JP2022543852A - 改変されたヒト可変ドメイン - Google Patents

Abstract

本発明は、改変されたヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドを提供する。対応する抗体、変異体、フラグメント、核酸、ベクター、ファージ、ライブラリー、方法およびキットも提供する。

Description

分野
本発明は、改変されたヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドを提供する。対応する抗体、変異体、フラグメント、核酸、ベクター、ファージ、ライブラリー、方法およびキットも提供する。

背景
抗体などの治療用タンパク質には多くの翻訳後改変が含まれ、その中にはタンパク質に好ましくない影響を与える可能性のあるものもある。例えば、ピログルタミン酸（通常、ｐＥ、ｐｙｒｏＥまたはｐｙｒｏＧｌｕと略される）は、インビトロおよびインビボでポリペプチド鎖のＮ末端に形成され得る。ピログルタミン酸の形成は、もともと合成されたグルタミン酸またはグルタミン残基がこの位置で再構成されることによって起こる（図１参照）。

生殖細胞系列の重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメントの再配列によってコードされるヒト、ヒト化またはキメラ抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＮ末端の最初の残基は、通常、グルタミンまたはグルタミン酸のいずれかである。抗体のＮ末端にあるグルタミンおよびグルタミン酸の両方は、インビトロで自発的にピログルタミン酸に環化することが示されている。ピログルタミン酸がグルタミンの環化によって形成される場合、結果として得られる抗体はより酸性となる。逆に、ピログルタミン酸がグルタミン酸の環化を介して形成される場合、得られる抗体は酸性度が低くなる。このため、時間の経過とともに抗体調製物の電荷が不均一になり、このことは多くの状況で好ましくない。抗体調製におけるこのような可変性を低減することは有益である。

しかしながら、ＶＨドメインのＮ末端におけるグルタミンあるいはグルタミン酸の存在は、重要であり得る。実際に、原核細胞および真核細胞から抗体が分泌される際、シグナルペプチド（ＳＰ；リーダーペプチドとも呼ばれる）が、シグナルペプチドと重鎖可変ドメインとの間の切断を介して、未成熟重鎖のＮ末端から除去される。シグナルペプチドの切断効率は、シグナルペプチドのみならず、ＶＨドメインの配列によって変わる。シグナルペプチドペプチダーゼ酵素（SPaseIなど）が認識するペプチドセグメントは、成熟タンパク質の開始点まで伸びている（Choo et al., 2008）。従って、ＶＨドメインの隣接残基は、シグナルペプチダーゼ処理に影響を与え、非標準的（non-canonical）切断部位に寄与している可能性がある。

本発明の簡単な概要
本発明において、驚くべきことに、アミノ酸変異をヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端に導入することができる一方で、対応する未改変のヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインの必要な親和性、特異性および／または構造的相互作用を維持できることが見出された。有利なことに、これは、改変されたヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインを含むタンパク質調製物（例えば、抗体調製物）における可変性（例えば、電荷不均一性）を減少させる。

従って、グルタミンまたはグルタミン酸を欠く改変Ｎ末端残基を含む一方でシグナルペプチド切断またはタンパク質発現には顕著に影響しない、新規抗体、重鎖可変領域、変異体、フラグメント、核酸、ベクター、ファージ、ライブラリー、それらに係る方法およびキットを、初めて本発明によりここに提供する。さらに、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、重鎖可変領域およびそれらをコードする核酸のパネル全体を、Ｎ末端グルタミンまたはグルタミン酸を広く除去して提示を可能にするように改変し、そしてそのような残基を含まない、かかるヒト抗体、重鎖可変領域のパネル全体をアッセイし、かつ評価し、そしてリード候補の同定時に下流の改変を行う作業を避け、そして時間と労力を節約すること、および好ましくは、シグナルペプチド切断またはタンパク質発現に顕著に影響しない、抗体製造方法をここに記載する。

さらに、活性についてスクリーニングされる重鎖または抗体のパネルを、ディスプレイ技術を介してまたは機能アッセイにおいて作成するとき、そのような分析の結果の変動を回避し、かつその後の生産において用いられ得る変異体に基づいて同じ分析を複数ラウンド実行する必要がないように、最終形態になり得るようかかるタンパク質を試験することが望ましい。しかしながら、翻訳後改変をもたらし得る残基を除去するために重鎖または抗体を分析するのは、抗体のようなリードが同定され、機能的特性評価が行われた後であることが一般的である。次に、特定の残基を、核酸変異誘発を含む当技術分野で知られる様々な組換え技術によって、または核酸合成によって変えることができ、その結果、残基を変える変異をコードする新しい配列が、貯蔵中にリードに潜在的な変化を生じさせることがある。例えば、免疫化後、免疫動物（トランスジェニックまたはその他）のＢ細胞の収集、または生成した抗体を分析するためのハイブリドーマもしくはライブラリーの作成の前に、抗体作製から生じる各タンパク質を特異的に改変しなければならないことは、手間と時間のかかるプロセスである。従って、本発明において、Ｎ末端グルタミンおよびグルタミン酸を変化させることにより、ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインを含む抗体、重鎖または可変領域のパネル全体を改変する新規な手段が開発された。

さらなる利点は、シグナルペプチドをコードする核酸を含み、ＶＨドメインの最初の１個のアミノ酸、または最初の２個のアミノ酸を含み、ここで、ＶＨドメインの最初のアミノ酸はグルタミンまたはグルタミン酸ではなく、そして少なくとも最初の１個のアミノ酸または最初の２個のアミノ酸は、本明細書において対照親可変領域、または従来のヒト、ヒト化もしくはキメラＶＨドメインとも称される未改変ＶＨドメインとは異なる、標準ベクターを使用可能であることである。このようなベクターを宿主細胞で用いて、本明細書に記載の改変されたＶＨドメインを含む抗体または重鎖のパネルを作成し、そして抗体産生のロバスト性および効率をさらに改善することができる。

免疫化またはパネル生成後、ディスプレイライブラリーを作成する前に生成された各抗体または重鎖を改変する際の別の複雑さは、そうすることによって、細胞表面に提示されるべき抗体または重鎖を担うシグナルペプチドが妨げられ、ディスプレイライブラリーの範囲（breadth）およびロバスト性が損なわれる結果になる懸念がある。

ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端にアミノ酸変異(複数可)を導入することにより、１以上のリード候補が選択された後ではなく、抗体パネルの作成中に改変を行うことができるため、より効率的に抗体を作製することができる。

本明細書に示すように、ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端におけるグルタミンまたはグルタミン酸を除去し、そのような残基を別のアミノ酸（アラニンなど）で置換すると、改変された可変ドメインを組み込んだ抗体などの何れかのタンパク質のＮ末端における自発的ピログルタミン酸形成が排除される。有利なことに、改変されたヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインを組み込んだＦａｂおよびファージディスプレイライブラリーの作成の成功は、改変されたヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインが、対応する未改変のヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインの必要な親和性、特異性および／または構造相互作用を保持していることを実証している。さらに、ユニバーサルプライマーの使用により、どのＶ遺伝子セグメントが可変領域を形成したかにかかわらず、Ｎ末端のこのグルタミンまたはグルタミン酸を除去したヒト重鎖可変領域または抗体のパネル全体の作成を可能とし、そのようなパネルの均一な試験およびハイスループットスクリーニングへの組み込みを可能にする、方法が用いられる。

ピログルタミン酸形成の除去により、いくつかの利点があると考えられる。上記のように、ピログルタミン酸の存在は、抗体の酸性度を変化させる可能性があり、これは抗体の分解をもたらすか、または貯蔵期間に影響を与え得る。さらに、ある閾値レベルを超えた低いｐＨを有する抗体は、患者における注射時に痛みを引き起こすことが報告されている。ピログルタミン酸の生成をなくすことで、これらの潜在的な有害性をなくすことができる。さらに、ピログルタミン酸の除去は、例えば、欧州医薬品庁のガイドラインでは、生物製剤の申請者に対して、凝集状態、Ｎ末端およびＣ末端（重鎖のＮ末端のピログルタミン酸およびＣ末端のリシン）を含むいくつかの構造特性をモニターするよう求めていることから、規制の目的でも有益である。Ｎ末端のピログルタミン酸を除去することで、このモニタリングのための変数がなくなり、規制当局の審査が容易になる。また、Ｎ末端ピログルタミン酸がないことにより、抗体の貯蔵性が向上する可能性もある。ピログルタミン酸の形成を排除することは、より大きなプロセス制御も提供し、そのようなＮ末端グルタミンまたはグルタミン酸残基に関連する疾患に対する利点を有し得る。Ｎ末端ピログルタミン酸の不在はまた、抗体の電荷不均一性の減少をもたらし、それにより、より効率的な電荷ベースの精製および分離を可能にする。Ｎ末端改変の付加、およびその後の分析も、ピログルタミン酸がない方が容易であり得る。

本発明者らはまた、驚くべきことに、そのようなアミノ酸変異（複数可）が、未成熟なヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端からのシグナルペプチドの効率的な切断を強化することができることを確認した。例えば、アラニン残基の導入（要すれば、さらなる第２の残基、例えばアラニン－プロリン、アラニン－アスパラギン酸、アラニン－グルタミン酸、アラニン－スレオニン、アラニン－バリン、アラニン－セリンまたはアラニン－ロイシン）をヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端に導入すると、ＶＨドメインとその上流のシグナルペプチドとの間の切断を増加させることができる。従って、発現および分泌に悪影響を与えず、好ましくは、改変されたヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメイン、ならびに抗体または抗体フラグメント、例えばそのようなドメインを含むＦａｂの効率的な発現および分泌を増加させる。

本発明において、ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインをコードする核酸を増幅および改変する（具体的には、ＶＨドメインのＮ末端にコードされる最初の（および要すれば次の）のアミノ酸を改変する）ために用いられ得るいくつかのユニバーサルプライマーが提供される。有利なことに、本明細書で提供されるユニバーサルプライマーは、特定の組み合わせにおいて、ヒトゲノムサンプルの各ＶＨ遺伝子ファミリーに存在する何れかの機能的ＶＨ遺伝子セグメントから生成されるヒト、ヒト化またはキメラ重鎖のレパートリー全体を偏りなく増幅および改変することができる。これらのユニバーサルプライマーは、可変領域を形成するために組換えまたは再配置されたＶＨ遺伝子セグメントに関係なく、生成されたヒト、ヒト化またはキメラ可変領域のパネル全体にこのような改変を生成することができる。これらのユニバーサルプライマーは、共通のヒト重鎖レパートリーの使用により、このような改変を生成することができる。

本発明は、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、可変ドメインが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含む、ポリペプチドを提供する。

好適には、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含み得る。

好適には、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含み得る。

好適には、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、アスパラギン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含み得る。

好適には、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、Ｎ末端アラニンを含み得る。

好適には、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、アラニン－プロリン、アラニン－アスパラギン酸、アラニン－グルタミン酸、アラニン－スレオニン、アラニン－バリン、アラニン－セリンおよびアラニン－ロイシンからなる群より選択されるＮ末端配列を含んでいてよい。

好適には、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、Ｎ末端配列アラニン－プロリンを含み得る。

好適には、ポリペプチドは、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインのＮ末端アミノ酸の上流にシグナルペプチドを含んでいてよい。

好適には、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）を含み得る。

本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドを含む抗体、抗体変異体または抗体フラグメントを提供する。

本発明は、さらに、本明細書に記載のポリペプチド、抗体、抗体変異体または抗体フラグメントをコードする核酸を提供する。

さらに、本発明は、本明細書に記載の核酸を含むベクターを提供する。

本発明はまた、シグナルペプチドおよび本明細書に記載のヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖の最初の１個のアミノ酸、または最初の２個のアミノ酸をコードする核酸配列を含むテンプレートベクター、あるいは標準ベクターを提供する。このようなテンプレートベクターは、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖をコードする核酸を含まない。

好適には、ベクターは、シグナルペプチドおよびアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸をコードする核酸配列を含む。

好適には、ベクターは、シグナルペプチドをコードする核酸配列およびアラニン－プロリン、アラニン－アスパラギン酸、アラニン－グルタミン酸、アラニン－スレオニン、アラニン－バリン、アラニン－セリンおよびアラニン－ロイシンからなる群より選択されるＮ末端配列を含む。

好適には、ベクターは、シグナルペプチドをコードする核酸配列およびＮ末端配列アラニン－プロリンを含む。

好適には、ベクター中の核酸配列によってコードされるシグナルペプチドは、アミノ酸配列ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）を含む。

好適には、ベクターは、ファージミドまたはプラスミドであり得る。

さらに、本発明は、本明細書に記載の核酸を含むファージを提供する。

また、本明細書に記載の少なくとも約１０^６個の異なる核酸、ベクターまたはファージを含むライブラリーも提供する。

本発明は、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を同時に増幅および改変する方法であって、
(a）ヒト、ヒト化、またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を提供する工程；および
(b）少なくとも１つの５’プライマー、少なくとも１つの３’プライマーおよび前記核酸を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された核酸を生成する工程
を含み、ここで、少なくとも１つの５’プライマーは、増幅された核酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするように増幅された核酸に改変を導入する改変部位を有する核酸を含む、
方法を提供する。

好適には、各増幅核酸は、Ｎ末端アラニンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードしていてもよい。

好適には、少なくとも１つの５’プライマーは、各増幅核酸が、アラニン－プロリン、アラニン－アスパラギン酸、アラニン－グルタミン酸、アラニン－スレオニン、アラニン－バリン、アラニン－セリンおよびアラニン－ロイシンからなる群より選択されるＮ末端配列を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするように、各増幅核酸において少なくとも２つの改変を導入する核酸を含み得る。

好適には、増幅された核酸の各々は、Ｎ末端配列アラニン－プロリンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードしていてもよい。

好適には、少なくとも１つの５’プライマーは、改変部位の上流のシグナルペプチドまたはシグナルペプチドの一部をコードし得る。

好適には、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）を含み得る。

好適には、工程（a）における核酸（複数可）は、ｃＤＮＡであり得る。

好適には、本方法は、動物のＢ細胞から核酸を抽出し、該核酸からｃＤＮＡを生成して、工程（a）で提供される核酸（複数可）を生成する、先行工程を含み得る。

好適には、動物は、目的の抗原で免疫化されていてよく、Ｂ細胞由来の核酸は、目的の抗原に対する特異性および親和性を有する重鎖をコードしていてよい。

好適には、動物は、マウス、ラット、ウサギおよびニワトリを含むがこれらに限定されない、非ヒト動物であり得る。

好適には、動物は、非ヒトトランスジェニック動物であり得る。

好適には、動物は、ヒトまたはキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むトランスジェニックマウス動物であり得る。

好適には、動物は、共通軽鎖を含むトランスジェニックマウス動物、ウサギまたはニワトリであってよい。

好適には、Ｂ細胞からのヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするすべての核酸は、以下をコードするように改変することができる：
－アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含むヒト、ヒト化、またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメイン；または
－アラニン－プロリン、アラニン－アスパラギン酸、アラニン－グルタミン酸、アラニン－スレオニン、アラニン－バリン、アラニン－セリンおよびアラニン－ロイシンからなる群より選択されるＮ末端配列を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメイン。

好適には、工程（a）は、以下のヒト遺伝子ファミリー：ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６およびＩＧＨＶ７のそれぞれから選択される少なくとも１つの組換えヒト遺伝子セグメントによってコードされる、またはそれに基づく複数の異なる核酸を提供することを含んでいてよい。

好適には、本方法は、
(a）１３０８ＡＰ、１３０８ＡＰ２、２０２０ＡＰ２、２０１８ＡＰまたは２０１８ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ１ファミリー遺伝子によってコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(b)１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４または１３１０ＡＰ５から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ２ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(c)０５０８ＡＰ、０５０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ、２０１８ＡＰ２、２０２１ＡＰ、２０２１ＡＰ２、２０２１ＡＰ３、２０２１ＡＰ４または２０２１ＡＰ５から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ３ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(d)１３１２ＡＰである５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ４ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(e)１３１３ＡＰまたは１３１３ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ５ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(f)１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４、１３１０ＡＰ５または１３１２ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ６ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(g)１３１４ＡＰまたは１３１４ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ７ファミリー遺伝子によってコードされる核酸を増幅および改変すること
を含み得る。

好適には、本方法は、
(a）１３０８ＡＰ２、２０２０ＡＰ２または２０１８ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ１ファミリー遺伝子によってコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(b）１３１０ＡＰ５である５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ２ファミリー遺伝子によってコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(c）０５０８ＡＰ、２０２１ＡＰ２または２０１８ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ３ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(d）１３１２ＡＰ２または２０１９ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ４ファミリー遺伝子によってコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(e）１３１３ＡＰ２である５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ５ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(f）１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４、１３１０ＡＰ５または１３１２ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ６ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；ならびに／または
(g）１３１４ＡＰ２である５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ７ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること
を含み得る。

好適には、改変されたヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、リード同定のために頻度分析に供され得る。

好適には、本方法は、増幅および改変された各核酸をベクターに導入することをさらに含み得る。

好適には、ベクターは、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。

好適には、ベクター中の核酸配列によってコードされるシグナルペプチドは、アミノ酸配列ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）を含む。

好適には、ベクターは、ファージミドまたはプラスミドであり得る。

好適には、本方法は、各ベクターを細胞に形質転換またはトランスフェクトして、ライブラリーを作成することをさらに含み得る。

好適には、細胞は、ファージコンピテント細胞であり得る。

好適には、改変されたヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、結合特異性および／または親和性のスクリーニングのためにファージに組込まれ得る。

好適には、本方法は、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインにおけるピログルタミン酸形成を減少させるために用いられ得る。

したがって、本発明はまた、ヒト、ヒト化、またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインにおけるピログルタミン酸形成を低減する方法であって、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を、該改変された核酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするように改変すること
を含む方法を提供する。

好適には、改変された核酸は、Ｎ末端アラニンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードしていてもよい。

好適には、改変された核酸は、アラニン－プロリン、アラニン－アスパラギン酸、アラニン－グルタミン酸、アラニン－スレオニン、アラニン－バリン、アラニン－セリンおよびアラニン－ロイシンからなる群より選択されるＮ末端配列を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。

好適には、改変された核酸は、Ｎ末端配列アラニン－プロリンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードしていてもよい。

本発明はさらに、以下のヒトＶＨ遺伝子ファミリー：ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６およびＩＧＨＶ７の１以上からなる群より選択されるか、またはそれに基づく、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする何れかの核酸を増幅および改変するための５’プライマーを提供し、ここで、該プライマーは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするような増幅された核酸に、改変を導入する改変部位を含む。

好適には、改変部位は、増幅された核酸が、Ｎ末端アラニンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするようなものであり得る。

好適には、改変部位は、増幅された核酸が、アラニン－プロリン、アラニン－アスパラギン酸、アラニン－グルタミン酸、アラニン－スレオニン、アラニン－バリン、アラニン－セリンおよびアラニン－ロイシンからなる群より選択されるＮ末端配列を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするようなものであり得る。

好適には、改変部位は、増幅された核酸が、Ｎ末端アラニン－プロリンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするようなものであり得る。

好適には、プライマーは、改変部位の上流のシグナルペプチドまたはシグナルペプチドの一部をコードし得る。

本発明はさらに、以下の群のそれぞれから選択される少なくとも１つの５’プライマーを含むキットを提供する：
(a）１３０８ＡＰ、１３０８ＡＰ２、２０２０ＡＰ２、２０１８ＡＰまたは２０１８ＡＰ２；
(b）１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４または１３１０ＡＰ５；
(c）０５０８ＡＰ、０５０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ、２０１８ＡＰ２、２０２１ＡＰ、２０２１ＡＰ２、２０２１ＡＰ３、２０２１ＡＰ４または２０２１ＡＰ５；
(d) １３１２ＡＰ２；
(e) １３１３ＡＰまたは１３１３ＡＰ２；
(f) １３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４、１３１０ＡＰ５または１３１２ＡＰ２；および
(g）１３１４ＡＰ２または１３１４ＡＰ。

好適には、キットは、以下の群のそれぞれから選択される少なくとも１つの５’プライマーを含んでいてもよい。
(a）１３０８ＡＰ２、２０２０ＡＰ２または２０１８ＡＰ２；
(b）１３１０ＡＰ５；
(c）０５０８ＡＰ、２０２１ＡＰ２または２０１８ＡＰ２；
(d) １３１２ＡＰ２または２０１９ＡＰ２；
(e) １３１３ＡＰ２；
(f) １３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４、１３１０ＡＰ５または１３１２ＡＰ２；および
(g）１３１４ＡＰ２。

本発明はさらに、抗体、抗体変異体または抗体フラグメントを製造するための方法であって、
－ 改変された核酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含む、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするように、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を改変する工程；
－ その後、抗体スクリーニング技術を用いて、標的抗原に結合するための、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンから選択されるＮ末端アミノ酸を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインを特定する工程；
－ 標的抗原に結合するヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択する工程；および
－ Ｎ末端アミノ酸をさらに改変することなく、該ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインを、治療用抗体、抗体変異体または抗体フラグメントの開発に用いる工程
を含む方法を提供する。

好適には、改変された核酸は、Ｎ末端アラニンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードしていてよい。

好適には、改変された核酸は、アラニン－プロリン、アラニン－アスパラギン酸、アラニン－グルタミン酸、アラニン－スレオニン、アラニン－バリン、アラニン－セリンおよびアラニン－ロイシンからなる群より選択されるＮ末端配列を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。

好適には、改変された核酸は、Ｎ末端配列アラニン－プロリンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖をコード化する。

好適には、抗体スクリーニング技術は、軽鎖と対になったときのヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインのスクリーニングを含む。

好適には、抗体スクリーニング技術は、共通の軽鎖と対になったときの、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインのスクリーニングを含む。

本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、“含む（comprise）”および“包含する（contain）”なる用語ならびにそれらの変形は、“～を含むが、それらに限定されない”ことを意味し、それらは他の部位、添加物、成分、整数または工程を除外することを意図しない（除外しない）。

本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、文脈上別段の解釈が必要でない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、本明細書は、文脈上別段の解釈が必要でない限り、単数形と同様に複数形を企図するものとして理解されるべきである。

本発明の特定の面、態様または実施例と関連して記載された特徴、整数、特性、化合物、化学的部分または基は、それと矛盾しない限り、本明細書に記載された他の面、態様または実施例に適用可能であると理解されるべきである。

本発明の様々な面は、以下にさらに詳細に記載される。

図面の簡単な説明
以下、添付図面を参照して、本発明の態様をさらに説明する：
図１は、タンパク質のＮ末端におけるピログルタミン酸（pyroGlu）形成を示す。 図２は、SignalPを用いたＳＰ（シグナルペプチド）開裂予測分析の結果を示す。分析した３６０個の配列について、ＤスコアならびにＶＨの位置１のアミノ酸毎の平均(avg.)Ｄスコアを示す。原核生物（Ｐ）のＳＰを有する配列データは左側に、真核生物（Ｅ）のＳＰを有する配列データは右側に記載されている。各データセットの右側には、カラム‘nat. freq. (％)'が、グラム陰性および真核生物のＳＰ含有タンパク質のパネルについて、位置１のアミノ酸頻度をリスト化している [Choo and Ranganathan, 2008]。 図３は、１１７０個の配列について、SignalPを用いたＳＰ切断予測分析の結果を示す。分析された１１７０個の配列について、ＤスコアならびにＶＨの位置２のアミノ酸毎の平均（avg.）Ｄスコアが示されている。原核生物（Ｐ）のＳＰを有する配列データは左側に、真核生物（Ｅ）のＳＰを有する配列データは右側に記載されている。各データセットの右側には、‘nat. freq. (％)’が、グラム陰性および真核生物のＳＰ含有タンパク質のパネルについて、位置２のアミノ酸頻度をリスト化している [Choo and Ranganathan, 2008]。 図４は、SignalPを用いたＳＰ切断予測分析の結果を示す。ＳＰおよびＶＨの開始位置の１８個の組み合わせのそれぞれについて、位置１および位置２に変異がある１１７０個の配列のサブセットについてＤスコアを示す。左側は原核生物（Ｐ）のＳＰを有する配列データ、右側は真核生物（Ｅ）のＳＰを有する配列データである。両ＳＰについて、Ｄスコアの平均値（avg.）も示している。上段は野生型（ＷＴ）配列の結果を示す。中段はベストな変異体、すなわちＤスコアが最も高い配列の結果を示す。下段は、最良の変異体のコンセンサス、すなわち、細菌ＳＰと組み合わせた場合および真核生物ＳＰと組み合わせた場合の両方で、ＷＴ配列よりも高いＤスコアを有する配列の結果を示す。ＷＴとのＤスコア差異も示している（最後の行）。 図５は、新規５’ＡＰプライマーのアラインメントを示す（最初の２つのＶＨコドンは太字で示し、下線を付している）。 図６は、２系統のＭｅｒｕｓ Ｍｏｕｓｅ（MeMo(登録商標））により発現されるＶＨ遺伝子セグメントの開始点に新たに設計した５’プライマーをアニーリングしたタンパク質の翻訳結果を示す。ＡＰに変更したＶＨ領域の最初の２残基を、太字かつ下線を付して示す。 図７にＡＰ ５’プライマーの増幅効率（アガロースゲル上でのＰＣＲ産物収量の比較）を示す。 図８は、新規ＡＰプライマーおよびＡＰ２プライマーのアライメントを示す。 図９は、ＡＰ２ ５’プライマーの増幅効率（アガロースゲル上でのＰＣＲ産物収量の比較）を示す。 図１０は、並行して試験したすべての新規プライマー（ＡＰおよびＡＰ２）の増幅効率を示す。 図１１は、１３１０ＡＰプライマーの５種の変異体と、２０２１ＡＰプライマーの５種の変異体に対する増幅効率を示す。 図１２は、すべての機能的ＩＧＨＶ１配列との新規プライマー１３０８ＡＰ２のアライメントを示す。 図１３は、すべての機能的なＩＧＨＶ１配列との新規プライマー２０２０ＡＰ２のアラインメントを示す。 図１４は、すべての機能的なＩＧＨＶ１配列との新規プライマー２０１８ＡＰ２のアラインメントを示す。 図１５は、ＩＧＨＶ１に対する新規プライマー１３０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ２および２０２０ＡＰ２のアラインメントを示す。 図１６は、すべての機能的なＩＧＨＶ２配列との新規プライマー１３１０ＡＰ５のアラインメントを示す。 図１７は、すべての機能的なＩＧＨＶ３配列との新規プライマー０５０８ＡＰのアラインメントを示す。 図１８は、全ての機能的ＩＧＨＶ３配列との新規プライマー２０２１ＡＰ２のアラインメントを示す。 図１９は、すべての機能的なＩＧＨＶ３配列との新規プライマー２０１８ＡＰ２のアラインメントを示す。 図２０は、ＩＧＨＶ３に特異的な３つの新規プライマーのアラインメントを示す。 図２１は、すべての機能的なＩＧＨＶ４配列との新規プライマー１３１２ＡＰ２のアラインメントを示す。 図２２は、すべての機能的なＩＧＨＶ４配列との新規プライマー２０１９ＡＰ２のアラインメントを示す。2019AP2。 図２３は、全ての機能的ＩＧＨＶ５配列との新規プライマー１３１３ＡＰ２のアライメントを示す。 図２４は、ＩＧＨＶ６－１との新規プライマーのアラインメントを示す。 図２５は、機能的なＩＧＨＶ７遺伝子セグメントとの新規プライマー１３１４ＡＰ２のアラインメントを示す。

本明細書に添付の図面は、各ファミリー内の特定のＶＨ遺伝子セグメントと、それらに対応するプライマーとの配列アラインメントを示す。ＶＨ遺伝子セグメントはアレルの変異により配列が異なる可能性があり、各ファミリー内の異なるＶＨ遺伝子セグメント配列に対応するプライマーもまた、本明細書に記載の発明に包含されることは、当業者には明らかであり得る。

本明細書に記載の特許文献、科学技術文献は、出願時に当業者が利用可能であった知識を説示するものである。本明細書中に引用された発行済み特許、公開済みおよび出願中の特許出願、ならびに他の刊行物の開示内容全体は、それぞれが引用により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、引用により本明細書に包含される。矛盾が生じた場合には、本明細書の記載が優先される。

本発明をさらに多面的かつ詳細に以下に記載する。

詳細な説明
本発明は、改変されたヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むポリペプチドを提供する。

用語“免疫グロブリン重鎖可変ドメイン”および“ＶＨドメイン”は、本明細書中で互換的に用いられる。この用語は、本明細書において、一般に、ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインを意味するために用いられる（文脈上特に別段の記載がない限り）。

用語“ペプチド”、“タンパク質”および“ポリペプチド”は、本明細書中で互換的に用いられる。タンパク質配列のＮ末端（アミノ末端、ＮＨ２末端、Ｎ末端またはアミン末端としても知られる）は、そのタンパク質配列の開始点である。ペプチド配列は、慣例によりＮ末端からＣ末端へ（左から右へ）記載される。Ｃ末端（カルボキシル末端、カルボキシ末端、Ｃ末端テール、Ｃ末端またはＣＯＯＨ末端ともいう）は、アミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端で、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）により終端している。

本明細書に記載の改変されたヒト、ヒト化またはキメラ可変ドメイン（本明細書中、改変ＶＨドメインとも呼ばれる）は、従来のヒトまたは親ヒト化もしくはキメラＶＨドメインと比較してアミノ酸改変を含み、すなわち、改変ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択される。これは、従来のヒトおよびヒト化またキメラの親ＶＨドメインがＮ末端にグルタミンまたはグルタミン酸残基を有するので、本明細書中、改変されていないＶＨドメインとも呼ばれる、従来のヒトまたは親ヒト化もしくはキメラＶＨドメインとは異なる。

本明細書で用いる、ＶＨドメインの“Ｎ末端”（またはＶＨドメインの“Ｎ末端アミノ酸”）は、ポリペプチド内に存在し得る他のペプチドドメインおよび配列が何であるかにかかわらず、ＶＨドメインアミノ酸配列の開始部分（すなわち、ＶＨドメインの最初のアミノ酸（左から右へ））を意味する。従って、疑念を避けるために、ＶＨドメインの“Ｎ末端”（またはＶＨドメインの“Ｎ末端アミノ酸”）は、成熟ＶＨドメインアミノ酸配列の最初のアミノ酸を意味し、例えばシグナルペプチド配列の一部としてポリペプチドに存在し得る上流アミノ酸は考慮に入れない。従って、ＶＨドメインの“Ｎ末端”（またはＶＨドメインの“Ｎ末端アミノ酸”）は実際には、ポリペプチド鎖の始点にない場合がある（その上流に他のアミノ酸残基がある場合がある）。言い換えれば、ＶＨドメインのアミノ酸配列のすぐ上流に隣接するシグナルペプチドを含むポリペプチドでは、ＶＨドメインの“Ｎ末端”は、ＶＨドメインの最初のアミノ酸（すなわち、シグナルペプチド配列の後の最初のアミノ酸）を意味する。限定されない例として、ポリペプチドが、シグナルペプチド（ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ （配列番号１） ＋ ＶＨドメイン（ＱＶＱＬＶＱＳＧ（配列番号２） ...（IGHV1-3^*01_X62109.1_Homoの通り)）を含み、配列ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧ （配列番号３） ....で示されるとき、ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸に下線を付す。

ＶＨドメインは４つのフレームワーク領域および３つの超可変領域（ＣＤＲとも呼ばれる）からなり、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（Ｎ末端からＣ末端）の配置を有する。フレームワーク領域は可変領域の約８５％を占め、ＶＨドメインのＣＤＲの足場として機能する。フレームワーク領域はＣＤＲに比べ、アミノ酸配列の変動が少ない。ＦＲ１領域の最初のアミノ酸は、ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸でもある。抗体配列中の残基の番号付けには、Kabatの番号付け法が広く用いられている。(Kabat, E.A. et al., NIH Publication No. 91-3242 (1991))。

ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端残基グルタミンまたはグルタミン酸は、抗体の抗原親和性、抗原特異性および／または構造的相互作用において重要な（または重大な）役割を果たすと考えられているが、今回、驚くべきことに、この位置でのアミノ酸変異は許容され得ることが分かった。有利なことに、これにより、グルタミンまたはグルタミン酸を別の（好ましい）アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンの一つで改変することができる。ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端アミノ酸をこのように改変すると、ピログルタミン酸の形成がなくなる（したがって、本明細書の他の場所で詳細に説明されるピログルタミン酸形成に関連する可能性のある有害作用が回避される）。

アミノ酸は、その生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、サイズなど）に従ってグループ化することができる。例えば、酸性残基には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、極性側鎖を有する非酸性残基の例には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。従って、一例では、ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端残基グルタミンまたはグルタミン酸が、アスパラギン酸またはアスパラギンなどの酸性または極性残基に置換されている。これらのアミノ酸は、グルタミンまたはグルタミン酸と同様の生化学的特性を有し、故に、このような改変は、グルタミンまたはグルタミン酸からピログルタミン酸への変化に由来し得る重鎖可変領域の下流の可能性のある変動を除去しながら、同様の生化学的特性を保持するので、有用な選択肢であり得る。

ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインの上流のシグナルペプチド切断部位の認識に対する各アミノ酸変異（すなわち、Ｎ末端アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリン）の可能性のある効果が、本明細書において分析された。ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端グルタミン酸またはグルタミン残基をアラニンで改変することは、ピログルタミン酸形成を排除し、また原核生物および真核生物におけるシグナルペプチド切断部位の認識を維持（例えば、改善）するので特に有用であることが見出された。平均Ｄスコアのインシリコレビューに基づく原核生物におけるシグナルペプチド切断部位の相対的な認識を維持しながら、ピログルタミン酸形成を排除する他のアミノ酸は、グリシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、スレオニン、バリンおよびチロシンである。真核生物において、シグナルペプチド切断部位の相対的な認識を維持しつつ、ピログルタミン酸形成を排除する他のアミノ酸には、平均Ｄスコアのインシリコレビューに基づいて、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリンおよびトリプトファンが含まれる。従って、これらの各アミノ酸は、Ｎ末端グルタミン酸またはグルタミン残基の改変にも有用である。原核生物および真核生物の両方において、シグナルペプチド切断部位の相対的な認識を維持しつつ、ピログルタミン酸形成を排除することを、未改変残基頻度に基づいて評価すると、好ましい残基はアラニン、アスパラギン酸およびセリンであることが示される。

アラニンは脂肪族残基である。従って、別の例では、ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端残基グルタミンまたはグルタミン酸は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンなどの脂肪族残基で置換される。

ＶＨドメインのＮ末端の第２のアミノ酸を別の（優先的な）アミノ酸で置換する効果も本明細書で検討されている。誤解を避けるために、“ＶＨドメインのＮ末端の第２のアミノ酸”とは、ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸に（Ｎ末端からＣ末端の方向で）直接隣接するアミノ酸（換言すれば、ＶＨドメインアミノ酸配列の２位のアミノ酸であり、Ｎ末端アミノ酸（未改変ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＱまたはＥなど）は１位である）であることを意味する。

驚くべきことに、ＶＨドメインのＮ末端の２番目のアミノ酸を（Ｎ末端からＣ末端方向に）プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、バリン、セリンまたはロイシンの一つに改変すると、シグナルペプチドを有するグラム陰性細菌の成熟タンパク質におけるそのような残基の未改変頻度に基づくＶＨドメイン上流のシグナルペプチド切断部位が切断されることが見出されている（Choo and Ranganathan, 2008）。これは、特に、ＶＨドメインのＮ末端の２番目のアミノ酸としてプロリンが選択された場合である。

従って、本明細書に記載の改変ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択される最初のＮ末端アミノ酸；並びにプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、バリンまたはロイシンからなる群より選択される第２のアミノ酸を含んでいてもよい。ある具体例において、ＶＨドメインのＮ末端の第２のアミノ酸はプロリンであるように選択され、好ましい１位および２位は、“アラニン－プロリン”または“ＡＰ”を含む。好ましくは、ここで、システイン残基は、Ｎ末端に高反応性基を導入し、製造時および保存時に開発責任問題（development liabilities）を引き起こし得るため、回避される。

以下のデータに示すように、改変ＶＨドメインのＮ末端におけるアミノ酸の特に有用な組み合わせは、アラニン－プロリン、アラニン－アスパラギン酸、アラニン－グルタミン酸、アラニン－セリン、アラニン－スレオニン、アラニン－バリン、アラニン－ロイシンである。本明細書で用いる“アラニン－プロリン”または“ＡＰ”等の表記は、改変ヒトＶＨドメインのＮ末端における２つの隣接するアミノ酸（すなわち、ＶＨドメインのＮ末端における“最初－次の”アミノ酸（Ｎ末端からＣ末端方向））を意味する。

signalPを用いたＳＰ開裂予測分析から、別の好ましい組み合わせを推測した。図３のデータに基づいて、他の好ましい組み合わせとして、グリシン－プロリン、グリシン－アスパラギン酸、グリシン－グルタミン酸、グリシン－セリン、グリシン－スレオニン、グリシン－ロイシン、グリシン－バリン、メチオニン－プロリン、メチオニン－アスパラギン酸、メチオニン－グルタミン酸、メチオニン－セリン、メチオニン－スレオニン、メチオニン－ロイシン、メチオニン－バリン、アスパラギン－プロリン、アスパラギン－アスパラギン酸、アスパラギン－グルタミン酸、アスパラギン－セリン、アスパラギン－スレオニン、アスパラギン－ロイシン、アスパラギン－バリン、セリン－プロリン、セリン－アスパラギン酸、セリン－グルタミン酸、セリン－セリン、セリン－スレオニン、セリン－ロイシン、セリン－バリン、スレオニン－プロリン、スレオニン－アスパラギン酸、スレオニン－グルタミン酸、スレオニン－セリン、スレオニン－スレオニン、スレオニン－ロイシン、スレオニン－バリン、バリン－プロリン、バリン－アスパラギン酸、バリン－グルタミン酸、バリン－セリン、バリン－スレオニン、バリン－ロイシン、バリン－バリン、チロシン－プロリン、チロシン－アスパラギン酸、チロシン－グルタミン酸、チロシン－セリン、チロシン－ロイシン、チロシン－バリンおよびチロシン－スレオニンのそれぞれが挙げられる。

ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端の最初の２つのアミノ酸をアラニン－プロリンに改変する効果をここでで検討した。この組み合わせは、シグナルペプチドの切断効率を促進するために特に有利であることが見出された。したがって、本明細書に記載の発明は、細胞内で上流シグナルペプチドとともに発現される改変ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインと共に用いられるときに特に有利である。本明細書中、“上流”とは、ポリペプチド中のシグナルペプチドの、改変ＶＨドメインと比較した位置を意味する。換言すれば、ポリペプチド全体で見たとき、シグナルペプチドが改変ＶＨドメインのアミノ酸配列よりもポリペプチドのＮ末端に近いとき、そのシグナルペプチドは改変ＶＨドメインの上流にある。

当業者には、いくつかの異なるシグナルペプチドが知られている。本明細書で用いる用語“シグナルペプチド”は、分泌経路への導入を確実にするリーダー配列を意味する。シグナルペプチドは、分泌タンパク質のＮ末端に位置する比較的短いペプチドであり、タンパク質を小胞体の内腔に導き、その後細胞から排出させるものである。例えば、真核生物では、新生タンパク質のＮ末端に存在する５－３０個のアミノ酸を含むシグナルペプチドは、タンパク質がリボソーム上でまだ合成されている間に細胞質中でシグナル認識粒子（ＳＲＰ）に認識される。次いで、ＳＲＰは、ＳＲＰ－リボソーム－新生鎖（ＳＲＰ－ＲＮＣ）複合体を小胞体（ＥＲ）膜にあるＳＲＰ－受容体（ＳＲ）に送達する。その後、ＧＴＰ依存的な機構により、ＲＮＣ複合体は膜に結合したトランスロコンを介して、伸長するポリペプチド鎖をＥＲ内腔に送達することが可能になる。ＥＲ膜を通過した後、シグナルペプチドは、シグナルペプチドペプチダーゼ（ＳＰＰ）により切断される。真核細胞でのタンパク質発現に適したいくつかのシグナルペプチドが当業者に知られている。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のＮ末端は、天然のシグナルペプチドまたはリーダー配列を有する（Nucl. Acids Res. (2005), 33, D256-D261)。他のシグナルペプチド配列は、Nucleic Acid Research (1984) 12, 5145－5164に記載されているように、当技術分野でよく知られている。膜タンパク質および分泌タンパク質のシグナルペプチドの例としては、酵母において従来の膜タンパク質および分泌タンパク質発現系で用いられるサッカロミセス・セレビシエまたは酵母ウイルス由来のものが挙げられ、α因子、α因子受容体、プレプロトキシン、ＳＵＣ２タンパク質およびＰＨＯ５タンパク質、ＢＧＬ２タンパク質、ならびにＡＧＡ２タンパク質由来の分泌シグナルペプチドが含まれる。分泌性シグナルペプチドの配列を予測するコンピュータプログラムも提供されている。SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、PSORT (http://psort.nibb.ac.jp/)、およびPhobius (http://phobius.cgb.ki.se/)。これらのコンピュータプログラムを使用することにより、分泌シグナルの配列予測が可能となる。

真核細胞におけるＶＨドメイン発現に用いられ得るシグナルペプチドの特定の例（これは、以下の実施例部分で用いられる）は、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＬＬＡＱＰＡＭＡ（配列番号４）である。これは、ＳＲＰが、その一次配列の変動にもかかわらず、共通の特徴に基づいてシグナルペプチドを選択的に結合するので、限定されない例であることが特記される。従って、他の適切なシグナルペプチドもまた、本明細書中で用いられ得る。

細菌の細胞質外環境に輸送されるタンパク質の多くは、いわゆるＳｅｃ経路を利用してターゲッティングを行う。この経路は、新たに合成された前駆体タンパク質上のシグナルペプチドが、原核生物およびミトコンドリアなどの原核生物由来のオルガネラにのみ存在するタンパク質であるＳｅｃＡに認識されることで開始される。

原核細胞におけるＶＨドメイン発現に用いられ得るシグナルペプチドの特定の例（これは以下の実施例部分で用いられる）は、ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１）である。これは、ＳｅｃＡが、その一次配列の変動にかかわらず、共通の特徴に基づいてシグナルペプチドを選択的に結合するので、限定されない例であることが特記される。従って、他の適切なシグナルペプチドもまた、本明細書中で用いられ得る。代表的なシグナル配列としては、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、エンドキシラナーゼおよびＳｔＩＩからのシグナル配列が挙げられる（Appl. Microbiol. Biotechnol (2004) 64:625-635)。

以下の実施例部分で用いられる２つの（限定されない）シグナルペプチドは、両方ともシグナルペプチドのＣ末端に配列ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）を有する（換言すれば、ＶＨドメインのＮ末端のすぐ上流のアミノ酸配列は、...ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）である）ことが特記される。従って、一例において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）を含む。

上記の通り、シグナルペプチドの切断効率は、ＶＨのそれと同様に、シグナルペプチド切断部位のシグナルペプチドの配列によって変わる。従って、シグナルペプチド切断部位に隣接するＶＨドメインおよびシグナルペプチドの残基は、シグナルペプチダーゼ処理に影響を与え、非典型的（non-canonical）切断部位に寄与し得る。従って、好ましくは、これらの残基は、

または

である（シグナルペプチドのＣ末端配列を太字で表わし、改変ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端アミノ酸に下線を付した）。

さらなる例では、従って、特に原核生物宿主細胞における発現のために、シグナルペプチド切断部位に隣接するＶＨドメインおよびシグナルペプチドのアミノ酸残基は、

または

である（シグナルペプチドのＣ末端配列を太字で表わし、改変ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端アミノ酸に下線を付した）。

さらなる例では、従って、特に真核宿主細胞における発現のために、シグナルペプチド切断部位に隣接するＶＨドメインおよびシグナルペプチドのアミノ酸残基は、

または

である（シグナルペプチドのＣ末端配列を太字で表わし、改変ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端アミノ酸に下線を付した）。

本明細書に記載のポリペプチドは、改変ＶＨドメインを含む。ポリペプチドは、本明細書に記載の改変ＶＨドメインを含む何れかのタンパク質であってよい。例えば、本明細書に記載の改変ＶＨドメインを含む抗体、抗体変異体または抗体フラグメントであってもよい。

抗体、抗体変異体および抗体フラグメント
“抗体”とは、抗原上のエピトープに結合する１以上のドメインを含む、タンパク質の免疫グロブリンクラスに属するタンパク質分子であり、かかるドメインは、抗体の可変領域に由来するか、またはそれと配列相同性を共有するものである。抗体結合は、特異性および親和性を含む様々な性質を有する。特異性は、どの抗原またはそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されるかを決定する。親和性は、特定の抗原またはエピトープへの結合の強さを示す指標である。ここで、簡便には、抗体の‘特異性’は、特定の抗原に対する選択性を意味し、一方、‘親和性’は、抗体の抗原結合部位と結合するエピトープとの間の相互作用の強さを意味することが特記される。したがって、本明細書で用いる“結合特異性”は、個々の抗体結合部位が抗原決定基と反応する能力を意味する。一般的には、本発明の抗体の結合部位は、Ｆａｂ部分に位置し、重鎖および軽鎖の超可変領域から構築される。

本明細書で用いる“抗体フラグメント”は、抗体の機能的部分（この場合、少なくとも本明細書に記載の改変ＶＨドメイン）を含むタンパク質部位を意味する。抗体フラグメントは、単鎖Ｆｖ、単鎖またはタンデム二重特異性抗体（TandAb(登録商標)）、ＶＨＨ、アンチカリン(登録商標)、ナノボディ(登録商標)、ＢｉＴＥ(登録商標)、Ｆａｂ、アンキリンリピートタンパク質またはDARPINs(登録商標)、Avimers(登録商標)、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Adnectins(登録商標)、Affilins(登録商標)、Trans-bodies(登録商標)、Affibodies(登録商標)、TrimerX(登録商標)、マイクロタンパク質、Fynomers(登録商標)、Centyrins(登録商標)あるいはKALBITOR(登録商標)など、何れかの結合剤であり得るが、これらに限定されるものではない。

“親和性”とは、１つの抗原結合部位とその抗原との相互作用の強さを意味する。本発明の抗体の抗原に対する単一の抗原結合部位は、親和性定数とも呼ばれる平衡解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。一般に、治療用途の抗体は、マイクロモル（１０^－６Ｍ；低親和性）からピコモル（１０^－１２Ｍ；高親和性）の範囲のＫｄ値を有する親和性を有し得る。

“抗原”とは、宿主生物に免疫反応を引き起こす（抗体を産生する）ことができる分子、および／または、抗体によって標的にされる分子を意味する。分子レベルでは、抗原は抗体の抗原結合部位に結合する能力によって特徴付けされる。また、抗原の混合物も‘抗原’と見なされ得て、すなわち当業者は、腫瘍細胞のライセートまたはウイルス粒子が‘抗原’として示されることがあるが、そのような腫瘍細胞ライセートまたはウイルス粒子調製物は、多くの抗原決定基を有することを理解し得る。抗原は、少なくとも１つ、多くの場合それ以上のエピトープを含む。

“エピトープ”または“抗原決定基”とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位である。エピトープは、連続アミノ酸から形成される場合と、タンパク質の３次元折り畳みによって並置された非連続アミノ酸から形成される場合がある（それぞれ、いわゆる線形エピトープおよび立体構造エピトープである）。連続した直鎖アミノ酸から形成されたエピトープは、通常、変性溶媒に曝されても保持されるが、３次元折り畳みコンフォメーションによって形成されたエピトープは、通常、変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは、一般的には、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個のアミノ酸をユニークな空間コンフォメーションで含み得る。

用語“重鎖”または“免疫グロブリン重鎖”は、何れかの生物由来の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含み、特記されない限り、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。重鎖可変ドメインは、特記されない限り、３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。重鎖のフラグメントは、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにそれらの組み合わせを含む。一般的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端まで）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的フラグメントには、抗原を特異的に認識することができ、少なくとも１つのＣＤＲを含むフラグメントが含まれる。

用語“軽鎖”は、何れかの生物由来の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、またはＶ_Ｌ（またはその機能的フラグメント）；および免疫グロブリン定常ドメイン、またはＣ_Ｌ（またはその機能的フラグメント）配列を含む。特記されない限り、軽鎖という用語は、ヒトκ、λおよびそれらの組み合わせから選択される軽鎖を含み得る。軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインは、特記されない限り、一般的には、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域を含む。一般に、全長軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＶ_Ｌドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。本発明で用いられ得る軽鎖には、例えば、重鎖によって選択的に結合されるエピトープと選択的に結合しないものが含まれる。

本発明の抗体で用いるのに適する軽鎖には、既存の抗体ライブラリー（ウェットライブラリーまたはインシリコ）において最も一般的に用いられている軽鎖をスクリーニングすることによって同定できるような共通の軽鎖（ｃＬＣ）があり、ここで、軽鎖は重鎖のエピトープ結合ドメインの親和性および／または選択性を実質的に妨害せず、かつ重鎖のアレイと対になるのに適切である。例えば、好適な軽鎖には、共通の軽鎖をゲノムに組み込んだＭｅＭｏ(登録商標)などのトランスジェニック動物からのものが含まれ、これを用いて、重鎖に多様性を有し、該抗原に曝露すると抗原と特異的に結合できる共通の軽鎖抗体の大きなパネルを作製することができる。

用語“共通の軽鎖”は、本発明の抗体の結合特異性に影響を与えない、すなわち機能的結合領域の形成に実質的に影響を与えないで、同一の、またはいくつかのアミノ酸配列相違を有する軽鎖を意味する。例えば、本明細書で用いる共通鎖の定義の範囲内で、例えば、保存的アミノ酸変化、同族鎖と対になったとき結合特異性に寄与しないかまたは部分的にしか寄与しない領域におけるアミノ酸の変異等を導入して試験することにより、同一ではないが依然として機能的に同等な可変鎖を準備または発見することができる。従って、かかる変異体は、異なる同族鎖を結合し、機能的な抗原結合ドメインを形成することもできる。従って、本明細書で用いる用語“共通の軽鎖”は、重鎖と対になった後、得られる抗体の結合特異性を保持しながら、同一であってもよいか、またはいくつかのアミノ酸配列の相違を有していてもよい軽鎖を意味する。ある共通の軽鎖およびそのような機能的に等価な変異体の組み合わせは、用語“共通の軽鎖”内に包含される。共通の軽鎖の使用、および好適な共通の軽鎖の詳細な説明については、ＷＯ２００４／００９６１８、ＷＯ２００９／１５７７７１およびＷＯ２０２０／１４１９７３を参照のこと。

“Ｆａｂ”とは、可変領域を含む結合ドメイン、一般的には、対になった重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む結合ドメインを意味する。Ｆａｂは、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）およびＶＬドメインと対になったＣＨ１およびＶＨドメインを含む定常領域ドメインを含んでいてよい。このような対は、例えば、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインにおけるジスルフィド架橋を介した共有結合として行われ得る。

“単鎖可変フラグメント”（ｓｃＦｖ）とは、例えば約１０アミノ酸長～約２５アミノ酸長のリンカー、例えばペプチドリンカーを介して連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む結合ドメインを意味する。ここで、用語“連結されている”とは、その一次アミノ酸配列によって互いに連結されているドメインを意味する。例えば、塩基抗体部分は、リンカーを介してさらなる結合ドメイン（または追加の結合ドメイン）に連結されてもよい。同様に、ＣＨ１ドメインは可変重鎖領域に連結されてもよく、ＣＬドメインは可変軽鎖領域に連結されていてもよい。次いで、“対合”とは、本発明のポリペプチドが多量体化し得るような相互作用を意味する。例えば、さらなる結合ドメインは、軽鎖領域（ＣＬ－ＶＬ）と対になる重鎖領域（ＣＨ１－ＶＨ）を含んでいてよく、（重鎖領域の）ＣＨ１および（軽鎖領域の）ＣＬは、一般的にはジスルフィド結合の形成により対形成する。混合結合ドメインなどの抗体鎖またはポリペプチドのドメインは、共有または非共有相互作用、例えば、ファンデルワールス力、水素結合、水を介した水素結合、塩架橋または他の静電力、芳香族側鎖間の引力相互作用、ジスルフィド結合の形成、または当業者に公知の他の力を介して、さらに相互作用して対形成してインターフェースを形成してよい。

本明細書において核酸またはアミノ酸配列を意味する“同一性パーセント（％）”は、最適な比較目的のために配列をアライメントさせた後、選択した配列中の残基と同一である候補配列中の残基のパーセントとして定義される。核酸を比較する配列同一性パーセントは、改変ClustalWアルゴリズム（Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680）、swgapdnamtスコアマトリックス、ギャップオープニングペナルティ１５およびギャップエクステンションペナルティ６．６６を用いたデフォルト設定を用いてVector NTI Program Advance 11.5.2 ソフトウェアのAlignXアプリケーションヲ用いて決定される。アミノ酸配列は、改変ClustalWアルゴリズム（Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J., 1994）、blosum62mt2スコアマトリックス、ギャップオープンペナルティ１０およびギャップエクステンションペナルティ０．１を用いるデフォルト設定を用いて、Vector NTI Program Advance 11.5.2ソフトのAlignXアプリケーションを用いてアライメントされる。

“複数”とは、２以上であることを意味する。

本明細書に記載の抗体の“変異体”は、抗体の機能的部分、機能的誘導体、誘導体および／または類縁体を含んでいてもよい。これには、抗体模倣体、モノボディおよびアプタマーが含まれる。変異体は、一般的には、抗体の結合特異性、例えば、二重特異性抗体の特異性を維持する。本明細書に記載の抗体の機能的誘導体は、連結領域によって連結された、１つの標的を結合する可変ドメインおよび第２の標的を結合する可変ドメインを含むタンパク質である。可変ドメインは、そのままの可変ドメインであってもよいか、またはＦａｂフラグメントまたはＶＨおよびＶＬがリンカーを介して連結されてなる単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントなどの可変ドメイン様分子であってもよい。その他の可変ドメイン様分子の例は、いわゆる単一ドメイン抗体フラグメントである。単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）は、単一のモノマー可変抗体領域を有する抗体フラグメントである。抗体全体と同様に、特定の抗原に選択的に結合することができる。分子量はわずか１２－１５ｋＤａで、２本の重鎖および２本の軽鎖からなる一般的な抗体（１５０－１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、Ｆａｂフラグメント（～５０ｋＤａ、１本の軽鎖および半分の重鎖）および１本鎖可変領域（～２５ｋＤａ、軽鎖から１つおよび重鎖から１つの２つの可変領域）よりもさらに小さなフラグメントである。単一ドメイン抗体は、それ自体は通常の抗体よりもそれほど小さくはない（一般的に、９０－１００ｋＤａである）。単一ドメイン抗体フラグメントは、主にラクダ科動物に見出される重鎖抗体から設計され、ＶＨＨフラグメント（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ(登録商標））と呼ばれる。また、魚類には重鎖のみの抗体（ＩｇＮＡＲ、‘immunoglobulin new antigen receptor’）を有するものがあり、それからＶＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメインの抗体フラグメントを得ることができる。また、ヒトまたはマウスの一般的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）から二量体の可変ドメインを単量体に分割する別の方法もある。現在、単一ドメイン抗体に関する研究のほとんどは重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。可変ドメイン様分子の他の限定されない例としては、ＶＨＨ、ヒトドメイン抗体（ｄＡｂｓ）およびユニボディが挙げられる。好ましい機能的部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、可変ドメインを含む部分である。このような可変ドメインの限定されない例としては、Ｆ（ａｂ）－フラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメントが挙げられる。可変ドメイン（類似）結合のための二重特異性形式は、例えば、２つの異なるｓｃＦｖに結合したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；二量化モチーフまたはヘリックスバンドルもしくはコイルドコイルのような自己会合二次構造を介して共に結合した２つの異なるｓｃＦｖを含む二重特異性ミニ抗体である（Morrison (2007) Nat. Biotechnol. 25:1233-34）。適切なＨＳＡリンカーの例およびｓｃＦｖをリンカーに結合させる方法は、ＷＯ２００９／１２６９２０に記載されている。

機能的誘導体は、抗体模倣体、ポリペプチド、アプタマーまたはそれらの組み合わせであり得る。これらのタンパク質またはアプタマーは、一般的に、１つの標的に結合する。本発明のタンパク質は、２以上の標的に結合する。これらの抗体、抗体模倣体、ポリペプチドおよびアプタマーの何れかの組み合わせは、当技術分野で公知の方法によって連結され得ることが理解される。例えば、いくつかの態様において、本発明の結合分子は、複合体または融合タンパク質である。抗体模倣体は、抗体のように、抗原を特異的に結合することができるが、構造的に抗体と関連しないポリペプチドである。抗体模倣体は一般的に、約３～２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質である。抗体と比較した場合の利点は、溶解性、組織への浸透性、熱および酵素に対する安定性ならびに比較的低い生産コストなどである。抗体模倣体の限定されない例は、アフィボディ分子（一般的にはプロテインＡのＺドメインに基づく）；アフィリン（一般的にはガンマＢ結晶またはユビキチンに基づく）；アフィマー（一般的にはシスタチンに基づく）；アフィチン（一般的にはスルフォロブス目の古細菌（Sulfolobus acidocaldarius)由来のＳａｃ７ｄに基づく）；アルファボディ（一般的にはトリプルヘリックスコイルドコイルに基づく）；アンチカリン（一般的にはリポカリンに基づく）；アビマー（一般的には種々の膜受容体のＡドメインに基づく）；ＤＡＲＰｉｎｓ（一般的にはアンキリン反復モチーフに基づく）；フィノマー（一般的にはＦｙｎ７のＳＨ３ドメインに基づく）；クニッツドメインペプチド（一般的には種々のプロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインに基づく）；およびモノボディ（一般的にはフィブロネクチンのタイプＩＩＩドメインに基づく）である。

モノボディは、分子骨格としてフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）を用いて構築される合成結合タンパク質である。モノボディは、抗体に代わる標的結合タンパク質として、簡便かつロバストに作製することができる。用語モノボディは、１９９８年に小出グループがヒトフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメインを用いてモノボディの概念を実証した最初の論文を発表したときに作られた用語である。モノボディおよび他の抗体模倣体は、一般的に、ファージディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイおよび酵母表面ディスプレイなどの分子ディスプレイならびに指向性進化技術（directed evolution technologies）を用いて足場の一部を多様化したコンビナトリアルライブラリーから作製される。多くの抗体模倣体は、それぞれの標的に対して高い親和性および特異性を有している。アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子である。アプタマーは通常、大規模なランダム配列プールから選択することで作成されるが、天然のアプタマーもリボスイッチに存在する。アプタマーは、高分子として基礎研究にも臨床にも用いることができる。“非結合型”相互作用は、共有結合で結合されていない原子間に作用する。したがって、電子の共有を伴わない結合であり、分子間あるいは分子内により分散した電磁 的相互作用のバリエーションである。非結合型相互作用には、水素結合、イオン結合およびハロゲン結合などの静電的相互作用がある。ファンデルワールス力は、永久双極子または誘導双極子（または多極子）を含む静電相互作用のサブセットである。これらには、永久双極子－双極子相互作用、双極子－誘導双極子相互作用および誘導双極子－誘導双極子相互作用が含まれる。塩架橋は、水素結合およびイオン結合の２つの非共有結合の組み合わせである。疎水性相互作用は、非極性（イオン化できない）炭化水素分子が、水：水の相互作用が強いために、強制的に結合させられる相互作用である。

核酸およびベクター
本発明はまた、本発明のポリペプチド、抗体、抗体変異体または抗体フラグメントをコードする核酸を提供する。

本明細書に記載の核酸は、本発明のポリペプチド、抗体、抗体変異体または抗体フラグメントを産生するために用いられ得る。従って、かかる核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）も提供され、これを用いて本発明のポリペプチド、抗体、抗体変異体または抗体フラグメントを産生することができる。

抗体は、一般的には、一体となって集合して抗体を形成するポリペプチドをコードする核酸を含む細胞によって産生される。抗体のポリペプチドを作るために用いられる核酸は、何れかの適切な発現ベクター中に配置することができ、適切な状況では、２以上のベクターを単一の宿主細胞に入れることができる。一般に、改変ＶＨドメインをコードする核酸は、適切なリンカーおよび／または定常領域と共にクローニングされてもよく、その配列は、発現のために適切な細胞株中の適切な発現構築物においてプロモーターと作動可能に連結して配置される。

改変ＶＨドメインをコードする核酸が、例えばクローニングまたは合成により導入され得るベクターＤＮＡは、好ましくは、シグナルペプチドおよびＶＨドメインの最初のアミノ酸、または最初の２個のアミノ酸をコードする核酸を含む。このように、ベクターＤＮＡは、本明細書に記載の改変抗体または重鎖の産生のための標準ベクターとして用いられ得て、それによって、各単一ＶＨドメインの最初のアミノ酸、または最初の２個のアミノ酸を改変しなければならないという必要性が省略される。従って、このベクターＤＮＡは、改変されたＶＨドメインをコードする核酸をまだ含んでいない。当業者は、例えば、ベクターＤＮＡ中に既に存在する改変ＶＨドメインをコードする核酸の最初のアミノ酸、または最初の２個のアミノ酸をコードするコドンを省略することによって、機能的抗体または重鎖が産生されるように、改変ＶＨドメインをコードする核酸をこのようなベクターＤＮＡに組み込む方法を知っている。

ベクターは、例えばファージミド（ファージでの発現用）またはプラスミド（細菌または真核細胞での発現用）のような、何れかの適切なベクターであってもよい。

ファージミドは、バクテリオファージおよびプラスミドの両方の性質を有するＤＮＡベースのクローニングベクターである。ファージミドは、プラスミド複製起点およびバクテリオファージ由来の複製起点を担持する。ファージミドは、糸状菌ファージＭ１３と組み合わせてクローニングベクターの一種として使用でき、またバクテリオファージのカプシドにパッケージ化され得る。ファージミドは、様々なバイオテクノロジー用途に用いられる。例えば、ファージディスプレイに用いられ得る（その詳細は、本明細書の別の箇所に記載されている）。いくつかの異なるファージミドが市販されており、本明細書中で用いられ得る。

本発明はまた、本発明の核酸またはベクターを含むファージを提供する。かかるファージは、ライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーの一部であってもよい。

プラスミドもまた、よく知られている。プラスミドは、本明細書の他の箇所に記載されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってその可変領域が産生（および改変）される免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を細菌または哺乳動物で発現させるために構築することができる。いくつかの異なるプラスミドが市販されており、本発明において用いることができる。

本発明のポリペプチドのスクリーニング、宿主細胞および製造方法
本発明はまた、本明細書の他の箇所に記載される改変ＶＨドメインを含むポリペプチドの製造方法を提供する。ＶＨドメインをコードするＶＨ核酸は、非ヒト動物、好ましくはトランスジェニック非ヒト動物を抗原で免疫化し、それによってその抗原に特異的なＶＨドメインを産生し、かかるＶＨドメインを産生するＢ細胞のクローン増殖をもたらすことによって提供され得る。ＶＨドメインをコードする核酸は、その後、ｃＤＮＡ合成のために単離され、本明細書に記載の方法で用いられ得る。

一つの方法において、このｃＤＮＡは、望ましい結合特性を示すＶＨドメインをスクリーニングするために、ファージディスプレイライブラリーの作成に用いられ得る。選択後、所望のＶＨ核酸は、抗体産生のために宿主細胞にトランスフェクトすることができる。

別の方法では、重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡがハイスループット配列決定に供され、ｃＤＮＡが、用いられる可変領域遺伝子セグメント、全可変領域配列、ＨＣＤＲ３または当業者にとって望ましい他の特徴の頻度に基づくなど、抗体産生のために宿主細胞へのトランスフェクションに選択される頻度分析に用いられる。

宿主細胞へのトランスフェクションは、当技術分野で既知であり、本明細書にさらに記載されるように実施することができる。例えば、本明細書に記載のベクターの何れかが、トランスフェクションに用いられ得る。宿主細胞が、好ましくは最初のおよび次のアミノ酸（複数可）位置でコード化される変異体を含む、改変ＶＨドメインをコードする核酸をそのゲノムに組み込んで含み、さらに下流の付加的変異を含んでいてもよいことがさらに企図される。

さらなる方法は、本発明の抗体へのアセンブリが可能なポリペプチドをコードする１以上の核酸を含む細胞を提供すること；ならびに、ポリペプチドの発現および抗体へのアセンブリを提供する条件下で該細胞を培養することを含む。

本明細書に記載の改変ＶＨドメインをコードする核酸分子は、染色体外コピーとして存在してもよく、および／または宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれてもよい。後者が好ましく、その場合、遺伝子サイレンシングの欠如について知られている遺伝子座が標的とされ得る。

ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドをコードする核酸を発現させるために、そのような発現を駆動できる配列をＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結できることは、当業者によく知られている。機能的に連結されるとは、ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドまたはその前駆体をコードする核酸が、これらの配列がＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドまたはその前駆体の発現を駆動できるように、発現を駆動できる配列に連結されることを意味する。有用な発現ベクターは当技術分野で入手可能であり、例えば、InvitrogenのｐｃＤＮＡベクターシリーズが挙げられる。目的のポリペプチドをコードする配列が、コードされたポリペプチドの転写および翻訳を調節する（governing）配列を参照して適切に組み込まれる場合、得られる発現カセットは、発現と称される目的のポリペプチドを産生するのに有用である。発現を駆動する配列には、プロモーター、エンハンサー等、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。これらは、宿主細胞内で機能し、それによってそれらが機能的に連結された核酸の発現を駆動することができるものであればよい。プロモーターは構成的であっても制御されていてもよく、ウイルス、原核生物または真核生物の供給源を含む様々な供給源から得ることができるか、または人工的に設計することができる。目的の核酸の発現は、天然プロモーターまたはその誘導体からであってもよいか、または完全に異種のプロモーターからであってもよい。真核細胞における発現のためのいくつかの周知かつ多用されているプロモーターは、アデノウイルス、例えばＥ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、例えばＣＭＶ即時型（ＩＥ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター等のウイルスに由来するプロモーターを含む。また、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ－１α）プロモーター、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターなどの真核細胞由来のプロモーターも好適に用いられ得る。宿主細胞において目的の配列の発現を駆動することができる何れかのプロモーターまたはエンハンサー／プロモーターは、本発明において好適である。一態様において、発現を駆動することができる配列は、ＣＭＶプロモーターからの領域、好ましくはＣＭＶ即時型遺伝子エンハンサー／プロモーターの－７３５～＋９５のヌクレオチドを含む領域を含む。当業者は、本発明で用いられる発現配列が、好適には、インシュレーター（insulator）、マトリックス付着領域、ＳＴＡＲ要素（ＷＯ０３/００４７０４）等の発現を安定化または増強できる要素と組み合わせてもよいことを認識し得る。これにより、安定性および／または発現レベルを高めることができる。

組換え宿主細胞におけるタンパク質産生は、例えば、Current Protocols in Protein Science, 1995, Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT, ISBN 0-471-11184-8；Bendig, 1988に広範に記載されている。細胞の培養は、細胞が代謝し、および／または成長し、および／または分裂し、および／または目的の組換えタンパク質を産生できるようにするために行われる。これは、当業者によく知られている方法によって達成することができ、細胞に栄養を供給することを含むが、これに限定されない。この方法は、表面に付着しての増殖、懸濁液中での増殖、またはそれらの組合せを含む。タンパク質産生収率を最適化するために、当業者によく知られている方法によって、いくつかの培養条件を最適化することができる。培養は、例えば、ディッシュ、ローラーボトルまたはバイオリアクター内で、バッチ、フェドバッチ（fedbatch）、連続システム、中空糸などを用いて行うことができる。細胞培養による組換えタンパク質の大量（連続）生産を実現するためには、懸濁液中で増殖可能な細胞を用いて、動物由来もしくはヒト由来の血清または動物由来もしくはヒト由来の血清成分がない状態で培養することが可能である。従って、培養液に由来する動物またはヒトのタンパク質が付加されないため、精製が容易で安全性が高く、また合成培地が最も再現性に優れているため、信頼性の高いシステムとなっている。

免疫グロブリン様ポリペプチドは、宿主細胞で発現され、当業者に一般的に知られている方法によって、細胞から、あるいは好ましくは、細胞培養液から回収される。回収後、これらのＩｇ様ポリペプチドは、当業者に公知の方法を用いることにより精製することができる。このような方法としては、沈殿、遠心分離、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、カチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等を挙げることができる。ＩｇＧポリペプチドを含む抗体の混合物の場合、プロテインＡまたはプロテインＧの親和性クロマトグラフィーを好適に用いることができる（例えば、米国特許第４，８０１，６８７号および同第５，１５１，５０４号参照）。

親和性クロマトグラフィーを用いた捕捉後、直交精製工程（orthogonal polishing steps）を経て、残存するプロセス関連および／または製品関連の不純物を除去し、この不純物には、ホモダイマー、電荷変異体、宿主細胞タンパク質（HCP）および宿主細胞DNAが含まれ得る。一般に、精製された二重特異性抗体または多価多量体を得るために、宿主細胞培養、回収清澄化、続いてタンパク質捕捉、宿主細胞ＤＮＡの除去を含むアニオン交換クロマトグラフィー、次に宿主細胞タンパク質、溶出プロテインＡ、潜在的凝集体および潜在的製品関連不純物の除去を含むカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）が用いられ、続いて最終ウイルス除去工程としてナノろ過などの追加の工程が実施される。当業者は、このような工程の順序が変更され得ること、または個々の工程が置き換えられ得ることを認識している。例えば、第２の精製工程の別法としては、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーが挙げられる。

本発明による方法で製造される免疫グロブリン様ポリペプチドおよび／またはその混合物は、好ましくは、共通の軽鎖を有する。したがって、本発明による方法であって、該宿主細胞に共通の軽鎖をコードする核酸を提供することをさらに含む、方法がさらに提供される。これは、少なくとも２つの異なる重鎖と対合することができ、それによって機能的な抗原結合ドメインを形成することができる軽鎖である。機能的な抗原結合ドメインは、抗原に特異的に結合することができる。一態様において、本発明の方法で製造された全ての重鎖と対合することができ、それによって機能的抗原結合ドメインを形成する共通の軽鎖が用いられるため、一致（マッチ）しない重鎖および軽鎖のミスペアリングが回避される。一態様では、１つの同一のアミノ酸配列を有する共通の軽鎖のみが用いられる。あるいは、当業者であれば、“共通の”は、アミノ酸配列が同一でない軽鎖の機能的等価体も意味することを認識し得る。該軽鎖の多くの変異体は、機能的結合領域の形成に重大な影響を与えない変異（欠失、置換、付加）が存在するところに存在する。したがって、そのような変異体は、異なる重鎖を結合し、機能的な抗原結合ドメインを形成することも可能である。したがって、本明細書で用いる用語“共通の軽鎖”は、重鎖と対合した後に得られる抗体の結合特異性を保持しながら、同一であってもよいか、または多少のアミノ酸配列の相違を有していてもよい軽鎖を意味する。例えば、保存的アミノ酸変化、および／または重鎖と対になったときに結合特異性に寄与しないかまたは部分的にしか寄与しない領域におけるアミノ酸変化等を導入して試験することにより、同一ではないが依然として機能的に同等な軽鎖を調製または見出すことが可能である。ある共通の軽鎖およびそのような機能的に等価な変異体の組み合わせは、用語“共通の軽鎖”の中に包含される。共通の軽鎖の使用に関する詳細な説明については、ＷＯ２００４/００９６１８を参照のこと。好ましくは、共通の軽鎖は、生殖細胞様軽鎖、より好ましくは生殖細胞系軽鎖、好ましくは再配列生殖細胞系ヒトκ軽鎖、最も好ましくは再配列生殖細胞系ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１～３９／Ｊκ、ＩＧＶκ３～１５／Ｊκ、またはＩＧＶκ３～２０／Ｊκが本発明において用いられる。また再配列生殖細胞系ヒトλ軽鎖も用いられ得る。好ましい再配列生殖細胞系ヒトλ軽鎖は、ＩＧＶＬ３－２１／ＪＬを含む。

あるいは、当業者は、共通鎖を用いることの別法として、かつ一致しない重鎖および軽鎖のミスペアリングを回避するために、当業者に知られている手段により、重鎖および軽鎖を強制的に対合させる手段を選択することができる。

本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞も本明細書中に提供される。本発明の“宿主細胞”は、例えばエシェリキア（例えば、大腸菌）、エンテロバクター、サルモネラ、バチルス、シュードモナス、ストレプトマイセスなどの細菌；S. セレビシエ、K. ラクティス、P. パストリスなどの酵母；カンジダ菌、またはヤロウイア菌（Yarrowia）、ニューロスポラ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニデュランスおよびアスペルギルス・ニゲルなどの糸状菌、ツマジロクサガメ（Spodoptera frugiperda）ＳＦ－９細胞またはＳＦ－２１細胞などの昆虫細胞、ならびに好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞およびＮＳ－０黒色腫細胞を含むマウス細胞、ＣＯＳ細胞およびＶｅｒｏ細胞などの霊長動物細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ハイブリドーマ、腫瘍細胞、不死化初代細胞、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０またはＰＥＲ.Ｃ６などの胚性網膜細胞などのヒト細胞などの哺乳動物細胞を含む、組換えＤＮＡ分子の発現が可能な何れかの宿主細胞であり得る。多くの場合、選択する発現系は、抗体が適切にグリコシル化され得るように、哺乳動物細胞発現ベクターおよび宿主を含み得る。ヒト細胞株を用いて、完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体を得ることができる。細胞を成長または増殖させるための条件（例えば、Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973) 参照）および組換え産物の発現条件は、多少異なっていてもよく、工程の最適化は通常、当業者に一般的に知られている方法に従って、産物の収率および／または細胞増殖を相対的に増加させるために行われる。一般に、哺乳動物細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコールおよび実用的な技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991)に見出すことができる。組換え宿主細胞における抗体の発現は、当技術分野において広範に記載されている。軽鎖および重鎖をコードする核酸は、染色体外コピーとして存在してもよく、および／または宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれていてもよい。

ライブラリー
本発明は、本発明の異なる核酸、ベクターまたはファージのライブラリー（すなわち、コレクション）を提供する。ライブラリーは、本発明の少なくとも約１０^６の異なる核酸、ベクターまたはファージを含んでいてもよい。

本発明によるライブラリーの一例は、ディスプレイライブラリーである。ディスプレイライブラリーを調製する方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、本発明の様々な改変ＶＨドメインを提示するディスプレイライブラリーの調製方法は、本発明の核酸（例えば、本明細書の別の箇所に記載されるベクターの形態）を、ファージまたは酵母などの生物、またはペプチドディスプレイ用の他の容器に組み込むことを含み、該生物が該生物または容器の表面上で該改変ＶＨドメインを発現および提示するものであってもよい。複数の改変ＶＨドメイン、一般的には複数の異なる改変ＶＨドメインは、ファージディスプレイライブラリーの使用により、複数の生物、例えばファージ（各ファージは１つの改変ＶＨドメインを表す）の表面に提示され得る。したがって、ディスプレイライブラリーにおいて、本発明の核酸によってコードされる複数の改変型ＶＨドメインは、ヒト共通鎖可変領域と対合してもよい。ディスプレイライブラリーは、例えば、Ｆａｂファージディスプレイライブラリーであってもよい。

ディスプレイライブラリー技術
ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイなどを含む様々な形態のディスプレイ技術が当技術分野で知られており、本明細書に記載の改変ＶＨドメインと共に使用するために、本明細書に記載の発明に包含される。以下の記載は、ファージディスプレイに焦点を当てているが、かかる記載は限定的ではなく、本明細書に提供される説明に基づいて、他の形態のディスプレイ技術に容易に適用され得る。ファージディスプレイは、細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージを用いる、タンパク質－タンパク質、タンパク質－ペプチドおよびタンパク質－ＤＮＡ相互作用の試験を含めて用いられる顕著な技術である。本明細書に記載のプロトコールの多くは、ファージディスプレイライブラリーの構築および目的の抗原に結合するためのファージのパンニングのための標準的なプロトコールであり、Antibody Phage Display: Methods and Protocols (編者: Philippa M. O’Brien、Robert Aitken)に記載されている。ライブラリーは、当技術分野で知られている手順に従い、例えば、Kramerら、2003（Kramer et al. Nucleic Acids Res.31(11): e59）により、ＶＣＳＭ１３（Stratagene）をヘルパーファージ株として用いて増殖および回収することができる。ファージは、当技術分野で知られている手順に従い、例えば、Kramerら、2003（Kramer et al. Nucleic Acids Res. 31(11): e59）により、ＶＣＳＭ１３をヘルパーファージ株として用いて増殖および処理することができる。

例示的な技術では、目的のタンパク質、例えば改変ＶＨドメインをコードする核酸をファージのコートタンパク質遺伝子に組み込むことで、ファージはその外側にタンパク質を“提示”させ、内側にそのタンパク質をコードする核酸を含むようになる。このようにして、遺伝子型および表現型が結びつけられる。抗体の発見に関しては、ファージディスプレイにおいて、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの大規模なコレクション（ライブラリー）が、結合ドメインを形成するために対になるように糸状バクテリオファージ粒子の表面上に発現され得る。これらのライブラリーから、抗原および提示された結合ドメインとの結合相互作用によってファージが選択されることがある。このように、提示されたファージを他のタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ配列または他の形態の標的部位に対してスクリーニングし、提示されたＶＨ、ＶＬまたは結合ドメインとそれらの他の部位との間の相互作用を検出することができる。このようにして、ＶＨ、ＶＬまたは結合ドメインの大規模なライブラリーを、自然淘汰に類似したインビトロ選択と称されるプロセスでスクリーニングし、増幅することができる。従って、本発明の改変ＶＨドメインは、ファージ上に提示することができる。

本明細書に記載の発明は、トランスジェニック動物を含む免疫化動物から重鎖可変領域をコードする核酸の本質的にすべてを得て、かつ改変重鎖可変領域をコードする核酸をディスプレイ技術（例えば、ファージ、酵母、リボソームなど）に組み込む、効率的なアセンブリラインプロセスを提供し、ここで、該核酸の各々は、改変重鎖可変領域のＮ末端における非グルタミン酸および非グルタミンアミノ酸残基をコードし、それにより、該動物におけるヒト可変領域遺伝子セグメントまたは可変領域が由来するものに関係なく、かかる残基を欠く免疫動物からの本質的に全ての重鎖可変領域の試験を可能にする。

あるいは、本発明は、Ｎ末端改変重鎖可変領域を含む、結合分子の定義された集団を製造する方法を提供し、それによって、限られたＶＬレパートリー、好ましくは単一または共通の軽鎖を発現し、かつ目的の抗原に特異的な種々の重鎖可変領域を発現するＢ細胞集団が得られる。該Ｂ細胞は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座(複数可)を担持するトランスジェニック動物に、目的の抗原を免疫化した後に得ることができる。該Ｂ細胞由来の核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、該重鎖可変領域の一部、好ましくは本質的に全てをコードする配列が決定される。該サンプル中の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする該核酸は、好ましくは増幅され、頻度分析に供され、ここで、該集団とのＶ遺伝子セグメント使用率が分析され、ＶＨ配列が分析され、ＨＣＤＲ３が分析され、および当業者が関心を有するレパートリーの追加の品質が分析される。

この頻度分析からの該重鎖可変領域（複数可）を次に選択し、少なくとも１つのＶＨ配列の可変領域の最初のまたは最初および次のコード化アミノ酸、好ましくは２つまたはそれ以上の該限定されたＶＬレパートリーまたは共通の軽鎖の少なくとも１つのＶＬ配列を含むバリエーションをさらに宿主細胞に提供するために本明細書に記載の方法で該宿主細胞内に提供する。その後、該宿主細胞を培養して改変ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの発現を可能にし、ここで、１つの改変ＶＨが１つのＶＬと共に該宿主細胞に提供されて単一特異性抗体を産生し、かつ２以上の改変ＶＨ配列が１つのＶＬと共に該宿主細胞に提供されて多重特異性抗体を産生することができる。

核酸の増殖および改変を同時に行う方法
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を同時に増幅および改変する方法もまた、本明細書に提供される。この方法は、増幅された核酸が本発明の新規ポリペプチド（すなわち、本明細書の他の箇所に記載されるような改変ヒトＶＨドメインを含むポリペプチド）をコードするように、標的テンプレートの増幅と該テンプレート配列の改変を単一ステップで組み合わせるので、特に有用である。

本明細書に記載の方法は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（本明細書中、ヒトＶＨドメインとも称される）をコードする核酸を提供するステップを含む。本方法における使用のために提供される核酸は、本明細書において、増幅かつ改変されるべき配列であるテンプレート配列とも呼ばれ得る。

テンプレート核酸は、何れかの適切な供給源から得てもよい。一般的には、テンプレート核酸は、ｃＤＮＡ、例えばＲＮＡサンプルの逆転写によって生成されたｃＤＮＡであってよい。ＲＮＡサンプルは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドを発現する細胞から得られた全ＲＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。

本明細書に記載の何れかの宿主細胞を用いて、テンプレート核酸（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする細胞によって産生されるＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ配列）を得ることができる。特に有利な例では、テンプレート核酸は、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含むヒト細胞またはトランスジェニック動物細胞から得られる。別の例では、トランスジェニック動物は、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座、またはその一部（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖ミニ遺伝子座）を含む。

何れかの適切なトランスジェニック動物、例えば、重鎖可変ドメインのＮ末端にグルタミン酸またはグルタミンを含むヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体または重鎖を形成するヒト可変領域遺伝子セグメントを含むトランスジェニックヒツジ、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックラット、トランスジェニックマウス、トランスジェニックニワトリを含むトリなどを用いることができる。

ヒト可変領域遺伝子セグメントを担持するトランスジェニック動物には、以前に記載したとおりである。かかるトランスジェニック動物は、本明細書に記載の方法において用いられ得る。本明細書に記載の発明における使用に適するトランスジェニック動物は、ＷＯ２００９／１５７７７１に記載のように、そのような動物の生殖細胞系において、再配列された軽鎖または重鎖可変鎖を含むヒト共通免疫グロブリン鎖をコードする核酸および同族鎖（複数）の未再配列の可変領域をコードする核酸を担持する。かかるトランスジェニック動物は、免疫グロブリンの２つの同族鎖のうち一方、例えば、抗原曝露後にＢ細胞発生および親和性成熟中に体細胞組換えを受ける未再配列重鎖または軽鎖を介して生成された多様性を有する抗体を産生することが可能である。これらのトランスジェニック動物、例えばMeMo(登録商標)は、抗原のアレイに対して多様な抗体レパートリーを産生することが可能である。

ヒトトランスジェニック動物は、目的とする抗原またはエピトープで免疫することができる。適切な免疫プロトコールは、通常、Ｂ細胞の選択的増殖を引き起こすものであり、すなわち、一次免疫およびブースター免疫は、目的の抗原またはエピトープに結合する抗体を産生するＢ細胞の選択的な増殖を引き起こすよう設計されている。免疫化プロトコールは、例えば、一次免疫およびその後の各ブースター免疫の間に、抗原の異なる形態またはフラグメントを用いてもよい。例えば、抗原は、細胞の膜、リポ粒子、ミセル、組換えタンパク質、別のタンパク質と融合した組換えタンパク質、タンパク質のドメインまたはタンパク質のペプチド上に発現されてもよい。免疫化プロトコールは、一次免疫および／またはブースター免疫の間、アジュバントの使用を含んでいてよい。アジュバントは、バイスタンダーＢ細胞の非特異的な増殖の程度を制限するためにのみ、一次免疫の間に用いられてもよい。バイスタンダーＢ細胞は、Ｂ細胞の表面上に発現する抗体受容体に抗原を結合させるステップを経ずに活性化される細胞である。例えばＦｃ融合タンパク質を用いて免疫化すると、全Ｂ細胞の約７０％までが目的の抗原ではなく融合タンパク質のＦｃ部分に反応するロバストな抗Ｆｃ応答が生じることが多いことが当業界で知られている。免疫化プロトコールは、免疫化に用いられる抗原によって活性化されたＢ細胞を優先的に増殖させるために、アジュバントなしで用いられてもよい。

トランスジェニック動物からヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を得るとき、一般的に、Ｂ細胞を回収する。Ｂ細胞は、組織（例えば、リンパ組織から、または骨髄から（すなわち、Ｂ細胞を産生する組織から））または末梢血（例えば、ヒツジなどの大型トランスジェニック動物について）など、何れかの適切な供給源から回収することができる。例えば、ヒト汎Ｂ細胞マーカーであるＣＤ１９でコーティングされた磁気マイクロビーズを用いて、末梢血からＢ細胞を単離することができる（例えば、Bertrand, F. E., III, et al., Blood 90 (1997) 736-744を参照のこと）。

ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ配列）は、一般的には、標準的技術を用いて細胞から単離される。遺伝子特異的プライマーまたは汎用ＲＮＡプライマー（例えば、ポリＡプライマー）を用いた逆転写を用いて、対応するｃＤＮＡを得ることができる。一般的には、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするこのｃＤＮＡは、本明細書に記載の方法においてテンプレート核酸として用いられる。

免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸はまた、非トランスジェニック動物の免疫化によって得られてもよい。その後、このような免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、好適には、当技術分野において知られているヒト化またはキメラ化方法に供される。

本方法はまた、少なくとも１つの５’プライマー、少なくとも１つの３’プライマーおよび核酸を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅核酸を生成する工程を含む。

用語“ポリメラーゼ連鎖反応”および“ＰＣＲ”は、本明細書中、互換的に用いられる。これらは、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの領域を特異的に増幅するための方法を意味する。領域は、単一の遺伝子、遺伝子の一部、コーディングもしくは非コーディング配列、またはこれらの組み合わせを含み得る。ほとんどのＰＣＲ法は、一般的に、数百塩基対（ｂｐ）のＤＮＡフラグメントを増幅するが、いくつかの技術では４０キロ塩基対（ｋｂ）までの大きさのフラグメントを増幅することが可能である。基本的なＰＣＲのセットアップにはいくつかの構成要素および反応材が必要である。これらの構成要素には、増幅すべき領域を含む核酸テンプレート、増幅すべき領域の５’－および３’－末端に相補的な２つのプライマー（それぞれ“５’プライマー”（またはフォワードプライマー）および“３’プライマー”（またはリバースプライマー））、Ｔａｑポリメラーゼもしくは別の熱安定性ポリメラーゼなどのポリメラーゼ、ポリメラーゼが新しい鎖を合成するデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼの最適な活性および安定性に適した化学的環境を提供する緩衝液、二価の陽イオン、一般にＭｇ^２＋、および最後にカリウムイオンなどの一価の陽イオンが含まれる。

テンプレート核酸を増幅するために必要な正確なＰＣＲ条件は、当業者であれば一般的な知識を用いて決定することができる。本明細書中で用いられ得るＰＣＲ条件の限定されない例には、本明細書の他の箇所に記載されているものが含まれる。

本発明の方法は、増幅された核酸が、グルタミンまたはグルタミン酸ではないＮ末端アミノ酸を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするように、増幅された核酸に改変を導入する改変部位を有する核酸を含む少なくとも１つの５’プライマーを用いる。この残基は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されてもよい。これにより、本発明の方法は、テンプレート核酸を増幅すると同時に、それが本発明のポリペプチド（すなわち、本明細書に記載の改変ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインを含むポリペプチド）をコードするように改変することができる。

少なくとも１つの５’プライマーは、増幅された核酸に必要な改変を導入する何れかの配列を有していてもよい。適切な５’プライマーのいくつかの例が本明細書に提供される。コード化されたＶＨドメインの必要な位置（複数可）に必要な改変を導入することができる他のプライマー配列もまた使用することができる。当業者が、驚くべきことに、ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端における改変が許容され得ることを認識したら、適切なプライマーの設計が可能である。

本発明の方法で用いられる少なくとも１つの５’プライマーは、増幅された核酸において、コード化されたヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端残基グルタミンまたはグルタミン酸がアスパラギン酸またはアスパラギンなどの酸性または極性残基に置換されるようにテンプレート核酸のコード化ＶＨドメインに改変を導入する配列を含み得る。これらのアミノ酸は、グルタミンまたはグルタミン酸と同様の生化学的特性を有するため、有用な選択となり得る。

特定の例において、本発明の方法で用いられる少なくとも１つの５’プライマーは、増幅された核酸において、コードされたヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端残基グルタミンまたはグルタミン酸がアラニンに置換されるように、テンプレート核酸のコード化ＶＨドメインに改変を導入する配列を含み得る。この改変は、ピログルタミン酸の形成を排除し、またシグナルペプチドの切断効率を維持（例えば、改善）するため、特に有用である。

アラニンは脂肪族残基である。したがって、別の例では、本発明の方法で用いられる少なくとも１つの５’プライマーは、増幅された核酸において、コードされたヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端残基グルタミンまたはグルタミン酸が、アラニン、グリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンなどの脂肪族残基に置換されるようなテンプレート核酸のコード化ＶＨドメインに改変を導入する配列を含み得る。

本発明の方法で用いられる少なくとも１つの５’プライマーは、増幅された核酸において、コード化されたヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端配列が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択される（最初の）Ｎ末端アミノ酸；ならびにプロリン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、ロイシンまたはスレオニンからなる群より選択される（第２の）アミノ酸（ＶＨドメインのＮ末端から計算すると）で置換されているように、テンプレート核酸のコード化ＶＨドメインに２つの改変を導入する配列を含み得る。一つの具体例において、ＶＨドメインのＮ末端の第２のアミノ酸は、プロリンであることが選択される。

一つの具体例において、本発明の方法で用いられる少なくとも１つの５’プライマーは、増幅された核酸において、コード化されたヒト、ヒト化、キメラＶＨドメインのＮ末端配列が、アラニン－プロリン、アラニン－アスパラギン酸、アラニン－グルタミン酸、アラニン－スレオニン、アラニン－バリン、アラニン－セリンおよびアラニン－ロイシンに置換されるように、テンプレート核酸のコード化されたＶＨドメインにおいて２つの改変を導入する配列を含んでいてよい。本明細書で用いる、“アラニン－プロリン”等の表記は、改変ＶＨドメインのＮ末端における２つの隣接アミノ酸（すなわち、ＶＨドメインのＮ末端における“最初の－次の”アミノ酸（Ｎ末端からＣ末端の方向））を意味する。

好ましい例において、本発明の方法で用いられる少なくとも１つの５’プライマーは、増幅された核酸において、コード化されたヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端の最初の２つのアミノ酸がアラニン－プロリンであるように、テンプレート核酸に２つの改変を導入する配列を含む。この組み合わせは、シグナルペプチドの切断効率を促進するために特に有利であることが見いだされた。

本発明の方法で用いられる少なくとも１つの５’プライマーは、増幅された（および改変された）核酸において、シグナルペプチドが、コード化された改変ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインの上流にコード化されるように、シグナルペプチドまたはシグナルペプチドの一部をコード化する配列を含み得る。シグナルペプチドとコード化されたポリペプチド中の改変ＶＨドメインのＮ末端の間の空間的関係は、本明細書の他の箇所で詳細に説明されているが、ここでも同様に適用される。

したがって、本発明の方法で用いられる少なくとも１つの５’プライマーは、シグナルペプチドまたは改変部位の上流の配列.....ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）を含むシグナルペプチドまたはシグナルペプチドの一部をコードする配列を含む（すなわち、該コード化されたポリペプチドにおいて、シグナルペプチドの配列.....ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）が改変ＶＨドメインの改変Ｎ末端に直接隣接する（および上流にある）ように含む）。例えば、少なくとも１つの５’プライマーは、増幅核酸によってコード化される改変ＶＨドメインのＮ末端にアラニン（またはアラニン－プロリン組合せ）を導入し、改変ＶＨドメインにおけるシグナルペプチド切断部位を隣接する残基がＡＱＰＡＭＡＡ（配列番号６）またはＡＱＰＡＭＡＡＰ（配列番号７）（シグナルペプチドのＣ末端配列を太字で示し、ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸に下線を付した）であるように、コード化された改変ＶＨドメインの上流にシグナルペプチドを導入する配列を含み得る。

さらなる例では、本発明の方法で用いられる少なくとも１つの５’プライマーは、改変部位の上流にある配列.....ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）を含むシグナルペプチドまたはシグナルペプチドの一部をコードする配列を含み得る（すなわち、コード化されたポリペプチドにおいて、シグナルペプチドの配列.....ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）が改変ＶＨドメインの改変Ｎ末端に直接隣接する（および上流にある）ように含み得る）。例えば、少なくとも１つの５’プライマーは、増幅核酸によってコードされる改変ＶＨドメインのＮ末端にアラニン（またはアラニン－プロリン組合せ）を導入し、改変ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインにおけるシグナルペプチド切断部位を隣接する残基がＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＡ（配列番号８）またはＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＡＰ（配列番号９）（シグナルペプチドのＣ末端配列を太字で示し、ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸に下線を付した）であるように、コード化された改変ＶＨドメインの上流にシグナルペプチドを導入する配列を含み得る。

さらなる例において、本発明の方法において用いられる少なくとも１つの５’プライマーは、改変部位の上流にある配列.....ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）を含むシグナルペプチドまたはシグナルペプチドの一部をコードする配列を含み得る（すなわち、コード化されたポリペプチドにおいて、シグナルペプチドの配列.....ＡＱＰＡＭＡ（配列番号５）が改変ＶＨドメインの改変Ｎ末端に直接隣接する（および上流にある）するような配列である）。例えば、少なくとも１つの５’プライマーは、増幅核酸によってコードされる改変ＶＨドメインのＮ末端にアラニン（またはアラニン－プロリン組合せ）を導入し、改変ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインにおけるシグナルペプチド切断部位を隣接する残基がＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＬＬＬＡＱＰＡＭＡＡ（配列番号１０）またはＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＬＬＬＡＱＰＡＭＡＡＰ（配列番号１１）（シグナルペプチドのＣ末端配列を太字で示し、ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸に下線を付す）を含むように、コード化された改変ＶＨドメインの上流にシグナルペプチドを導入する配列を含み得るである。

ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＮ末端の最初の２つのコドンを改変し（アラニン－プロリンをコードするため）、コード化された改変ＶＨドメインの直接隣接する上流にシグナルペプチドを導入する好適な５’プライマー配列の例を、以下の表に提供する。表から分かるように、例示された５’プライマーは、各遺伝子ファミリーからの各機能的ヒトＩＧＨＶ遺伝子セグメントの増幅のために設計されている。これは、プライマー中の改変部位の後の配列が、列記されたヒトＶＨ遺伝子セグメント中のこれらの位置に見出される非改変核酸に相補的（少なくとも部分的に）であることに基づいている。

従って、本明細書に記載の方法は、
(a）１３０８ＡＰ、１３０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ、２０１８ＡＰ２または２０２０ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いてＩＧＨＶ１ファミリー遺伝子によってコード化される核酸を増幅および改変すること；および／または
(b）１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４または１３１０ＡＰ５から選択される５’プライマーを用いてＩＧＨＶ２ファミリー遺伝子によりコード化される核酸を増幅および改変すること；および／または
(c）０５０８ＡＰ、０５０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ、２０１８ＡＰ２、２０２１ＡＰ２、２０２１ＡＰ、２０２１Ａ３、２０２１ＡＰ４または２０２１ＡＰ５から選択される５’プライマーを用いてＩＧＨＶ３ファミリー遺伝子によりコード化される核酸を増幅および改変すること；および／または
(d）１３１２ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いてＩＧＨＶ４ファミリー遺伝子によってコード化される核酸を増幅および改変すること；および／または
(e）１３１３ＡＰまたは１３１３ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ５ファミリー遺伝子によりコード化される核酸を増幅および改変すること；および／または
(f）１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４、１３１０ＡＰ５または１３１２ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いてＩＧＨＶ６ファミリー遺伝子によりコード化される核酸を増幅および改変すること；および／または
(g）１３１４ＡＰまたは１３１４ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いてＩＧＨＶ７ファミリー遺伝子によってコード化される核酸を増幅および改変すること
を含み得る。

プライマー１３１２ＡＰ２および２０１９ＡＰ２が同一の配列を有すること、故に、これらの用語は互換的に用いられ得ることが特記される。これは、本明細書中、用語“１３１２ＡＰ２／２０１９ＡＰ２”の使用によっても示される。

以下の実施例部分に示すように、本明細書に記載の特定の５’プライマーは、優先的に用いられ得る。

例えば、ＩＧＨＶ１遺伝子ファミリー由来の遺伝子セグメントによってコードされる核酸を増幅および改変するとき、１３０８ＡＰ、１３０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ、２０１８ＡＰ２または２０２０ＡＰ２から選択される５’プライマーが用いられてよい。あるいは、ＡＰをコードするためのヒト可変領域の最初の２つのＮ末端アミノ酸を同様に改変するプライマーを使用してもよい。一つの特定の例は、１３０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ２または２０２０ＡＰ２から選択される５’プライマーを含む。

さらに、ＩＧＨＶ２遺伝子ファミリー由来の遺伝子セグメントによってコードされる核酸を増幅および改変するとき、１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４または１３１０ＡＰ５から選択される５’プライマーを使用してもよいか、あるいは、ＡＰをコードするためのヒト可変領域の最初の２つのＮ末端アミノ酸を同様に改変するプライマーを使用してもよい。一つの特定の例には、１３１０ＡＰ５である５’プライマーが含まれる。

さらに、ＩＧＨＶ３遺伝子ファミリー由来の遺伝子セグメントによってコードされる核酸を増幅および改変するとき、０５０８ＡＰ、０５０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ、２０１８ＡＰ２、２０２１ＡＰ、２０２１ＡＰ２、２０２１ＡＰ３、２０２１ＡＰ４または２０２１ＡＰ５から選択される５’プライマーを使用してもよいか、あるいは、ＡＰをコードするためのヒト可変領域の最初の２つのＮ末端アミノ酸を同様に改変するプライマーを使用してもよい。一つの特定の例には、０５０８ＡＰ、２０２１ＡＰ２または２０１８ＡＰ２から選択される５’プライマーが含まれる。

さらに、ＩＧＨＶ４遺伝子ファミリー由来の遺伝子セグメントによってコードされる核酸を増幅および改変するとき、１３１２ＡＰ２である５’プライマーを使用してもよいか、あるいは、ＡＰをコードするためのヒト可変領域の最初の２つのＮ末端アミノ酸を同様に改変するプライマーを用いてもよい。

さらに、ＩＧＨＶ５遺伝子ファミリー由来の遺伝子セグメントによってコードされる核酸を増幅および改変するとき、１３１３ＡＰまたは１３１３ＡＰ２である５’プライマーを用いてもよいか、あるいは、ＡＰをコードするためのヒト可変領域の最初の２つのＮ末端アミノ酸を同様に改変するプライマーを用いてもよい。一つの特定の例は、１３１３ＡＰ２である５’プライマーを含む。

さらに、ＩＧＨＶ６遺伝子ファミリー由来の遺伝子セグメントによってコードされる核酸を増幅および改変するとき、１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４、１３１０ＡＰ５または１３１２ＡＰ２である５’プライマーを使用してもよいか、あるいは、ＡＰをコードするためのヒト可変領域の最初の２つのＮ末端のアミノ酸を同様に改変するプライマーを使用してもよい。一つの特定の例は、１３１２ＡＰ２および１３１０ＡＰ５から選択される５’プライマーを含む。

ＩＧＨＶ７ファミリー遺伝子由来の遺伝子セグメントによってコードされる核酸を増幅および改変するとき、１３１４ＡＰまたは１３１４ＡＰ２である５’プライマーを使用してもよいか、あるいは、ＡＰをコードするためのヒト可変領域の最初の２つのＮ末端アミノ酸を同様に改変するプライマーを使用してもよい。一つの特定の例は、１３１４ＡＰ２である５’プライマーを含む。

当業者には明らかであるが、異なるヒトＶＨドメインをコードする複数の異なるテンプレート核酸を同時に増幅および改変することが有益であり得る状況が存在し得る。例えば、本明細書に記載の方法を用いて、ヒトおよび／またはヒトトランスジェニック動物細胞サンプル内にコード化された異なるヒトＶＨドメインの部分的または完全なレパートリーを増幅（および改変）することが有益であり得る。

一例として、本明細書に記載の方法は、トランスジェニック動物（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座またはその一部を有するトランスジェニックマウスまたは鳥類；例えばMeMo(登録商標)マウス）においてヒトＶＨドメインをコードする核酸のレパートリーを同時に改変および増幅するために用いられ得る。本明細書で提供される方法は、例えば、いくつかの異なる５’プライマーが用いられる多重ＰＣＲ反応を用いて、異なるＩＧＨＶ遺伝子セグメントの同時の増幅および改変を可能にするものである。

用語“多重ポリメラーゼ連鎖反応”または“多重ＰＣＲ”は、異なる配列を有する増幅核酸を生成するために単一のＰＣＲ反応／混合において複数のユニークなプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を意味するため、本明細書中で互換的に用いられる。複数の遺伝子を同時に標的とすることで、通常であれば数倍の反応材および時間を必要とするテストも、１回のテストで追加情報を得ることができる。各プライマーセットのアニーリング温度は、１回の反応で正しく動作するように最適化されている必要がある。

従って、本方法は、以下のヒト遺伝子ファミリー：ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６およびＩＧＨＶ７のそれぞれから選択される少なくとも１つのヒト遺伝子セグメントによってコード化される複数の異なる核酸を提供するステップを含み得る。有利には、（テンプレート核酸として）提供される複数の異なる核酸は、１回のＰＣＲ反応において、同時に増幅および改変され得る。

例えば、表１の各列から少なくとも１つのプライマーを選択し、本発明の方法において用いて、以下のヒト遺伝子ファミリー：ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６およびＩＧＨＶ７内の機能遺伝子セグメントをコードするテンプレート核酸を同時に増幅および改変してもよい。

以下の実施例部分に示すように、本明細書に記載の特定の５’プライマーを優先的に用いることができる。

例えば、以下のカテゴリーのそれぞれからの少なくとも１つのプライマーの組み合わせが、本発明の方法において用いられるように選択され得る（その結果、ＶＨレパートリーを生じさせるＶ遺伝子ファミリーの数に応じて、少なくとも６つの異なる５’プライマーの混合物が１回の反応において用いられる）：
a）１３０８ＡＰ、１３０８ＡＰ２、２０２０ＡＰ２、２０１８ＡＰまたは２０１８ＡＰ２から選択される５’プライマー；
b）１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４または１３１０ＡＰ５から選択される５’プライマー；
c）０５０８ＡＰ、０５０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ、２０１８ＡＰ２、２０２１ＡＰ、２０２１ＡＰ２、２０２１ＡＰ３、２０２１ＡＰ４または２０２１ＡＰ５から選択される５’プライマー；
d）１３１２ＡＰ２である５’プライマー；
e）１３１３ＡＰまたは１３１３ＡＰ２から選択される５’プライマー；
f）１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４、１３１０ＡＰ５または１３１２ＡＰ２から選択される５’プライマー；および
g）１３１４ＡＰまたは１３１４ＡＰ２から選択される５’プライマー。

当業者には明らかであろうが、上記のａ）からｇ）のそれぞれからの少なくとも１つのプライマーの組み合わせは、１回の反応でヒトＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６およびＩＧＨＶ７遺伝子セグメントをコードするテンプレート核酸を同時に増幅および改変し得るユニバーサル５’プライマーミックスを提供し得るため、特に有利であり得る。

また、表１に記載された（または上記ａ）～ｇ）に記載された）プライマーのサブセットが好ましい状況もあり得る。例えば、ヒトＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３のみをコードするテンプレート核酸に注目したとき、表１の対応する行（または、上記（a）～（c））のプライマーのみを組み合わせて選択することが有用であり得る。どのプライマーを用いるかは、例えば、抗体または重鎖の作製に用いるプラットフォーム内の遺伝子ファミリーと相関がある。例えば、遺伝子ファミリーＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ５およびＩＧＨＶ７由来のＶＨ遺伝子セグメントを含むヒトミニ遺伝子座を担持するトランスジェニック宿主が用いられる場合、Ｎ末端に変異を含む重鎖のパネルを生成するのに、好ましくは該遺伝子ファミリーに対応する表１に記載のプライマーが用いられる。上記に提供されたプライマーに加えて、本明細書に記載の教示に基づいて、当業者は、何れかのヒトＶＨドメインの増幅のために各ＶＨ遺伝子ファミリーにわたって適用するプライマーをさらに開発することができ、これも同様に、本発明に包含させる。

本明細書に記載の方法は、少なくとも１つの５’プライマー、少なくとも１つの３’プライマーおよび核酸を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅された核酸を生成することを含む。少なくとも１つの５’プライマーおよび（テンプレート）核酸は、上記で詳細に記載されている。

何れかの適切な３’プライマーまたは３’プライマーの混合物を用いてもよい。当業者には明らかであろうが、これには、コードされたヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのＦＲ４領域をコードする核酸に相補的な３’プライマー、あるいはヒト重鎖定常ドメインをコードする核酸に相補的な３’プライマーが含まれる。ヒトＶＨドメインでは、ＦＲ４領域は再配置されたヒトＪ遺伝子セグメント（または共通の重鎖におけるＪ遺伝子セグメント）によってコードされる。したがって、適当な３’プライマーの設計は、当業者にはよく知られている。

以下に、ＦＲ４の末端に相補的な領域を含み、かつ制限部位ＢｓｔＥＩＩおよびＸｈｏＩを含む、例示的なプライマーを提供する。

HuJH1/2xho ＝ＴＡＴＴＧＴＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣ (配列番号１２）
HuJH3xho ＝ＴＡＴＴＧＴＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧＴＣＣＣ (配列番号１３)
HuJH4/5xho ＝ＴＡＴＴＧＴＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣ (配列番号１４)
HuJH6xho ＝ＴＡＴＴＧＴＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣ (配列番号１５)

本明細書に記載の方法は、増幅および改変された各核酸をベクターに導入するステップをさらに含んでいてよい。核酸をベクターに導入する方法はよく知られており、制限酵素消化およびライゲーションが含まれる。適切なベクターは、本明細書の他の箇所に記載されており、ファージミドまたはプラスミドが含まれる。

本明細書に記載の方法はまた、各ベクターを細胞に形質転換またはトランスフェクトして、ライブラリーを生成することをさらに含んでいてよい。ベクターを細胞に導入する方法はよく知られている。適切な宿主細胞は、本明細書の他の箇所に記載されており、ファージコンピテント大腸菌またはファージコンピテント酵母のようなファージコンピテント細胞を含む。対応するライブラリーもまた、本明細書の他の箇所に記載されている。

キット
本明細書ではキットも提供される。キットは、本明細書に記載される複数の５’プライマーを含む。キットは、本明細書に記載の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ等の異なる５’プライマーを含んでいてもよい。要すれば、キットは、ヒト、ヒト化またはキメラＶＨドメインのレパートリーの性質に応じて、本明細書に記載される少なくとも１つの３’プライマーも含む。適切なプライマーの詳細は、上記に記載されており、ここでも同様に適用される。

キットの構成要素は、輸送に適した容器に収容されてもよい。

さらに、キットは、該キットで提供される材料の使用に関する指示（すなわち、プロトコール）を含む指示書を含んでいてよい。指示書は一般的には文書または印刷物を含むが、そのような指示を保存し、エンドユーザーに伝達することができる何れかの媒体で提供されてもよい。適切な媒体には、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）および光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）が含まれるが、これらに限定されない。媒体は、指示書を提供するインターネットサイトへのアドレスを含んでもよい。そのような指示は、本明細書で詳述する方法または用途のいずれかに従っていてもよい。

医薬組成物および使用方法
抗体、抗体フラグメントまたは抗体変異体、ならびに薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含む医薬組成物もまた、本発明により提供される。従って、本発明は、治療によるヒトまたは動物の身体の処置に用いるための、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメントまたは抗体変異体を提供する。本発明によりさらに提供されるのは、疾病に罹患するヒトまたは動物の処置のための方法であり、この方法は、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメントまたは抗体変異体の治療的有効量を該ヒトまたは動物に投与することを含む。患者に投与される本発明による抗体、抗体フラグメントまたは抗体変異体の量は、一般的には、治療濃度域（therapeutic window）内にあり、これは、治療効果を得るために十分な量を用いる一方で、その量は、許容できない程度の副作用につながる閾値を超えないということを意味する。所望の治療効果を得るために必要な抗体、抗体フラグメントまたは抗体変異体の量が少ないほど、治療濃度域は一般に大きくなる。従って、低用量で十分な治療効果を発揮する本発明の抗体、抗体フラグメントまたは抗体変異体が好ましい。

本明細書において、先行技術として示された特許文献または他の文献への言及は、それらの文献が、主張されている何れかの優先日において知られていたこと、または、それが含む情報が一般的な一般的技術常識の一部であったことを認めるとして解釈されないものとする。

本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本明細書で別途定義されない限り、本発明が属する技術分野における当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の何れかの方法および材料が本発明の実施において使用されるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。従って、すぐ以下に定義される用語は、全体として本明細書を参照することにより、より完全に説明される。また、本明細書で用いる、単数形の用語“ａ”、“ａｎ”は、文脈が明らかにそうでないことを示されない限り、複数形の言及を含む。特記しない限り、核酸は５’から３’の方向で左から右に記載され、アミノ酸配列は、それぞれアミノからカルボキシの方向で左から右に記載される。本発明は、記載された特定の方法、プロトコールおよび反応材に限定されないことが理解され、これは、それらが当業者によって用いられる場面に応じて変わり得るためである。

本発明の複数の態様が、以下の限定されない実施例によって示される。

実施例
各ヒトＶＨ遺伝子ファミリー内の各機能性ＶＨ遺伝子セグメントから産生される可変領域の全体を増幅することができる新規プライマーを同定した。この新規プライマーは、何れかの機能的ヒトＶＨ遺伝子セグメントの組換えにより生成される何れかのヒトＶＨドメインのＮ末端を改変し、その結果、Ｎ末端ピログルタミン酸形成の防止および／または発現の増大をもたらす。

以下の実施例は、MerusのMeMo(登録商標)マウスによって産生された可変領域をコードするＤＮＡを用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの最初の（または最初および次の）Ｎ末端コード化アミノ酸を変化させながら、かかるＤＮＡをベクターに組込んで、本発明を実証している。２種類のMeMo(登録商標)マウスが産生する可変領域をコードするＤＮＡのパネルを、最初の（または最初および次の）Ｎ末端コード化アミノ酸を変化させたベクターに組込むことに成功した。このようなMeMo(登録商標)マウスは、ヒトＶＨ遺伝子ファミリーの代表的なＶＨ遺伝子セグメントを含む合成重鎖ミニ遺伝子座を有している。プライマーは、すべてのＶＨ遺伝子サブファミリーに渡って機能することが示されている。プライマーはＶＨ増幅効率およびＶＨ多様性のために最適化されている。これらのプライマーを用いて、ファージディスプレイライブラリーの作成、およびその後のＦａｂの発現に成功した。

試験の理由付け（Study rationale）
上記のMerusマウス（MeMo(登録商標)）系統は、ヒトＶＨ領域を有する抗体を発現する。これらのマウスを免疫化した後、ＲＮＡを単離し、その後ｃＤＮＡ合成およびＶＨ領域のＰＣＲ増幅を行うことができる。ＶＨ配列はＥまたはＱで始まる配列であることが特記される。

現在、増幅中にすべてのＶＨ配列のＮ末端のＥまたはＱを置換するＰＣＲプライマーが設計されている。このプライマーは、何れかのヒト組換え機能的Ｖ遺伝子セグメントおよび機能的遺伝子ファミリーからなる何れかの重鎖可変領域のＶＨレパートリーを正確に増幅するように特別に設計されている。

ＶＨのＮ末端の配列を変更するとき、抗体の構造、抗原結合性および安定性ならびにシグナルペプチド（ＳＰ）切断性などの抗体特性に影響を与えないように注意する必要がある。真核生物、グラム陽性菌およびグラム陰性菌由来の２３５２種の分泌タンパク質について、ＳＰの各位置および関連する成熟タンパク質のアミノ酸頻度が解析されている[Choo and Ranganathan, 2008]。この解析では、生物種グループ間の類似点および相違点が示されている。全体として、アミノ酸の優位性は主にＳＰ内で観察されたが、成熟ペプチドの最初の数残基にもある種の優位性が観察された。

これらのデータを検討した結果、真核生物（２５％がＡまたはＱ）およびグラム陰性菌（５４％がＡまたはＱ）の成熟タンパク質の最初の位置にはＡおよびＱが好まれることが特記される。真核生物では、Ｐは第２の位置（１６％）および第４の位置（１１％）に比較的多く見られた。グラム陰性菌では、Ｄ、Ｅ、ＰおよびＴが第２の位置によく見られた（全解析タンパク質の５６％がこの４残基のいずれか１つを有する）。第３の位置および第４の位置については、Ｔが第３の位置（１１％）および第４の位置（１３％）に多く見られた。

一方、いくつかのアミノ酸は、ある位置では明らかに出現が少ない。例えば、Ｗは真核生物およびグラム陰性菌では最初の位置に約１％の頻度でしか存在しない。従って、特定のアミノ酸が好まれたり好まれなかったりするように、成熟ペプチドの最初の数残基の配列を適合させることによって、ＳＰ切断の最適化が可能であろうと結論づけられる。

ＶＨ Ｎ末端の配列を変更するとき、改変後の配列は原核生物（細菌）だけでなく、真核生物のＳＰともよく結合すべきである。

細菌のＳＰとしては、例えば、ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１）などが挙げられる。真核生物ＳＰとしては、例えば、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＬＬＡＱＰＡＭＡ（配列番号４）などが挙げられる。これらのシグナルペプチドは、以下の代表的な限定されない例として用いられた。

改変ＶＨからのＳＰ切断が対応する野生型（ＷＴ）ＶＨの場合と少なくとも同程度であることをインシリコで確認できるように、それぞれがＳＰおよびＶＨ領域の最初の２０個のＮ末端アミノ酸を含む１８種の代表配列セットを生成した（９種のＶＨ領域と２種のＳＰ配列の組み合わせ＝１８種の代表配列）。選ばれたＶＨ領域配列は、すべてのＶＨ遺伝子サブファミリーの代表配列として特別に選ばれたものである。ＶＨ領域の２０位以降のＶＨ残基は、ＳＰ切断に大きな影響を与えないことが理解されている[Choo and Ranganathan, 2008]。

１８種の配列のそれぞれにおける最初のＶＨ残基（“位置１”）は、すべての２０個の可能なアミノ酸をすべて含むように変化させたので、１８×２０＝３６０種の配列が得られた。すべての配列にＰ＃ＸまたはＥ＃Ｘのフォーマットでコードを付した。
Ｐ＝原核生物ＳＰ； Ｅ＝真核生物ＳＰ
＃ 内部指定番号
Ｘ ＝位置１のＶＨのアミノ酸
例えば、Ｐ１Ａは原核生物ＳＰを含み、２０残基のＶＨ配列は、最初のＶＨコード化アミノ酸ＥがＡに変更されている。

ＳＰ切断における最初のＶＨ残基の影響を調べるために、全３６０種の配列を、予測ツールSignalP 4.1（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP [Petersen et al, 2011]）を用いて、以下のパラメータでインシリコ解析した：
生物群：Ｐ＃Ｘ配列は“グラム陰性菌”、Ｅ＃Ｘ配列は“真核生物”、
出力形式：‘ショート（グラフィックなし）’
他のすべてのパラメータ：標準／デフォルト。

３６０種の配列すべてにおいて、ＳＰ切断部位の位置が正しく予測された。予測結果のいわゆるＤ（Discrimination）スコアを全３６０配列について比較した（図２参照）。Ｄスコアが高いほど、ＶＨ領域より前の配列が実際にシグナルペプチドである可能性が高いことを示す。ここでは、Ｄスコアが高いほど、ＳＰが効率的に切断される可能性が高いことに対応すると仮定している。図２は、Ｎ末端ＳＰを含むグラム陰性菌３０７種および真核生物１８７７種のタンパク質について、１位の未改変アミノ酸頻度も示している[Choo and Ranganathan, 2008; additional file 2]。ここでは、頻度が高いほど、ＳＰが効率的に切断される可能性が高いと仮定している。Ｐ＃Ｘ配列では、Ｘ＝Ａで最も高いＤスコアが観測され（平均０．９１１）、Ａは原核生物の分泌タンパク質で最も頻度の高いアミノ酸（４１．７％）である。別の例として、Ｅ＃Ｘ配列では、最も低いＤスコアはＸ＝Ｐ（平均０．８６３）で観測され、Ｐは真核生物の分泌タンパク質で最も頻度の低いアミノ酸（０．３％）であることが分かった。

Ｄスコアに基づき、最も高いスコアを有する以下の３個の残基を最初のＶＨの位置の代替残基候補として選択した：
Ａ：ＥおよびＱと比較して、ほとんどのスコア／頻度が（かなり）高い；未改変のＳＰのアミノ酸の中で最も頻度が高い。
Ｄ：側鎖はＥと化学的に類似している；スコア／頻度はＥおよびＱと同程度である。
Ｓ：Ｅおよび／またはＱと比較して、スコア／頻度の一部が少し高い。
位置１にＥまたはＱを含む配列と合わせると、５×９×２＝９０個（位置１の５個のアミノ酸×９個のＶＨ領域×２個のＳＰ）の配列がさらなる解析対象となる。

９０個の配列（すなわち位置１にＡ、Ｄ、Ｅ、ＱまたはＳを有する）それぞれについて、第２のＶＨ残基（’位置２’）を変化させた。以下の７個の残基は、未改変のＳＰではほとんど見られないか、または全く見られないため省略した［Choo and Ranganathan, 2008］；括弧内のグラム陰性／真核生物のＳＰの位置２の頻度。
Ｃ（０．０％／１．９％）
Ｆ（１．０％／２．２％）
Ｈ（０．３％／２．５％）
Ｍ（０．０％／０．７％）
Ｒ（０．３％／４．７％）
Ｗ（１．６％／０．９％）
Ｙ（０．３％／２．５％）。

これにより、位置２で変化させるべき残基は以下の１３個となった。
Ａ（５．９％／３．７％）
Ｄ（１７．３％／８．０％）
Ｅ（１６．９％／８．８％）
Ｇ（６．５％／５．０％）
Ｉ（２．９％／３．７％）
Ｋ（１．６％／５．０％）
Ｌ（１．６％／４．６％）
Ｎ（５．９％／４．３％）
Ｐ（１０．８％／１５．８％）
Ｑ（４．９％／４．９％）
Ｓ（５．５％／９．０％）
Ｔ（１０．８％／５．６％）
Ｖ（５．９％／６．３％）。

以上の結果、９０×１３＝１１７０個の配列が解析対象となる。

１１７０個の配列が生成された。すべての配列には、Ｐ＃ＸＺまたはＥ＃ＸＺという形式のコードが付与された。式中、
Ｐ＝原核生物ＳＰ；Ｅ＝真核生物ＳＰ
＃＝内部指定番号
Ｘ＝位置１のＶＨのアミノ酸
Ｚ＝位置２のＶＨのアミノ酸
例えば、Ｐ１ＡＤは原核生物ＳＰを含み、２０残基のＶＨ配列は、最初のＶＨにコードされるアミノ酸ＥがＡに、次のＶＨにコードされるアミノ酸ＶがＤに変更されている。

ＳＰ切断における最初の２つの変化したＶＨ残基の効果を調べるため、予測ツールSignalP 4.1を用いて、全１１７０配列をインシリコで分析し、パラメータをさらに本明細書に示した。

１１７０個の配列すべてにおいて、ＳＰ切断部位の位置が正しく予測された。１１７０配列のＤスコアを比較した（図３）。その結果、位置２の残基の同一性がＳＰ切断に与える影響は、位置１の残基の同一性には大きく依存しないことが確認された。例えば、位置１の残基がＡ、Ｄ、Ｅ、ＱまたはＳのいずれであっても、位置２がＫの場合は比較的低いＤスコアが得られた。さらに、位置１がＡの配列では一般的に最も高いスコアが得られた。

図３の結果を用いて、９種のプライマーについて、位置１および２の残基の最適な組み合わせを以下のように定義し、図４にまとめた。

まず、ＳＰおよびＶＨ遺伝子セグメントの１８種の組み合わせそれぞれについて、Ｄスコアが最も高い変異体を同定した。例えば、コードＰ１ＸＺの６５個の配列については、位置１＋２にＡＶを有する変異体が最も高いＤスコア（０．９０７）を有した。興味深いことに、細菌ＳＰを有する配列の最良の変異体はすべて、位置１＋２にＡＶ（または、時にはＡＴも）を有していた。同様に、真核生物ＳＰを有する配列の最良の変異体はすべて、位置１＋２にＡＰ（または、時にはＡＶも）を有していた。

本明細書に記載の教示に基づいて、当業者は、原核生物または真核生物シグナルペプチドと共に用いるための別個のプライマーを同定し得ることも理解される。

好ましくは、原核生物または真核生物ＳＰと共に用いるＶＨのために別個のプライマーは必要ではなく、位置１＋２のコンセンサス配列が９個のプライマーのそれぞれについて決定され、これは両方のＳＰとの組み合わせで対応するＷＴ配列より高いスコア／頻度を与える。このデータを基に、このコンセンサス配列をＡＰと定義した：
細菌ＳＰと組み合わせると、位置１＋２のＡＰはＷＴ配列より０．０３０～０．０６５（平均０．０４０）高いＤスコアを与える。

真核生物ＳＰと組み合わせると、位置１＋２のＡＰは、ＷＴ配列より０．００２～０．００５（平均０．００３）高いＤスコアを与える。
Ａは、未改変の細菌ＳＰ（４１．７％）および真核生物ＳＰ（１３．５％）と組み合わせたとき、位置１のアミノ酸として最も頻度が高い（図３参照）。

Ｐは、未修飾の細菌ＳＰと組み合わせたとき、位置２のアミノ酸の頻度が３番目に高く（１０．８％）、そして未修飾の真核生物ＳＰと組み合わせたとき、位置２のアミノ酸の頻度が最も高い（１５．８％、図３参照）。

新しいＦＷ（５’）プライマーは、すべての新しいＦＷプライマーにおいて、最初の２つのＶＨコドンが、これらがＥＶ、ＥＱ、ＱＩまたはＱＬの代わりにＡＰをコードするように変更されたことを除いて、図５に列記したプライマーと同じである（０５０８ＡＰ、１３０８ＡＰ、１３１０ＡＰなどと命名された）。遺伝子コドンの縮重のため、Ａ（ＧＣＮ）およびＰ（ＣＣＮ）には４つの異なるコドンが存在する。プライマーについては、現在のプライマーのコドンと最も相同性の高いコドンが選択された（これはプライマーごとに異なる）。ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩおよびＸｈｏＩの新しいクローニングサイト３が導入されないように注意した。得られた９個の新しいプライマーの配列を図５に示し、これらのプライマーのタンパク質翻訳を図６に示す。

設計したプライマーを、ＶＨ領域にコードされる最初および次のアミノ酸を変更しない現行のプライマーと並行して試験した。結果の概要は以下の通りである。

実験結果
プライマー設計および増幅効率の解析
２種の異なるMeMo(登録商標)マウス系統を用いた。これらのマウス内の核酸を基にしたｃＤＮＡを用いて、新規プライマーおよび現行プライマーでＶＨ増幅を行った。増幅効率は、アガロースゲル上でＰＣＲ産物の収量を比較することにより、各プライマーについて解析した（図７参照）。

以下のプライマーは、十分なＰＣＲ産物を得ることが示された。
ＩＧＨＶ１ファミリーの場合：１３０８ＡＰ；２０１８ＡＰ
ＩＧＨＶ３ファミリーの場合：０５０８ＡＰ；２０１８ＡＰ
ＩＧＶＨ４ファミリーの場合：１３１２ＡＰ；２０１９ＡＰ
ＩＧＨＶ５ファミリーの場合：１３１３ＡＰ
ＩＧＨＶ７ファミリーの場合：１３１４ＡＰ。

以下のプライマーでは、収量が少ないか、または全く得られなかった。
ＩＧＨＶ１ファミリーの場合：２０２０ＡＰ（収量なし）
ＩＧＨＶ２ファミリーの場合：１３１０ＡＰ（低収量）。

新規(ＡＰ)プライマーのうち３個は、ｃＤＮＡからＶＨ遺伝子セグメントを増幅するＰＣＲでうまくいかなかったため、プライマー設計を見直した。Ｇ／Ｃのような長い配列モチーフが、二量体およびヘアピンのような好ましくない二次構造を引き起こす可能性がある。用いたプライマーの配列を調べたところ、変異の導入により、ＡｌａにＧＣＧ、ＰｒｏにＣＣＣ／ＣＣＧというコドンを用いるため、１０－１１ｂｐの比較的長いＧ／Ｃ伸張が生じることがわかった。このような伸張は、良好な結果を得たプライマーにも存在したが、その悪影響は、プライマーごとに異なる、他のプライマーの配列特性によって変わり得る。

遺伝子コドンの縮重により、他のコドンを選択することによりＧ／Ｃ伸長の長さを短縮することができる。そこで、ＧＣＡおよびＣＣＴをそれぞれＡｌａおよびＰｒｏに対応させた新しいプライマー（バージョン２；ＡＰ２；０５０８ＡＰ２、１３１０ＡＰ２などと命名した）を設計した。これは、うまくいかなかった３つのプライマーだけでなく、他の６つのプライマーについても行われた。

バージョン２／ＡＰ２のプライマーがより良いパフォーマンスを期待できるかどうかをインシリコで確認するために、Vector NTIソフトウェアのOligo Analyses機能を用いてサブセットを解析した。例えば、プライマーDO_2020およびその新しいバージョンでは、以下の望ましくない二量体およびヘアピンが予測された：
２０２０ＡＰ：６５個の二量体および２６個のヘアピン（合計９１個）。これは、比較的高い値であり、このプライマーがうまく機能しなかった理由（の一部）であり得る。
２０２０ＡＰ２：４９個の二量体および１９個のヘアピン（合計６８個）。これは、２０２０ＡＰの場合よりもはるかに少ない。これは、２０２０ＡＰ２がそれよりも良いパフォーマンスを示す可能性を示唆している。

また、Ｇ／Ｃ含有量をさらに減らすことで、予測される二次構造がさらに少なくなる可能性があるかどうかも確認した：
ＶＨの前にあるＡｌａコドンＧＣＣをＧＣＴまたはＧＣＡに置換したプライマー２０２０ＡＰ２では、５５個または５４個の可能な二量体および２２個の可能なヘアピンが予測された（合計７７個または７６個）。これは２０２０ＡＰ２の場合よりも多いため、このＡｌａコドンはＧＣＣのまま維持された。

他のプライマーについても同様の予測結果が得られた（図示せず）。
新規プライマー（ＡＰ)および最適化プライマー（ＡＰ２)のアラインメントを図８に示す。

ＡＰ２プライマーの大半は、十分なＰＣＲ産物を得られることが示された。図９参照。しかしながら、プライマー０５０８ＡＰ２および１３１０ＡＰ２；（マウス１についてのレーン＃２および４)は、以前の設計に対して（あまり）改善を示していない。２０２０ＡＰ２（マウス２のレーン＃５)は、以前の設計(２０２０ＡＰ)では機能しなかったが、現在では機能する。陰性対照（－）は、陰性である。

すべての新しいプライマー（ＡＰおよびＡＰ２）バージョンは、増幅効率を分析するために並行して試験した。図１０参照。前に見られたように、プライマー２０２０ＡＰ２（＃８マウス２）は機能し、一方、２０２０ＡＰ（＃７マウス２）は機能しない。両マウスとも、０５０８ＡＰ（＃１）は０５０８ＡＰ２（＃２）より少しよく働くようである。その他の全ての反応では、ＡＰ２の収量はＡＰと同等か、またはわずかに優れている。

１３１０ＡＰプライマーの更なる最適化を開始した。さらに、ＩＧＨＶ３ファミリーの追加プライマー（２０２１ＡＰ）を試験した。１３１０ＡＰプライマーの５種の変異体を、２０２１ＡＰプライマーの５種の変異体と共に試験した。図１１参照。新しいプライマー１３１０ＡＰ５（＃６マウス１）は、以前に最も良い結果を示したプライマー１３１０ＡＰ２（＃３マウス１）よりも明らかに良い結果を与える。新しいプライマー２０２１ＡＰから２０２１ＡＰ５(＃８から１２)はすべて、同様に良好な結果を示す。

全体として、以下のプライマーは十分なＰＣＲ産物を得ることができる。
ＩＧＨＶ１ファミリーの場合：１３０８ＡＰ、１３０８ＡＰ２、２０２０ＡＰ２、２０１８ＡＰ、２０１８ＡＰ２
ＩＧＨＶ２ファミリーの場合：１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４、１３１０ＡＰ５
ＩＧＨＶ３ファミリーの場合：０５０８ＡＰ、０５０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ、２０１８ＡＰ２、２０２１ＡＰ、２０２１ＡＰ２、２０２１ＡＰ３、２０２１ＡＰ４、２０２１ＡＰ５
ＩＧＶＨ４ファミリーの場合：１３１２ＡＰ２／２０１９ＡＰ２
ＩＧＨＶ５ファミリーの場合：１３１３ＡＰ、１３１３ＡＰ２
ＩＧＨＶ６ファミリーの場合：１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４、１３１０ＡＰ５、１３１２ＡＰ２／２０１９ＡＰ２
ＩＧＨＶ７ファミリーの場合：１３１４ＡＰ、１３１４ＡＰ２。

上記の種々のプライマーのＰＣＲ産物を精製し、ベクターにライゲーションして、ファージコンピテント細菌細胞に形質転換した。ファージディスプレイライブラリーを作製した。コロニーＰＣＲおよびシークエンシングを行い、挿入頻度および配列多様性を決定した。

ＶＨ多様性の分析
増幅したＶＨ遺伝子セグメントをＦａｂファージベクターにクローニングし、ファージディスプレイライブラリー（サイズ約１Ｅ６～１Ｅ７）を構築した。これらのライブラリーからの個々のクローンは、様々なＶＨ遺伝子ファミリーの代表を決定するために配列決定された。得られた配列を分析して、様々なＶＨ遺伝子ファミリーの代表を決定した。この代表（すなわち、増幅されたＶＨ遺伝子セグメントの総数における各ＶＨの割合）は、新しい変異誘導プライマーおよび非変異ＶＨ配列を増幅するプライマーで同様であることが分かり、ＶＨ配列の最初の２つの位置を含む変異体を生成するプライマーが、生成したファージライブラリーにおける対応するＶ遺伝子セグメントおよびＶＨファミリーの代表に影響を及ぼさないことが実証された。

Ｆａｂ発現の分析
ライブラリーの個々のクローンを用いて、可溶性Ｆａｂを含む非精製ペリプラズム抽出物を作製した。これらのＦａｂの濃度は、Ｏｃｔｅｔ定量を用いて測定した。ほとんどの生産物は、同じ範囲（約１０－１５μｇ／ｍｌ）のＦａｂ収率であることが見いだされた（データは示さず）。ＡＰ変異を有するＦａｂはよく生産され、全体としてＷＴ Ｆａｂより高い平均収量（１１．４ vs １０．０μｇ／ｍｌ）となり、変異体生成プライマーの有用性およびＮ末端可変領域における変異を実証した。

Ｆａｂ完全性の分析
生産された可溶性ＦａｂのサブセットをＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングに供した。その結果、予期されるサイズのバンドがブロット上に確認された（データは示さず）。

結果の概要
試験は、本明細書に記載の発明のプライマーを用いて、多様なＶＨレパートリーを含むファージディスプレイライブラリーを生成できること、およびこれらのライブラリー由来のメンバーによってＦａｂが発現され得ることを示した。新しいプライマーは、ヒト可変領域遺伝子セグメントレパートリー全体にわたるＶＨ遺伝子セグメントをコードするｃＤＮＡを増幅するために用いることができ、一方、Ｎ末端ピログルタミン酸形成を阻止し、および／またはＦａｂ発現を増加させるためにコード化された可変ドメインのＮ末端を改変することができる。

本願に関連して本明細書と同時またはそれ以前に提出され、かつ本明細書とともに公の閲覧に供されているすべての論文および文献が注目され、すべてのかかる論文および文献の内容は、引用により本明細書に包含させる。

本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された全ての特徴、および／またはそのように開示された何れかの方法もしくはプロセスの全てのステップは、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、何れかの組み合わせで組み合わせることができる。

本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された各特徴は、明示的に別段の記載がない限り、同一、同等または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えることができる。従って、明示的に別段の記載がない限り、開示された各特徴は、同等または類似の特徴の一般的な一連の一例のみである。

本発明は、何れかの上記の態様の詳細に限定されるものではない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された特徴の何れかの新規なもの、または何れかの新規な組み合わせ、あるいはそのように開示された何れかの方法またはプロセスのステップの何れかの新規なもの、または何れかの新規な組み合わせに及ぶ。

文献
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Fowler, E., Moyer, M., Krishna, R. G., Chin, C. C. Q., and Wold, F. (1996). Removal of N-terminal blocking groups from proteins, Current Protocols in Protein Science.

Jefferis, R. (2016). Review article. Posttranslational modifications and the immunogenicity of biotherapeutics. Journal of Immunology Research 2016.
Liu YD, Goetze AM, Bass RB, Flynn GC (2011). N-terminal glutamate to pyroglutamate conversion in vivo for human IgG2 antibodies. J Biol Chem. 2011 Apr 1;286(13):11211-7.

Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., and Nielsen, H. (2011). SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods 8, 785-786.

Yu L., Vizel A., Huff M.B., Young M., Remmele R.L. Jr, He B. (2006). Investigation of N-terminal glutamate cyclization of recombinant monoclonal antibody in formulation development. J. Pharm. Biomed. Anal. 42(4): 455-63.

Ambrogelly A., Gozo S., Katiyar A., Dellatore S., Kune Y., Bhat R., Sun J., Li N., Wang D., Nowak C., Neill A., Ponniah G., King C., Mason B., Beck A, Liu H. (2018). Analytical comparability of recombinant monoclonal antibody therapeutics. MAbs 10(4): 513-538

Claims (17)

1. ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、該可変ドメインが、
   －アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸；または
   －アラニン－プロリン、アラニン－アスパラギン酸、アラニン－グルタミン酸、アラニン－スレオニン、アラニン－バリン、アラニン－セリンおよびアラニン－ロイシンからなる群より選択されるＮ末端配列
   を含む、ポリペプチド。
2. ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインが、Ｎ末端配列アラニン－プロリンを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
3. ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインのＮ末端アミノ酸の上流にシグナルペプチドを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. 請求項１または２に記載のポリペプチドを含む抗体、抗体変異体または抗体フラグメント。
5. 請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド、抗体、抗体変異体または抗体フラグメントをコードする核酸であって、ここで、核酸はベクターまたはファージ内に存在していてよい、核酸。
6. 請求項５に記載の少なくとも約１０^６種の異なる核酸、ベクターまたはファージを含む、ライブラリー。
7. ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を同時に増幅および改変する方法であって、該方法が、
   (a) ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を提供する工程；および
   (b) 少なくとも１つの５’プライマー、少なくとも１つの３’プライマーおよび核酸を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された核酸を生成する工程
   を含み、ここで、少なくとも１つの５’プライマーは、増幅された核酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするように、該増幅された核酸に改変を導入する改変部位を有する核酸を含む、方法。
8. 各増幅された核酸が、Ｎ末端配列アラニンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードし、ここで、各増幅された核酸が、Ｎ末端配列アラニン－プロリンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードしていてもよい、請求項７に記載の方法。
9. 少なくとも１つの５’プライマーが、改変部位の上流のシグナルペプチドまたはシグナルペプチドの一部をコードする、請求項７または８に記載の方法。
10. 工程（a）における核酸がｃＤＮＡであり、ここで、この方法が、動物のＢ細胞から核酸を抽出し、該核酸からｃＤＮＡを生成して、工程（a）に提供される核酸を生成する予工程を含んでいてよく；さらに、
    i) 動物が目的の抗原で免疫化されており、Ｂ細胞由来の核酸が目的の抗原に対して特異性および親和性を有する重鎖をコードしていてよい；および／または
    ii) 動物が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むトランスジェニックマウス動物であってよい、および／または、
    iii) 動物が、共通する軽鎖を含むトランスジェニックマウス動物であってよい、
    請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 工程（a）が、ヒト遺伝子ファミリー：ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６およびＩＧＨＶ７のそれぞれから選択される少なくとも１つの組換えヒト遺伝子セグメントによってコードされる、またはそれに基づく複数の異なる核酸を提供することを含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. （a）１３０８ＡＰ、１３０８ＡＰ２、２０２０ＡＰ２、２０１８ＡＰまたは２０１８ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いてＩＧＨＶ１ファミリー遺伝子によってコードされる核酸を増幅および改変すること；および／または
    （b）１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４または１３１０ＡＰ５から選択される５’プライマーを用いてＩＧＨＶ２ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；および／または
    （c）０５０８ＡＰ、０５０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ、２０１８ＡＰ２、２０２１ＡＰ、２０２１ＡＰ２、２０２１ＡＰ３、２０２１ＡＰ４または２０２１ＡＰ５から選択される５’プライマーを用いてＩＧＨＶ３ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること、および／または
    （d）１３１２ＡＰである５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ４ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；および／または
    （e）１３１３ＡＰまたは１３１３ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ５ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；および／または
    （f）１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４、１３１０ＡＰ５または１３１２ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いてＩＧＨＶ６ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること；および／または
    （g）１３１４ＡＰまたは１３１４ＡＰ２から選択される５’プライマーを用いて、ＩＧＨＶ７ファミリー遺伝子によりコードされる核酸を増幅および改変すること、
    を含む、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ヒトＶＨ遺伝子ファミリーＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６およびＩＧＨＶ７の１以上から選択される、またはそれらに基づく、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする何れかの核酸を増幅し、改変するための５’プライマーであって、ここで、該プライマーが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするように、増幅された核酸に改変を導入する改変部位を含む、プライマー。
14. 改変部位が、増幅された核酸がＮ末端アラニンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするような部位であり、ここで、該改変部位が、増幅された核酸がＮ末端アラニン－プロリンを含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするような部位であってよい、請求項１３に記載のプライマー。
15. 以下の各群から選択される少なくとも１つの５’プライマーを含むキット：
    (a)１３０８ＡＰ、１３０８ＡＰ２、２０２０ＡＰ２、２０１８ＡＰまたは２０１８ＡＰ２；
    (b）１３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４または１３１０ＡＰ５；
    (c）０５０８ＡＰ、０５０８ＡＰ２、２０１８ＡＰ、２０１８ＡＰ２、２０２１ＡＰ、２０２１ＡＰ２、２０２１ＡＰ３、２０２１ＡＰ４または２０２１ＡＰ５；
    (d) １３１２ＡＰ２；
    (e) １３１３ＡＰまたは１３１３ＡＰ２；
    (f) １３１０ＡＰ２、１３１０ＡＰ３、１３１０ＡＰ４、１３１０ＡＰ５または１３１２ＡＰ２；および
    (g) １３１４ＡＰ２または１３１４ＡＰ。
16. 抗体、抗体変異体または抗体フラグメントを製造する方法であって、
    －アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするように、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を改変すること；
    －次いで、抗体スクリーニング技術を用いて、標的抗原に結合するための、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンから選択されるＮ末端アミノ酸を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインを同定すること；
    －標的抗原と結合するヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択すること；および
    －Ｎ末端アミノ酸をさらに改変することなく、該ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインを治療用抗体、抗体変異体または抗体フラグメントの開発に用いること
    を含む、方法。
17. ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインにおけるピログルタミン酸形成を低減する方法であって、ここで、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を含むヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするように、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を改変すること
    を含む、方法。

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