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JP2021100430A - フォレート受容体１抗体及びそのイムノコンジュゲート及び使用 - Google Patents

フォレート受容体１抗体及びそのイムノコンジュゲート及び使用 Download PDF

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Abstract

【課題】フォレート受容体１抗体及びそのイムノコンジュゲート及び使用の提供。【解決手段】ヒトフォレート受容体１に結合する抗体及びイムノコンジュゲートを包含するがこれらに限定されない新しい抗癌剤を提供する。剤、抗体、又はイムノコンジュゲートの使用方法、例えば腫瘍成育を抑制する方法もまた提供する。一実施形態において、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントが提供され、この抗体は、下記：（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸａａ１ＦＸａａ２Ｘａａ３（配列番号５６）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１０年２月２４日に出願された米国仮特許出願６１／３０７，７９７号、
２０１０年５月２０日に出願された米国仮特許出願６１／３４６，５９５号、及び２０１
０年１１月１２日に出願された米国仮特許出願６１／４１３，１７２号の優先権を主張し
、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の分野は一般的にヒトフォレート受容体１に結合する抗体及びイムノコンジュゲ
ート、並びに癌のような疾患の治療のための抗体及びイムノコンジュゲートを使用する方
法に関する。
癌は先進国における代表的死亡原因の１つであり、合衆国では年間百万人超が癌と診断
され、５０万の死亡例がある。全体として３人に１人以上がその寿命において何らかの形
態の癌を発症することになる。癌には２００種類超の異なる型が存在し、そのうちの４種
である乳癌、肺癌、結腸直腸癌及び前立腺癌は全新規症例の過半数に相当する（Jemal等
、2003,Cancer J. Clin. 53:5-26）。
フォレート受容体（ＦＯＬＲ１）は別名フォレート受容体アルファ又はフォレート結合
蛋白としても知られており、細胞の原形質膜上に発現されるＮ−グリコシル化蛋白である
。ＦＯＬＲ１は葉酸に対し、そして数種の還元型葉酸誘導体に対して高親和性を有する。
ＦＯＬＲ１は細胞内部への生理学的フォレート、即ち５−メチルテトラヒドロフォレート
の送達を媒介する。
ＦＯＬＲ１は大部分の卵巣癌において、並びに多くの子宮癌、子宮内膜癌、膵臓癌、腎
臓癌、肺癌及び乳癌において過剰発現されるが、正常組織上でのＦＯＬＲ１の発現は近位
尿細管、肺胞、膀胱、精巣、脈絡叢、及び甲状腺における上皮細胞の先端膜に限定される
（WeitmanSD,等、CancerRes52: 3396-3401(1992); Antony AC, AnnuRev Nutr 16: 501-52
1(1996); Kalli KR,等、GynecolOncol108:619-626 (2008)）。ＦＯＬＲ１のこの発現パタ
ーンは、それをＦＯＬＲ１指向癌治療のための望ましい標的としている。
卵巣癌は典型的には進行期までは非徴候性であるため、それは後期になって診断される
場合が多く、現在使用可能な手順、典型的には外科的減量の後の化学療法剤で治療した場
合には不良な予後となる（vonGruenigenV等、Cancer112: 2221-2227(2008); Ayhan A
等、Am JObstet Gynecol 196: 81 e81-86(2007); Harry VN等、ObstetGynecolSurv64:548
-560 (2009)）。即ち、卵巣癌のためのより有効な治療薬が医療上明らかに望まれてい
る。
３種の抗ＦＯＬＲ１抗体が潜在的抗癌薬として検討されている。ネズミモノクローナル
抗体Ｍｏｖ１８及びＭｏｖ１９は１９８０年代後期に単離され（Miotti S等、IntJCancer
39: 297-303 (1987)）、ＦＯＬＲ１をターゲティングすることが確認され（ConeyLR等
、Cancer Res 51:6125-6132 (1991)）、そして細胞傷害リボソーム不活性化蛋白とのコ
ンジュゲートとして抗原発現癌細胞を根絶するそれらの能力に関して前臨床試験において
試験されている（CondeFP等、Eur JBiochem178:795-802 (1989)）。
Ｍｏｖ１９は細胞傷害Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞をターゲティングする二重特
異性抗体として（MezzanzanicaD等、Int JCancer41:609-615 (1988); Ferrini S等、IntJ
Cancer Suppl 4: 53-55 (1989); FerriniS等、IntJCancer 48:227-233 (1991)）
、そしてインビボにおけるインターロイキン−２とのＭｏｖ１９の単鎖Ｆｖの融合蛋白と
して（Melani C等、CancerRes58:4146-4154(1998)）試験されている。キメラ（ネズミ
可変／ヒト定常）抗ＦＯＬＲ１抗体Ｍｏｖ１８およびＭｏｖ１９はインビトロにおいてＦ
ＯＬＲ１発現腫瘍の細胞傷害性免疫細胞依存性殺傷を媒介するそれらの能力に関して前臨
床的に検討されており（ConeyLR等、CancerRes54:2448-2455 (1994)）、そしてキメラ
Ｍｏｖ１８−ＩｇＥはＩｇＥ依存性免疫治療前臨床モデルにおいて試験されている（Kara
giannisSN等、JImmunol179:2832-2843(2007); Gould HJ等、Eur J Immunol 29: 3527-353
7(1999)）。
Ｍｏｖ１８は前臨床試験において、そしてその後１９９０年代初頭に臨床治験において
（Zacchetti A等、Nucl Med Biol36:759-770(2009)）種々の放射性核種とのコンジュ
ゲートの形態で研究され、それは如何なる薬物も臨床使用のために認可されずに終了して
いる。
ＭＯＲＡｂ００３、即ち、ネズミモノクローナル抗ＦＯＬＲ１抗体ＬＫ２６のヒト化形
態は非修飾抗体として（EbelW等、Cancer Immun7:6(2007)）、そして１１１Ｉｎ放射性
核種とのコンジュゲートとして（Smith-JonesPM等、Nucl Med Biol 35:343-351(2008)）
前臨床的に評価されており、そして現在は非修飾抗体として臨床治験に付されている（D.
K.Armstrong等、J. Clin. Oncol.26: ２００８年５月２０日補遺;要約5500）。
Jemal等、2003,Cancer J.Clin. 53:5-26 WeitmanSD,等、CancerRes 52: 3396-3401 (1992) AntonyAC, Annu Rev Nutr 16: 501-521 (1996) Kalli KR,等、GynecolOncol 108: 619-626 (2008) vonGruenigen V等、Cancer112: 2221-2227 (2008) AyhanA等、Am J ObstetGynecol 196: 81 e81-86 (2007) HarryVN等、ObstetGynecol Surv 64: 548-560 (2009) MiottiS等、Int J Cancer39: 297-303 (1987) ConeyLR等、Cancer Res51: 6125-6132 (1991) Conde FP等、Eur JBiochem 178: 795-802 (1989) Mezzanzanica D等、IntJ Cancer 41: 609-615 (1988) Ferrini S等、Int JCancer Suppl 4: 53-55 (1989) Ferrini S等、Int JCancer 48: 227-233 (1991) Melani C等、Cancer Res58: 4146-4154 (1998) Coney LR等、Cancer Res54: 2448-2455 (1994) Karagiannis SN等、JImmunol 179: 2832-2843 (2007) Gould HJ等、Eur JImmunol 29: 3527-3537 (1999) Zacchetti A等、NuclMed Biol 36: 759-770 (2009) Ebel W等、Cancer Immun7:6 (2007) Smith-Jones PM等、NuclMed Biol 35: 343-351 (2008) D. K. Armstrong等、J.Clin. Oncol. 26: ２００８年５月２０日補遺;要約5500
本発明はヒトフォレート受容体１に結合する新規な抗体、これらの抗体を含むイムノコ
ンジュゲート、及びそれらの使用方法を提供する。本発明は又、新規なポリペプチド、例
えばヒトフォレート受容体１に結合する抗体、そのような抗体のフラグメント、及びその
ような抗体に関連する他のポリペプチドを提供する。ポリペプチドをコードする核酸配列
を含むポリヌクレオチド、並びにポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。本
発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む細胞も提供される。新規なフォレ
ート受容体１抗体又はイムノコンジュゲートを含む組成物（例えば医薬組成物）もまた提
供される。更に又、新規なフォレート受容体１抗体又はイムノコンジュゲートを作成及び
使用する方法、例えば腫瘍生育を阻害及び／又は癌を治療するための新規なフォレート受
容体１抗体又はコンジュゲートの使用方法も提供される。
即ち、１つの側面において、本発明はヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト
化抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、ここで抗体は以下：（ａ）ＧＹＦＭＮ（
配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸａａ１ＦＸａａ２Ｘａ
ａ３（配列番号５６）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を含
む重鎖ＣＤＲ３；及び、（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号７）を含む軽
鎖ＣＤＲ１；ＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＲＥＹＰＹ
Ｔ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ３；ただしここで、Ｘａａ１はＫ、Ｑ、Ｈ及びＲから
選択され；Ｘａａ２はＱ、Ｈ、Ｎ及びＲから選択され；そしてＸａａ３はＧ、Ｅ、Ｔ、Ｓ
、Ａ及びＶから選択されるもの；を含む。特定の実施形態においては、ヒト化抗体又はそ
の抗原結合フラグメントは、抗体キメラＭｏｖ１９と実質的に同じ親和性でヒトフォレー
ト受容体１に結合する。特定の実施形態においては、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグ
メントは重鎖ＣＤＲ２配列ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号２）を含む。
特定の実施形態においては、結合親和性はフローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ又は
ラジオイムノアッセイにより計測される。
別の実施形態においては、本発明は、抗体が以下：（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を
含む重鎖ＣＤＲ１、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；ＲＩ
ＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、又は１、２、３又
は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を
含む重鎖ＣＤＲ３、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及び
／又は、（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ１、又
は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；ＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号
８）を含む軽鎖ＣＤＲ２、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体
；及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ３、又は１、２、３又は４の
保存的アミノ酸置換を含むその変異体；を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合
するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
特定の実施形態においては、本発明は配列番号６の重鎖を含むヒトフォレート受容体１
に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態
においては、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは２０１０年４月７日にＡＴＣＣ
に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７２、ＰＴＡ−１０７７３又は１０
７７４を有するプラスミドＤＮＡによりコードされる。
特定の実施形態において、本発明は、ＦＯＬＲ１への特異的結合に関して、（ａ）ＧＹ
ＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸａａ１ＦＸａ
ａ２Ｘａａ３（配列番号５６）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号
３）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び、（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号７）
を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＲ
ＥＹＰＹＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ３；ただしここで、Ｘａａ１はＫ、Ｑ、Ｈ及
びＲから選択され；Ｘａａ２はＱ、Ｈ、Ｎ及びＲから選択され；そしてＸａａ３はＧ、Ｅ
、Ｔ、Ｓ、Ａ及びＶから選択されるもの；を含む抗体と競合するヒト化抗体又はその抗原
結合フラグメントを提供する。特定の実施形態においては、ヒト化抗体は重鎖ＣＤＲ２配
列ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号２）を含む。
特定の実施形態においては、本発明は、配列番号４に少なくとも約９０％同一である重
鎖可変ドメイン、及び配列番号１０又は配列番号１１に少なくとも約９０％同一である軽
鎖可変ドメインを含むヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであるポリペプチドを提
供する。別の実施形態においては、ヒト化抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号４に
少なくとも約９５％同一である重鎖可変ドメイン、及び配列番号１０又は配列番号１１に
少なくとも約９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。その他の実施形態において、ヒ
ト化抗体は
抗原結合フラグメントは配列番号４に少なくとも約９９％同一である重鎖可変ドメイン、
及び配列番号１０又は配列番号１１に少なくとも約９９％同一である軽鎖可変ドメインを
含む。特定の実施形態においては、ヒト化抗体は抗原結合フラグメントは配列番号４の重
鎖可変ドメイン、及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含む。特定の
実施形態においては、本発明は配列番号８８〜１１９に少なくとも約９０％同一であるポ
リペプチド、抗体、又は抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態においては、
本発明は配列番号８８〜１１９に少なくとも約９５％同一であるポリペプチド、抗体、又
は抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態においては、本発明は配列番号８８
〜１１９に少なくとも約９９％同一であるポリペプチド、抗体、又は抗原結合フラグメン
トを提供する。
特定の実施形態においては、本発明は、真核生物細胞においてｃｈＭｏｖ１９よりも少
なくとも１０倍高値で発現されるヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
特定の実施形態においては、真核生物細胞はＨＥＫ−２９３Ｔ細胞である。
特定の実施形態においては、本発明は抗体が以下：（ａ）ＳＳＹＧＭＳ（配列番号３０
）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹ（配列番号３１）を含む重鎖ＣＤＲ２；及
び／又はＤＧＥＧＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は、（
ｂ）ＫＡＳＤＨＩＮＮＷＬＡ（配列番号２７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＧＡＴＳＬＥＴ（配
列番号２８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＹＷＳＴＰＦＴ（配列番号２９）を含む軽鎖
ＣＤＲ３；を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フ
ラグメントを提供する。別の実施形態においては、本発明は抗体が以下：（ａ）ＴＮＹＷ
ＭＱ（配列番号６０）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰＧＮＧＤＳＲ（配列番号６１）を含
む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＲＤＧＮＹＡＡＹ（配列番号６２）を含む重鎖ＣＤＲ３；及
び／又は、（ｂ）ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号５７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＡＡＴ
ＮＬＡＤ（配列番号５８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＡＳＰＹＴ（配列番号５９
）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合する抗体又はそ
の抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態においては、本発明は抗体が以下：（
ａ）ＴＮＹＷＭＹ（配列番号６６）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰＧＮＳＤＴＴ（配列番
号６７）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＲＨＤＹＧＡＭＤＹ（配列番号６８を）含む重
鎖ＣＤＲ３；及び／又は、（ｂ）ＲＡＳＥＮＩＹＴＮＬＡ（配列番号６３）を含む軽鎖Ｃ
ＤＲ１；ＴＡＳＮＬＡＤ（配列番号６４）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＶＳＰＹＴ
（配列番号６５）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含むヒトフォレート受容体１に特異的に結合す
る抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態においては、本発明は抗
体が以下：（ａ）ＳＳＦＧＭＨ（配列番号７２）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＹＩＳＳＧＳＳＴ
ＩＳ（配列番号７３）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＥＡＹＧＳＳＭＥＹ（配列番号７
４）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は（ｂ）ＲＡＳＱＮＩＮＮＮＬＨ（配列番号６９）を
含む軽鎖ＣＤＲ１；ＹＶＳＱＳＶＳ（配列番号７０）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＮ
ＳＷＰＨＹＴ（配列番号７１）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含むヒトフォレート受容体１に特
異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態においては
、本発明は抗体が以下：（ａ）ＴＳＹＴＭＨ（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＹＩ
ＮＰＩＳＧＹＴＮ（配列番号７９）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＧＧＡＹＧＲＫＰＭ
ＤＹ（配列番号８０）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は、（ｂ）ＫＡＳＱＮＶＧＰＮＶＡ
（配列番号７５）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号７６）を含む軽鎖ＣＤ
Ｒ２；及びＱＱＹＮＳＹＰＹＴ（配列番号７７）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含むヒトフォレ
ート受容体１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは完全長抗体又は抗原結合フラグメ
ントである。特定の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントはＦａｂ、Ｆａ
ｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ即ちｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡ
Ｒドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディー、ＩｇＧ−ＣＨ２、ミニボディー、Ｆ（ａｂ
'）３、テトラボディー、トリアボディー、ダイアボディー、単ドメイン抗体、ＤＶＤ−
Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、又はｓｃＦｖ−Ｆｃである。
特定の実施形態においては、本発明の抗体又はポリペプチドは約１．０〜約１０ｎＭの
Ｋｄでヒトフォレート受容体１に結合する。１つの実施形態において抗体又はポリペプチ
ドは約１．０ｎＭ又はそれより良好なＫｄでヒトフォレート受容体１に結合する。特定の
実施形態においては、結合親和性はフローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ又はラジオイ
ムノアッセイにより計測される。
本発明は又、本発明の抗体を発現する細胞を培養すること；及び（ｂ）該培養細胞から
抗体を単離することを含む、該抗体を作成する方法を提供する。特定の実施形態において
は、細胞は真核生物の細胞である。
本発明は又、式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有し、式中（Ａ）は本発明の抗体又は抗原結
合フラグメント又はポリペプチドであり；（Ｌ）はリンカーであり；そして、（Ｃ）は細
胞傷害剤であり；そして該リンカー（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲ
ートを提供する。
特定の実施形態においては、リンカーは切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、
親水性リンカー、及びジカルボン酸系リンカーよりなる群から選択される。その他の実施
形態において、リンカーはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエ
ート（ＳＰＰ）又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペン
タノエート（スルホ−ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタ
ノエート（ＳＰＤＢ）又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スル
ホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）
シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレ
イミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミ
ジル４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；及びＮ−スクシンイミ
ジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（
ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）よりなる群から選択される。特定の実施形態においては
、リンカーはＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエ
チレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）である。
１つの実施形態において、イムノコンジュゲートはマイタンシノイド、マイタンシノイ
ド類縁体、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類縁体、デ
ュオカルマイシン、デュオカルマイシン類縁体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラ
スタチン類縁体、アリスタチン、トマイマイシン誘導体、及びレプトマイシン誘導体又は
該剤のプロドラッグよりなる群から選択される細胞傷害剤を含む。その他の実施形態にお
いて、細胞傷害剤はがマイタンシノイドである。別の実施形態においては、細胞傷害剤は
Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイ
タンシン又はＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキ
ソペンチル）−マイタンシンである。
１つの実施形態において、本発明は（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号
１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジ
ル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（Ｎ
ＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）；及び、（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メ
ルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン；を含み、ここで（Ｌ）は
（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲートを提供する。
１つの実施形態において、本発明は（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号
１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジ
ル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）；及び、（Ｃ）Ｎ（２’）−デ
アセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン
；を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲートを提供する。
１つの実施形態において、本発明は（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号
１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジ
ル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペン
チル）−マイタンシン；を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジ
ュゲートを提供する。
１つの実施形態において、本発明は（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号
１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジ
ル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノエート（スルホ−ＳＰＰ）；及び、
（Ｃ）；Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル
）−マイタンシン；を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲ
ートを提供する。
１つの実施形態において、本発明は（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号
１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジ
ル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）；及び、（Ｃ）；Ｎ（２’）−
デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン；を
含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲートを提供する。
本発明は又本発明の抗体、抗原結合フラグメント、ポリペプチド又はイムノコンジュゲ
ート及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態においては
、医薬組成物は更に第１の抗癌剤を含む。
本発明は又、標識された本発明の抗体、抗原結合フラグメント、ポリペプチド又はイム
ノコンジュゲートを含む診断試薬を提供する。１つの実施形態において、標識は放射標識
、蛍光団、発色団、画像化剤及び金属イオンよりなる群から選択される。
本発明は又、本発明の抗体、抗原結合フラグメント、ポリペプチド又はイムノコンジュ
ゲートを含むキットを提供する。
本発明は又、対象に本発明の抗体、抗原結合フラグメント、ポリペプチド、イムノコン
ジュゲート又は医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、対象における腫瘍生育を
阻害する方法を提供する。特定の実施形態においては、本発明は、式（Ａ）−（Ｌ）−（
Ｃ）を有し、式中：（Ａ）はヒトフォレート受容体１に特異的に結合する抗体又はその抗
原結合フラグメントであり；（Ｌ）はリンカーであり；そして、（Ｃ）はマイタンシノイ
ド及びマイタンシノイド類縁体よりなる群から選択される細胞傷害剤であり；ここで（Ｌ
）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲートの治療有効量を投与することを含み
；ここでイムノコンジュゲートはＫＢ異種移植片モデルにおいて平均腫瘍体積を少なくと
も２倍低減する、対象における腫瘍生育を阻害する方法を提供する。特定の実施形態にお
いては、方法は（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＲＩＨＰＹＤＧＤ
ＴＦＹＮＱＸａａ１ＦＸａａ２Ｘａａ３（配列番号５６）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＹＤ
ＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び、（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧ
ＴＳＬＭＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号８）を含む軽
鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ３；ただしここで
、Ｘａａ１はＫ、Ｑ、Ｈ及びＲから選択され；Ｘａａ２はＱ、Ｈ、Ｎ及びＲから選択され
；そしてＸａａ３はＧ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ａ及びＶから選択されるもの；を含む抗体又はその
抗原結合フラグメントを投与することを含む。その他の実施形態において、抗体はＲＩＨ
ＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２を含む。
特定の実施形態においては、本発明は、２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、そ
してＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７２、ＰＴＡ−１０７７３又は１０７７４を有する
プラスミドＤＮＡによりコードされる抗体又はその抗原結合フラグメントを投与すること
を含む腫瘍生育を阻害するための方法を提供する。
別の実施形態においては、方法は配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は
配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル−［（
Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−Ｐ
ＥＧ４−マレイミド）；及び、（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト
−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン；を含むイムノコンジュゲートを投
与することを提供する。
別の実施形態においては、方法は（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１
０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル
４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）；及び、（Ｃ）Ｎ（２’）−デア
セチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン；
を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲートを投与すること
を提供する。
別の実施形態においては、方法は（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１
０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル
４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）；及び、（
Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチ
ル）−マイタンシン；を含み；ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュ
ゲートを投与することを提供する。
別の実施形態においては、方法は（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１
０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル
４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノエート（スルホ−ＳＰＰ）；及び、（
Ｃ）；Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）
−マイタンシン；を含み；ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲー
トを投与することを提供する。
別の実施形態においては、方法は（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１
０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル
４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）；及び、（Ｃ）；Ｎ（２’）−デ
アセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン；を含
み；ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲートを投与することを提
供する。
別の実施形態においては、方法は２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡ
ＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７５及びＰＴＡ−１０７７６を有するｈｕＦＲ−１−２１
抗体を含むイムノコンジュゲートを投与することを含む。特定の実施形態においては、ｈ
ｕＦＲ１−２１抗体は、以下：（ａ）ＳＳＹＧＭＳ（配列番号３０）を含む重鎖ＣＤＲ１
；ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹ（配列番号３１）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＤＧＥＧＧＬＹＡＭ
ＤＹ（配列番号３２）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び、（ｂ）ＫＡＳＤＨＩＮＮＷＬＡ（配列
番号２７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＧＡＴＳＬＥＴ（配列番号２８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；
及びＱＱＹＷＳＴＰＦＴ（配列番号２９）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含む。特定の実施形態
においては、方法は（ａ）ＴＮＹＷＭＱ（配列番号６０）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰ
ＧＮＧＤＳＲ（配列番号６１）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＲＤＧＮＹＡＡＹ（配列番号６
２）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び、（ｂ）ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号５７）を含む
軽鎖ＣＤＲ１；ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号５８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＡＳ
ＰＹＴ（配列番号５９）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含む、抗体がｈｕＦＲ１−４８抗体であ
るイムノコンジュゲートを投与することを含む。特定の実施形態においては、（ａ）ＴＮ
ＹＷＭＹ（配列番号６６）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰＧＮＳＤＴＴ（配列番号６７）
を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＲＨＤＹＧＡＭＤＹ（配列番号６８を）含む重鎖ＣＤＲ３；及
び、（ｂ）ＲＡＳＥＮＩＹＴＮＬＡ（配列番号６３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＴＡＳＮＬＡ
Ｄ（配列番号６４）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＶＳＰＹＴ（配列番号６５）を含
む軽鎖ＣＤＲ３；を含む、抗体がｈｕＦＲ１−４９抗体であるイムノコンジュゲートを投
与することを含む。特定の実施形態においては、（ａ）ＳＳＦＧＭＨ（配列番号７２）を
含む重鎖ＣＤＲ１；ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＳ（配列番号７３）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＥ
ＡＹＧＳＳＭＥＹ（配列番号７４）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び（ｂ）ＲＡＳＱＮＩＮＮＮ
ＬＨ（配列番号６９）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＹＶＳＱＳＶＳ（配列番号７０）を含む軽鎖
ＣＤＲ２；及びＱＱＳＮＳＷＰＨＹＴ（配列番号７１）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含む、抗
体がｈｕＦＲ１−５７抗体であるイムノコンジュゲートを投与することを含む。特定の実
施形態においては、（ａ）ＴＳＹＴＭＨ（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＹＩＮＰ
ＩＳＧＹＴＮ（配列番号７９）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＧＧＡＹＧＲＫＰＭＤＹ（配列
番号８０）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び、（ｂ）ＫＡＳＱＮＶＧＰＮＶＡ（配列番号７５）
を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号７６）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＹ
ＮＳＹＰＹＴ（配列番号７７）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含む、抗体がｈｕＦＲ１−６５抗
体であるイムノコンジュゲートを投与することを含む。
１つの実施形態において、方法は卵巣腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、子宮腫瘍、子宮内膜腫
瘍、膵臓腫瘍、腎臓腫瘍、及び肺腫瘍の生育を阻害する。特定の実施形態においては、方
法は卵巣腫瘍生育を阻害する。別の実施形態においては、本発明は肺腫瘍生育を阻害する
。特定の実施形態においては、腫瘍生育の阻害は癌を治療するために使用される。その他
の実施形態において、方法は第２の抗癌剤を対象に投与することを含む。特定の実施形態
においては、第２の抗癌剤は化学療法剤である。
本発明は又、本発明の抗体、抗原結合フラグメント又はポリペプチドを生産する単離さ
れた細胞を提供する。
本発明は又、配列番号５、１４、１５、３７、３８、４３、４４、４７、４８及び１２
０〜１２７よりなる群から選択される配列に少なくとも９０％同一である配列を含む単離
されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態においては、単離されたポリペプチ
ドは、配列番号５、１４、１５、３７、３８、４３、４４、４７、４８及び１２０〜１２
７よりなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一である。別の実施形態において
は、単離されたポリペプチドは、配列番号５、１４、１５、３７、３８、４３、４４、４
７、４８及び１２０〜１２７よりなる群から選択される配列に少なくとも９９％同一であ
る。本発明は又、配列番号５、１４、１５、３７、３８、４３、４４、４７、４８及び１
２０〜１２７のポリヌクレオチドの何れかを含むベクターを提供する。別の実施形態にお
いては、本発明は配列番号５、１４、１５、３７、３８、４３、４４、４７、４８及び１
２０〜１２７のポリヌクレオチドを含有するベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
抗体が下記：
（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸ
ａａ１ＦＸａａ２Ｘａａ３（配列番号５６）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＹＤＧＳＲＡＭＤ
Ｙ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び、
（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＲＡＳＮ
ＬＥＡ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号９）を含
む軽鎖ＣＤＲ３；
ただしここで、Ｘａａ１はＫ、Ｑ、Ｈ及びＲから選択され；Ｘａａ２はＱ、Ｈ、Ｎ及び
Ｒから選択され；そしてＸａａ３はＧ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ａ及びＶから選択されるもの；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗原結合フラグ
メント。
（項目２）
抗体キメラＭｏｖ１９と実質的に同じ親和性でヒトフォレート受容体１に結合する、項
目１記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目３）
結合親和性がフローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ又はラジオイムノアッセイにより
計測される、項目２記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目４）
重鎖ＣＤＲ２配列がＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号２）を含む、項目
１〜３の何れかに記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目５）
抗体が下記：
（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１、又は１、２、３又は４の保存的
アミノ酸置換を含むその変異体；ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号２）を
含む重鎖ＣＤＲ２、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及び
ＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３、又は１、２、３又は４の保存的
アミノ酸置換を含むその変異体；及び／又は、
（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ１、又は１、
２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；ＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号８）を
含む軽鎖ＣＤＲ２、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及び
ＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ３、又は１、２、３又は４の保存的
アミノ酸置換を含むその変異体；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗原結合フラグ
メント。
（項目６）
配列番号６の重鎖を含むヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はそ
の抗原結合フラグメント。
（項目７）
２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７
２、ＰＴＡ−１０７７３又は１０７７４を有するプラスミドＤＮＡによりコードされるヒ
ト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目８）
ヒトフォレート受容体１への特異的結合に関して項目１〜７の何れかに記載の抗体と競
合するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目９）
配列番号４に少なくとも約９０％同一である重鎖可変ドメイン、及び配列番号１０又は
配列番号１１に少なくとも約９０％同一である軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体又はそ
の抗原結合フラグメント。
（項目１０）
該重鎖可変ドメインが配列番号４に少なくとも約９５％同一であり、そして該軽鎖可変
ドメインが配列番号１０又は配列番号１１に少なくとも約９５％同一である、項目９記載
のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１１）
該重鎖可変ドメインが配列番号４に少なくとも約９９％同一であり、そして該軽鎖可変
ドメインが配列番号１０又は配列番号１１に少なくとも約９９％同一である、項目１０記
載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１２）
該重鎖可変ドメインが配列番号４に同一であり、そして該軽鎖可変ドメインが配列番号
１０又は配列番号１１に同一である、項目１１記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグ
メント。
（項目１３）
該抗体が真核生物細胞においてｃｈＭｏｖ１９よりも少なくとも１０倍高値で発現され
る、項目１〜１２の何れか１項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１４）
該真核生物細胞がＨＥＫ−２９３Ｔ細胞である、項目１３記載のヒト化抗体。
（項目１５）
ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号４に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド;及び／又は
、
（ｂ）配列番号１０又は配列番号１１に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペ
プチド；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するポリペプチド。
（項目１６）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号４に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド;及び／又は
、
（ｂ）配列番号１０又は配列番号１１に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペ
プチド；
を含む、項目１５記載のポリペプチド。
（項目１７）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号４に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド;及び／又は
、
（ｂ）配列番号１０又は配列番号１１に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペ
プチド；
を含む、項目１６記載のポリペプチド。
（項目１８）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号４のポリペプチド；及び／又は、
（ｂ）配列番号１０又は配列番号１１のポリペプチド；
を含む、項目１７記載のポリペプチド。
（項目１９）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号４のポリペプチド；及び、
（ｂ）配列番号１０又は配列番号１１のポリペプチド；
を含む、項目１８記載のポリペプチド。
（項目２０）
抗体が下記：
（ａ）ＳＳＹＧＭＳ（配列番号３０）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹ（配
列番号３１）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＤＧＥＧＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号３２）
を含む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は、
（ｂ）ＫＡＳＤＨＩＮＮＷＬＡ（配列番号２７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＧＡＴＳＬＥＴ
（配列番号２８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＹＷＳＴＰＦＴ（配列番号２９）を含む
軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント
。
（項目２１）
抗体が下記：
（ａ）ＴＮＹＷＭＱ（配列番号６０）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰＧＮＧＤＳＲ（配
列番号６１）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＲＤＧＮＹＡＡＹ（配列番号６２）を含む
重鎖ＣＤＲ３；及び／又は、
（ｂ）ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号５７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＡＡＴＮＬＡＤ
（配列番号５８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＡＳＰＹＴ（配列番号５９）を含む
軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント
。
（項目２２）
抗体が下記：
（ａ）ＴＮＹＷＭＹ（配列番号６６）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰＧＮＳＤＴＴ（配
列番号６７）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＲＨＤＹＧＡＭＤＹ（配列番号６８）を含
む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は、
（ｂ）ＲＡＳＥＮＩＹＴＮＬＡ（配列番号６３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＴＡＳＮＬＡＤ
（配列番号６４）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＶＳＰＹＴ（配列番号６５）を含む
軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント
。
（項目２３）
抗体が下記：
（ａ）ＳＳＦＧＭＨ（配列番号７２）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＳ（配
列番号７３）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＥＡＹＧＳＳＭＥＹ（配列番号７４）を含
む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は、
（ｂ）ＲＡＳＱＮＩＮＮＮＬＨ（配列番号６９）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＹＶＳＱＳＶＳ
（配列番号７０）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＮＳＷＰＨＹＴ（配列番号７１）を含
む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント
。
（項目２４）
抗体が下記：
（ａ）ＴＳＹＴＭＨ（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＹＩＮＰＩＳＧＹＴＮ（配
列番号７９）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＧＧＡＹＧＲＫＰＭＤＹ（配列番号８０）
を含む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は、
（ｂ）ＫＡＳＱＮＶＧＰＮＶＡ（配列番号７５）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＳＡＳＹＲＹＳ
（配列番号７６）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＹＮＳＹＰＹＴ（配列番号７７）を含む
軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント
。
（項目２５）
ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号９７に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又
は、
（ｂ）配列番号９６に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するポリペプチド。
（項目２６）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号９７に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又
は、
（ｂ）配列番号９６に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目２５記載のポリペプチド。
（項目２７）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号９７に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又
は、
（ｂ）配列番号９６に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目２６記載のポリペプチド。
（項目２８）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号９７のポリペプチド；及び／又は、
（ｂ）配列番号９６のポリペプチド；
を含む、項目２７記載のポリペプチド。
（項目２９）
該ポリペプチドが配列番号９７のポリペプチド及び配列番号９６のポリペプチドを含む
、項目２８記載のポリペプチド。
（項目３０）
ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号９９に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又
は、
（ｂ）配列番号９８に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するポリペプチド。
（項目３１）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号９９に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又
は、
（ｂ）配列番号９８に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目３０記載のポリペプチド。
（項目３２）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号９９に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又
は、
（ｂ）配列番号９８に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目３１記載のポリペプチド。
（項目３３）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号９９のポリペプチド；及び／又は、
（ｂ）配列番号９８のポリペプチド；
を含む、項目３2記載のポリペプチド。
（項目３４）
該ポリペプチドが配列番号９９のポリペプチド及び配列番号９８のポリペプチドを含む
、項目３３記載のポリペプチド。
（項目３５）
ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１０１に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１００に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するポリペプチド。
（項目３６）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１０１に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１００に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目３５記載のポリペプチド。
（項目３７）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１０１に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１００に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目３６記載のポリペプチド。
（項目３８）
該ポリペプチドが（ａ）配列番号１０１のポリペプチド；及び／又は、（ｂ）配列番号
１００のポリペプチドを含む、項目３７記載のポリペプチド。
（項目３９）
該ポリペプチドが配列番号１０１のポリペプチド及び配列番号１００のポリペプチドを
含む、項目３８記載のポリペプチド。
（項目４０）
ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１０３に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１０２に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するポリペプチド。
（項目４１）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１０３に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１０２に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目４０記載のポリペプチド。
（項目４２）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１０３に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１０２に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目４１記載のポリペプチド。
（項目４３）
該ポリペプチドが（ａ）配列番号１０３のポリペプチド；及び／又は、（ｂ）配列番号
１０２のポリペプチドを含む、項目４２記載のポリペプチド。
（項目４４）
該ポリペプチドが配列番号１０３のポリペプチド及び配列番号１０２のポリペプチドを
含む、項目４３記載のポリペプチド。
（項目４５）
ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１３に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１２に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するポリペプチド。
（項目４６）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１３に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１２に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目４５記載のポリペプチド。
（項目４７）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１３に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１２に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目４６記載のポリペプチド。
（項目４８）
該ポリペプチドが（ａ）配列番号１１３のポリペプチド；及び／又は、（ｂ）配列番号
１１２のポリペプチドを含む、項目４７記載のポリペプチド。
（項目４９）
該ポリペプチドが配列番号１１３のポリペプチド及び配列番号１１２のポリペプチドを
含む、項目４８記載のポリペプチド。
（項目５０）
ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１５に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１４に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するポリペプチド。
（項目５１）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１５に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１４に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目５０記載のポリペプチド。
（項目５２）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１５に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１４に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目５１記載のポリペプチド。
（項目５３）
該ポリペプチドが（ａ）配列番号１１５のポリペプチド；及び／又は、（ｂ）配列番号
１１４のポリペプチドを含む、項目５２記載のポリペプチド。
（項目５４）
該ポリペプチドが配列番号１１５のポリペプチド及び配列番号１１４のポリペプチドを
含む、項目５３記載のポリペプチド。
（項目５５）
ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１７に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１６に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するポリペプチド。
（項目５６）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１７に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１６に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目５５記載のポリペプチド。
（項目５７）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１７に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１６に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目５６記載のポリペプチド。
（項目５８）
該ポリペプチドが（ａ）配列番号１１７のポリペプチド；及び／又は、（ｂ）配列番号
１１６のポリペプチドを含む、項目５７記載のポリペプチド。
（項目５９）
該ポリペプチドが配列番号１１７のポリペプチド及び配列番号１１６のポリペプチドを
含む、項目５8記載のポリペプチド。
（項目６０）
ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１９に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１８に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するポリペプチド。
（項目６１）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１９に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１８に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目６０記載のポリペプチド。
（項目６２）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号１１９に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／
又は、
（ｂ）配列番号１１８に少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド；
を含む、項目６１記載のポリペプチド。
（項目６３）
該ポリペプチドが（ａ）配列番号１１９のポリペプチド；及び／又は、（ｂ）配列番号
１１８のポリペプチドを含む、項目６２記載のポリペプチド。
（項目６４）
該ポリペプチドが配列番号１１９のポリペプチド及び配列番号１１８のポリペプチドを
含む、項目６３記載のポリペプチド。
（項目６５）
抗体である項目２５〜６５の何れか１項に記載の抗体。
（項目６６）
完全長抗体である項目１〜２４の何れか１項に記載の抗体。
（項目６７）
抗原結合フラグメントである項目１〜２４の何れか１項に記載の抗体。
（項目６８）
該抗体又は抗原結合フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆ
ｖ即ちｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボ
ディー、ＩｇＧ−ＣＨ２、ミニボディー、Ｆ（ａｂ'）３、テトラボディー、トリアボデ
ィー、ダイアボディー、単ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦ
ｖ）２、又はｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、項目６７記載の抗体。
（項目６９）
約１．０〜約１０ｎＭのＫｄでヒトフォレート受容体１に結合する、項目１〜６８の何
れか１項に記載の抗体又はポリペプチド。
（項目７０）
約１．０ｎＭ又はそれより良好なＫｄでヒトフォレート受容体１に結合する、項目１〜
６９の何れか１項に記載の抗体又はポリペプチド。
（項目７１）
結合親和性がフローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ又はラジオイムノアッセイにより
計測される、項目６９又は７０記載の抗体。
（項目７２）
（ａ）項目１〜２４の何れか１項に記載の抗体を発現する細胞を培養すること；及び（
ｂ）該培養細胞から抗体を単離することを含む該抗体を作成する方法。
（項目７３）
該細胞が真核生物の細胞である項目７２記載の方法。
（項目７４）
式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有し、式中：
（Ａ）は項目１〜７１の何れか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント又はポリペプ
チドであり；
（Ｌ）はリンカーであり；そして、
（Ｃ）は細胞傷害剤であり；
そして該リンカー（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲート。
（項目７５）
該リンカーが切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、及びジカ
ルボン酸系リンカーよりなる群から選択される、項目７４記載のイムノコンジュゲート。
（項目７６）
該リンカーがＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰ
Ｐ）又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノエート
（スルホ−ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（
ＳＰＤＢ）又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエ
ート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキ
サンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチ
ル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（
ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；及びＮ−スクシンイミジル−［（
Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−Ｐ
ＥＧ４−マレイミド）よりなる群から選択される、項目７５記載のイムノコンジュゲート
。
（項目７７）
該リンカーがＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラ
エチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）である、項目７５記載
のイムノコンジュゲート。
（項目７８）
該リンカーがＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤ
Ｂ）又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（
スルホ−ＳＰＤＢ）である、項目７５記載のイムノコンジュゲート。
（項目７９）
該細胞傷害剤がマイタンシノイド、マイタンシノイド類縁体、ベンゾジアゼピン、タキ
ソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類縁体、デュオカルマイシン、デュオカルマイ
シン類縁体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類縁体、アリスタチン、ト
マイマイシン誘導体、及びレプトマイシン誘導体又は該剤のプロドラッグよりなる群から
選択される、項目７４〜７８の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート。
（項目８０）
該細胞傷害剤がマイタンシノイドである、項目７９記載のイムノコンジュゲート。
（項目８１）
該細胞傷害剤がＮ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソ
プロピル）−マイタンシン又はＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−
メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシンである、項目８０記載のイムノコンジュゲ
ート。
（項目８２）
下記：
（Ａ）配列番号９７、９９、１０１又は１０３の重鎖可変ドメイン及び配列番号９６、９
８、１００又は１０２の軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート
（ＳＭＣＣ）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）
−マイタンシン；
を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、イムノコンジュゲート。
（項目８３）
下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメ
インを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレン
グリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペン
チル）−マイタンシン；
を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、イムノコンジュゲート。
（項目８４）
下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメ
インを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）；及
び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペン
チル）−マイタンシン；
を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、イムノコンジュゲート。
（項目８５）
下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメ
インを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（ス
ルホ−ＳＰＤＢ）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペン
チル）−マイタンシン；
を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、イムノコンジュゲート。
（項目８６）
下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメ
インを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノエート（
スルホ−ＳＰＰ）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）
−マイタンシン；
を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、イムノコンジュゲート。
（項目８７）
下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメ
インを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）；及
び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）
−マイタンシン；
を含み、ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、イムノコンジュゲート。
（項目８８）
第２の（Ｃ）を更に含む、項目７４〜８７の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート
。
（項目８９）
第３の（Ｃ）を更に含む、項目８８記載のイムノコンジュゲート。
（項目９０）
第４の（Ｃ）を更に含む、項目８９記載のイムノコンジュゲート。
（項目９１）
２〜６個の（Ｃ）を含む、項目７４〜９０の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート
。
（項目９２）
３〜４個の（Ｃ）を含む、項目７４〜９０の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート
。
（項目９３）
項目１〜７１及び７４〜９２の何れか１項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、ポリ
ペプチド又はイムノコンジュゲート及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
（項目９４）
イムノコンジュゲートが（Ａ）当たり平均で約３〜約４個の（Ｃ）を有する項目７４〜
９２の何れか１項に記載のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物。
（項目９５）
イムノコンジュゲートが（Ａ）当たり平均で約３．５±０．５個の（Ｃ）を有する、項
目４７記載の医薬組成物。
（項目９６）
第２の抗癌剤を更に含む、項目９３〜９５の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目９７）
標識されている項目１〜７１及び７４〜９２の何れか１項に記載の抗体、抗原結合フラ
グメント、ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む診断試薬。
（項目９８）
該標識が放射標識、蛍光団、発色団、画像化剤及び金属イオンよりなる群から選択され
る、項目９７記載の診断試薬。
（項目９９）
項目１〜７１及び７４〜９２の何れか１項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、ポリ
ペプチド又はイムノコンジュゲートを含むキット。
（項目１００）
対象に項目１〜７１及び７１〜９５の何れか１項に記載の抗体、抗原結合フラグメント
、ポリペプチド、イムノコンジュゲート又は医薬組成物の治療有効量を投与することを含
む、対象における腫瘍生育を阻害する方法。
（項目１０１）
式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有し、式中：
（Ａ）はヒトフォレート受容体１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント
であり；
（Ｌ）はリンカーであり；そして、
（Ｃ）はマイタンシノイド及びマイタンシノイド類縁体よりなる群から選択される細胞傷
害剤であり；ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結するイムノコンジュゲートの治療有効
量を投与することを含み；
ここでイムノコンジュゲートはＫＢ異種移植片モデルにおいて平均腫瘍体積を少なくと
も２倍低減する、対象における腫瘍生育を阻害する方法。
（項目１０２）
該抗体又はその抗原結合フラグメントが下記：
（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸａ
ａ１ＦＸａａ２Ｘａａ３（配列番号５６）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹ
（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び、
（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＲＡＳＮ
ＬＥＡ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号９）を含
む軽鎖ＣＤＲ３；
ただしここで、Ｘａａ１はＫ、Ｑ、Ｈ及びＲから選択され；Ｘａａ２はＱ、Ｈ、Ｎ及び
Ｒから選択され；そしてＸａａ３はＧ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ａ及びＶから選択されるもの；
を含む、項目１０１記載の方法。
（項目１０３）
重鎖ＣＤＲ２配列がＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号２）を含む、項目
１０２記載の方法。
（項目１０４）
該抗体又はその抗原結合フラグメントが２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、そ
してＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７２、ＰＴＡ−１０７７３又は１０７７４を有する
プラスミドＤＮＡによりコードされる、項目１０１記載の方法。
（項目１０５）
該イムノコンジュゲートが下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメ
インを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレン
グリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペン
チル）−マイタンシン；
を含む、項目１０１記載の方法。
（項目１０６）
該イムノコンジュゲートが下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメ
インを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）；及
び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペン
チル）−マイタンシン；
を含み；
ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、項目１０１記載の方法。
（項目１０７）
該イムノコンジュゲートが下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメ
インを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（ス
ルホ−ＳＰＤＢ）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペン
チル）−マイタンシン；
を含み；
ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、項目１０１記載の方法。
（項目１０８）
該イムノコンジュゲートが下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメ
インを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノエート（
スルホ−ＳＰＰ）；及び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）
−マイタンシン；
を含み；
ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、項目１０１記載の方法。
（項目１０９）
該イムノコンジュゲートが下記：
（Ａ）配列番号４の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０又は配列番号１１の軽鎖可変ドメ
インを含むヒト化抗体；
（Ｌ）Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）；及
び、
（Ｃ）Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）
−マイタンシン；
を含み；
ここで（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結する、項目１０１記載の方法。
（項目１１０）
該抗体が２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−
１０７７５及びＰＴＡ−１０７７６を有するｈｕＦＲ−１−２１抗体である、項目１０１
記載の方法。
（項目１１１）
該抗体がｈｕＦＲ１−２１抗体であり、ここで該抗体が下記：
（ａ）ＳＳＹＧＭＳ（配列番号３０）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹ（配
列番号３１）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＤＧＥＧＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を含む
重鎖ＣＤＲ３；及び、
（ｂ）ＫＡＳＤＨＩＮＮＷＬＡ（配列番号２７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＧＡＴＳＬＥＴ
（配列番号２８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＹＷＳＴＰＦＴ（配列番号２９）を含む
軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、項目１０１記載の方法。
（項目１１２）
該抗体がｈｕＦＲ１−４８抗体であり、ここで該抗体が下記：
（ａ）ＴＮＹＷＭＱ（配列番号６０）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰＧＮＧＤＳＲ（配
列番号６１）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＲＤＧＮＹＡＡＹ（配列番号６２）を含む重鎖Ｃ
ＤＲ３；及び、
（ｂ）ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号５７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＡＡＴＮＬＡＤ
（配列番号５８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＡＳＰＹＴ（配列番号５９）を含む
軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、項目１０１記載の方法。
（項目１１３）
該抗体がｈｕＦＲ１−４９抗体であり、ここで該抗体が下記：
（ａ）ＴＮＹＷＭＹ（配列番号６６）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰＧＮＳＤＴＴ（配
列番号６７）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＲＨＤＹＧＡＭＤＹ（配列番号６８）を含む重鎖
ＣＤＲ３；及び、
（ｂ）ＲＡＳＥＮＩＹＴＮＬＡ（配列番号６３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＴＡＳＮＬＡＤ
（配列番号６４）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＶＳＰＹＴ（配列番号６５）を含む
軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、項目１０１記載の方法。
（項目１１４）
該抗体がｈｕＦＲ１−５７抗体であり、ここで該抗体が下記：
（ａ）ＳＳＦＧＭＨ（配列番号７２）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＳ（配
列番号７３）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＥＡＹＧＳＳＭＥＹ（配列番号７４）を含む重鎖
ＣＤＲ３；及び、
（ｂ）ＲＡＳＱＮＩＮＮＮＬＨ（配列番号６９）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＹＶＳＱＳＶＳ
（配列番号７０）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＮＳＷＰＨＹＴ（配列番号７１）を含
む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、項目１０１記載の方法。
（項目１１５）
該抗体がｈｕＦＲ１−６５抗体であり、ここで該抗体が下記：
（ａ）ＴＳＹＴＭＨ（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＹＩＮＰＩＳＧＹＴＮ（配
列番号７９）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＧＧＡＹＧＲＫＰＭＤＹ（配列番号８０）を含む
重鎖ＣＤＲ３；及び、
（ｂ）ＫＡＳＱＮＶＧＰＮＶＡ（配列番号７５）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＳＡＳＹＲＹＳ
（配列番号７６）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＹＮＳＹＰＹＴ（配列番号７７）を含む
軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、項目１０１記載の方法。
（項目１１６）
腫瘍が卵巣腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、子宮腫瘍、子宮内膜腫瘍、膵臓腫瘍、腎臓腫瘍、
及び肺腫瘍よりなる群から選択される、項目１００〜１１５の何れか１項に記載の方法。
（項目１１７）
腫瘍が卵巣腫瘍である、項目１１６記載の方法。
（項目１１８）
腫瘍が肺腫瘍である、項目１１６記載の方法。
（項目１１９）
癌を治療するために腫瘍生育を阻害する、項目１００〜１１８の何れか１項に記載の方
法。
（項目１２０）
対象に第２の抗癌剤を投与することをさらに含む、項目１１９記載の方法。
（項目１２１）
該第２の抗癌剤が化学療法剤である、項目１２０記載の方法。
（項目１２２）
項目１〜７１の何れか１項に記載の抗体、抗原結合フラグメント又はポリペプチドを生
産する単離された細胞。
（項目１２３）
配列番号５、１４、１５、３７、３８、４３、４４、４７、４８及び１２０〜１２７よ
りなる群から選択される配列に少なくとも９０％同一である配列を含む単離されたポリヌ
クレオチド。
（項目１２４）
該配列が配列番号５、１４、１５、３７、３８、４３、４４、４７、４８及び１２０〜
１２７よりなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一である、項目１２３記載の
単離されたポリヌクレオチド。
（項目１２５）
該配列が配列番号５、１４、１５、３７、３８、４３、４４、４７、４８及び１２０〜
１２７よりなる群から選択される配列に少なくとも９９％同一である、項目１２４記載の
単離されたポリヌクレオチド。
（項目１２６）
項目１２３〜１２５の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目１２７）
項目１２６記載のベクターを含む宿主細胞。
図１はネズミ（ｍｕＭｏｖ１９）及びヒト化（ｈｕＭｏｖ１９）Ｍｏｖ１９に関する表面残基を示す。（Ａ）ネズミ及びヒト化Ｍｏｖ１９軽鎖表面残基。ネズミ及びヒト化Ｍｏｖ１９軽鎖可変領域フレーム表面残基及び位置数（Ｋａｂａｔシステム）を示す。元のネズミ配列とは異なるヒト残基には下線を付す。＊７４位は表面位置ではないが、バージョン１．００におけるコンセンサスＮ連結グリコシル化部位を除去するために、この位置をスレオニンに変更し（この位置における最も一般的なヒト残基）、これによりバージョン１．６０とした。（Ｂ）ネズミ及びヒトＭｏｖ１９重鎖表面残基。ネズミ及びヒト化Ｍｏｖ１９重鎖可変領域フレーム表面残基及び位置数（Ｋａｂａｔシステム）を示す。元のネズミ配列とは異なるヒト残基には下線を付す。ＦＲ１−２１（Ｃ）及び（Ｄ）について同様の表面残基を与えている。 図１はネズミ（ｍｕＭｏｖ１９）及びヒト化（ｈｕＭｏｖ１９）Ｍｏｖ１９に関する表面残基を示す。（Ａ）ネズミ及びヒト化Ｍｏｖ１９軽鎖表面残基。ネズミ及びヒト化Ｍｏｖ１９軽鎖可変領域フレーム表面残基及び位置数（Ｋａｂａｔシステム）を示す。元のネズミ配列とは異なるヒト残基には下線を付す。＊７４位は表面位置ではないが、バージョン１．００におけるコンセンサスＮ連結グリコシル化部位を除去するために、この位置をスレオニンに変更し（この位置における最も一般的なヒト残基）、これによりバージョン１．６０とした。（Ｂ）ネズミ及びヒトＭｏｖ１９重鎖表面残基。ネズミ及びヒト化Ｍｏｖ１９重鎖可変領域フレーム表面残基及び位置数（Ｋａｂａｔシステム）を示す。元のネズミ配列とは異なるヒト残基には下線を付す。ＦＲ１−２１（Ｃ）及び（Ｄ）について同様の表面残基を与えている。 図１はネズミ（ｍｕＭｏｖ１９）及びヒト化（ｈｕＭｏｖ１９）Ｍｏｖ１９に関する表面残基を示す。（Ａ）ネズミ及びヒト化Ｍｏｖ１９軽鎖表面残基。ネズミ及びヒト化Ｍｏｖ１９軽鎖可変領域フレーム表面残基及び位置数（Ｋａｂａｔシステム）を示す。元のネズミ配列とは異なるヒト残基には下線を付す。＊７４位は表面位置ではないが、バージョン１．００におけるコンセンサスＮ連結グリコシル化部位を除去するために、この位置をスレオニンに変更し（この位置における最も一般的なヒト残基）、これによりバージョン１．６０とした。（Ｂ）ネズミ及びヒトＭｏｖ１９重鎖表面残基。ネズミ及びヒト化Ｍｏｖ１９重鎖可変領域フレーム表面残基及び位置数（Ｋａｂａｔシステム）を示す。元のネズミ配列とは異なるヒト残基には下線を付す。ＦＲ１−２１（Ｃ）及び（Ｄ）について同様の表面残基を与えている。 図２はキメラＭｏｖ１９及びｈｕＭｏｖ１９重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及びｍｕＦＲ１−２１及びｈｕＦＲ１−２１重鎖及び軽鎖可変ドメインのアライメントを示す。Ｍｏｖ１９及びＦＲ１−２１可変領域のリサーフィシング配列とそれらのネズミ対応物とのアライメント。Ａ）及びＣ）軽鎖可変ドメイン；Ｂ）及びＤ）重鎖可変ドメイン。ダッシュ「−」はネズミ配列との同一性を示す。ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義）には下線を付す。 図３はＨＥＫ細胞におけるキメラＭｏｖ１９とｈｕＭｏｖ１９の発現を示す。キメラ及びヒトＭｏｖ１９発現プラスミドを懸濁ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内に一過性にトランスフェクトし、７日後に採取し、そして発現された抗体を定量的ＥＬＩＳＡにより測定した。軽鎖及び重鎖のプラスミドは３：１又は６：１のそれぞれのモル比でトランスフェクトした。 図４は抗ＦＯＬＲ１抗体の結合特異性を、それらのＦＯＬＲ１発現３００−１９細胞への結合により検出したものである。フローサイトメトリーによる３００−１９−ＦＯＬＲ１細胞へのｈｕＭｏｖ１９の結合。ＦＯＬＲ１を発現している３００−１９親細胞。グレー塗りつぶし部分は細胞外自己蛍光を示し；黒点線はＦＩＴＣにコンジュゲートした抗ヒト二次抗体と共にインキュベートした細胞を示し、黒実線はｈｕＭｏｖ１９抗体及びＦＩＴＣにコンジュゲートした抗ヒト二次抗体と共にインキュベートした細胞を示す。 図５は抗ＦＯＬＲ１抗体及びイムノコンジュゲートの結合親和性及びインビトロの細胞傷害活性を示す。ｈｕＭｏｖ１９及び種々のネズミ及びヒト化ＦＲ−１抗体の結合親和性をＳＫＯＶ３細胞において計測した。列挙した抗体のＰＥＧ４−Mａｌ−ＤＭ４コンジュゲートのインビトロの細胞傷害活性も又アッセイした。 図６はイムノコンジュゲートの抗体依存性細胞性細胞傷害を示す。ｈｕＭｏｖ１９、ｈｕＦＲ１−２１及びＭｏｒ００３のＡＤＣＣ活性をＩｇｒｏｖ１細胞に対してアッセイした。Ｉｇｒｏｖ１は標的：ＮＫ細胞比１：４の１５００細胞／ウェルとともにインキュベートした。 図７はＫＢ細胞におけるｈｕＦＲ１−２１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ４及びｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ４の連続曝露の細胞傷害活性を示す。過剰量の非コンジュゲート抗体は、それらをＫＢ細胞の存在下に同時インキュベートした場合に、イムノコンジュゲートの活性を抑制し、細胞傷害活性が抗原依存性であることを示した。 図８はＫＢ異種移植片モデルにおけるｈｕＭｏｖ１９ターゲティングコンジュゲートのインビボの薬効を示す。ＦＯＬＲ１−ターゲティング切断可能コンジュゲートｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（Ｂ）を非ＦＯＬＲ１−ターゲティングｈｕＣ２４２−ＳＰＤＭ−ＤＭ４（Ｄ）と対比させながら、そして、切断不可能コンジュゲートｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−Mａｌ−ＤＭ４（Ｃ）をｈｕＣ２４２−ＰＥＧ４Mａｌ−ＤＭ４（Ｅ）と対比させながら、ＳＣＩＤマウスに皮下移植されたＫＢ細胞の樹立された異種移植片モデルを用いて試験した。ｈｕＭｏｖ１９によるＦＯＬＲ１のターゲティングは平均腫瘍体積の有意な低減をもたらした。 図９はＫＢ異種移植片モデルにおけるネズミＦＲ−１抗ＦＯＬＲ１抗体と比較した場合のｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−Mａｌ−ＤＭ４のインビボの薬効を示す。未コンジュゲート又はＰＥＧ４−Mａｌ−ＤＭ４とコンジュゲートしたＦＲ−１シリーズの抗体を、ＫＢ異種移植片腫瘍モデルにおいてｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−Mａｌ−ＤＭ４と比較しながら平均腫瘍体積を低減するそれらの能力に関して試験した。（Ａ）ＦＲ−１−９、（Ｂ）ＦＲ−１−１３、（Ｃ）ＦＲ−１−２２及び（Ｄ）ＦＲ−１−２３。 図１０はＫＢ異種移植片モデルにおけるｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−Mａｌ−ＤＭ４及びｈｕＦＲ１−２１−ＰＥＧ４−Mａｌ−ＤＭ４のインビボの薬効を示す。接種後第６日にｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−Mａｌ−ＤＭ４及びｈｕＦＲ１−２１−ＰＥＧ４−Mａｌ−ＤＭ４の１０ｍｇ／ｋｇの単回注射を行った。ｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ４及びｈｕＦＲ１−２１−ＰＥＧ４−Mａｌ−ＤＭ４の両方が平均腫瘍体積の有意な低減を示した。「平均ＴＶ］とは平均腫瘍体積をさす。 図１１はｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ４がＫＢ異種移植片モデルにおいて用量依存性の活性を示したことを表わしている。イムノコンジュゲートの用量依存性活性は試験した用量の範囲にわたってアッセイした。毎週投薬は抗腫瘍活性の向上をもたらした。高い薬物負荷のみが１０ｍｇ／ｋｇ用量群において活性を限定的に改善し、より低用量の群では活性は低減していた。３．４ＤＡＲとは抗体当たり３．７薬物分子を指す。 図１２は種々のリンカーを用いてＤＭ１及びＤＭ４にコンジュゲートしたｈｕＭｏｖ１９のインビボの薬効を示す。ｈｕＭｏｖ１９を、抗体当たり３．９薬物分子でＳＭＣＣ−ＤＭ１に、抗体当たり３．７薬物分子でスルホ−ｍａｌ−ＤＭ４に（Ｂ）、そして抗体当たり８．２３薬物分子でスルホ−ｍａｌ−ＤＭ４に（Ｃ）コンジュゲートし、そしてｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ４と比較しながら種々の濃度において平均腫瘍体積を低減するそれらの能力についてアッセイした。 図１３は種々のリンカーを用いてＤＭ１及びＤＭ４にコンジュゲートしたｈｕＭｏｖ１９のインビボの薬効を示す。ｈｕＭｏｖ１９を、抗体当たり４．３薬物分子でＳＰＰ−ＤＭ１に、抗体当たり３．８薬物分子でスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４に、抗体当たり３．８薬物分子でＳＰＤＢ−ＤＭ４に、そして抗体当たり６．８薬物分子でスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４にコンジュゲートし、そして平均腫瘍体積を低減するそれらの能力についてアッセイした。マウスには５ｍｇ／ｋｇ（Ａ）及び２．５ｍｇ／ｋｇ（Ｂ）の上記したコンジュゲートの１つ、又はＰＢＳ単独を投与した。 図１４はＯＶＣＡＲ−３異種移植片腫瘍モデルにおけるｈｕＭｏｖ１９−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４のインビボの薬効を示す。マウスには２５、５０又は１００μｇ／ｋｇのｈｕＭｏｖ１９−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、又はＰＢＳ単独を投与した。 図１５はＩＧＲＯＶ−１異種移植片腫瘍モデルにおけるｈｕＭｏｖ１９−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４のインビボの薬効を示す。マウスには２５、５０又は１００μｇ／ｋｇのｈｕＭｏｖ１９−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、又はＰＢＳ単独を投与した。 図１６はＯＶ−９０異種移植片腫瘍モデルにおけるｈｕＭｏｖ１９−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４のインビボの薬効を示す。マウスには２５、５０又は１００μｇ／ｋｇのｈｕＭｏｖ１９−スルホＳＰＤＢ−ＤＭ４、又はＰＢＳ単独を投与した。 図１７はＫＢ異種移植片モデルにおけるイムノコンジュゲートの薬効に対する切断可能及び切断不可能なリンカーの作用を示す。 図１８は（Ａ）ＫＢ異種移植片モデル（Ｂ）ＯＶＣＡＲ−３異種移植片モデルにおけるイムノコンジュゲートの薬効に対する切断可能なリンカーの作用を示す。 図１９はＫＢ及び異種移植片腫瘍モデルにおけるｈｕＦＲ１−４８、ｈｕＦＲ１−４９、ｈｕＦＲ１−５７及びｈｕＦＲ１−６５−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のインビトロ及びインビボノ薬効を示す。マウスには２００μｇ／ｋｇの単回用量を投与した。
本発明はヒトフォレート受容体１（ＦＯＬＲ１）に結合するポリペプチド、例えば抗体
及びイムノコンジュゲートを包含するがこれらに限定されない新しい剤を提供する。関連
のポリペプチド及びポリヌクレオチド、ＦＯＬＲ１結合剤を含む組成物、及びＦＯＬＲ１
結合剤を作成する方法も提供する。新しいＦＯＬＲ１結合剤を使用する方法、例えば腫瘍
の生育を阻害する、及び／又は癌を治療する方法もまた提供する。
１．定義
本発明の理解を容易にするために、多くの用語及びフレーズを以下に定義する。
「ヒトフォレート受容体１」即ち「ＦＯＬＲ１」という用語は、本明細書において使用
する場合、特段の記載が無い限り何れかのネイティブのひとＦＯＬＲ１を指す。「ＦＯＬ
Ｒ１」という用語は又、「完全長」の、未プロセシングのＦＯＬＲ１、並びに細胞内のプ
ロセシングの結果生じる何れかの形態のＦＯＬＲ１を包含する。用語は又、天然に存在す
るＦＯＬＲ１変異体、例えばスプライス変異体、対立遺伝子変異体及びアイソフォームを
包含する。本明細書に記載したＦＯＬＲ１ポリペプチドは種々の原料から、例えばヒト組
織型から、又はその他の減量から単離するか、又は組み換え又は合成の方法により調製す
ることができる。ＦＯＬＲ１配列の例は、ＮＣＢＩレファレンス番号Ｐ１５３２８、ＮＰ
＿００１０９２２４２．１、ＡＡＸ２９２６８．１、ＡＡＸ３７１１９．１、ＮＰ＿０５
７９３７．及びＮＰ＿０５７９３６．１を包含するがこれらに限定されない。
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内部の抗原認識部位少なくとも
１つを介して、蛋白、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質又は
これらの組み合わせのような標的を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味
する。本明細書において使用する場合、「抗体」という用語は未損傷のポリクローナル抗
体、未損傷のモノクローナル抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
ｂ’）２、及びＦｖフラグメント）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、少なくとも２つ
の未損傷抗体から形成された二重特異性抗体のような多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト
化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合蛋白、及び、抗体が所望の生物学的活
性を呈する限りにおいて、抗原認識部位を含むいずれかの他の修飾された免疫グロブリン
分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと
称される自身の重鎖定常ドメインのアイデンティティーに基づいて、免疫グロブリンの５
主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（アイソ
タイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）の
何れかであることができる。異なるクラスの免疫グロブリンは異なる良く知られたサブユ
ニット構造及び三次元配置を有する。抗体はネイキッドであるか、毒素、放射性同位体等
のような他の分子にコンジュゲートされていることができる。
「ブロッキング」抗体又は「拮抗剤」抗体とはＦＯＬＲ１ような自身が結合する抗原の
生物学的活性を阻害又は低減するものである。一部の実施形態においてはブロッキング抗
体又は拮抗剤抗体は抗原の生物学的活性を実質的に、又は完全に阻害する。望ましくは生
物学的活性は１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は
１００％までも低減することができる。
「抗ＦＯＬＲ１抗体」又は「ＦＯＬＲ１に結合する抗体」という用語はＦＯＬＲ１をタ
ーゲティングする場合において診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、
十分な親和性を持ってＦＯＬＲ１に結合することができる抗体を指す。未関連の非ＦＯＬ
Ｒ１蛋白への抗ＦＯＬＲ１抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
により計測した場合にＦＯＬＲ１への抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態
においてはＦＯＬＲ１に結合する抗体は≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ
、又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
「抗体フラグメント」という用語は未損傷の抗体の一部分を指し、そして未損傷の抗体
の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）
２、及びＦｖフラグメント、線状抗体、単鎖抗体、及び抗体フラグメントから形成された
多重特異性抗体を包含するがこれらに限定されない。
「モノクローナル抗体」とは単一の抗原決定基、即ちエピトープの高度に特異的な認識
及び結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは種々異なる抗原決定基に対して指向さ
れた種々異なる抗体を典型的には包含しているポリクローナル抗体とは対照的である。「
モノクローナル抗体」という用語は未損傷及び完全長のモノクローナル抗体、並びに抗体
フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）突然変異
体、抗体部分を含む融合蛋白、及び抗原認識部位を含む何れかの他の修飾された免疫グロ
ブリン分子を包含する。更に又、「モノクローナル抗体」とはハイブリドーマ、ファージ
選択、組み換え発現、及びトランスジェニック動物による方法を包含するがこれらに限定
されない態様の何れかにより作成された抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は最小限の非ヒト（例えばネズミ）配列を含有する特異的な
免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、又はそのフラグメントである非ヒト（例えば
ネズミ）抗体の形態を指す。典型的にはヒト化抗体は所望の特異性、親和性及び能力を有
する非ヒト種（例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲに由来する残基に
より、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が置き換えられているヒト免疫グロブリンで
ある(Jones等、1986,Nature,321:522-525;Riechmann等、1988, Nature,332:323-327; Ver
hoeyen等、1988,Science,239:1534-1536)。一部の例においては、ヒト免疫グロブリ
ンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒ
ト種由来抗体中の相当する残基で置き換えられている。ヒト化抗体は更に抗体の特異性、
親和性及び／又は能力を精鋭化及び最適化するためにＦｖフレームワーク内及び／又は置
き換えられた非ヒト残基内部における追加的残基の置換により修飾できる。一般的にヒト
化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに相当するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有す
る可変ドメイン少なくとも１つ、そして典型的には２つ又は３つの実質的に全てを含むこ
とになり、一方ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列
のものである。ヒト化抗体は又、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なく
とも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むこともできる。ヒト化抗体を形
成するために使用される方法の例は米国特許５，２２５，５３９又は５，６３９，６４１
号に記載されている。
抗体の「可変領域」とは単独又は組み合わせにおいて、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重
鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は各々、超可変領域としても知られている
３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）よ
りなる。各鎖におけるＣＤＲはＦＲにより近接して共に保持されており、そして他の鎖の
ＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するためには少
なくとも２つの手法、即ち：（１）種間の配列変動性に基づくアプローチ（即ちKabat等
、Sequences of Proteins ofImmunological Interest, (5th 編、1991,NationalInstitut
esofHealth,Bethesda Md.)）；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づい
たアプローチ（Al-lazikaniet al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)）が存在する。
更に又、これらの２つのアプローチの組み合わせがＣＤＲを決定するために当該分野で使
用される場合もある。
Ｋａｂａｔナンバリングシステムは一般的に可変ドメイン内の残基（概ね、軽鎖の残基
１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）を指す場合に使用される（例えばKabat等、Seque
ncesofImmunologicalInterest.5th Ed. Public HealthService, National Institutes
of Health, Bethesda, Md.(1991)）。
Ｋａｂａｔの場合のアミノ酸位置のナンバリングはKabat等、Sequencesof Proteins of
ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service, NationalInstitutes ofHealth,
Bethesda,Md. (1991)における抗体のコンピレーションの重鎖可変ドメイン又は軽
鎖可変ドメインに対して使用されるナンバリングシステムである。このナンバリングシス
テムを使用すると、実際の線状アミノ酸配列は可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短鎖化、
又はそれへの挿入に相当する、より少数又は追加のアミノ酸を含有する場合がある。例え
ば、重鎖可変ドメインはＨ２の残基５２の後の単一のアミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによる
残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えばＫａｂａｔによる残基８２ａ
、８２ｂ及び８２ｃ等）を包含する場合がある。残基のＫａｂａｔナンバリングは「標準
的」Ｋａｂａｔナンバリングされた配列との、抗体の配列の相同性の領域におけるアライ
メントにより所定の抗体について決定することができる。Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに構造
ループの箇所を指している（ChothiaandLeskJ.Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。Ｋ
ａｂａｔのナンバリング法を用いてナンバリングした場合のＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ−Ｈ
１ループの終点はループの長さによりＨ３２とＨ３４の間で変動する（その理由はＫａｂ
ａｔのナンバリング法はＨ３５ＡとＨ３５Ｂに挿入を置いており；３５Ａと３５Ｂの何れ
も存在しない場合はループは３２で終点となり；３５Ａのみが存在する場合は、ループは
３３で終点隣；３５Ａと３５Ｂの両方が存在する場合は、ループは３４で終点となる）。
ＡｂＭ超可変領域はＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの間の妥協点を示
しており、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウエア
により使用されている。
Figure 2021100430
「ヒト抗体」という用語は、ヒトにより作成された抗体、又は当該分野で知られている
何れかの手法を用いて人工的に生成された抗体に相当するアミノ酸配列を有する抗体を意
味する。ヒト抗体のこの定義は、未損傷又は完全長の抗体、そのフラグメント、及び／又
は少なくとも１つのヒト重鎖及び／又は軽鎖のポリペプチドを含む抗体、例えばネズミ軽
鎖及びヒト重鎖のポリペプチドを含む抗体を包含する。
「キメラ抗体」という用語は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種から誘
導されている抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性
、親和性及び能力を有する哺乳類の１種（例えばマウス、ラット、ウサギ等）から誘導さ
れた抗体の可変領域に相当し、そして、定常領域はその種における免疫応答を誘発するこ
とを回避するために別のもの（通常はヒト）から誘導された抗体中の配列に相同である。
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、本明細書においては互換的に使用さ
れ、そして特定の抗体により認識され、そして特異的に結合されることができる抗原の部
分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは蛋白の３次折り畳みにより並置
された連続アミノ酸及び非連続アミノ酸の両方から形成できる。連続アミノ酸から形成さ
れたエピトープは典型的には蛋白変性時に保持されるのに対し、３次折り畳みにより形成
されるエピトープは典型的には蛋白変性時に消失する。エピトープは典型的には少なくと
も３つ、そしてより普通には少なくとも５又は８〜１０個のアミノ酸をユニークな空間的
コンホーメーションにおいて包含している。
「結合親和性」とは一般的に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合相手（
例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総計の強度を指す。特段の記載が無い限
り、本明細書において使用する場合、「結合親和性」とは結合対のメンバー（例えば抗体
と抗原）の間の１：１相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。分子Ｘのその相手
Ｙに対する親和性は一般的に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は本明細
書に記載する者を含めて当該分野で知られている一般的方法により計測できる。低親和性
の抗体は一般的に緩徐に抗原に結合し、そして容易に解離する傾向があるのに対し、高親
和性の抗体は一般的に急速に抗原に結合し、そしてより長時間結合したままとなる傾向を
有する。結合親和性を計測するための種々の方法が当該分野で知られており、それらのい
ずれも本発明の目的のために使用できる。特定の例示される実施形態は後述するとおりで
ある。
「より良好」とは本明細書において使用する場合、分子とその結合相手との間のより強
い結合を指す。「より良好」とは本明細書において使用する場合、より小さい数のＫｄ値
により表されるより強い結合を指す。例えば、「０．６ｎMより良好」な抗原に対する親
和性を有する抗体について、その抗原に対する抗体の親和性は＜０．６ｎＭ、即ち０．５
９ｎＭ、０．５８ｎＭ、０．５７ｎＭ、等、又は０．６ｎＭ未満の何れかの値である。
「実質的に同様」又は「実質的に同じ」というフレーズは、本明細書において使用する
場合、当業者が２つの値の間の差が、その値（例えばＫｄ値）により計測される生物学的
特性の範囲内において生物学的及び／又は統計学的な有意性を殆ど又は全く有さないと考
えるような、２つの数値（一般的に１つは本発明の抗体に関連するものであり、もう１つ
はレファレンス／コンパレーター抗体に関連するもの）の間の十分高度な同様性を意味す
る。該２つの値の間の差は、レファレンス／コンパレーター抗体の値の関数として、約５
０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満である。
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物は
、自然界で観察されない形態となっているポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベク
ター、細胞又は組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベク
ター、細胞又は組成物はそれらが自然界で観察される形態にはそれらがもはやなりえない
程度にまで精製されているものを包含する。一部の実施形態においては、単離された抗体
、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は実質的に純粋である。
本明細書において使用する場合、「実質的に純粋」とは少なくとも５０％純粋（即ち夾
雑物が存在しない）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％
純粋、少なくとも９９％純粋である物質を指す。
「イムノコンジュゲート」又は「コンジュゲート」という用語は本明細書において使用
する場合、細胞結合剤（即ち抗ＦＯＬＲ１抗体又はそのフラグメント）に連結された化合
物又はその誘導体を指し、そして包括的な式：Ｃ−Ｌ−Ａにより定義され、式中、Ｃ＝細
胞傷害物質、Ｌ＝リンカー、そしてＡ＝細胞結合剤又は抗ＦＯＬＲ１抗体又は抗体フラグ
メントである。イムノコンジュゲートは又、逆順序の包括的な式：Ａ−Ｌ−Ｃによっても
定義できる。
「リンカー」とは安定な共有結合の態様において抗ＦＯＬＲ１抗体又はそのフラグメン
トのような細胞結合剤に、通常はマイタンシノイドのような薬物を連結することができる
何れかの化学的部分である。リンカーは化合物又は抗体が活性であり続けられる条件にお
いて、酸誘導切断、光誘導切断、ペプチダーゼ誘導切断、エステラーゼ誘導切断、及びジ
スルフィド結合切断に対して感受性であるか、又は実質的に抵抗性であることができる。
適当なリンカーは当該分野で良く知られており、そして例えばジスルフィド基、チオエー
テル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基及びエステラーゼ不安定基を包
含する。リンカーは又本明細書に記載する、そして当該分野で知られている荷電リンカー
、及びその親水性形態を包含する。
「癌」及び「癌性の」という用語は細胞集団が制御不可能な細胞生育を特徴とする哺乳
類における生理学的状態を指すか、これを説明するものである。癌の例は癌腫、リンパ腫
、芽腫、肉腫、及び白血病を包含するがこれらに限定されない。そのような癌のより特定
的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の
癌。肝細胞癌、胃腸の癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘ
パトーマ、乳癌、結腸癌結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、
前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、及び種々の型の頭頚部の癌を包含する。
「腫瘍」及び「新生物」は前癌患部を包含する良性（非癌性）又は悪性（癌性）の何れか
の過剰な細胞の生育又は増殖に起因する組織の何れかの塊を指す。
「癌細胞」、「腫瘍細胞」という用語及び文法的等価表現は、腫瘍細胞集団の塊状物を
含む非腫瘍形成性細胞及び腫瘍形成性幹細胞（癌幹細胞）の両方を包含する腫瘍又は前癌
性の患部から誘導された細胞の総集団を指す。本明細書において使用する場合、「腫瘍細
胞」という用語は、癌幹細胞からそれらの腫瘍細胞を区別できるように更新及び分化する
能力を欠いている腫瘍細胞のみを指す場合には、「非腫瘍形成性」という用語により修飾
されることになる。
「対象」という用語は、特定の治療のレシピエントとなるべきヒト、非ヒト霊長類、げ
っ歯類等を包含するがこれらに限定されない何れかの動物（例えば哺乳類）を指す。典型
的には、「対象」及び「患者」という用語は、ヒト対象に言及する場合には本明細書にお
いては互換的に使用される。
１つ以上の他の治療剤「と組み合わせた」投与とは、同時（並行）及び何れかの順序に
おける連続投与を包含する。
「医薬品製剤」という用語は活性成分の生物学的活性を有効とする形態にあり、そして
、製剤を投与する対象に対して許容できない程度毒性である追加的成分を含有しない調製
物を指す。そのような製剤は滅菌されることができる。
本明細書に開示する抗体の「有効量」とは特に記載された目的を実施するために十分な
量である。「有効量」は記載された目的に関連して、実験的に、そして定型的な態様にお
いて決定できる。
「治療有効量」という用語は対象又は哺乳類における疾患又は障害を「治療」するため
に有効な抗体又は他の薬物の量を指す。癌の場合は、薬物の治療有効量は癌細胞の数を低
減し；腫瘍の大きさを低減し；周辺臓器内部への癌細胞の浸潤を阻害し（即ちある程度ま
で緩徐化、そして特定の実施形態においては停止させ）；腫瘍の転移を阻害し（即ちある
程度まで緩徐化、そして特定の実施形態においては停止させ）；腫瘍の生育をある程度ま
で阻害し；及び／又は癌に関連する症状の１つ以上をある程度まで緩和することができる
。本明細書における「治療すること」の定義を参照できる。薬物が既存の癌細胞の生育を
防止できる限り、それらは細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であることができる。「
予防有効量」とは所望の予防結果を達成するために、必要な投薬量において必要な期間に
渡り、有効な量を指す。必然的にではないが典型的には、予防用量は疾患の前、又は早期
の段階において対象において使用されるため、予防有効量は治療有効量より低値となる。
「標識」という用語は本明細書において使用する場合、「標識された」抗体を形成する
べく抗体に直接又は間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物又は組成物を指す。
「標識はそれ自体検出されることができる（例えば放射性同位体標識又は蛍光標識）か、
又は、酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒すること
ができる。
「化学療法剤」とは作用機序に関わらず、癌の治療において有用な化学的化合物である
。化学療法剤のクラスはアルキル化剤、代謝拮抗剤、紡錘毒植物アルカロイド、細胞傷害
／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、抗体、光感作剤、及びキナーゼ阻害剤を包
含するがこれらに限定されない。化学療法剤は「ターゲティング治療」及び従来の化学療
法で使用される化合物を包含する。
「治療すること」又は「治療」又は「治療するため」又は「軽減すること」又は「軽減
するため」等の用語は、１）診断された病理学的状態又は障害の症状の治癒、緩徐化、減
少、及び／又は進行の停止を行う治療手段、及び２）ターゲティングされた病理学的状態
又は障害の発症を防止及び／又は緩徐化する予防的又は防止的な手段の両方を指す。即ち
、治療を必要とするものは、障害を既に有する者；障害を有し易い者；及び障害を防止す
べき者を包含する。特定の実施形態においては、対象は患者が以下：癌細胞の数の減少又
は完全な非存在；腫瘍の大きさの低減；例えば軟組織及び骨内部への癌の拡張を包含する
周辺臓器内部への癌細胞の浸潤の阻害又は非存在；腫瘍転移の阻害又は非存在；腫瘍生育
の阻害又は非存在；特定の癌に関連する症状１つ以上の緩解；罹患率及び死亡率の低減；
クオリティーオブライフの向上；腫瘍の腫瘍形成性、腫瘍形成頻度、又は腫瘍形成能力の
低減；腫瘍中の癌幹細胞の数又は頻度の低減；腫瘍形成性細胞の非腫瘍形成性状態への分
化；又は作用の何らかの組み合わせの１つ以上を呈する場合に本発明の方法に従って癌に
関して良好に「治療される。
本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、何れか
の長さのヌクレオチドの重合体を指し、そしてＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ヌクレオチ
ドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、
及び／又はそれらの類縁体、又はＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼにより重合体内に取り込
まれることができる何れかの基質であることができる。ポリヌクレオチドは修飾されたヌ
クレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類縁体を含むことができる。存在
する場合、ヌクレオチド構造の修飾は重合体の組み立ての前又は後に行うことができる。
ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていることができる。ポリヌク
レオチドは重合の後に、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより更に修飾されるこ
とができる。他の型の修飾は、例えば「キャップ」、天然に存在するヌクレオチド１つ以
上の類縁体による置換、ヌクレオチド間修飾、例えば未荷電連結部（例えばメチルホスホ
ネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カーバメート等）及び荷電連結部（例
えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、例えば蛋白のような
懸垂部分を含有するもの（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−
Ｌ−リジン等）、インターカレーターを有する者（例えばアクリジン、ソラレン等）、キ
レート形成剤を含有するもの（例えば金属、放射活性金属、ホウ素、酸化性金属等）、ア
ルキル化剤を含有するもの、修飾された連結部を有するもの（例えばアルファアノマー核
酸等）並びにポリヌクレオチドの未修飾の形態を包含する。更に又、糖に元から存在する
ヒドロキシル基の何れかを例えばホスホネート基、ホスフェート基で置き換えるか、標準
的な保護基で保護するか、又は活性化して別のヌクレオチドへの別の連結部を調製するこ
とができ、又は固体支持体にコンジュゲートすることができる。５’及び３’末端のＯＨ
はホスホリル化するか、又は、アミン又は炭素原子１〜２０個の有機キャッピング基部分
で置換することができる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化すること
ができる。ポリヌクレオチドは又、当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキ
シリボースの糖の類縁体型、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フル
オロ−又は２’−アジド−リボース、カルボキシル糖類縁体、アルファアノマー型糖、エ
ピマー型糖、例えばアラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノー
ス糖、セドヘプツロース、非環式類縁体及び無塩基のヌクレオシド類縁体、例えばメチル
リボーシドを含有できる。１つ以上のホスホジエステル連結部を代替の連結基で置き換え
ることができる。このような代替の連結基はホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、
Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ
’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）である実施形態を包含するがこれらに限定され
ず、式中各々のＲ又はＲ’は独立してＨ又は置換又は未置換の場合によりエーテル（−Ｏ
−）連結部を含有するアルキル（１−２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル
、シクロアルケニル又はアラルキルである。ポリヌクレオチド中の全ての連結部が必ずし
も同一である必要はない。以上の記載はＲＮＡ及びＤＮＡを包含する本明細書において言
及する全てのポリヌクレオチドに適用される。
「ベクター」という用語は宿主細胞中に１つ以上の遺伝子又は配列を送達及び発現する
ことができるコンストラクトを意味する。ベクターの例はウィルスベクター、ネイキッド
ＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン
性縮合剤に会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内にカプセル化されたＤ
ＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及び特定の真核生物の細胞、例えばプロデューサー細胞を
包含するがこれらに限定されない。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白」という用語は本明細書においては何れか
の長さのアミノ酸の重合体を指すために互換的に使用される。重合体は直鎖又は分枝鎖で
あることができ、修飾されたアミノ酸を含むことができ、そして非アミノ酸により中断さ
れることができる。用語は又、天然に、又は介入、例えばジスルフィド結合形成、グリコ
シル化、脂質化、アセチル化、ホスホリル化、又は他の何れかの操作又は修飾、例えば標
識成分とのコンジュゲーションにより修飾されているアミノ酸重合体を包含する。同様に
包含されるものは、例えばアミノ酸の類縁体１つ以上（例えば非天然のアミノ酸等を包含
）並びに他の当該分野で知られている修飾を含有するポリペプチドである。本発明のポリ
ペプチドは抗体に基づいているため、特定の実施形態においては、ポリペプチドは単鎖又
は会合している鎖として存在することができる。
２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈における「同一」又はパーセント「同一性」と
いう用語は、配列同一性の部分として如何なる保存的アミノ酸置換も考慮しない場合に、
最大相応が得られるように比較してアライン（必要に応じてギャップを導入）した場合に
、同じであるか、又は同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージ
を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。パーセント同一性は配列比較ソフトウエア
又はアルゴリズムを用いながら、又は目視による検査により計測できる。アミノ酸又はヌ
クレオチド配列のアライメントを得るために使用できる種々のアルゴリズム及びソフトウ
エアが当該分野で知られている。そのような配列アライメントアルゴリズムの非限定的な
例は、Karlin等、1993,Proc.Natl.Acad. Sci.,90:5873-5877により変更され、ＮＢＬ
ＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム(Altschul等、1991,Nucleic Acids Res., 25:3389-34
02)に組み込まれたKarlin等、1990,Proc.Natl.Acad. Sci.,87:2264-2268に記載されて
いるアルゴリズムである。特定の実施形態においてはＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをAltsch
ul等、1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402に記載の通り使用できる。ＢＬＡＳＴ−２
、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ (Altschul等、1996, Methodsin Enzymology, 266:460-480)、Ａ
ＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２(Genentech,SouthSan Francisco,California)又はＭｅｇａ
ｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は配列をアラインするために使用できる別の好適に入手でき
るソフトウエアプログラムである。特定の実施形態においては、２つのヌクレオチド配列
の間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウエアにおけるＧＡＰプログラムを用いながら
（例えばＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及びギャップウエイト４０、５０、６
０、７０又は９０及びレングスウエイト１、２、３、４、５及び６を用いながら）求めら
れる。特定の代替の実施形態においては、NeedlemanandWunsch(J.Mol. Biol. (48):444-4
53 (1970))のアルゴリズムを組み込んだＧＣＧソフトウエアパッケージにおけるＧＡ
Ｐプログラムを用いることにより２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性を求めるこ
とができる（例えばＢｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス及び
ギャップウエイト１６、１４、１２、１０、８、６又は４及びレングスウエイト１、２、
３、４、５を用いる）。あるいは特定の実施形態においては、ヌクレオチド又はアミノ酸
配列の間のパーセント同一性はMyersandMiller(CABIOS,4:11-17 (1989))のアルゴリズ
ムを用いながら求める。例えばパーセント同一性はＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２
．０）を用いながら、そして、残基表を伴ったＰＡＭ１２０、ギャップレングスペナルテ
ィー１２及びギャップペナルティー４を用いながら、求めることができる。特定のアライ
メントソフトウエアによる最大のアライメントのための適切なパラメーターは当業者が決
定できる。特定の実施形態においては、アライメントソフトウエアのデフォルトパラメー
ターを使用する。特定の実施形態においては、第１のアミノ酸配列の第２の配列に対する
パーセンテージ同一性「Ｘ」は１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは第１及び
第２の配列のアライメント（目視検査によるか特定の配列アライメントプログラムにより
アラインした場合）における同一マッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、そし
てＺは第２の配列中の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列より長い場合、
第２の配列に対する第１の配列のパーセント同一性は第１の配列に対する第２の配列のパ
ーセント同一性より長くなることになる。
非限定的な例として、何れかの特定のポリヌクレオチドが、レファレンス配列に対して
特定のパーセント配列同一性を有する（例えば少なくとも８０％同一、少なくとも８５％
同一、少なくとも９０％同一、そして一部の実施形態においては少なくとも９５％、９６
％、９７％、９８％、又は９９％同一）かは、特定の実施形態においては、Ｂｅｓｔｆｉ
ｔプログラムを用いて測定できる（WisconsinSequenceAnalysisPackage, Version 8 for
Unix（登録商標）, GeneticsComputer Group,UniversityResearch Park, 575 ScienceDri
ve, Madison,WI 53711）。Ｆｅｓｔｆｉｔは２つの配列の間の相同性の最良セグメントを
見つけるためにSmithandWaterman,Advances inApplied Mathematics 2: 482 489 (1981)
のローカルホモロジーアルゴリズムを使用している。Ｂｅｓｔｆｉｔ及び何れかの
他の配列アライメントプログラムを用いることにより本発明に従って特定の配列がレファ
レンス配列に対して例えば９５％同一であるかどうかを調べる場合、パラメーターは、同
一性のパーセンテージがレファレンスヌクレオチド配列の完全長に渡って計算されるよう
に、そしてレファレンス配列におけるヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギ
ャップが許容されるように設定する。
一部の実施形態においては、本発明の２つの核酸又はポリペプチドは、配列比較アルゴ
リズムを用いるか、又は目視検査により計測した場合に最大相応が得られるように比較し
てアラインした場合に、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少な
くとも８５％、少なくとも９０％、そして一部の実施形態においては少なくとも９５％、
９６％、９７％、９８％、又は９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する
ことを意味するべく、実質的に同一という。特定の実施形態においては、同一性は少なく
とも約１０、約２０、約４０〜６０残基長の、又はその間の何れかの整数値である配列の
領域に渡って、そして６０〜８０残基より長い領域、例えば少なくとも約９０〜１００残
基に渡って存在し、或いは、配列は例えばヌクレオチド配列のコドン領域のように、比較
される配列の完全長に渡って実質的に同一である。
「保存的アミノ酸置換」とは１つのアミノ酸残基が同様の側鎖を有する別のアミノ酸残
基で置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当
該分野で定義されており、例えば、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン
）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、未荷電極性側鎖（例えばアスパ
ラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例え
ばグリシン、アラニン、バアリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニ
ン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソ
ロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、ゲニルアラニン、トリプトファン、ヒスチ
ジン）を包含する。例えば、チロシンに対するフェニルアラニンの置換は保存的置換であ
る。特定の実施形態においては、本発明のポリペプチド及び抗体の配列における保存的置
換は、そのアミノ酸配列を含有するポリペプチド又は抗体の、ポリペプチド又は抗体が結
合する抗原、即ちＦＯＬＲ１への結合を消失させない。抗原結合を排除しないヌクレオチ
ド及びアミノ酸の保存的置換を識別するための方法は当該分野で良く知られている（例え
ばBrummell等、Biochem.32:1180-1187 (1993);Kobayashi等、Protein Eng. 12(10):879-8
84 (1999)；及びBurks等、Proc.Natl.Acad.Sci. USA94:.412-417 (1997)を参照）
。
本開示及び請求項において使用する場合、「ある〜」、そして「その〜」という単数標
記は、特段の記載が無い限り複数標記も包含するものとする。
「含む」という表現で実施形態を本明細書に記載する場合は常時、「よりなる」及び／
又は「より本質的になる」と言う用語において説明する別様の類似の実施形態も提供され
るものと理解しなければならない。
本明細書において「Ａ及び／又はＢ」等のフレーズにおいて使用する場合の「及び／又
は」という用語は「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」及び「Ｂ」の何れをも包含するこ
とを意図している。同様に「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」というフレーズにおいて使用する場合
の「及び／又は」という用語は、以下の実施形態：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又は
Ｃ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ」；Ａｏｙｏｂｉ Ｂ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（
単独）；及びＣ（単独）の各々を包含することを意図している。
ＩＩ．ＦＯＬＲ１結合剤
本発明はヒトＦＯＬＲ１に特異的に結合する剤を提供する。これらの剤は本明細書にお
いては、「ＦＯＬＲ１結合剤」と称する。ＦＯＬＲ１に関する完全長アミノ酸（ａａ）及
びヌクレオチド（ｎｔ）配列は当該分野で知られており、そしてそれぞれ配列番号２５及
び２６で示されるとおり、本明細書において提供される。
特定の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合剤は抗体、イムノコンジュゲート又はポリ
ペプチドである。一部の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合剤はヒト化抗体である。特
定の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合剤はネズミＭｏｖ１９抗体のヒト化バージョン
である（可変重鎖及び軽鎖は配列番号１７及び１８にそれぞれ示す）。
特定の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合剤は以下の作用、即ち：
腫瘍細胞の増殖の阻害、腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低減することによる腫瘍の腫瘍形
成性の低減、腫瘍生育の阻害、生存率の増大、腫瘍細胞の細胞死のトリガー、腫瘍形成性
細胞から非腫瘍形成性状態への分化、又は腫瘍細胞の転移の防止、の１つ以上を有する。
特定の実施形態においては、ヒトＦＯＬＲ１に特異的に結合するイムノコンジュゲート
又は他の剤は細胞傷害剤を介して細胞死をトリガーする。例えば、特定の実施形態におい
ては、ヒトＦＯＬＲ１抗体に対する抗体は、蛋白内在化によりＦＯＬＲ１を発現している
腫瘍細胞において活性化されるマイタンシノイドにコンジュゲートされる。特定の代替の
実施形態においては、剤又は抗体はコンジュゲートされない。
特定の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合剤は腫瘍生育を阻害することができる。特
定の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合剤はインビボで（例えば異種移植片マウスモデ
ル及び／又は癌を有するヒトにおいて）腫瘍生育を阻害することができる。特定の実施形
態においては、ＦＯＬＲ１結合剤はヒトにおける腫瘍の生育を阻害することができる。
即ち、本発明はヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗原結
合フラグメントを提供し、ここで抗体は以下：（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重
鎖ＣＤＲ１；ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸａａ１ＦＸａａ２Ｘａａ３（配列番号５６）
を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び
、（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＲＡＳＮ
ＬＥＡ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号９）を含
む軽鎖ＣＤＲ３；ただしここで、Ｘａａ１はＫ、Ｑ、Ｈ及びＲから選択され；Ｘａａ２は
Ｑ、Ｈ、Ｎ及びＲから選択され；そしてＸａａ３はＧ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ａ及びＶから選択さ
れるもの；を含む。特定の実施形態においては、抗体はＭｏｖ１９抗体であり、これは重
鎖ＣＤＲ２であるＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号２）を含む上記抗体で
ある。
特定の実施形態においては、本発明はＣＤＲ当たり４つまで（即ち０、１、２、３又は
４つ）の保存的アミノ酸置換を有するｈｕＭｏｖ１９のＣＤＲを含むＦＯＬＲ１に特異的
に結合するヒト化抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。即ち、特定の実施形態にお
いては、本発明は抗体が以下：（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１、又
は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮ
ＱＫＦＱＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸
置換を含むその変異体；及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３、又
は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及び／又は、（ｂ）ＫＡＳ
ＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ１、又は１、２、３又は４の
保存的アミノ酸置換を含むその変異体；ＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ
２、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及びＱＱＳＲＥＹＰ
ＹＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ３、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を
含むその変異体；を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はそ
の抗原結合フラグメントを提供する。
本発明は又、抗体が以下：（ａ）ＳＳＹＧＭＳ（配列番号３０）を含む重鎖ＣＤＲ１；
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹ（配列番号３１）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＤＧＥＧＧＬＹ
ＡＭＤＹ（配列番号３２）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は、（ｂ）ＫＡＳＤＨＩＮＮＷ
ＬＡ（配列番号２７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＧＡＴＳＬＥＴ（配列番号２８）を含む軽鎖
ＣＤＲ２；及びＱＱＹＷＳＴＰＦＴ（配列番号２９）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含む、ヒト
フォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体（ｈｕＦＲ１−２１）又はその抗原結
合フラグメントを提供する。
特定の実施形態においては、本発明はＣＤＲ当たり４つまで（即ち０、１、２、３又は
４つ）の保存的アミノ酸置換を有するｈｕＦＲ１−２１のＣＤＲを含むＦＯＬＲ１に特異
的に結合するヒト化抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。即ち、特定の実施形態に
おいては、本発明は抗体が以下：（ａ）ＳＳＹＧＭＳ（配列番号３０）を含む重鎖ＣＤＲ
１、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；ＴＩＳＳＧＧＳＹＴ
Ｙ（配列番号３１）を含む重鎖ＣＤＲ２、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を
含むその変異体；及びＤＧＥＧＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を含む重鎖ＣＤＲ３、又
は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及び／又は、（ｂ）ＫＡＳ
ＤＨＩＮＮＷＬＡ（配列番号２７）を含む軽鎖ＣＤＲ１、又は１、２、３又は４の保存的
アミノ酸置換を含むその変異体；ＧＡＴＳＬＥＴ（配列番号２８）を含む軽鎖ＣＤＲ２、
又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及びＱＱＹＷＳＴＰＦＴ
（配列番号２９）を含む軽鎖ＣＤＲ３、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含
むその変異体；を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はその
抗原結合フラグメントを提供する。
特定の実施形態においては、本発明はＣＤＲ当たり４つまで（即ち０、１、２、３又は
４つ）の保存的アミノ酸置換を有するｈｕＦＲ１−４８のＣＤＲを含むＦＯＬＲ１に特異
的に結合するヒト化抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。即ち、特定の実施形態に
おいては、本発明は抗体が以下：（ａ）ＴＮＹＷＭＱ（配列番号６０）を含む重鎖ＣＤＲ
１、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；ＡＩＹＰＧＮＧＤＳ
Ｒ（配列番号６１）を含む重鎖ＣＤＲ２、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を
含むその変異体；及びＲＤＧＮＹＡＡＹ（配列番号６２）を含む重鎖ＣＤＲ３、又は１、
２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及び／又は、（ｂ）ＲＡＳＥＮＩ
ＹＳＮＬＡ（配列番号５７）を含む軽鎖ＣＤＲ１、又は１、２、３又は４の保存的アミノ
酸置換を含むその変異体；ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号５８）を含む軽鎖ＣＤＲ２、又は１
、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及びＱＨＦＷＡＳＰＹＴ（配列
番号５９）を含む軽鎖ＣＤＲ３、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその
変異体；を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗原結
合フラグメントを提供する。
特定の実施形態においては、本発明はＣＤＲ当たり４つまで（即ち０、１、２、３又は
４つ）の保存的アミノ酸置換を有するｈｕＦＲ１−４９のＣＤＲを含むＦＯＬＲ１に特異
的に結合するヒト化抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。即ち、特定の実施形態に
おいては、本発明は抗体が以下：（ａ）ＴＮＹＷＭＹ（配列番号６６）を含む重鎖ＣＤＲ
１、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；ＡＩＹＰＧＮＳＤＴ
Ｔ（配列番号６７）を含む重鎖ＣＤＲ２、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を
含むその変異体；及びＲＨＤＹＧＡＭＤＹ（配列番号６８）を含む重鎖ＣＤＲ３、又は１
、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及び／又は、（ｂ）ＲＡＳＥＮ
ＩＹＴＮＬＡ（配列番号６３）を含む軽鎖ＣＤＲ１、又は１、２、３又は４の保存的アミ
ノ酸置換を含むその変異体；ＴＡＳＮＬＡＤ（配列番号６４）を含む軽鎖ＣＤＲ２、又は
１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及びＱＨＦＷＶＳＰＹＴ（配
列番号６５）を含む軽鎖ＣＤＲ３、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むそ
の変異体；を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗原
結合フラグメントを提供する。
特定の実施形態においては、本発明はＣＤＲ当たり４つまで（即ち０、１、２、３又は
４つ）の保存的アミノ酸置換を有するｈｕＦＲ１−５７のＣＤＲを含むＦＯＬＲ１に特異
的に結合するヒト化抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。即ち、特定の実施形態に
おいては、本発明は抗体が以下：（ａ）ＳＳＦＧＭＨ（配列番号７２）を含む重鎖ＣＤＲ
１、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；ＹＩＳＳＧＳＳＴＩ
Ｓ（配列番号７３）を含む重鎖ＣＤＲ２、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を
含むその変異体；及びＥＡＹＧＳＳＭＥＹ（配列番号７４）を含む重鎖ＣＤＲ３、又は１
、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及び／又は、（ｂ）ＲＡＳＱＮ
ＩＮＮＮＬＨ（配列番号６９）を含む軽鎖ＣＤＲ１、又は１、２、３又は４の保存的アミ
ノ酸置換を含むその変異体；ＹＶＳＱＳＶＳ（配列番号７０）を含む軽鎖ＣＤＲ２、又は
１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及びＱＱＳＮＳＷＰＨＹＴ（
配列番号７１）を含む軽鎖ＣＤＲ３、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含む
その変異体；を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗
原結合フラグメントを提供する。
特定の実施形態においては、本発明はＣＤＲ当たり４つまで（即ち０、１、２、３又は
４つ）の保存的アミノ酸置換を有するｈｕＦＲ１−６５のＣＤＲを含むＦＯＬＲ１に特異
的に結合するヒト化抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。即ち、特定の実施形態に
おいては、本発明は抗体が以下：（ａ）ＴＳＹＴＭＨ（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ
１、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；ＹＩＮＰＩＳＧＹＴ
Ｎ（配列番号７９）を含む重鎖ＣＤＲ２、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を
含むその変異体；及びＧＧＡＹＧＲＫＰＭＤＹ（配列番号８０）を含む重鎖ＣＤＲ３、又
は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及び／又は、（ｂ）ＫＡＳ
ＱＮＶＧＰＮＶＡ（配列番号７５）を含む軽鎖ＣＤＲ１、又は１、２、３又は４の保存的
アミノ酸置換を含むその変異体；ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号７６）を含む軽鎖ＣＤＲ２、
又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；及びＱＱＹＮＳＹＰＹＴ
（配列番号７７）を含む軽鎖ＣＤＲ３、又は１、２、３又は４の保存的アミノ酸置換を含
むその変異体；を含む、ヒトフォレート受容体１に特異的に結合するヒト化抗体又はその
抗原結合フラグメントを提供する。
本明細書に記載した個々の軽鎖又は重鎖の１つを含むポリペプチド、並びに軽鎖及び重
鎖の両方を含むポリペプチド（例えば抗体）も提供する。配列番号４及び６のポリペプチ
ドはそれぞれｈｕＭｏｖ１９の重鎖の可変ドメイン及びｈｕＭｏｖ１９の重鎖を含む。配
列番号１０〜１３のポリペプチドはそれぞれｈｕＭｏｖ１９の可変ドメイン軽鎖バージョ
ン１．００、可変ドメイン軽鎖バージョン１．６０、軽鎖バージョン１．００、及び軽鎖
バージョン１．６０を含む。配列番号４２及び４６のポリペプチドはそれぞれｈｕＦＲ１
−２１の重鎖の可変ドメイン及びｈｕＦＲ１−２１の重鎖を含む。配列番号４１及び４５
のポリペプチドはそれぞれｈｕＦＲ１−２１の可変ドメイン軽鎖及び軽鎖を含む。配列番
号９７及び１１３のポリペプチドはそれぞれｈｕＦＲ１−４８の重鎖の可変ドメイン及び
ｈｕＦＲ１−４８の重鎖を含む。配列番号９６及び１１２のポリペプチドはそれぞれｈｕ
ＦＲ１−４８の可変ドメイン軽鎖及び軽鎖を含む。配列番号９９及び１１５のポリペプチ
ドはそれぞれｈｕＦＲ１−４９の重鎖の可変ドメイン及びｈｕＦＲ１−４９の重鎖を含む
。配列番号９８及び１１４のポリペプチドはそれぞれｈｕＦＲ１−４９の可変ドメイン軽
鎖及び軽鎖を含む。配列番号１０１及び１１７のポリペプチドはそれぞれｈｕＦＲ１−５
７の重鎖の可変ドメイン及びｈｕＦＲ１−５７の重鎖を含む。配列番号１００及び１１６
のポリペプチドはそれぞれｈｕＦＲ１−５７の可変ドメイン軽鎖及び軽鎖を含む。配列番
号１０３及び１１９のポリペプチドはそれぞれｈｕＦＲ１−６５の重鎖の可変ドメイン及
びｈｕＦＲ１−６５の重鎖を含む。配列番号１０２及び１１８のポリペプチドはそれぞれ
ｈｕＦＲ１−６５の可変ドメイン軽鎖及び軽鎖を含む。
同様に提供されるものは、（ａ）配列番号４又は６に少なくとも約９０％の配列同一性
を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号１０〜１３に少なくとも約９０％の配
列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチドである。同様に提供されるものは、（
ａ）配列番号４２又は４６に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及
び／又は（ｂ）配列番号４１及び４５に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペ
プチドを含むポリペプチドである。同様に提供されるものは、（ａ）配列番号９７又は１
１３に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番
号９６及び１１２に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペ
プチドである。同様に提供されるものは、（ａ）配列番号９９又は１１５に少なくとも約
９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号９８及び１１４に
少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチドである。同様
に提供されるものは、（ａ）配列番号１０１又は１１７に少なくとも約９０％の配列同一
性を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号１００及び１１６に少なくとも約９
０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチドである。同様に提供されるも
のは、（ａ）配列番号１０３又は１１９に少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリ
ペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号１０２及び１１８に少なくとも約９０％の配列同一
性を有するポリペプチドを含むポリペプチドである。特定の実施形態においては、ポリペ
プチドは配列番号４、６、１０〜１３、４１、４２、４５又は４６に少なくとも約９５％
、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９
９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。即ち、特定の実施形態においては、ポリ
ペプチドは（ａ）配列番号４又は６に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプ
チド；及び／又は（ｂ）配列番号１０〜１３に少なくとも約９５％の配列同一性を有する
ポリペプチドを含む。特定の実施形態においては、ポリペプチドは（ａ）配列番号４２又
は４６に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列
番号４１及び４５に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。同様
に提供されるものは、（ａ）配列番号９７又は１１３に少なくとも約９５％の配列同一性
を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号９６及び１１２に少なくとも約９５％
の配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチドである。同様に提供されるものは
、（ａ）配列番号９９又は１１５に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチ
ド；及び／又は（ｂ）配列番号９８及び１１４に少なくとも約９５％の配列同一性を有す
るポリペプチドを含むポリペプチドである。同様に提供されるものは、（ａ）配列番号１
０１又は１１７に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又は（
ｂ）配列番号１００及び１１６に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド
を含むポリペプチドである。同様に提供されるものは、（ａ）配列番号１０３又は１１９
に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号１
０２及び１１８に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプ
チドである。特定の実施形態においては、ポリペプチドは（ａ）配列番号４のアミノ酸配
列を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配
列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態においては、ポリペプチドは（ａ）配列
番号４５のアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号４６のアミノ
酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態においては、ポリペプチドは（ａ）
配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号１２又は配
列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態においては、ポ
リペプチドはヒトフォレート受容体１に特異的に結合する抗体及び／又はポリペプチドで
ある。特定の実施形態においては、ポリペプチドはヒトフォレート受容体１に特異的に結
合するヒト化抗体である。例えば、本発明は（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド；及び（ｂ）配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを含むヒトＦＯＬＲ１に特異的に結合する抗体又はヒト化抗体を提供する。特定の実
施形態においては、配列番号４を含むポリペプチドは重鎖可変領域である。特定の実施形
態においては、配列番号１０又は１１を含むポリペプチドは軽鎖可変領域である。本発明
は又、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番
号１２又は配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むヒトＦＯＬＲ１に特
異的に結合する抗体又はヒト化抗体を提供する。本発明は又、（ａ）配列番号４５のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを含むヒトＦＯＬＲ１に特異的に結合する抗体又はヒト化抗体を提供する。
本発明は又、（ａ）配列番号１１２のアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び／又は（
ｂ）配列番号１１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むヒトＦＯＬＲ１に特異的
に結合する抗体又はヒト化抗体を提供する。本発明は又、（ａ）配列番号１１４のアミノ
酸配列を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号１１５のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを含むヒトＦＯＬＲ１に特異的に結合する抗体又はヒト化抗体を提供する。
本発明は又、（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び／又は（
ｂ）配列番号１１７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むヒトＦＯＬＲ１に特異的
に結合する抗体又はヒト化抗体を提供する。本発明は又、（ａ）配列番号１１８のアミノ
酸配列を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号１１９のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを含むヒトＦＯＬＲ１に特異的に結合する抗体又はヒト化抗体を提供する。
特定の実施形態においては、配列番号４、６、１０〜１３、４１、４２、４５、４６、９
６〜１０３及び１１２〜１１９に対して特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリ
ペプチドと、配列番号４、６、１０〜１３、４１、４２、４５、４６、９６〜１０３及び
１１２〜１１９との相違点は保存的アミノ酸置換のみである。
特定の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合剤はｈｕＭｏｖ１９、ＦＲ−１−２１、Ｆ
Ｒ１−４８、ＦＲ１−４９、ＦＲ１−５７、及びＦＲ１−６５抗体よりなる群から選択さ
れる抗ＦＯＬＲ１抗体を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。
特定の実施形態においては、ｈｕＭｏｖ１９抗体は２０１０年４月７日にＡｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、そし
てＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７２及びＰＴＡ−１０７７３又は１０７７４を有する
プラスミドによりコードされる。
特定の実施形態においては、ＦＲ−１−２１抗体は２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄
託され、そしてＡＴＣＣ受託番号番号ＰＴＡ−１０７７５及びＰＴＡ−１０７７６を有す
るプラスミドによりコードされる。
特定の実施形態においては、ヒト化抗体は抗体キメラＭｏｖ１９と実質的に同じ親和性
でＦＯＬＲ１に結合する。抗原に対する抗体の親和性又はアビディティーは当該分野で良
く知られている何れかの適当な方法、例えばフローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は動態分析（例えばＢ
ＩＡＣＯＲＥＴＭ分析）を用いながら実験的に測定できる。直接の結合アッセイ並びに競
合的結合アッセイのフォーマットを容易に使用できる。（例えばBerzofsky等、"Antibody
-AntigenInteractions,"InFundamentalImmunology,Paul, W. E., 編、Raven Press: New
York, N.Y. (1984);Kuby,JanisImmunology, W. H.Freeman and Company: New York,
N.Y. (1992);及び本明細書に記載した方法を参照）。特定の抗体−抗原相互作用の計測
される親和性は異なる条件下（例えば塩濃度、ｐＨ、温度）で計測されれば変動する場合
がある。即ち、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えばＫＤ又はＫｄ、Ｋｏｎ，Ｋ
ｏｆｆ）の計測は抗体及び抗原の標準溶液、及び当該分野で知られている、そして本明細
書に記載した緩衝液のような標準的な緩衝液を用いて行われる。
１つの側面において、結合アッセイは表面にＦＯＬＲ１抗原を発現している細胞に対し
てフローサイトメトリーを用いながら実施できる。例えば、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液
（２％正常ヤギ血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）中試料当たり１ｘ１０５細胞と
しながら種々の濃度の抗ＦＯＬＲ１抗体と共にＳＫＯＶ３のようなＦＯＬＲ１陽性細胞を
インキュベートした。次に、細胞をペレット化し、洗浄し、そして１００μＬのＦＩＴＣ
コンジュゲートヤギ抗マウス又はヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（例えばＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙから入手可能なもの、ＦＡＣＳ緩衝液中６μｇ／ｍｌ）と共に１時間イン
キュベートした。細胞を再度ペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、そして１％ホルム
アルデヒド含有ＰＢＳ２００μＬ中に再懸濁した。試料は、例えばＨＴＳマルチウエルサ
ンプラーを用いたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーを用いながら獲得し、そ
してＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏを用いて分析した（全ての入手元：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＵＳ）。各試料につき、ＦＬ１に関する平均蛍光強度（
ＭＦＩ）をエキスポートし、そして片対数プロットで抗体濃度に対してプロットすること
により、結合曲線を作成した。ジグモイド型の用量応答曲線を結合曲線に対してフィット
させ、そしてデフォルトパラメーターを用いながらＧｒａｐｈＰａｄのＰｒｉｓｍのｖ４
（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のようなプログラ
ムを用いてＥＣ５０を計算する。ＥＣ５０値は各抗体に関する見かけの解離定数「Ｋｄ」
又は「ＫＤ」の尺度として使用できる。
モノクローナル抗体はハイブリドーマ法、例えばKohler and Milstein (1975)Nature 2
56:495に記載のものを用いながら調製できる。ハイブリドーマ法を用いながら、マウス、
ハムスター又は他の適切な宿主動物を上記した通り免疫化することにより免疫化抗原に特
異的に結合するすることになる抗体のリンパ球による生産を誘発する。リンパ球はインビ
トロで免疫化することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、そして例えばポリエチ
レングリコールを用いながら適当なミエローマ細胞系統と融合することによりハイブリド
ーマを形成し、これを次に未融合のリンパ球及びミエローマ細胞から選別する。免疫沈降
、イムノブロッティングによるか、又はインビトロの結合試験（例えばラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）；酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ））により決定される選択された抗
原に対して特異的に指向されたモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、その後
、インビトロの培養で標準的な方法を用いながら（Goding,MonoclonalAntibodies:Princi
plesand Practice, AcademicPress, 1986）又はインビボで動物中の腹水腫瘍として増
殖され得る。次にモノクローナル抗体は、上記においてポリクローナル抗体に関して説明
したとおり、培地又は腹水から精製されえる。
或いは、モノクローナル抗体は又、米国特許４，８１６，５６７に記載の通り組み換え
ＤＮＡ法を用いて作成することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオ
チドを、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチド
プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ等により成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマから単離し、そ
してその配列を従来の操作法を用いながら決定する。次に重鎖及び軽鎖をコードする単離
されたポリヌクレオチドを適当な発現ベクター内にクローニングし、そしてこれが、別様
には免疫グロブリン蛋白を生産しないＥ・コリ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハム
スター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞のような宿主細胞内にトランスフェクト
された場合に、モノクローナル抗体が宿主細胞により形成される。更に又、所望の種の組
み換えモノクローナル抗体又はそのフラグメントは記載された所望の種のＣＤＲを発現す
るファージディスプレイライブラリから単離で切る（McCafferty等、1990,Nature,348:55
2-554;Clackson等、1991,Nature,352:624-628；及びMarks等、1991, J. Mol.Biol.,
222:581-597）。
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは更に、組み換えＤＮＡ技術を用い
ながら多くの種々異なる態様において修飾することにより代替の抗体を形成することがで
きる。一部の実施形態においては、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定
常ドメインを、１）キメラ抗体を形成するために例えばヒト抗体のこれらの領域に対して
、又は２）融合抗体を形成するために非免疫グロブリンポリペプチドに対して、置換する
ことができる。一部の実施形態においては、定常領域をトランケーションするか除去する
ことにより、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを形成する。可変領域の部位
指向性又は高密度の突然変異誘発を用いることによりモノクローナル抗体の特異性、親和
性等を最適化することができる。
一部の実施形態においては、ヒトＦＯＬＲ１に対するモノクローナル抗体はヒト化抗体
である。特定の実施形態においては、そのような抗体を治療上使用することにより、ヒト
対象への投与時の抗原性及びＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答を低減する。
非ヒト及びヒト抗体を操作、ヒト化又はリサーフィシングするための方法もまた使用で
き、そして当該分野で良く知られている。ヒト化、リサーフィシング、又は同様に操作さ
れた抗体は、非ヒト、例えば限定しないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又は
他の哺乳類である原料に由来するアミノ酸残基１つ以上を有することができる。これらの
非ヒトアミノ酸残基は、既知のヒト配列の「インポート」可変、定常又は他のドメインか
ら典型的には取り出される「インポート」残基としばしば称される残基により置き換えら
れる。
このようなインポートされた配列は免疫原性を低減するため、又は、結合、親和性、オ
ンレート、イフレート、アビディティ、特異性、半減期、又は当該分野で知られている何
れかの他の適当な特性を低減、増強又は変調するために使用できる。一般的に、ＣＤＲ残
基は、ＦＯＬＲ１結合への影響においては、直接、そして最も実質的に関与している。従
って、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全部が維持されつつ、可変及び定常領域の非
ヒト配列がヒト又は他のアミノ酸により置き換えられることができる。
抗体は又、場合により、抗原ＦＯＬＲ１に対する高親和性、及びその他の望ましい生物
学的特性を保持するように操作されたヒト化、リサーフィシング、操作又はヒト抗体であ
ることができる。この目的を達成するために、親、操作及びヒト化配列の３次元モデルを
用いた親配列及び種々の概念的なヒト化及び操作産物の分析の過程により、ヒト化（又は
ヒト）又は操作抗ＦＯＬＲ１抗体及びリサーフィシング抗体を場合により調製することが
できる。３次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、そして当該分野で良く
知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される３次元コンホーメーショ
ン構造を図示標示するコンピュータープログラムを使用できる。これらのディスプレイの
検討により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、即ち
、候補免疫グロブリンがＦＯＬＲ１のような自身の抗原に結合する能力に影響する残基の
分析が可能になる。このようにして、フレームワーク（ＦＲ）残基を選択肢、コンセンサ
ス及びインポート配列とから組み合わせることにより、標的抗原に対する増大した親和性
のような所望の抗体特性を達成する。
本発明の抗体のヒト化、リサーフィシング又は操作は、何れかの知られた方法、例えば
限定しないがWinter(Jones等、Nature321:522(1986);Riechmann等、Nature 332:323(1988
); Verhoeyen等、Science239:1534(1988)),Sims等、J.Immunol. 151: 2296(1993);Chothi
a and Lesk, J. Mol. Biol.196:901(1987), Carter等、Proc.Natl. Acad. Sci.U.S.A.
89:4285 (1992); Presta等、J.Immunol.151:2623(1993), 米国特許５，６３９
，６４１，５，７２３，３２３；５，９７６，８６２；５，８２４，５１４；５，８１７
，４８３；５，８１４，４７６；５，７６３，１９２；５，７２３，３２３；５，７６６
，８８６；５，７１４，３５２；６，２０４，０２３；６，１８０，３７０；５，６９３
，７６２；５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，２２５，５３９；４，８１６
，５６７；ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０；ＵＳ９６／１８９７８；ＵＳ９１／０９６
３０；ＵＳ９１／０５９３９；ＵＳ９４／０１２３４；ＧＢ８９／０１３３４；ＧＢ９１
／０１１３４；ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３；ＷＯ９０／１４４２４；
ＷＯ９０／１４４３０；ＥＰ２２９２４６；７，５５７，１８９；７，５３８，１９５；
及び７，３４２，１１０号に記載されているものを用いて実施でき、これらの各々はその
引用文献を含めて参照により全体が本明細書に組み込まれる。
特定の代替の実施形態においては、ＦＯＬＲ１に対する抗体はヒト抗体である。ヒト抗
体は当該分野で知られている種々の手法を用いながら直接調製することができる。インビ
トロで免疫化された、又は標的抗原に対して指向された抗体を生産する免疫化個体から単
離された不朽化ヒトＢリンパ球を形成できる（例えばCole等、MonoclonalAntibodiesand
CancerTherapy, Alan R. Liss, p. 77(1985); Boemer等、1991,J.Immunol.,147(1):86-95
;及び米国特許５，７５０，３７３参照）。更に又、ヒト抗体は例えばVaughan等、1996,N
at.Biotech.,14:309-314,Sheets等、1998,Proc. Nat’l. Acad. Sci.,95:6157-6162,Hoog
enboom andWinter,1991, J.Mol. Biol., 227:381, and Marks等、1991,J.Mol.Biol.,222:
581に記載のように、ファージライブラリがヒト抗体を発現するそのファージライブラリ
から選択できる。抗体ファージライブラリの形成及び使用のための手法は又、米国特許５
，９６９，１０８，６，１７２，１９７，５，８８５，７９３，６，５２１，４０４；６
，５４４，７３１；６，５５５，３１３；６，５８２，９１５；６，５９３，０８１；６
，３００，０６４；６，６５３，０６８；６，７０６，４８４；及び７，２６４，９６３
;及びRothe等、2007,J.Mol.Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018にも記載され
ている（これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。アフィニティー成
熟法及び鎖シャフリング法（Marks等、1992,Bio/Technology10:779-783；参照に
より全体が本明細書に組み込まれる）が当該分野で知られており、そして高親和性のヒト
抗体を形成するために使用できる。
ヒト化抗体は又、内因性免疫グロブリン生産の非存在下でヒト抗体の完全レパートリー
を生産することが免疫化により可能であるヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトラン
スジェニックマウスにおいて作成することができる。このアプローチは米国特許５，５４
５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３
３，４２５；及び５，６６１，０１６に記載されている。
本発明は又ヒトフォレート受容体１を特異的に認識する二重特異性抗体も包含する。
二重特異性抗体は少なくとも２つの異なるエピトープを特異的に認識して結合することが
できる抗体である。異なるエピトープは同じ分子（例えば同じヒトフォレート受容体１）
内、又は、例えば抗体がヒトフォレート受容体１、並びに、例えば、１）Ｔ細胞受容体（
例えばＣＤ３）又はＦｃ受容体（例えばＣＤ６４、ＣＤ３２又はＣＤ１６）のような白血
球上のエフェクター分子、又は２）後に詳述する細胞傷害剤を特異的に認識して結合する
両方の場合のように、異なる分子上にあることができる。
例示される二重特異性抗体は２つの異なるエピトープに結合することができ、その少な
くとも１つは本発明のポリペプチド中で生じる。或いは、免疫グロブリン分子の抗抗原性
アームは、Ｔ細胞受容体分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）又はＩｇＧに
対するＦｃ受容体のような白血球上のトリガリング分子に結合するアームと組み合わせる
ことにより特定の抗原を発現する細胞に細胞防御機序を集中させることができる。二重特
異性抗体は又特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害剤を指向させるために使用できる。こ
れらの抗体は抗原結合アーム及び細胞傷害剤又はＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ又は
ＴＥＴＡのような放射性各種キレート形成剤に結合するアームを保有している。二重特異
性抗体を作成するための手法は当該分野で一般的である（Millstein等、1983,Nature305:
537-539;Brennan等、1985, Science 229:81;Suresh等、 1986, MethodsinEnzymol.121:12
0;Traunecker等、1991, EMBOJ.10:3655-3659; Shalaby等、1992, J.Exp.Med.175:217-225
;Kostelny等、1992, J.Immunol. 148:1547-1553;Gruber等、1994,J.Immunol.
152:5368;及び米国特許５，７３１，１６８）。２価より高価の抗体もまた意図される。
例えば３重特異性抗体を調製できる（Tutt等、J.Immunol.147:60 (1991)）。即ち、特定
の実施形態においては、ＦＯＬＲ１に対する抗体は多重特異性である。
特定の実施形態においては、例えば腫瘍貫通性を増大させるための抗体フラグメントが
提供される。抗体フラグメントの生産のための種々の手法が知られている。伝統的にはこ
れらのフラグメントは未損傷の抗体の蛋白分解性の消化を介して誘導される（例えばMori
moto等、1993,JournalofBiochemical andBiophysical Methods 24:107-117;Brennan
等、1985, Science, 229:81）。特定の実施形態においては、抗体フラグメントは組み換
えにより生産される。Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ抗体フラグメントは全てＥ・コリ又は他
の宿主細胞中で発現され、これらより分泌されることができ、これによりこれらのフラグ
メントの大量の生産が可能となる。そのような抗体フラグメントは上記考察した抗体ファ
ージライブラリから単離することもできる。抗体フラグメントは又例えば米国特許５，６
４１，８７０に記載の通り線状抗体であることもでき、そして単一特異性又は二重特異性
であることができる。抗体フラグメントの生産のための他の手法は当業者の知る通りであ
る。
本発明によればヒトフォレート受容体１に特異的な単鎖抗体の生産のために手法を適合
させることができる（米国特許４，９４６，７７８参照）。更に又、方法をＦａｂ発現ラ
イブラリの構築（Huse,等、Science246:1275-1281(1989)）のために適合させることに
よりヒトフォレート受容体１に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグ
メント、その誘導体、フラグメント、類縁体又は相同体の迅速で効果的な識別が可能とな
る。抗体フラグメントは当該分野の手法により生産でき、例えば限定しないが（ａ）抗体
分子のペプシン消化により生産されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｂ）Ｆ（ａｂ’）
２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより形成されるＦａｂフラグメント
、（ｃ）パパイン及び還元剤による抗体分子の処理により形成されるＦａｂフラグメント
、及び（ｄ）Ｆｖフラグメントが包含されるがこれらに限定されない。
特に抗体フラグメントの場合は、その血清中半減期を増大させるために抗体を修飾する
ことが更に望ましい場合がある。これは例えば抗体フラグメントにおける適切な領域の突
然変異による抗体フラグメント内へのサルベージ受容体結合エピトープの取り込みにより
、又は、エピトープをペプチドタグ内に取り込み、次にこれを末端又は中央の何れかにお
いて抗体フラグメントに融合させること（例えばＤＮＡ又はペプチド合成による）により
達成できる。
ヘテロコンジュゲート抗体も又、本発明の範囲に包含される。ヘテロコンジュゲート抗
体は２つの共有結合的に連結された抗体より成る。そのような抗体は例えば望ましくない
細胞に免疫細胞をターゲティングするために提案されている（米国特許４，６７６，９８
０）。合成蛋白化学における知られた方法、例えば架橋剤を使用するものを用いながらイ
ンビトロで抗体を調整することが可能であることも意図している。例えば、ジスルフィド
交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構築するこ
とができる。この目的のための適当な試薬の例は、イミノチオレート及びメチル−４−メ
ルカプトブチルイミデートを包含する。
本発明の目的のためには、修飾された抗体はヒトＦＯＬＲ１のポリペプチドとの抗体の
会合をもたらす可変領域の何れかの型を含むことができることは当然である。この点に関
し、可変領域は、体液性応答を生じさせ、そして所望の腫瘍会合抗原に対する免疫グロブ
リンを発生させるように誘導することができる哺乳類の何れかの型を含むか、これから誘
導することができる。即ち、修飾された抗体の可変領域は例えば、ヒト、ネズミ、非ヒト
霊長類（例えばカニクイザル、マカク等）又はオオカミ起源のものであることができる。
一部の実施形態においては、修飾された免疫グロブリンの可変領域及び定常領域の両方が
ヒトのものである。他の実施形態において、適合性抗体（通常は非ヒト原料から誘導）の
可変領域を、操作又は特別調整することにより結合特性を向上させるか、又は分子の免疫
原性を低減することができる。この点に関し、本発明において有用な可変領域はヒト化さ
れるか、又は別様にインポートされたアミノ酸配列の包含を介して改変することができる
。
特定の実施形態においては、重鎖及び軽鎖の両方における可変ドメインはＣＤＲ１つ以
上の少なくとも部分的な置き換えにより、そして必要に応じて部分的なフレームワーク領
域の置き換え及び配列変化により、改変される。ＣＤＲはフレームワーク領域の誘導元の
抗体と同じクラス、更にはサブクラスの抗体から誘導できるが、異なるクラスの抗体から
、そして特定の実施形態においては異なる種に由来する抗体から、ＣＤＲを誘導すること
も意図される。ある可変ドメインの抗原結合能力を別のものに転移させるためにドナーの
可変領域由来の完全なＣＤＲでＣＤＲの全てを置き換えることが常時必要なわけではない
場合がある。寧ろ、一部の場合においては、抗原結合部位の活性を維持するために必要な
残基を転移させる必要があるのみの場合がある。米国特許５，５８５，０８９、５，６９
３，７６１及び５，６９３，７６２に記載されている説明によれば、これは、定型的な実
験を実施することによるか、又は、低減された免疫原性を有する機能的抗体を得るための
試行錯誤の試験を行うことにより、当業者の能力の範囲内で十分行える。
可変領域の改変にも関わらず、当業者の知る通り、本発明の修飾された抗体は、ネイテ
ィブ又は未改変の定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した場合に増強された腫
瘍局在化又は低減された血清中半減期のような所望の生化学的特性を提供できるように、
定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも部分が欠失又は別様に改変されている抗体（例
えば完全長抗体又はその免疫反応性フラグメント）を含むことになる。一部の実施形態に
おいては、修飾された抗体の定常領域はヒト定常領域を含むことになる。本発明と適合す
る定常領域への修飾は、１つ以上のドメインにおける１つ以上アミノ酸の付加、欠失又は
置換を含む。即ち、本明細書に開示された修飾された抗体は３つの重鎖定常ドメイン（Ｃ
Ｈ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の１つ以上に対する、及び／又は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に
対する改変又は修飾を含むことができる。一部の実施形態においては、１つ以上のドメイ
ンが部分的又は全体的に欠失している修飾された定常領域が意図される。一部の実施形態
においては、修飾された抗体は全ＣＨ２ドメインが除去されているドメイン欠失のコンス
トラクト又は変異体を含むことになる（ΔＣＨ２コンストラクト）。一部の実施形態にお
いては、省かれた定常領域ドメインは、非存在定常領域により典型的には付与される分子
柔軟性の一部を与える短いアミノ酸スペーサー（例えば１０残基）により置き換えられる
ことになる。
それらの配置の他に、定常領域は数種のエフェクター機能を媒介することも当該分野で
知られている。例えば抗体への補体のＣ１成分の結合は補体系を活性化させる。補体の活
性化は細胞病原体のオプソニン作用及び溶解において重要である。補体の活性化は又、炎
症応答を刺激し、そして自己免疫過敏症に関与する場合もある。更に又、抗体はＦｃ領域
を介して細胞に結合し、その際、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体Ｆｃ領域
上にＦｃ受容体部位がある。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イータ受容体）、ＩｇＡ
（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュウ受容体）を包含する抗体の種々異なるクラスに対
して特異的な多くのＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は多
くの重要で多様な生物学的応答、例えば抗体被覆粒子の囲い込みと破壊、免疫複合体のク
リアランス、抗体被覆標的細胞のキラー細胞による溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
、即ちＡＤＣＣと称される）、炎症メディエーターの放出、胎盤転移及び免疫グロブリン
生産の制御をトリガーする。
特定の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合抗体は改変されたエフェクター機能をもた
らし、次にこれが投与された抗体の生物学的プロファイルに影響する。例えば定常領域ド
メインの欠失又は不活性化（点突然変異又は他の手段を介する）は循環中の修飾された抗
体のＦｃ受容体結合を低減し、これにより腫瘍の局在化を増強することができる。他の例
においては、本発明と矛盾しない定常領域の修飾は補体結合を緩和し、そしてこれにより
血清中半減期及びコンジュゲートした細胞毒の非特異的会合を低減してよい。定常領域の
更に別の修飾は、増大した抗原特異性又は抗体柔軟性に起因する増強された局在化をもた
らすジスルフィド連結部又はオリゴ糖部分を排除するために使用できる。同様に、本発明
に従った定常領域の修飾は、当業者の知見の範囲内に十分含まれる良く知られた生化学的
又は分子操作の手法を用いながら容易に作成できる。
特定の実施形態においては、抗体であるＦＯＬＲ１結合剤は１つ以上のエフェクター機
能を有さない。例えば、一部の実施形態においては、抗体は抗体依存性細胞性細胞傷害（
ＡＤＣＣ）活性を有さず、及び／又は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有さない。
特定の実施形態においては、抗体はＦｃ受容体及び／又は補体因子に結合しない。特定の
実施形態においては、抗体はエフェクター機能を有さない。
特定の実施形態においては、修飾された抗体は、それぞれの修飾された抗体のヒンジ領
域に直接ＣＨ３ドメインを融合するように操作されることができることになる。別のコン
ストラクトにおいては、ヒンジ領域及び修飾されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインの間
にペプチドスペーサーを与えることが望ましい場合がある。例えば、適合性のあるコンス
トラクトはＣＨ２ドメインが欠失しており、そして残りのＣＨ３ドメイン（修飾又は未修
飾）が５〜２０アミノ酸スペーサーでヒンジ領域に連結されているように発現させること
ができる。そのようなスペーサーは例えば定常ドメインの調節エレメントが使用可能な状
態のままであること、又は、ヒンジ領域が柔軟性を維持していることを確保するために、
付加させることができる。しかしながら、アミノ酸スペーサーは一部の場合においては免
疫原性であることがわかっており、そしてコンストラクトに対する望ましくない免疫応答
を誘発することに留意しなければならない。したがって、特定の実施形態においては、コ
ンストラクトに付加された何れのスペーサーも、修飾された抗体の所望の生化学的品質を
維持するために比較的非免疫原性となるか、又は全体が省略されることになる。
全定常領域ドメインの欠失のほかに、当然ながら、本発明の抗体は数個、更には単一の
アミノ酸の部分的欠失又は置換により与えられる場合もある。例えば、ＣＨ２ドメインの
選択された区域内の単一のアミノ酸の突然変異がＦｃ結合を実質的に低減し、そしてこれ
により腫瘍局在化を増強するために十分であってよい。同様に修飾すべきエフェクター機
能（例えば補体Ｃ１Ｑ結合）を制御する定常領域ドメイン１つ以上の部分を単に欠失させ
ることが望ましい場合がある。そのような定常領域の部分的欠失は抗体の選択された特性
（血清中半減期）を向上させつつ、対象の定常領域ドメインに関連する他の所望の機能は
未損傷のままとすることができる。更に又、前述の通り、開示された抗体の定常領域は結
果として生じるコンストラクトのプロファイルを増強させる突然変異又はアミノ酸１つ以
上の置換を介して修飾できる。この点に関し、保存された結合部位により与えられる活性
（例えばＦｃ結合）を途絶しつつ、修飾された抗体の配置及び免疫原性プロファイルを実
質的に維持してよい。特定の実施形態は、エフェクター機能の低下又は上昇のような所望
の特性を増強するか、又はより多くの細胞毒又は炭水化物の結合を可能とするために、定
常領域へのアミノ酸１つ以上の付加を含むことができる。そのような実施形態において、
選択された定常領域ドメインから誘導される特定の配列を挿入又は複製することが望まし
い場合がある。
本発明は更に本明細書に記載したキメラ、ヒト化及びヒトの抗体又はその抗体フラグメ
ントに実質的に相同である変異体及び等価物を包含する。これらは例えば、保存的置換突
然変異、即ち、アミノ酸１つ以上の同様のアミノ酸による置換を含むことができる。例え
ば保存的置換はあるアミノ酸の同じ一般的クラス内の別のものによる、例えばある酸性ア
ミノ酸の別の酸性アミノ酸による
、ある塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸による、又は、ある中性アミノ酸の別の中性
アミノ酸による置換を指す。保存的アミノ酸置換が意図するものは当該分野で良く知られ
ている。
本発明のポリペプチドはヒトＦＯＬＲ１に対する抗体又はそのフラグメントを含む組み
換えポリペプチド、天然ポリペプチド、又は合成のポリペプチドであることができる。当
該分野で知られるとおり、本発明の一部のアミノ酸配列は蛋白の構造又は機能に大きく影
響することなく変動させることができる。即ち、本発明は更にヒトフォレート受容体蛋白
に対する抗体又はそのフラグメントの実質的な活性を示すか、又はその領域を含む、ポリ
ペプチドの変形例も包含する。そのような突然変異体は欠失、挿入、反転、反復及び型置
換を包含する。
ポリペプチド及び類縁体は更に、通常では蛋白の部分ではない追加的な化学部分を含有
するように修飾できる。これらの誘導体化された部分は蛋白の溶解性、生物学的半減期、
又は吸収を向上させることができる。部分は又、蛋白の何らかの望ましくない副作用等を
低減又は排除することもできる。これらの部分の概説はREMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIEN
CES,20th 編、MackPublishing Co.,Easton, PA (2000)に記載されている。
本明細書に記載する単離されたポリペプチドは当該分野で知られている何れかの適当な
方法により生産できる。そのような方法は直接の蛋白合成の方法から、単離されたポリペ
プチド配列をコードし、これらの配列を適当な形質転換宿主中で発現するＤＮＡ配列を構
築することまで様々である。一部の実施形態においてはＤＮＡ配列は目的の野生型蛋白を
コードするＤＮＡ配列を単離又は合成することにより組み換え技術を用いながら構築され
る。場合により、配列を部位特異的突然変異誘発により突然変異誘発することによりその
機能的類縁体を得ることができる。例えばZoeller等、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 81:566
2-5066 (1984) 及び米国特許４，５８８，５８５を参照できる。
一部の実施形態においては目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列はオリゴヌクレ
オチド合成器を用いた化学合成により構築される。そのようなオリゴヌクレオチドは、所
望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、そして目的の組み換えポリペプチドが生産
されることになる宿主細胞にとって好都合なコドンを選択しながら、設計することができ
る。標準的な方法は目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオ
チド配列を合成するために適用できる。例えば完全なアミノ酸配列を用いて戻し翻訳され
た遺伝子を構築できる。更に又、特定の単離されたポリペプチドに関してコードしている
ヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成できる。例えば、所望のポリペプチ
ドの部分に関してコードしている数種の小型のオリゴヌクレオチドを合成し、次にライゲ
ーションすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは典型的には相補的組み立てのた
めの５’又は３’オーバーハングを含有する。
組み立て（合成、部位指向性突然変異誘発又は他の方法による）の後、目的の特定の単
離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクター内に挿入し、そ
して所望の宿主中での蛋白の発現のために適切である発現制御配列に作動可能に連結する
ことになる。適当な組み立ては、ヌクレオチド配列決定、制限マッピング、及び適当な宿
主における生物学的に活性なポリペプチドの発現により確認できる。当該分野で良く知ら
れている通り、宿主中でのトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るために
は、遺伝子は選択された発現宿主中で機能的である転写及び翻訳発現制御配列に作動可能
に連結していなければならない。
特定の実施形態においては、組み換え発現ベクターはヒトＦＯＬＲ１に対する抗体又は
そのフラグメントをコードするＤＮＡを増幅して発現させるために使用される。組み換え
発現ベクターは哺乳類、微生物、ウィルス又は昆虫の遺伝子から誘導された適当な転写又
は翻訳調節エレメントに作動可能に連結した抗ＦＯＬＲ１抗体又はそのフラグメントのポ
リペプチド鎖をコードする合成又はｃＤＮＡ誘導のＤＮＡフラグメントを有する複製可能
なＤＮＡコンストラクトである。転写ユニットは一般的に、（１）遺伝子エレメント又は
遺伝子発現において調節的役割を有するエレメント、例えば転写プロモーター又はエンハ
ンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、そして蛋白に翻訳される構造又はコーディング配列
、及び（３）以下に詳述する適切な転写及び翻訳の開始および終止配列の組み立て物を含
む。そのような調節エレメントは転写を制御するためのオペレーター配列を包含できる。
複製起点により通常は付与される宿主において複製するための能力、及び形質転換体の認
識を容易にする選択遺伝子もまた組み込まれる。ＤＮＡ領域はそれらが相互に機能的に関
連している場合に作動可能に連結されている。例えばシグナルペプチド（分泌リーダー）
に関するＤＮＡはそれがポリペプチドの分泌に参画する前駆体としてそれが発現される場
合はポリペプチドに関するＤＮＡに作動可能に連結しており；プロモーターはそれが配列
の転写を制御する場合はコーディング配列に作動可能に連結しており；或いは、リボソー
ム結合部位はそれが翻訳を可能とするように位置づけられていればコーディング配列に作
動可能に連結している。コウボ発現系において使用するために意図された構造エレメント
は宿主細胞による翻訳蛋白の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を包含する。或いは、
リーダー又はトランスポート配列の非存在下で組み換え蛋白が発現される場合、それはＮ
末端メチオニン残基を包含できる。この残基は場合により後に、発現された組み換え蛋白
から切断されて、最終産物を与える。
発現制御配列及び発現ベクターの選択は宿主の選択に依存することになる。広範な種類
の発現宿主／ベクターの組み合わせを使用できる。真核生物宿主のための有用な発現ベク
ターは、例えばＳＶ４０、ウシパピローマウィルス、アデノウィルス及びサイトメガロウ
ィルスに由来する発現制御配列を含むベクターを包含する。細菌宿主のための有用な発現
ベクターは、知られた細菌プラスミド、例えばエシェリシア・コリ由来のプラスミド、例
えばｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、広範宿主範囲のプラスミド
、例えばＭ１３及びフィラメント様１本鎖ＤＮＡファージを包含する
ＦＯＬＲ１結合ポリペプチド又は抗体（又は抗原として使用するためのＦＯＬＲ１蛋白
）の発現のための適当な宿主細胞は、適切なプロモーターの制御下の、原核生物、コウボ
、昆虫及びより高等な真核生物の細胞を包含する。原核生物はグラム陰性又はグラム陽性
の生物、例えばＥ・コリ又はバチルスを包含する。より高等な真核生物の細胞は後述する
ような哺乳類起源の樹立された細胞系統を包含する。無細胞翻訳系もまた使用される。細
菌、カビ、コウボ、及び哺乳類細胞の宿主を用いた適切なクローニング及び発現ベクター
はPouwels等、(CloningVectors:ALaboratoryManual, Elsevier, N.Y.,1985)により記
載されており、その該当開示は参照により本明細書に組み込まれる。抗体生産を包含する
蛋白生産の方法に関する別の情報は、例えば米国特許出願公開２００８／０１８７９５４
、米国特許６，４１３，７４６及び６，６６０，５０１及び国際特許公開ＷＯ０４００９
８２３に記載されており、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
種々の哺乳類及び昆虫細胞の培養系も又、組み換え蛋白を発現させるために好都合に使
用される。哺乳類細胞中の組み換え蛋白の発現は、そのような蛋白が一般的に正しく折り
畳まれ、適切に修飾され、そして完全に機能することから、実施することができる。適当
な哺乳類宿主細胞系統の例は、ＨＥＫ−２９３及びＨＥＫ−２９３Ｔ、Gluzman(Cell23:1
75,1981)により記載されているサル腎臓細胞のＣＯＳ−７系統、及び他の細胞系統、
例えばＬ細胞、Ｃ１２７，３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ及
びＢＨＫ細胞系統を包含する。哺乳類発現ベクターは非転写エレメント、例えば複製起点
、発現すべき遺伝子に連結された適当なプロモーター及びエンハンサー、及び５’又は３
’フランキング非転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列、例えば必要なリボソーム結合
部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、及び転写終止配列
を含むことができる。昆虫細胞中の非相同蛋白の生産のためのバキュロウィルス系はLuck
owandSummers,Bio/Technology6:47 (1988)において考察されている。
形質転換された宿主により生産される蛋白は何れかの適当な方法に従って精製できる。
そのような標準的な方法はクロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー及び
サイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又は何れかの他の標準的
な蛋白精製手法を包含する。アフィニティータグ、例えばヘキサヒスチジン、マルトース
結合ドメイン、インフルエンザ被膜配列及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを蛋
白に結合することにより、適切なアフィニティーカラム上を通過させることによる容易な
精製が可能となる。単離された蛋白は又、蛋白分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶分析のよう
な手法を用いながら物理的に特性化することができる。
例えば、培地中に組み換え蛋白を分泌する系からの上澄みを先ず、市販の蛋白濃縮フィ
ルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニ
ットを用いながら濃縮することができる。濃縮工程の後、濃縮液を適当な精製マトリック
スに適用することができる。或いは、アニオン交換樹脂、例えば懸垂ジエチルアミノエチ
ル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基材を使用できる。マトリックスはアクリル
アミド、アガロース、デキストラン、セルロース又は蛋白精製において一般的に使用され
ている他の型であることができる。或いは、カチオン交換皇帝を使用できる。適当なカチ
オン交換剤はスルホプロピル又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスを
包含する。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば懸垂メチル又は他の脂肪族基を有
するシリカゲルを用いた１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
工程を用いてＦＯＬＲ１結合剤を更に精製することができる。種々の組み合わせににおけ
る上記した精製工程の一部又は全てを用いて均質な組み換え蛋白を得ることもできる。
細菌培養物中に生産された組み換え蛋白は、例えば細胞ペレットからの初期抽出、その
後の１回以上の濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズエクスクルージョンクロマトグラ
フィーの工程により単離できる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工
程のために使用できる。組み換え蛋白の発現において使用した微生物細胞は、何れかの好
都合な方法、例えば凍結解凍のサイクリング、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の
使用により破壊できる。
抗体及び他の蛋白を精製するために当該分野で知られている方法は又、例えば米国特許
出願公開２００８／０３１２４２５、２００８／０１７７０４８及び２００９／０１８７
００５に記載されているものを包含し、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み
込まれる。
特定の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合剤は抗体ではないポリペプチドである。蛋
白標的に高親和性で結合する非抗体ポリペプチドを識別して生産するための種々の方法が
当該分野で知られている。例えばSkerra,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304 (2007),Hos
se等、Protein Science,15:14-27(2006), Gill等、Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658
(2006),Nygren, FEBS J.,275:2668-76 (2008), andSkerra,FEBS J., 275:2677-83
(2008)に記載されており、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合ポリペプチドを識別／生産するためにファー
ジディスプレイ技術が用いられている。特定の実施形態においては、ポリペプチドはプロ
テインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートド
メイン及びチオレドキシンよりなる群から選択される型の蛋白スカホールドを含む。
一部の実施形態においては、剤は非蛋白分子である。特定の実施形態においては、剤は
小分子である。非蛋白ＦＯＬＲ１結合剤の識別において有用なコンビナトリアル化学ライ
ブラリ及び手法は当該分野で知られている。例えばKennedy等、J.Comb.Chem,10:345-354
(2008),Dolle等、 J. Comb. Chem.,9:855-902(2007),andBhattacharyya, Curr. Med.Chem
., 8:1383-404 (2001)を参照でき、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込ま
れる。特定の別の実施形態においては、剤は炭水化物、グリコサミノグリカン、糖蛋白、
又はプロテオグリカンである。
特定の実施形態においては、剤は核酸アプタマーである。アプタマーは別の分子に結合
する自身の能力に基づいて（例えばランダム又は突然変異誘発物質化プールから）選択さ
れているポリヌクレオチド分子である。一部の実施形態においては、アプタマーはＤＮＡ
ポリヌクレオチドを含む。特定の大体の実施形態においては、アプタマーはＲＮＡポリヌ
クレオチドを含む。特定の実施形態においては、アプタマーは１つ以上の修飾された核酸
残基を含む。蛋白への結合に関して核酸アプタマーを作成及びスクリーニングする方法は
当該分野で良く知られている。例えば米国特許５，２７０，１６３、米国特許５，６８３
，８６７、米国特許５，７６３，５９５、米国特許６，３４４，３２１、米国特許７，３
６８，２３６、米国特許５，５８２，９８１、米国特許５，７５６，２９１、米国特許５
，８４０，８６７、米国特許７，３１２，３２５、米国特許７，３２９，７４２、国際特
許公開ＷＯ０２／０７７２６２、国際特許公開ＷＯ０３／０７０９８４、米国特許出願公
開２００５／０２３９１３４、米国特許出願公開２００５／０１２４５６５及び米国特許
出願公開２００８／０２２７７３５を参照でき、これらの各々は参照により全体が本明細
書に組み込まれる。
ＩＩＩ．イムノコンジュゲート
本発明は又、細胞傷害剤（薬物）又はプロドラッグに連結又はコンジュゲートされた本
明細書に開示された抗ＦＯＬＲ１抗体、抗体フラグメント、機能的等価物、向上した抗体
及びそれらの側面を含むコンジュゲート（本明細書においてはイムノコンジュゲートとも
称する）に関する。即ち、特定の実施形態においては、本発明はヒトフォレート受容体１
に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを含むイムノコンジュゲー
トを提供し、ここで抗体は以下：（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；
ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸａａ１ＦＸａａ２Ｘａａ３（配列番号５６）を含む重鎖Ｃ
ＤＲ２；及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び、（ｂ）ＫＡ
ＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＲＡＳＮＬＥＡ（配列
番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ
３；ただしここで、Ｘａａ１はＫ、Ｑ、Ｈ及びＲから選択され；Ｘａａ２はＱ、Ｈ、Ｎ及
びＲから選択され；そしてＸａａ３はＧ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ａ及びＶから選択されるもの；を
含む。特定の実施形態においては、抗体はｈｕＭｏｖ１９抗体であり、これは重鎖ＣＤＲ
２であるＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号２）を含む上記抗体である。他
の実施形態において、抗体はＦＲ１−２１であり、そして（ａ）ＳＳＹＧＭＳ（配列番号
３０）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹ（配列番号３１）を含む重鎖ＣＤＲ２
；及び／又はＤＧＥＧＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び（ｂ）
ＫＡＳＤＨＩＮＮＷＬＡ（配列番号２７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＧＡＴＳＬＥＴ（配列番
号２８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＹＷＳＴＰＦＴ（配列番号２９）を含む軽鎖ＣＤ
Ｒ３を含む。他の実施形態において、抗体はＦＲ１−４８であり、そして（ａ）ＴＮＹＷ
ＭＱ（配列番号６０）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰＧＮＧＤＳＲ（配列番号６１）を含
む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＲＤＧＮＹＡＡＹ（配列番号６２）を含む重鎖ＣＤＲ３；及
び／又は、（ｂ）ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号５７）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＡＡＴ
ＮＬＡＤ（配列番号５８）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＡＳＰＹＴ（配列番号５９
）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含む。他の実施形態において、抗体はＦＲ１−４９であり、そ
して（ａ）ＴＮＹＷＭＹ（配列番号６６）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＡＩＹＰＧＮＳＤＴＴ（
配列番号６７）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＲＨＤＹＧＡＭＤＹ（配列番号６８）を
含む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は、（ｂ）ＲＡＳＥＮＩＹＴＮＬＡ（配列番号６３）を含む
軽鎖ＣＤＲ１；ＴＡＳＮＬＡＤ（配列番号６４）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＨＦＷＶＳ
ＰＹＴ（配列番号６５）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含む。他の実施形態において、抗体はＦ
Ｒ１−５７であり、そして（ａ）ＳＳＦＧＭＨ（配列番号７２）を含む重鎖ＣＤＲ１；Ｙ
ＩＳＳＧＳＳＴＩＳ（配列番号７３）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び／又はＥＡＹＧＳＳＭＥ
Ｙ（配列番号７４）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は、（ｂ）ＲＡＳＱＮＩＮＮＮＬＨ（
配列番号６９）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＹＶＳＱＳＶＳ（配列番号７０）を含む軽鎖ＣＤＲ
２；及びＱＱＳＮＳＷＰＨＹＴ（配列番号７１）を含む軽鎖ＣＤＲ３；を含む。他の実施
形態において、抗体はＦＲ１−６５であり、そして（ａ）ＴＳＹＴＭＨ（配列番号７８）
を含む重鎖ＣＤＲ１；ＹＩＮＰＩＳＧＹＴＮ（配列番号７９）を含む重鎖ＣＤＲ２；及び
／又はＧＧＡＹＧＲＫＰＭＤＹ（配列番号８０）を含む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は、（ｂ
）ＫＡＳＱＮＶＧＰＮＶＡ（配列番号７５）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＳＡＳＹＲＹＳ（配列
番号７６）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＹＮＳＹＰＹＴ（配列番号７７）を含む軽鎖Ｃ
ＤＲ３；を含む。
適当な薬物又はプロドラッグは当該分野で知られている。特定の実施形態においては、
薬物又はプロドラッグは細胞傷害剤である。本発明の細胞傷害コンジュゲートにおいて使
用される細胞傷害剤は、細胞死をもたらすか、又は細胞死を誘導するか、又は一部の態様
においては細胞の生存性を低下させる何れかの化合物であることができ、そして例えばマ
イタンシノイド及びマイタンシノイド類縁体、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１
０６５及びＣＣ−１０６５類縁体、デュオカルマイシン及びデュオカルマイシン類縁体、
エネジイン、例えばカリケアマイシン、ドラスタチン及びドラスタチン類縁体、例えばオ
ーリスタチン、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、メトトレキセート、シス
プラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブ
ラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル及びモルホリノドキソルビ
シンを包含する。特定の実施形態においては、細胞傷害剤はマイタンシノイド及びマイタ
ンシノイド類縁体である。
そのようなコンジュゲートは抗体又は機能的等価物に薬物又はプロドラッグを連結する
ために連結基を用いることにより調製できる。適当な連結基は当該分野で良く知られてお
り、そして、例えばジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチ
ダーゼ不安定基及びエステラーゼ不安定基を包含する。
薬物又はプロドラッグは例えばジスルフィド結合を介して抗ＦＯＬＲ１抗体又はそのフ
ラグメントに連結できる。リンカー分子又は架橋剤は抗ＦＯＬＲ１抗体又はそのフラグメ
ントと反応することができる反応性の化学基を含む。特定の実施形態においては、細胞結
合剤との反応のための反応性化学基はＮ−スクシンイミジルエステル及びＮ−スルホスク
シンイミジルエステルである。更に又、リンカー分子は反応性の化学基、特定の実施形態
においては薬物と反応してジスルフィド結合を形成できるジチオピリジル基、を含む。特
定の実施形態においては、リンカー分子は、例えば−スクシンイミジル３−（２−ピリジ
ルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えばＣａｒｌｓｓｏｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．、１７３：７２３−７３７（１９７８）参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピ
リジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば米国特許４，５６３，３０４参照）、
Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノエート（スルホ−Ｓ
ＰＤＢ）（米国特許公開２００９０２７４７１３参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２
−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（例えばＣＡＳ登録番号３４１４９８−０
８−６参照）、２−イミノチオラン又は無水アセチルコハク酸を包含する。例えば、抗体
又は細胞結合剤は架橋試薬で修飾することができ、そしてこのようにして誘導された遊離
又は保護されたチオール基を含有する抗体又は細胞結合剤を次に、ジスルフィド又はチオ
ール含有マイタンシノイドと反応させることによりコンジュゲートを生成する。コンジュ
ゲートはクロマトグラフィー、例えば限定しないがＨＰＬＣ、サイズエクスクルージョン
、吸着、イオン交換及びアフィニティーキャプチャー、透析又はタンジェンシャルフロー
濾過により精製できる。特定の実施形態においては、抗ＦＯＬＲ１抗体はＳＰＤＢ又はス
ルホ−ＳＰＤＢリンカーを介して細胞傷害薬に連結される。特定の実施形態においては、
ｈｕＭｏｖ１９抗体はＳＰＤＢ又はスルホ−ＳＰＤＢリンカーを介して細胞傷害物に連結
される。
本発明の別の側面において、抗ＦＯＬＲ１抗体は、イムノコンジュゲートの力価、溶解
性又は薬効を増強する場合に、ジスルフィド結合及びポリエチレングリコールを介して細
胞傷害薬に連結される。そのような切断可能な親水性のリンカーはＷＯ２００９／０１３
４９７６に記載されている。このリンカー設計の追加的な利点は、所望の高い単量体比及
び最小限の抗体薬物コンジュゲート凝集である。この側面において得に意図されるものは
、細胞結合剤のコンジュゲートであり、そして２〜８の薬物負荷の狭小な範囲を有するポ
リエチレングリコールスペーサー（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ＝１−１４）を担持するジスル
フィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を介して連結した薬物は、癌細胞に対して比較的高い強力な生
物学的活性を示し、そして高いコンジュゲート州立及び高い単量体比と最小限の蛋白凝集
という望ましい生化学的特性を有すると記載されている。
この側面において特に意図されるものは式（Ｉ）の抗ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲー
ト又は式（Ｉ’）のコンジュゲート：
Ａ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｙ−Ｃ］ｍ （Ｉ）
［Ｃ−Ｙ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−Ａ （Ｉ’）であり、
式中：
Ａは抗ＦＯＬＲ１抗体又はフラグメントを示し；
Ｃは細胞傷害薬を示し；
Ｘはチオエーテル結合、アミド結合、カーバメート結合、又はエーテル結合を介して細胞
結合剤に結合された脂肪族、芳香族又はヘテロ環の単位を示し；
Ｙはジスルフィド結合を介して薬物に結合された脂肪族、芳香族又はヘテロ環の単位を示
し；
ｌは０又は１であり；
ｍは２〜８の整数であり；そして、
ｎは１〜２４の整数である。
一部の実施形態においては、ｍは２〜６の整数である。
一部の実施形態においては、ｍは３〜５の整数である。
更に又、特定の実施形態においては、ｎは２〜８の整数である。或いは、例えば米国特
許６，４４１，１６３及び７，３６８，５６５に開示されている通り、細胞結合剤との反
応に適する反応性エステルを導入するために先ず薬物を修飾することができる。活性化さ
れたリンカー部分を含有するこれらの薬物の細胞結合剤との反応は、細胞結合剤薬物コン
ジュゲートを生成する別の方法を提供する。マイタンシノイドは例えば米国特許６，７１
６，８２１に記載のＰＥＧ連結基を用いながら抗ＦＯＬＲ１抗体又はフラグメントに連結
することもできる。これらのＰＥＧ切断不可能な連結基は水及び非水性の溶媒の両方に可
溶であり、そして１つ以上の細胞傷害剤を細胞結合剤に連結するために使用できる。例示
されるＰＥＧ連結基は、一端において官能性のスルヒドリル又はジスルフィド基、及び、
他端において活性エステルを介してリンカーの両側末端で細胞傷害剤及び細胞結合剤と反
応するヘテロ２官能性ＰＥＧリンカーを包含する。ＰＥＧ連結基を用いる細胞傷害コンジ
ュゲートの合成の一般的例として、ここでも米国特許６，７１６，８２１を参照でき、こ
れは参照により全体が本明細書に組み込まれる。合成の開始は反応性のＰＥＧ部分を担持
している細胞傷害剤１つ以上の細胞結合剤との反応であり、これにより細胞結合剤のアミ
ノ酸残基による各反応性ＰＥＧ部分の末端活性エステルの置き換えが起こり、これにより
ＰＥＧ連結基を介して細胞結合剤に共有結合下細胞傷害剤１つ以上を含む細胞傷害コンジ
ュゲートが生じる。或いは、細胞結合剤を２官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾することにより反
応性のジスルフィド部分（例えばピリジルジスルフィド）を導入することができ、これを
次にチオール含有マイタンシノイドで処理することによりコンジュゲートを得ることがで
きる。別の方法においては、細胞結合を２官能性のＰＥＧ架橋剤で修飾することによりチ
オール部分を導入することができ、次にこれを反応性ジスルフィド含有マイタンシノイド
（例えばピリジルジスルフィド）で処理することによりコンジュゲートを得ることができ
る。
切断不可能なの連結を有する抗体−マイタンシノイドコンジュゲートもまた調製できる
。そのような架橋剤は当該分野で報告されており（ThermoScientificPierceCrosslinking
Technical Handbook及び米国特許公開２００５／０１６９９３３参照）、そして、Ｎ
−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣ
Ｃ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カル
ボキシ−（６−アミドカプロエート）、即ち、ＳＭＣＣの「長鎖」類縁体（ＬＣ−ＳＭＣ
Ｃ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、β−マ
レイミドプロパン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＢＭＰＳ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ
−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエス
テル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサ
ノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレ
ート（ＳＭＰＢ）、及びＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、
Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ
−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテー
ト（ＳＢＡ）、及びＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（
ＳＢＡＰ）を包含するがこれに限定されない。特定の実施形態においては、抗体は、１〜
１０個の反応性の基を導入するために文献記載の通り、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ
、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−
ＭＢＳ又はスクシンイミジル−ヨードアセテートのような架橋剤で修飾される（Yoshitak
e等、Eur.J.Biochem.,101:395-399(1979); Hashida等、 J. Applied Biochem., 56-63(19
84)；及びLiu等、Biochem.,18:690-697(1979)）。次に修飾された抗体をチオール
含有マイタンシノイド誘導体と反応させることによりコンジュゲートを生成する。コンジ
ュゲートはＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムを通したゲル濾過により、又は、透析又はタン
ジェンシャルフロー濾過により精製できる。修飾された抗体をチオール含有マイタンシノ
イド（１〜２モル等量／マレイミド基）で処理し、そして、抗体−マイタンシノイドコン
ジュゲートをＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムを通したゲル濾過、セラミックヒドロキシア
パタイトカラム上のクロマトグラフィー、透析又はタンジェンシャルフロー濾過又はこれ
らの方法の組み合わせにより精製する。典型的には、抗体当たり平均で１〜１０個のマイ
タンシノイドを連結する。１つの方法はスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）
−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で抗体を修飾することによりマレ
イミド基を導入し、その後、修飾された抗体をチオール含有マイタンシノイドと反応させ
ることによりチオエーテル連結コンジュゲートとする。ここでも抗体分子当たり１〜１０
薬物分子を有するコンジュゲートが生じる。抗体、抗体フラグメント、蛋白ホルモン、蛋
白成長因子及び他の蛋白のマイタンシノイドコンジュゲートを同じ態様において製造する
。
本発明の別の側面においては、ＰＥＧスペーサーを間においた切断不可能な結合を介し
て薬物にＦＯＬＲ１抗体（例えばｈｕＭｏｖ１９、ＦＲ１−２１、ＦＲ１−４８、ＦＲ１
−４９、ＦＲ１−５７又はＦＲ１−６５）を連結させる。薬物と抗ＦＯＬＲ１抗体又はフ
ラグメントの間のリンカーを形成する親水性ＰＥＧ鎖を含む適当な架橋試薬は、当該分野
で良く知られており、或いは、市販されている（例えばQuantaBiodesign,Powell,Ohio
）。適当なＰＥＧ含有架橋剤は又、当該分野で知られている標準的合成化学手法を用いな
がら市販のＰＥＧ自体から合成することもできる。薬物を米国特許出願公開２００９０２
７４７１３及びＷＯ２００９／０１３４９７６に詳述されている方法により２官能性ＰＥ
Ｇ含有架橋剤と反応させることにより次の式、即ちＺ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−
）ｎ−Ｙｐ−Ｄの化合物とし、次にこれを細胞結合剤と反応させることによりコンジュゲ
ートとすることができる。或いは、細胞結合を２官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾することによ
りチオール反応性基（例えばマレイミド又はハロアセトアミド）を導入し、次にこれをチ
オール含有マイタンシノイドで処理することによりコンジュゲートとすることができる。
別の方法においては、細胞結合を２官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾することによりチオール部
分を導入し、次にこれをチオール反応性マイタンシノイド（例えばマレイミド又はハロア
セトアミドを担持したマイタンシノイド）で処理することによりコンジュゲートとするこ
とができる。
従って本発明の別の側面は式（ＩＩ）又は式（ＩＩ’）の抗ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジ
ュゲート：
Ａ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｃ］ｍ （ＩＩ）
［Ｃ−Ｙｐ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−Ａ （ＩＩ’）
であり、式中、Ａは抗ＦＯＬＲ１抗体又はフラグメントを示し；
Ｃは薬物を示し；
Ｘはチオエーテル結合、アミド結合、カーバメート結合、又はエーテル結合を介して細胞
結合剤に結合された脂肪族、芳香族又はヘテロ環の単位を示し；
Ｙはチオエーテル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭
素−炭素結合及びヒドラゾン結合よりなる群から選択される共有結合を介して薬物に結合
された脂肪族、芳香族又はヘテロ環の単位を示し；
ｌは０又は１であり；
ｐは０又は１であり；
ｍは２〜１５の整数であり；そして、
ｎは１〜２０００の整数である。
特定の実施形態においては、ｍは２〜８の整数であり；そして、
ｎは１〜２４の整数である。
特定の実施形態においては、ｍは２〜６の整数である。
特定の実施形態においては、ｎは２〜８の整数である。
特定の実施形態においては、ｍは３〜５の整数である。特定の実施形態においては、抗
体はｈｕＭｏｖ１９である。別の実施形態においては、抗体はＦＲ−１−２１である。別
の実施形態においては、抗体はＦＲ−１−４８である。別の実施形態においては、抗体は
ＦＲ−１−４９である。別の実施形態においては、抗体はＦＲ−１−５７である。別の実
施形態においては、抗体はＦＲ−１−６5である。適当なＰＥＧ含有リンカーの例は、抗
ＦＯＬＲ１抗体又はそのフラグメントとの反応のためのＮ−スクシンイミジルエステル又
はＮ−スルホスクシンイミジルエステル、並びに化合物との反応のためのマレイミド−又
はハロアセチル系の部分を有するリンカーを包含する。ＰＥＧスペーサーは、本明細書に
記載する方法により当該分野で知られている何れかの架橋剤内に取り込まれることができ
る。
本明細書に開示するリンカーの多くは米国特許特許公開 ２００５０１６９９３３及び
２００９０２７４７１３、及びＷＯ２００９／０１３４９７６に詳述されており；その内
容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、約２〜約８個の薬物分子（「薬物負荷」）、例えばマイタンシノイドが抗Ｆ
ＯＬＲ１抗体又はそのフラグメントに連結しており、コンジュゲートの抗腫瘍採用が同じ
細胞結合剤に連結した薬物の数が低値又は高値である薬物負荷と比較して遥かに効果的で
ある側面を包含する。「薬物負荷」とは本明細書において使用する場合、細胞結合剤（例
えば抗ＦＯＬＲ１抗体又はそのフラグメント）に結合できる薬物分子（例えばマイタンシ
ノイド）の数を指す。１つの側面において、細胞結合剤に結合することができる薬物分子
の数は平均で約２〜約８個（例えば１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、
２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、
３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、
４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、
５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、
６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、
７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１個）であることができる。特
定の実施形態においては、薬物はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−
オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）又はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メ
ルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）マイタンシン（ＤＭ４）である。即ち、特
定の実施形態においては、抗体ｈｕＭｏｖ１９をＤＭ１又はＤＭ４にコンジュゲートする
。別の実施形態においては、、抗体ＦＲ−１−２１をＤＭ１又はＤＭ４にコンジュゲート
する。別の実施形態においては、抗体ＦＲ−１−４８をＤＭ１又はＤＭ４にコンジュゲー
トする。別の実施形態においては、抗体ＦＲ−１−４９をＤＭ１又はＤＭ４にコンジュゲ
ートする。別の実施形態においては、抗体ＦＲ−１−５７をＤＭ１又はＤＭ４にコンジュ
ゲートする。別の実施形態においては、抗体ＦＲ−１−６５をＤＭ１又はＤＭ４にコンジ
ュゲートする。
即ち、１つの側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり１個のマイタンシノイ
ドを含む。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり２個のマイタンシノイド
を含む。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり３個のマイタンシノイドを
含む。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり４個のマイタンシノイドを含
む。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり５個のマイタンシノイドを含む
。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり６個のマイタンシノイドを含む。
別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり７個のマイタンシノイドを含む。別
の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり８個のマイタンシノイドを含む。
１つの側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり約１〜約８個のマイタンシノ
イドを含む。別の側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり約２〜約７個のマイ
タンシノイドを含む。別の側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり約２〜約６
個のマイタンシノイドを含む。別の側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり約
２〜約５個のマイタンシノイドを含む。別の側面において、イムノコンジュゲートは抗体
あたり約３〜約５個のマイタンシノイドを含む。別の側面において、イムノコンジュゲー
トは抗体あたり約３〜約４個のマイタンシノイドを含む。
１つの特徴において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体当たり結合した薬物分
子（例えばマイタンシノイド）を平均で約２〜約８個（例えば１．９、２．０、２．１、
２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、
３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、
４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、
５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、
６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、
７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１個
）有する。１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体あたり平均で
約１〜約８個の薬物分子（例えばマイタンシノイド）を有する。１つの側面において、イ
ムノコンジュゲートを含む組成物は抗体あたり平均で約２〜約７個の薬物分子（例えばマ
イタンシノイド）を有する。１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は
抗体あたり平均で約２〜約６個の薬物分子（例えばマイタンシノイド）を有する。１つの
側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体あたり平均で約２〜約５個の薬
物分子（例えばマイタンシノイド）を有する。１つの側面において、イムノコンジュゲー
トを含む組成物は抗体あたり平均で約３〜約５個の薬物分子（例えばマイタンシノイド）
を有する。１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体あたり平均で
約３〜約４個の薬物分子（例えばマイタンシノイド）を有する。１つの側面において、イ
ムノコンジュゲートを含む組成物は抗体あたり平均で約３．５〜約４個の薬物分子（例え
ばマイタンシノイド）を有する。
１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体当たり結合した薬物分
子（例えばマイタンシノイド）を平均で約２±０．５個、約２．５±０．５個、約３±０
．５個、約３．５±０．５個、約４±０．５個、約４．５±０．５個、約５±０．５個、
約５．５±０．５個、約６±０．５個、約６．５±０．５個、約７±０．５個、約７．５
±０．５個、又は約８±０．５個有する。１つの側面において、イムノコンジュゲートを
含む組成物は抗体当たり平均で約３．５±０．５個の薬物分子（例えばマイタンシノイド
）有する。
抗ＦＯＬＲ１抗体又はそのフラグメントは２官能性架橋試薬を抗ＦＯＬＲ１抗体又はそ
のフラグメントに反応させ、これにより抗ＦＯＬＲ１抗体又はそのフラグメントへのリン
カー分子の共有結合を起こすことにより修飾できる。本明細書において使用する場合、「
２官能性架橋試薬」とは本明細書に記載する薬物のような薬物に細胞結合剤を共有結合さ
せる何れかの化学部分である。別の方法においては、連結部分の一部分は薬物により与え
られる。この点に関し、薬物は薬物に細胞結合剤を連結するために使用されるより大きい
リンカー分子の部分である連結部分を含む。例えば、マイタンシノイドＤＭ１を形成する
ためには、マイタンシンのＣ−３ヒドロキシル基における側鎖を遊離のスルヒドリル基（
ＳＨ）を有するように修飾する。マイタンシンのこのチオール化された型は修飾された細
胞結合剤と反応してコンジュゲートを形成できる。従って、再修理かは２つの成分から組
み立てられ、その１つは架橋試薬から与えられ、もう１つはＤＭ１に由来する側鎖により
与えられる。
薬物分子は血清アルブミンのような中間的担体分子を介して抗体分子に連結することが
できる。
本明細書において使用する場合、「細胞結合剤に連結した」又は「抗ＦＯＬＲ１抗体又
はフラグメントに連結した」という表現は適当な連結基を介して細胞結合剤抗ＦＯＬＲ１
抗体又はフラグメントに結合した少なくとも１つの薬剤誘導体を含むコンジュゲート又は
その前駆体を指す。特定の実施形態においては、１つの連結基はＳＭＣＣである。
特定の実施形態においては、本発明において有用な細胞傷害剤はマイタンシノイド及び
マイタンシノイド類縁体である。適当なマイタンシノイドの例はマイタンシノールのエス
テル及びマイタンシノール類縁体を包含する。マイタンシノール及びマイタンシノール類
縁体のように微小管形成を阻害し、そして哺乳類細胞に対して高度に毒性である如何なる
薬物も包含される。
適当なマイタンシノールエステルの例は修飾された芳香族環を有するもの、及び他の位
置における修飾を有するものを包含する。このような適当なマイタンシノイドは米国特許
４，４２４，２１９；４，２５６，７４６；４，２９４，７５７；４，３０７，０１６；
４，３１３，９４６；４，３１５，９２９；４，３３１，５９８；４，３６１，６５０；
４，３６２，６６３；４，３６４，８６６；４，４５０，２５４；４，３２２，３４８；
４，３７１，５３３；５，２０８，０２０；５，４１６，０６４；５，４７５，０９２；
５，５８５，４９９；５，８４６，５４５；６，３３３，４１０；７，２７６，４９７及
び７，４７３，７９６に開示されている。
特定の実施形態においては、本発明のイムノコンジュゲートは細胞傷害剤として、正式
名称はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタ
ンシンであるチオール含有マイタンシノイド（ＤＭ１）を利用する。ＤＭ１は下記構造式
（ＩＩＩ）により表わされる。
Figure 2021100430
別の実施形態においては、本発明のコンジュゲートは細胞傷害剤として、チオール含有
マイタンシノイドＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オ
キソプロピル）−マイタンシン（例えばＤＭ４）を利用する。ＤＭ４は下記構造式（ＩＶ
）により表わされる。
Figure 2021100430
立体障害チオール結合を含有する側鎖を含む別のマイタンシノイドは下記構造式（Ｖ）
で表わされるＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−
マイタンシン（ＤＭ３と称する）である。
Figure 2021100430
米国特許５，２０８，０２０及び７，２７６，４９７において教示されているマイタン
シノイドの各々もまた、本発明におけるコンジュゲートにおいて使用できる。この点に関
し、５，２０８，０２０及び７，２７６，６９７の全開示は参照により本明細書に組み込
まれる。
マイタンシノイドの多くの位置が連結部分を化学的に連結するための位置として機能す
る。例えばヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位
、ヒドロキシルで修飾されたＣ−１５位及びヒドロキシ基を有するＣ−２０位が全て有用
であると期待される。特定の実施形態においては、Ｃ−３位を利用する。特定の実施形態
においては、マイタンシノールのＣ−３位を利用する。
特定のコンジュゲートの構造図を以下に示す。
Figure 2021100430
Figure 2021100430
Figure 2021100430
Figure 2021100430
Figure 2021100430
Figure 2021100430
Figure 2021100430
Figure 2021100430
特定の実施形態においては、抗体はｈｕＭｏｖ１９である。別の実施形態においては、抗
体はＦＲ１−２１である。
このような抗体マイタンシノイドコンジュゲートを生成するための幾つかの説明が米国
特許６，３３３，４１０、６，４４１，１６３、６，７１６，８２１及び７，３６８，５
６５に記載されており、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
一般的に、水性緩衝液中の抗体の溶液を、反応性の基を担持したジスルフィド部分を有
するマイタンシノイドのモル過剰量と共にインキュベートすることができる。過剰なアミ
ン（例えばエタノールアミン、タウリン等）を添加することにより反応混合物をクエンチ
ングできる。次にマイタンシノイド−抗体コンジュゲートをゲル濾過により精製できる。
抗体分子当たりに結合しているマイタンシノイド分子の数は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍ
の吸光度の比を分光光学的に計測することにより求めることができる。平均で１〜１０個
のマイタンシノイド分子／抗体を用い、そして特定の実施形態においては平均で２〜５個
を使用する。マイタンシノイド分子／抗体の平均数は、例えば１〜１０、２〜５、３〜４
、３．５〜４又は約３．５であることができる。１つの側面において、マイタンシノイド
分子の平均数は約３．５±０．５である。１つの側面において、マイタンシノイド分子の
平均数は約３．５〜４である。
マイタンシノイド薬物との抗体のコンジュゲートがインビトロで種々の望ましくない細
胞系統の増殖を抑制する能力を評価することができる。例えば、ヒトＫＢ細胞系統のよう
な細胞系統が、これらの化合物の細胞傷害性を評価するために容易に使用できる。評価す
べき細胞を４〜５日間化合物に曝露し、そして細胞の生存割合を知られた方法により直接
アッセイにおいて計測できる。次にＩＣ５０値をアッセイ結果から計算できる。
例えば米国特許出願２０１０／０２０３００７号に記載のベンゾジアゼピン化合物（例
えばインドリノベンゾジアゼピン又はオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、それらの誘導
体、それらの中間体もまた、抗ＦＯＬＲ１抗体フラグメント又はコンジュゲートを調製す
るために使用してよい。
有用なベンゾジアゼピンは下記式（ＸＩＶ）、（ＸＶ）及び（ＸＶＩ）：
Figure 2021100430
Figure 2021100430
Figure 2021100430
［式中、ＮとＣとの間の二重線−−は単結合又は二重結合を示すが、ただしそれが二重結
合の場合はＸは非存在であり、ＹはＨであり、そしてそれが単結合である場合はＸはＨで
あるか、又は化合物をプロドラッグに変換するアミノ保護部分であり；
Ｙは−ＯＲ、−ＯＣＯＲ’で示されるエステル、−ＯＣＯＯＲ’で示されるカーボネート
、−ＯＣＯＮＲ’Ｒ”で示されるカーバメート、ＮＲ’Ｒ”で示されるヒドロキシルアミ
ン、−ＮＲＣＯＲ’で示されるアミド、ＮＲＣＯＰで示されるペプチド、ただしここでＰ
はアミノ酸又は２〜２０個のアミノ酸単位を含有するペプチドであるもの、ＳＲ’で示さ
れるチオエステル、ＳＯＲ’で示されるスルホキシド、−ＳＯ２−Ｒ’で示されるスルホ
ン、−ＳＯ３で示されるスルファイト、−ＯＳＯ３で示されるビスルファイト、ハロゲン
、シアノ、アジド、又はチオールから選択され、ここでＲ，Ｒ’及びＲ”は同じかまたは
異なっていて、Ｈ、炭素原子１〜１０個を有する置換又は未置換の直鎖、分枝鎖又は環状
のアルキル、アルケニル又はアルキニル、ポリエチレングリコール単位（−ＯＣＨ２ＣＨ
２）ｎ、ただしここでｎは１〜２０００の整数であるもの、炭素原子６〜１０個を有する
アリール、炭素原子３〜１０個を有するヘテロ環、ただしここで置換基はＯＲ７、ＮＲ８
Ｒ９、ＮＯ２、ＮＲＣＯＲ’、ＳＲ１０から選択されるもの、ＳＯＲ’で示されるスルホ
キシド、−ＳＯ２Ｒ’で示されるスルホン、−ＳＯ３で示されるスルファイト、−ＯＳＯ
３で示されるビスルファイト、ＳＯ２ＮＲＲ’で示されるスルホンアミド、シアノ、アジ
ド、−ＣＯＲ１１、ＯＣＯＲ１１又はＯＣＯＮＲ１１Ｒ１２、ただしここでＲ７、Ｒ８、
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２の定義は上記において示したとおりであり、場合により
Ｒ”はＯＨであり；
ＷはＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＣＨ２、ＢＨ、ＳＯ又はＳＯ２であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ４’は各々独立してＨ、炭素原
子１〜１０個を有する置換又は未置換の直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又
はアルキニル、ポリエチレングリコール単位（−ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ、ただしここでｎは
１〜２０００の整数であるもの、又はハロゲン、グアニジニウム［−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）Ｎ
Ｈ２］、ＯＲ７、ＮＲ８Ｒ９、ＮＯ２、ＮＲＣＯＲ’、ＳＲ１０、ＳＯＲ’で示されるス
ルホキシド、−ＳＯ２Ｒ’で示されるスルホン、スルファイト−ＳＯ３、ビスルファイト
−ＯＳＯ３、ＳＯ２ＮＲＲ’で示されるスルホンアミド、シアノ、アジド、−ＣＯＲ１１
、ＯＣＯＲ１１又はＯＣＯＮＲ１１Ｒ１２から選択される置換基から選択され、ここでＲ
７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は各々独立してＨ、炭素原子１〜１０個を有
する置換又は未置換の直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又はアルキニル、ポ
リエチレングリコール単位（−ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ、ただしここでｎは１〜２０００の整
数であるもの、炭素原子６〜１０個を有するアリール、炭素原子３〜１０個を有するヘテ
ロ環から選択され、場合によりＲ１０はＳＲ１３又はＣＯＲ１３であり、ここでＲ１３は
炭素原子１〜１０個を有する直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又はアルキニ
ル、ポリエチレングリコール単位（−ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ、ただしここでｎは１〜２００
０の整数であるもの、炭素原子６〜１０個を有するアリール、炭素原子３〜１０個を有す
るヘテロ環から選択され、場合によりＲ１１はＯＲ１４であり、ここでＲ１４はＲと同じ
定義を有し、場合によりＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’，又はＲ４’
の何れか１つは共有結合を介した細胞結合剤への連結を可能にする連結基であるか、又は
、ポリピロロ、ポリインドリル、ポリイミダゾリル、ポリピロロイミダゾリル、ポリピロ
ロインドリル又はポリイミダゾロインドリル単位であって場合により細胞結合剤への連結
を可能にする連結基を担持しているものから選択され；
Ｚは（ＣＨ２）ｎただしｎが１、２又は３であるもの、ＣＲ１５Ｒ１６、ＮＲ１７、Ｏ又
はＳから選択され、ここでＲ１５、Ｒ１６及びＲ１７は各々独立してＨ、炭素原子１〜１
０個を有する直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル、ポリエチレングリコール単位（−ＯＣＨ
２ＣＨ２）ｎ、ただしここでｎは１〜２０００の整数であるものから選択され；
Ｒ６はＯＲ、ＳＲ又はＮＲＲ’であり、ここでＲ及びＲ’は上記と同じ定義を有し；
Ｘ’はＣＨ２、ＮＲ、ＣＯ、ＢＨ、ＳＯ又はＳＯ２から選択され、ここでＲは上記と同じ
定義を有し；
Ｙ’はＯ、ＣＨ２、ＮＲ又はＳであり、ここでＲは上記と同じ定義を有し；
Ｚ’はＣＨ２又は（ＣＨ２）ｎであり、ここでｎは２、３又は４であるが、ただしＸ’、
Ｙ’及びＺ’は同時に全てＣＨ２であることはなく；
Ａ及びＡ’は同じかまたは異なっていて、そしてＯ、−ＣＲＲ’Ｏ、Ｓ、−ＣＲＲ’Ｓ、
−ＮＲ１５又はＣＲＲ’ＮＨＲ１５から選択され、ここでＲ及びＲ’は上記と同じ定義を
有し、そして、Ｒ１５はＲに関する上記と同じ定義を有し；
Ｄ及びＤ’は同じかまたは異なっていて、そして独立して炭素原子１〜１０個を有する直
鎖、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又はアルキニルであって場合によりハロゲン
、ＯＲ７、ＮＲ８Ｒ９、ＮＯ２、ＮＲＣＯＲ’、ＳＲ１０、ＳＯＲ’で示されるスルホキ
シド、−ＳＯ２Ｒ’で示されるスルホン、スルファイト−ＳＯ３、ビスルファイト−ＯＳ
Ｏ３、ＳＯ２ＮＲＲ’で示されるスルホンアミド、シアノ、アジド、−ＣＯＲ１１、ＯＣ
ＯＲ１１又はＯＣＯＮＲ１１Ｒ１２の何れか１つで置換されており、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、
Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２の定義は上記の通りであるもの、ポリエチレングリコール単位
（−ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ、ただしここでｎは１〜２０００の整数であるもの、から選択さ
れ；
Ｌは場合により置換されている任意のフェニル基又は炭素原子３〜１０個を有する複素環
であり、ここで置換基は共有結合を介した細胞結合剤への連結を可能にする連結基であり
、或いは、炭素原子１〜１０個を有する直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又
はアルキニルであって場合によりハロゲン、ＯＲ７、ＮＲ８Ｒ９、ＮＯ２、ＮＲＣＯＲ’
、ＳＲ１０、ＳＯＲ’で示されるスルホキシド、−ＳＯ２Ｒ’で示されるスルホン、スル
ファイト−ＳＯ３、ビスルファイト−ＯＳＯ３、ＳＯ２ＮＲＲ’で示されるスルホンアミ
ド、シアノ、アジド、−ＣＯＲ１１、ＯＣＯＲ１１又はＯＣＯＮＲ１１Ｒ１２の何れか１
つで置換されており、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２の定義は上記の通り
であるもの、ポリエチレングリコール単位（−ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ、ただしここでｎは１
〜２０００の整数であるもの、から選択され；場合によりＬそのものが共有結合を介した
細胞結合剤への連結を可能にする連結基である］の化合物、又はそれらの製薬上許容しう
る溶媒和物、塩、水和物、又は含水塩、それらの光学異性体、ラセミ混合物、ジアステレ
オマー、エナンチオマー又はこれらの化合物の多形結晶構造物を包含し、ここで２量体の
化合物は場合により細胞結合剤への連結を可能にする連結基を担持するが；ただし、化合
物は共有結合を介した細胞結合剤の連結を可能にする連結基を１つより多くは有さない。
１つの側面において、ＮとＣとの間の二重線−−は単結合又は二重結合を示すが、ただ
しそれが二重結合の場合はＸは非存在であり、ＹはＨであり、そしてそれが単結合である
場合はＸはＨであるか、又は化合物をプロドラッグに変換するアミノ保護部分であり；
Ｙは−ＯＲ、ＮＲ’Ｒ”、スルファイト−ＳＯ３又はビスルファイト−ＯＳＯ３から選択
され、ここでＲはＨ、炭素原子１〜１０個を有する直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル、ア
ルケニル又はアルキニル、ポリエチレングリコール単位（−ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ、ただし
ここでｎは１〜２０００の整数であるもの、炭素原子６〜１０個を有するアリール、炭素
原子３〜１０個を有するヘテロ環から選択され；
ＷはＣ＝Ｏ、ＣＨ２又はＳＯ２であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ４’は各々独立してＨ、ＮＯ２
又は共有結合を介した細胞結合剤への連結を可能にする連結基から選択され；
Ｒ６はＯＲ１８であり、ここでＲ１８はＲと同じ定義を有し；
Ｚは（ＣＨ２）ｎただしｎが１、２又は３であるもの、ＣＲ１５Ｒ１６、ＮＲ１７、Ｏ又
はＳから選択され、ここでＲ１５、Ｒ１６及びＲ１７は各々独立してＨ、炭素原子１〜１
０個を有する直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル、ポリエチレングリコール単位（−ＯＣＨ
２ＣＨ２）ｎ、ただしここでｎは１〜２０００の整数であるものから選択され；
Ｘ’はＣＨ２又はＣ＝Ｏから選択され；
Ｙ’はＯ、ＮＲ又はＳであり、ここでＲは上記と同じ定義を有し；
Ｚ’はＣＨ２又は（ＣＨ２）２であり；
Ａ及びＡ’は各々Ｏであり；
Ｄ及びＤ’は同じかまたは異なっていて、そして独立して炭素原子１〜１０個を有する直
鎖、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又はアルキニルから選択され；
Ｌは場合により置換されている任意のフェニル基又は炭素原子３〜１０個を有する複素環
であり、ここで置換基は共有結合を介した細胞結合剤への連結を可能にする連結基であり
、或いは、炭素原子１〜１０個を有する直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又
はアルキニルであって場合によりハロゲン、ＯＲ７、ＮＲ８Ｒ９、ＮＯ２、ＮＲＣＯＲ’
、ＳＲ１０、ＳＯＲ’で示されるスルホキシド、−ＳＯ２Ｒ’で示されるスルホン、スル
ファイト−ＳＯ３、ビスルファイト−ＯＳＯ３、ＳＯ２ＮＲＲ’で示されるスルホンアミ
ド、シアノ、アジド、−ＣＯＲ１１、ＯＣＯＲ１１又はＯＣＯＮＲ１１Ｒ１２の何れか１
つで置換されているもの、ポリエチレングリコール単位（−ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ、ただし
ここでｎは１〜２０００の整数であるもの、から選択され；場合によりＬそのものが共有
結合を介した細胞結合剤への連結を可能にする連結基でありるもの；又はそれらの製薬上
許容しうる溶媒和物、塩、水和物、又は含水塩、それらの光学異性体、ラセミ混合物、ジ
アステレオマー、エナンチオマー又はこれらの化合物の多形結晶構造物である。
別の特徴において、化合物は下記式（ＸＶＩＩ）：
Figure 2021100430
［式中、ＮとＣとの間の二重線−−は単結合又は二重結合を示すが、ただしそれが二重結
合の場合はＸは非存在であり、ＹはＨであり、そしてそれが単結合である場合はＸはＨで
あるか、又は化合物をプロドラッグに変換するアミノ保護部分であり、そしてＹはＯＨ、
−ＯＲで示されるエーテル、スルファイト−ＳＯ３、又はビスルファイト−ＯＳＯ３から
選択され、ここでＲは炭素原子１〜１０個を有する直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル、ア
ルケニル又はアルキニルから選択され；
Ｒ２、Ｒ３の１つは共有結合を介した細胞結合剤への連結を可能にする連結基であり、も
う１つはＨであり；
Ｌ’、Ｌ”又はＬ’”の１つは細胞結合剤への連結を可能にする連結基であり、残余はＨ
であり；Ｌ’は連結基であることができ、そしてＧはＣＨ又はＮである］により表わされ
る。他の例は米国特許出願６１／１５０，２０１に記載されており、その全内容は参照に
より本明細書に組み込まれる。即ち、特定の実施形態においては、抗体ｈｕＭｏｖ１９を
上記ＸＩＸ−ＸＸＩＩに示す構造を有するベンゾジアゼピンにコンジュゲートする。別の
実施形態においては、抗体ＦＲ−１−２１を上記ＸＩＸ−ＸＸＩＩに示す構造を有するベ
ンゾジアゼピンにコンジュゲートする。
ＩV．ポリヌクレオチド
特定の実施形態においては、本発明はＦＯＬＲ１に特異的に結合するポリペプチド、又
はそのようなポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌク
レオチドを包含する。例えば、本発明はヒトＦＯＬＲ１に対する抗体をコードする、又は
そのような抗体のフラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する
。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であることができる。ＤＮ
ＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを包含し；そして２本鎖又は１本鎖である
ことができ、そして１本鎖である場合はコーディング鎖又は非コーディング（アンチセン
ス）鎖であることができる。
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは単離されている。特定の実施形態にお
いては、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。
本発明は配列番号４、１０、１１、４１、４２及び８８〜１０３よりなる群から選択さ
れる配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提
供する。同様に提供されるものは配列番号４、１０、１１、４１、４２及び８８〜１０３
に少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％
、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドである。
ポリヌクレオチド配列番号５、１４及び１５はそれぞれｈｕＭｏｖ１９可変ドメイン重
鎖、可変ドメイン軽鎖バージョン１．００及び可変ドメイン軽鎖バージョン１．６０に関
するコーディング配列を含む。
本発明は又、配列番号５、１４、１５、３７、３８、４３、４４、４７、４８及び１２
０〜１２７よりなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチドを提供する。同様に提
供されるものは配列番号５、１４、１５、３７、３８、４３、４４、４７、４８及び１２
０〜１２７に少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくと
も約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。即
ち、特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは（ａ）配列番号５に少なくとも約９
５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び／又は（ｂ）配列番号１４又は１５に
少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態にお
いては、ポリヌクレオチドは（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有するポリヌクレオチド
；及び／又は（ｂ）配列番号１４又は配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリヌクレオ
チドを含む。
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞からのポリペプチド
の発現及び分泌を支援する、ポリヌクレオチドに同じ読み枠で融合した成熟ポリペプチド
に関するコーディング配列を含む（例えば細胞からのポリペプチドの輸送を制御するため
の分泌配列として機能するリーダー配列）。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレ
蛋白であり、そして宿主細胞により切断されてポリペプチドの成熟型を形成するリーダー
配列を有することができる。ポリヌクレオチドは又、成熟蛋白プラス追加５’アミノ酸残
基であるプロ蛋白に対してもコードできる。プロ配列を有する成熟蛋白はプロ蛋白であり
、そして蛋白の不活性型である。プロ配列が切断されると活性な成熟蛋白が残存する。
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは例えばコードされたポリペプチドの精
製を可能にするマーカー配列に同じ読み枠で融合した成熟ポリペプチドに関するコーディ
ング配列を含む。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合はマーカーに融合した成熟ポ
リペプチドの精製を可能にするｐＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサヒスチジンタ
グであることができ、又は、哺乳類宿主（例えばＣＯＳ−７細胞）を使用する場合は、イ
ンフルエンザヘマグルチニン蛋白から誘導されたヘマグルチニン（ＨＡ）タグであること
ができる。
本発明は更に例えばフラグメント、類縁体及び誘導体をコードする上記下ポリヌクレオ
チドの変異体に関する。
ポリヌクレオチド変異体はコーディング領域、非コーディング領域、又は両方において
改変を含有できる。一部の実施形態においては、ポリヌクレオチド変異体はサイレントな
置換、負荷、又は欠失をもたらすが、コードされたポリペプチドの特性又は活性を改変し
ない改変を含有する。一部の実施形態においては、ヌクレオチド変異体は遺伝子コードの
縮重によるサイレントな置換により生成される。ポリヌクレオチド変異体は種々の理由の
ため、例えば特定の宿主に対してコドンの発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ中のコドンを
Ｅ・コリのような細菌宿主により好まれるものに変える）ために生産することもできる。
本明細書に記載するポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も提供される。
Ｖ．使用方法及び医薬組成物
本発明のＦＯＬＲ１結合剤（抗体、イムノコンジュゲート及びポリペプチドを包含）は
癌の治療のような施療的治療方法を包含するがこれに限定されない種々の用途において有
用である。特定の実施形態においては、剤は腫瘍生育を阻害し、分化を誘導し、腫瘍体積
を低減し、及び／又は腫瘍の腫瘍形成性を低減するために有用である。使用方法はインビ
トロ、エクスビボ、又はインビボの方法であってよい。特定の実施形態においては、ＦＯ
ＬＲ１結合剤又は抗体又はイムノコンジュゲート又はポリペプチドはそれが結合するヒト
ＦＯＬＲ１の拮抗剤である。
１つの側面において、本発明の抗ＦＯＬＲ１抗体及びイムノコンジュゲートは生物学的
試料中のＦＯＬＲ１の存在を検出するために有用である。「検出する」という用語は本明
細書において使用する場合、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の実施形態におい
ては、生物学的試料は細胞又は組織を含む。特定の実施形態においては、そのような組織
は、他の組織と相対比較してより高値のレベルでＦＯＬＲ１を発現する正常及び／又は癌
性の組織、例えばＢ細胞及び／又はＢ細胞関連組織を包含する。特定の実施形態において
は、ＦＯＬＲ１の過剰発現は卵巣癌、肺癌、脳の癌、乳癌、子宮癌、腎臓癌又は膵臓癌の
存在を検出する。
１つの側面において、本発明は生物学的試料中のＦＯＬＲ１の存在を検出する方法を提
供する、特定の実施形態においては、方法は、ＦＯＬＲ１への抗ＦＯＬＲ１抗体の結合を
可能にする条件下で抗ＦＯＬＲ１抗体に生物学的試料を接触させること、及び、抗ＦＯＬ
Ｒ１抗体とＦＯＬＲ１との間に複合体が形成されているかどうか検出することを含む。
１つの側面において、本発明はＦＯＬＲ１の増大した発現に関連する障害を診断する方
法を提供する。特定の実施形態においては、方法は、抗ＦＯＬＲ１抗体に被験細胞を接触
させること；ＦＯＬＲ１への抗ＦＯＬＲ１抗体の結合を検出することにより被験細胞によ
るＦＯＬＲ１の発現のレベルを（定量的又は定性的に）測定すること；及び被験細胞によ
るＦＯＬＲ１の発現のレベルを対照細胞（例えば被験細胞と同じ組織起源の正常細胞、又
は、そのような正常細胞に匹敵するレベルでＦＯＬＲ１を発現している細胞）によるＦＯ
ＬＲ１の発現のレベルと比較することを含み、ここで対照細胞と比較した場合に被験細胞
によるより高レベルのＦＯＬＲ１の発現は、ＦＯＬＲ１の増大した発現に関連する障害の
存在を示している。特定の実施形態においては、被験細胞はＦＯＬＲ１の増大した発現に
関連する障害を有すると疑われる個体から得られる。特定の実施形態においては、障害は
細胞増殖障害、例えば癌又は腫瘍である。
特定の実施形態においては、上記した者のような診断又は検出の方法は、細胞の表面上
に発現されているか、又は自身の表面上にＦＯＬＲ１を発現している細胞から得られた膜
調製物中の、ＦＯＬＲ１への抗ＦＯＬＲ１抗体の結合を検出することを含む。特定の実施
形態においては、方法は、ＦＯＬＲ１への抗ＦＯＬＲ１抗体の結合を可能にする条件下で
抗ＦＯＬＲ１抗体に細胞を接触させること、及び細胞表面上の抗ＦＯＬＲ１抗体とＦＯＬ
Ｒ１との間に複合体が形成されているかどうか検出することを含む。細胞表面に発現され
たＦＯＬＲ１への抗ＦＯＬＲ１抗体の結合を検出するための例示されるアッセイは「ＦＡ
ＣＳ」アッセイである。
特定の別の方法を用いてＦＯＬＲ１への抗ＦＯＬＲ１抗体の結合を検出することができ
る。そのような方法は、当該分野で良く知られている抗原結合試験、例えばウエスタンブ
ロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着試験）。「サンドイッチ
」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセ
イ及び免疫組織化学（ＩＨＣ）を包含するがこれらに限定されない。
特定の実施形態においては、抗ＦＯＬＲ１抗体を標識する。標識は、直接検出される標
識又は部分（例えば蛍光、発色団、電子稠密、化学ルミネセント、及び放射活性の標識）
並びに例えば酵素的反応又は分子相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンド
のような部分を包含するがこれらに限定されない。
特定の実施形態においては、抗ＦＯＬＲ１抗体は不溶性マトリックス上に固定化される
。固定化とは溶液中に遊離で残存する如何なるＦＯＬＲ１からも抗ＦＯＬＲ１抗体を分離
することを意味する。これは従来より、水不溶性マトリックス又は表面に吸着することに
よる（Bennich等、米国特許３，７２０，７６０）か、又は共有結合カップリング（例え
ばグルタルアルデヒド架橋を用いる）による等して、アッセイ操作の前に抗ＦＯＬＲ１抗
体を不溶化することによるか、又は例えば免疫沈降により抗ＦＯＬＲ１抗体とＦＯＬＲ１
との間の複合体の形成の後に抗ＦＯＬＲ１抗体を不溶化することによるかの、いずれかに
より達成される。
診断又は検出の上記した実施形態の何れも、抗ＦＯＬＲ１抗体の代わりに、又はそれに
追加して、本発明のイムノコンジュゲートを使用しながら実施してよい。
特定の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合剤又は拮抗剤（例えばｈｕＭｏｖ１９抗体
又はイムノコンジュゲート）で治療される疾患は癌である。特定の実施形態においては、
癌はＦＯＬＲ１結合剤（例えば抗体）が結合する相手で
あるフォレート受容体１を発現する腫瘍により特徴付けられる。
本発明は対象（例えば治療を要する対象）にＦＯＬＲ１結合剤の治療有効量を投与する
ことを含む癌の治療の方法を提供する。特定の実施形態においては、癌は結腸直腸癌、膵
臓癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、乳癌、脳の癌、腎臓癌、前立腺癌、胃腸癌、黒色腫、子宮
頸癌、膀胱癌、神経膠芽腫、及び頭頚部の癌よりなる群から選択される。特定の実施形態
においては、癌は卵巣癌である。特定の実施形態においては、癌は肺癌である。特定の実
施形態においては、対象はヒトである。
本発明は更に本明細書に記載する抗体又は他の剤を用いた腫瘍生育を阻害するための方
法を提供する。特定の実施形態においては、腫瘍生育を阻害する方法はインビトロでＦＯ
ＬＲ１結合剤（例えば抗体）に細胞を接触させることを含む。例えば、ＦＯＬＲ１を発現
する不朽化細胞系統又は癌細胞を培地中で培養し、これに抗体又は他の剤を添加して腫瘍
生育を阻害する。一部の実施形態においては、患者試料、例えば生検組織、胸水又は血液
試料から腫瘍細胞を単離し、培地中で培養し、これにＦＯＬＲ１結合剤を添加して腫瘍生
育を阻害する。
一部の実施形態においては、腫瘍生育を阻害する方法はインビボでＦＯＬＲ１結合剤（
例えば抗体）に腫瘍又は腫瘍細胞を接触させることを含む。特定の実施形態においては、
ＦＯＬＲ１結合剤に腫瘍又は腫瘍細胞を接触させることは動物モデルにおいて行われる。
例えば免疫無防備状態のマウス（例えばＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）中で成育させておいた
１つ以上のＦＯＬＲ１を発現する異種移植片にＦＯＬＲ１結合剤を投与することにより腫
瘍生育を阻害することができる。一部の実施形態においては癌幹細胞を患者試料、例えば
生検組織、胸水又は血液試料から単離し、免疫無防備状態のマウスに注射し、次にＦＯＬ
Ｒ１結合剤を投与することにより腫瘍細胞生育を阻害する。一部の実施形態においては、
ＦＯＬＲ１結合剤は動物内への腫瘍形成性細胞の導入と同時かその直後に投与することに
より腫瘍生育を防止する。一部の実施形態においては、ＦＯＬＲ１結合剤は腫瘍形成性細
胞が特定の大きさまで成育した後に治療薬として投与される。
特定の実施形態においては、腫瘍生育を阻害する方法はＦＯＬＲ１結合剤の治療有効量
を対象に投与することを含む。特定の実施形態においては、対象はヒトである。特定の実
施形態においては、対象は腫瘍を有するか、腫瘍を除去している。
特定の実施形態においては腫瘍はＦＯＬＲ１結合剤又は抗体が結合するフォレート受容
体を発現する。特定の実施形態においては、腫瘍はヒトＦＯＬＲ１を過剰発現する。
特定の実施形態においては、腫瘍は脳の癌、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫
瘍、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、黒色腫、子宮頚部腫瘍、膀
胱腫瘍、神経膠芽腫、及び頭頚部の腫瘍よりなる群から選択される。特定の実施形態にお
いては、腫瘍は卵巣腫瘍である。
更に又、本発明は対象にＦＯＬＲ１結合剤の治療有効量を投与することを含む対象中の
腫瘍の腫瘍形成性を低減する方法を提供する。特定の実施形態においては、腫瘍は癌幹細
胞を含む。特定の実施形態においては、腫瘍中の癌幹細胞の発生頻度は剤の投与により低
減される。
即ち、特定の実施形態においては、本発明はｈｕＭｏｖ１９抗体及びイムノコンジュゲ
ートを用いて癌を治療する方法を提供する。特定の実施形態においては、ｈｕＭｏｖ１９
イムノコンジュゲートはｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４；ｈｕＭｏｖ１９−スルホ−
ＳＰＰ−ＤＭ１；ｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＰ−ＤＭ１；又はｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−Ｍ
ａｌ−ＤＭ４である。
本発明は更にＦＯＬＲ１結合剤に腫瘍形成性細胞を接触することを含む非腫瘍形成性細
胞への腫瘍形成性細胞の文化の方法を提供する（例えば腫瘍形成性細胞を含む腫瘍を有す
るか、又はそのような腫瘍を除去している対象にＦＯＬＲ１結合剤を投与することによる
）。特定の実施形態においては、腫瘍形成性細胞は卵巣腫瘍細胞である。
本発明は又、ＦＯＬＲ１結合剤、ポリペプチド又は抗体の有効量に固形腫瘍の支質を接
触することを含むその支質における筋腺維芽細胞の活性化を低減する方法を提供する。
本発明は更に、本明細書に記載したＦＯＬＲ１結合剤の１つ以上を含む医薬組成物を提
供する。特定の実施形態においては、医薬組成物は更に製薬上許容しうるベヒクルを含む
。これらの医薬組成物はヒト患者において腫瘍生育を阻害し、そして癌を治療する場合に
使用できる。
特定の実施形態においては、製剤は、製薬上許容しうるベヒクル（例えば担体、賦形剤
）に本発明の精製された抗体又は剤を混合することにより保存及び使用のために調製され
る（Remington,TheScienceand Practice of Pharmacy 20th EditionMackPublishing,
2000）。適当な製薬上許容しうるベヒクルは
非毒性緩衝物質、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸;塩類、例えば塩化ナトリ
ウム；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料（例えばオクタデシルジ
メチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；
塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、
例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール
；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（例えば約１０アミ
ノ酸残基未満）；蛋白、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性重
合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラ
ギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；炭水化物、例えば単糖類、２糖類、グルコ
ース、マンノース、デキストリン；キレート形成剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスク
ロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリ
ウム；金属複合体（例えばＺｎ−蛋白複合体）；及びノニオン性界面活性剤、例えばＴＷ
ＥＥＮ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含するがこれらに限定されない。
本発明の医薬組成物は局所又は全身投与の何れかのために如何なる数の方法においても
投与できる。投与は局所（例えば経膣及び肛門送達を包含する経粘膜）、例えば経皮パッ
チ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体及び粉末；肺
（例えば粉末又はエアロゾルの吸入又は吸収、例えばネブライザーによるもの；気管内、
鼻内、表皮及び経皮）；経口;又は非経腸、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋
肉内の注射又は輸液；又は頭蓋内（例えば髄腔内又は脳室内）投与であることができる。
本発明のイムノコンジュゲートの抗体は、医薬複合製剤又は複合療法としての投薬法に
おいて、抗癌特性を有する第２の化合物と組み合わせることができる。医薬複合製剤又は
投薬法の第２の化合物は好ましくはそれらが相互に悪影響を及ぼさないように複合物のＡ
ＤＣに対して補完的活性を有する。ＦＯＬＲ１結合剤及び第２の抗癌剤を含む医薬組成物
も提供される。
疾患の治療のためには、本発明の抗体又は剤の適切な用量は、治療すべき疾患の型、疾
患の重症度及び経過、疾患の応答性、抗体又は剤が治療又は予防目的の何れで投与される
か、以前の治療、患者の病歴等に応じたものとなり、全て担当医の判断による。抗体又は
剤は、１回、又は数日から数か月まで継続する一連の治療に渡り、或いは、治癒が成功す
るか、又は疾患の縮小（例えば腫瘍の大きさの減少）が達成されるまで投与することがで
きる。最適な投薬計画は患者の身体における薬物の蓄積の計測から計算でき、そして個々
の抗体又は剤の相対的力価に応じて変動することになる。投薬医師は最適な用量、投薬法
および反復率を容易に決定できる。特定の実施形態においては、用量はｋｇ体重当たり０
．０１μｇ〜１００ｍｇであり、そして毎日、毎週、毎月又は毎年１回以上投与できる。
特定の実施形態においては、抗体又は他のＦＯＬＲ１結合剤を２週間に１回、又は３週間
に１回投与する。特定の実施形態においては、抗体又は他のＦＯＬＲ１結合剤の用量はｋ
ｇ体重当たり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇである。担当医は体液又は組織中の薬物の滞留時
間及び濃度の計測値に基づいて投薬の反復率を推定できる。
複合療法は「相乗作用」をもたらすことができ、「相乗作用的」であることがわかって
おり、即ち、活性成分を共に使用した場合に達成される作用が、化合物を別個に使用した
場合に得られる作用の総和より大きい。相乗作用は、活性成分が（１）共同製剤され、そ
して複合単位剤型において同時に投与又は送達されるか；（２）別個の製剤として交互又
は並行して送達されるか；又は（３）何らかの他の投薬法による場合に、達成できる。交
互治療において送達される場合、相乗作用は、化合物が逐次的に、例えば別個のシリンジ
における異なる注射により投与又は送達される場合に達成できる。一般的に、交互治療中
は、各活性成分の有効用量を逐次的、即ち連続して投与するが、複合療法の場合は、２つ
以上の活性成分の有効用量を共に投与する。
ＶＩ．ＦＯＬＲ１結合剤を含むキット
本発明は本明細書に記載した抗体、イムノコンジュゲート又は他の剤を含み、そして本
明細書に記載した方法を実施するために使用できるキットを提供する。特定の実施形態に
おいては、キットは容器１つ以上の中にヒトフォレート受容体１に対する精製された抗体
少なくとも１つを含む。一部の実施形態においては、キットは対照、アッセイ実施のため
の説明書、及び結果の分析及び表示のための何れかの必要なソフトウエアの全てを含む検
出アッセイを実施するために必要及び／又は十分な成分の全てを含有する。本発明の開示
した抗体、イムノコンジュゲート及び他の剤は当該分野で良く知られている確立されたキ
ットフォーマットの１つに容易に組み込むことができることが当業者の知る通りである。
更に提供されるものはＦＯＬＲ１結合剤（例えばＦＯＬＲ１結合抗体）並びに第２の抗
癌剤を含むキットである。特定の実施形態においては、第２の抗癌剤は化学療法剤（例え
ばゲムシタビン又はイリノテカン）である。
本発明の実施形態は以下の非限定的な例を参照することにより更に明確化でき、これら
は本開示の特定の抗体の調製及び本開示の抗体を用いるための方法を詳細に説明している
。物質及び方法の両方に対する多くの変更が本開示の範囲から逸脱することなく実施でき
ることは当業者の知る通りである。
本明細書に記載した実施例及び実施形態は説明を目的としているのみであり、そしてそ
れに基づく種々の改変または変更が当業者に示唆されることになり、そして本出願の精神
及び範囲に包含されるべきであると理解しなければならない。
（実施例１）
ネズミモノクローナル抗体Ｍｏｖ１９のキメラ化
Ｍｏｖ１９の可変領域アミノ酸配列をＮＣＢＩデータベース（軽鎖（配列番号２４）に関
してはアクセッションＣＡＡ６８２５３及び重鎖（配列番号２３）に対してはＣＡＡ６８
２５２）から入手し、そして次にコドン最適化し、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙにより合成した。軽鎖可変領域はｐＡｂＫＺｅｏプラスミド中のＥｃｏＲ
Ｉ及びＢｓｉＷＩ部位にクローニングし、そして重鎖可変領域はｐＡｂＧ１Ｎｅｏプラス
ミドのＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａ１部位にクローニングした。
（実施例２）
ネズミモノクローナル抗体Ｍｏｖ１９及びＦＲ１−２１のヒト化Ｍｏｖ１９抗体は以前
に報告されているフレームワークリサーフィシング法（Roguska M.等、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 1994 Feb;91:969-973)及び(Roguska等、Protein Eng.9(10):895-904 (199
6)）に従ってヒト化した。要すれば、各可変領域フレームワーク残基に関する平均溶媒ア
クセス性をＰＤＢデータベースの緊密関連解明抗体構造(closely related solved ant
ibody structure)を用いて計算し、そして３０％平均アクセス性より高値の位置を表面
残基としてマークした（Pedersen J.T.等、J. Mol. Biol. 1994; 235: 959-973）
。ヒト表面置き換え配列は、Ｋａｂａｔデータベースにおけるヒト抗体生殖細胞系統配列
の相当する位置にネズミ抗体配列の表面位置をアラインすることにより選択した（Johnso
n,G. and Wu, T. T. (2001) Nucleic Acids Research,29:205-206）。最も相同
なヒト軽鎖可変領域表面（クローンDPK19、Ｍｏｖ１９に関してはIMGT遺伝子座IGKV2D-30
*01、そしてＦＲ１−２１に関してはIMGT遺伝子座IGKV1/OR2-0*01）及び最も相同なヒト
重鎖可変領域表面（クローン8M27、Ｍｏｖ１８に関してはIMGT遺伝子座IGHV1-69*08、そ
してＦＲ１−２１に関してはIMGT遺伝子座IGHV5-51*02 for FR1-21）を選択することに
よりネズミＭｏｖ１９フレームワーク表面位置を置き換え、６ＣＤＲ（表１）は未改変の
ままとした。ネズミ及びヒトＭｏｖ１９及びＦＲ１−２１の表面位置及び残基を図１Ａ〜
Ｄに示す。
Figure 2021100430
Figure 2021100430
残基変化の何れも、Ｍｏｖ１９又はＦＲ１−２１のＣＤＲとフォレート受容体１上のそ
れらの標的エピトープとの相互作用に影響するという問題を生じさせず、従って表面の復
帰突然変異は何れの抗体のヒト化配列に関しても考慮しなかった。しかしながらリサーフ
ィシングされたＭｏｖ１９配列は軽鎖Ｎ７４においてコンセンサスＮ連結グリコシル化部
位を導入しており（軽鎖バージョン１．００）、従ってこの部位を除去するために第２の
ヒト化軽鎖バージョンを作成した。Ｋａｂａｔのヒト軽鎖配列データベースを検討した所
、スレオニンが軽鎖７４位において観察される最も一般的な残基であることがわかり、従
って７４位にスレオニンを有するようにヒト化Ｍｏｖ１９軽鎖バージョン１．６０を構築
した。７４位は表面残基ではないため、この残基置換はリサーフィシングによるヒト化に
影響しない。ネズミ及びヒト化Ｍｏｖ１９及びＦＲ１−２１の可変領域配列のアライメン
トを図２に示す。
ヒト化Ｍｏｖ１９及びＦＲ１−２１の可変領域配列をコドン最適化し、Ｂｌｕｅ Ｈｅ
ｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより合成した。配列は単鎖哺乳類発現プラスミド
における該当する定常配列とインフレームにクローニングし易くするための制限酵素部位
によりフランキングされている。軽鎖可変領域をｐＡｂＫＺｅｏプラスミド中のＥｃｏＲ
Ｉ及びＢｓｉＷＩ部位にクローニングした。得られたｈｕＭｏｖ１９軽鎖をコードするプ
ラスミドＤＮＡをＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７３及びＰＴＡ−１０７７４としてＡ
ＴＣＣに寄託し、そして得られたＦＲ１−２１軽鎖をコードするプラスミドＤＮＡをＡＴ
ＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７６として寄託した。重鎖可変領域はｐＡｂＧ１Ｎｅｏプラ
スミドのＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａ１部位にクローニングした。得られたｈｕＭｏｖ１９
重鎖をコードするプラスミドＤＮＡをＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７２としてＡＴＣ
Ｃに寄託し、そして得られたＦＲ１−２１重鎖をコードするプラスミドＤＮＡをＡＴＣＣ
受託番号ＰＴＡ−１０７７５として寄託した。次にこれらのプラスミドを実施例３に記載
するとおりトランスフェクトすることによりｈｕＭｏｖ１９を作成した。何れかのｈｕＭ
ｏｖ１９系さをコードするプラスミド（即ちＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７７３及びＰ
ＴＡ−１０７７４として寄託されたもの）をｈｕＭｏｖ１９重鎖をコードするプラスミド
と対にすることにより、本明細書に記載する方法に従って、そして当該分野で良く知られ
ている通り、ｈｕＭｏｖ１９抗体を作成することができる。
（実施例３）
組み換え抗体発現
キメラ及びヒト化抗体コンストラクトを標準的なリン酸カルシウム操作法を用いながら付
着ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣａｌＰｈｏｓ乳類
トランスフェクションキット、カタログ番号６３１３１２）又は、ＰＥＩ変法を用いなが
ら懸濁処理ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において（DurocherY,PerretS, Kamen A High-leveland
high-throughputrecombinant proteinproductionbytransient transfection ofsuspensio
n-growinghuman 293-EBNA1 cells.NucleicAcidsRes. 2002 Jan15;30(2):E9）スピナーフ
ラスコ中で一過性に作成した。ＰＥＩ一過性トランスフェクションは、今回はＨＥＫ−２
９３Ｔ細胞をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で生育させ、そして
ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体添加後に培養容積を未希釈のままとした以外は、以前に報告されて
いる通り実施した（Durocher,Y.等、NucleicAcidsRes.30(2):E9(2002)）。付着
及び懸濁物の一過性トランスフェクションの両方を１週間インキュベートし、そして次に
清澄化された上澄みをプロテインＡカラム、ついでＣＭカラムイオン交換クロマトグラフ
ィーにより後述するとおり精製した。図３に示す通り、ｈｕＭｏｖ１９の発現はトランス
フェクトされた細胞においてキメラＭｏｖ１９の発現より少なくとも１０倍高値であった
。
（実施例４）
抗体精製
抗体を例えばプロテインＡ又はＧクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐプロテインＡ又は
ＧＨＰ、１ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のような標準的方法を用
いながら清澄化細胞培養上澄みから精製した。要すれば、１／１０容量の１ＭＴｒｉｓ／
ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０を添加することにより上澄みをクロマトグラフィー用に調製し
た。ｐＨ調節上澄みを０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、そして結合緩衝液
（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で平衡化したカラムにロードした。カラムは２８０ｎｍにおける
吸光度が無く安定なベースラインが得られるまで結合緩衝液で洗浄した。０．５ｍＬ／分
の流量を用いながら、０．１５ＭＮａＣｌを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ２．８で
抗体を溶離した。約０．２５ｍＬの画分を採取し、１／１０容量の１ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ
、ｐＨ８．０を添加することにより中和した。ピーク画分を１ｘＰＢＳに対して２回一夜
透析し、０．２μｍのメンブレンフィルターを通して濾過することにより滅菌した。精製
された抗体はＡ２８０の吸光度により定量した。
プロテインＡ精製画分は、更にカルボキシメチル（ＣＭ）クロマトグラフィーによるイ
オン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）を用いて最終精製した。要すれば、プロテインＡ
精製からの試料を結合緩衝液（１０ｍＭリン酸カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐ
Ｈ７．５）に緩衝液交換し、そして０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。調製し
た試料を次に、１２０ｃｍ／ｈｒの流量で出発緩衝液で平衡化されたＣＭファーストフロ
ー樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にロードした。カラムのサイズは試料中の
全ての抗体に結合するために十分な容量を有するように選択した。次にカラムを２８０ｎ
ｍにおける吸光度が無く安定なベースラインが得られるまで結合緩衝液で洗浄した。２０
カラム容量（ＣＶ）中１０ｍＭから５００ｍＭの塩化ナトリウムの勾配を開始することに
より抗体を溶離した。腫瘍ピークの５０ｍＡｕより高値のＵＶ読み取り値を有する画分を
収集した。純度（単量体及び可溶性高分子量凝集物のパーセンテージ）はＡｇｉｌｅｎｔ
ＨＰＬＣ１１００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｌａ，ＣＡ）を用いな
がら、ＳＷＸＬガードカラム、６．０ｘ４０ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，
Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を用いたＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ，７
．８ｘ３００ｍｍ上のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（ＳＥＣ）で評価し
た。所望の純度（＞９５％）を有する画分をプールし、ＴＦＦシステムを用いてＰＢＳ（
ｐＨ７．４）に緩衝液交換し、そして０．２μｍのメンブレンフィルターを通して濾過す
ることにより滅菌した。精製された抗体を更にその純度に関してＳＥＣにより試験し、そ
して１．４７の消衰係数を用いながら２８０ｎｍにおける吸光度測定によりＩｇＧ濃度を
求めた。必要に応じて希釈を行った。或いは、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ
）もまた良好な選択性でネズミ及びヒト化抗体の両方を最終精製するために使用できる。
粒径４０μｍのＩＩ型ＣＨＴ樹脂（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）もＩＥＸ
クロマトグラフィーに関して記載したものと同様のプロトコルで抗体の最終精製に適用し
た。ＣＨＴの出発緩衝液は２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０とし、そして抗体は２
０ＣＶに渡って２０〜１６０ｍＭリン酸ナトリウムの勾配により溶離した。
（実施例５）
ねずみ抗ＦＯＬＲ１抗体の開発
２種の異なる免疫化／スクリーニングのシリーズを用いた。第１のシリーズはＦＲ１−２
１クローンの形成をもたらし、そして第２のシリーズはＦＲ１−４８、ＦＲ１−４９、Ｆ
Ｒ１−５７及びＦＲ１−６５クローンの形成をもたらしている。第１のシリーズにおいて
は、マウスを約５ｘ１０６ＦＯＬＲ１発現ＫＢ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７）で皮下免疫化した。
第２のシリーズにおいては、自身の表面にヒトＦＯＬＲ１を発現する３００−１９細胞を
用いてマウスを免疫化した。これらの細胞を作成するためにヒトＦＯＬＲ１アミノ酸配列
をＮＣＢＩウエブサイト（アクセッションＮＰ＿０５７９３７）から入手し、次にそれを
コドン最適化し、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより合成し、Ｅ
ｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限部位によりフランキングさせることによりｐＳＲａ哺乳類発現
ベクター内へのクローニングを容易にした。３００−１９細胞、即ちＢａｌｂ／ｃマウス
から誘導した前Ｂ細胞系統（Reth等、Nature, 317: 353-355 (1985)）をｐＳＲａ−Ｆ
ｏｌＲ１発現プラスミドでトランスフェクトすることにより細胞表面上にｈｕＦＯＬＲ１
を高レベルで安定に発現させた。ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃにおいて使用されているも
ののような当該分野で知られている標準的な免疫化プロトコルを両方のシリーズに適用し
た。免疫化したマウスは、ハイブリドーマ形成のために屠殺する３日前に抗原でブースト
した。マウスの脾臓を標準的動物プロトコルに従って、例えば２枚の滅菌フロスト処理顕
微鏡用スライドの間で組織を磨砕することによりＲＰＭＩ−１６４０培地中の単細胞懸濁
液を得た。脾細胞を遠心分離し、ペレット化し、洗浄し、ポリエチレングリコール−１５
００（Ｒｏｃｈｅ７８３６４１）を用いることによりネズミミエローマ、例えばＰ３Ｘ６
３Ａｇ８．６５３細胞（Kearney等、J Immunol,123: 1548-1550（1979））と融合させ
た。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）（ＳｉｇｍａＨ−０２６２）
を含有するＲＰＭＩ−１６４０選択培地に融合細胞を再懸濁し、そして３７℃５％ＣＯ２
下に９６穴平底培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ３５９６、ウェル当たり細
胞懸濁液０．２ｍＬ）中における生育に関して選択した。５日間インキュベートした後、
培養上澄み０．１ｍＬを各ウェルから取り出し、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）補給
物（ＳｉｇｍａＨ−０１３７）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地０．１ｍＬと置き換え
た。ハイブリドーマクローンが抗体スクリーニングに使用できるようになるまで、３７℃
５％ＣＯ２下にインキュベーションを継続した。免疫化及びハイブリドーマ作成の他の手
法、例えばLangone等、(編集“Immunochemical Techniques,Part I”,Methods in En
zymology,Academic Press, volume 121,Florida)及びHarlow等、(“Antibodies: A
Laboratory Manual”; Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York (1988)
)に記載されているものも使用できる。
Figure 2021100430
（実施例６）
ハイブリドーマスクリーニング及び選択
ヒトＦＯＬＲ１でトランスフェクトしたＦＯＬＲ１−３００−１９細胞及びＫＢ細胞を第
１及び第２のシリーズのスクリーニングにそれぞれ使用した。ＦＯＬＲ１陽性細胞、例え
ばＦＯＬＲ１発現３００−１９細胞又はＫＢ細胞には結合するがＦＯＬＲ１陰性細胞、例
えば非トランスフェクトの３００−１９細胞には結合しないマウスモノクローナル抗体の
分泌に関してフローサイトメトリーによりハイブリドーマの培養上澄みをスクリーニング
した。ハイブリドーマ上澄み０．１ｍＬを０．１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％正常ヤギ血
清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）中ＦＯＬＲ１陽性細胞又は非トランスフェクトの
３００−１９細胞（試料当たり１ｘ１０５個）の何れかと共に３時間インキュベートした
。次に細胞を遠心分離し、ペレット化し、洗浄し、ＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体（例えばＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手可能、ＦＡＣＳ緩衝液中
６μｇ／ｍｌ）０．１ｍＬと共に１時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、再度ペ
レット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ０．２ｍＬ中に
再懸濁した。細胞会合蛍光をＨＴＳマルチウェルサンプラーを用いたＦＡＣＳＣａｌｉｂ
ｕｒフローサイトメトリー又はＦＡＣＳアレイフローサイトメトリーを用いながら計測し
、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（全ての入手元はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＵＳ）を用いて分析した。陽性所見のハイブリドーマクローンを限界
希釈によりサブクローニングした。フローサイトメトリーにより親細胞と同じＦＯＬＲ１
に対する反応性を示した各ハイブリドーマから１つのサブクローンを選択して後の分析に
付した。安定なサブクローンを培養し、各分泌抗ＦＯＬＲ１抗体のアイソタイプを市販の
アイソタイピング試薬（Ｒｏｃｈｅ１４９３０２７）を用いて識別した。上記した通り清
澄化されたハイブリドーマ培地からネズミ抗体をプロテインＡ精製した。これらの抗体を
ＦＲ−１抗体と表記した。
（実施例７）
ネズミモノクローナル抗体精製
抗体を例えばプロテインＡ又はＧクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐプロテインＡ又はＧ
ＨＰ、１ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のような標準的方法を用い
ながらハイブリドーマサブクローン上澄みから精製した。要すれば、１／１０容量の１Ｍ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０を添加することにより上澄みをクロマトグラフィー
用に調製した。ｐＨ調節上澄みを０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、そして
結合緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で平衡化したカラムにロードした。カラムは２８０ｎ
ｍにおける吸光度が無く安定なベースラインが得られるまで結合緩衝液で洗浄した。０．
５ｍＬ／分の流量を用いながら、０．１５ＭＮａＣｌを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐ
Ｈ２．８で抗体を溶離した。約０．２５ｍＬの画分を採取し、１／１０容量の１ＭＴｒｉ
ｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を添加することにより中和した。ピーク画分を１ｘＰＢＳに対し
て２回一夜透析し、０．２μｍのメンブレンフィルターを通して濾過することにより滅菌
した。精製された抗体はＡ２８０の吸光度により定量した。
（実施例８）
フローサイトメトリーによる結合の特性化
精製された抗体を用いながらフローサイトメトリーにより結合特異性を試験した。抗ＦＯ
ＬＲ１のＦＯＬＲ１発現３００−１９細胞への結合及び親３００−１９細胞への結合が無
いことを示すＦＡＣＳヒストグラムを図４に示す。０．１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％正
常ヤギ血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）中のＦＯＬＲ１発現３００−１９細胞又
は非トランスフェクト３００−１９細胞（試料当たり細胞１ｘ１０５個）の何れかと共に
３時間、各抗体をインキュベートした。次に、細胞をペレット化し、洗浄し、０．１ｍＬ
のＦＩＴＣ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（例えばＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙから入手可能、ＦＡＣＳ緩衝液中６μｇ／ｍｌ）と共に１時間インキュベー
トした。細胞を再度ペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアルデヒド含有
ＰＢＳ２００μＬ中に再懸濁した。試料はＨＴＳマルチウェルサンプラーを用いたＦＡＣ
ＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー又はＦＡＣＳアレイフローサイトメトリーを用い
ながら獲得し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（全ての入手元はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＵＳ）を用いて分析した。抗ＦＯＬＲ１抗体のＦＡＣＳ
ヒストグラムは蛍光のシフトを示したが、親３００−１９細胞は示さなかった。細胞系統
の何れもＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体単独のみとインキュベートした場
合には有意な蛍光のシフトは検出されなかった。
（実施例９）
ｍｕＦＲ１−２１のＶＬ及びＶＨ領域のクローニング及び配列決定
製造元のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡｇｅｎ）を用いながら５ｘ１０
６ハイブリドーマ細胞から全細胞ＲＮＡを調製した。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩ
ＩｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いながら全ＲＮＡからｃＤＮＡを合
成した。ハイブリドーマ細胞から誘導したｃＤＮＡ上の第１ラウンドの変性ＰＣＲ反応の
ための操作法はWang等、((2000)JImmunolMethods. Jan 13;233(1-2):167-77) and Co
等、((1992)J Immunol. Feb15;148(4):1149-54)に記載の方法に基づいた。ＶＨ配列は以
下の変性プライマー：ＥｃｏＭＨ１ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧ
ＳＡＧＳＡＧＴＣ（配列番号５０），ＥｃｏＭＨ２ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴ
ＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ（配列番号５１）及びＢａｍＩｇＧ１ＧＧＡＧＧ
ＡＴＣＣＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣ（配列番号５２）を
用いたＰＣＲにより増幅した。ＶＬ配列は以下の変性プライマー：ＳａｃＩＭＫＧＧＡＧ
ＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ（配列番号５３）及びＨｉｎ
ｄＫＬＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣ
ＡＧＴＴＧＧＴＧＣ（配列番号５４）を用いたＰＣＲにより増幅した。（混合塩基は以下
の通り、即ち：Ｎ＝Ｇ＋Ａ＋Ｔ＋Ｃ，Ｓ＝Ｇ＋Ｃ，Ｙ＝Ｃ＋Ｔ，Ｍ＝Ａ＋Ｃ，Ｒ＝Ａ＋Ｇ
，Ｗ＝Ａ＋Ｔと定義した）。
次にＰＣＲ反応混合物を１％低融点アガロースゲル上で泳動させ、３００〜４００ｂｐ
バンドを切り出し、ＺｙｍｏＤＮＡミニカラムを用いて精製し、そして配列決定のために
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに送付した。それぞれの５’及び３’ＰＣ
Ｒプライマーを配列決定プライマーとして使用することにより両方の方向から可変領域ｃ
ＤＮＡを形成した。ＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列はＶｅｃｔｏｒＮＴＩソフトウエア
を用いてＤＮＡ配列決定の結果を解釈することにより得た。
予備可変領域ｃＤＮＡ配列における５’末端プライマー配列決定の人工的要因を発見す
るために、ＮＣＢＩのＩｇＢｌａｓｔサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）
を用いて抗体配列の誘導元のネズミ生殖細胞系統の配列に関して検索した。次に明確化さ
れた可変領域配列を特定の抗体の定常領域に関するＮＣＢＩのレファレンス配列と組み合
わせることにより予測される完全長のネズミ抗体配列を組み立てた。次に予測されるネズ
ミＦｒ１−２１軽鎖及び重鎖の分子量を計算し、そして、液体クロマトグラフィー／質量
スペクトル分析（ＬＣ／ＭＳ）により計測した質量と比較した。ネズミＦＲ１−２１重鎖
は計測された質量とマッチしたが、軽鎖は５’末端配列を調べるためにフォローアップの
配列決定作業を必要とした。ネズミ抗体の生殖細胞系統連結リーダー配列にアニーリング
するようにＣＤ３７−１ＬＣｌｅａｄ１ＰＣＲプライマー（ｔｔｔｔｇａａｔｔｃｇｃｃ
ａｃｃａｔｇａａｇｔｔｔｃｃｔｔｃｔｃａａｃｔｔｃｔ）を設計し、これによりこの新
しいＰＣＲ反応がプライマーにより改変されない完全な可変領域ｃＤＮＡを与えるように
した。ＰＣＲ反応、バンド精製、及び配列決定は上記した通り実施し、そして新しい完全
な配列はＬＣ／ＭＳにより計測したＦｒ１−２１の軽鎖の分子量にマッチする軽鎖をコー
ドしていた。
（実施例１０）
レファレンス抗体の発現
Morphotech抗FOLR1抗体、MorAb-003(Farletuzumab)、アミノ酸配列をWorldHealthOrganiz
ation(WHO) InternationalNonproprietary Namesfor PharmaceuticalSubstances(INN)
のリストから入手し、コドン最適化し、BlueHeronBiotechnologyにより合成した。単
鎖哺乳類発現プラスミドにおけるそれぞれの定常配列とインフレームにクローニングする
ために、軽鎖可変領域配列はEcoRI及びBsiWI制限酵素部位によりフランキングされており
、そして重鎖可変領域配列はHindIII及びApa1制限酵素部位によりフランキングされてい
る。クローニング、発現及び精製は上記ヒト化Ｍｏｖ１９及びＦｒ１−２１に関して記載
したとおり実施した。
（実施例１１）
ｈｕＭｏｖ１９のＡＤＣＣ活性
ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）はエフェクター細胞としての新しく単離されたヒ
トナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を用いた腫瘍細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（Ａ
ＤＣＣ）を計測するために使用されている（例えばShields,J.Biol.Chem., 276(9):6591-
6604 (2001)）。ＮＫ単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１３０−
０９１−１５２）に関する修正プロトコルを用いながら正常者ドナー由来のヒト血液（Re
searchBloodComponents, Inc.,Brighton,MA）から最初に単離した。血液を１ｘＰＢＳ
で２倍希釈した。希釈血液２５ｍＬを５０ｍＬ三角試験管中の２５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ
Ｐａｑｕｅ上に慎重に重層し、ＲＴで４５分間４００Ｇで遠心分離した。末梢血単核球（
ＰＢＭＣ）を界面から収集し、新しい５０ｍＬ三角試験管に移し、そして１ｘＰＢＳで１
回洗浄した。ＰＢＭＣをＮＫ単離緩衝液（１ｘＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭＥＤＴＡ
）２ｍＬ中に再懸濁し、次にビオチン抗体カクテル５００μＬを細胞懸濁液に添加した。
ビオチン抗体カクテルは、ＮＫ細胞以外のリンパ球に結合してＮＫ細胞の負の選択をもた
らすビオチニル化抗体を含有する。混合物を１０分間４℃でインキュベートし、次にＮＫ
単離緩衝液１．５ｍＬ及び抗ビオチンマイクロビーズ１ｍＬを添加した。細胞−抗体混合
物を４℃で更に１５分インキュベートした。次に、細胞を１回５０ｍＬのＮＫ単離緩衝液
で洗浄し、３ｍＬのＮＫ単離緩衝液に再懸濁した。次にＭＡＣＳＬＣカラムを自動ＭＡＣ
Ｓ分離機（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上に搭載し、ＮＫ単離緩衝液３ｍＬで予
備洗浄した。細胞懸濁液を自動的にカラムにアプライし、洗浄し、そして未標識ＮＫ細胞
を有する溶出画分を新しい５０ｍＬ容量の三角試験管に収集した。得られたＮＫ細胞を、
一夜、完全ＲＰＭＩ培地（５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１
ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％１００ＸＭＥＭ非必須アミノ酸溶液
を添加したＲＰＭＩ−１６４０）３０ｍＬ中にプレーティングした。その後のアッセイ及
び全ての希釈はＲＨＢＰ培地（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡ及び１
％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）中で実施した。
ＲＨＢＰ培地中の種々の濃度の抗体を丸底９６穴プレート中５０μＬ／ウェルで２連に分
注した。標的細胞をＲＨＢＰ培地中１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、抗体希釈物を含有する
各ウェルに１００μＬ／ウェルで添加した。標的細胞及び抗体希釈物を含有するプレート
を３７℃で３０分間インキュベートした。次に５０μＬ／ウェルで標的細胞を含有するウ
ェルにＮＫ細胞を添加した。典型的な比は３〜４ＮＫ細胞に対して１標的細胞とした。少
なくとも以下の対照、即ち：ＮＫ細胞単独、標的細胞単独（自発的ＬＤＨ放出）、標的細
胞とＮＫ細胞（抗体非依存性ＬＤＨ放出）、標的細胞と１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（
最大ＬＤＨ放出）を各実験に対して設定した。混合物を４時間３℃でインキュベートする
ことにより細胞溶解を可能とした。プレートを１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上
澄み１００μＬを慎重に新しい平底９６穴プレートに移した。細胞傷害検出キット（Ｒｏ
ｃｈｅ １６４４７９３）から入手したＬＤＨ反応混合物（１００μＬ／ウェル）を各ウ
ェルに添加し、５〜３０分間室温でインキュベートした。試料の光学密度を４９０ｎｍで
計測した（ＯＤ４９０）。各試料のパーセント特異的溶解は、以下の式、即ち：パーセン
ト特異的溶解＝（試料の値−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）＊１００を用いて
求めた。
ｈｕＭｏｖ１９とのインキュベーションはヒトＮＫエフェクター細胞の存在下のＩＧＲ
ＯＶ−１細胞に対する良好なＡＤＣＣ活性をもたらす。ＩＧＲＯＶ−１に対するＡＤＣＣ
活性をｈｕＭｏｖ１９、ｈｕＦＲ−１−２１、Ｍｏｒ００３及びｃｈＴＫ１（アイソタイ
プ対照）に関して比較した（図６）。０．９ｎｇ／ｍＬのｈｕＭｏｖ１９の投与は約３０
％のＩＧＲＯＶ−１細胞溶解をもたらし、他の抗ＦＯＬＲ１抗体で観察された活性と同様
であった。ｈｕＭｏｖ１９のＡＤＣＣ活性は０．２０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０を有し、ｈｕ
ＦＲ−１−２１は０．１１ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０を有し、Ｍｏｒ００３は０．１６ｎｇ／
ｍＬであり、そしてｃｈＴＫ１はＩＧＲＯＶ−１細胞に対して如何なる活性も示さなかっ
た。
（実施例１２）
抗ＦＯＬＲ１イムノコンジュゲートの調製
ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．６−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の調製
例示される２−スルホ−ＳＰＤＢリンカーをＤＭＡ中に溶解した。ｈｕＭｏｖ１９ｖ１
．６抗体をｐＨ７．５において２５℃で約２時間２−スルホ−ＳＰＤＢリンカーの１２倍
モル過剰量と共に８ｍｇ／ｍｌでインキュベートした。
５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．
５で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ２５Ｆカラムを用いて反応混合物を精製した。マ
イタンシノイドＤＭ４をジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、終濃度は５％）中に溶解し、リ
ンカーと比較して１．７倍モル過剰量をスルホ−ＳＰＤＢ修飾抗体に滴下した。１ｍＨＥ
ＰＥＳ緩衝液で反応混合物をｐＨ７．５に調節した。室温で一夜インキュベートした後、
コンジュゲートした抗体を１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭグリシン、１％スクロース、
ｐＨ５．５で平行化したＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ２５Ｆ上のクロマトグラフィーにより精
製した。
以前に報告されている抗体及びマイタンシノイドに関する消衰係数を用いながら抗体分子
当たり連結したＤＭ４分子の数を求めた（Widdison, WC,等、JMedChem,49:4392-4408(200
6)）。全遊離マイタンシノイド分子種のパーセンテージを上記した通り求めた。ｈｕ
Ｍｏｖ１９ｖ１．６抗体当たり３．５〜５個のＤＭ４分子のコンジュゲートが得られ、＜
１％が未コンジュゲートマイタンシノイドとして存在していた。
ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．６−ＳＰＰ−ＤＭ１の調製
例示されるＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）
リンカーをエタノールに溶解した。５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、及び５％エタノ
ールを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中室温で約２時間、ＳＰＰ
リンカーの６．５〜６倍モル過剰量と共に８ｍｇ／ｍｌでｈｕＭｏｖ１９ｖ１．６抗体を
インキュベートした。ＳＰＰ修飾抗体をＰＢＳ、ｐＨ６．５中で２倍希釈し、そしてマイ
タンシノイドＤＭ１の１．５倍モル過剰による修飾を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）
中のＤＭ１の濃溶液（１５〜３０ｍＭ）の添加により行った。ＤＭＡの濃度を５％に調節
し、そして室温で一夜インキュベートした後、コンジュゲートした抗体を、１０ｍＭ、２
５０ｍＭグリシン、１％スクロースｐＨ５．５で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ２５
Ｆ上のクロマトグラフィーにより精製した。抗体及びＤＭ１に関する以前に報告されてい
る消衰係数を用いながら抗体分子当たりに連結したＤＭ１分子の数を求めた（Liu等、Pro
c.Natl.Acad.Sci. USA, 93,8618-8623 (1996)）。コンジュゲート反応の後に存在す
る遊離のマイタンシノイドのパーセンテージは、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．０中の２５％アセトニトリル中で平衡化されたＨｉＳｅｐＴＭカラム上に２０〜５
０μｇのコンジュゲートを注入し、そしてアセトニトリル中に溶離することにより求めた
。２５２ｎｍの波長にセットした吸光度検知器を用いて総遊離マイタンシノイド分子種（
勾配溶離し、そして既知標準物質との溶離時間の比較により同定）のピーク面積を計測し
、そして結合マイタンシノイド（カラムのフロースルー画分中コンジュゲートピーク中に
溶離）に関連するピーク面積と比較することにより総遊離マイタンシノイド分子種のパー
センテージを計算した。ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．６当たり３．５〜４個のＤＭ１分子を有す
るコンジュゲートが得られ、＜１％が未コンジュゲートのマイタンシノイドとして存在し
ていた。
ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の調製
例示されるＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）
リンカーをエタノールに溶解した。５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、及び３％エタノ
ールを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中室温で約２時間、ＳＰＤ
Ｂリンカーの５．５〜５倍モル過剰量と共に８ｍｇ／ｍｌでｈｕＭｏｖ１９ｖ１．６抗体
をインキュベートした。ＳＰＤＢ飾抗体をＰＢＳ、ｐＨ６．５中で２倍希釈し、そしてマ
イタンシノイドＤＭ４の１．５倍モル過剰による修飾を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ
）中のＤＭ４の濃溶液（１５〜３０ｍＭ）の添加により行った。室温で一夜インキュベー
トした後、コンジュゲートした抗体を、１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭグリシン、１％
スクロースｐＨ５．５で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ２５Ｆ上のクロマトグラフィ
ーにより精製した。抗体及びマイタンシノイドに関する以前に報告されている消衰係数を
用いながら抗体分子当たりに連結したＤＭ４分子の数を求めた（Widdison,WC,等、JMedCh
em,49:4392-4408 (2006)）。総遊離マイタンシノイド分子種のパーセンテージは上記
した通り求めた。ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．６抗体当たり３．５〜４個のＤＭ４分子を有する
コンジュゲートが得られ、＜１％が未コンジュゲートのマイタンシノイドとして存在して
いた。
ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．０−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４の調製
ＮＨＳ−３−スルホ−ｍａｌリンカー及びＤＭ４をＤＭＡに別個に溶解した。
４０％２００ｍＭスクシネート緩衝液、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ５．０を含有するＤＭＡの
溶液中でリンカー及びＤＭ４チオールを混合し、ＤＭ４のリンカーに対するモル比を１．
６：１とし、そしてＤＭ４の終濃度を１０ｍＭとした。混合物を２５℃で２時間反応させ
た。４ｍｇ／ｍｌ抗体、９０％リン酸塩緩衝液／１０％ＤＭＡｐＨ７．５（ｖ／ｖ）の最
終コンジュゲーション条件下でリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）中ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．０
抗体の溶液に、抗体に対してリンカー９．６モル過剰の相当量が添加されるように、精製
することなく反応混合物を添加した。室温で一夜インキュベートした後、コンジュゲーシ
ョン混合物をＰＢＳｐＨ７．５中に平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸＧ２５上のクロマトグラ
フィーにより精製した。次にｈｕＭｏｖ１９ｖ１．０−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４を９．５
５ｍＭリン酸塩、１３９．６ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．５を含有する緩衝液中に透析した。
抗体及びマイタンシノイドに関する以前に報告されている消衰係数を用いながら抗体分子
当たりに連結したＤＭ４分子の数を求めた（Widdison,WC,等、JMedChem, 49:4392-4408(2
006)）。総遊離マイタンシノイド分子種のパーセンテージは上記した通り求めた。ｈ
ｕＭｏｖ１９ｖ１．０抗体当たり３．５〜４個のＤＭ４分子を有するコンジュゲートが得
られ、＜１％が未コンジュゲートのマイタンシノイドとして存在していた。
ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の調製
ＮＨＳ−スルホ−ＳＭＣＣリンカー及びＤＭ１をＤＭＡに別個に溶解した。
４０％２００ｍＭスクシネート緩衝液、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ５．０を含有するＤＭＡの
溶液中でリンカー及びＤＭ１チオールを混合し、ＤＭ１のリンカーに対するモル比を１．
２：１とし、そしてＤＭ１の終濃度を３．７５ｍＭとした。混合物を２０℃で７５分間反
応させた。４ｍｇ／ｍｌ抗体、８８％５０ｍＭリン酸カルシウム、５０ｍＭＮａＣｌ、２
ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５／１２％ＤＭＡｐＨ７．５（ｖ／ｖ）の最終コンジュゲーショ
ン条件下でリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）中ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．０抗体の溶液に、抗体
に対してリンカー６．４モル過剰の相当量が添加されるように、精製することなく反応混
合物を添加した。２０℃で２時間インキュベートした後、コンジュゲーション混合物をＰ
ＢＳｐＨ７．５中に平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸＧ２５上のクロマトグラフィーにより精
製した。次にｈｕＭｏｖ１９ｖ１．０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１を２５０ｍＭグリシン、１０ｍ
ＭヒスチジンｐＨ５．５を含有する緩衝液中に透析した。抗体及びマイタンシノイドに関
する以前に報告されている消衰係数を用いながら抗体分子当たりに連結したＤＭ１分子の
数を求めた（Widdison,WC,等、JMedChem, 49:4392-4408(2006)）。総遊離マイタンシ
ノイド分子種のパーセンテージは上記した通り求めた。ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．０抗体当た
り３．５〜４個のＤＭ１分子を有するコンジュゲートが得られ、＜２．８％が未コンジュ
ゲートのマイタンシノイドとして存在していた。
ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．０−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１の調製
ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１の１ステップ試薬をＤＭＡに溶解した。５０ｍＭＫ
Ｐｉ、５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５及び容量で１０％のＤＭＡ中、２
５℃で一夜、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１の５．７倍モル過剰量とともに５ｍｇ／
ｍｌにおいてｈｕＭｏｖ１９ｖ１．０抗体をインキュベートした。ＰＢＳｐＨ７．５中に
平行化したＳＥＰＨＡＤＥＸＧ２５カラムで反応混合物を精製した。ｈｕＭｏｖ１９ｖ１
．０−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１を２５０ｍＭグリシン、１０ｍＭヒスチジンｐＨ５．５
を含有する緩衝液中に透析した。抗体及びマイタンシノイドに関する以前に報告されてい
る消衰係数を用いながら抗体分子当たりに連結したＤＭ１分子の数を求めた（Widdison,W
C,等、JMedChem, 49:4392-4408(2006)）。総遊離マイタンシノイド分子種のパーセン
テージは上記した通り求めた。ｈｕＭｏｖ１９ｖ１．０抗体当たり３．５〜４個のＤＭ１
分子を有するコンジュゲートが得られ、＜１．１％が未コンジュゲートのマイタンシノイ
ドとして存在していた。
（実施例１３）
抗体及びコンジュゲートの結合親和性
抗ＦＯＬＲ１抗体及びそのＳＰＤＢ−ＤＭ４、ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４、ＳＭＣＣ−ＤＭ
１又は抗ＦＯＬＲ１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの結合親和性をフローサ
イトメトリーによりアッセイした。ＦＯＬＲ１発現ＳＫＯＶ３細胞を種々の濃度の抗ＦＯ
ＬＲ１抗体及びそのコンジュゲートと共にインキュベートし、そして、フローサイトメト
リー分析のために上記した通り処理した。データ分析はＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（Ｂ
Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＵＳ）を用いながら実施し、そして各
試料につき、ＦＬ１に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）をエキスポートし、そして片対数プ
ロットで抗体濃度に対してプロットした。用量応答曲線を非直線回帰により作成し、そし
てＳＫＯＶ３細胞への結合に関する被験試料の見かけの平衡解離定数（Ｋｄ）に関する値
をＧｒａｐｈＰａｄのＰｒｉｓｍのｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて計算し、そして図５に示した。結果によれば、使用したリ
ンカーの何れかを介した各ＤＭ１又はＤＭ４へのコンジュゲートは抗体の何れか（例えば
ｈｕＭｏｖ１９）の親和性を顕著には改変しなかったことを示している。
（実施例１４）
インビトロ細胞傷害アッセイ
例示されるｍｕＦＲ１−９、ｍｕＦＲ１−１３、ｍｕＦＲ１−２２、ｍｕＦＲ１−２３、
ｈｕＦＲ１−２３、ｍｕＦＲ１−２１及びｈｕＦＲ１−２１コンジュゲートが細胞成育を
阻害する能力をKovtunYV等、(CancerRes66: 3214-3221(2006)）に記載されている方法
によるインビトロの細胞傷害アッセイを用いて計測した。完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ−
１６４０、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１％ゲンタマイシン、全試薬入手元
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μＬ中ウェル当たり１０００細胞で９６穴プレート中ＦＯ
ＬＲ１発現ＫＢ細胞に種々の濃度のＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートを添加した
。３倍連続希釈により完全ＲＰＭＩ培地中に抗体及びコンジュゲートを希釈し、そして１
００μＬをウェル当たり添加した。終濃度は典型的には３ｘ１０−８Ｍ〜４．６ｘ１０−
１２Ｍとなった。細胞及び培地を含有するがコンジュゲートを含有しない対照ウェル及び
培地のみを含有するウェルを各アッセイプレートに包含させた。５％ＣＯ２含有湿潤雰囲
気下に３７℃で４〜６日間プレートをインキュベートした。次にＷＳＴ−８試薬、１０％
ｖ／ｖ（DojindoMolecularTechnologies,Gaithersburg,MD, US）をウェルに添加し、
そしてプレートを２〜６時間３７℃でインキュベートした。ＷＳＴ−８は生細胞において
はデヒドロゲナーゼにより還元されて組織培地中可溶であるオレンジ色の最大ホルマザン
産物をもたらす。生成されるホルマザン産物は生細胞の数に正比例する。マルチウエルプ
レートリーダーにおいて４５０ｎｍ（Ａ４５０）及び６５０ｎｍ（Ａ６５０）の吸光度を
計測することによりプレートを分析した。先ず、細胞の不透明度のバックグラウンド（Ａ
６５０）をＡ６５０から差し引いた。次に得られたＡ＊４５０を用いて細胞の生存割合を
測定した。バックグラウンドＡ＊４５０吸光度は培地及びＷＳＴ−８のみを有するウェル
の値である。生存割合は以下の通りの計算、即ち：パーセント生存性＝１００ｘ（Ａ＊４
５０投与試料−Ａ＊４５０バックグラウンド）／（Ａ＊４５０未投与試料−Ａ＊４５０バ
ックグラウンド）とした。各投与につき片対数プロットにおいて抗体又はコンジュゲート
の濃度に対し生存割合の値をプロットした。次にこれらのデータよりＧｒａｐｈＰａｄの
Ｐｒｉｓｍのｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
を用いてＩＣ５０を求め、図５に示した。図５に示された結果によれば、全てのコンジュ
ゲートはＦＯＬＲ１発現ＫＢ細胞に対するそれらの細胞傷害力価において同様に活性であ
る。ＦＯＬＲ１に対する抗ＦＯＬＲ１マイタンシノイドコンジュゲートの特異性を更に確
認するために、それらの活性をＫＢ細胞に対する過剰量の非コンジュゲート抗体の存在下
に評価した。コンジュゲートへの競合する非コンジュゲート抗体の過剰量の添加は図７に
示す通り、それらの細胞傷害を抑制した。これらのデータはコンジュゲートが抗原依存的
な態様においてＫＢ細胞を殺傷することを示している。追加的なデータによれば、ｈｕＭ
ｏｖ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４はインビトロアッセイにおいて、ＫＢ細胞のＧ２／Ｍ期にお
いて細胞周期停止を誘導している。
（実施例１５）
ＫＢ異種移植片モデルにおける同様の非ターゲティングコンジュゲートとの比較におけ
るｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４及びｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コン
ジュゲートのインビボの薬効ＳＣＩＤマウスに皮下移植されたＫＢ細胞の樹立された異種
移植片モデルを用いながら、非ターゲティングｈｕＣ２４２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４との比較
におけるＦＯＬＲ１ターゲティング切断可能コンジュゲートｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＤＢ−
ＤＭ４、及び非ターゲティングｈｕＣ２４２−ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４との比較における
切断不可能コンジュゲートｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４を試験した。マウス
は体重により投与群に無作為に割りつけ、そして細胞接種後第３日において単回（ＳＰＤ
Ｂコンジュゲート）、又は、３回、毎週細胞接種後第３、１０、及び１７日において、５
及び１０ｍｇ／ｋｇのコンジュゲートを用いて投与した。種々異なる投与群のメジアン腫
瘍体積を図８にプロットした。ｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４又はｈｕＭｏｖ１９−
ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４の何れかの投与はＰＢＳ対照と比較してメジアン腫瘍体積の減少
をもたらしたのに対し、対応する非ターゲティングコンジュゲートの何れかの投与は有意
な作用をもたらさなかった。
（実施例１６）
ＫＢ異種移植片モデルにおける抗ＦＯＬＲ１−ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲート
のインビボの薬効ＳＣＩＤマウスに皮下移植されたＫＢ細胞の樹立された異種移植片モデ
ルを用いながら、例示される抗ＦＯＬＲ１抗体、ｈｕＭｏｖ１９、ｍｕＦＲ−１−９、ｍ
ｕＦＲ−１−１３、ｍｕＦＲ−１−２２、ｍｕＦＲ−１−２３及びｈｕＦＲ−１−２１の
ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートを試験した。マウスを体重により無作為に割り付
け、そして細胞接種後第３日に１回、上記列挙したコンジュゲートの何れかを１０ｍｇ／
ｋｇ、又はＰＢＳのみを投与した。ｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４Ｍａｌ-ＤＭ４はインビト
ロにおけるその細胞傷害力価においてｍｕＦＲ−１−９、ｍｕＦＲ−１−１３、ｍｕＦＲ
−１−２２、ｍｕＦＲ−１−２３及びｈｕＦＲ−１−２１のＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４コン
ジュゲートと同様であることが解った。ｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４Ｍａｌ-ＤＭ４及びＦ
Ｒ−１−２１−ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４は他のコンジュゲートの何れよりもインビボで有
意に高力価であり、メジアン腫瘍体積のより顕著な現象をもたらした（図９及び１０）。
力価は又、用量依存性（図１１）であり、そしてリンカーの選択も同様に役割を果たして
いることがわかった（図１２及び１３）。
（実施例１７）
異種移植片モデルにおける抗ＦＯＬＲ１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの
インビトロ薬効
３種の卵巣漿液性腺癌異種移植片：ＯＶＣＡＲ−３、ＩＧＲＯＶ−１及びＯＶ−９０にお
いて抗ＦＯＬＲ１ｈｕＭｏｖ１９−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートを試験した
。３種これらの異種移植片腫瘍の各々は、ホルマリン固定パラフィン包埋切片上のカリブ
レーションされた免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色法を用いて計測した場合、患者腫瘍に匹
敵するＦＯＬＲ１発現レベルを示している。樹立された皮下異種移植片腫瘍を有するマウ
ス（約１００ｍｍ３）に対し、１．２、２．５及び５．０ｍｇ／ｋｇにおいてｈｕＭｏｖ
１９−ＳＰＰ−ＤＭ１コンジュゲートの単回静脈内注射により投与した（抗体濃度に基づ
く；図１４〜１６はμｇ／ｋｇにおけるマイタンシノイドコンジュゲートの濃度を示す）
。コンジュゲートは評価した３種のモデルの全てにおいて活性であった。ＯＶＣＡＲ−３
異種移植片においては、最小有効用量（ＭＥＤ）は１．２ｍｇ／ｋｇであった（図１４）
。より高値の用量レベルは高度に活性であり、２．５及び５．０ｍｇ／ｋｇの投与群にお
いて、それぞれ、４／６及び２／６のマウスで完全後退（ＣＲ）をもたらした。コンジュ
ゲートの投与はＩＧＲＯＶ−１及びＯＢ−９０異種移植片モデルの両方において強力な抗
腫瘍活性をもたらし、単回注射で２．５ｍｇ／ｋｇのＭＥＤを有していた（図１５及び１
６）。これらのデータは、患者腫瘍に匹敵するＦＯＬＲ１発現レベルを有する卵巣異種移
植片腫瘍に対するｈｕＭｏｖ１９−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の強力な抗腫瘍活性を示し
ている。
（実施例１８）
イムノコンジュゲート薬効に対するリンカーの影響
抗ＦＯＬＲ１抗体ｈｕＭｏｖ１９をジスルフィド含有切断可能リンカーＳＰＰ、ＳＰＤＢ
、又はスルホ−ＳＰＤＢを介して、又は切断不可能なリンカーＳＭＣＣを介して、ＤＭ１
又はＤＭ４に連結した。ＫＢ、ＩＧＲＯＶ−１及びＪＥＧ−３細胞系統に対するこれらの
コンジュゲートのインビトロの細胞傷害活性を検討した。ＦＡＣＳ分析によれば、ＫＢ（
子宮頸癌）細胞は細胞当たり＞２，０００，０００抗体結合部位を有していた。ＩＧＲＯ
Ｖ−１（卵巣癌）細胞は細胞当たり２６０，０００抗体結合部位を有しており、そしてＪ
ＥＧ−３（絨毛癌）細胞は細胞当たり４０，０００抗体結合部位を有していた。インビト
ロの細胞傷害の結果を以下の表２にまとめた。切断可能なコンジュゲートはＳＭＣＣコン
ジュゲートの場合と比較して顕著に高値のインビトロの活性を示していた。
Figure 2021100430
ＦＯＬＲ１陽性ＫＢ及びＯＶＣＡＲ−３−腫瘍モデルにおけるコンジュゲートのインビ
ボの活性も試験した。図１７に示す結果によれば、切断可能なＳＰＤＢ−ＤＭ４及びスル
ホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは切断不可能なＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートよ
りもインビボでより強力であった。更に又、切断可能なコンジュゲートのうち、ＳＰＰ−
ＤＭ１コンジュゲートはＳＰＤＢ−ＤＭ４又はスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート
の何れよりも、両方の異種移植片モデルにおいて低活性であった（図１８）。後者の２つ
のコンジュゲートはＫＢ腫瘍に対して同様に活性であり、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コン
ジュゲートはＯＶＣＡＲ−３モデルに対してより活性であった。ＯＶＣＡＲ−３モデルを
用いて得たデータを以下の表３にまとめた。
Figure 2021100430
これらのデータによれば、切断可能なリンカーを含有するイムノコンジュゲートはイン
ビトロ及びインビボの両方で上昇した薬効を示し、そしてスルホ−ＳＰＤＢを含有する抗
ＦＯＬＲ１イムノコンジュゲートは腫瘍モデルにおいて高度に活性である。
（実施例１９）
ｈｕＦＲ１抗体ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ及びインビボの薬効
抗ＦＯＬＲ１ｈｕＦＲ１−４８、ｈｕＦＲ１−４９、ｈｕＦＲ１−５７、及びｈｕＦＲ１
−６５をＳＭＣＣリンカー及びＤＭ１とコンジュゲートし、そしてＫＢ細胞に対する作用
をインビボで上記異種移植片モデルを用いて上記した通り分析した。抗体の各々はＫＢ細
胞モデルにおいて同様の薬効を示し、ｈｕＦＲ１−４８、ｈｕＦＲ１−４９、ｈｕＦＲ１
−５７、及びｈｕＦＲ１−６５イムノコンジュゲートは、変動するが有意なインビボの薬
効を、２００μｇ／ｋｇの用量において、異種移植片モデル系において示していた（表４
及び図１９）。
Figure 2021100430
本明細書において引用した全ての出版物、特許、特許出願、インターネットサイト、及
び受託番号／データベースの配列（ポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列の両方を包
含する）は、各々の出版物、特許、特許出願、インターネットサイト、及び受託番号／デ
ータベースの配列が特定的及び個別に参照により本明細書に組み込まれる場合と同等程度
まで、全ての目的のために、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
Figure 2021100430
Figure 2021100430
Figure 2021100430
Figure 2021100430
Figure 2021100430
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Figure 2021100430
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Figure 2021100430
Figure 2021100430
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