包含：(i)编码第一致耐受性因子的核苷酸序列；(ii)基本上由SEQ ID NO:7组成并且与位于该B2M基因座中的该靶位点的左侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iii)基本上由SEQ ID NO:13组成并且与位于该B2M基因座中的该靶位点的右侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中(i)的侧翼是(ii)和(iii)；其中该B2M基因座在该靶位点被切割，并且包含编码该第一致耐受性因子的核苷酸序列的核酸被插入该B2M基因座中，从而破坏该B2M基因；(c)包含RNA引导的核酸酶和靶向硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因座中的靶位点的gRNA的第二RNP复合体；和(d)包含核酸的第二载体，该核酸包含：(i)编码第二致耐受性因子的核苷酸序列；(ii)基本上由SEQ ID NO:25组成并且与位于该TXNIP基因座中的该靶位点的左侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iii)基本上由SEQ ID NO:32组成并且与位于该TXNIP基因座中的该靶位点的右侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中(i)的侧翼是(ii)和(iii)；其中该TXNIP基因座在该靶位点被切割，并且包含编码该第二致耐受性因子的核苷酸序列的核酸被插入该TXNIP基因座中，从而破坏该TXNIP基因并且产生通用供体细胞，其中该通用供体细胞与对照细胞相比具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
在另一种方法即方法85A中，本披露提供了如方法85所提供的方法，其中将(b)中的该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该B2M基因座中和/或其中将(d)中的该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该TXNIP基因座中。
在另一种方法即方法86中，本披露提供了如方法85所提供的方法，其中该对照细胞是野生型细胞或不包含该插入的核酸的细胞。
在另一种方法即方法87中，本披露提供了如方法85所提供的方法，该破坏的B2M基因具有降低或消除的B2M表达，并且该破坏的TXNIP基因具有降低或消除的TXNIP表达。
在另一种方法即方法88中，本披露提供了如方法85所提供的方法，其中该第一RNP复合体的gRNA包含对应于由SEQ ID NO:1-3或35-44组成的序列的间隔子序列，并且该第二RNP复合体的gRNA包含对应于由SEQ ID NO:15-24组成的序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法89中，本披露提供了如方法85所提供的方法，其中该第一RNP复合体的gRNA包含对应于由SEQ ID NO:2组成的序列的间隔子序列，并且该第二RNP复合体的gRNA包含对应于由SEQ ID NO:20组成的序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法90中，本披露提供了如方法85所提供的方法，其中该第一载体是质粒载体，并且该第二载体是质粒载体。
在另一种方法即方法91中，本披露提供了如方法85所提供的方法，其中该第一致耐受性因子是程序性死亡配体1(PD-L1)，并且该第二致耐受性因子是HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA-E)。
在另一种方法即方法92中，本披露提供了如方法91所提供的方法，其中编码PD-L1的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:11组成。
在另一种方法即方法93中，本披露提供了如方法91所提供的方法，其中编码HLA-E的该核苷酸序列包含编码HLA-E三聚体的序列，该HLA-E三聚体包含与HLA-G呈递肽融合的B2M信号肽，该HLA-G呈递肽与B2M膜蛋白融合，该B2M膜蛋白与HLA-E融合而无其信号肽，并且编码该HLA-E三聚体的该序列基本上由SEQ ID NO:55组成。
在另一种方法即方法94中，本披露提供了如方法85所提供的方法，其中编码该第一致耐受性因子的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子，并且编码该第二致耐受性因子的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子。
在另一种方法即方法95中，本披露提供了如方法94所提供的方法，其中该外源启动子是CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC启动子。
在另一种方法即方法96中，本披露提供了如方法85所提供的方法，其中该第一RNP复合体和该第二RNP复合体中的每一种包含1:3的RNA引导的核酸酶与gRNA的摩尔比。
在另一种方法即方法97中，本披露提供了如方法85所提供的方法，其中该第一RNP复合体和该第二RNP复合体各自的RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶。
在另一种方法即方法98中，本披露提供了如方法97所提供的方法，其中该Cas9核酸酶连接到至少一个核定位信号。
在另一种方法即方法99中，本披露提供了如方法85所提供的方法，其中该干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。
在另一种方法即方法100中，本披露提供了如方法85所提供的方法，其中该干细胞是人干细胞。
在另一种方法即方法101中，本披露提供了用于产生通用供体细胞的体外方法，该方法包括向干细胞递送：(a)包含RNA引导的核酸酶和靶向β-2微球蛋白(B2M)基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)的第一核糖核蛋白(RNP)复合体；(b)包含核酸的第一载体，该核酸包含：(i)编码第一致耐受性因子的核苷酸序列；(ii)与位于该B2M基因座中的该靶位点的左侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iii)与位于该B2M基因座中的该靶位点的右侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中(i)的侧翼是(ii)和(iii)，并且该第一载体包含由SEQ IDNO:33组成的核苷酸序列；其中该B2M基因座在该靶位点被切割，并且包含编码该第一致耐受性因子的核苷酸序列的核酸被插入其中的该B2M基因座中，从而破坏该B2M基因；(c)包含RNA引导的核酸酶和靶向硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因座中的靶位点的gRNA的第二RNP复合体；和(d)包含核酸的第二载体，该核酸包含：(i)编码第二致耐受性因子的核苷酸序列；(ii)与位于该TXNIP基因座中的该靶位点的左侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iii)与位于该TXNIP基因座中的该靶位点的右侧且在该靶位点的50个核碱基内的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中(i)的侧翼是(ii)和(iii)，并且该第二载体包含由SEQ ID NO:34或56组成的核苷酸序列，其中该TXNIP基因座在该靶位点被切割，并且包含编码该第二致耐受性因子的核苷酸序列的核酸被插入该TXNIP基因座中，从而破坏该TXNIP基因并且产生通用供体细胞，其中该通用供体细胞与对照细胞相比具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
在另一种方法即方法101A中，本披露提供了如方法101所提供的方法，其中将(b)中的该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该B2M基因座中和/或其中将(d)中的该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该TXNIP基因座中。
在另一种方法即方法102中，本披露提供了如方法101所提供的方法，其中该对照细胞是野生型细胞或不包含该插入的核酸的细胞。
在另一种方法即方法103中，本披露提供了如方法10所提供的方法，其中该破坏的B2M基因具有降低或消除的B2M表达，并且该破坏的TXNIP基因具有降低或消除的TXNIP表达。
在另一种方法即方法104中，本披露提供了如方法101所提供的方法，其中该第一RNP复合体的gRNA包含对应于由SEQ ID NO:1-3或35-44组成的序列的间隔子序列，并且该第二RNP复合体的gRNA包含对应于由SEQ ID NO:15-24组成的序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法105中，本披露提供了如方法101所提供的方法，其中该第一RNP复合体的gRNA包含对应于由SEQ ID NO:2组成的序列的间隔子序列，并且该第二RNP复合体的gRNA包含对应于由SEQ ID NO:20组成的序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法106中，本披露提供了如方法101所提供的方法，其中该第一载体是质粒载体，并且该第二载体是质粒载体。
在另一种方法即方法107中，本披露提供了如方法101所提供的方法，其中该第一致耐受性因子是程序性死亡配体1(PD-L1)，并且该第二致耐受性因子是HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA-E)。
在另一种方法即方法108中，本披露提供了如方法101所提供的方法，其中该第一RNP复合体和该第二RNP复合体中的每一种包含1:3的RNA引导的核酸酶与gRNA的摩尔比。
在另一种方法即方法109中，本披露提供了如方法101所提供的方法，其中该第一RNP复合体和该第二RNP复合体各自的RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶。
在另一种方法即方法110中，本披露提供了如方法109所提供的方法，其中该Cas9核酸酶连接到至少一个核定位信号。
在另一种方法即方法111中，本披露提供了如方法101所提供的方法，其中该干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。
在另一种方法即方法112中，本披露提供了如方法101所提供的方法，其中该干细胞是人干细胞。
在第一方法即方法1中，本披露提供了用于产生通用供体细胞的方法，该方法包括：(a)通过在编码β-2微球蛋白(B2M)的基因内或附近插入编码程序性死亡配体1(PD-L1)的核苷酸序列来修饰干细胞，从而产生PD-L1阳性细胞；(b)富集PD-L1阳性细胞；(c)通过在编码硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)的基因内或附近插入编码HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA-E)的核苷酸序列来修饰来自(b)的该PD-L1阳性细胞，从而产生PD-L1、HLA-E双阳性细胞；(d)富集PD-L1、HLA-E双阳性细胞；(e)单细胞分选以选择PD-L1、HLA-E双阳性细胞；(f)将来自(e)的细胞表征为通用供体细胞；以及(g)冷冻这些通用供体细胞用于长期储存。
在另一种方法即方法2中，本披露提供了如方法1中所提供的方法，其中(a)中的该修饰包括向该干细胞递送(1)包含RNA引导的核酸酶和靶向该B2M基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)的第一核糖核蛋白(RNP)复合体和(2)包含核酸的第一载体，该核酸包含(i)与位于该B2M基因座中的该靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列、(ii)编码PD-L1的该核苷酸序列和(iii)与位于该B2M基因座中的该靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中该B2M基因座在该靶位点处被切割，并且包含编码PD-L1的该核苷酸序列的核酸被插入该B2M基因座中，从而破坏该B2M基因。
在另一种方法即方法2A中，本披露提供了如方法2所提供的方法，其中将该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该B2M基因座中。
在另一种方法即方法3中，本披露提供了如方法2中所提供的方法，其中该第一RNP复合体的RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶，并且该第一RNP复合体的gRNA包含对应于由SEQID NO:2组成的靶序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法4中，本披露提供了如方法3中所提供的方法，其中该Cas9核酸酶连接到至少一个核定位信号。
在另一种方法即方法5中，本披露提供了如方法2中所提供的方法，其中该第一RNP包含3:1的gRNA:RNA引导的核酸酶的摩尔比。
在另一种方法即方法6中，本披露提供了如方法2中所提供的方法，其中(a)(2)(i)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:7组成，并且(a)(2)(iii)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:13组成。
在另一种方法即方法7中，本披露提供了如方法2中所提供的方法，其中编码PD-L1的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:11组成。
在另一种方法即方法8中，本披露提供了如方法2中所提供的方法，其中编码PD-L1的该核苷酸序列可操作地连接到CAG启动子。
在另一种方法即方法9中，本披露提供了如方法2中所提供的方法，其中该第一载体是质粒载体并且包含由SEQ ID NO:33组成的核苷酸序列。
在另一种方法即方法10中，本披露提供了如方法2中所提供的方法，其中(a)(1)和(a)(2)的该递送包括电穿孔。
在另一种方法即方法11中，本披露提供了如方法1中所提供的方法，其中(b)中的该富集PD-L1阳性细胞包括磁性辅助细胞分选(MACS)、单细胞克隆、扩增所述PD-L1阳性细胞或其组合。
在另一种方法即方法12中，本披露提供了如方法1中所提供的方法，其中(c)中的该修饰包括向该PD-L1阳性细胞递送(1)包含RNA引导的核酸酶和靶向该TXNIP基因座中的靶位点的gRNA的第二RNP复合体和(2)包含核酸的第二载体，该核酸包含(i)与位于该TXNIP基因座中的该靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列、(ii)编码HLA-E的该核苷酸序列和(iii)与位于该TXNIP基因座中的该靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中该TXNIP基因座在该靶位点处被切割，并且包含编码HLA-E的该核苷酸序列的核酸被插入该TXNIP基因座，从而破坏该TXNIP基因。
在另一种方法即方法12A中，本披露提供了如方法12所提供的方法，其中将该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该TXNIP基因座中。
在另一种方法即方法13中，本披露提供了如方法12中所提供的方法，其中该第二RNP复合体的RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶，并且该第二RNP复合体的gRNA包含对应于由SEQ ID NO:20组成的靶序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法14中，本披露提供了如方法13中所提供的方法，其中该Cas9核酸酶连接到至少一个核定位信号。
在另一种方法即方法15中，本披露提供了如方法12中所提供的方法，其中该第二RNP包含3:1的gRNA:RNA引导的核酸酶的摩尔比。
在另一种方法即方法16中，本披露提供了如方法12中所提供的方法，其中(c)(2)(i)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:25组成，并且(c)(2)(iii)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:32组成。
在另一种方法即方法17中，本披露提供了如方法12中所提供的方法，其中编码HLA-E的该核苷酸序列包含编码HLA-E三聚体的序列，该HLA-E三聚体包含与HLA-G呈递肽融合的B2M信号肽，该HLA-G呈递肽与B2M膜蛋白融合，该B2M膜蛋白与HLA-E融合而无其信号肽。
在另一种方法即方法18中，本披露提供了如方法17中所提供的方法，其中编码该HLA-E三聚体的该序列基本上由SEQ ID NO:55组成。
在另一种方法即方法19中，本披露提供了如方法12中所提供的方法，其中编码HLA-E的该核苷酸序列可操作地连接到CAG启动子。
在另一种方法即方法20中，本披露提供了如方法12中所提供的方法，其中该第二载体是质粒载体并且包含由SEQ ID NO:34或56组成的核苷酸序列。
在另一种方法即方法21中，本披露提供了如方法12中所提供的方法，其中(c)(1)和(c)(2)的该递送包括电穿孔。
在另一种方法即方法22中，本披露提供了如方法权利要求1中所提供的方法，其中(d)中的该富集PD-L1、HLA-E双阳性细胞包括磁性辅助细胞分选、单细胞克隆、扩增所述PD-L1、HLA-E双阳性细胞或其组合。
在另一种方法即方法23中，本披露提供了如方法1中所提供的方法，其中(e)中的该单细胞分选包括荧光激活细胞分选(FACS)、单细胞克隆、扩增所述单细胞分选的细胞或其组合。
在另一种方法即方法24中，本披露提供了如方法1中所提供的方法，其中(f)中的该表征包括接合性和/或插缺谱的DNA分析。
在另一种方法即方法25中，本披露提供了如方法1中所提供的方法，其中(f)中的该表征包括对形态学、活力、核型分析、内毒素水平、支原体水平、中靶/脱靶分析、随机载体插入、残余Cas9、残余载体、多能性状态、分化能力或其组合的细胞分析。
在另一种方法即方法26中，本披露提供了如方法1中所提供的方法，其中该方法进一步包括在(f)中的该表征之前冷冻。
在另一种方法即方法27中，本披露提供了如方法1中所提供的方法，该方法进一步包括在(a)中扩增所产生的PD-L1阳性细胞，在(c)中扩增所产生的PD-L1、HLA-E双阳性细胞，在(e)中扩增所选择的PD-L1、HLA-E双阳性细胞或其组合。
在另一种方法即方法28中，本披露提供了用于产生通用供体细胞的方法，该方法包括：(a)通过在编码MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子的基因内或附近插入编码第一致耐受性因子的核苷酸序列来修饰干细胞，从而产生第一致耐受性因子阳性细胞；(b)富集第一致耐受性因子阳性细胞；(c)通过在编码存活因子的基因内或附近插入编码第二致耐受性因子的核苷酸序列来修饰来自(b)的该第一致耐受性因子阳性细胞，从而产生第一致耐受性因子阳性/第二致耐受性因子阳性细胞；(d)富集第一致耐受性因子阳性/第二致耐受性因子阳性细胞；(e)单细胞分选以选择第一致耐受性因子阳性/第二致耐受性因子阳性细胞；(f)将来自(e)的这些细胞表征为通用供体细胞；以及(g)冷冻这些通用供体细胞用于长期储存。
在另一种方法即方法29中，本披露提供了如方法28中所提供的方法，其中(b)中的该富集第一致耐受性因子阳性细胞包括磁性辅助细胞分选(MACS)、单细胞克隆、扩增所述第一致耐受性因子阳性细胞或其组合。
在另一种方法即方法30中，本披露提供了如方法28或29中所提供的方法，其中(d)中的该富集第一致耐受性因子阳性/第二致耐受性因子阳性细胞包括磁性辅助细胞分选、单细胞克隆、扩增所述第一致耐受性因子阳性/第二致耐受性因子阳性细胞或其组合。
在另一种方法即方法31中，本披露提供了如方法28至30中任一项中所提供的方法，该方法进一步包括在(a)中扩增所产生的第一致耐受性因子阳性细胞，在(c)中扩增所产生的第一致耐受性因子阳性/第二致耐受性因子阳性细胞，在(e)中扩增所选择的第一致耐受性因子阳性/第二致耐受性因子阳性细胞，或其组合。
在另一种方法即方法32中，本披露提供了如方法28至31中任一项中所提供的方法，其中(a)中的该修饰包括向这些干细胞递送(1)第一RNA引导的核酸酶和靶向MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子中的靶位点的第一引导RNA(gRNA)和(2)包含第一核酸的第一载体，该第一核酸包含(i)与位于该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子中的该靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列、(ii)编码该第一致耐受性因子的该核苷酸序列和(iii)与位于该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子中的该靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子在该靶位点处被切割，并且包含编码第一致耐受性因子的该核苷酸序列的该第一核酸被插入该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子中，从而破坏该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因的组分或转录调控因子。
在另一种方法即方法32A中，本披露提供了如方法32所提供的方法，其中将该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子中。
在另一种方法即方法33中，本披露提供了如方法32中所提供的方法，其中该第一RNA引导的核酸酶和该第一gRNA形成第一核糖核蛋白(RNP)复合体。
在另一种方法即方法34中，本披露提供了如方法28至33中任一项中所提供的方法，其中(a)中的该修饰包括向这些干细胞递送(1)包含第一RNA引导的核酸酶和靶向MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子中的靶位点的第一引导RNA(gRNA)的第一核糖核蛋白(RNP)复合体和(2)包含第一核酸的第一载体，该第一核酸包含(i)与位于该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子中的该靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列、(ii)编码该第一致耐受性因子的该核苷酸序列和(iii)与位于该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子中的该靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子在该靶位点处被切割，并且包含编码第一致耐受性因子的该核苷酸序列的该第一核酸被插入该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子中，从而破坏该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因的组分或转录调控因子。
在另一种方法即方法34A中，本披露提供了如方法34所提供的方法，其中将该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因座的组分或转录调控因子中。
在另一种方法即方法35中，本披露提供了如方法28至34中任一项中所提供的方法，其中该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因的组分或转录调控因子是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、NLRC5、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK。
在另一种方法即方法36中，本披露提供了如方法28至35中任一项中所提供的方法，其中该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体基因的组分或转录调控因子是B2M。
在另一种方法即方法37中，本披露提供了如方法36中所提供的方法，其中(a)(2)(i)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:7组成，并且(a)(2)(iii)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:13组成。
在另一种方法即方法38中，本披露提供了如方法36或37中所提供的方法，其中该第一gRNA包含对应于由SEQ ID NO:2组成的靶序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法39中，本披露提供了如方法32至38中任一项中所提供的方法，其中该第一RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶。
在另一种方法即方法40中，本披露提供了如方法39中所提供的方法，其中该Cas9核酸酶连接到至少一个核定位信号。
在另一种方法即方法41中，本披露提供了如方法32至40中任一项中所提供的方法，其中该第一RNP包含3:1的第一gRNA:第一RNA引导的核酸酶的摩尔比。
在另一种方法即方法42中，本披露提供了如方法28至41中任一项中所提供的方法，其中该第一致耐受性因子是PD-L1、HLA-E、HLA-G、CTLA-4或CD47。
在另一种方法即方法43中，本披露提供了如方法28至42中任一项中所提供的方法，其中编码该第一致耐受性因子的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子。
在另一种方法即方法44中，本披露提供了如方法43中所提供的方法，其中该外源启动子是CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC启动子。
在另一种方法即方法45中，本披露提供了如方法28至44中任一项中所提供的方法，其中该第一致耐受性因子是PD-L1。
在另一种方法即方法46中，本披露提供了如方法45中所提供的方法，其中编码PD-L1的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:11组成。
在另一种方法即方法47中，本披露提供了如方法46中所提供的方法，其中编码PD-L1的该核苷酸序列可操作地连接到CAG启动子。
在另一种方法即方法48中，本披露提供了如方法45至47中任一项中所提供的方法，其中该第一载体包含由SEQ ID NO:33组成的核苷酸序列。
在另一种方法即方法49中，本披露提供了如方法28至48中任一项中所提供的方法，其中(c)中的该修饰包括向这些干细胞递送(1)第二RNA引导的核酸酶和靶向存活因子基因座中的靶位点的第二引导RNA(gRNA)和(2)包含第二核酸的第二载体，该第二核酸包含(i)与位于该存活因子基因座中的该靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列、(ii)编码该第二致耐受性因子的该核苷酸序列和(iii)与位于该存活因子基因座中的该靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中该存活因子基因座在该靶位点处被切割，并且包含编码该第二致耐受性因子的核苷酸序列的第二核酸被插入该存活因子基因座中，从而破坏该存活因子基因。
在另一种方法即方法49A中，本披露提供了如方法49所提供的方法，其中将该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该存活因子基因座中。
在另一种方法即方法50中，本披露提供了如方法49中所提供的方法，其中该第二RNA引导的核酸酶和该第二gRNA形成第二核糖核蛋白(RNP)复合体。
在另一种方法即方法51中，本披露提供了如方法28至48中任一项中所提供的方法，其中(c)中的该修饰包括向这些第一致耐受性因子阳性细胞递送(1)包含第二RNA引导的核酸酶和靶向存活因子基因座中的靶位点的第二引导RNA(gRNA)的第二核糖核蛋白(RNP)复合体和(2)包含第二核酸的第二载体，该第二核酸包含(i)与位于该存活因子基因座中的该靶位点左侧的区域同源的核苷酸序列、(ii)编码该第二致耐受性因子的核苷酸序列和(iii)与位于该第二存活因子基因座中的该靶位点右侧的区域同源的核苷酸序列，其中该存活因子基因座在该靶位点处被切割，并且包含编码该第二致耐受性因子的核苷酸序列的第二核酸被插入该存活因子基因座中，从而破坏该存活因子基因。
在另一种方法即方法51A中，本披露提供了如方法51所提供的方法，其中将该核酸在该靶位点的50个碱基对内插入该存活因子基因座中。
在另一种方法即方法52中，本披露提供了如方法28至51中任一项中所提供的方法，其中该存活基因是TXNIP、ZNF143、FOXO1、JNK或MANF。
在另一种方法即方法53中，本披露提供了如方法52中所提供的方法，其中该存活基因是TXNIP。
在另一种方法即方法54中，本披露提供了如方法53中所提供的方法，其中该第二gRNA包含对应于由SEQ ID NO:20组成的靶序列的间隔子序列。
在另一种方法即方法55中，本披露提供了如方法52或53中所提供的方法，其中(c)(2)(i)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:25组成，并且(c)(2)(iii)的该核苷酸序列基本上由SEQ ID NO:32组成。
在另一种方法即方法56中，本披露提供了如方法49至55中任一项中所提供的方法，其中该第二RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶。
在另一种方法即方法57中，本披露提供了如方法56中所提供的方法，其中该Cas9核酸酶连接到至少一个核定位信号。
在另一种方法即方法58中，本披露提供了如方法49至57中任一项中所提供的方法，其中该第二RNP包含3:1的第二gRNA:第二RNA引导的核酸酶的摩尔比。
在另一种方法即方法59中，本披露提供了如方法49至58中任一项中所提供的方法，其中该第二致耐受性因子是PD-L1、HLA-E、HLA-G、CTLA-4或CD47。
在另一种方法即方法60中，本披露提供了如方法28至59中任一项中所提供的方法，其中编码该第二致耐受性因子的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子。
在另一种方法即方法61中，本披露提供了如方法60中所提供的方法，其中该外源启动子是CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC启动子。
在另一种方法即方法62中，本披露提供了如方法28至61中任一项中所提供的方法，其中该第二致耐受性因子是HLA-E。
在另一种方法即方法63中，本披露提供了如方法62中所提供的方法，其中编码HLA-E的该核苷酸序列包含编码HLA-E三聚体的序列，该HLA-E三聚体包含与HLA-G呈递肽融合的B2M信号肽，该HLA-G呈递肽与B2M膜蛋白融合，该B2M膜蛋白与HLA-E融合而无其信号肽。
在另一种方法即方法64中，本披露提供了如方法63中所提供的方法，其中编码该HLA-E三聚体的该序列基本上由SEQ ID NO:55组成。
在另一种方法即方法65中，本披露提供了如方法63或64中所提供的方法，其中编码HLA-E的该核苷酸序列可操作地连接到CAG启动子。
在另一种方法即方法66中，本披露提供了如方法62至65中任一项中所提供的方法，其中该第二载体包含由SEQ ID NO:34或56组成的核苷酸序列。
在另一种方法即方法67中，本披露提供了如方法28至66中任一项中所提供的方法，其中(e)中的单细胞分选包括荧光激活细胞分选(FACS)、单细胞克隆、扩增所述单细胞分选的细胞或其组合。
在另一种方法即方法68中，本披露提供了如方法28至67中任一项中所提供的方法，其中(f)中的该表征包括接合性和/或插缺谱的DNA分析。
在另一种方法即方法69中，本披露提供了如方法28至68中任一项中所提供的方法，其中(f)中的表征包括对形态学、活力、核型分析、内毒素水平、支原体水平、中靶/脱靶分析、随机载体插入、残余Cas9、残余载体、多能性状态、分化能力或其组合的细胞分析。
在另一种方法即方法70中，本披露提供了如方法28至69中任一项中所提供的方法，其中该方法进一步包括在(f)中的该表征之前冷冻。
VII.实例
下面的实例描述了根据本披露的特定通用供体细胞的产生和表征。
实例1：细胞维持和扩增
hESC/hiPSC的维持。如Schulz等人(2012)PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]7(5):e37004中所述，维持、培养、传代、增殖和铺板人胚胎干细胞系CyT49(专有hES细胞系，加利福尼亚州圣地亚哥维亚赐特公司(ViaCyte,Inc.,San Diego,CA))的细胞。将CyT49细胞使用
Figure BDA0003531856240000991
(干细胞技术公司(Stemcell Technologies)07920或等同物)解离。
将人诱导多能干细胞(hiPSC)如TC1133细胞系(龙沙集团(Lonza))在BIOLAMININ521CTG(拜奥拉米那公司(BioLamina)，目录号CT521)包被的组织培养板上维持在StemFlexComplete(生命科技公司(Life Technologies)，A3349401)中。在37℃下，用BIOLAMININ在DPBS、钙、镁中的1:10或1:20稀释液(生命科技公司，14040133)将板预包被2小时。每天用StemFlex培养基饲喂细胞。为了使细胞传代，使用与CyT49相同密度的细胞。为了将细胞作为单细胞进行铺板，将细胞用在StemFlex中的1％RevitaCellTM补充剂(100X)(赛默飞世尔公司(Thermofisher)，目录号A2644501)铺板在BIOLAMININ包被的板上。
hPSC的单细胞克隆。对于单细胞克隆，在用
Figure BDA0003531856240000992
解离前3-4小时用具有Revitacell的StemFlex Complete(最终浓度为1X Revitacell)饲喂hPSC(hESC或hiPSC)。解离后，将细胞分选为在BIOLAMININ包被的96孔组织培养板的每个孔中有单个细胞。使用WOLF FACS分选仪(纳诺赛莱克特公司(Nanocellect))来将单细胞分选到孔中。将板预先填充上100-200μL的具有Revitacell的StemFlex Complete。细胞接种后三天，用新鲜的StemFlex饲喂细胞并且每隔一天继续用100-200μL培养基饲喂细胞。生长10天后，每天用StemFlex饲喂细胞，直到第12-14天。此时，将板用
Figure BDA0003531856240000993
解离并且将收集的细胞悬浮液1:2分开，一半进入新的96孔板以进行维持并且一半进入DNA提取溶液QuickExtractTM DNA提取溶液(卢西根公司(Lucigen))中。提取DNA后，进行PCR以评估所需的基因编辑在所靶向DNA基因座处的存在或不存在。使用Sanger测序来验证所需的编辑。
单细胞衍生的hPSC克隆的扩增。对于CyT49(维亚赐特公司)，将成功靶向的克隆传代到具有纯10％XF KSR A10H10培养基的24孔板上，而不是在BIOLAMININ包被的板上。在24孔阶段后，如Schulz等人(2012)PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]7(5):e37004中所述，对CyT49克隆进行传代。
对于hiPSC(TC1133)，在传代阶段在具有Revitacell的BIOLAMININ包被板的上的整个克隆和定期维持过程中，将细胞维持在StemFlex Complete中。
实例2：B2M敲除(KO)人多能干细胞(hPSC)的产生
针对hPSC中B2M的引导RNA(gRNA)选择。设计了三个靶向B2M的gRNA，用于靶向B2M编码序列的外显子1。基于使用gRNA设计软件进行的序列同源性预测，这些gRNA具有预测的低脱靶得分。gRNA的靶序列如表1所呈现。gRNA包含对应于靶DNA序列的RNA序列。
表1.B2M gRNA靶序列
Figure BDA0003531856240001001
为了评估它们在hPSC中的切割效率，使用Neon电穿孔仪(Neon转染系统，赛默飞世尔公司，目录号MPK5000)，用Cas9蛋白(碧欧美公司(Biomay))和引导RNA(Synthego公司)(参见表3中的gRNA序列)的摩尔比为3:1(gRNA:Cas9)的核糖核蛋白(RNP)混合物(绝对值为125pmol Cas9和375pmol gRNA)对CyT49细胞(维亚赐特专有hES细胞系)进行电穿孔。为了形成RNP复合体，将gRNA和Cas9与R-缓冲液(Neon转染系统100μL试剂盒，赛默飞世尔公司，目录号MPK10096)在一个容器中合并至25μL的总体积，并在室温下孵育15min。使用
Figure BDA0003531856240001012
将细胞解离，然后重悬于DMEM/F12培养基(吉布科公司(Gibco)，目录号11320033)中，使用NC-200(克莫麦特公司(Chemometec))计数并离心。用RNP复合体重悬总共1×106个细胞，并添加R-缓冲液至125μL的总体积。然后将该混合物以1100V用2个脉冲电穿孔30ms。电穿孔后，将细胞吸出到填充有含有RevitaCell的StemFlex培养基的Eppendorf管中。然后将该细胞悬浮液铺板到用1:20稀释度下的BIOLAMININ 521CTG预包被的组织培养皿中。将细胞在常氧培养箱(37℃，8％CO2)中培养48小时。48小时后，使用QuickExtract(卢西根公司，威斯康星州米德尔顿；目录号QE09050)从细胞中收获基因组DNA。
进行针对靶B2M序列的PCR，并通过TIDE分析评估经扩增的所得DNA的切割效率。使用Platinum Taq Supermix(英杰公司(Invitrogen)，目录号125320176和目录号11495017)进行相关区域的PCR。PCR引物的序列如表2所呈现；并且循环条件如表3所提供。
表2.B2M TIDE引物
Figure BDA0003531856240001011
表3.B2M PCR循环参数
Figure BDA0003531856240001021
将所得扩增子提交进行PCR清除和Sanger测序。将Sanger测序结果与引导序列一起输入到Tsunami软件中。通过软件计算插缺百分比和身份。然后基于它们在hPSC中的插缺频率选择特定的gRNA。图1示出了B2M-1、B2M-2和B2M-3gRNA的切割效率。
使用序列相似性预测位点的杂交捕获分析，在干细胞衍生的DNA中评估所选择的gRNA的脱靶。B2M-2和B2M-3向导未显示出可检测的脱靶效应。选择B2M-2gRNA用于进一步的克隆产生，这是由于其高中靶活性和不可检测的脱靶活性。
B2M KO hPSC克隆的产生和表征。使用B2M-2gRNA，对CyT49 hESC(维亚赐特公司)进行电穿孔，并在电穿孔后3天使用WOLF FACS分选仪(纳诺赛莱克特公司)将单细胞分选到具有StemFlex和Revitacell的BIOLAMININ 521CTG包被的96孔板中。使经铺板的单细胞在常氧培养箱(37℃，8％CO2)中生长，每隔一天更换一次培养基，直到集落大到足以作为单细胞重新接种。汇合时，将样品分开以进行维持和基因组DNA提取。
经由PCR和Sanger测序确认克隆的B2M KO状态。在Snapgene软件中对靶B2M区域的所得DNA序列进行比对，以确定插缺身份和接合性。将具有所需编辑的克隆扩增，并通过针对B2M表达的流式细胞术评估进一步验证(有关所利用的抗体列表，参见表4)。在使用或不使用干扰素-γ处理(25ng/mL，R&D系统公司(R&D Systems)，285-IF)的情况下评估克隆。图2A示出了在野生型细胞中的B2M表达，并且图2B呈现了在B2M KO细胞中的B2M表达。通过Cell Line Genetics服务(威斯康星州麦迪逊)评价克隆的核型状态，并报告正常核型。
表4.用于多能性流式细胞术的抗体
Figure BDA0003531856240001031
通过针对多能性标记物OCT4和SOX2的细胞内流式细胞术确认克隆保留多能性。使用先前建立的方法(Schulz等人(2012)PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]7(5):e37004)使已确认的多能克隆分化成胰腺内分泌祖细胞。
实例3：B2M KO/PD-L1敲入(KI)人多能干细胞(hPSC)的产生
B2M KO/PD-L1 KI策略的设计。进行将PD-L1(CD274)插入B2M基因座中的质粒设计，使得B2M的起始密码子在经历同源定向修复(HDR)以插入PD-L1后被移除，从而使部分B2M表达的任何机会无效。图3呈现了质粒的示意图，并且表5标识了元件和其中的位置。供体质粒含有CAGGS启动子驱动的PD-L1cDNA，其侧接有800个碱基对的同源臂，这些同源臂与外显子1周围的B2M基因座具有相同序列。该质粒的完整序列包含SEQ ID NO:33。
表5.B2M-CAGGS-PD-L1供体质粒的元件
元件 位置(大小以bp计) SEQ ID NO:
左ITR 1-130(130) 6
LHA-B2M 145-944(800) 7
CMV增强子 973-1352(380) 8
鸡β-肌动蛋白启动子 1355-1630(276) 9
嵌合内含子 1631-2639(1009) 10
PD-L1 2684-3556(873) 11
bGH聚(A)信号 3574-3798(225) 12
RHA-B2M 3805-4604(800) 13
右ITR 4646-4786(141) 14
完整质粒 7133bp 33
使用B2M-2gRNA来促进PD-L1转基因在所靶向B2M基因座处的插入。将PD-L1供体质粒以及由靶向B2M的gRNA和Cas9蛋白组成的RNP复合体一起引入。每100万个CyT49细胞(维亚赐特公司)，将4μg质粒DNA与RNP一起递送。如实例2中所述进行电穿孔。电穿孔后七天，使用WOLF FACS分选仪(纳诺赛莱克特公司)将细胞针对PD-L1表面表达分选到具有StemFlex与Revitacell的BIOLAMININ 521CTG包被的96孔板中。为了进行FACS分选，未经编辑的细胞充当阴性对照。选择PD-L1阳性细胞用于分选和单细胞克隆。
为了检测PD-L1表面表达，使用抗PD-L1荧光抗体(参见表4)。使经铺板的单细胞在常氧培养箱(37℃，8％CO2)中生长，每隔一天更换一次培养基，直到集落大到足以作为单细胞重新接种。汇合时，将样品分开以进行维持和基因组DNA提取。
使用以下引物经由针对PD-L1敲入(KI)插入的PCR鉴定正确靶向的克隆，这些引物扩增从质粒同源臂外部到PD-L1cDNA插入的区域，从而使得能够仅扩增KI整合的DNA。通过PCR测试中靶插入的接合性，以评估KI是以杂合方式还是纯合方式发生。如果鉴定出杂合克隆，则将KI阴性等位基因送去进行Sanger测序以验证它在非KI等位基因中含有破坏B2M的插缺。将具有完全B2M破坏(经由KI插入或插缺形成)的正确的KI克隆以增加的组织培养形式扩增，直到达到3000万个细胞的群体大小。以这种方式扩增了大约10个克隆，并通过经由细胞内流式细胞术针对OCT4和SOX2进行测试而确认这些克隆为多能性的(图4)。然后对通过以上测试的克隆进行进一步测试以用于核型分析(细胞系遗传中心(Cell LineGenetics))，如下所述。另外，然后经由已建立的方案(Schulz等人(2012)PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]7(5):e37004)测试克隆分化成胰腺内胚层前体(PEC)的能力，如下所述。通过流式细胞术，通过在使用或不使用干扰素-γ处理(25ng/mL，R&D系统公司，285-IF)的情况下B2M表达的缺乏来进一步确认B2M的丢失。图5A和5B分别示出了在野生型和B2M KO/PD-L1 KI细胞中的PD-L1表达。
实例4：经编辑的克隆的核型分析
经编辑的胚胎干(ES)细胞的G带核型分析。将100万个经编辑的ES细胞传代到具有培养基(具有10ng/mL激活素和10ng/mL调蛋白的DMEM/F12+10％无Xeno的KSR)的T-25培养烧瓶中。培养过夜后，将三个T25培养烧瓶运送到细胞遗传学实验室(CytogeneticsLaboratory)(细胞系遗传中心公司(Cell Line Genetics,Inc.))以进行核型分析；针对1、12、17、20号染色体的FISH分析；以及用标准8x 60K阵列进行的阵列比较基因组杂交(aCGH)分析。用非切割向导(“NCG”)、B2M KO克隆和B2M KO/PD-L1 KI克隆(“V1-A”)电穿孔的所选择的细胞的G显带结果如表6所示。
表6.G带核型分析结果
Figure BDA0003531856240001051
Figure BDA0003531856240001061
实例5：经编辑的人胚胎干细胞向胰腺内胚层细胞(PEC)的分化
经编辑的人胚胎干细胞(ES)的维持。将不同传代(P38-42)下的经编辑的人胚胎干细胞对于4天传代以33,000个细胞/cm2接种，或对于3天传代以50,000个细胞/cm2接种，该传代用hESM培养基(DMEM/F12+10％KSR+10ng/mL激活素A和10ng/mL调蛋白)和最终10％的人AB血清。
用于PEC分化的经编辑的人胚胎干细胞的聚集。用
Figure BDA0003531856240001062
将经编辑的ES解离成单细胞，然后离心并以100万个细胞/ml重悬于在DMEM/F12培养基中的2％StemPro(目录号A1000701，英杰公司，加利福尼亚州)中，并且将总共3.5-4亿个细胞在转速为8RPM±0.5RPM的一个850cm2滚瓶(目录号431198，康宁公司(Corning)，纽约州)中接种18-20小时，之后进行分化。如Schulz等人(2012)PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]7(5):e37004中所述，使用滚瓶使来自经编辑的人胚胎干细胞的ES聚集体分化成胰腺谱系。
实例6：分化的胰腺内胚层细胞(PEC)的表征
针对在第1阶段(DE)的FOXA2和SOX17以及在PEC阶段的CHGA、PDX1和NKX6.1的流式细胞术。用PBS洗涤hESC衍生的第1阶段聚集体或hESC衍生的胰腺聚集体，然后使用ACCUMAXTM(目录号A7089，西格玛公司(Sigma)，密苏里州)在37℃下将其酶促解离为单细胞悬浮液。添加MACS分离缓冲液(目录号130-091-221，美天旎生物科技公司(MiltenyiBiotec)，德国北莱因-威斯特伐利亚)，并且使悬浮液通过40μm过滤器并沉淀。对于细胞内标记物染色，将细胞在4％(wt/v)多聚甲醛中固定30min，在FACS缓冲液(PBS、0.1％(wt/v)BSA、0.1％(wt/v)NaN3)中洗涤，然后用Perm缓冲液(PBS、0.2％(v/v)曲通X-100(目录号A16046，阿法埃莎公司(Alfa Aesar)，马萨诸塞州)、5％(v/v)正常驴血清、0.1％(wt/v)NaN3)在冰上透化30min，然后用洗涤缓冲液(PBS、1％(wt/v)BSA、0.1％(wt/v)NaN3)洗涤。将细胞与用封闭缓冲液(PBS、0.1％(v/v)曲通X-100、5％(v/v)正常驴血清、0.1％(wt/v)NaN3)稀释的一抗(表7)在4℃下一起孵育过夜。将细胞在IC缓冲液中洗涤，然后在4℃下与适当的二抗一起孵育60min。将细胞在IC缓冲液中洗涤，然后在FACS缓冲液中洗涤。流式细胞术数据是用NovoCyte流式细胞仪(艾森生物科学公司(ACEA Biosciences)，布鲁塞尔)获取的。使用FlowJo软件(树星公司(Tree Star,Inc.))分析数据。基于正向(低角度)和侧向(正交，90°)光散射鉴定完整细胞。使用抗体对照和未分化细胞估计背景。在图中，示出了针对亚群之一的代表性流式细胞术图。图中报告的数字表示来自完整细胞门的总细胞的百分比。
表7.用于表征分化PEC的流式细胞术的抗体
Figure BDA0003531856240001071
在DE阶段，FOXA2和SOX17双阳性细胞的群体超过来自CyT49野生型分化细胞的总细胞的90％。与野生型细胞相比，PD-L1 KI/B2M KO和B2M KO细胞显示出相当的DE百分比(图6和图7)。
在PEC阶段，进行针对嗜铬粒蛋白(CHGA)、PDX1和NKX6.1的流式细胞术。在PEC阶段的异质群体包括胰腺祖细胞和早期内分泌细胞(图8)。根据异质群体的饼图(图9)，来自分化的经编辑细胞(PD-L1 KI/B2M KO或B2M KO)的细胞群体的分布与野生型细胞非常相似。
靶向RNAseq。用于基因表达分析的靶向RNAseq使用Illumina TruSeq和靶向111个基因的寡核苷酸的定制面板来进行。该面板主要含有作为胰腺分化过程中发育阶段的标记物的基因。在每个分化阶段结束时，收集10μL APV(聚集的沉淀物体积)并使用QiagenRNeasy或RNeasy 96自旋柱方案(包括柱上DNA酶处理)提取。使用与Qubit结合的TapeStation，或通过使用Qiagen QIAxcel，进行定量和质量控制。根据Illumina TruSeq文库制备方案处理50-200ng RNA，该文库制备方案由以下组成：cDNA合成、定制寡核苷酸池的杂交、洗涤、延伸、结合的寡核苷酸的连接、文库的PCR扩增以及文库的清除；之后使用与Qubit结合的TapeStation，或通过使用Qiagen QIAxcel，对所得dsDNA文库进行定量和质量控制。随后将文库稀释至4nM的浓度并合并，然后变性、掺入PhiX对照、并进一步稀释至10-12pM，之后加载在Illumina MiSeq测序仪上。测序运行后，通过BaseSpace自动执行初始数据分析，从而针对每种定制探针生成原始读取计数。对于每个基因，然后将对应于该基因的所有探针的这些读取计数求和，并添加1个读取计数(以防止下游部分达到0)。针对基因SF3B2进行归一化，并且读取通常可视化为相比于第0阶段的倍数变化。当处理数据以进行主成分分析时，使用DEseq方法进行归一化。
所选择的基因的表达如图10所示。来自PD-L1 KI/B2M KO或B2M KO细胞的FOXA2、CHGA、PDX1和NKX6.1的动力学表达模式与野生型细胞相似。
在PEC阶段B2M和PD-L1表达的确认。在PEC阶段，在使用或不使用干扰素-γ(50ng/ml)的情况下处理分化聚集体48小时。用PBS洗涤聚集体，然后使用ACCUMAXTM(目录号A7089，西格玛公司，密苏里州)在37℃下将其酶促解离为单细胞悬浮液。添加MACS分离缓冲液(目录号130-091-221，美天旎生物科技公司，德国北莱因-威斯特伐利亚)，并且使悬浮液通过40μm过滤器并沉淀。对于表面标记物染色，将经解离的细胞与在MACS分离缓冲液中稀释的荧光缀合抗体一起孵育20min，然后在MACS分离缓冲液中洗涤。将细胞重悬于FACS缓冲液中以进行流获取。流式细胞术数据是用NovoCyte流式细胞仪获取的。如图11A-11F所示，B2M表达在来自B2M KO(图11B)或PD-L1 KI/B2M KO(图11C)的分化PEC中低于检测限，并且PD-L1在来自PD-L1 KI/B2M KO(图11F)的分化PEC中表达。通常，超过约90％的PEC表达PD-L1，表明细胞的同质群体。通常，在经基因编辑的干细胞分化后，转基因表达随时间而丧失(Hong等人,Mol.Ther.[分子治疗],2017,25(1):44-53)。
PEC细胞的免疫表型。在PEC阶段，在使用或不使用干扰素-γ(50ng/ml)的情况下处理分化聚集体48小时。收获聚集体以用于MHC I类和II类染色。在PEC阶段没有来自野生型或经编辑的细胞(PD-L1 KI/B2M KO和B2M KO)的MHC II类表达(图12D-12F)。HLA-ABC(MHC I类)的表达较低(来自野生型细胞有1.3％)，并且它在IFN-γ刺激后受高度调控。然而，即使在IFN-γ刺激下，HLA-ABC在经编辑的细胞(PD-L1 KI/B2M KO和B2M KO)中也不表达(图12A-12C)。
实例7：TXNIP KO人多能干细胞(hPSC)的产生
针对TXNIP的引导RNA(gRNA)选择。设计了十个靶向TXNIP的gRNA，用于靶向TXNIP编码序列的外显子1和外显子2(表8)。PAM序列在表8所呈现的靶序列中以粗体字呈现，并且对应于引导序列的DNA序列如表8所呈现。基于使用gRNA设计软件进行的序列同源性预测，这些gRNA具有预测的低脱靶得分。
表8.所选择的TXNIP靶序列和gRNA序列
Figure BDA0003531856240001101
TXNIP KO hiPSC克隆的产生和表征。为了评估这些gRNA在hiPSC中的切割效率，使用Neon电穿孔仪(Neon转染系统，赛默飞世尔公司，目录号MPK5000)，用Cas9蛋白(碧欧美公司)和引导RNA(Synthego公司)的摩尔比为3:1(gRNA:Cas9)的RNP混合物(绝对值为125pmolCas9和375pmol gRNA)对TC1133 hiPSC细胞进行电穿孔。为了形成RNP复合体，将gRNA和Cas9与R-缓冲液在一个容器中合并至25μL的总体积，并在室温下孵育15min。使用
Figure BDA0003531856240001102
将细胞解离，然后重悬于DMEM/F12培养基(吉布科公司，目录号11320033)中，使用NC-200(克莫麦特公司)计数并离心。用RNP复合体重悬总共1×106个细胞，并添加R-缓冲液至125μL的总体积。然后使用以下参数对该混合物进行电穿孔：2个脉冲，30ms，1100V。电穿孔后，将细胞吸出到填充有含有RevitaCell的StemFlex培养基的Eppendorf管中。然后将该细胞悬浮液铺板到用BIOLAMININ 521CTG预包被的组织培养皿中。将细胞在常氧培养箱(37℃，8％CO2)中培养48小时。48小时后，使用QuickExtract从细胞中收获基因组DNA。
进行针对靶TXNIP序列的PCR，并对经扩增的所得DNA进行Sanger测序。TIDE分析用于使用Tsunami软件分析插缺百分比的输出测序数据。图13示出了TXNIP gRNA的切割效率。然后基于它们在hPSC中的插缺频率选择gRNA。
使用序列相似性预测位点的杂交捕获分析，在干细胞衍生的DNA中评估切割效率最高的gRNA的脱靶。用TXNIP gRNA T5进行了进一步的实验，因为它没有显示出可检测的脱靶效应并证明了高的中靶活性。
TXNIP KO hPSC克隆的产生和表征。使用TXNIP gRNA T5，对CyT49 hESC(维亚赐特公司)进行电穿孔，并在电穿孔后3天使用WOLF FACS分选仪(纳诺赛莱克特公司)将单细胞分选到具有StemFlex和Revitacell的BIOLAMININ 521CTG 96孔板中。使经铺板的单细胞在常氧培养箱(37℃，8％CO2)中生长，每隔一天更换一次培养基，直到集落大到足以作为单细胞重新接种。汇合时，将样品分开以进行维持和基因组DNA提取。
经由PCR和Sanger测序确认克隆的TXNIP KO状态。在Snapgene软件中对靶TXNIP区域的所得DNA序列进行比对，以确定插缺身份和接合性。将具有所需编辑的克隆扩增，并通过针对TXNIP表达的流式细胞术评估进一步验证。通过Cell Line Genetics服务评价克隆的核型状态，并报告正常核型(表9)。
表9.核型分析
细胞系 传代 核型分析 FISH分析 aCGH阵列分析
TXNIPKO#2 P31 正常 正常 通过
TXNIPKO#13 P31 正常 正常 通过
通过针对多能性标记物OCT4和SOX2的细胞内流式细胞术确认克隆保留多能性。使用先前建立的方法(Schulz等人(2012)PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]7(5):e37004)使已确认的多能克隆分化成胰腺内分泌祖细胞。
用于基因表达分析的靶向RNAseq使用Illumina TruSeq和寡核苷酸的定制面板来进行，如上所述。所选择的基因的表达如图20所示。来自TXNIP KO细胞的FOXA2、CHGA、PDX1和NKX6.1的动力学表达模式与野生型细胞相似。在PEC阶段，还进行针对嗜铬粒蛋白(CHGA)、PDX1和NKX6.1的流式细胞术。在PEC阶段的异质群体包括30.6％的胰腺祖细胞(即，CHGA-/NKX6.1+/PDX1+)(图21)。
实例8：B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI人多能干细胞(hPSC)的产生
B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI策略的设计。产生了下述细胞，其中PD-L1编码序列被插入该B2M基因座中(从而敲除该B2M基因)并且HLA-E编码序列被插入该TXNIP基因座中(从而敲除该TXNIP基因)。
实例3描述了将PD-L1(CD274)插入B2M基因座的质粒设计。供体质粒含有CAGGS启动子驱动的PD-L1 cDNA，其侧接有800个碱基对的同源臂，这些同源臂与外显子1周围的B2M基因座具有相同序列。使用B2M-2gRNA来促进PD-L1转基因在所靶向B2M基因座处的插入。将PD-L1供体质粒以及由靶向B2M的gRNA和Cas9蛋白组成的RNP复合体一起引入。每100万个CyT49细胞(维亚赐特公司)，将4μg质粒DNA与RNP一起递送。如实例2中所述进行电穿孔。电穿孔后七天，使用Miltenyi试剂(抗小鼠IgG微珠，目录号130-048-401；LS柱，目录号130-042-401；和MidiMACS分离器，目录号130-042-302)或Thermofisher试剂(DynaMagTM-15磁体，目录号12301D；CELLectionTM Pan小鼠IgG试剂盒，目录号11531D；DynabeadsTM Pan小鼠IgG，目录号11042)经由磁性辅助细胞分选(MACS)富集细胞中的PD-L1阳性细胞。
在富集的PD-L1阳性群体扩增后，使用包含HLA-E序列的供体质粒经由CRISPR诱导的HDR将HLA-E三聚体cDNA转基因插入TXNIP基因组基因座中。HLA-E三聚体cDNA由与HLA-G呈递肽融合的B2M信号肽构成，该HLA-G呈递肽与B2M膜蛋白融合，该B2M膜蛋白与HLA-E蛋白融合而没有其信号肽。该三聚体设计先前已经公布(Gornalusse等人(2017)Nat.Biotechnol.[自然·生物技术]35(8):765-772)。HLA-E三聚体编码序列(包括接头)是SEQ ID NO:55(即，SEQ ID NO:26-31)。用于HLA-E递送的供体质粒含有驱动HLA-E三聚体表达的CAGGS启动子，其侧接有800个碱基对的同源臂，这些同源臂与外显子1周围的TXNIP基因座具有相同序列(图14、表10和表11)。在一些实施例中，供体质粒包含SEQ ID NO:34或56。
表10.TXNIP-CAGGS-HLA-E供体质粒1的元件
元件 位置(大小以bp计) SEQ ID NO:
左ITR 1-130(130) 6
LHA-TXNIP 145-944(800) 25
CMV增强子 973-1352(380) 8
鸡β-肌动蛋白启动子 1355-1630(276) 9
嵌合内含子 1631-2639(1009) 10
B2M信号序列 2684-2743(60) 26
HLA-G肽 2744-2770(27) 27
GS接头 2771-2815(45) 28
B2M膜蛋白 2816-3112(297) 29
GS接头 3113-3172(60) 30
HLA-E 3173-4183(1011) 31
bGH聚(A)信号 4204-4428(225) 12
RHA-TXNIP 4435-5234(800) 32
右ITR 5276-5416(141) 14
完整质粒 7763bp 34
表11.TXNIP-CAGGS-HLA-E供体质粒2的元件
元件 位置(大小以bp计) SEQ ID NO:
左ITR 1-130(130) 6
LHA-TXNIP 145-944(800) 25
CMV增强子 973-1352(380) 8
鸡β-肌动蛋白启动子 1355-1630(276) 9
嵌合内含子(截短) 1631-2336(706) 57
B2M信号序列 2381-2440(60) 26
HLA-G肽 2441-2467(27) 27
GS接头 2468-2512(45) 28
B2M膜蛋白 2513-2809(297) 29
GS接头 2810-2869(60) 30
HLA-E 2870-3880(1011) 31
bGH聚(A)信号 3901-4125(225) 12
RHA-TXNIP 4132-4931(800) 32
右ITR 4973-5113(141) 14
完整质粒 7460bp 56
使用TXNIP-T5 gRNA来促进HLA-E转基因在所靶向TXNIP基因座处的插入。将HLA-E供体质粒以及由TXNIP-T5 gRNA和Cas9蛋白组成的RNP复合体一起引入。每100万个PD-L1+细胞，将4μg HLA-E质粒DNA(SEQ ID NO:56)与RNP一起递送。替代性地，可使用HLA-E供体质粒DNA(SEQ ID NO:34)。如实例2中所述进行电穿孔。电穿孔后七天，使用Miltenyi试剂或Thermofisher试剂经由MACS富集细胞中的HLA-E阳性细胞。HLA-E富集后，使用WOLF FACS分选仪(纳诺赛莱克特公司)将细胞单细胞分选到具有StemFlex和Revitacell的BIOLAMININ521CTG包被的96孔板中。使经铺板的单细胞在常氧培养箱(37℃，8％CO2)中生长，每隔一天更换一次培养基，直到集落大到足以作为单细胞重新接种。汇合时，将样品分开以进行维持和基因组DNA提取。抗PD-L1和抗HLA-E抗体(表4)用于MACS富集和FACS分选到96孔板中，其中针对HLA-E和PD-L1双阳性细胞设置门控。为了进行FACS分选，未经编辑的细胞充当阴性对照。
使用以下引物经由针对PD-L1 KI插入和HLA-E KI插入的PCR鉴定正确靶向的克隆，这些引物分别扩增从质粒同源臂外部到PD-L1 cDNA插入或HLA-E cDNA插入的区域，从而使得能够仅扩增KI整合的DNA。通过PCR测试中靶插入的接合性，以评估KI是以杂合方式还是纯合方式发生。如果鉴定出杂合克隆，则将KI阴性等位基因送去进行Sanger测序以验证它分别含有破坏B2M的插缺或破坏TXNIP的插缺。将具有完全B2M和TXNIP破坏(经由KI插入或插缺形成)的正确的KI克隆以增加的组织培养形式扩增，直到达到3000万个细胞的群体大小。以这种方式扩增了大约10个克隆，并通过经由细胞内流式细胞术针对OCT4和SOX2进行测试而确认这些克隆为多能性的(图15)。
然后对通过以上测试的克隆进行进一步测试以用于核型分析(细胞系遗传中心(Cell Line Genetics))，如上所述。所选择的B2M KO/PD-L1 KI+TXNIP KO/HLA-E KI(“V1-B”)克隆的G带结果如表12所示。另外，然后测试V1-B克隆分化成胰腺内胚层前体(PEC)的能力。
表12.G-带结果
细胞系 传代 核型分析 FISH分析 aCGH阵列分析
V1-B003 P37 正常 正常 通过
V1-B007 P37 正常 正常 通过
V1-B008 P36 正常 正常 通过
根据先前报道的胰腺内分泌方案(Rezania等人(2014)Nat.Biotechnol.[自然·生物技术]32(11):1121-1133)，在分化成第6阶段细胞后，PD-L1和HLA-E继续表达(图16)。分化细胞的群体就转基因的表达而言是同质的，例如94.4％的细胞表达PD-L1并且97.0％的细胞表达HLA-E。图22A示出了与野生型和非切割向导对照细胞相比分化至第6阶段的各种克隆细胞(“S6-V1B-H9”、“S6-V1B-3B11”、“S6-V1B-1G7”和“S6-V1B-3C2”)的相似形态。B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI克隆的所选择的基因表达如图23A至图23F所示。来自B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI克隆细胞的INS、NKX6.1、GCK、GCG和SST的动力学表达模式与野生型细胞相似(图23A)。来自各种分化的B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-EKI克隆(“S6-V1B-H9”、“S6-V1B-3B11”、“S6-V1B-1G7”和“S6-V1B-3C2”)的第6阶段标记物INS(图23B)、NKX6.1(图23C)、GCG(图23D)、SST(图23E)和GCK(图23F)的表达水平与第6阶段野生型细胞和野生型胰岛中的水平相似。未分化的B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI克隆(“ES-V1B-H9”)用作阴性对照。
图24A-24B示出了从B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI克隆分化的第6阶段细胞中INS和GCG表达(图24A)以及INS和NKX6.1表达(图24B)的流式细胞术评估。图25A-25B示出了从两种B2M KO/PD-L1 KI和TXNIP KO/HLA-E KI克隆(“S6-V1B003”和“V1B-H9”)分化的第6阶段细胞中INS表达(图25A)和NKX6.1表达(图25B)的百分比。两者中的表达与野生型和非切割向导对照细胞中的表达相似。
在PEC阶段，进行针对嗜铬粒蛋白(CHGA)、PDX1和NKX6.1的流式细胞术。在PEC阶段的异质群体包括胰腺祖细胞、早期内分泌物(图17)。如上所述进行用于基因表达分析的靶向RNAseq。TXNIP KO克隆的所选择的基因表达如图18A所示，并且V1-B克隆的所选择的基因表达如图18B所示。来自V1-B或TXNIP KO克隆细胞的FOXA2、CHGA、PDX1和NKX6.1的动力学表达模式与野生型细胞相似。
使用包含SEQ ID NO:56的核苷酸序列的HLA-E供体载体产生了下述细胞，其中HLA-E编码序列被插入该TXNIP基因座中(从而敲除该TXNIP基因)。如上所述进行用于基因表达分析的靶向RNAseq。TXNIP KO/HLA-E KI克隆的所选择的基因表达如图28所示。来自TXNIP KO/HLA-E KI细胞的FOXA2、CHGA、PDX1和NKX6.1的动力学表达模式与野生型细胞相似。
替代性地，使用包含SEQ ID NO:34的核苷酸序列的HLA-E供体载体产生了下述细胞，其中HLA-E编码序列被插入该TXNIP基因座中。大量经编辑的细胞分化至PEC阶段，并在至少75％的细胞群体中表达HLA-E(数据未示出)。从TXNIP KO细胞分化的PEC细胞中PDX1和NKX6.1表达的流式细胞术评估与从野生型细胞分化的PEC细胞相似(数据未示出)。
实例9：T细胞激活/增殖测定
经由体外人T细胞激活/增殖测定测试了PEC分化细胞触发免疫应答的能力。从Hemacare公司购买新鲜的供体PBMC，并使用人泛T细胞分离试剂盒(美天旎公司，目录号130-096-535)纯化CD3+T细胞。将所分离的T细胞根据制造商说明书用CellTraceTM CFSE细胞增殖试剂盒方案(赛默飞世尔公司，目录号C34554)标记，并与分化PEC共孵育5天。将用于T细胞扩增和激活的DynabeadsTM人T激活因子CD3/CD28(赛默飞世尔公司，目录号11161D)用作阳性对照来激活T细胞。将单独T细胞用CFSE标记并用作阴性对照。测量CD3+CFSE+细胞的百分比以评估T细胞增殖的百分比(图19A-19B)。WT PEC触发了高于仅T细胞对照的T细胞增殖。B2M KO、B2M KO/PD-L1 KI和B2M KO/PD-L1 KI+TXNIP KO/HLA-E KI CyT49衍生的PEC未触发高于仅T细胞对照的T细胞增殖，显示出经编辑的细胞的低免疫原性性质。
实例10：基因靶向克隆系的体内功效研究
胰腺内胚层细胞由CyT49衍生的克隆hES细胞系产生，具有以下遗传修饰：1)B2M表达的靶向缺失和PD-L1的强制表达，2)B2M表达的靶向缺失和HLA-E的强制表达，或3)TXNIP的靶向缺失。另外，通过用非切割的引导RNA(NCG)转染获得克隆的未经修饰细胞系。
按照标准程序，将源自所示克隆系的胰腺内胚层聚集体加载到穿孔装置(PD)中以产生供试品或对照品。PD允许在皮下移植时直接血管化，并且包封的胰腺祖细胞在体内成熟为功能性胰腺内分泌细胞，包括葡萄糖响应性的胰岛素产生细胞。
如表13中所总结的，将五组无胸腺裸大鼠皮下植入两个制品，每个制品含有从上述四个克隆系的分化获得的约7×106个胰腺内胚层细胞、或野生型CyT49 hES(维亚赐特公司)细胞。
表13.研究设计
Figure BDA0003531856240001181
从12周开始，通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测试对所有存活的动物进行功效评价。在腹膜内施用3g/kg葡萄糖之前和之后从非禁食动物获得血液样品。人C-肽的血清浓度通过标准酶联免疫吸附测定法确定。
在第12、16和20周进行GSIS测试。结果表明，实验组之间没有显著差异，尤其是超过12周的时间点。与对照组中检测到的C-肽水平(组1，<40pM至2.0nM，平均1.1nM)相比，在组3的6只动物中有2只C-肽水平升高(TXNIP KO，平均1.5nM)。其他组，组2(NCG，平均0.5nM)、组4(B2M KO/PD-L1 KI，平均0.5nM)和组5(B2M KO/HLA-E KI，平均0.4nM)，与对照组相比呈现相似的C-肽水平范围，但更多动物接近该范围的下限。然而，这些差异在统计学上不显著。这些结果表明，引入的遗传修饰或产生克隆系所需的操作都不影响所讨论的细胞系在体外分化成胰腺内胚层细胞并随后在体内产生功能性β细胞的能力。
在第20周，GSIS测试后，对动物实施安乐死，并将外植的供试品固定在中性缓冲福尔马林中，加工成载玻片，并用H&E染色且通过免疫组织化学测定胰岛素和胰高血糖素。
通过GSIS测试进行的体内功效评价显示，未编辑的对照品和用胰腺内胚层细胞配制的经编辑的供试品之间没有显著差异，这些胰腺内胚层细胞源自各自携带遗传修饰亚组的克隆细胞系。结果表明个体遗传修饰和引入它们的过程可在体内耐受。
实例11.B2M KO/PD-L1 KI、TXNIP KO/HLA-E KI细胞系的体内功效研究
基本上如上文实例8所述产生四个克隆系，并将其加载到穿孔装置中以形成供试品。对照品含有未经修饰的CyT49细胞(维亚赐特公司)。将包含约7×106个胰腺内胚层细胞的制品皮下植入无胸腺裸大鼠中(2个制品/大鼠，8只大鼠/组)。
在第12、16、20和24周，对所有存活的动物进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测试。在腹膜内施用3g/kg葡萄糖之前和之后从禁食动物获得血液样品。人C-肽的血清浓度通过标准酶联免疫吸附测定法确定。大多数动物在植入后12周检测到血清C-肽。植入后第16、20和24周的血清C-肽水平如表14所呈现。在植入经基因编辑的细胞与对照细胞的动物组之间没有观察到统计学上的显著差异。
表14.体内血清C-肽水平。
Figure BDA0003531856240001201
在第25周，存活的动物将接受胰岛素攻击(胰岛素耐量试验，ITT)，以评估在不进食的情况下响应于血糖减少的血清人C-肽变化。在腹膜内施用每kg体重1单位胰岛素之前和之后的多个时间点(15、30、60分钟)从禁食动物获得血液样品。人C-肽的血清浓度将通过标准酶联免疫吸附测定法确定。
在第26周，将对存活的动物实施安乐死，并且外植的供试品将被加工成载玻片，并用H&E染色且通过免疫组织化学(IHC)测定胰岛素和胰高血糖素，以鉴定人胰腺内分泌细胞。将对人特异性核标记物NuMA1进行另外的IHC，以鉴定移植物衍生的细胞在供试品外植体的内腔外的潜在位置。
实例12.B2M KO/PD-L1 KI、TXNIP KO/HLA-E KI细胞系的体内功效研究
将B2M KO/PD-L1 KI、TXNIP KO/HLA-E KI胰腺内胚层细胞(包含约7×106个细胞)的聚集体配制成供试品。将四十六只无胸腺裸大鼠各自皮下植入两个供试品。将评价研究动物的GSIS、ITT和非空腹血糖(NFBG)。将在第13、17、26和39周的计划终止时间点对每组十只动物实施安乐死，同时将研究6只另外的动物以考虑可能的早期非计划终止。从每只动物中随机分配两个外植的供试品以进行组织学评价或总C肽含量评估。表15呈现了研究设计。
表15.研究设计
Figure BDA0003531856240001211
在第12、16、20、24、30和36周，将通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测试对所有存活的动物进行功效评价。将在腹膜内施用3g/kg葡萄糖之前和之后从禁食动物获得血液样品。人C-肽的血清浓度将通过标准酶联免疫吸附测定法确定。
在第25周和第33周，存活的动物将接受胰岛素攻击(胰岛素耐量试验，ITT)，以评估在不进食的情况下响应于血糖减少的血清人C-肽变化。在腹膜内施用每kg体重1单位胰岛素之前和之后的多个时间点(15、30、60分钟)从禁食动物获得血液样品。人C-肽的血清浓度将通过标准酶联免疫吸附测定法确定。
非空腹血糖(NFBG)将在开始空腹进行GSIS和ITT测试之前，在大约12、16、20、24、25、30、33和36周进行测量。
在表13中确定的计划终点，将对动物实施安乐死。安乐死将通过CO2吸入法进行，然后进行双侧开胸。将对所有计划和非计划的终止进行大体尸检，并记录宏观异常。
将冷冻指定的外植体，随后对内腔内容物进行均质化。匀浆的总C-肽含量将通过标准酶联免疫吸附测定法确定。外植体C-肽的总含量将用于设计临床给药。
将指定的外植供试品固定在中性缓冲福尔马林中，加工成载玻片，并用H&E染色且通过免疫组织化学(IHC)测定胰岛素和胰高血糖素，以鉴定人胰腺内分泌细胞。将对人特异性核标记物NuMA1进行另外的IHC，以鉴定移植物衍生的细胞在供试品外植体的内腔外的潜在位置。
实例13：B2M KO/PD-L1 KI、TXNIP KO/HLA-E KI在人iPSC中的产生
产生了这样的人iPSC(iPSC 0025)，其中PD-L1编码序列被插入该B2M基因座中。通过将B2M-2gRNA(SEQ ID NO:2)和Cas9蛋白以3:1的摩尔比(gRNA:Cas9)组合来形成RNP复合体。为了形成RNP复合体，将gRNA和Cas9与R-缓冲液在一个容器中合并至25μL的总体积，并在室温下孵育15min。使用
Figure BDA0003531856240001221
将细胞解离，然后重悬于DMEM/F12培养基(吉布科公司，目录号11320033)中，使用NC-200(克莫麦特公司)计数并离心。用RNP复合体重悬总共1×106个细胞。添加4μg B2M-CAGGS-PD-L1供体质粒(SEQ ID NO:33)和R-缓冲液至125μL的总体积。然后使用以下参数对该混合物进行电穿孔：2个脉冲，30ms，1100V。电穿孔后七天，基本上如实例8所述，使用Miltenyi试剂或Thermofisher试剂经由MACS富集细胞中的PD-L1阳性细胞。
在富集的PD-L1阳性群体扩增后，基本上如上所述用包含摩尔比为3:1(gRNA:Cas9)的TXNIP-T5 gRNA(SEQ ID NO:20)和Cas9蛋白的RNP复合体以及4μgTXNIP-CAGGS-HLA-E供体质粒2(SEQ ID NO:56)对细胞进行电穿孔。电穿孔后七天，使用Miltenyi试剂或Thermofisher试剂经由MACS富集细胞中的HLA-E阳性细胞。HLA-E富集后，使用WOLF FACS分选仪(纳诺赛莱克特公司)将细胞单细胞分选到具有StemFlex和Revitacell的BIOLAMININ521CTG包被的96孔板中。使经铺板的单细胞在常氧培养箱(37℃，8％CO2)中生长，每隔一天更换一次培养基，直到集落大到足以作为单细胞重新接种。汇合时，将样品分开以进行维持和基因组DNA提取。抗PD-L1和抗HLA-E抗体(表4)用于MACS富集和FACS分选到96孔板中，其中针对HLA-E和PD-L1双阳性细胞设置门控。为了进行FACS分选，未经编辑的细胞充当阴性对照。
使用以下引物经由针对PD-L1 KI插入和HLA-E KI插入的PCR鉴定正确靶向的克隆，这些引物分别扩增从质粒同源臂外部到PD-L1 cDNA插入或HLA-E cDNA插入的区域，从而使得能够仅扩增KI整合的DNA。通过PCR测试中靶插入的接合性，以评估KI是以杂合方式还是纯合方式发生。如果鉴定出杂合克隆，则将KI阴性等位基因送去进行Sanger测序以验证它分别含有破坏B2M的插缺或破坏TXNIP的插缺。将具有完全B2M和TXNIP破坏(经由KI插入或插缺形成)的正确的KI克隆以增加的组织培养形式扩增，直到达到3000万个细胞的群体大小。以这种方式扩增所选择的克隆，并通过经由细胞内流式细胞术针对OCT4和SOX2进行测试而确认这些克隆为多能性的。
使用Rezania等人(Nat Biotechnol.[自然·生物技术]2014年11月；32(11):1121-33)的胰腺内分泌方案分化四个经编辑的hiPSC克隆(VI-B)。在第4阶段，进行针对嗜铬粒蛋白(CHGA)、PDX1和NKX6.1的流式细胞术。以不同代表性密度接种的克隆(克隆1)的PDX1和NKX6.1的结果如图26A所示。所有四个克隆的CHGA均为阴性。还进行了PD-L1和HLA-E的流式细胞术。克隆(克隆1)的PD-L1和HLA-E的结果如图26B所示。
实例14：B2M KO/PD-L1 KI、TXNIP KO/HLA-E KI人多能干细胞(hPSC)冷冻细胞库的制造方法
将CyT49 hESC(维亚赐特公司)用包含摩尔比为3:1(gRNA:Cas9)的B2M-2gRNA(SEQID NO:2)和Cas9蛋白的RNP复合体以及4μg B2M-CAGGS-PD-L1供体质粒(SEQ ID NO:33)以1100V进行30ms的2个脉冲。电穿孔后，将细胞吸出到填充有含有RevitaCell的StemFlex培养基的Eppendorf管中。然后将该细胞悬浮液铺板到用1:20稀释度下的BIOLAMININ 521CTG预包被的组织培养皿中。将细胞在常氧培养箱(37℃，8％CO2)中培养。
电穿孔后七天，使用Alexa-488标记的抗PD-L1抗体和磁珠(
Figure BDA0003531856240001241
Pan小鼠IgG；赛默飞世尔公司)经由MACS富集细胞中的PD-L1阳性细胞。通过在XF-KSR扩增培养基(吉布科公司)中培养7天来扩增PD-L1阳性细胞。
然后将PD-L1阳性细胞用包含摩尔比为3:1(gRNA:Cas9)的TXNIP-T5 gRNA(SEQ IDNO:20)和Cas9蛋白的RNP复合体以及4μg TXNIP-CAGGS-HLA-E供体质粒2(SEQ ID NO:56)以1100V进行30ms的2个脉冲。电穿孔后，将细胞吸出到填充有含有RevitaCell的StemFlex培养基的Eppendorf管中。然后将该细胞悬浮液铺板到用1:20稀释度下的BIOLAMININ 521CTG预包被的组织培养皿中。将细胞在常氧培养箱(37℃，8％CO2)中培养。
电穿孔后七天，使用PE标记的抗HLA-E抗体和磁珠(
Figure BDA0003531856240001242
Pan小鼠IgG；赛默飞世尔公司)经由MACS富集细胞中的HLA-E阳性细胞。通过在XF-KSR扩增培养基(吉布科公司)中培养约5天来扩增PD-L1和HLA-E双阳性细胞。
对PD-L1和HLA-E双阳性细胞进行单细胞分选。为此，在用
Figure BDA0003531856240001243
解离前3-4小时用具有Revitacell的StemFlex Complete(最终浓度为1X Revitacell)饲喂细胞。解离后，将单个细胞分选到BIOLAMININ包被的96孔组织培养板的单个孔中。WOLF FACS分选仪(纳诺赛莱克特公司)用于使用上述抗PD-L1和抗HLA-E抗体将单细胞分选到孔中。将板预先填充上100-200μL的具有Revitacell的StemFlex Complete。细胞接种后三天，用新鲜的StemFlex饲喂细胞并且每隔一天继续用100-200μL培养基饲喂细胞。生长10天后，每天用StemFlex饲喂细胞，直到第12-14天。此时，将板用
Figure BDA0003531856240001244
解离并且将收集的细胞悬浮液1:2分开到两个96孔板中，将其培养约4天。
收获一部分细胞用于视觉分析(形态学)和DNA分析(PCR和DNA测序用于接合性分析和插缺谱)，并且培养剩余的细胞并扩增用于在T175烧瓶中培养。培养约两周后，选择克隆进行冷冻。在冷冻之前和之后使用标准程序表征细胞的形态、活力、内毒素、支原体、核型、多能性、分化能力、中靶/脱靶分析、随机质粒整合、残余Cas9/质粒。将细胞在冷冻培养基中冷冻并在-80℃或液氮下储存在冷冻小瓶中。
通过所述方法制备并分离特定的B2M KO/PD-L1KI+TXNIP KO/HLA-E KI克隆(“种子克隆”)。将种子克隆分化至PEC阶段并表征。图27A显示PEC阶段的种子克隆的形态与野生型细胞相似。图27B显示从种子克隆分化的细胞在分化时程中的FOXA2、CHGA、PDX1和NKX6.1的动力学表达模式与野生型细胞相似。图27C示出了CHGA-/NKX6.1+/PDX1+细胞在分化群体中的百分比。
Figure IDA0003531856300000011
Figure IDA0003531856300000021
Figure IDA0003531856300000031
Figure IDA0003531856300000041
Figure IDA0003531856300000051
Figure IDA0003531856300000061
Figure IDA0003531856300000071
Figure IDA0003531856300000081
Figure IDA0003531856300000091
Figure IDA0003531856300000101
Figure IDA0003531856300000111
Figure IDA0003531856300000121
Figure IDA0003531856300000131
Figure IDA0003531856300000141
Figure IDA0003531856300000151
Figure IDA0003531856300000161
Figure IDA0003531856300000171
Figure IDA0003531856300000181
Figure IDA0003531856300000191
Figure IDA0003531856300000201
Figure IDA0003531856300000211
Figure IDA0003531856300000221
Figure IDA0003531856300000231
Figure IDA0003531856300000241
Figure IDA0003531856300000251
Figure IDA0003531856300000261
Figure IDA0003531856300000271
Figure IDA0003531856300000281
Figure IDA0003531856300000291
Figure IDA0003531856300000301
Figure IDA0003531856300000311
Figure IDA0003531856300000321

Claims (52)

1.一种通用供体细胞，该通用供体细胞包含插入编码存活因子的基因内或附近的编码第一致耐受性因子的核苷酸序列，其中该通用供体细胞表达该致耐受性因子并且具有破坏的该存活因子的表达，并且该通用供体细胞与对照细胞相比具有增加的免疫逃避和/或细胞存活。
2.如权利要求1所述的通用供体细胞，其中该对照细胞是野生型细胞或不包含插入的核苷酸序列的细胞。
3.如权利要求1或2所述的通用供体细胞，其中该破坏的存活因子的表达包括降低或消除的表达。
4.如权利要求1至3中任一项所述的通用供体细胞，其中该第一致耐受性因子是PD-L1、HLA-E、HLA-G、CTLA-4或CD47。
5.如权利要求1至4中任一项所述的通用供体细胞，其中该存活因子是TXNIP、ZNF143、FOXO1、JNK或MANF。
6.如权利要求1至5中任一项所述的通用供体细胞，其中该第一致耐受性因子是HLA-E并且该存活因子是TXNIP。
7.如权利要求5或6所述的通用供体细胞，其中编码HLA-E的该核苷酸序列包含编码HLA-E三聚体的序列，该HLA-E三聚体包含与HLA-G呈递肽融合的B2M信号肽，该HLA-G呈递肽与B2M膜蛋白融合，该B2M膜蛋白与HLA-E融合而无其信号肽。
8.如权利要求7所述的通用供体细胞，其中编码该HLA-E三聚体的该序列基本上由SEQID NO:55组成。
9.如权利要求1至8中任一项所述的通用供体细胞，其中编码该第一致耐受性因子的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子。
10.如权利要求9所述的通用供体细胞，其中该外源启动子是CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC启动子。
11.如权利要求1至10中任一项所述的通用供体细胞，该通用供体细胞进一步包含插入编码MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子的基因内或附近的编码第二致耐受性因子的核苷酸序列，其中该通用供体细胞表达该致耐受性因子并且具有破坏的该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子的表达。
12.如权利要求11所述的通用供体细胞，其中该破坏的MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子的表达包括降低或消除的表达。
13.如权利要求11或12所述的通用供体细胞，其中该第二致耐受性因子是PD-L1、HLA-E、HLA-G、CTLA-4或CD47。
14.如权利要求11至13中任一项所述的通用供体细胞，其中该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者该MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、NLRC5、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK。
15.如权利要求11至14中任一项所述的通用供体细胞，其中该第二致耐受性因子是PD-L1，并且该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者该MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子是B2M。
16.如权利要求15所述的通用供体细胞，其中编码PD-L1的该核苷酸序列基本上由SEQID NO:11组成。
17.如权利要求11至16中任一项所述的通用供体细胞，其中编码该第二致耐受性因子的该核苷酸序列可操作地连接到外源启动子。
18.如权利要求17所述的通用供体细胞，其中该外源启动子是CMV、EF1α、PGK、CAG或UBC启动子。
19.如权利要求11至18中任一项所述的通用供体细胞，其中该第一致耐受性因子是HLA-E，该存活因子是TXNIP，该第二致耐受性因子是PD-L1，并且该MHC-I或MHC-II人白细胞抗原或者该MHC-I或MHC-II复合体的组分或转录调控因子是B2M。
20.如权利要求1至19中任一项所述的通用供体细胞，其中该细胞是干细胞。
21.如权利要求20所述的通用供体细胞，其中该干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。
22.如权利要求1至19中任一项所述的通用供体细胞，其中该细胞是分化细胞或体细胞。
23.如权利要求1至19中任一项所述的通用供体细胞，其中该细胞能够分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞。
24.如权利要求23所述的通用供体细胞，其中这些谱系限制性祖细胞是胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、间充质祖细胞、肌肉祖细胞、母细胞、造血祖细胞或神经祖细胞。
25.如权利要求23所述的通用供体细胞，其中这些完全分化体细胞是胰腺β细胞、上皮细胞、内胚层细胞、巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、血细胞、心肌细胞或免疫系统细胞。
26.多种如权利要求1至25中任一项所述的通用供体细胞。
27.一种谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞群体，这些谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞源自如权利要求26所述的多种通用供体细胞。
28.如权利要求27所述的细胞群体，其中这些谱系限制性祖细胞是胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、间充质祖细胞、肌肉祖细胞、母细胞、造血祖细胞或神经祖细胞，并且这些完全分化体细胞是胰腺β细胞、上皮细胞、内胚层细胞、巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、血细胞或免疫系统细胞。
29.多种如权利要求6或19所述的通用供体细胞。
30.一种谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞群体，这些谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞源自如权利要求29所述的多种通用供体细胞。
31.如权利要求30所述的细胞群体，其中这些谱系限制性祖细胞是定形内胚层细胞、原肠管细胞、后前肠细胞、胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、未成熟β细胞或成熟β细胞，并且这些完全分化体细胞是胰腺β细胞。
32.如权利要求26或29所述的多种细胞，其中至少约50％、至少约70％或至少约90％的这些细胞表达该第一致耐受性因子、该第二致耐受性因子、或该第一致耐受性因子和该第二致耐受性因子。
33.如权利要求27、28、30或31中任一项所述的细胞群体，其中至少约50％、至少约70％或至少约90％的这些细胞表达该第一致耐受性因子、该第二致耐受性因子、或该第一致耐受性因子和该第二致耐受性因子。
34.一种组合物，该组合物包含如权利要求26所述的多种细胞或如权利要求27或28所述的细胞群体。
35.如权利要求34所述的组合物，其用于治疗有需要的受试者。
36.如权利要求35所述的组合物，其中该受试者患有疾病、怀疑患有疾病或有疾病风险。
37.如权利要求36所述的组合物，其中该疾病是在遗传上可遗传的疾病。
38.一种组合物，该组合物包含如权利要求29所述的多种细胞或如权利要求30或31所述的细胞群体。
39.如权利要求38所述的组合物，其用于治疗有需要的受试者的糖尿病。
40.如权利要求39所述的组合物，其中该受试者患有I型糖尿病或II型糖尿病。
41.如权利要求35至40中任一项所述的组合物，其中该受试者是人。
42.一种获得用于施用至有需要的受试者的细胞的方法，该方法包括：
(a)获得或已经获得如权利要求26、29或32中任一项所述的多种通用供体细胞；以及
(b)在足以使这些细胞分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞的时间和条件下维持该多种通用供体细胞。
43.一种用于治疗有需要的受试者的方法，该方法包括：
(a)获得或已经获得分化成谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞后的如权利要求26、29或32中任一项所述的多种通用供体细胞；以及
(b)向该受试者施用这些谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞。
44.如权利要求43所述的方法，其中施用包括将包含这些谱系限制性祖细胞或完全分化体细胞的装置植入该受试者中。
45.如权利要求42至44中任一项所述的方法，其中这些谱系限制性祖细胞是胰腺内胚层祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、间充质祖细胞、肌肉祖细胞、母细胞、造血祖细胞或神经祖细胞，并且这些完全分化体细胞是胰腺β细胞、上皮细胞、内胚层细胞、巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、血细胞或免疫系统细胞。
46.如权利要求42至45中任一项所述的方法，其中该受试者患有疾病、怀疑患有疾病或有疾病风险。
47.如权利要求46所述的方法，其中该疾病是在遗传上可遗传的疾病。
48.如权利要求42至47中任一项所述的方法，其中该受试者是人。
49.一种用于治疗有需要的受试者的糖尿病的方法，该方法包括：
(a)获得或已经获得分化成胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞后的如权利要求29或32所述的多种通用供体细胞；以及
(b)向该受试者施用这些胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞。
50.如权利要求49所述的方法，其中施用包括将包含这些胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞、未成熟β细胞、成熟β细胞或胰腺β细胞的装置植入该受试者中。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中该受试者患有I型糖尿病或II型糖尿病。
52.如权利要求49至51中任一项所述的方法，其中该受试者是人。
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