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JP2020521804A - Ｍｍｐ１３結合免疫グロブリン - Google Patents

Ｍｍｐ１３結合免疫グロブリン Download PDF

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Abstract

本発明は、ＭＭＰ１３に特異的に結合する免疫グロブリン、より特にはポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする核酸に；かかるポリペプチドを調製する方法に；予防、治療または診断目的のための、かかるポリペプチドを含む組成物、特に医薬組成物に、関する。特に、本発明の免疫グロブリンはＭＭＰ１３の活性を阻害し、好ましくはまた安定である。

Description

１．発明の分野
本発明は、ＭＭＰ１３に結合する免疫グロブリンに、より特に、１つ以上のかかる免疫グロブリンを含むかまたは本質的にそれからなるポリペプチド（本明細書ではそれぞれ、「本発明の免疫グロブリン」および「本発明のポリペプチド」とも呼ばれる）に関する。本発明はまた、かかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを含む構築物、ならびにかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドをコードする核酸（本明細書では「本発明の核酸」とも呼ばれる）に；かかる免疫グロブリン、ポリペプチドおよび構築物を調製する方法に；かかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを発現するかまたは発現可能な宿主細胞に；かかる免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸および／または宿主細胞を含む組成物、および特に医薬組成物に；特に、本明細書に記載の予防および／または治療目的などの予防および／または治療目的のための、免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸、宿主細胞および／または組成物の使用に、関する。本発明の他の側面、態様、利点および用途は、本明細書のさらなる説明から明らかになるであろう。
２．発明の背景
変形性関節症（ＯＡ）は、世界中に及ぶ廃疾の最も一般的な原因の１つである。３，０００万人のアメリカ人がこれに罹患しており、最も一般的な関節障害である。米国人口の２０％以上が、２０２５年までにこれに罹患すると予測されている。この疾患は全身性ではなく、通常は少数の関節に限定されている。しかし、この疾患はすべての関節で、ほとんどの場合は膝、股関節、手、および脊椎で発生する。ＯＡは、慢性的な痛みと障害をもたらす関節軟骨（骨を覆う軟骨）の進行性の侵食によって特徴付けられる。最終的にこの疾患は、関節軟骨の完全な破壊、その下にある骨の硬化、骨棘形成などにつながり、すべて運動の喪失と痛みにつながる。痛みはＯＡの最も顕著な症状であり、多くの場合、患者が医療的援助を求める理由となる。ＯＡに治療法はなく；疾患管理はせいぜい緩和的な処置に限られ、疾患の進行の根本的な原因にはほとんど対処できない。
構造的疾患の進行を阻害し、理想的には症状および／または機能も改善する薬剤として定義できる疾患修飾性抗変形性関節症薬（ＤＭＯＡＤ）が、強く求められている。ＤＭＯＡＤは、高齢人口のこの慢性疾患において長期間にわたって処方される可能性が高いため、複数の併存疾患および薬物間相互作用の可能性がある標的集団において、優れた安全性データが要求される。
変形性関節症は、関節症状、関節軟骨の欠損に起因する徴候、ならびに骨、腱、および筋肉などを含む隣接組織における変化の組み合わせを特徴とする、多様な状態群として定義できる。関節軟骨の最も豊富な成分は、プロテオグリカンおよびコラーゲン（主にコラーゲンＩＩ）である。軟骨の主なプロテオグリカンはアグリカンである。疾患の開始は多因子性であり得るが、軟骨の破壊は、制御されないタンパク質分解性の細胞外マトリックス破壊（ＥＣＭ）の結果であると考えられる。
上記のように、軟骨細胞外マトリックスの主要成分はアグリカンである（Kiani et al。2002 Cell Research 12：19-32）。この分子は、軟骨に耐荷重性を与える水和ゲル構造を提供することにより、関節軟骨の適切な機能において重要である。アグリカンは、軟骨細胞によって発現される大きなマルチモジュラー分子（２３１７アミノ酸）である。そのコアタンパク質は、３つの球状ドメイン（Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３）および、グリコサミノグリカン鎖の結合のためのＧ２とＧ３の間の大きな拡張領域で構成されている。この拡張領域は、２つのドメイン、すなわちケラタン硫酸鎖で置換されたドメイン（ＫＳドメイン）とコンドロイチン硫酸鎖で置換されたドメイン（ＣＳドメイン）で構成されている。ＣＳドメインには、１００〜１５０のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合している。アグリカンはヒアルロナンと大きな複合体を形成し、ここでは５０〜１００のアグリカン分子が、Ｇ１ドメインおよびリンクタンパク質を介して１つのヒアルロナン分子と相互作用する。水を吸収すると（ＧＡＧ含有量により）、これらの複合体は圧縮に抵抗する可逆的に変形可能なゲルを形成する。関節軟骨の構造、体液貯留および機能は、アグリカンのマトリックス含有量、および無傷のコアタンパク質に結合したコンドロイチン硫酸の量に関連している。
ＩＩ型コラーゲン（コラーゲンＩＩ、Ｃｏｌ ＩＩ）は関節軟骨の５０％を構成する。コラーゲン原線維はネットワークを形成し、軟骨がプロテオグリカンを取り込むことを可能にし、組織に強度を提供する。コラーゲンは、三重の平行な左利きポリプロリンＩＩ型（ＰＰＩＩ）らせんの、右利きの束で構成される構造タンパク質である。三重らせん内のＰＰＩＩらせんの密なパッキングのため、アミノ酸である３番目ごとの残基は、Ｇｌｙ（グリシン）である。グリシンは側鎖を持たない最小のアミノ酸であるため、繊維状構造タンパク質において独自の役割を果たす。コラーゲンでは、３番目ごとの位置においてＧｌｙが必要とされるが、その理由は、三重らせんのアセンブリがこの残基をらせんの内部（軸）に配置するため、ここにはグリシンの単一の水素原子よりも大きい側基のためのスペースがないからである。
ＯＡの特徴は、１）アグリカンの分解、ドメインＧ３およびＧ２の漸進的な放出（結果として軟骨の「収縮」）、および最終的にＧ１ドメインの放出、ならびに２）コラーゲンの分解、軟骨構造を不可逆的に破壊することである。
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）がＯＡに関連する組織破壊に大きな役割を果たすことを実証する、説得力のある証拠が存在する。ＭＭＰは、細胞外マトリックスの分解および組織のリモデリングに関与する亜鉛依存性エンドペプチダーゼのファミリーである。約２８のＭＭＰファミリーメンバーがあり、これらは、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、膜型ＭＭＰ、マトリリシン、エナメリシンなどを含む様々なサブグループに分類できる。ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、およびＭＭＰ１８を含むコラゲナーゼは、三重らせん原線維コラーゲンを、特徴的な３／４および１／４断片に分解することできる。さらにＭＭＰ１４はまた、原線維コラーゲンを切断することも示されており、ＭＭＰ２もコラーゲン分解が可能であるという証拠がある。ＭＭＰは長い間、ＯＡの処置のための魅力的な治療標的として考えられてきた。しかし、関節炎の処置用に開発された広域スペクトルＭＭＰ阻害剤は、筋骨格症候群（ＭＳＳ）と呼ばれる痛みを伴う関節硬化の副作用のために、臨床試験で失敗した。ＭＳＳは、複数のＭＭＰの非選択的阻害によって引き起こされると考えられている。
Nam et al. (2017 Proc Natl Acad Sci USA 113:14970‐14975)は、ＭＭＰ１４の活性部位に特異的に向けられていることが明らかなナノボディについて記載している。
ＯＡにおける治療的介入は、薬物を関節軟骨へ標的化する困難さによっても妨げられている。関節軟骨は無血管および無リンパ組織であるため、従来の薬物送達経路（経口、静脈内、筋肉内）は、薬物の、受動拡散による滑膜毛細血管から軟骨への経滑膜移行に最終的に依存している。したがって、薬物を軟骨に選択的に標的化するメカニズムが存在しない場合、身体を全身的に高薬物濃度に曝露して、持続的な関節内治療用量を達成する必要がある。高い全身暴露の結果として、ＯＡの従来の治療法のほとんどは、深刻な毒性に悩まされてきた。
さらに、新しく開発されたＤＭＯＡＤのほとんどは、関節内に投与された場合でも、関節内での滞留時間が短い（Edwards 2011 Vet. J. 190:15-21; Larsen et al. 2008 J Pham Sci 97:4622-4654）。治療用タンパク質の関節内（ＩＡ）送達は、関節空間からの急速なクリアランスおよび軟骨内での保持不足により制限されている。関節における薬物の滑膜滞留時間は、多くの場合２４時間未満である。ほとんどのＩＡ注射された薬物の急速なクリアランスのため、有効な濃度を維持するには頻繁な注射が必要となる（Owen et al., 1994 Br J Clin Pharmacol 38:349-355）。しかし、頻繁なＩＡ注射は、痛みや不快感のために患者のコンプライアンスが問題となる可能性があり、また関節に感染症を引き起こすリスクがあるため、望ましくない。
効果的なＤＭＯＡＤの必要性が残されている。
３．発明の概要
本発明は、他の有利な特性に加えて、従来技術のアミノ酸配列および抗体と比較した場合に、改善された予防的、治療的および／または薬理学的特性（例えば、改善された調製の容易さ、良好な安定性、および／または商品のコスト削減）を有する、ＯＡに対するポリペプチドを提供することを目的とする。特に本発明は、ＭＭＰを阻害し、特にＭＭＰ１３を阻害するための、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）およびこれを含むポリペプチドを提供することを目的とする。
本発明者らは、ＭＭＰ１３の酵素活性を阻害するための最良の領域は、ＩＳＶＤを触媒ポケットに対して高めることであろうと仮定した。しかし、これは大きな課題であることが判明した。特に、ＭＭＰ１３は不活性なプロ形態（ｐｒｏＭＭＰ１３）として分泌され、ここでプロドメインは触媒ポケットをマスクするため、免疫応答を高めるためにポケットにアクセスすることができない。一方、活性化されたＭＭＰ１３は半減期が短く、これは主に自己タンパク質分解によるものである。さらに、本発明者らが以前の２つの問題を克服した後でも、様々の種の間での触媒ドメインの高い配列保存が、強固な免疫応答に先行することが判明した。
最終的に本発明者らは、新しいツールおよび慣例にないスクリーニング方法のオリジナルな開発により、これらの課題に対処することができた。
様々なスクリーニングキャンペーンからＩＳＶＤを分離し、さらに、安定性、親和性および阻害活性を含む多様で好ましい特徴を有してさらに操作した。ＭＭＰ１３に結合する本発明の一価ＩＳＶＤは、比較薬よりも優れていた。ＭＭＰ１３の活性を阻害するのにあまり適さないＩＳＶＤを含む二重パラトピックポリペプチドは、さらに強力であった。
したがって本発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に結合し、好ましくはマトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ１３に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドに関する。本発明はまた、それぞれ個別にＭＭＰ１３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶＤを含む、ポリペプチドも含み、ここで
ａ）少なくとも「第１」ＩＳＶＤは、ＭＭＰ１３の第１の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、または立体構造に特異的に結合し；およびここで、
ｂ）少なくとも「第２」ＩＳＶＤは、第１の抗原決定基エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造とはそれぞれ異なる、ＭＭＰ１３の第２の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造に、特異的に結合する。
さらに提供されるのは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に結合する単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、および、軟骨プロテオグリカン、好ましくはアグリカンに結合するさらなる単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含む、本発明のポリペプチドである。
さらなる側面は、医薬として使用するための、本発明によるポリペプチドに関する。さらに別の側面は、例えばＭＭＰ１３活性が関与する、個体の疾患または障害を処置し予防する方法に関し、この方法は、本発明のポリペプチドを、前記疾患または障害の症状を処置または予防するのに有効な量で、前記個体に投与することを含む。
ポリペプチドおよび組成物の他の側面、利点、用途および使用は、本明細書のさらなる開示から明らかになるであろう。本明細書の本文にわたりいくつかの文書が引用されている。ここに引用された各文書（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記であっても下記であっても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のすべては、本発明が先行発明によってかかる開示に先行する権利を与えられない、ということの承認として解釈されるべきではない。
４．図の凡例
図１は、蛍光発生コラーゲンアッセイにおけるプロファイル１ナノボディ（左のグラフ）およびプロファイル２ナノボディ（右のグラフ）の用量反応曲線を示す図である。 図２は、ＭＭＰ１３リードナノボディの選択性を示す図である。 図３は、マウス抗ヒトＭＭＰ１３ ｍＡｂ（R&D Systems #MAB511）で被覆された、ヒト全長ＭＭＰ１３上のプロファイル１およびプロファイル２ナノボディのパネルに対する、０．６ｎＭのビオチン化４０Ｅ０９の競合ＥＬＩＳＡを示す図である。ＭＭＰ１３は、ＡＰＭＡとのインキュベーションにより、３７℃で９０分間活性化された。 図４は、ラットＭＭＴモデルにおける、軟骨分解のナノボディによる阻害を示す図である。
５．詳細な説明
安全で効果的なＯＡ医薬品の必要性が残されている。これらの医薬は、特に広く適用可能なフォーマットが意図される場合、様々な頻繁に対立する要件に適合する必要がある。そのためこのフォーマットは、好ましくは広範囲の患者に有用であるべきである。フォーマットは好ましくは安全であり、頻繁なＩＡ投与による感染を誘発しない。さらに、フォーマットは患者に優しいものであることが望ましい。例えば、このフォーマットは、投与の際にすぐに除去されないように、関節において延長された半減期を有するべきである。しかし、半減期を延長しても、好ましくは標的外の活性や副作用が生じたり、有効性が制限されるべきではない。
本発明は、これらの要件の少なくとも１つを実現する。
従来にはないスクリーニング、特性評価、および組み合わせ戦略に基づいて、本発明者らは驚くべきことに、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）が、in vitroおよびin vivo実験で非常に良好に機能することを観察した。
さらに本発明者らは、ＩＳＶＤを再操作して、比較薬より優れた性能を発揮させることができた。二重パラトピック方式では、この性能が保持されただけでなく、改善までされた。
一方、本発明のＩＳＶＤは、比較分子よりも有意に効果的であることも実証された。
本発明は、ＭＭＰ、特にＭＭＰ１３に拮抗するポリペプチドであって、比較分子と比較して、より安全なプロファイルを含む改善された予防的、治療的および／または薬理学的特性を有する前記ポリペプチドを提供する。
したがって本発明は、（本明細書で定義されるように）ＭＭＰに向けられるおよび／または特異的に結合し得る、ＩＳＶＤおよびポリペプチドに関し、好ましくは、前記ＭＭＰは、ＭＭＰ１３（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ８（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ１９（マトリックスメタロプロテイナーゼＲＡＳＩ）およびＭＭＰ２０（エナメリシン）からなる群から選択され、好ましくは前記ＭＭＰはＭＭＰ１３であり、およびその活性を調節し、特に、ＭＭＰ１３に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドに関し、ここでＭＭＰ１３への結合は、ＭＭＰ１３の活性を調節する。
定義
別に示されているか定義されていない限り、使用されるすべての用語は、当業者には明白であろうこの分野でのそれらの通常の意味を有する。例えば、次のような標準的なハンドブックが参照される：Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、F. Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987)、Lewin (Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985)、Old et al. (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981)；Roitt et al. (Immunology (6th Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001)、Roitt et al. (Roitt’s Essential Immunology (10th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001)、およびJaneway et al. (Immunobiology (6th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005)、ならびに本明細書で引用する一般的な背景技術。
別に示されていない限り、特に詳細に説明されていないすべての方法、ステップ、技術、および操作は、それ自体既知の様式で実行でき、また実行されており、これは当業者には明らかであろう。例えば、本明細書で言及される標準ハンドブックおよび一般的な背景技術、ならびにそこに引用されているさらなる参考文献が再び参照され；また、例えば、以下のレビューも参照される：Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006)、Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006)、Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001)、Schmitz et al. (Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000)、Gonzales et al. (Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005)；これらは、親和性成熟などのタンパク質工学技術、および免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性およびその他の望ましい特性を改善するためのその他の技術について、説明している。
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の言及を含むことに留意すべきである。したがって例えば、１つの「試薬」への言及には、かかる異なる試薬の１つ以上が含まれ、「方法」への言及には、改変され得るかまたは本明細書に記載の方法で置換され得る、当業者に知られている同等のステップおよび方法への言及が含まれる。
特に明記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のすべての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載された本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。かかる均等物は、本発明に含まれることが意図されている。
用語「および／または」は、本明細書で使用される場合は常に、「および」、「または」、および「前記用語によって接続される要素のすべてまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１５％以内、より好ましくは１０％以内、おとび最も好ましくは５％以内を意味する。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈が特に必要としない限り、「含む」という単語、および「含む」および「含むこと」などの変形は、述べられた整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを含むが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを除外しない、ということを意味する。本明細書で使用する場合、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」または「含む（including）」という用語で置き換えることができ、または場合によっては本明細書において、「有する」という用語を使用することもできる。
本明細書で使用される場合、用語「配列」（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語）は、一般に、文脈がより限定された解釈を必要としない限り、関連するアミノ酸配列ならびにこれをコードする核酸またはヌクレオチド配列の両方を含むと理解されるべきである。
アミノ酸配列は、文脈に依存して、単一のアミノ酸または、２つ以上のアミノ酸の分岐していない配列を意味すると解釈される。ヌクレオチド配列は、３つ以上のヌクレオチドの非分岐配列を意味すると解釈される。
アミノ酸は、天然のタンパク質に一般的に見られるＬ−アミノ酸である。アミノ酸残基は、標準の３文字または１文字のアミノ酸コードに従って示される。例えば、WO 08/020079の４８頁表Ａ−２を参照されたい。Ｄ−アミノ酸を含むこれらのアミノ酸配列は、この定義に含まれることを意図しない。翻訳後修飾されたアミノ酸を含むアミノ酸配列は、この表Ａ−２に示されている記号および、例えばヒドロキシル化またはグリコシル化などの修飾位置を使用して、最初に翻訳されるアミノ酸配列として説明し得るが、しかしこれらの修飾は、アミノ酸配列に明示的に示されてはならない。配列修飾された結合、架橋およびエンドキャップ、非ペプチジル結合などとして発現できるペプチドまたはタンパク質はすべて、この定義に含まれる。
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「タンパク質／ペプチド」、および「ポリペプチド」は、本開示を通して交換可能に使用され、それぞれは本開示の目的に対して同じ意味を有する。各用語は、２つ以上のアミノ酸の直鎖でできた有機化合物を指す。化合物は、１０以上のアミノ酸、２５以上のアミノ酸；５０以上のアミノ酸；１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、さらには３００以上のアミノ酸を有し得る。当業者は、以下を理解するであろう：すなわち、ポリペプチドは一般にタンパク質よりも少ないアミノ酸を含むが、しかしポリペプチドとタンパク質を区別するアミノ酸の数の、当技術分野で認識されているカットオフポイントは存在しないこと；ポリペプチドは、化学合成または組換え法により作成できること；および、タンパク質は一般に、当分野で 知られている組換え方法によりin vitroまたはin vivoで作製されること。慣例により、ポリペプチドの一次構造のアミド結合は、アミノ酸が書かれている順序の通りであり、ここでポリペプチドのアミン末端（Ｎ末端）は常に左側にあり、酸末端（Ｃ末端）は右側にある。
核酸またはアミノ酸配列が、「（本質的に）単離された（形態）（にある）」と見なされるのは、−例えば、それが得られた反応培地または培養培地と比較して−、上記ソースまたは培地と通常関連している少なくとも１つの別の成分から、例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分または高分子、または少なくとも１つの汚染物質、不純物または微量成分などから、分離された場合である。特に、核酸またはアミノ酸配列は、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より特に少なくとも１００倍、および最大１０００倍またはそれ以上まで精製されている場合に、「（本質的に）単離された」と見なされる。「（本質的に）単離された形態にある」核酸またはアミノ酸は、適切な技術を使用して、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動などの適切なクロマトグラフィー技術を使用して決定されるように、好ましくは本質的に均質である。
ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を「含む」、または別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から「本質的になる」と言われる場合、これは、後者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、最初に言及されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列それぞれに組み込まれていることを意味し得るが、より一般的には、これは一般に、最初に言及されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列がその配列内に、後者の配列と同じヌクレオチド配列またはアミノ酸配列それぞれを有する、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のストレッチそれぞれを含むことを意味し、最初に言及された配列が実際にどのように生成または取得されたか（例えば、本明細書に記載の任意の適切な方法による）には関係しない。非限定的な例により、本発明のポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメイン（「ＩＳＶＤ」）を含むと言われる場合、これは、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン配列が、本発明のポリペプチドの配列に組み込まれたことを意味し得るが、より通常には、これは一般に、本発明のポリペプチドがどのように生成または取得されたかに関係なく、本発明のポリペプチドがその配列内に、免疫グロブリン単一可変ドメインの配列を含むことを意味する。また、核酸またはヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むと言われる場合、最初に言及された核酸またはヌクレオチド配列は、これが発現産物（例えばポリペプチド）に発現されるときに、後者のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列が前記発現産物の一部を形成している（言い換えると、後者のヌクレオチド配列は、最初に言及されたより大きな核酸またはヌクレオチド配列と同じリーディングフレームにある）。また、本発明の構築物がポリペプチドまたはＩＳＶＤを含むと言われる場合、これは、前記構築物が、前記ポリペプチドまたはＩＳＶＤをそれぞれ、少なくとも包含することを意味し得るが、より一般的には、これは、前記構築物が、前記ポリペプチドまたはＩＳＶＤに加えて、基、残基（例えばアミノ酸残基）、部分および／または結合単位を包含することを意味し、ここで前記ポリペプチドまたはＩＳＶＤが前記の基、残基（例えば、アミノ酸残基）、部分および／または結合単位にどのように接続されているかには関係せず、および前記構築物がどのように生成または取得されたかにも関係しない。
「本質的に〜からなる」とは、本発明の方法で使用される免疫グロブリン単一可変ドメインが、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと全く同一であるか、または、本発明の次のような免疫グロブリン単一可変ドメインに対応することを意味する：すなわち、限られた数のアミノ酸残基、例えば１〜２０アミノ酸残基など、例えば１〜１０のアミノ酸残基、好ましくは１〜６のアミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５または６個のアミノ酸残基を、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端とカルボキシ末端の両方に付加されて有する、免疫グロブリン単一可変ドメイン。
２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージは、次のように計算することができる：［第２ヌクレオチド配列内の対応する位置のヌクレオチドと同一の、第１ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの数］を、［第１ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの総数］で除算し、［１００％］を掛ける；ここで、第１ヌクレオチド配列と比較した、第２ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの各欠失、挿入、置換または追加は、単一のヌクレオチド（位置）における違いと見なされる。代替的に、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、NCBI Blast v2.0などの配列アラインメントのための既知のコンピューターアルゴリズムを使用して、標準設定を用いて計算され得る。配列同一性の程度を決定するための他のいくつかの技術、コンピューターアルゴリズムおよび設定は、例えば、WO 04/037999、EP 0967284、EP 1085089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185およびGB 2357768に記載されている。通常、上記で概説した計算方法に従って２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的で、最大数のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列が「第１」ヌクレオチド配列とされ、他のヌクレオチド配列が「第２」ヌクレオチド配列とされる。
２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列の間の「配列同一性」のパーセンテージ（本明細書では「アミノ酸同一性」とも呼ばれる）は、次のように計算することができる：［第２アミノ酸配列内の対応する位置のアミノ酸残基と同一の、第１アミノ酸配列内のアミノ酸残基の数］を、［第１アミノ酸配列内のアミノ酸残基の総数］で除算し、［１００％］を掛ける；ここで、第１アミノ酸配列と比較した、第２アミノ酸配列内のアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換または追加は、単一のアミノ酸残基（位置）における違い、すなわち本明細書で定義される「アミノ酸差異」と見なされる。代替的に、２つ以上のアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、ヌクレオチド配列の配列同一性の程度を決定するための上記のような既知のコンピューターアルゴリズムを使用して、再度標準設定を用いて計算され得る。通常、上記で概説した計算方法に従って２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的で、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列が「第１」アミノ酸配列とされ、他のアミノ酸配列が「第２」アミノ酸配列とされる。
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際に、当業者はいわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮してもよく、これは一般的に、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換されるが、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんどまたは本質的に影響を与えないアミノ酸置換として説明することができる。かかる保存的アミノ酸置換は、当分野において、例えばWO 04/037999、GB 335768、WO 98/49185、WO 00/46383およびWO 01/09300からよく知られており；およびかかる置換の（好ましい）種類および／または組み合わせは、例えばWO 04/037999ならびにWO 98/49185およびそこに引用されているさらなる参考文献からの関連する教示に基づいて選択され得る。
かかる保存的置換は、好ましくは、以下のグループ（ａ）〜（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じグループ内の別のアミノ酸残基で置換される置換である：（ａ）小さな脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；（ｂ）極性の負に帯電した残基およびそれらの（非帯電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は、以下の通りである：Ａｌａを、ＧｌｙまたはＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；Ａｓｎを、ＧｌｎまたはＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｎをＡｓｐへ；Ｇｌｙを、ＡｌａまたはＰｒｏへ；Ｈｉｓを、ＡｓｎまたはＧｌｎへ；Ｉｌｅを、ＬｅｕまたはＶａｌへ；Ｌｅｕを、ＩｌｅまたはＶａｌへ；Ｌｙｓを、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕへ；Ｍｅｔを、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、またはＩｌｅへ；Ｐｈｅを、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｙｒをＴｒｐへ；および／またはＰｈｅを、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕへ。
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al. (“Principles of Protein Structure”, Springer-Verlag, 1978)によって開発された異なる種の相同タンパク質の間のアミノ酸変異の頻度の分析、Chou and Fasman (Biochemistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978)によって開発された構造形成可能性の分析、およびEisenberg et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984)、Kyte and Doolittle (J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981)およびGoldman et al. (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986)によって開発されたタンパク質の疎水性パターンの分析に、基づいてもよい；これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ナノボディの一次、二次および三次構造に関する情報は、本明細書の説明および上記で引用した一般的な背景技術に記載されている。また、この目的のために、ラマからのＶＨＨドメインの結晶構造は、例えば、Desmyter et al. (Nature Structural Biology, 3: 803, 1996)、Spinelli et al. (Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996)およびDecanniere et al. (Structure, 7 (4): 361, 1999)により与えられている。従来のＶＨドメインにおいてＶＨ／ＶＬ界面を形成するいくつかのアミノ酸残基、およびこれらの位置での潜在的なラクダ化置換についてのさらなる情報は、上記の先行技術に見出すことができる。
アミノ酸配列および核酸配列は、それらがその全長にわたって１００％の配列同一性（本明細書で定義されるもの）を有する場合、「完全に同一」と言われる。
２つのアミノ酸配列を比較する場合、用語「アミノ酸差異（amino acid difference）」は、第２の配列と比較した、第１の配列の位置にある単一のアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を指す；２つのアミノ酸配列が、１つ、２つまたはそれ以上のかかるアミノ酸差異を含み得ることが理解されている。より具体的には、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドにおいて、用語「アミノ酸差異」は、ｂ）、ｄ）またはｆ）で特定されるＣＤＲ配列の位置上の、それぞれａ）、ｃ）またはｅ）のＣＤＲ配列と比較した、単一アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を指す。ｂ）、ｄ）およびｆ）のＣＤＲ配列は、それぞれａ）、ｃ）またはｅ）のＣＤＲ配列と比較して、１、２、３、４または最大５個のかかるアミノ酸差異を含み得ることが理解される。
「アミノ酸差異」は、任意の１、２、３、４または最大５個の置換、欠失または挿入、またはそれらの任意の組み合わせであることができ、これは、本発明のポリペプチドなどの本発明のＭＭＰ１３結合剤の特性を改善するか、または、本発明のポリペプチドなどの本発明のＭＭＰ１３結合剤の所望の特性から、または所望の特性のバランスもしくは組み合わせから、少なくとも過度に低減のないものである。この点において、本発明のポリペプチドなどの本発明で得られたＭＭＰ１３結合剤は、１、２、３、４、または最大５つの置換、欠失、または挿入なしの１つ以上のＣＤＲ配列を含むポリペプチドと比較して、少なくとも、同じ、ほぼ同じ、またはより高い親和性でＭＭＰ１３に結合すべきである。親和性は、当分野で 知られている任意の適切な方法により測定され得るが、好ましくは、実施例の節に記載の方法により測定される。
この点において、ｂ）、ｄ）および／またはｆ）によるＣＤＲのアミノ酸配列は、それ自体知られているかまたは実施例に記載されているような親和性成熟の１つ以上の技術を使用した親和性成熟を用いた、それぞれａ）、ｃ）および／またはｅ）によるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であってよい。例えば、本発明のポリペプチドの発現に使用される宿主生物に応じて、かかる欠失および／または置換は、翻訳後修飾のための１つ以上の部位（１つ以上のグリコシル化部位など）が削除されるように設計され得、これは当業者の能力の範囲内であろう（実施例を参照）。
本明細書で使用される場合、任意の配列番号の文脈における「によって表される」は、前記配列番号「を含むかまたはそれからなる」と等価であり、好ましくは前記配列番号「からなる」と等価である。
本明細書で使用される「ナノボディファミリー」、「ＶＨＨファミリー」または「ファミリー」とは、同一の長さを有するナノボディおよび／またはＶＨＨ配列のグループを指し（すなわち、それらはその配列内に同じ数のアミノ酸を有する）、そのうち、位置８と位置１０６（Kabat番号付けによる）の間のアミノ酸配列は、８９％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
互換的に使用可能な用語「エピトープ」および「抗原決定基」とは高分子の一部を指し、例えば免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／または本発明のポリペプチドなどの、抗原結合分子によって、より具体的には前記分子の抗原結合部位によって認識される、ポリペプチドまたはタンパク質である。エピトープは、免疫グロブリンに対する最小結合部位を定義し、したがって免疫グロブリンの特異性の標的を表す。
エピトープを認識する抗原結合分子（免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／または本発明のポリペプチドなど）の一部は、「パラトープ」と呼ばれる。
特定のエピトープ、抗原またはタンパク質（またはその少なくとも一部、断片またはエピトープ）に対して、「結合」または「特異的に結合」できるか、「親和性を有する」か、および／または「特異性を有する」アミノ酸配列（本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、抗体、ポリペプチド、または一般にその抗原結合タンパク質またはポリペプチドまたは断片）は、前記エピトープ、抗原またはタンパク質に「対する」または「向けられる」と言われるか、またはかかるエピトープ、抗原またはタンパク質に関する「結合」分子であるか、または「抗」エピトープ、「抗」抗原または「抗」タンパク質（例えば、「抗」ＭＭＰ１３）であると言われる。
親和性は、分子相互作用の強度または安定性を示す。親和性は通常、ＫＤ、または解離定数として与えられ、これはモル／リットル（またはＭ）の単位を有する。親和性は会合定数ＫＡとして表すこともでき、これは１／ＫＤに等しく、（モル／リットル）−１（またはＭ−１）の単位を有する。本明細書において、２つの分子間の相互作用の安定性は、主にそれらの相互作用のＫＤ値に関して表される。ＫＡ＝１／ＫＤの関係を考慮して、分子相互作用の強度をそのＫＤ値によって指定することを用いて、対応するＫＡ値を計算できることは、当業者には明らかである。ＫＤ値はまた、分子相互作用の強度を熱力学的意味でも特徴付けるが、これはＫＤ値が、結合の自由エネルギー（ΔＧ）の変化に、よく知られている関係ΔＧ＝ＲＴｌｎ（ＫＤ）（等価的にΔＧ＝−ＲＴｌｎ（ＫＡ））（式中、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度、ｌｎは自然対数を表す）によって関連するためである。
重要（例えば特異的）と考えられる生物学的相互作用のＫＤは、通常１０−１２Ｍ（０．００１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲である。相互作用が強いほど、ＫＤは低くなる。
ＫＤは、ｋｏｆｆで表される複合体の解離速度定数と、ｋｏｎで表されるその会合速度との比として表すこともできる（したがってＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎおよびＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。オフレートｋｏｆｆの単位はｓ−１である（ｓは秒のＳＩ単位表記である）。オンレートｋｏｎの単位はＭ−１ｓ−１である。オンレートは、１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変化し、二分子相互作用の拡散律速会合速度定数に近づく。オフレートは、関係ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆによって、特定の分子相互作用の半減期に関連している。オフレートは、１０−６ｓ−１（複数日数のｔ１／２を有する不可逆的な複合体に近い）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
ＩＳＶＤなどの抗原結合タンパク質の、抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば飽和結合アッセイおよび／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイを含む、それ自体既知の任意の適切な方法、および当技術分野でそれ自体知られているそれらの様々な変形、ならびに本明細書で言及される他の技術により、決定することができる。
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が既知の異なる技術によって測定でき、例えば、周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術などであり（例えば、Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559）ここで、一方の分子はバイオセンサーチップに固定され、もう一方の分子は、ｋｏｎ、ｋｏｆｆの測定、したがってＫＤ（またはＫＡ）値をもたらすフロー条件下で、固定された分子上を通過する。これは例えば、よく知られているBIACORE（登録商標）機器（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）を使用して実行できる。Kinetic Exclusion Assay（KINEXA（登録商標）機器）（Drake et al. 2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43）は、結合パートナーの標識なしで溶液中の結合イベントを測定し、複合体の解離を動力学的に除外することに基づいている。溶液内親和性分析はまた、自動化されたバイオ分析と迅速な試料ターンアラウンドのプラットフォームを提供するGYROLAB（登録商標）イムノアッセイシステム（Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）を使用して実行することもできる。
また、測定プロセスが、例えばある分子のバイオセンサーのコーティングに関連するアーチファクトにより、意味された分子の固有の結合親和性に何らかの影響を与える場合、測定されたＫＤが見かけのＫＤに対応し得ることも当業者には明らかであろう。また、１つの分子が他の分子に対する複数の認識部位を含む場合、見かけのＫＤを測定してもよい。かかる状況において、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合力の影響を受ける可能性がある。特に、ＫＤの正確な測定は非常に労働集約的である可能性があり、その結果、見かけ上のＫＤ値が、２つの分子の結合強度を評価するためにしばしば決定される。すべての測定が一貫した方法で行われる限り（例えば、アッセイ条件を変更しない限り）、見かけのＫＤ測定を真のＫＤの近似値として使用できるため、本書ではＫＤおよび見かけのＫＤは、同等の重要性または関連性で扱うべきである。
「特異性」という用語は、例えば、WO 08/020079の５３〜５６頁の段落ｎ）に記載されているように、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤなど）分子が結合できる、抗原または抗原決定基の異なる種類の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、WO 08/020079（参照により本明細書に組み込まれる）の５３〜５６頁に記載されているように、親和性および／または結合力に基づいて決定することができ、ここには、抗原結合分子（本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤなど）と関連抗原の間の結合を測定するためのいくつかの好ましい技術も記載されている。典型的には、抗原結合タンパク質（本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなど）は、解離定数（ＫＤ）として１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、およびより好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルで、それらの抗原に結合する（すなわち、会合定数（ＫＡ）として１０５〜１０１２リットル／モル以上、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル以上、およびより好ましくは１０８〜１０１２リットル／モル）。１０−４モル／リットルを超える任意のＫＤ値（または１０４リットル／モル未満の任意のＫＡ値）は、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価ＩＳＶＤは、所望の抗原に、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満、例えば１０〜５ｐＭ以下などの親和性で、結合するであろう。
免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドが、（第１）標的または抗原に対して、別の（第２）標的または抗原と比較して「特異的」であると言われるのは、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドが第１の抗原に、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原に結合する場合の親和性よりも、（上記のように、およびＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆレートおよび／またはＫｏｎレートとして適切に表現されて）少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍以上の親和性で結合する場合である。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドは、第１の標的または抗原に、前記免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原に結合するＫＤよりも少なくとも１０分の１、例えば少なくとも１００分の１、および好ましくは少なくとも１０００分の１、またはさらに小さいＫＤ値で、結合し得る。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドが、第１の標的または抗原に対して、第２の標的または抗原と比較して「特異的」である場合、（本明細書で定義されるように）これは前記第１の標的または抗原には向けられるが、前記第２の標的または抗原には向けられない。
抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば飽和結合アッセイ、スキャッチャード分析および／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイなどを含む、それ自体既知の任意の適切な方法、および当技術分野で知られているそれらの異なる変形；ならびに本明細書で言及される他の技術により、決定することができる。当業者には明らかであり、およびWO 08/020079の５３〜５６頁に記載されているように、解離定数は、実際のまたは見かけの解離定数であってもよい。解離定数を決定する方法は当業者には明らかであり、例えば、WO 08/020079の５３〜５６頁に記載されている技術が含まれる。
親和性を評価するために使用できる他の好ましいアプローチは、Friguet et al. 1985 (J. Immunol. Methods 77: 305-19)の２ステップＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）手順である。この方法は、液相結合平衡測定を確立し、プラスチックなどの支持体への１つの分子の吸着に関連する、起こりうるアーチファクトを回避する。当業者には明らかなように、またWO 08/020079の５３〜５６頁に記載されているように、解離定数は実際のまたは見かけの解離定数であってよい。解離定数を決定する方法は当業者には明らかであり、例えばWO 08/020079の５３〜５６頁に記載されている技術が含まれる。
一側面において、本発明は、本発明のＩＳＶＤおよびポリペプチドなどのＭＭＰ１３結合剤に関し、ここで前記ＭＭＰ１３結合剤は、ＭＭＰ１またはＭＭＰ１４（膜型）に結合しない。
最後に、多くの状況において、経験ある科学者はある参照分子に対する結合親和性を決定するのが便利であると判断し得ることに、注意すべきである。例えば、分子ＡとＢの間の結合強度を評価するために、例えばＢに結合することが知られており、かつ発蛍光団または発色団または他の化学成分で好適に標識されている、例えばＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）または他のフォーマット（蛍光検出用の発蛍光団、光吸収検出用の発色団、ストレプトアビジン媒介ＥＬＩＳＡ検出用のビオチン）についてのビオチンなどで好適に標識されている、参照分子Ｃを使用し得る。通常、参照分子Ｃを固定濃度に維持し、Ａの濃度をＢの特定の濃度または量に対して変化させる。その結果、Ａの不在下でＣについて測定されたシグナルが半分になるところでのＡの濃度に対応する、ＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆ、および参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知である場合、相互作用Ａ−Ｂの見かけのＫＤは、次の式から得られる：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆである場合、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに注意。ＩＣ５０の測定が、比較される結合剤について一貫した方法で行われる場合（例えば、ｃｒｅｆを固定するなど）、分子相互作用の強度または安定性の違いを、ＩＣ５０を比較することで評価でき、この測定は、このテキスト全体でＫＤまたは見かけのＫＤに等価であると判断される。
半数阻害濃度（ＩＣ５０）はまた、例えば薬理効果などの生物学的または生化学的機能を阻害することにおける、化合物の有効性の尺度でもある。この定量的尺度は、一定の生物学的プロセス（またはプロセスの成分、すなわち、酵素、細胞、細胞受容体、走化性、退形成、転移、侵襲性など）を半分に阻害するために必要な、ポリペプチドまたはＩＳＶＤ（ナノボディなど）の量を示す。言い換えれば、これは物質の最大半数（５０％）阻害濃度（ＩＣ）（５０％ＩＣ、またはＩＣ５０）である。ＩＣ５０値は、本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤ（例えばナノボディ）などの所定のアンタゴニストについて、アゴニストの最大生物学的応答の半分を阻害するために必要な濃度を決定することにより、計算することができる。薬物のＫＤは、用量反応曲線を作成し、本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤ（例えばナノボディ）などのアンタゴニストの異なる濃度が、アゴニスト活性を逆転させる効果を調べることにより、決定することができる。
半数効果濃度（ＥＣ５０）という用語は、指定された暴露時間の後、ベースラインと最大の中間の反応を引き起こす化合物の濃度を指す。本文脈において、これは、ポリペプチド、またはＩＳＶＤ（例えばナノボディ）の効力の尺度として使用される。段階的用量反応曲線のＥＣ５０は、最大効果の５０％が観察される化合物の濃度を表す。濃度は、モル単位で表されることが好ましい。
生物学的システムにおいて、リガンド濃度のわずかな変化は、典型的には、Ｓ字関数に従った急速な応答の変化をもたらす。リガンド濃度の増加に伴う応答の増加が鈍化し始める変曲点が、ＥＣ５０である。これは、適合線の導出によって数学的に決定できる。推定のためにグラフに依存することは、ほとんどの場合に便利である。ＥＣ５０が実施例の節で提供されている場合、実験は、ＫＤを可能な限り正確に反映するように設計されている。すなわち、ＥＣ５０値はＫＤ値と見なされる。用語「平均ＫＤ」は、少なくとも１回、しかし好ましくは１回より多くの、例えば少なくとも２回の実験で得られた、平均ＫＤ値に関する。「平均」という用語は、数学用語の「平均」（データの合計をデータのアイテムの数で割ったもの）を指す。
これはまた、化合物の阻害（５０％阻害）の尺度であるＩＣ５０にも関連している。競合結合アッセイおよび機能的アンタゴニストアッセイの場合、ＩＣ５０は用量反応曲線の最も一般的な要約測度である。アゴニスト／刺激剤アッセイの場合、最も一般的な要約測度はＥＣ５０である。
阻害定数Ｋｉは、阻害剤がどれだけ強力かを示す指標である；これは、半数阻害をもたらすのに必要な濃度である。実験条件に応じて変化する可能性のあるＩＣ５０とは異なり（しかし上記を参照のこと）、Ｋｉは絶対値であり、しばしば薬物の阻害定数と呼ばれる。阻害定数Ｋｉは、次のCheng-Prusoff方程式を使用して計算できる：
式中、［Ｌ］はリガンドの固定濃度である。
本明細書で使用される、本発明のポリペプチドの「効力」という用語は、その特定の効果が生じるのに必要な本発明のポリペプチドの量の関数である。
これは単純に、そのポリペプチドのＩＣ５０の逆数として測定される。これは、本発明のポリペプチドの、ＭＭＰ１３の活性を調節および／または部分的もしくは完全に阻害する能力を指す。より具体的には、前記ポリペプチドの、本明細書で定義されるＭＭＰ１３活性を低下させるか、または完全に阻害する能力を指す場合がある。したがってこれは、前記ポリペプチドの、プロテアーゼ活性エンドペプチダーゼ活性などのタンパク質分解を阻害する、および／または、例えば、アグリカン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩＶおよびゼラチンなどの基質への結合を阻害する能力を指し得る。効力は、当技術分野で知られているか、または本明細書に記載されている任意の適切なアッセイによって測定され得る。
本発明のポリペプチドの「有効性」は、効果自体の最大強度を、飽和ポリペプチド濃度において測定する。有効性は、本発明のポリペプチドから達成可能な最大応答を示す。これは、ポリペプチドが所望の（治療）効果を生み出す能力を指す。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＭＭＰ１３に、例えばKinExAによって決定される場合、ＫＤとして１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１３Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、好ましくは最大で１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍもしくは１Ｅ−０９Ｍ未満、または１Ｅ−１０Ｍ未満、例えば５Ｅ−１１Ｍ、４Ｅ−１１Ｍ、３Ｅ−１１Ｍ、２Ｅ−１１Ｍ、１．７Ｅ−１１Ｍ、１Ｅ−１１Ｍなど、または５Ｅ−１２Ｍ、４Ｅ−１２Ｍ、３Ｅ−１２Ｍ、１Ｅ−１２Ｍなどで、結合する
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、例えば競合ＥＬＩＳＡ、競合ＴＩＭＰ−２ ＥＬＩＳＡ、蛍光発生ペプチドアッセイ、蛍光発生コラーゲンアッセイ、またはコラーゲン分解アッセイ、例えば実施例の節で詳述されるようなものによって決定される場合、ＩＣ５０が１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−;１１Ｍの間で、ＭＭＰ１３の活性を阻害する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、ＩＣ５０が最大１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍ、５Ｅ−０９Ｍ、または４Ｅ−９Ｍ、３Ｅ−９Ｍ、２Ｅ−９Ｍ、例えば１Ｅ−９Ｍなどで、ＭＭＰ１３の活性を阻害する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、例えば競合ＥＬＩＳＡ、競合ＴＩＭＰ−２ ＥＬＩＳＡ、蛍光発生ペプチドアッセイ、蛍光発生コラーゲンアッセイまたはコラーゲン分解アッセイによって決定される場合、ＥＣ５０が１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１１Ｍの間で、ＭＭＰ１３に結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、例えばＳＰＲによって決定される場合、オフレートが１Ｅ−０４（ｓ−１）未満でＭＭＰ１３に結合する。
ＩＳＶＤまたはポリペプチドなどのアミノ酸配列が、２つの異なる抗原または抗原決定基（例えば、哺乳動物の異なる種からのＭＭＰ１３、例えばヒトＭＭＰ１３、イヌＭＭＰ１３、ウシＭＭＰ１３、ラットＭＭＰ１３、ブタＭＭＰ１３、マウスＭＭＰ１３、ウサギＭＭＰ１３、カニクイザルＭＭＰ１３、および／またはアカゲザルＭＭＰ１３など）に対して「交差反応性である」と言われるのは、これが、これらの異なる抗原または抗原決定基に特異的（本明細書で定義のように）である場合である。ＩＳＶＤまたはポリペプチドは、２つの異なる抗原に対する結合親和性が、２、５、１０、５０、１００倍またはそれ以上に異なる可能性があっても、これらの異なる抗原または抗原決定基に（本明細書で定義されるように）特異的であれば、交差反応性であると考えられることが理解されよう。
ＭＭＰ１３は、ＣＬＧ３またはコラゲナーゼ３、ＭＡＮＤＰ１、ＭＭＰ１３、マトリックスメタロペプチダーゼ１３、またはＭＤＳＴとしても知られている。
ＭＭＰ１３についての関連する構造情報は、例えば、以下の表１に示すように、UniProtアクセッション番号に見出すことができる（表Ｂを参照）。
表１
「ヒトＭＭＰ１３」とは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＭＭＰ１３を指す。一側面において、本発明のポリペプチドは、Human sapiens、Mus musculus、Canis lupus、Bos taurus、Macaca mulatta、Rattus norvegicus、Gallus gallus、および／またはP.troglodytesからのＭＭＰ１３に特異的に結合し、好ましくはヒトＭＭＰ１３、好ましくは配列番号１１５に特異的に結合する。
用語「（交差）ブロックする」、「（交差）ブロックされた」、「（交差）ブロッキング」、「競合的結合」、「（交差）競合する」、「（交差）競合すること」および「（交差）競合」は本明細書において互換的に使用され、免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは他の結合剤が、他の免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは結合剤の所定の標的への結合を妨害する能力を意味する。免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは他の結合剤が標的への別の結合を妨げることができる程度、したがって、本発明に従って交差ブロックすると言うことができるかどうかは、当技術分野で一般的な競合結合アッセイを使用して、例えば、精製されたＩＳＶＤを、実施例で記載のように、競合ＥＬＩＳＡにおいてファージ上に提示されたＩＳＶＤに対してスクリーニングすることによる等で、決定することができる。標的（交差）ブロックに向けられた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、または他の結合剤が、本明細書で定義されるように（交差）ブロッキングが可能か、競合的に結合するか、または（交差）競合するかを決定するための方法は、例えばXiao-Chi Jia et al. (Journal of Immunological Methods 288: 91‐98, 2004)、Miller et al. (Journal of Immunological Methods 365: 118‐125, 2011)および／または本明細書に記載の方法（例えば例７参照）において、説明されている。
本発明は、本明細書に記載の、例えば配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７または８で表されるポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えば競合ＥＬＩＳＡによって決定されるように、ポリペプチドと競合する。
本発明は、本明細書に記載のポリペプチドと競合する、ポリペプチドなどの競合物質を決定する方法に関し、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７または８のいずれか１つによって表され、ここで本明細書に記載のポリペプチドは、ＭＭＰ１３への、例えばヒトＭＭＰ１３（配列番号１１５）への結合について、ポリペプチドなどの競合物質と競合するか、またはこれを交差ブロックし、ここで競合物質のＭＭＰ１３への結合は、本発明のポリペプチドの存在下において、本発明のポリペプチドの不在下でのＭＭＰ１３への結合と比較して、少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、例えば８０％、９０％または１００％、低減される（すなわち、特定のアッセイでは実質的に検出不能）。競合および交差ブロッキングは、例えば競合ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で知られている任意の手段によって決定することができる。一側面において、本発明は、本発明のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７または８によって表される少なくとも１つのポリペプチドのＭＭＰ１３への結合を交差ブロックするか、および／または、そのＭＭＰ１３への結合が、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７または８によって表される少なくとも１つのポリペプチドによって、交差ブロックされている。
本発明はまた、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７または８などの本明細書に記載のポリペプチドと競合する、競合物質に関し、ここで競合物質は、ＭＭＰ１３への結合について本明細書に記載のポリペプチドと競合または交差ブロックし、ここで本発明のポリペプチドのＭＭＰ１３への結合は、前記競合物質の存在下において、前記競合物質の不在下における本発明のポリペプチドによるＭＭＰ１３への結合と比較して、少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上、例えば８０％、またはさらにそれ以上、例えば少なくとも９０％または１００％、低減される（すなわち、特定のアッセイでは実質的に検出不能）。一側面において、本発明は、ポリペプチドであって、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７または８の１つなどの本発明のポリペプチドによるＭＭＰ１３への結合を、交差ブロックするか、および／または、ＭＭＰ１３への結合が、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７または８の少なくとも１つなどの本発明のポリペプチドによって、交差ブロックされている、前記ポリペプチドに関し、ここで好ましくは、前記ポリペプチドは、ＭＭＰ１３に特異的に結合する少なくとも１つのＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂ、または免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、ここでＭＭＰ１３への結合は、ＭＭＰ１３の活性を調節する。
「ＭＭＰ１３活性」および「ＭＭＰ１３の活性」（これらの用語は本明細書では互換的に使用される）には、限定はされないが、一方では、プロテアーゼ活性（プロテイナーゼまたはペプチダーゼ活性とも呼ばれる）などのタンパク質分解、およびエンドペプチダーゼ活性が含まれ、および、例えばヘモペキシン様ドメインおよびペプチドグリカン結合ドメインによる基質への結合が含まれる。ＭＭＰ１３活性には、アグリカン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩＶおよびゼラチンなどの基質への、結合および／またはそのタンパク質分解が含まれる。本明細書で使用される場合、タンパク質分解とは、タンパク質の、より小さなポリペプチドまたはアミノ酸への分解であって、ポリペプチド鎖においてアミノ酸を一緒に連結するペプチド結合の加水分解によるものである。
本発明の文脈において、「調節すること」または「調節する」とは、一般に、適切なin vitro、細胞またはin vivoアッセイ（例えば、本明細書で言及されるものなど）を使用して測定される、ＭＭＰ１３による活性の変化を意味する。特に、「調節すること」または「調節する」とは、適切なin vitro、細胞またはin vivoアッセイ（例えば、本明細書で言及されるものなど）を使用して測定されるＭＭＰ１３の活性を、同じアッセイにおいて、同じ条件下であるが本発明のＩＳＶＤまたはポリペプチドが存在しない場合のＭＭＰ１３の活性と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％以上、低下または阻害するか、または活性を増加させることを意味し得る。
したがって本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＭＭＰ１３の活性を調節し、好ましくはＭＭＰ１３の活性を阻害する。
したがって本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、ＭＭＰ１３のプロテアーゼ活性を阻害する、例えば、アグリカン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩＶおよび／またはゼラチンなどの基質の、タンパク質分解を阻害する。
したがって本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、ＭＭＰ１３の、アグリカン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩＶおよび／またはゼラチンなどの基質への結合をブロックし、ここで前記コラーゲンは好ましくはコラーゲンＩＩである。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、ＭＭＰ１３のコラーゲンおよび／またはアグリカンへの結合を、例えばＥＬＩＳＡベースの競合アッセイで決定される場合、少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上、ブロックする（Howes et al. 2014 J. Biol. Chem. 289:24091‐24101を参照）。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、ＭＭＰ１３の活性を拮抗または阻害する、例えば（ｉ）プロテアーゼ活性、好ましくはアグリカンおよび／またはコラーゲンの切断（ここで、前記コラーゲンは好ましくはコラーゲンＩＩである）；（ｉｉ）コラーゲンのヘモペキシン様ドメインへの結合を、拮抗または阻害する。
したがって本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、ＭＭＰ１３のプロテアーゼ活性を、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって、例えば、競合アッセイまたは実施例の節に記載されているように決定される場合、好ましくは少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上、阻害する。
ＩＳＶＤ
特に明記しない限り、用語「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン配列」は、本明細書において重鎖抗体または従来の４鎖抗体を指すために使用されるかどうかにかかわらず、フルサイズの抗体、その個々の鎖の両方、ならびにそのすべての部分、ドメインまたは断片（それぞれ、抗原結合ドメインまたは断片、例えばＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインなどを含むが、これらに限定されない）を含む一般用語として使用される。
本明細書で使用される（ポリペプチドまたはタンパク質の）「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りの部分とは無関係にその三次構造を保持する能力を有する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般にドメインはタンパク質の個別の機能特性に関与しており、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの機能を失うことなく、他のタンパク質に追加、除去、または転送されることができる。
本明細書で使用される用語「免疫グロブリンドメイン」とは、抗体鎖の球状領域（例えば、従来の４鎖抗体または重鎖抗体の鎖など）、またはかかる球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折り畳みを保持するという特徴があり、これは、２つのβシートに配置された約７つの逆平行β鎖の２層サンドイッチで構成され、任意に、保存されたジスルフィド結合によって安定化される。
本明細書で使用される用語「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、これらは当技術分野および本明細書では、それぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と呼ばれる；当該フレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって中断され、これらは当技術分野および本明細書の以下では、それぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と呼ばれる。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造または配列は、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４のように示され得る。抗原結合部位を保有することにより、抗体に抗原に対する特異性を付与するのは、免疫グロブリン可変ドメインである。
本発明のすべての側面の好ましい態様において、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は、好ましくは、上に略述した一般的な構造の、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなるか、または本質的にこれらからなる。好ましいフレームワーク配列は、例えば以下の表Ａ−２に概説されており、本発明のＩＳＶＤにおいて使用することができる。好ましくは、表Ａ−２に示されているＣＤＲは、同じＩＳＶＤ構築物のそれぞれのフレームワーク領域と一致している。
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（本明細書では「ＩＳＶＤ」または「ＩＳＶ」と略す）は、「単一可変ドメイン」と交換可能に使用され、これは、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン上にあり、かつ単一免疫グロブリンドメインによって形成されている分子を定義する。このため免疫グロブリン単一可変ドメインは、「従来の」免疫グロブリンまたはその断片とは別に設定され、ここで２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して、抗原結合部位を形成する。通常、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して、抗原結合部位を形成する。後者の場合、ＶＨとＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与する、すなわち、合計６つのＣＤＲが抗原結合部位の形成に関与する。
上記の定義を考慮して、従来の４鎖抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子など；当技術分野で既知）またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合ＦｖまたはｓｃＦｖ断片などのＦｖ断片、またはかかる従来の４鎖抗体に由来するダイアボディ（すべて当技術分野で知られている）の、抗原結合ドメインは、通常、免疫グロブリン単一可変ドメインと見なされないが、その理由は、これらの場合、抗原の各エピトープへの結合が、通常１つの（単一）免疫グロブリンドメインではなく、一対の（関連する）免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖および重鎖可変ドメインなどによって、すなわち、それぞれの抗原のエピトープに共同して結合する免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬペアによって、生じるからである。
対照的にＩＳＶＤは、追加の免疫グロブリン可変ドメインとペアリングすることなく、抗原のエピトープに特異的に結合することができる。ＩＳＶＤの結合部位は、単一のＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬドメインによって形成される。したがって、ＩＳＶＤの抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲによって形成される。
そのため、単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）またはその適切な断片；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列またはＶＨＨ配列）またはその適切な断片であってよいが、ただし、単一の抗原結合単位（すなわち機能的抗原結合単位；これは単一の可変ドメインから本質的になり、単一の抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用して機能性抗原結合単位を形成する必要はない）を形成できる限りにおいてである。
本発明の一側面において、ＩＳＶＤは重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）である；より具体的には、ＩＳＶＤは、従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
例えば、ＩＳＶＤは、（単一）ドメイン抗体（または（単一）ドメイン抗体としての使用に適したペプチド）、「ｄＡｂ」またはｄＡｂ（またはｄＡｂとしての使用に適したペプチド）、またはナノボディ（本明細書で定義され、ＶＨＨを含むがこれに限定されない）；他の単一可変ドメイン、またはそのいずれかの適切な断片であってよい。
特に、ＩＳＶＤは、Nanobody（登録商標）（本明細書で定義）またはその適切な断片であり得る。［注：Nanobody（登録商標）およびNanobodies（登録商標）は、Ablynx N.Vの登録商標である。］ナノボディの一般的な説明については、以下の詳細な説明、および本明細書で引用した先行技術、例えばWO 08/020079（１６頁）に記載されている。
ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、およびＶＨＨ抗体としても知られる「ＶＨＨドメイン」は、元々「重鎖抗体」の（すなわち、「軽鎖を欠く抗体」の；Hamers-Casterman et al. 1993 Nature 363: 446-448）抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記述されてきた。用語「ＶＨＨドメイン」が選択されたのは、これらの可変ドメインを、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」または「ＶＨドメイン」と呼ばれる）から、および従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」または「ＶＬドメイン」と呼ばれる）から区別するためである。ＶＨＨおよびナノボディの詳細については、Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)のレビュー、および一般的な背景技術として言及されている以下の特許出願を参照する： Vrije Universiteit BrusselのWO 94/04678、WO 95/04079およびWO 96/34103；UnileverのWO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231およびWO 02/48193； Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)のWO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016およびWO 03/055527；Algonomics N.V.およびAblynx N.V.のWO 03/050531；National Research Council of Canada によるWO 01/90190；Institute of AntibodiesによるWO 03/025020 (= EP 1433793)；ならびにAblynx N.V.によるWO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787およびWO 06/122825、およびAblynx NVによるさらなる公開された特許出願。これらの出願で言及されたさらなる先行技術、特に国際出願WO 06/040153の４１〜４３頁の参考文献のリストも参照；そのリストおよび参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。これらの参考文献に記載されているように、ナノボディ（特にＶＨＨ配列および部分ヒト化ナノボディ）は、１つ以上のフレームワーク配列に１つ以上の「ホールマーク残基」が存在することによって、特に特徴付けられる。ナノボディのヒト化および／またはラクダ化、ならびに他の修飾、部分または断片、誘導体または「ナノボディ融合」、多価構築物（リンカー配列の非限定的な例を含む）、およびナノボディの半減期を延ばすための異なる修飾およびその調製を含む、ナノボディのさらなる説明は、例えばWO 08/101985およびWO 08/142164に見出すことができる。ナノボディのさらなる一般的な説明については、本明細書で引用される先行技術、例えばWO 08/020079（１６頁）の記載を参照する。
特に、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＭＭＰ１３結合剤に存在するフレームワーク配列は、本発明のＭＭＰ１３結合剤がナノボディであるように、１つ以上のホールマーク残基を含んでもよい（例えば、WO 08/020079（表Ａ−３からＡ−８）に定義のように）。かかるフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）のいくつかの好ましいが非限定的な例は、本明細書のさらなる開示から明らかになる（例えば、表Ａ−２を参照）。一般に、ナノボディ（特にＶＨＨ配列および部分的ヒト化ナノボディ）は、１つ以上のフレームワーク配列における１つ以上の「ホールマーク残基」の存在によって、特に特徴付けることができる（例えば、WO 08/020079、６１頁２４行目から９８頁３行目にさらに記載されているように）。
より詳細には、本発明は、次の（一般的な）構造を有するアミノ酸配列である少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、ＭＭＰ１３結合剤を提供する：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３を指し、および前記ＩＳＶＤは：
ｉ）配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７または８（表Ａ−１を参照）のアミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸の同一性の程度を決定する目的で、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される。この点において表Ａ−２も参照し、この表は、配列番号１〜２２および１０９〜１１２の免疫グロブリン単一可変ドメインの、フレームワーク１配列（配列番号６７〜７９）、フレームワーク２配列（配列番号８０〜８７および１０８）、フレームワーク３配列（配列番号８８〜９９および１１３〜１１４）を列挙する；または、
ｉｉ）表Ａ−２に示すフレームワーク配列の組み合わせ；
およびここで：
ｉｉｉ）好ましくは、Kabatの番号付けによる位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８における１つ以上のアミノ酸残基は、例えばWO 08/020079の表Ａ−３から表Ａ−８に記載されているようなホールマーク残基から選択される。
本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＭＭＰ１３結合剤はまた、すべて「改良された免疫グロブリン可変ドメイン」と題された以下の同時係属米国仮出願に記載された特定の変異／アミノ酸残基を含み得る：２０１４年５月１６日出願のUS 61/994552；２０１４年６月１８日出願のUS 61/014,015；２０１４年８月２１日出願のUS 62/040,167；２０１４年９月８日出願のUS 62/047,560（すべてAblynx N.V.に割り当てられている）。
特に、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＭＭＰ１３結合剤は、以下を好適に含有し得る：（ｉ）位置１１２にＫまたはＱ；または（ｉｉ）位置１１のＶと組み合わせた、位置１１０のＫまたはＱ；または（ｉｉｉ）位置８９のＴ；または（ｉｖ）位置８９のＬおよび位置１１０のＫまたはＱ；または（ｖ）位置１１のＶおよび位置８９のＬ；または（ｉ）〜（ｖ）の適切な組み合わせ。
前記同時係属米国仮出願にも記載されているように、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＭＭＰ１３結合剤が、上記（ｉ）から（ｖ）の１つ（またはその適切な組み合わせ）に従った変異を含む場合：
−位置１１のアミノ酸残基は、好ましくはＬ、Ｖ、またはＫから選択される（およびＶが最も好ましい）；および／または
−位置１４のアミノ酸残基は、好ましくはＡまたはＰから適切に選択される；および／または
−位置４１のアミノ酸残基は、好ましくはＡまたはＰから適切に選択される；および／または
−位置８９のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＶまたはＬから適切に選択される；および／または
−位置１０８のアミノ酸残基は、好ましくはＱまたはＬから適切に選択される；および／または
−位置１１０のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＫまたはＱから適切に選択される；および／または
−位置１１２のアミノ酸残基は、好ましくはＳ、ＫまたはＱから適切に選択される。
前記同時係属米国仮出願で述べたように、前記の変異は、いわゆる「既存の抗体」の、本発明の免疫グロブリンおよび化合物への結合を防止または低減するのに有効である。この目的のために、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＭＭＰ１３結合剤はまた、（任意に前記変異と組み合わせて）Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを含み得る（式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；および各Ｘは、独立して選択される（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から独立して選択される）、これについては再度、前記米国仮出願およびWO 12/175741が参照される。特に、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＭＭＰ１３結合剤は、タンパク質、ポリペプチドまたはこれらを含む他の化合物もしくは構築物のＣ末端を形成する場合、かかるＣ末端伸長を含み得る（再度、前記米国仮出願およびWO 12/175741にさらに記載されている）。
本発明のＭＭＰ１３結合剤は、任意の適切な様式で任意の適切な供給源に由来する免疫グロブリン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインであり得、例えば、天然に存在するＶＨＨ配列（すなわち、ラクダ科の適切な種由来）または、合成または半合成アミノ酸配列であって、「ヒト化」（本明細書で定義）ナノボディまたはＶＨＨ配列、「ラクダ化」（本明細書で定義）免疫グロブリン配列（および特にラクダ化重鎖可変ドメイン配列）を含むがこれらに限定されないもの、ならびに、親和性成熟（例えば、合成、ランダム、または天然の免疫グロブリン配列から開始）、ＣＤＲグラフト、ベニアリング、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の組み合わせ、オーバーラッププライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、および当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための同様の技術などの手法によって得られたナノボディ；または、本明細書でさらに説明する前述のいずれかの適切な組み合わせであってよい。また、免疫グロブリンがＶＨＨ配列を含む場合、本明細書でさらに説明するように、前記免疫グロブリンを適切にヒト化して、本発明の１つ以上のさらなる（部分的または完全な）ヒト化免疫グロブリンを提供してもよい。同様に、免疫グロブリンが合成または半合成配列（部分的ヒト化配列など）を含む場合、前記免疫グロブリンを任意にさらに適切にヒト化して、再度、本明細書に記載されるように、再度、１つ以上のさらなる（部分的または完全な）本発明のヒト化免疫グロブリンを提供する。
「ドメイン抗体」は、「Ｄａｂ」、「Domain Antibodies」、および「dAbs」（「Domain Antibodies」および「dAbs」は、GlaxoSmithKlineグループの商標として使用されている）としても知られ、例えば以下に記載されている：EP 0368684、Ward et al. (Nature 341: 544-546, 1989)、Holt et al. (Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003)およびWO 03/002609ならびに例えばWO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388；およびDomantis Ltdの他の公開特許出願。ドメイン抗体は本質的に、非ラクダ科哺乳類のＶＨまたはＶＬドメイン、特にヒト４鎖抗体に対応する。エピトープを単一の抗原結合ドメインとして、すなわちＶＬまたはＶＨドメインとそれぞれペアリングせずに結合するために、かかる抗原結合特性の特異的な選択が必要となり、例えばヒトの単一ＶＨまたはＶＬドメイン配列のライブラリを使用することによる。ドメイン抗体は、ＶＨＨと同様に約１３から約１６ｋＤａの分子量を有し、完全にヒト配列に由来する場合、例えばヒトにおける治療的使用のためにはヒト化を必要としない。
哺乳動物起源ではないために本発明の文脈ではあまり好ましくないが、単一可変ドメインは、ある種のサメに由来し得ることにも留意されたい（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えばWO 05/18629を参照）。
本発明は特にＩＳＶＤに関し、ここで該ＩＳＶＤは、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨおよびラクダ化ＶＨからなる群から選択される。
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)によるＶＨドメインの一般的な番号付けに従って、例えばRiechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)の図２に示されるように、ラクダのＶＨＨドメインに適用されたようになされる。ＶＨドメインのアミノ酸残基に番号付けする代替方法は、同様の方法でＶＨＨドメインにも適用することができ、当技術分野で知られている。しかし、本明細書、特許請求の範囲、および図面では、特に明記しない限り、上記のようにＶＨＨドメインに適用されるKabatによる番号付けに従う。
ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて当技術分野で周知のように、各ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の総数は変化する可能性があり、Kabatの番号付けにより示されるアミノ酸残基の総数に対応しない場合があることに、留意すべきである（すなわち、Kabat番号付けによる１つ以上の位置が実際の配列で占有されていないか、または実際の配列がKabat番号付けで許容されている数よりも多くのアミノ酸残基を含む場合がある）。これは一般に、Kabatによる番号付けは、実際の配列内のアミノ酸残基の実際の番号付けに対応する場合と対応しない場合があることを意味する。ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインのアミノ酸残基の総数は、通常１１０〜１２０、多くの場合１１２〜１１５の範囲にあるだろう。しかし、より小さな配列およびより長い配列もまた、本書に記載の目的に適する可能性があることに注意すべきである。
ＣＤＲに関しては、当技術分野でよく知られているように、Kabatの定義（これは配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている）およびChothiaの定義（これは構造ループ領域の位置に基づいている）などの、ＶＨまたはＶＨＨ断片のＣＤＲを定義および説明するための複数の規則がある。例えば、ウエブサイトhttp://www.bioinf.org.uk/abs/を参照。本明細書および特許請求の範囲の目的のために、ＣＤＲは、最も好ましくはＡｂｍ定義に基づいて定義され（これは、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアに基づいている）、これはKabat定義とChothia定義の間の最適な妥協案であると考えられている（参照：http://www.bioinf.org.uk/abs/）。本明細書で使用する場合、ＦＲ１はアミノ酸残基を位置１〜２５に含み、ＣＤＲ１はアミノ酸残基を位置２６〜３５含み、ＦＲ２はアミノ酸を位置３６〜４９に含み、ＣＤＲ２はアミノ酸残基を位置５０〜５８に含み、ＦＲ３はアミノ酸残基を位置５９〜９４に含み、ＣＤＲ３はアミノ酸残基を位置９５〜１０２に含み、ＦＲ４はアミノ酸残基を位置１０３〜１１３に含む。
本発明の意味において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」は、非ヒト源、好ましくはラクダ科動物、好ましくはラクダ科動物の重鎖抗体に由来するポリペプチドを含む。本明細書に記載されるように、それらはヒト化されてもよい。さらにこの用語は、非ラクダ科の供給源、例えばマウスまたはヒトであって、本明細書に記載されるように「ラクダ化」されたものに由来する、ポリペプチドを含む。
したがって、ドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのＩＳＶＤは、ヒト化の対象となる場合がある。特に、ナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのヒト化ＩＳＶＤは、本明細書で一般的に定義されるＩＳＶＤであり得るが、ここで少なくとも１つのアミノ酸残基が（特に、フレームワーク残基の少なくとも１つに）存在し、これはヒト化置換（本明細書で定義のように）であるか、および／またはそれに対応する。潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することで確認でき、その後、こうして決定された1つ以上の潜在的に有用なヒト化置換（またはその組み合わせ）は、前記ＶＨＨ配列に導入され得（本明細書でさらに説明されるように、それ自体既知の任意の様式によって）、得られたヒト化ＶＨＨ配列は、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さおよびレベル、および／またはその他の所望の特性について、試験され得る。このようにして、限られた程度の試行錯誤によって、他の適切なヒト化置換（またはその適切な組み合わせ）が、本明細書の開示に基づき当業者によって決定され得る。また、上記に基づいて、ナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのＩＳＶＤ（のフレームワーク領域）は、部分的にヒト化または完全にヒト化されてもよい。
本発明の別の特に好ましいクラスのＩＳＶＤは、天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、ただし「ラクダ化」されているアミノ酸配列を有するＩＳＶＤを含み、ここで「ラクダ化」されているとは、すなわち従来の４本鎖抗体からの天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基が、重鎖抗体のＶＨＨドメイン内の対応する位置にある１つ以上のアミノ酸残基で置換されることによる。これは、それ自体既知の様式で実行することができ、当業者には、例えば本明細書の説明に基づいて明らかであろう。かかる「ラクダ化」置換は、好ましくは、本明細書で定義されるように、ＶＨ−ＶＬ界面を形成するおよび／またはそこに存在するアミノ酸位置に、および／または、いわゆるラクダ科のホールマーク残基に、挿入される（例えば、WO 94/04678およびDavies and Riechmann (1994 and 1996)も参照）。好ましくは、ラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインを生成または設計するための出発材料または出発点として使用されるＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物からのＶＨ配列、より好ましくはＶＨ３配列などのヒトのＶＨ配列である。しかし、本発明のかかるラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインは、それ自体既知の任意の適切な様式で得ることができ、したがって、天然のＶＨドメインを含むポリペプチドを出発材料として使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されるのではないことに、留意されたい。例えば以下を参照：Davies and Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994；Biotechnol. 13: 475-479, 1995；Prot. Eng. 9: 531-537, 1996)およびRiechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)。
例えば本明細書でさらに説明するように、「ヒト化」および「ラクダ化」は共に、次のように実施することができる：天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインそれぞれをコードするヌクレオチド配列を提供し、次いで、それ自体既知の様式で、前記ヌクレオチド配列中の１つ以上のコドンを変更して、新しいヌクレオチド配列がそれぞれ本発明の「ヒト化」または「ラクダ化」ＩＳＶＤをコードするようにすること。次いでこの核酸をそれ自体既知の様式で発現させて、本発明の所望のＩＳＶＤを提供することができる。代替的に、天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列それぞれに基づいて、本発明の所望のヒト化またはラクダ化ＩＳＶＤのアミノ酸配列をそれぞれ設計し、それ自体知られているペプチド合成の技術を使用してde novoで合成することができる。また、天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列それぞれに基づいて、本発明の所望のヒト化またはラクダ化ＩＳＶＤをそれぞれコードするヌクレオチド配列を設計し、次に、それ自体既知の核酸合成の技術を使用してde novoで合成することができ、その後、こうして得られた核酸をそれ自体既知の様式で発現させて、本発明の所望のＩＳＶＤを提供することができる。
ドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインおよびヒト化ＶＨＨドメインを含む）などのＩＳＶＤはまた、１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列に１つ以上の変更を導入することで親和性成熟させることができ、この変更は、それぞれの親分子と比較して、そのそれぞれの抗原について得られたＩＳＶＤに改善された親和性をもたらす。本発明の親和性成熟ＩＳＶＤ分子は、当技術分野で 知られている方法によって調製することができ、例えば以下に記載されている：Marks et al. (Biotechnology 10:779-783, 1992)、Barbas, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994)、Shier et al. (Gene 169: 147-155, 1995)、Yelton et al. (Immunol. 155: 1994-2004, 1995)、Jackson et al. (J. Immunol. 154: 3310-9, 1995)、Hawkins et al. (J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992)、Johnson and Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996)。
ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ドメイン抗体またはナノボディなどのＩＳＶＤから開始して、ポリペプチドを設計／選択および／または調製するプロセスは、本明細書では前記ＩＳＶＤを「フォーマットする」とも呼ばれる；および、ポリペプチドの一部を作るＩＳＶＤは、「フォーマットされた」または「そのフォーマットの」ポリペプチドであると言われる。ＩＳＶＤがフォーマットされ得る方法の例およびかかるフォーマットの例は、本明細書の開示に基づいて当業者には明らかであろう；および、かかるフォーマットされた免疫グロブリン単一可変ドメインは、本発明のさらなる側面を形成する。
好ましいＣＤＲを、表Ａ−２に示す。
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は、以下からなる群から選択され：
（ａ）配列番号２７、２８、２５、２６、２３、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６および２４；および
（ｂ）配列番号２７、２８、２５、２６、２３、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６および２４と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群から選択され：
（ｃ）配列番号４２、４３、４０、４１、３７、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、３８および３９；および
（ｄ）配列番号４２、４３、４０、４１、３７、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、３８および３９と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群から選択される：
（ｅ）配列番号５６、１０７、５７、５４、１０６、５５、５２、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６および５３；および
（ｆ）配列番号５６、１０７、５７、５４、１０６、５５、５２、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６および５３と１、２、３または４個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列。
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は、以下からなる群から選択され：
（ａ）配列番号２３；および
（ｂ）配列番号２３と１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここで位置７においてＹはＲに変更されており；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群から選択され：
（ｃ）配列番号３７；および
（ｄ）配列番号３７と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここで
−位置４において、ＶはＴに変更されており；
−位置５において、ＧはＡに変更されており；および／または
−位置９において、ＮはＨに変更されており；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群から選択される：
（ｅ）配列番号５２；および
（ｆ）配列番号５２と１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここで位置６においてＹはＳに変更されている。
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号２６であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は配列番号４１であり；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群から選択される：
（ｅ）配列番号５５；および
（ｆ）配列番号５５と１または２個のアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで
−位置８において、ＮはＱまたはＳに変更されており、および／または
−位置１９において、ＮはＶまたはＱに変更されている。
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号２８であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は配列番号４３であり；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群から選択される：
（ｅ）配列番号５７；および
（ｆ）配列番号５７と１、２、３または４個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここで
−位置１０において、ＤはＥ、Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、ＷまたはＹに変更されており；
−位置１６において、ＭはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｚ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、ＹまたはＶに変更されており；
−位置１７において、ＤはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｚ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹまたはＶに変更されており；および／または
−位置１８において、ＹはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｚ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＶに変更されている。
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
−ＣＤＲ１は、配列番号２７、２８、２５、２６、２３、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６および２４からなる群から選択され；
−ＣＤＲ２は、配列番号４２、４３、４０、４１、３７、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、３８および３９からなる群から選択され；および
−ＣＤＲ３は、配列番号５６、１０７、５７、５４、１０６、５５、５２、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６および５３からなる群から選択される。
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで前記ＩＳＶＤは、ＩＳＶＤの群から選択され、ここで：
−ＣＤＲ１は配列番号２７であり、ＣＤＲ２は配列番号４２であり、ＣＤＲ３は配列番号５６である；
−ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４３であり、ＣＤＲ３は配列番号１０７である；
−ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４３であり、ＣＤＲ３は配列番号５７である；
−ＣＤＲ１は配列番号２５であり、ＣＤＲ２は配列番号４０であり、ＣＤＲ３は配列番号５４である；
−ＣＤＲ１は配列番号２６であり、ＣＤＲ２は配列番号４１であり、ＣＤＲ３は配列番号１０６である；
−ＣＤＲ１は配列番号２６であり、ＣＤＲ２は配列番号４１であり、ＣＤＲ３は配列番号５５である；
−ＣＤＲ１は配列番号２３であり、ＣＤＲ２は配列番号３７であり、ＣＤＲ３は配列番号５２である；
−ＣＤＲ１は配列番号２６であり、ＣＤＲ２は配列番号４８であり、ＣＤＲ３は配列番号６２である；
−ＣＤＲ１は配列番号２６であり、ＣＤＲ２は配列番号４１であり、ＣＤＲ３は配列番号６３である；
−ＣＤＲ１は配列番号２９であり、ＣＤＲ２は配列番号４４であり、ＣＤＲ３は配列番号５８である；
−ＣＤＲ１は配列番号３０であり、ＣＤＲ２は配列番号４５であり、ＣＤＲ３は配列番号５８である；
−ＣＤＲ１は配列番号３１であり、ＣＤＲ２は配列番号４６であり、ＣＤＲ３は配列番号５９である；
−ＣＤＲ１は配列番号３２であり、ＣＤＲ２は配列番号４７であり、ＣＤＲ３は配列番号６０である；
−ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号４１であり、ＣＤＲ３は配列番号６１である；
−ＣＤＲ１は配列番号３４であり、ＣＤＲ２は配列番号４９であり、ＣＤＲ３は配列番号６４である；
−ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号５０であり、ＣＤＲ３は配列番号６５である；
−ＣＤＲ１は配列番号３６であり、ＣＤＲ２は配列番号５１であり、ＣＤＲ３は配列番号６６である；
−ＣＤＲ１は配列番号２３であり、ＣＤＲ２は配列番号３９であり、ＣＤＲ３は配列番号５３である；および
−ＣＤＲ１は配列番号２４であり、ＣＤＲ２は配列番号３８であり、ＣＤＲ３は配列番号５２である。
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、ＣＤＲ１は配列番号２７であり、ＣＤＲ２は配列番号４２であり、ＣＤＲ３は配列番号５６である。
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで前記ＩＳＶＤは、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７および８からなる群から選択される。
限定することなく、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ポリペプチドの調製のための「ビルディングブロック」として使用でき、これは、ビルディングブロックとして（すなわち、ＭＭＰ１３上の同一または別のエピトープに対して、および／またはＭＭＰ１３以外の１つ以上の他の抗原、タンパク質、または標的に対して）機能することができる、１つ以上のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを任意に含み得ることが、理解されるであろう。
ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、ＭＭＰ、好ましくはＭＭＰ１３に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤを含み、例えばＭＭＰ１３に結合する２つのＩＳＶＤ、および好ましくはアグリカンに結合する少なくとも１つのＩＳＶＤ、より好ましくはアグリカンに結合する２つのＩＳＶＤを含む。本発明のポリペプチドにおいて、ＩＳＶＤは、直接連結されても、リンカーを介して連結されてもよい。さらにより好ましくは、本発明のポリペプチドは、Ｃ末端伸長を含む。以下に詳述するように、Ｃ末端伸長は、ヒト対象／患者のほとんどの試料中の既存の抗体／因子の結合を、本質的に防止／除去する。Ｃ末端伸長は、最後の（最もＣ末端に位置する）ＩＳＶＤの最後のアミノ酸残基（通常はセリン残基）のＣ末端に存在する。
本明細書でさらに詳述するように、ＩＳＶＤは、ＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬドメインに由来し得るが、しかしＩＳＶＤは、本発明のポリペプチドにおいてＶＨおよびＶＬドメインの相補的な対を形成しないように選択される。ナノボディ、ＶＨＨ、およびヒト化ＶＨＨは、軽鎖を有しない天然のラクダ抗体に由来するという点で珍しく、実際これらのドメインは、ラクダ科の軽鎖と会合して相補的なＶＨＨとＶＬの対を形成することができない。したがって、本発明のポリペプチドは、相補的ＩＳＶＤを含まず、および／または例えば相補的ＶＨ／ＶＬ対などの相補的ＩＳＶＤ対を形成しない。
一般に、単一のビルディングブロック、例えば単一のＩＳＶＤまたは単一のナノボディを、含むかまたは本質的にそれらからなるポリペプチドまたは構築物は、本明細書においてそれぞれ「一価」ポリペプチドおよび「一価構築物」と呼ばれる。２つ以上のビルディングブロック（例えばＩＳＶＤなど）を含むポリペプチドまたは構築物は、本明細書において「多価」ポリペプチドまたは構築物とも呼ばれ、かかるポリペプチドまたは構築物に存在するビルディングブロック／ＩＳＶＤは、本明細書において、「多価フォーマット」であると言及される。例えば、「二価」ポリペプチドは、リンカー配列を介して任意に連結された２つのＩＳＶＤを含み得るが、「三価」ポリペプチドは、２つのリンカー配列を介して任意に連結された３つのＩＳＶＤを含み得；一方、「四価」ポリペプチドは、３つのリンカー配列を介して任意に連結された４つのＩＳＶＤを含み得る、などである。
多価ポリペプチドにおいて、２つ以上のＩＳＶＤは同一でも異なっていてもよく、同じ抗原または抗原決定基に対して（例えば、エピトープの同一部分またはエピトープの異なる部分に対して）向けられてもよく、または代替的に、異なる抗原または抗原決定基、またはそれらの任意の適切な組み合わせに向けられてもよい。少なくとも２つのビルディングブロック（例えば、ＩＳＶＤなど）を含むポリペプチドおよび構築物であって、ここで少なくとも１つのビルディングブロックは第１の抗原（すなわち、ＭＭＰ１３）に向けられ、少なくとも１つのビルディングブロックは第２の抗原（すなわち、ＭＭＰ１３とは異なるもの）に向けられるものは、「多重特異性」ポリペプチドおよび構築物とも呼ばれ、かかるポリペプチドおよび構築物に存在するビルディングブロック（例えばＩＳＶＤなど）は、本明細書において「多重特異性フォーマット」とも呼ばれる。したがって、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＭＭＰ１３）に向けられた少なくとも１つのＩＳＶＤ、および第２の抗原（すなわちＭＭＰ１３とは異なる）に向けられた少なくとも１つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであり、一方、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＭＭＰ１３）に向けられた少なくとも１つのＩＳＶＤ、第２の抗原（すなわちＭＭＰ１３とは異なる）に向けられた少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤ、および少なくとも第３の抗原（すなわち、ＭＭＰ１３と第２の抗原の両方とは異なる）に向けられた少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤを含むポリペプチドである、など。
一側面において、本発明は、ＭＭＰ１３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶＤを含むポリペプチドに関し、ここで：
ａ）少なくとも「第１」ＩＳＶＤは、ＭＭＰ１３の第１の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造に特異的に結合し；好ましくは、ＭＭＰ１３に特異的に結合する前記「第１」ＩＳＶＤは、配列番号１１１、１１、１１０、１０、１１２、１２、１０９、９、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され；およびここで、
ｂ）少なくとも「第２」ＩＳＶＤは、第１の抗原決定基エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、または立体構造とはそれぞれ異なる、ＭＭＰ１３の第２の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、または立体構造に特異的に結合し、好ましくはＭＭＰ１３に特異的に結合する前記「第２」ＩＳＶＤは、配列番号１、２、３、４、５、６、７および８からなる群から選択される。
一側面において、本発明は、ＭＭＰ１３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、配列番号１６０〜１６５からなる群から選択される、好ましくは配列番号１６０である、前記ポリペプチドに関する（表Ａ−３を参照）。
「多重パラトピック」ポリペプチドおよび「多重パラトピック」構築物、例えば「二重パラトピック」ポリペプチドまたは構築物および「三重パラトピック」ポリペプチドまたは構築物は、それぞれ異なるパラトープを有する２つ以上のビルディングブロックを含むか、本質的にそれらからなる。
したがって、ＭＭＰ１３に結合する本発明のＩＳＶＤは、本質的に単離された形態（本明細書で定義）であることができ、または、ＭＭＰ１３に結合する１つ以上のＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなり得、かつ任意にさらに１つ以上のさらなるアミノ酸配列を含み得る（すべて任意に１つ以上の適切なリンカーを介して連結される）構築物またはポリペプチドの、一部を形成し得る。本発明は、ＭＭＰ１３に結合する本発明の１つ以上のＩＳＶＤ（またはその適切な断片）などの、本発明による少なくとも１つのＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなる、ポリペプチドまたは構築物に関する。
本発明の１つ以上のＩＳＶＤは、かかるポリペプチドまたは構築物中のビルディングブロックとして使用され、すべて本明細書に記載される本発明の一価、多価または多重パラトピックポリペプチドまたは構築物を提供する。したがって本発明はまた、本発明の一価ポリペプチドまたはＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなる、一価構築物であるポリペプチドに関する。
したがって本発明は、例えば、本発明の２つ以上のＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれらからなる二価または三価ポリペプチドまたは構築物などの、多価ポリペプチドまたは多価構築物であるポリペプチドまたは構築物にも関する（１つ以上のＶＨＨドメインを含む多価および多重特異性ポリペプチドおよびそれらの調製については、例えばConrath et al. (J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001)、ならびに例えばWO96/34103、WO99/23221およびWO 2010/115998も参照）。
一側面において、その最も単純な形態において、本発明の多価ポリペプチドまたは構築物は、ＭＭＰ１３に向けられたナノボディなどの第１のＩＳＶＤ、およびＭＭＰ１３に向けられたナノボディなどの同一の第２のＩＳＶＤを含む、本発明の二価ポリペプチドまたは構築物であり、ここでナノボディなどの前記第１および前記第２のＩＳＶＤは、リンカー配列（本明細書で定義される）を介して任意に連結されてもよい。最も単純な形態において、本発明の多価ポリペプチドまたは構築物は、ＭＭＰ１３に向けられたナノボディなどの第１のＩＳＶＤ、ＭＭＰ１３に向けられたナノボディなどの同一の第２のＩＳＶＤ、およびＭＭＰ１３に向けられたナノボディなどの同一の第３のＩＳＶＤを含む、本発明の三価ポリペプチドまたは構築物であり、ここでナノボディなどの前記第１、第２および第３のＩＳＶＤは、１つ以上、特に２つのリンカー配列を介して任意に連結され得る。一側面において、本発明は、ＭＭＰ１３に結合する、２、３または４個のＩＳＶＤ（またはその適切な断片）などの、本発明による少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなる、ポリペプチドまたは構築物に関する。２つ以上のＩＳＶＤは、１つ以上のペプチドリンカーを介して任意に連結されてもよい。
別の側面において、本発明の多価ポリペプチドまたは構築物は、ＭＭＰ１３に向けられたナノボディなどの第１のＩＳＶＤと、例えばアグリカンなどの第２の抗原に向けられたナノボディなどの第２のＩＳＶＤとを含む、本発明の二重特異性ポリペプチドまたは構築物であり得、ここでナノボディなどの前記第１および第２のＩＳＶＤは、リンカー配列（本明細書で定義される）を介して任意に連結され得る；一方、本発明の多価ポリペプチドまたは構築物はまた、ＭＭＰ１３に向けられたナノボディなどの第１のＩＳＶＤ、例えばアグリカンなどの第２の抗原に向けられたナノボディなどの第２のＩＳＶＤ、および第３の抗原に向けられたナノボディなどの第３のＩＳＶＤを含む、本発明の三重特異性ポリペプチドまたは構築物であってもよく、ここでナノボディなどの前記第１、第２および第３のＩＳＶＤは、１つ以上、特に２つのリンカー配列を介して、任意に連結されていてもよい。
本発明はさらに、ＭＭＰ１３、好ましくはヒトＭＭＰ１３に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤ（またはその適切な断片）、およびアグリカンに結合するＩＳＶＤなどの少なくとも１つの追加のＩＳＶＤを含むか、または（本質的に）それからなる、多価ポリペプチドに関する。
本発明による特に好ましい三価、二重特異性ポリペプチドまたは構築物は、本明細書に記載の実施例および表Ａ−３に示すものである。
好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたは構築物は、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むか、または本質的にそれからなり、ここで該少なくとも２つのＩＳＶＤは同一でも異なっていてもよいが、その少なくとも１つのＩＳＶＤはＭＭＰ１３に向けられる。
本発明の多価ポリペプチドまたは構築物に存在する２つ以上のＩＳＶＤは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）からなり得る；それらは、従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列で構成されていてもよい。好ましい側面において、それらは、ドメイン抗体（またはドメイン抗体としての使用に適したペプチド）、単一ドメイン抗体（または単一ドメイン抗体としての使用に適したペプチド）、または「ｄＡｂ」（またはｄＡｂとしての使用に適したペプチド）、Nanobody（登録商標）（ＶＨＨを含むがこれに限定されない）、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列；または親和性成熟によって得られたＶＨＨ配列からなる。２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、部分的または完全にヒト化されたナノボディまたは部分的または完全にヒト化されたＶＨＨからなることができる。
本発明の一側面において、本発明の多重パラトピック（好ましくは二重パラトピックまたは三重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物に存在する第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤは、ＭＭＰ１３への結合について互いに（交差）競合せず、したがって、異なるファミリーに属する。したがって本発明は、各ＩＳＶＤが異なるファミリーに属している２つ以上のＩＳＶＤを含む、多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物に関する。一側面において、本発明のこの多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物の第１のＩＳＶＤは、本発明のこの多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物の第２のＩＳＶＤのＭＭＰ１３への結合を交差ブロックせず、および／または、第１のＩＳＶＤは、第２のＩＳＶＤによってＭＭＰ１３への結合を交差ブロックされない。別の側面において、本発明の多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物の第１のＩＳＶＤは、本発明のこの多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物の第２のＩＳＶＤのＭＭＰ１３への結合を交差ブロックし、および／または、第１のＩＳＶＤは、第２のＩＳＶＤによってＭＭＰ１３への結合を交差ブロックされる。
特に好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたは構築物は、３つ以上のＩＳＶＤを含むか、または本質的にそれからなり、このうち少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＭＭＰ１３に向けられている。ＭＭＰ１３に向けられた前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、同一でも異なっていてもよく、ＭＭＰ１３の同じエピトープまたは異なるエピトープに向けられてもよく、同じエピトープビンまたは異なるエピトープビンに属することができ、および／または、ＭＭＰ１３の同じドメインまたは異なるドメインに結合できることが、理解されるであろう。
好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたは構築物は、ＭＭＰ１３に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含むか、または本質的にそれらからなり、前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、同一または異なることができ、これらは独立して、配列番号１１１、１１、１１０、１０、１１２、１２、１０９、９、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２、および配列番号１、２、３、４、５、６、７および８からなる群から選択され、より好ましくは、前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、配列番号１１１、１１、１１０、１０、１１２、１２、１０９、９および１からなる群から独立して選択され、および／または、少なくとも１つのＩＳＶＤは、配列番号１１１、１１、１１０、１０、１１２、１２、１０９、９、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、かつ少なくとも１つのＩＳＶＤは、配列番号１、２、３、４、５、６、７および８からなる群から選択される。
さらなる態様において、本発明は、ＭＭＰ１３に向けられた２つ以上のＩＳＶＤを含む多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物に関し、前記ＩＳＶＤは、配列番号１１１、１１、１１０、１０、１１２、１２、１０９、９、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、および２２のいずれか１つにより結合されるか、または配列番号１、２、３、４、５、６、７および８のいずれか１つにより結合されるのと同じエピトープに結合する。
さらなる側面において、本発明は本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１６０〜１６５（すなわち１６０、１６１、１６２、１６３、１６４または１６５）および１７６〜１９２（すなわち１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１または１９２）のいずれか１つと、好ましくは配列番号１９２と、少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％（より好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは１００％）の配列同一性を有する。
保持
当該技術は、変形性関節症などの関節の軟骨に影響を与える障害に対する、より効果的な治療を必要としている。関節内に投与された場合でも、罹患した軟骨を処置するためのほとんどの薬物の滞留時間は不十分である。本発明者らは、本発明の構築物、ポリペプチドおよびＩＳＶＤなどの治療薬の有効性は、治療薬を、関節内に薬物を「固定」しその結果薬物の保持を増加させるが、治療薬の有効性は邪魔しない部分に結合することによって、顕著に増加させることができるとの仮説をたてた（この部分は、本明細書では「軟骨固定タンパク質」または「ＣＡＰ」とも呼ばれる）。この固定の概念は、薬物の有効性を増加するのみでなく、毒性と副作用を減らすことによって罹患した関節の操作上の特異性も増加することができ、それにより、可能性のある有用な薬物の数を増加させた。
臨床使用のための分子の最終フォーマットは、ＭＭＰ１３に結合する、ＩＳＶＤなどの１つまたは２つのビルディングブロック、およびかかる保持モードの作用を有する、ＩＳＶＤなどの１つ以上のビルディングブロック、および場合によってはさらなる部分を含むことが予想された。実施例の節において、かかるフォーマットは、ＭＭＰ１３結合と例えば抑制活性などの治療効果の両方、ならびに保持特性を保持することが実証されている。保持モードの作用を有する、ＩＳＶＤなどの１つ以上のビルディングブロックは、例えば以下のようなＭＭＰ１３が関与する疾患において保持効果を有する任意のビルディングブロックである（「ＣＡＰビルディングブロック」）：関節炎、変形性関節症、脊椎骨端異形成症、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、関節リウマチ、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーおよび悪性腫瘍の転移。
「ＣＡＰビルディングブロック」は、他の例えば治療用のビルディングブロック、例えばＭＭＰ１３に結合するＩＳＶＤなどを、例えば関節などの所望の部位に、誘導、固定、および／または保持するために使用され、ここで前記他の例えば治療用のビルディングブロックは、例えばＭＭＰ１３の結合および／または活性の阻害などの、その効果を発揮する。
本発明者らはさらに、アグリカンに結合するＩＳＶＤなどのアグリカン結合剤は、アグリカンが重度にグリコシル化され、関節の軟骨に影響を及ぼす様々な障害において分解されるにも関わらず、潜在的にかかるアンカーとして機能すると仮定した。さらに、薬剤が臨床に入る前に必要とされる様々な動物モデルでのコストおよび広範な試験を考慮すると、かかるアグリカン結合剤は、優先的に広範な種の交差反応性を有するべきであり、例えば、アグリカン結合剤は、様々な種のアグリカンに結合すべきである。
様々な独創的な免疫化、スクリーニング、および特性評価方法を使用して、本発明者らは、関節内において延長された保持時間および活性を可能にする、優れた選択性、安定性、および特異性を備えた様々なアグリカン結合剤を特定することができた。
一側面において本発明は、関節からの、組成物、ポリペプチドまたは構築物の流出を低減および／または阻害する方法に関し、前記方法は、本発明による少なくとも１つのポリペプチド、本発明による構築物、または本発明による組成物の薬学的活性量を、それを必要とする人へ投与することを含む。
本発明において、用語「流出の低減および／または阻害」は、組成物、ポリペプチドまたは構築物の、関節内から外部への外向きの流れを低減および／または阻害することを意味する。好ましくは、流出は、関節内における前述の組成物、ポリペプチドまたは構築物の流出であって、同じ条件下であるが本発明のアグリカン結合剤、例えばアグリカンに結合するＩＳＶＤの存在なしの流出と比較して、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％、またはそれ以上、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％をも、低減および／または阻害される。
ＭＭＰ１３が関与する疾患、例えば関節炎、変形性関節症、脊椎骨端異形成症、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、関節リウマチ、離断性骨軟骨炎、アグリカノパチーおよび悪性腫瘍の転移などの次に、本発明のアグリカン結合剤はまた、軟骨に影響を与える様々な他の疾患、例えば、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、（例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離）、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎（本明細書では一般に「アグリカン関連疾患」と示される）にも使用できることが予想される。
ＣＡＰビルディングブロック、例えばアグリカンに結合するＩＳＶＤは、好ましくは軟骨および／または半月板などの軟骨組織に結合する。好ましい側面において、ＣＡＰビルディングブロックは他の種に対して交差反応性であり、以下の１つ以上に特異的に結合する：ヒトアグリカン（配列番号１０５）、イヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン；ブタアグリカン；マウスアグリカン、ウサギアグリカン；カニクイザルアグリカンおよび／またはアカゲザルアグリカン。アグリカンの関連構造情報は、例えば下の表２に示すように、（UniProt）アクセッション番号に記載されている。
好ましいＣＡＰビルディングブロックは、ＩＳＶＤ結合アグリカン、好ましくはヒトアグリカンであり、好ましくは表Ｂに示されるように配列番号１０５で表される。
表２
したがって本発明は、少なくとも１つのＣＡＰビルディングブロックをさらに含む、本発明によるポリペプチドまたは構築物に関する。
したがって本発明は、例えば表Ｅに示されるようなアグリカンに特異的に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤであって、好ましくは配列番号１６６〜１６８で表されるＩＳＶＤから選択されるものをさらに含む、本発明によるポリペプチドまたは構築物に関する。
特に、本発明は、アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで前記ＩＳＶＤは、以下からなるＩＳＶＤの群から選択される：（ａ）ＣＤＲ１は配列番号１６９であり、ＣＤＲ２は配列番号１７０であり、およびＣＤＲ３は配列番号１７１である；および（ｂ）ＣＤＲ１は配列番号１７２であり、ＣＤＲ２は配列番号１７３であり、およびＣＤＲ３は配列番号１７４である。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、同一でも異なっていてもよい。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、配列番号１６６〜１６８からなる群から独立して選択される。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、配列番号１６６〜１６８によって表される。
ある側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤを含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、ヒトアグリカン［配列番号１０５］に特異的に結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、ヒトアグリカン（配列番号１０５）、イヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン；ブタアグリカン；マウスアグリカン、ウサギアグリカン；カニクイザルアグリカンおよび／またはアカゲザルアグリカンに、特異的に結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここでアグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、好ましくは軟骨および／または半月板などの軟骨組織に結合する。
本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび構築物は、好ましくは安定であることが理解されるであろう。本発明のポリペプチド、構築物またはＩＳＶＤの安定性は、当業者に知られている日常的なアッセイにより測定することができる。典型的なアッセイには、例えば実施例の節に詳述されるように、（限定はされないが）ポリペプチド、構築物またはＩＳＶＤの活性が測定され、続いて滑液中で所望の期間インキュベートされ、その後活性が再度測定されるアッセイが含まれる。
一側面において、本発明は、滑液（ＳＦ）中３７℃で、少なくとも７日、例えば少なくとも１４日、２１日、１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月間も、安定性を有する、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは構築物に関する。
一側面において、本発明は、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは構築物であって、少なくとも５μｍ、例えば少なくとも１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍまたはそれ以上軟骨に浸透する、前記ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは構築物に関する。
本発明の多価ポリペプチドまたは構築物中の例えばＭＭＰ１３に結合するＩＳＶＤなどの、治療用ビルディングブロックの望ましい活性は、当業者に知られている日常的なアッセイにより測定することができる。典型的なアッセイには、（限定はされないが）実施例の節に詳述されているＧＡＧ放出アッセイが含まれる。
相対的親和性は、ポリペプチド内のＩＳＶＤの位置に依存し得る。本発明のポリペプチドにおけるＩＳＶＤの順序（配向）は、当業者の必要性に従って選択され得ることが理解されるであろう。個々のＩＳＶＤの順序、およびポリペプチドがリンカーを含むかどうかは、設計選択の問題である。リンカーの有無にかかわらず、一部の配向は、他の配向と比較して優先される結合特性を提供し得る。例えば、本発明のポリペプチドにおける第１のＩＳＶＤ（例：ＩＳＶＤ１）および第２のＩＳＶＤ（例：ＩＳＶＤ２）の順序は、（Ｎ末端からＣ末端へ）：（ｉ）ＩＳＶＤ１（例：ナノボディ１）−［リンカー］−ＩＳＶＤ２（例：ナノボディ２）−［Ｃ末端伸長］；または（ｉｉ）ＩＳＶＤ２（例：ナノボディ２）−［リンカー］−ＩＳＶＤ１（例ナノボディ１）−［Ｃ末端伸長］；（ここで、角括弧内の部分、すなわちリンカーおよびＣ末端伸長は、任意である）。すべての配向が本発明に包含される。所望の結合特性を提供するＩＳＶＤの配向を含むポリペプチドは、例えば実施例の節で例示されるように、日常的なスクリーニングにより容易に同定され得る。好ましい順序は、Ｎ末端からＣ末端へ：ＭＭＰ１３に結合したＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合したＩＳＶＤ−［Ｃ末端伸長］であり、ここで角括弧内の部分は任意である。さらに好ましい順序は、Ｎ末端からＣ末端へ：ＭＭＰ１３に結合したＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合したＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合したＩＳＶＤ−［Ｃ末端伸長］、ここで角括弧内の部分は任意である。例えば表Ｆを参照。
半減期
本発明の特定の側面において、本発明の構築物またはポリペプチドは、それのない本発明の対応する構築物またはポリペプチドと比較して増加した半減期を付与する部分を、有し得る。本発明のかかる構築物およびポリペプチドのいくつかの好ましいが非限定的な例は、当業者には、本明細書のさらなる開示に基づいて明らかになり、これは例えば以下を含む：化学修飾されて半減期を増加させた（例えば、ペグ化による）、本発明のＩＳＶＤまたはポリペプチド；血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合するための少なくとも１つの追加の結合部位を含む、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＭＭＰ１３結合剤；または、本発明のアミノ酸配列の半減期を延長する少なくとも１つの部分（特に少なくとも１つのアミノ酸配列）に連結された、少なくとも１つの本発明のＩＳＶＤを含む本発明のポリペプチド。かかる半減期延長部分またはＩＳＶＤを含む本発明のポリペプチドなどの、本発明の構築物の例は、本明細書のさらなる開示に基づいて当業者に明らかになるであろう；例としては、限定はされないが、以下のポリペプチドである：本発明の１つ以上のＩＳＶＤが、１つ以上の血清タンパク質またはその断片（（ヒト）血清アルブミンまたはその適切な断片など）に好適に連結したポリペプチド、または、血清タンパク質に結合することができる１つ以上の結合単位に好適に連結したポリペプチド（血清タンパク質の例としては、例えば、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に適した免疫グロブリン単一可変ドメイン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に適した免疫グロブリン単一可変ドメイン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用に適した免疫グロブリン単一可変ドメイン、または血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）などの血清タンパク質に結合できるナノボディ、ＩｇＧなどの血清免疫グロブリン、またはトランスフェリンである；本明細書に記載のさらなる説明および参考文献を参照されたい）；本発明のアミノ酸配列がＦｃ部分（ヒトＦｃなど）またはその適切な部分もしくは断片に連結されているポリペプチド；または、本発明の１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、血清タンパク質に結合することができる１つ以上の小タンパク質またはペプチドに適切に結合したポリペプチド、例えば、以下に記載のタンパク質およびペプチド：WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489、WO2008/068280、WO2009/127691およびPCT/EP2011/051559。
一側面において、本発明は、本発明の構築物またはポリペプチドを提供し、ここで前記構築物または前記ポリペプチドはさらに、血清タンパク質結合部分または血清タンパク質を含む。好ましくは、前記血清タンパク質結合部分は、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンに結合する。
一側面において、本発明は、血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
一般に、半減期が増加した本発明の構築物またはポリペプチドは、好ましくは、対応する本発明の構築物またはポリペプチドそれ自体、すなわち半減期の増加をもたらす部分がない場合の半減期よりも長い、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍より長い、半減期を有する。例えば、半減期が増加した本発明の構築物またはポリペプチドは、対応する本発明の構築物またはポリペプチド自体と比較して、すなわち半減期の増加をもたらす部分がない場合と比較して、例えばヒトにおいて、半減期の増加が１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、またはさらに２４、４８または７２時間を超え得る。
本発明の好ましいが非限定的な側面において、本発明の構築物および本発明のポリペプチドは、例えばヒトにおいて、対応する本発明の構築物またはポリペプチド自体、すなわち半減期の増加をもたらす部分がない場合と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、さらには２４、４８または７２時間超増加した、血清半減期を有する。
本発明の別の好ましいが非限定的な側面において、本発明のポリペプチドなどの本発明のかかる構築物は、ヒトにおいて少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間またはそれ以上の、血清半減期を示す。例えば、本発明の構築物またはポリペプチドは、血清半減期として、少なくとも５日（約５〜１０日など）、好ましくは少なくとも９日（約９〜１４日など）、より好ましくは少なくとも約１０日（約１０〜１５日など）、または少なくとも約１１日（約１１〜１６日など）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２〜１８日またはそれ以上など）、または１４日以上（約１４〜１９日など）を有し得る。
本発明の特に好ましいが非限定的な側面において、本発明は、ＭＭＰ１３に結合する１つ以上のビルディングブロックと潜在的に例えばアグリカンに結合するＩＳＶＤなどの１つ以上のＣＡＰビルディングブロックに加えて、血清アルブミンに結合する少なくとも１つのビルディングブロック、例えば、本明細書に記載のヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含む、本発明の構築物および本発明のポリペプチドを提供する。好ましくは、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含むか、または本質的にそれらからなり、ここでＣＤＲ１はＳＦＧＭＳであり、ＣＤＲ２はＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧであり、およびＣＤＲ３はＧＧＳＬＳＲである。好ましくは、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは、Ａｌｂ８、Ａｌｂ２３、Ａｌｂ１２９、Ａｌｂ１３２、Ａｌｂ１１、Ａｌｂ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ、Ａｌｂ８２、Ａｌｂ８２−Ａ、Ａｌｂ８２−ＡＡ、Ａｌｂ８２−ＡＡＡ、Ａｌｂ８２−Ｇ、Ａｌｂ８２−ＧＧ、Ａｌｂ８２−ＧＧＧ、Ａｌｂ９２、Ａｌｂ１３５またはＡｌｂ２２３からなる群から選択される（表Ｄを参照）。
一側面において、本発明は、血清タンパク質結合部分を含むポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで前記血清タンパク質結合部分は、非抗体ベースのポリペプチドである。
その他の部分
一側面において、本発明は、少なくとも１つのＩＳＶＤまたはポリペプチド、および１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位を含む、本明細書に記載の構築物に関する。１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、好ましくは、以下：ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質に結合できる結合単位、Ｆｃ部分、および、血清タンパク質、さらなるアミノ酸残基、例えば毒素、標識、放射性化学物質などのタグまたは他の機能的部分に結合可能な、小タンパク質またはペプチド；からなる群から選択される。
一側面において、以下で言及されるように、本発明は、半減期延長を付与する部分を含むポリペプチドなどの、本発明の構築物に関し、ここで、前記部分はＰＥＧである。したがって、本発明はまた、ＰＥＧを含む本発明の構築物またはポリペプチドに関する。
さらなるアミノ酸残基は、本発明のポリペプチドの他の（生物学的）特性を変化させ、変更し、またはその他の影響を与えても与えなくてもよく、本発明のポリペプチドにさらなる機能を加えても加えなくてもよい。例えば、かかるアミノ酸残基は：
ａ）Ｎ末端Ｍｅｔ残基を、例えば異種宿主細胞または宿主生物での発現の結果として、含むことができる；
ｂ）合成時に宿主細胞からのポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列またはリーダー配列を、形成し得る（例えば、本発明のポリペプチドを発現するために使用する宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチドのプレ、プロまたはプレプロ形態を提供するため）。適切な分泌リーダーペプチドは、当業者には明らかであり、本明細書でさらに説明されているとおりであってよい。通常、かかるリーダー配列はポリペプチドのＮ末端に連結されるが、ただし最も広い意味での本発明はこれに限定されない；
ｃ）「タグ」、すなわち例えばポリペプチドの精製を可能にするまたは促進するアミノ酸配列または残基を、例えば前記配列または残基に向けられた親和性技術を使用して、形成し得る。その後、前記配列または残基を除去して（例えば、化学的または酵素的切断により）、ポリペプチドを提供することができる（この目的のために、タグは、切断可能なリンカー配列を介してアミノ酸配列またはポリペプチド配列に任意に連結するか、切断可能なモチーフを含むことができる）。かかる残基のいくつかの好ましいが非限定的な例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、およびＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ（配列番号１７５）などのｍｙｃタグ、ＭＹＣ−ＨＩＳタグ（配列番号１２３）またはＦＬＡＧ−ＨＩＳ６タグ（配列番号１２４）である（表Ｂ参照）；
ｄ）官能化された、および／または官能基の結合部位として機能することができる、１つ以上のアミノ酸残基であってもよい。適切なアミノ酸残基および官能基は当業者には明らかであり、本発明のポリペプチドの誘導体について本明細書で言及されるアミノ酸残基および官能基が含まれるが、これらに限定はされない。
本発明にさらに包含されるのは、本発明のＩＳＶＤを含み、さらに他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射性化学物質などを含む、構築物および／またはポリペプチドである。
他の基、残基、部分または結合単位は、例えば化学基、残基、部分であってよく、これらは例えば、それ自体で生物学的および／または薬理学的に活性であってもなくてもよい。例えば、限定されないが、かかる基は、本発明のポリペプチドまたは構築物の「誘導体」を提供するために、本発明の１つ以上のＩＳＶＤまたはポリペプチドに連結され得る。
したがって本発明は、その最も広い意味で、本発明の構築物および／またはポリペプチドの誘導体である、構築物および／またはポリペプチドも含む。かかる誘導体は一般に、本発明の構築物および／またはポリペプチド、および／または本発明のポリペプチドを形成する１つ以上のアミノ酸残基の、修飾によって、および特に化学的および／または生物学的（例えば酵素的）修飾によって、得ることができる。
かかる修飾の例、ならびにかかる様式で修飾可能なポリペプチド配列内のアミノ酸残基の例（すなわち、タンパク質骨格上であるか、好ましくは側鎖上）、かかる修飾に使用できる方法および技術、およびかかる修飾の潜在的な使用および利点は、当業者には明らかであろう（Zangi et al., Nat Biotechnol 31(10):898-907, 2013も参照）。
例えば、かかる修飾は、１つ以上の（官能）基、残基または部分の、本発明のポリペプチド内またはこれの上への導入（例えば、共有結合によるかまたは他の適切な様式による）、および特に、本発明の構築物および／またはポリペプチドに１つ以上の所望の特性または機能性を付与する、１つ以上の（官能）基、残基または部分の導入を、含み得る。かかる官能基の例は、当業者には明らかであろう。
例えば、かかる修飾は、本発明の構築物またはポリペプチドの半減期、溶解度および／または吸収を増加させ、本発明の構築物またはポリペプチドの免疫原性および／または毒性を低減し、本発明の構築物またはポリペプチドの望ましくない副作用を排除または減弱し、および／または本発明の構築物またはポリペプチドに他の有利な特性を付与しおよび／または望ましくない特性を低減する、１つ以上の機能的部分の；または前述の２つ以上の任意の組み合わせの、導入（例えば、共有結合によるか、または他の適切な様式による）を含み得る。かかる機能的部分およびそれらを導入するための技術の例は、当業者には明らかであり、一般に、本明細書の上記で引用した一般的な背景技術で言及されるすべての機能的部分および技術、ならびに医薬品タンパク質の修飾のための、それ自体既知の機能的部分および技術を含むことができる；および特に、抗体または抗体断片（ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体を含む）の修飾については、例えばRemington (Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980)を参照されたい。かかる機能的部分は、例えば、本発明のポリペプチドに直接（例えば共有結合で）、または任意に適切なリンカーまたはスペーサーを介して、連結することができ、これは再度、当業者には明らかであろう。
１つの具体例は、本発明のポリペプチドまたは構築物が化学的に修飾されてその半減期が増加した（例えば、ペグ化により）、本発明の誘導体ポリペプチドまたは構築物である。これは、医薬タンパク質の半減期の延長および／または免疫原性の低下に、最も広く使用されている手法の１つであり、好適な薬学的に許容し得るポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール）またはｍＰＥＧ）などの結合を含む。一般に、任意の適切な形態のペグ化、例えば抗体および抗体断片（（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖを含むがこれらに限定されない）に対して当技術分野で使用されるペグ化などを、使用することができる；例えば、以下を参照：Chapman (Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002)、Veronese and Harris (Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, 2003)、Harris and Chess (Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221, 2003)およびWO 04/060965。タンパク質のペグ化のための様々な試薬も市販されており、例えばNektar Therapeutics, USAからである。
好ましくは、特にシステイン残基を介した部位特異的ペグ化が使用される（例えば、Yang et al. (Protein Engineering 16: 761-770, 2003を参照）。例えばこの目的のために、ＰＥＧを、本発明のポリペプチドに天然に存在するシステイン残基に結合させることができ、本発明の構築物またはポリペプチドは、ＰＥＧの結合のために１つ以上のシステイン残基を適切に導入するように修飾され得、または、ＰＥＧの結合のための１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列が、本発明の構築物またはポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合されてもよく、これらはすべて、当業者にそれ自体既知のタンパク質工学の技術を使用するものである。
好ましくは、本発明の構築物またはポリペプチドについては、５０００を超える分子量、例えば１０，０００超および２００，０００未満、例えば１００，０００未満；例えば、２０，０００〜８０，０００の範囲の分子量を有するＰＥＧが使用される。
別の、通常はあまり好ましくない修飾は、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化を、本発明のポリペプチドの発現に使用される宿主細胞に応じて、通常は同時翻訳および／または翻訳後の修飾の一部として含む。
さらに別の修飾は、本発明のポリペプチドまたは構築物の意図する使用に応じた、１つ以上の検出可能な標識または他のシグナル生成基もしくは部分の導入を含み得る。それらを結合、使用および検出するための適切な標識および技術は、当業者には明らかであり、例えば、以下を含むがこれに限定はされない：蛍光標識（例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（phthaldehyde）、およびフルオレスカミンおよび１５２Ｅｕなどの蛍光金属、またはランタニド系のその他の金属など）、リン光標識、化学発光標識または生物発光標識（例えばルミナール、イソルミノール、セロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンまたはＧＦＰおよびそのアナログ）、放射性同位体（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、および７５Ｓｅなど）、金属、金属キレート、または金属カチオン（例えば金属カチオン、例：９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、および６８Ｇａ、またはin vivo、in vitroもしくはin situ診断およびイメージングでの使用に特に適した他の金属または金属カチオン、例えば（１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅ））、ならびに発色団および酵素（例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチナビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ）。他の適切な標識は当業者には明らかであり、例えば、ＮＭＲまたはＥＳＲ分光法を使用して検出可能な部分を含む。
本発明のかかる標識ポリペプチドおよび構築物は、例えば、in vitro、in vivoまたはin situアッセイ（それ自体既知の免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の「サンドイッチアッセイ」等を含む）に、ならびにin vivoの診断およびイメージングを目的として、特定の標識の選択に応じて使用され得る。
当業者には明らかであるように、別の修飾は、例えば上記の金属または金属カチオンの１つをキレート化するためのキレート基の導入を伴い得る。適切なキレート基には、例えば限定するものではないが、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が含まれる。
さらに別の修飾は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合ペアなどの特定の結合ペアの一部である、機能的部分の導入を含んでもよい。かかる機能的部分を使用して、本発明のポリペプチドを、結合ペアの他の半分に結合する別のタンパク質、ポリペプチドまたは化学化合物に、例えば結合ペアの形成により連結することができる。例えば、本発明の構築物またはポリペプチドをビオチンにコンジュゲートさせ、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートした別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体に連結することができる。例えば、本発明のかかるコンジュゲート構築物またはポリペプチドは、レポーターとして、例えば、検出可能なシグナル発生剤がアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされる診断システムにおいて、使用され得る。かかる結合ペアは、例えば本発明の構築物またはポリペプチドを、薬学的目的に適した担体を含む担体に結合するために使用することもできる。１つの非限定的な例は、Cao and Suresh (Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000)に記述されたリポソーム製剤である。かかる結合ペアはまた、治療的に活性な薬剤を本発明のポリペプチドに連結するために使用され得る。
他の可能性のある化学的および酵素的修飾は、当業者には明らかであろう。かかる修飾はまた、研究目的（例えば、機能−活性の関係を研究するため）で導入することもできる。例えばLundblad and Bradshaw (Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997)を参照する。
好ましくは、構築物、ポリペプチドおよび／または誘導体は、ＭＭＰ１３に、本明細書で定義される親和性（本明細書でさらに説明されるように、ＫＤ値（実際または見かけの値）、ＫＡ値（実際または見かけの値）、ｋｏｎレートまたはｋｏｆｆレート、あるいは代替的にＩＣ５０値として、適切に測定および／または表示される）で結合する（すなわち、本発明のポリペプチドについて定義されるように）。
本発明のかかる構築物および／またはポリペプチドならびにその誘導体はまた、本質的に単離された形態（本明細書で定義される）であってもよい。
一側面において、本発明は、本発明のＩＳＶＤまたは本発明のポリペプチドを含むかまたは本質的にそれからなり、さらに、任意に１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されている１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位を含む、本発明の構築物に関する。
一側面において、本発明は、１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位が、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質に結合可能な結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合可能な小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、本発明の構築物に関する。
リンカー
本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物において、例えばＩＳＶＤなどの２つ以上のビルディングブロック、および任意に１つ以上の他の基、薬物、薬剤、残基、部分、または結合単位は、互いに直接連結されてもよく（例えば、WO 99/23221に記載されているように）、および／または１つ以上の適切なスペーサーまたはリンカーを介して互いに連結されてもよく、またはそれらの任意の組み合わせである。多価および多重特異性ポリペプチドでの使用に適したスペーサーまたはリンカーは、当業者には明らかであり、一般に、アミノ酸配列を連結するために当技術分野で使用される任意のリンカーまたはスペーサーであり得る。好ましくは、前記リンカーまたはスペーサーは、薬学的使用を目的とする構築物、タンパク質またはポリペプチドの構築における使用に適している。
例えば、本発明のポリペプチドは、三価、三重特異性ポリペプチドであって、例えば、ＭＭＰ１３に結合するＩＳＶＤなどの１つのビルディングブロック、アグリカンに結合するＩＳＶＤなどのＣＡＰビルディングブロック、および第３のＩＳＶＤなどの潜在的に別のビルディングブロックを含む、前記ポリペプチドであってもよく、ここでＩＳＶＤなどの前記第１、第２および第３のビルディングブロックは、１つ以上、特に２つのリンカー配列を介して、任意に連結されてもよい。また本発明は、本発明の構築物またはポリペプチドであって、ＭＭＰ１３に結合する第１のＩＳＶＤ、および場合によりアグリカンに結合する第２のＩＳＶＤ、および／または場合により第３のＩＳＶＤ、および／または場合により第４のＩＳＶＤを含む、前記構築物またはポリペプチドを提供し、ここで前記第１のＩＳＶＤおよび／または場合により前記第２のＩＳＶＤおよび／または場合により前記第３のＩＳＶＤおよび／または場合により前記第４のＩＳＶＤは、リンカー、特に３つのリンカーを介して、連結される。
いくつかの特に好ましいリンカーには、抗体断片または抗体ドメインを連結するために当技術分野で使用されるリンカーが含まれる。これらには、上記の一般的な背景技術で言及されたリンカー、ならびに例えばダイアボディまたはＳｃＦｖ断片を構築するために当技術分野で使用されるリンカーが含まれる（この点についてはしかし、ダイアボディおよびＳｃＦｖ断片において、使用されるリンカー配列は、適切なＶＨおよびＶＬドメインが一緒になって完全な抗原結合部位を形成することを可能にする長さ、ある程度の柔軟性、および他の特性を有するべきであり、本発明のポリペプチドで使用されるリンカーの長さまたは柔軟性に特に制限はなく、これは、ナノボディなどの各ＩＳＶＤが、それ自体で完全な抗原結合部位を形成するからである）。
例えばリンカーは、適切なアミノ酸配列であってよく、特に１〜５０個、好ましくは１〜３０個、例えば１〜１０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり得る。かかるアミノ酸配列のいくつかの好ましい例には、例えば（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）２タイプのｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、例えばWO 99/42077に記載されている（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３または（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３など、および、本明細書に記載のAblynxによる出願に記載されているＧＳ３０、ＧＳ１５、ＧＳ９およびＧＳ７リンカー（例えばWO 06/040153およびWO 06/122825を参照）、ならびにヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体または類似の配列のヒンジ領域など（WO 94/04678に記載されている）が含まれる。好ましいリンカーを、表Ｃに示す。
いくつかの他の特に好ましいリンカーは、ポリアラニン（ＡＡＡなど）、ならびにリンカーＧＳ３０（WO 06/122825の配列番号８５）およびＧＳ９（WO 06/122825の配列番号８４）である。
他の適切なリンカーは一般に、有機化合物またはポリマー、特に医薬用途のタンパク質での使用に適したものを含む。例えばポリ（エチレングリコール）部分は、抗体ドメインを連結するために使用されている；例えばWO 04/081026を参照。
使用されるリンカーの長さ、柔軟性の程度、および／または他の特性（ただし通常は、ＳｃＦｖ断片で使用されるリンカーの場合ほど重要ではない）が、本発明のポリペプチドなどの本発明の最終構築物の、ＭＭＰ１３または１つ以上の他の抗原に対する親和性、特異性または結合力を含む特性（これらに限定はされない）にいくらかの影響を及ぼし得ることは、本発明の範囲に包含される。本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明のポリペプチドなどの本発明の特定の構築物で使用する最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
例えば、ＭＭＰ１３および別の標的に向けられた、ビルディングブロック、ＩＳＶＤまたはナノボディを含む本発明の多価ポリペプチドにおいて、リンカーの長さおよび柔軟性は、ポリペプチド中の本発明のＩＳＶＤなどの各ビルディングブロックが、その同族の標的、例えば各標的の抗原決定基に結合することを可能にするようなものであることが好ましい。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明のポリペプチドなどの本発明の特定の構築物で使用するための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
さらに本発明の範囲内であるのは、使用されるリンカーが、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に、１つ以上の他の好ましい特性または機能性を付与し、および／または誘導体の形成および／または官能基の結合のための１つ以上の部位を提供することである（例えば、本発明のＩＳＶＤの誘導体について本明細書に記載のように）。例えば、１つ以上の荷電アミノ酸残基を含むリンカーは改善された親水性を提供できるが、小さなエピトープまたはタグを形成するかまたは含むリンカーは、検出、識別、および／または精製の目的で使用することができる。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明の特定のポリペプチドで使用するための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
最後に、本発明のポリペプチドなどの構築物に２つ以上のリンカーが使用される場合、これらのリンカーは同一でも異なっていてもよい。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明の特定の構築物またはポリペプチドで使用する最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
通常、発現および生産を容易にするために、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物は、線状ポリペプチドである。しかし本発明は、その最も広い意味でこれに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物が３つ以上のビルディングブロック、ＩＳＶＤまたはナノボディを含む場合、３つ以上の「アーム」を有するリンカーの使用によってそれらを連結することが可能であり、それぞれの「アーム」は、ビルディングブロック、ＩＳＶＤまたはナノボディに連結されて「星形」の構築物を提供する。通常はあまり好ましくはないが、円形の構築物を使用することも可能である。
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、前記ＩＳＶＤは互いに直接連結されるか、またはリンカーを介して連結される。
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、第１のＩＳＶＤおよび／または第２のＩＳＶＤおよび／またはおそらく血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、リンカーを介して連結されている。
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、前記リンカーは、Ａ３、５ＧＳ、７ＧＳ、８ＧＳ、９ＧＳ、１０ＧＳ、１５ＧＳ、１８ＧＳ、２０ＧＳ、２５ＧＳ、３０ＧＳ、３５ＧＳ、４０ＧＳ、Ｇ１ヒンジ、９ＧＳ−Ｇ１ヒンジ、ラマ上部の長いヒンジ領域、およびＧ３ヒンジ、のリンカーからなる群から選択され、これらは例えば表Ｃに示されている。
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで前記ポリペプチドは、表Ａ−３および表Ｆに示される群から、例えば配列番号１６４〜１６５、１６０、１６１、１６２、１６３、および配列番号１７６、１９２、および１７５〜１９１（すなわち、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０または１９１）からなる群から選択される。
調製
本発明はさらに、本明細書に記載の構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤ、核酸、宿主細胞、および組成物を調製する方法に関する。
本発明の多価ポリペプチドは一般に、少なくとも本発明のＩＳＶＤおよび／または一価ポリペプチドを、場合により１つ以上の適切なリンカーを介して、１つ以上のさらなるＩＳＶＤに適切に連結するステップを含む方法によって調製することができ、こうして本発明の多価ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドはまた、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供するステップ、前記核酸を適切な方法で発現するステップ、および発現された本発明のポリペプチドを回収するステップを含む方法によっても、調製することができる。かかる方法は、それ自体既知の様式で実行することができ、これは当業者には、例えば本明細書でさらに説明する方法および技術に基づいて、明らかであろう。
本発明の多価ポリペプチドを調製する方法は、少なくとも、本発明の２つ以上のＩＳＶＤおよび例えば１つ以上のリンカーを、適切な様式で一緒に連結するステップを含んでもよい。本発明のＩＳＶＤ（およびリンカー）は、当技術分野で知られており本明細書でさらに説明する任意の方法により、結合することができる。好ましい技術には、本発明のＩＳＶＤ（およびリンカー）をコードする核酸配列を連結して、多価ポリペプチドを発現する遺伝子構築物を調製することが含まれる。アミノ酸または核酸を連結する技術は当業者には明らかであり、標準的なハンドブック、例えば上記のSambrook et al.およびAusubel et al.など、ならびに以下の実施例を再び参照する。
したがって、本発明は、本発明の多価ポリペプチドの調製における、本発明のＩＳＶＤの使用にも関する。多価ポリペプチドを調製する方法は、本発明のＩＳＶＤを、任意に１つ以上のリンカーを介して、少なくとも１つのさらなる本発明のＩＳＶＤに連結することを含む。次いで、本発明のＩＳＶＤは、２つ（例えば、二価ポリペプチド中）、３つ（例えば、三価ポリペプチド中）、４つ（例えば、四価中）、またはそれ以上（例えば、多価ポリペプチド中）のビルディングブロックを含む多価ポリペプチドを提供および／または調製する際の、結合ドメインまたはビルディングブロックとして使用される。これに関して、本発明のＩＳＶＤは、２、３、４またはそれ以上のビルディングブロックを含む本発明の二価、三価または四価などの多価ポリペプチドを提供および／または調製する際の、結合ドメインまたは結合単位として、使用することができる。
したがって、本発明はまた、本発明のＩＳＶＤポリペプチド（本明細書に記載）の、多価ポリペプチドの調製における使用にも関する。多価ポリペプチドの調製方法は、本発明のＩＳＶＤの、任意に１つ以上のリンカーを介した、少なくとも１つのさらなる本発明のＩＳＶＤへの連結を含む。
本発明のポリペプチドおよび核酸は、本明細書のさらなる説明から当業者に明らかなように、それ自体既知の様式で調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体の調製、特に抗体断片（（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない）の調製のための、それ自体既知の任意の様式で調製することができる。ポリペプチドおよび核酸を調製するためのいくつかの好ましいが非限定的な方法には、本明細書に記載の方法および技術が含まれる。
本発明のポリペプチドを生産する方法は、以下のステップを含み得る：
−本発明の前記ポリペプチドをコードする核酸（本明細書では「本発明の核酸」とも呼ばれる）の、適切な宿主細胞または宿主生物（本明細書では「本発明の宿主」とも呼ばれる）における、または別の適切な発現系における発現；続いて任意に、
−こうして得られた本発明のポリペプチドを単離および／または精製すること。
特に、かかる方法は、以下のステップを含んでもよい：
−本発明の宿主を、本発明の宿主が本発明の少なくとも１つのポリペプチドを発現および／または生産するような条件下で、培養および／または維持すること；続いて任意に、
−こうして得られた本発明のポリペプチドを、単離および／または精製すること。
したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチド、ＩＳＶＤまたは構築物をコードする核酸またはヌクレオチド配列（「本発明の核酸」とも呼ばれる）にも関する。
本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得る。本発明の一態様によれば、本発明の核酸は、本明細書で定義されるように、本質的に単離されている。本発明の核酸はまた、発現ベクターなどのベクター、例えばプラスミド、コスミドまたはＹＡＣ（これもまた本質的に単離された形態であり得る）の形態であっても、その中に存在しても、および／またはベクターの一部であってもよい。したがって本発明はまた、本発明の核酸またはヌクレオチド配列を含む、発現ベクターにも関する。
本発明の核酸は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドに関する情報に基づいて、それ自体既知の様式で調製または取得でき、および／または適切な天然源から単離できる。また、当業者には明らかであるように、本発明の核酸を調製するために、いくつかのヌクレオチド配列、例えば本発明のＩＳＶＤをコードする少なくとも２つの核酸、および例えば１つ以上のリンカーをコードする核酸などを、適切な様式で一緒に連結することができる。本発明の核酸を生成するための技術は当業者には明らかであり、例えば、限定はされないが、以下を含み得る：自動化されたＤＮＡ合成；部位特異的変異誘発；２つ以上の天然に存在する配列および／または合成配列（またはその２つ以上の部分）の組み合わせること、切断された発現産物の発現をもたらす変異の導入；１つ以上の制限部位の導入（例えば、適切な制限酵素を使用して、容易に消化および／またはライゲートできるカセットおよび／または領域を作成するため）、および／または１つ以上の「不一致」プライマーを使用した、ＰＣＲ反応による変異の導入。これらおよび他の技術は当業者には明らかであり、再度、標準的なハンドブック、例えば上記のSambrook et al.およびAusubel et al.など、ならびに以下の実施例を参照する。
好ましいが非限定的な態様において、本発明の遺伝子構築物は以下を含む：
ａ）本発明の少なくとも１つの核酸；
ｂ）１つ以上の調節要素に動作可能に接続されている、例えばプロモーター、および任意に適切なターミネーター；および任意にまた
ｃ）それ自体知られている、遺伝子構築物の１つ以上のさらなる要素；
ここで、用語「調節要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、および「動作可能に接続された」は、当技術分野における通常の意味を有する。
本発明の遺伝子構築物は一般に、本発明のヌクレオチド配列を、例えば上記のSambrook et al.およびAusubel et al.など一般的なハンドブックに記載された技術を使用して、上記の１つ以上のさらなる要素に適切に連結することにより提供され得る。
本発明の核酸および／または本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞または宿主生物を形質転換するために、すなわち、本発明のポリペプチドの発現および／または生産のために、使用され得る。適切な宿主または宿主細胞は当業者には明らかであり、例えば、任意の適切な真菌、原核生物または真核生物の細胞または細胞株、または任意の適切な真菌、原核生物または（非ヒト）真核生物ならびに、抗体および抗体断片（（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない）の発現および生産についてそれ自体既知の宿主細胞または（非ヒト）宿主であることができ、これらは当業者には明らかであろう。上記で引用された一般的な背景技術、ならびに例えば以下も参照される：WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken et al. (Res Immunol. 149: 589-99, 1998)；Riechmann and Muyldermans (1999)上記；van der Linden (J. Biotechnol. 80: 261-70, 2000)；Joosten et al. (Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003)；Joosten et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-92, 2005)；および、本明細書に引用されているさらなる参考文献。さらに本発明のポリペプチドは、無細胞発現系で発現および／または生産することもでき、かかる系の適切な例は当業者には明らかであろう。本発明の宿主または宿主細胞を形質転換するための適切な技術は、当業者には明らかであり、意図される宿主細胞／宿主生物および使用される遺伝子構築物に依存し得る。再度、上記のハンドブックおよび特許出願を参照する。形質転換された宿主細胞（安定な細胞株の形態であり得る）または宿主生物（安定な変異体系統または株の形態であり得る）は、本発明のさらなる側面を形成する。したがって本発明は、本発明による核酸、または本発明による発現ベクターを含む、宿主または宿主細胞に関する。好ましくは、これらの宿主細胞または宿主生物は、本発明のポリペプチド（および宿主生物の場合：その少なくとも１つの細胞、部分、組織または臓器において）を発現するか、（少なくとも）（例えば、適切な条件下で）発現可能なものである。本発明はまた、本発明の宿主細胞または宿主生物のさらなる世代、後代および／または子孫を含み、これらは例えば、細胞分裂または有性生殖または無性生殖により得ることができる。
本発明のポリペプチドの発現を生成／取得するために、形質転換された宿主細胞または形質転換された宿主生物は、一般に、本発明の（望ましい）ポリペプチドが発現／生産されるような条件において、保たれる、維持される、および／または培養され得る。適切な条件は当業者には明らかであり、通常、使用される宿主細胞／宿主生物、ならびに本発明の（関連する）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節要素に依存する。再度、本発明の遺伝子構築物に関する段落で上述した、ハンドブックおよび特許出願を参照する。
次いで、本発明のポリペプチドの単離は、宿主細胞／宿主生物および／または前記宿主細胞もしくは宿主生物が培養された培地から、それ自体既知のタンパク質の単離および／または精製技術、例えば（分取）クロマトグラフィーおよび／または電気泳動技術、示差沈殿技術、親和性技術（例えば、本発明のポリペプチドと融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を使用）および／または分取免疫学的技術（すなわち、単離されるポリペプチドに対する抗体を使用）を用いて、行うことができる。
一側面において、本発明は、少なくとも以下のステップを含む、本発明による構築物、ポリペプチドまたはＩＳＶＤを生産する方法に関する：（ａ）適切な宿主細胞または宿主生物または別の適切な発現系において、本発明による核酸配列を発現するステップ；これに続いて任意に（ｂ）本発明による構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤを単離および／または精製するステップ。
医薬（本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチド、構築物の使用）
本明細書で述べるように、安全で効果的なＯＡ医薬品の必要性が残されている。非従来的なスクリーニング、特性評価および組み合わせ戦略に基づいて、本発明者らは、ＭＭＰ１３に結合しこれを阻害するＩＳＶＤを特定した。これらのＭＭＰ１３結合剤は、in vitroおよびin vivo実験で非常に優れた性能を発揮した。さらに、本発明のＩＳＶＤは、比較分子よりも有意に有効であることも実証された。したがって本発明は、ＭＭＰ、特にＭＭＰ１３に拮抗するＩＳＶＤおよびポリペプチドであって、比較分子と比べて、より安全なプロファイルを含む、改善された予防的、治療的および／または薬理学的特性を有する前記ＩＳＶＤおよびポリペプチドを提供する。さらに、これらのＭＭＰ１３結合剤は、ＣＡＰビルディングブロックに連結されると、関節での保持が増加し、一方で活性が保持された。
一側面において、本発明は、医薬として使用するための、本発明による組成物、本発明によるＩＳＶＤ、本発明によるポリペプチド、および／または本発明による構築物に関する。
別の側面において、本発明は、少なくともＭＭＰ１３関連疾患の予防および／または処置のための医薬組成物の調製における、および／または本明細書に記載の処置方法の１つ以上で使用するための、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物の使用に関する。
本発明はまた、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチド、化合物および／または構築物の使用であって、ＭＭＰ、好ましくはＭＭＰ１３の活性を調節すること、例えばアグリカンおよび／またはコラーゲンの分解を抑制することにより予防および／または処置できる少なくとも１つの疾患または障害の、予防および／または処置のための医薬組成物の調製における、前記使用に関する。
本発明はまた、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチド、化合物および／または構築物の使用であって、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチド、化合物および／または構築物を患者に投与することにより予防および／または処置することができる少なくとも１つの疾患、障害または状態の予防および／または処置のための医薬組成物の調製における、前記使用に関する。
本発明はさらに、少なくとも１つのＭＭＰ１３関連疾患の予防および／または処置に使用するための、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチド、化合物および／もしくは構築物、またはそれを含む医薬組成物に関する。
本発明のＭＭＰ１３結合剤は、軟骨に影響を与える様々な疾患において、例えば関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチー（本明細書では一般的に「ＭＭＰ１３関連疾患」として示される）において、使用可能であることが予想される。
一側面において、本発明は、ＭＭＰ１３関連疾患の症状を処置または予防するのに使用するための、本発明による組成物、ＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物に関し、前記疾患としては例えば、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーである。より好ましくは、前記疾患または障害は関節炎であり、最も好ましくは変形性関節症である。
一側面において、本発明は、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎を予防または処置するための方法に関し、ここで前記方法は、それを必要とする対象に、少なくとも本発明による組成物、免疫グロブリン、ポリペプチド、または構築物の薬学的活性量を投与することを含む。より好ましくは、前記疾患は関節炎であり、最も好ましくは変形性関節症である。
一側面において、本発明は、本発明によるＩＳＶＤ、ポリペプチド、組成物または構築物の使用であって、例えば関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーなどの疾患また障害を処置または予防するための医薬組成物の調製における、前記使用に関する。より好ましくは、前記疾患または障害は関節炎であり、最も好ましくは変形性関節症である。
アグリカンに結合することにより、本発明の構築物および／またはポリペプチドは、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）／マトリキシンまたはトロンボスポンジンモチーフを有するＡディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＭＭＰ２０、ＡＤＡＭＴＳ５（アグリカナーゼ２）、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ１）、および／またはＡＤＡＭＴＳ１１の活性を、アグリカンの分解において低下または阻害し得る。
本発明の文脈において、用語「予防および／または処置」は、疾患の予防および／または処置を含むだけでなく、一般に以下も含む：疾患の発症の予防、疾患の進行の遅延または逆転、疾患の予防または遅延、疾患に関連する１つ以上の症状の発症の予防または遅延、疾患に関連する１つ以上の症状の軽減および／または緩和、疾患の重症度および／または持続期間および／またはそれに関連する症状の低減、および／または疾患の重症度および／またはそれに関連する任意の症状のさらなる増加の予防、疾患によって引き起こされる任意の生理学的損傷の予防、軽減、または逆転、および処置される患者に有益な一般的に任意の薬理作用。
投与計画は、担当医および臨床的要因によって決定される。医療分野でよく知られているように、任意の一患者への投与量は、例えば患者のサイズ、体重、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、使用されるポリペプチド（抗体を含む）の活性、投与の時間と経路、一般的な健康状態、および他の療法または処置との組み合わせを含む、多くの要因に依存する。タンパク質性の薬学的活性物質は、１用量あたり１ｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の量で存在し得る；しかしながら、この例示的な範囲を下回るかまたは上回る用量も想定される。計画が持続注入の場合、１分間に体重１キログラムあたり１ｐｇ〜１００ｍｇの範囲であり得る。
本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは構築物は、ＭＭＰ１３の生物学的機能を、当技術分野で周知の方法によりアッセイされる場合に、少なくとも約５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％、９５％または最大９９％、および最も好ましくは約１００％（本質的に完全に）阻害および／または中和するために、例えば、０．０１、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０または５０ｐｇ／ｍｌの濃度で使用され得る。
本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは構築物は、ＭＭＰ１３の生物学的機能を、当技術分野で周知の方法によりアッセイされる場合に、少なくとも約５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％、９５％または最大９９％、および最も好ましくは約１００％（本質的に完全に）阻害および／または中和するために、例えば、１、２、５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、２５０または５００ｎｇ／ｍｇ軟骨の濃度で使用され得る。
一般に処置計画は、本発明の１つ以上のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／もしくは構築物、またはそれを含む１つ以上の組成物の、１以上の薬学的有効量または用量での投与を含む。投与されるべき特定の量または用量は、臨床医により、再度上記の要因に基づいて決定することができる。本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤの有用な用量は、それらのin vitro活性と動物モデルにおけるin vivo活性とを比較することにより決定することができる。マウスおよび他の動物での有効用量をヒトに外挿する方法は、当技術分野で知られている；例えば、US 4,938,949を参照。
一般に、処置される特定の疾患、障害または状態、使用される特定の本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物の効力、特定の投与経路および使用される特定の医薬製剤または組成物に応じて、臨床医は適切な１日用量を決定できるであろう。
本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤの、処置における使用に必要とされる量は、選択された特定の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、および／または構築物だけでなく、投与経路、処置される状態の性質、患者の年齢および状態によっても異なり、最終的には担当医または臨床医の裁量に委ねられる。また、本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤの用量は、標的細胞、組織、移植片、関節または臓器に応じて変化する。
所望の用量は、単回用量で、または適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日あたり２、３、４またはそれ以上のサブ用量として便利に提示され得る。サブ用量自体は、例えば、いくつかの別個の大まかに間隔を空けた複数の投与にさらに分割されてもよい。好ましくは、用量は、週に１回またはより少ない頻度で、例えば２週間に１回、３週間に１回、月に１回、または２ヶ月に１回などでも投与される。
投与計画には、長期にわたる処置が含まれ得る。「長期」とは、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヶ月、または数年の期間を意味する。この用量範囲の必要な修正は、本明細書の教示および通常の実験のみを使用して、当業者により決定され得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照。投与量は、任意の合併症の場合には、個々の医師が調整することもできる。
通常、上記の方法において、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物が使用される。しかしながら、本発明の２つ以上のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物を組み合わせて使用することは、本発明の範囲内である。
本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物は、１つ以上のさらなる薬学的に活性な化合物または成分と組み合わせて、すなわち、併用治療計画として使用することができ、これは、相乗効果をもたらすことも、そうでない場合もある。
医薬組成物はまた、少なくとも１つのさらなる活性剤、例えば１つ以上のさらなる抗体またはその抗原結合断片、ペプチド、タンパク質、核酸、有機および無機分子を含み得る。
再度、臨床医は、かかるさらなる化合物または成分、ならびに適切な併用処置計画を、上記の要因と自身の専門家の判断に基づき、選択することができる。
特に、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物は、本明細書に引用される疾患、障害および状態の予防および／または処置に使用されるかまたは使用できる、他の薬学的に活性な化合物または成分と、組み合わせて使用することができ、その結果、相乗効果が得られる場合も得られない場合もある。かかる化合物および成分の例、ならびにそれらを投与するための経路、方法および医薬製剤または組成物は、臨床医には明らかであろう。
２つ以上の物質または成分が併用処置計画の一部として使用される場合、それらは同じ投与経路または異なる投与経路を介して、本質的に同時にまたは異なる時間に投与され得る（例えば、本質的に同時に、連続的に、または交互の方式に従って）。物質または成分を同じ投与経路を介して同時に投与する場合、それらは、当業者には明らかなように、異なる医薬製剤もしくは組成物、または組み合わせた医薬製剤または組成物の一部として、投与することができる。
また、２つ以上の活性物質または成分を併用処置計画の一部として使用する場合、物質または成分の各々は、化合物または成分をそれ自体で使用する場合に使用するのと同じ量で、同じ計画に従って投与してもよく、かかる併用は、相乗効果をもたらすこともあり、もたらさないこともある。しかし、２つ以上の活性物質または成分の組み合わせ使用が相乗効果をもたらす場合、投与する物質または成分の１つ、それ以上、またはすべての量を減らすことも可能であり、なおかつ所望の治療効果を達成する。これは例えば、通常の量で使用する場合に、１つ以上の物質または成分の使用に関連する任意の望ましくない副作用を、回避、制限、または軽減するのに役立ち得て、なおかつ所望の医薬または治療効果が得られる。
本発明に従って使用される処置計画の有効性は、臨床医には明らかであるように、関与する疾患、障害または状態について、それ自体既知の任意の様式で決定しおよび／または従うことができる。臨床医はまた、必要に応じておよびケースバイケースで特定の処置計画を変更または修正して、望ましい治療効果を達成し、望ましくない副作用を回避、制限、または軽減することができ、および／または、一方では望ましい治療効果を達成し、他方では望ましくない副作用を回避、制限、または軽減することの間の適切なバランスを達成する。
一般に処置計画は、所望の治療効果が達成されるまで、および／または所望の治療効果が維持される限り、続けられるであろう。再度、これは臨床医が決定できる。
したがって、さらなる側面において、本発明は、本発明の少なくとも１つの構築物、本発明の少なくとも１つのポリペプチド、本発明の少なくとも１つのＩＳＶＤ、または本発明の少なくとも１つの核酸、および少なくとも１つの適切な担体、希釈剤または賦形剤（すなわち、医薬用途に適した）、および任意に１つ以上のさらなる活性物質を含む、医薬組成物に関する。特定の側面において、本発明は、本発明による構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤまたは核酸、好ましくは配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７、８、１６０〜１６５（すなわち配列番号１６０、１６１、１６２、１６３、１６４または１６５）および１７６〜１９２（すなわち配列番号１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１または１９２）の少なくとも１つ、および少なくとも１つの適切な担体、希釈剤または賦形剤（すなわち、医薬用途に適したもの）、および任意に１つ以上のさらなる活性物質を含む、医薬組成物に関する。
処置される対象は、任意の温血動物であってもよいが、特に哺乳動物、より具体的にはヒトである。獣医用途においては、処置される対象に、商業目的で飼育されているかペットとして飼われている任意の動物が含まれる。当業者には明らかであるように、処置される対象は、特に、本明細書で言及される疾患、障害および状態に苦しんでいるか、またはそのリスクのある人である。したがって、本発明の好ましい側面において、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、医学または診断において使用するためのものである。好ましくは、医薬組成物は、ヒト医学で使用するためのものであるが、獣医学的目的で使用することもできる。
再度、かかる医薬組成物において、本発明の１つ以上の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物および／もしくは構築物、またはそれをコードするヌクレオチド、および／またはそれを含む医薬組成物は、１つ以上の他の活性成分、例えば本明細書に記載されているものと、適切に組み合わせることができる。
本発明はまた、in vitro（例えば、in vitroまたは細胞アッセイ）またはin vivo（例えば、単一細胞または多細胞生物、および特に哺乳動物、より具体的にはヒト、例えば本発明の疾患、障害または状態のリスクがあるか、またはこれに罹患しているヒト）のいずれかで使用するための組成物（例えば、限定されることなく、本明細書にさらに記載の医薬組成物または製剤など）にも関する。
特に明記しない限り、処置への言及には、確立された症状の処置および予防的処置の両方が含まれることを理解されたい。
一般に、医薬用途では、本発明の構築物、ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤは、少なくとも１つの本発明の構築物、ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤおよび、少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバント、ならびに任意に１つ以上の薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む、医薬製剤または組成物として製剤化することができる。非限定的な例として、かかる製剤は、経口投与のため、非経口投与のため（静脈内、筋肉内または皮下注射または静脈内注入など）、局所投与（例えば関節内投与）のため、吸入による投与のために、皮膚パッチ、インプラント、座薬などに適した形態であることができ、ここで関節内投与が好ましい。かかる適切な投与形態−これは投与の様式に応じて固体、半固体または液体であり得る−およびその調製に使用するための方法および担体は、当業者には明らかであり、本明細書でさらに説明される。かかる医薬製剤または組成物は、一般に、本明細書において「医薬組成物」と呼ばれる。
例示的な賦形剤として、崩壊剤、結合剤、充填剤、および潤滑剤が言及され得る。崩壊剤の例には、寒天、アルギン、炭酸カルシウム、セルロース、コロイド二酸化ケイ素、ゴム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、メチルセルロース、およびデンプンが含まれる。結合剤の例には、微結晶セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびポリビニルピロリドンが含まれる。充填剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、三塩基性硫酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、セルロース、デキストリン、デキストロース、フルクトース、ラクチトール、ラクトース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルチトール、マルトデキストリン、マルトース、ソルビトール、デンプン、スクロース、糖、およびキシリトールが含まれる。潤滑剤の例には、寒天、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、グリセリン、パルミトステアリン酸グリセリル、硬化植物油、酸化マグネシウム、ステアリン酸塩、マンニトール、ポロキサマー、グリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリルナトリウム、ソルビトール、およびタルクが含まれる。通常の安定剤、防腐剤、湿潤剤および乳化剤、粘稠性改善剤、風味改善剤、浸透圧を変化させる塩、緩衝物質、可溶化剤、希釈剤、皮膚軟化剤、着色剤、およびマスキング剤、および抗酸化剤が、医薬品アジュバントとして考慮される。
適切な担体には、限定はされないが、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバター、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが含まれる。
一般に、本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤは、それ自体既知の任意の適切な様式で、製剤化および投与することができる。例えば、上記で引用された一般的な背景技術（および特にWO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867およびWO 08/020079）、ならびに標準のハンドブック、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)、Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)；またはthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007（例えば、２５２〜２５５頁参照）を参照。
特定の側面において、本発明は、本発明による構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤまたは核酸を含み、さらに少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントを含み、任意に１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む、医薬組成物に関する。
本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤは、従来の抗体および抗体断片（ＳｃＦｖおよびダイアボディを含む）および他の薬学的に活性なタンパク質についてのそれ自体既知の任意の様式で、製剤化および投与され得る。かかる製剤およびそれを調製する方法は、当業者には明らかであり、例えば、非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、管腔内、動脈内、脊髄内、鼻腔内または気管支内投与）、またさらに局所（例えば、関節内、経皮または皮内）投与に好ましく適している製剤を含む。
局所または非経口投与のための製剤は、例えば、注入または注射に適した滅菌溶液、懸濁液、分散液または乳液であり得る。かかる製剤に適した担体または希釈剤には、例えば、WO 08/020079の１４３頁に記載されているものが含まれる。通常、水溶液または懸濁液が好ましい。
本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤはまた、遺伝子治療から知られている送達方法を用いて投与することもでき、例えば、その遺伝子治療送達方法に関して参照により組み込まれる米国特許第5,399,346号を参照されたい。遺伝子治療の送達方法を使用して、本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤをコードする遺伝子でトランスフェクトされた一次細胞は、特定の臓器、組織、移植片、関節、または細胞を標的とする組織特異的プロモーターでさらにトランスフェクトされ得、さらに、細胞内局在発現のためのシグナルおよび安定化配列でトランスフェクトされ得る。
本発明のさらなる側面によれば、本発明のポリペプチドは、in vivoおよびin vitroでのさらなる用途に使用され得る。例えば本発明のポリペプチドは、診断目的のために、例えば、ＭＭＰ１３の存在を検出および／または定量化するため、および／またはＭＭＰ１３を精製するために設計されたアッセイにおいて、使用され得る。ポリペプチドはまた、毒性学、安全性、および投与量の研究を実施するために、特定の疾患の動物モデルで試験され得る。
最後に本発明は、本発明による少なくとも１つのポリペプチド、前記成分をコードする少なくとも１つの核酸配列、本発明のベクターまたはベクターシステム、および／または本発明による宿主細胞を含む、キットに関する。キットは、異なる形態、例えば診断キットとして提供され得ることが企図される。
本発明を、以下の非限定的な好ましい側面、実施例および図によりさらに説明する。
本出願を通して引用されるすべての参考文献（文献参照、発行済み特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の全内容は、特に上記で参照された教示に関して、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
配列は、明細書の本文および、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５による別個の配列リストに記載されている。特定の番号で指定された配列は、明細書本文と別個の配列リストにおいて同一であるべきである。例として、配列番号１は、明細書本文と別個の配列リストの両方で、同じ配列を定義すべきである。明細書本文と別個の配列リストの配列定義の間に矛盾がある場合（例えば、明細書本文の配列番号１が誤って、別個の配列リストの配列番号２に対応する場合）、本出願における特定の配列への言及、特に特定の態様における言及は、別個の配列リストへの言及ではなく、本出願の本文中の配列への言及として理解されるべきである。言い換えれば、明細書本文と別個の配列リストとの間の、配列定義／指定の矛盾は、別個の配列リストを、明細書、実施例、図、および特許請求の範囲を含む出願の本文に開示されている配列およびそれらの指定に修正することにより、解決される。
６．例
以下の実施例は、本発明の方法および生成物を説明するものである。分子生物学および細胞生物学の分野で通常遭遇する当業者に明らかな記載の条件およびパラメーターの、適切な改変および適応は、本発明の精神および範囲内である。
６．１ 方法
６．１．１ ラマの免疫化
ラマの免疫化は標準的な手順に従い、使用する抗原の量、アジュバントの種類、および注射方法を変えて行った。これらの変更については、以下の各節で詳しく説明する。すべての免疫化実験は、地元の倫理委員会によって承認された。
６．１．２ ライブラリの構築
ｃＤＮＡを、ＭＭＰ１３で免疫化したすべてのラマ／アルパカの血液試料から抽出した総ＲＮＡを使用して調製した。ナノボディをコードするヌクレオチド配列を、ｃＤＮＡからワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応で増幅し、ファージミドベクターｐＡＸ２１２の対応する制限部位にライゲートし、続いて、大腸菌株ＴＧ−１の形質転換を、ライゲーション産物を用いエレクトロポレーションを介して実施した。
ＮＮＫライブラリは、変性プライマーを使用したオーバーラップエクステンションＰＣＲにより生成した。ＰＣＲ産物を発現ベクター（ｐＡＸ１２９）にクローニングし、大腸菌ＴＧ−１コンピテント細胞に形質転換した。ナノボディコード配列のフレーム内で、ベクターはＣ末端ＦＬＡＧ３−およびＨｉｓ６−タグをコードする。
目的のクローンの配列を検証した。
６．１．３ 選択
ファージディスプレイライブラリを、組換えＭＭＰ１３を使用して調査した。結果の節、すなわち例６．２以降で詳細に説明するように、異なる抗原を異なるラウンドの選択において使用した。
選択は、抗原をライブラリファージ粒子と共に２時間（２％Marvelおよび０．０５％Tween 20を補充したＰＢＳ中で）インキュベートすることからなる。ビオチン化抗原を、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Invitrogen, 112-05D）を使用して捕捉した。非ビオチン化抗原を、MaxiSorpプレート（Nunc, 430341）に被覆した。未結合のファージを洗い流した（０．０５％Tween 20を補充したＰＢＳ中）；結合したファージは、トリプシン（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）を添加して１５分間溶出した。溶出したファージは、ファージレスキューのための、指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ−１細胞に感染するために使用した。選択された出力から調製されたファージは、後続の選択ラウンドで入力として使用した。
６．１．４ ＥＬＩＳＡ直接被覆抗原
MaxiSorpプレート（Nunc, 430341）を、ヒトｐｒｏＭＭＰ１３で４℃にて一晩被覆した後、ＲＴで１時間ブロッキング（ＰＢＳ、１％カゼイン）した。ＰＢＳ＋０．０５％Tween20での洗浄ステップの後、ＰＢＳ、０．１％カゼイン、０．０５％Tween 20中のペリプラズム抽出物の１０倍希釈液を、ＲＴで１時間加えた。結合したナノボディは、マウス抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ（Sigma (A8592)）で検出した。
捕捉された抗原
−活性化ヒトＭＭＰ１３ ＥＬＩＳＡ
−活性化ラットＭＭＰ１３ ＥＬＩＳＡ
−活性化イヌＭＭＰ１３ ＥＬＩＳＡ
MaxiSorpプレート（Nunc, 430341）を、ヒトＭＭＰ１３抗体ｍＡｂ５１１で４℃にて一晩被覆した後、ＲＴで１時間ブロッキング（ＰＢＳ、１％カゼイン）した。ＰＢＳ＋０．０５％Tween20での洗浄ステップの後、２０ｎＭの活性化ヒト、ラットまたはイヌＭＭＰ１３を、ＲＴで１時間加えた。２回目の洗浄ステップの後、ペリプラズム抽出物の１０倍希釈液またはＰＢＳ、０．１％カゼイン、０．０５％Tween 20中の精製ナノボディの希釈系列を、ＲＴで１時間添加した。結合したナノボディは、マウス抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ（Sigma(A8592)）で検出した。
６．１．５ 蛍光発生ペプチドアッセイ
ヒト、カニクイザル、ラット、イヌ、およびウシのＭＭＰ１３蛍光発生ペプチドアッセイ、ならびにヒトＭＭＰ１およびＭＭＰ１４蛍光発生ペプチドアッセイの設定の概要は、次のとおりである：活性化ＭＭＰを、以下を用いて３７℃で２時間インキュベートした：蛍光ペプチド基質Ｍｃａ−ＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２（R&D Systems #ES001）、およびペリプラズム抽出物の１／５希釈または精製ナノボディ／陽性対照の希釈系列（総容量＝アッセイバッファー：５０ｍＭのTris、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、および０．０１％のTween20中、２０μｌ）。蛍光の線形の増加（ｖ０−１５〜４５分間のインキュベーション）を酵素活性の尺度として使用し、％阻害を、式：１００−１００（試験ナノボディの存在下でのｖ０／陰性対照ナノボディ（Cablys）の存在下でのｖ０）により計算した。
６．１．６ コラーゲン分解アッセイ
このアッセイの設定の概要は、次のとおりである。２５０ｎｇ／ｍｌの免疫グレードのヒトコラーゲンＩＩ（Chondrex #20052）を、５ｎＭの活性化ＭＭＰと共に、１００μｌのアッセイバッファー（５０ｍＭのTris−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％Tween-20）中でインキュベートした。３５℃で１．５時間のインキュベーションの後、反応物をＥＤＴＡ（３０ｍＭのストックを１０μｌ）で中和した。ＭＭＰ１３で切断されたコラーゲンは、エラスターゼを用いて３８℃で２０分間さらに分解して、分解したコラーゲンＩＩの再アニーリングを回避した（ＩＩ型コラーゲン検出キット（Chondrex #6009）で提供される１／３希釈ストック１０μｌ）。残されたそのままのコラーゲンは、ＥＬＩＳＡ（ＩＩ型コラーゲン検出キット（Chondrex #6009）で提供される試薬）を介して検出した。
６．１．７ 蛍光発生コラーゲンアッセイ
簡潔に言えば、このアッセイの設定は次のとおりである：ウシ皮膚からの１００μｇ／ｍｌのＤＱ(登録商標)Ｉ型コラーゲン（フルオレセインコンジュゲート、Molecular Probes #D-12060 lot 1149062）を、１０ｎＭの活性化ＭＭＰ１３および精製ナノボディ／陽性対照の希釈系列と共に、４０μｌアッセイバッファー（５０ｍＭのTris−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％Tween-20）中、３７℃で２時間インキュベートした。蛍光の線形の増加（ｖ０−１５〜４５分間のインキュベーション）を酵素活性の尺度として使用し、％阻害を、式：１００−１００（試験ナノボディの存在下でのｖ０／陰性対照ナノボディ（Cablys）の存在下でのｖ０）により計算した。
６．１．８ ＴＩＭＰ−２競合アッセイ
５０μｌのＴＩＭＰ−２（０．６３ｎＭ；R&D Systems #971-TM）を、抗ヒトＴＩＭＰ−２抗体（R&D Systems #MAB9711）被覆プレート（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ；一晩）上に捕捉した（ＲＴで１時間）。この捕捉中に、１．２６ｎＭの活性化ＭＭＰ１３−ビオチンを、７０μｌのアッセイバッファー（５０ｍＭのTris−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％Tween-20）中のナノボディ／ＴＩＭＰ−３／MSC2392891Aの希釈系列と共にプレインキュベートした。この混合物５０μｌを、捕捉したＴＩＭＰ−２に加え、室温で１時間インキュベートした。ＭＭＰ１３−ビオチンは、５０μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：５０００、DakoCytomation #P0397）で検出した。
６．１．９ サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）
ＴＳＡを、５μｌの精製された一価ナノボディを用いて、基本的にEricsson et al. (2006 Anals of Biochemistry, 357: 289-298)に従って実施した。
６．１．１０ 分析サイズ排除クロマトグラフィー（分析ＳＥＣ）
分析ＳＥＣ実験は、Ultimate 3000 machine （Dionex）をBiosep-SEC-3（Agilent）カラムと組み合わせて実行した。
６．１．１１ 強制酸化
ナノボディ試料（１ｍｇ／ｍｌ）を、Ｈ２Ｏ２を含まない対照試料と並行して、ＲＴで４時間、暗所でＰＢＳ中の１０ｍＭのＨ２Ｏ２にさらし、次いでバッファーをＰＢＳに、Zeba脱塩スピンカラム（０．５ｍｌ）（Thermo Scientific）を使用して切り替えた。その後、ストレスをかけた試料および対照試料を、ＲＰＣにより、Series 1200または1290 machine（Agilent Technologies）でZorbax 300SB-C3カラム（Agilent Technologies）を使用して７０℃で分析した。ナノボディの酸化は、主要なタンパク質ピークと比較した、酸化ストレスの結果として生じるプレピークのピーク面積％の決定により定量化した。
６．１．１２ 温度ストレス
ナノボディ試料（１〜２ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ中、−２０℃（陰性対照）、２５および４０℃で４週間保存した。このインキュベーション期間の後、ナノボディをトリプシンまたはＬｙｓＣで消化した。次に、ストレスを受けた試料および対照試料のペプチドを、ＲＰＣにより、Series 1200 machine（Agilent Technologies）でＱ−ＴＯＦ質量分析計（6530 Accurate Mass Q-TOF（Agilent））に接続した６０℃のAcquity UPLC BEH300-C18カラム（Agilent Technologies）を用いて分析した。
６．２ 免疫化
ＭＭＰ１３は、非活性なプロ形態（ｐｒｏＭＭＰ１３）として分泌される。これはプロドメインが切断されると活性化され、触媒ポケットを形成する触媒ドメインと、基質コラーゲンＩＩ（Ｃｏｌ ＩＩ）のドッキング／相互作用ドメインとして機能すると説明されているヘモペキシン様ドメイン（ＰＤＢ：１ＰＥＸ）とで構成される活性酵素が残される。
ＭＭＰ１３の酵素活性を阻害するのに最適な領域は、触媒ポケットであると仮定された。しかし、触媒ポケットに対する免疫応答を高めるには、様々な重要な問題がある。
第１に、ｐｒｏＭＭＰ１３では、プロドメインが触媒ポケットをマスクするため、免疫応答を高めるためにポケットにアクセスすることができない。
第２に、活性化されたＭＭＰ１３の半減期は短く、これは主に自己タンパク質分解によるものである。この短い半減期は、強い免疫応答の発達を妨げる。
第３に、触媒ドメインの配列は種間で高度に保存されている。したがって予想される免疫応答は、仮に上昇したとしても弱いものになる。
６．２．１ 免疫化戦略
これらの問題に対処し、触媒ポケットに結合するＭＭＰ１３阻害剤を成功して取得する可能性を高めるために、ＭＭＰ１３の様々なフォーマットを含む洗練された精巧な免疫戦略が考案された。最終的に、次の免疫化が実施された：
（ａ）３頭のラマを、触媒ドメインからなり、かつＭＭＰ１３を自己タンパク質分解から保護する変異Ｆ７２Ｄを含有する、切断型ＭＭＰ１３バリアントで免疫化した；
（ｂ）３頭のラマを、変異Ｆ７２Ｄに加えて酵素機能を不活性化する変異Ｅ１２０Ａを含む（ａ）と同じ切断型ＭＭＰ１３バリアントで免疫化した；
（ｃ）３頭のラマを、全長ｐｒｏＭＭＰ１３タンパク質で免疫化した；および
（ｄ）３頭のラマを、分泌型ｐｒｏＭＭＰ１３バリアント（Ｖ１２３Ａ）またはＧＰＩアンカー型ｐｒｏＭＭＰ１３バリアント（Ｖ１２３Ａ）のいずれかをコードするプラスミドの混合物で免疫化した。Ｖ１２３Ａ変異は、ＭＭＰ１３についてＣｙｓ１０４と触媒亜鉛イオンとの弱い相互作用を引き起こし、自発的な自動活性化をもたらすと記載されている。
６．２．２ 血清力価
血清力価を、ｐｒｏＭＭＰ１３および触媒ドメイン（Ｆ７２Ｄ）に対して決定した。
一般に、タンパク質ｐｒｏＭＭＰ１３（ｃ）またはｐｒｏＭＭＰ１３ Ｖ１２３ＡをコードするＤＮＡ（ｄ）で免疫化した動物は、ｐｒｏＭＭＰ１３に対して良好な免疫応答を示したが、触媒ドメイン（Ｆ７２Ｄ）に対しては弱くしか応答しなかった。触媒ドメイン（Ｆ７２Ｄ）（ａ）または不活性な触媒ドメイン（Ｆ７２Ｄ、Ｅ１２０Ａ）（ｂ）で免疫化した動物は、触媒ドメインに対する免疫応答をまったく示さないか、弱い免疫応答のみを示した。
６．２．３ ライブラリの構築
触媒ドメインに対する低い血清力価にもかかわらず、本発明者らは、広範なスクリーニングにより、触媒ポケットへの阻害性結合剤の同定が可能になることを確信した。
ＲＮＡをＰＢＬ（一次血液リンパ球）から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとして使用して、遺伝子断片をコードするナノボディを増幅した。これらの断片をファージミドベクターｐＡＸ２１２にクローニングし、Ｈｉｓ６−およびＦＬＡＧ３−タグと融合したナノボディを表示するファージ粒子の生産を可能にした。ファージは、標準プロトコル（Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual 1st Edition, Brian K. Kay, Jill Winter, John McCafferty, Academic Press, 1996）に従って調製および保存した。
最終的に得られた１８の免疫ライブラリの平均サイズは、約５＊１０８個の個別のクローンであった。
６．３ 一次スクリーニング
ファージディスプレイの選択を、１８の免疫ライブラリおよび２つの合成ナノボディライブラリを使用して行った。ライブラリは、異なる抗原提示フォーマットを使用して、ヒトｐｒｏＭＭＰ１３、活性化ヒト、ラットおよびイヌＭＭＰ１３、ならびにヒトＭＭＰ１３触媒ドメイン（Ｆ７２Ｄ）の異なる組み合わせに対して、２〜４ラウンドの濃縮を行った。選択出力からの個々のクローンを、ヒトおよびラットＭＭＰ１３に対するＥＬＩＳＡ（ナノボディを発現する大腸菌細胞からのペリプラズム抽出物を使用）での結合、およびペプチド加水分解時の蛍光の増加を測定する蛍光発生ペプチドアッセイでの阻害活性について、広スペクトルＭＭＰ蛍光発生ペプチド基質を用いてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡでは結合を示したが、蛍光発生ペプチドアッセイでは阻害活性を示さなかったナノボディを、コラーゲン分解アッセイでさらにスクリーニングした。コラーゲン分解アッセイは、ペプチド代用物の代わりに天然の基質を使用する。コラーゲンは蛍光発生ペプチドよりもＭＭＰ１３との相互作用面がはるかに大きいため、ナノボディはコラーゲンの分解に干渉するが、ペプチドの分解には干渉しないという仮説を立てた。しかし、コラーゲン分解アッセイはペリプラズム抽出物と適合せず、精製されたナノボディの使用が必要であった。
６．３．１ キャンペーン１
第1の選択キャンペーンでは、ＭＭＰ１３を、直接被覆された抗原として提示した。これにより、ヒトおよびラットＭＭＰ１３のＥＬＩＳＡ（結合アッセイ）において、ＥＬＩＳＡで広範な結合シグナルを有するヒトＭＭＰ１３に結合するナノボディの多様性を含む、高いヒット率が得られた。ナノボディの大部分は、ラットＭＭＰ１３と交差反応することが見出された。しかし、蛍光発生ペプチドアッセイ（阻害アッセイ）では、非常に低いヒット率が得られた。さらに、観察された阻害は不完全であり、これらのナノボディのいくつかはラット交差反応性を示さなかった。
一価の完全阻害性ナノボディが得られなかったため、本発明者らは、正しいエピトープが標的化されておらず、選択中に使用した条件が最適ではないと仮定した。ただし、選択条件の試験は、陽性対照の不在のために妨げられた。
最終的に、直接被覆が酵素活性を妨げることがわかった。
６．３．２ キャンペーン２
キャンペーン２では、ビオチン化ＭＭＰ１３を使用して溶液中で選択を行った。しかし、直接被覆されたｐｒｏＭＭＰ１３の代わりに、非中和抗体を介して捕捉された活性化ヒトおよびラットＭＭＰ１３を使用すると、ＥＬＩＳＡヒット率はキャンペーン１よりもはるかに低かった。ヒット率は、蛍光発生ペプチドアッセイでも非常に低かった。しかし、コラーゲン分解アッセイにおいて完全に阻害する１つのナノボディが見出された。酵素のプロ形態を結合剤の濃縮に使用したため、重要なエピトープがプロペプチドによってマスクされていると仮定した。
６．３．３ キャンペーン３
キャンペーン１と２の残念な結果を考慮して、本発明者らは、触媒ドメインにおける重要なエピトープの提示を、非中和抗体によって捕捉された活性化ＭＭＰ１３を使用することにより最適化することを選択した。同じ捕捉フォーマットをＥＬＩＳＡにも使用した。これにより、ＥＬＩＳＡでヒトとラットの両方のＭＭＰ１３について、高いヒット率もたらされた。しかし、蛍光発生ペプチドアッセイのヒット率は以前のキャンペーンに比べてわずかに高かったものの、ナノボディは依然として不完全な阻害しか示さず、ラット交差反応性は弱いかまったく示されなかったため、ＭＭＰ１３の捕捉された提示が依然として最適ではないことが示唆された。
C0101040E09（「４０Ｅ０９」）を含む３つのクローンは、蛍光発生ペプチドアッセイで不完全な阻害を与えたにもかかわらず、コラーゲン分解アッセイで陽性であることが見出された。４０Ｅ０９のファミリーメンバーがクローン化され、配列決定された：C0101PMP040E08、C0101PMP042A04、C0101PMP040B05、C0101PMP042D12、C0101PMP042A03、C0101PMP024A08およびC0101PMP040D01（表Ａ−１およびＡ−２を参照）。ＣＤＲ領域の配列の多様性を、以下の表６．３．３Ａ、６．３．３Ｂおよび６．３．３Ｃに示す。クローン４０Ｅ０９のＣＤＲのアミノ酸配列は、ファミリーメンバーのＣＤＲを比較する基準として使用した（ＣＤＲ１はKabat位置２６で始まり、ＣＤＲ２はKabat位置５０で始まり、ＣＤＲ３はKabat位置９５で始まる）。
表６．３．３Ａ（４０Ｅ０９ ＣＤＲ１）

＊１つのクローンにおいて最大１個のＣＤＲ１変異（配列番号２３）
表６．３．３Ｂ（４０Ｅ０９ ＣＤＲ２）

＊１つのクローンにおいて最大３個のＣＤＲ２変異（配列番号３７）
表６．３．３Ｃ（４０Ｅ０９ ＣＤＲ３）

＊１つのクローンにおいて最大１個のＣＤＲ変異（配列番号５２）
６．３．４ キャンペーン４
第４のキャンペーンにおいて、免疫化戦略（ａ）および（ｃ）に由来する免疫性ナノボディファージディスプレイライブラリに加えて、選択戦略（ｂ）および（ｄ）に由来するライブラリも調査した（例６．２．１を参照）。選択戦略は、溶液で使用されたＭＭＰ１３触媒ドメイン（Ｆ７２Ｄ）に焦点を合わせた。蛍光発生ペプチドアッセイのヒット率はライブラリ全体で増加し、多くのナノボディが完全な阻害を示した。阻害性ナノボディはＥＬＩＳＡでの不十分な結合のみを示し、キャンペーン３で使用されたＭＭＰ１３の捕捉提示もまた、重要なエピトープのアクセシビリティに最適ではないことを確認した。その結果、ラット交差反応性を評価するために、ＥＬＩＳＡの代わりにラット蛍光発生ペプチドアッセイを使用した。確認された阻害能を持つナノボディのファミリーの代表はすべてラット交差反応性であり、この特定のクローンのセットによって認識されるエピトープが、保存されたＭＭＰ１３触媒ポケット内にあることを示唆している。
要約すると、ＭＭＰ１３の任意の日常的操作は、酵素の活性とＴＩＭＰ−２結合を妨害することがわかった（データは示さず）。以下を含む様々なパラメーターを変更および評価した後に：すなわち、異なる抗原（例えば、ｐｒｏＭＭＰ１３、触媒ドメイン（Ｆ７２Ｄ）、活性化ヒトＭＭＰ１３、活性化ラットＭＭＰ１３、活性化イヌＭＭＰ１３）；異なるアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ヒト蛍光発生ペプチドアッセイ、ラット蛍光発生ペプチドアッセイ、ヒトコラーゲン分解アッセイ；異なるアッセイ設定、例えば被覆条件の変化、溶液中、およびＭＭＰ１３の捕捉、を変更および評価した後に、完全阻害ナノボディの同定のための唯一の成功戦略は、触媒ドメイン（Ｆ７２Ｄ）または活性化ＭＭＰ１３種を使用した選択であることが見出された（キャンペーン４）。
６．３．５ リードパネル
蛍光発生ペプチドアッセイまたはコラーゲン分解アッセイで同定された阻害性ナノボディの配列を決定した。配列情報に基づき、ナノボディは様々なファミリーに分類できた。スクリーニングキャンペーン２および３に由来する４つのファミリーは、コラーゲン分解アッセイでは完全な阻害を示したが、蛍光発生ペプチドアッセイでは活性を示さなかった；本明細書において「プロファイル１」クローンとしてさらに示す（４０Ｅ０９およびファミリーメンバーを参照）。スクリーニングキャンペーン４に由来する１０のファミリーは、コラーゲン分解アッセイおよび蛍光発生ペプチドアッセイの両方で阻害活性を示した；本明細書において「プロファイル２」クローンとしてさらに示す。
ナノボディファミリーごとに代表的なクローンを選択し、合計１４の代表を選んだ。代表クローンの配列を表Ａ−１に示す。
６．４ 一価リードパネルのin vitro特性評価
代表ナノボディクローンの機能をさらに特徴付けるために、それらをｐＡＸ１２９に再クローン化し、大腸菌に形質転換し、標準プロトコルに従って発現および精製した（例：Maussang et al. 2013 J Biol Chem 288(41): 29562-72）。その後これらのクローンを、様々な機能的in vitroアッセイに供した。
６．４．１ 酵素アッセイ
ナノボディの効力／有効性を、異なるＭＭＰ１３オルソログ用に設定した蛍光発生ペプチドアッセイ、およびヒトコラーゲン分解アッセイで試験した（両方のアッセイは、スクリーニング中にも使用した、例６．３を参照）。さらに、コラーゲン分解アッセイと比較してより高いコラーゲン濃度を使用する、第２のコラーゲンベースのアッセイ（蛍光発生コラーゲンアッセイ）を確立し、ＭＭＰ１３阻害剤が活性であると予想される軟骨の高コラーゲン濃度条件をシミュレートした。このアッセイでは、無傷のＦＩＴＣ標識コラーゲン基質の蛍光は、フルオロフォアの相互消光効果のために低い。切断すると、消光が失われ、蛍光が増加する。
酵素アッセイにおける効力の概要を、表６．４．１に示す。
表６．４．１ ＭＭＰ１３酵素アッセイにおけるリードパネルの効力。効力は、有効性が約１００％の場合にのみ報告される。
図１に、高濃度のウシコラーゲンＩを使用した場合の、活性化ヒトＭＭＰ１３の阻害の用量反応曲線を示す（蛍光発生コラーゲンアッセイ）。

図１：蛍光発生コラーゲンアッセイにおける、プロファイル１ナノボディ（左のグラフ）およびプロファイル２ナノボディ（右のグラフ）の用量反応曲線
プロファイル１ナノボディは、低コラーゲン濃度条件下でのコラーゲン分解アッセイにおいて完全な有効性を示したが、その有効性は、高コラーゲン濃度条件下での蛍光発生コラーゲンアッセイにおいて低下した（図１、左パネル）。
また、比較薬であるMSC2392891Aは、蛍光発生コラーゲンアッセイにおいてさらに弱い有効性を示した（図１）。
プロファイル２の代表的なナノボディは、コラーゲン分解アッセイおよび蛍光発生コラーゲンアッセイの両方で、強力かつ完全に有効であった。このアッセイでは、ほとんどのナノボディが比較薬よりも活性が高かった。これらのプロファイル２の代表は、ヒト、カニクイザル、ラット、イヌ、およびウシの蛍光発生ペプチドアッセイで同等の効力（表６．４．１を参照）および有効性（図１、右パネル）を示した。
６．４．２ 結合アッセイ
ＥＬＩＳＡの設定を、結合親和性を評価するために使用した。しかしこのアッセイは、プロファイル１ナノボディの親和性の評価にのみ適しており、プロファイル２ナノボディには適さないことが判明した（例６．３を参照）。
結果を表６．４．２Ａに示す。
表６．４．２Ａ：プロファイル１ナノボディのＥＬＩＳＡで評価した結合親和性（ＥＣ５０）
結論として、プロファイル１ナノボディの結合親和性は、試験した３種で同等である（すなわち、１０倍未満の差）。クローン４０Ｅ０９は、ヒトＭＭＰ１３に対して２番目に優れた結合親和性であったが、種全体では最高の親和性を示す。
プロファイル２ナノボディは、ＭＭＰ１３への結合に関してＴＩＭＰ−２と競合することがわかったため、ＴＩＭＰ−２競合ＥＬＩＳＡを設定し、プロファイル２ナノボディの親和性を評価するために使用した。特に、プロファイル１ナノボディはＴＩＭＰ−２と競合しない。
結果を表６．４．２Ｂに示す。
表６．４．２Ｂ：プロファイル２ナノボディのＴＩＭＰ−２競合ＥＬＩＳＡで評価した効力（ＩＣ５０）

結論として、評価は酵素アッセイで得られた効力と類似しており、ナノボディ５１６Ｇ０８、５２９Ｃ１２および６２Ｃ０２が最高の阻害能を示し、一方ナノボディ５９Ｆ０６、５２５Ｃ０４および６３Ｆ０１がそれに続いた。
６．４．３ 選択性アッセイ
ＭＭＰ１およびＭＭＰ１４と比較したＭＭＰ１３に対するナノボディの選択性を決定するために、蛍光発生ペプチドアッセイを使用した。ＭＭＰ１とＭＭＰ１４は、密接に関連する２つのＭＭＰファミリーメンバーである。プロファイル１ナノボディはＭＭＰ１３蛍光発生ペプチドアッセイで阻害を示さなかったため、プロファイル２ナノボディのみの試験が可能であった。非選択的ＭＭＰ阻害剤であるＴＩＭＰ−２を、これらのアッセイの陽性対照として使用した。
結果を図２に示す。

図２． ＭＭＰ１３リードナノボディの選択性

すべてのナノボディは高度に選択的であった。それらはＭＭＰ１阻害を示さず、いくつかのナノボディについては高濃度のＭＭＰ１４で非常にわずかな阻害のみが観察された。
６．４．４ エピトープビニング
エピトープビニングのために、プロファイル１およびプロファイル２由来の一価ナノボディのパネルを、競合ＥＬＩＳＡにおいて精製ナノボディ４０Ｅ０９（プロファイル１）に対して試験した。
競合ＥＬＩＳＡの結果を図３に示す。

図３．マウス抗ヒトＭＭＰ１３ ｍＡｂ（R&D Systems #MAB511）を介して捕捉した、ヒト全長ＭＭＰ１３のプロファイル１およびプロファイル２ナノボディのパネルに対する、０．６ｎＭビオチン化４０Ｅ０９の競合ＥＬＩＳＡ。ＭＭＰ１３は、３７℃で１時間３０分のＡＰＭＡとのインキュベーションにより活性化された。

プロファイル１ナノボディ３２Ｂ０８、４３Ｂ０５、４３Ｅ１０および４０Ｅ０９（陽性対照）は、すべて４０Ｅ０９と競合する。一方、プロファイル２ナノボディ５９Ｆ０６、６２Ｃ０２、６３Ｆ０１、５１３Ｃ０４、５１６Ｇ０８、５１７Ａ０１、および陰性対照ｃＡｂＬｙｓは、４０Ｅ０９と競合しない。
したがって、プロファイル１ナノボディは、プロファイル２ナノボディ（仮に「ビン２」と呼ぶ）とは異なるエピトープビン（仮に「ビン１」と呼ぶ）に属していると考えられる。
６．５ 二価構築物
上記の例６．４．１で実証されているように、プロファイル１ナノボディは、蛍光発生ペプチドアッセイにおいて阻害を示さなかった（表６．４．１を参照）。本発明者らは、プロファイル１ナノボディとプロファイル２ナノボディの組み合わせの効果の調査に着手した。
最良の種の交差反応性結合剤として（例６．４．２を参照）、ナノボディ４０Ｅ０９を、プロファイル１ナノボディの代表として選択した。プロファイル２については、５１６Ｇ０８、６２Ｃ０２、５１７Ａ０１の３つのナノボディを選択した。プロファイル１およびプロファイル２のナノボディは、３５ＧＳリンカーを用いて二価のフォーマットで結合した（表６．５参照；Ｎｂ（Ａ）−３５ＧＳ−Ｎｂ（Ｂ））。二価ナノボディをｐＡＸ２０５にクローニングし、P. pastorisに形質転換し、標準的な手順に従って発現および精製した。
これらの二価構築物の効力を評価するため、ラット蛍光発生ペプチドアッセイを使用したが、スクリーニングの設定と比較してアッセイの感度を向上させるために、ＭＭＰ１３濃度を低くした（１．３３ｎＭではなく０．１５ｎＭ）。二価構築物は、この適合された蛍光発生ペプチドアッセイおよびヒト蛍光発生コラーゲンアッセイで試験した。
得られたデータを、表６．５にまとめる。
表６．５：ラット蛍光発生ペプチドアッセイ（より感度が高いように適合）およびヒト蛍光発生コラーゲンアッセイにおける、二価ナノボディの効力
結果は、プロファイル１ナノボディとプロファイル２ナノボディを組み合わせてなる２価の構築物が、それらの１価のビルディングブロックよりも、適合ラットの蛍光発生ペプチドアッセイにおいて強力であり、最大４０倍の効力改善を有することを示す。また、ヒト蛍光発生コラーゲンアッセイにおいても、効力の改善が観察された（最大４倍）。両方のアッセイにおいて、二価構築物は、陽性の非選択的対照ＴＩＭＰ−２に対して同等に強力であった。
したがって、プロファイル１ナノボディはそれ自体では特に阻害性ではないが、２価の構築物に組み合わされると、プロファイル２ナノボディの効力を向上させた。
６．６ 生物物理学的特性評価
患者の利便性を促進するために、治療化合物の低い投与頻度および高い保持が好ましい。したがって、ナノボディが高い安定性を有することが好ましい。
安定性を試験するために、５つの代表的プロファイル２ナノボディおよび１つの代表的プロファイル１ナノボディを、生物物理学的特性評価に供した。
６．６．１ サーマルシフトアッセイ
野生型抗ＭＭＰ１３ナノボディの熱安定性を、サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）で調査した。
結果を表６．６．１に示す。
表６．６．１：一価ナノボディのｐＨ７でのＴｍ

ｐＨ７でのＴｍ値は、６５℃から８３℃の範囲であり、安定性特性が良好から非常に良好であることを示す。
６．６．２ 分析ＳＥＣ
５つの代表的な抗ＭＭＰ１３ナノボディの選択されたパネルの、多量体化および凝集の傾向を、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）によって調査した。
結果の要約を、表６．６．２に示す。
表６．６．２：ＭＭＰ１３リードナノボディの分析ＳＥＣパラメーター

５つの代表的なナノボディの保持時間は、一価ナノボディについての予想範囲内（７．６〜８．２分）であり、主要ピークの相対面積および全体の回収率は、すべてのナノボディで９０％を超えていた。
ＴＳＡおよびａＳＥＣに基づく生物物理学的特性は、試験したすべてのナノボディについて、さらなる開発に適していると考えられた。
６．７ さらなる開発および配列最適化のためのクローンの選択
代表的ナノボディおよび二価構築物の機能的および生物物理学的特性に基づいて、４つの例示的なリードナノボディ：６２Ｃ０２、５２９Ｃ１２、８０Ａ０１および二価構築物C01010080（「００８０」、プロファイル２ナノボディ５１７Ａ０１とプロファイル１ナノボディ４０Ｅ０９からなる）を、さらなる開発用に選択した。
本発明者らは、リードパネルのアミノ酸配列の最適化（「配列最適化」または「ＳＯ」）に着手した。配列最適化のプロセスにおいては、以下を試みる：（１）翻訳後修飾（ＰＴＭ）のために部位をノックアウトする；（２）親ナノボディをヒト化する；および（３）潜在的な既存抗体のエピトープをノックアウトする。同時に、ナノボディの機能的および生物物理学的特性を維持するか、さらに改善することが望ましい。
６．７．１ 翻訳後修飾（ＰＴＭ）
評価した翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、Ｍｅｔ酸化、Ａｓｎ脱アミド化、Ａｓｐ異性化、Ａｓｎグリコシル化およびピログルタメート形成である。
Ｅ１Ｄ変異（通常、ピログルタメートの形成を防ぐために組み込まれている）は、配列最適化の間には分析しなかったが、フォーマットされたナノボディに含まれていた。変異は、１２倍の効力低下が観察された６２Ｃ０２を除き、すべてのＭＭＰ１３リードナノボディで受け入れられていた。したがってＥ１Ｄ変異は、６２Ｃ０２ビルディングブロックには組み込まないと決定された。
潜在的なＰＴＭを評価するために、強制酸化および温度ストレスをリードパネルに加えた。C0101517A01（「５１７Ａ０１」）およびC0101080A01（「８０Ａ０１」）を除き、リードパネルに修飾は観察されなかった。
強制酸化および温度ストレス条件下では、C0101080A01はＡｓｐ異性化およびＭｅｔ酸化を受けやすくなった。ただし、異性化と酸化の程度は評価条件で異なり、それぞれの場合に適用されたしきい値をわずかに下回るか上回る値であった。最終的に、アミノ酸残基５４−５５、１００ｄ−１００ｅ、Ｍ１００ｊおよび１０１−１０２が、ＰＴＭの原因となる残基として同定された。特に、これらの残基はすべて、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３領域のいずれかに位置しているため、潜在的に標的結合に関与する。異なる要件に対応する試みのために、これらの残基が変異したＮＫＫライブラリを構築し、その後、蛍光発生ペプチドアッセイでスクリーニングして潜在的な効力の損失を評価し、生物物理学的特性（Ｔｍ）についてスクリーニングした。意外なことに、これらのＣＤＲにおいて様々な位置の変異が、効力を大幅に失うことなく、つまり８０％以上の阻害を維持しながら、可能であることが見出された。
・Ｄ１００ｄＸライブラリの場合、９個のアミノ酸（「ＡＡ」）置換が８０％を超える阻害を示した（Ｅ、Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、ＷおよびＹ）。
・Ｍ１００ｊＸライブラリの場合、１６個のＡＡ置換が８５％を超える阻害を示した（Ｔ、Ｃ、Ｈを除くすべて）。
・Ｄ１０１Ｘライブラリの場合、１６個のＡＡ置換が９０％を超える阻害を示した（Ｄ、Ｆ、Ｐを除くすべて）。
・Ｙ１０２Ｘライブラリの場合、ほとんどのクローンは９０％を超える阻害を示した。したがって、アミノ酸位置１０２は、任意の残基に変異させることができると考えられた。
以下の保存された変異が特に好ましい：Ｄ１００ｄＥおよびＭ１００ｊＬ。
ＣＤＲ領域での好ましい変異の概要は、以下の表６．７．１Ａ、６．７．１Ｂおよび６．７．１Ｃに提供される。クローン８０Ａ０１のＣＤＲのアミノ酸配列は、ファミリーメンバーのＣＤＲを比較する基準として使用した。Kabatの番号付けに従って、ＣＤＲ１はアミノ酸残基２６から始まり、ＣＤＲ２はアミノ酸残基５０から始まり、ＣＤＲ３はアミノ酸残基９５から始まる。
表６．７．１Ａ（８０Ａ０１ＳＯ ＣＤＲ１）

＊１つのクローンにおいて最大０個のＣＤＲ１変異（配列番号２８）
表６．７．１Ｂ（８０Ａ０１ＳＯ ＣＤＲ２）

＊１つのクローンにおいて最大０個のＣＤＲ２変異（配列番号４３）
表６．７．１Ｃ（８０Ａ０１ＳＯ ＣＤＲ３）

＊１つのクローンにおいて最大４個のＣＤＲ変異（配列番号５７）
Ｘ１＝Ｅ，Ｇ，Ａ，Ｐ，Ｔ，Ｒ，Ｍ，Ｗ，Ｙ
Ｘ２＝Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ，Ｚ，Ｇ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｗ，ＹおよびＶ
Ｘ３＝Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｚ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，ＹおよびＶ
Ｘ４＝Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｚ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，ＷおよびＶ
強制酸化および温度ストレス条件下では、C0101517A01は脱アミド化されやすい傾向にあった。最終的に、アミノ酸残基Ｎ１００ｂおよびＮ１０１は、温度ストレス実験により脱アミド化に敏感な残基として同定された。ただしこれらの残基はＣＤＲ３領域にあり、標的結合に潜在的に関与している。したがって脱アミド化部位をノックアウトすると、結合に影響を与える可能性がある。またこの場合において、脱アミド化されやすい残基が変異したＮＫＫライブラリを構築し、その後、蛍光発生ペプチドアッセイでスクリーニングして潜在的な効力の損失を評価し、生物物理学的特性（Ｔｍ）についてスクリーニングした。
Ｎ１００ｂをＱまたはＳに変異させるか、Ｎ１０１をＱまたはＶに変異させると、脱アミド化が妨げられることがまったく予想外に示され、同時に、親ナノボディC0101517A01と比較してＴｍが１〜３℃増加したが、一方で効力は同等であった。４つの好ましいバリアントを表６．７．１Ｄに示す；これには、ＴＳＡおよび蛍光発生ペプチドアッセイの結果も要約する。ＣＤＲにおける好ましい変異の概要を、以下の表に示す。
表６．７．１Ｄ．第２ラウンドのC0101517A01配列最適化バリアントのデータ概要：
ＣＤＲ領域での好ましい変異の概要を、以下の表６．７．１Ｅ、６．７．１Ｆおよび６．７．１Ｇに提供する。クローン５１７Ａ０１のＣＤＲのアミノ酸配列は、他のクローンのＣＤＲと比較する基準として使用した。Kabat番号付けに従って、ＣＤＲ１はアミノ酸残基２６から始まり、ＣＤＲ２はアミノ酸残基５０から始まり、ＣＤＲ３はアミノ酸残基９５から始まる。
表６．７．１Ｅ（５１７Ａ０１ＳＯ ＣＤＲ１）

＊１つのクローンにおいて最大０個のＣＤＲ１変異（配列番号２６）
表６．７．１Ｆ（５１７Ａ０１ＳＯ ＣＤＲ２）

＊１つのクローンにおいて最大０個のＣＤＲ２変異（配列番号４１）
表６．７．１Ｇ（５１７Ａ０１ＳＯ ＣＤＲ３）

＊１つのクローンにおいて最大２個のＣＤＲ変異（配列番号５５）
６．７．２ ヒト化
ヒト化のために、ナノボディ配列を、ヒトＩＧＨＶ３−ＩＧＨＪ生殖細胞系コンセンサス配列とさらに相同的にした。ナノボディ「ホールマーク」残基以外の、ナノボディとヒトＩＧＨＶ３−ＩＧＨＪ生殖細胞系コンセンサス配列とで異なるフレームワーク領域における特定のアミノ酸を、ヒトの対応物に変更して、ただしタンパク質の構造、活性、および安定性は元のまま維持した。
６．７．３ 既存の抗体および抗薬物抗体
本発明者らは、配列最適化戦略を導く免疫原性に関連する臨床結果の、早期リスク評価を行った。評価には、薬物候補の免疫原性の可能性と、作用機序と最終的な生物治療分子の性質に基づく抗薬物抗体の影響の可能性の両方が含まれた。これについてナノボディの配列を評価し、（ｉ）任意の天然に存在する既存抗体の結合を最小限に抑え、（ｉｉ）処置によって出現する免疫原性応答の誘発の可能性を低減した。
変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ｌを、すべてのＭＭＰ１３ナノボディに導入した。
６．７．４ 好ましいＳＯクローン
表Ａ−１およびＡ−２において、配列は、リードパネルの配列最適化に基づいて描かれており、ここで配列は、ＰＴＭ、ヒト化、および潜在的な既存の抗体および抗薬物抗体のエピトープを考慮して詳述された。
６．８ 二重特異性構築物
抗ＭＭＰ１３ナノボディは、ＭＭＰ１３の軟骨分解機能を阻害するために、関節などの対象部位で優先的に活性である必要がある。アグリカンは関節に豊富に存在し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主なプロテオグリカンは、総タンパク質含有量の約５０％を占める。したがって、少なくとも理論的には、抗ＭＭＰ１３ナノボディをアグリカン結合剤に固定すると、抗ＭＭＰ１３ナノボディを関連組織に誘導し、その保持力を向上することができる。
本発明の抗ＭＭＰ１３結合剤をこれらのアグリカン結合剤と組み合わせ、得られた二重特異性構築物の効力を、ヒト蛍光発生ペプチドアッセイおよび競合ＥＬＩＳＡアッセイで試験することを目的とした。アグリカン結合剤およびＭＭＰ１３阻害剤を含む様々な二重特異性構築物を生成し、表に示されているように試験した。
典型的な結果のフォーマットおよび有効性を、表６．８Ａおよび表６．８Ｂに示す。
表６．８Ａ：二重特異性ＭＭＰ１３−ＣＡＰナノボディをヒト蛍光発生ペプチドアッセイで試験した。効力をそれぞれの単一特異性対応物と比較した。ＴＩＭＰ−２およびMSC2392891Aは、個々のアッセイにおいて内部基準として使用した。ＳＯ：最適化配列、ただしプレＡｂ変異は除く。ＳＯｖａｒ：非最終ＳＯバリアント。
表６．８Ｂ：二重特異性ＭＭＰ１３−ＣＡＰナノボディを競合ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。効力をそれぞれの単一特異性対応物（ＡＬＢ２６融合物）と比較した。ＳＯ：最適化配列（プレＡｂ変異を除く）。ＳＯｖａｒ：非最終ＳＯバリアント。
表６．８Ａおよび６．８Ｂに示す結果は、アグリカン結合剤をＭＭＰ１３阻害剤に組み合わせても、ＭＭＰ１３阻害剤の効力に悪影響がないことを示す。特にほとんどの場合、リードパネルＭＭＰ１３阻害剤は、非選択的ＭＭＰ阻害剤ＴＩＭＰ−２と同じ効力を有する。
例６．９ in vivoラットＭＭＴモデルのＤＭＯＡＤ研究
本発明のＣＡＰ結合剤に融合したＭＭＰ１３阻害剤の、in vivo効力をさらに実証するために、ラットで外科的に誘発された内側半月板断裂（Tear）（ＭＭＴ）モデルを使用した。簡単に述べると、抗ＭＭＰ１３ナノボディを、ＣＡＰ結合剤（「７５４」またはC010100754）に結合させた。ラットの片膝を手術して、ＯＡ様の症状を引き起こした。処置は、手術後３日目にＩＡ注射により開始した。組織病理学を術後４２日目に実施した。中間および最終血清試料を、探索的バイオマーカー分析のために採取した。内側および全体の実質的軟骨変性の幅、ならびに軟骨変性の減少率を決定した。群当たり２０匹の動物を使用した。
内側脛骨の軟骨分解の抑制を図４に示す。
結果は、軟骨幅が、ＭＭＰ１３−ＣＡＰ構築物によって４２日後に、ビヒクルと比較して大幅に減少したことを示す。これらの結果は、以下を示唆する：
（ａ）ＣＡＰ部分は、例６．８の結果と一致して、抗ＭＭＰ１３ナノボディ（７５４）の活性に悪影響を与えない；
（ｂ）ＣＡＰ部分は、抗ＭＭＰ１３ナノボディの保持を可能にする；および
（ｃ）抗ＭＭＰ１３ナノボディは、軟骨の幅にプラスの効果がある。

図４ ラットＭＭＴモデルにおける、ナノボディによる軟骨分解の阻害

本出願を通して引用されるすべての参考文献（文献参照、発行済み特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の全内容は、特に上記で参照された教示に関して、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
表Ａ−１：抗ＭＭＰ１３阻害剤のアミノ酸配列（「ＩＤ」は、本明細書で使用する配列番号を指す）
表Ａ−２：ＣＤＲおよびフレームワークの配列、および式Ｉで提供される好ましい組み合わせ、すなわちＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（以下の用語：「ＩＤ」は所定の配列番号を指す。最初の列はＩＳＶＤ全体のＩＤを指す）
表Ａ−３：抗ＭＭＰ１３構築物のアミノ酸配列（「ＩＤ」は本明細書で使用する配列番号を指す）
表Ｂ
表Ｃ：様々なリンカー配列（「ＩＤ」は本明細書で使用する配列番号を指す）
表Ｄ：血清アルブミン結合ＩＳＶＤ配列（「ＩＤ」は本明細書で使用する配列番号を指す）、ＣＤＲ配列を含む
表Ｅ：アグリカン結合ＩＳＶＤ配列（「ＩＤ」は本明細書で使用する配列番号を指す）、ＣＤＲ配列を含む
表Ｆ：多価構築物（「ＩＤ」は本明細書で使用する配列番号を指す）、ＣＤＲ配列を含む

Claims (49)

  1. マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含む、ポリペプチド。
  2. ＭＭＰが、ＭＭＰ１３（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ８（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ１９およびＭＭＰ２０（エナメリシン）からなる群から選択され、好ましくはＭＭＰがＭＭＰ１３である、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. ＭＭＰ１３に結合するＩＳＶＤが、ＭＭＰ１またはＭＭＰ１４（膜型）に結合しない、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. ＭＭＰ１３に結合するＩＳＶＤが３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、請求項３に記載のポリペプチドであって、ここで
    （ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号２７、２８、２５、２６、２３、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６および２４；および
    配列番号２７、２８、２５、２６、２３、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６および２４と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
    （ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号４２、４３、４０、４１、３７、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、３８および３９；および
    配列番号４２、４３、４０、４１、３７、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、３８および３９と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；および
    （ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号５６、１０７、５７、５４、１０６、５５、５２、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６および５３；および
    配列番号５６、１０７、５７、５４、１０６、５５、５２、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６および５３と１、２、３または４個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される、
    前記ポリペプチド。
  5. 請求項４に記載のポリペプチドであって、ここで
    （ｉ）ＣＤＲ１は、以下からなる群から選択され：
    （ａ）配列番号２３；および
    （ｂ）配列番号２３と１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここで、
    −位置７において、ＹはＲに変更されており；
    （ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群から選択され：
    （ｃ）配列番号３７；および
    （ｄ）配列番号３７と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここで、アミノ酸差異は以下のように定義され：
    −位置４において、ＶはＴに変更されており；および／または
    −位置５において、ＧはＡに変更されており；および／または
    −位置９において、ＮはＨに変更されており；
    および
    （ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群から選択される：
    （ｅ）配列番号５２；および
    （ｆ）配列番号５２と１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、すなわち位置６において、ＹがＳに変更されているもの、
    前記ポリペプチド。
  6. 請求項４に記載のポリペプチドであって、ここで
    （ｉ）ＣＤＲ１は配列番号２６であり；
    （ｉｉ）ＣＤＲ２は配列番号４１であり；および
    （ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群から選択され：
    （ｅ）配列番号５５；および
    （ｆ）配列番号５５と１または２個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここでアミノ酸差異は、以下のように定義され：
    −位置８において、ＮはＱまたはＳに変更されており；および／または
    −位置１９において、ＮはＶまたはＱに変更されている、
    前記ポリペプチド。
  7. 請求項４に記載のポリペプチドであって、ここで
    （ｉ）ＣＤＲ１は配列番号２８であり；
    （ｉｉ）ＣＤＲ２は配列番号４３であり；および
    （ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群から選択され：
    （ｅ）配列番号５７；および
    （ｆ）配列番号５７と１、２、３または４個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここでアミノ酸差異は、以下のように定義される：
    −位置１０において、ＤはＥ、Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、ＷまたはＹに変更されており；および／または
    −位置１６において、ＭはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｚ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、ＹまたはＶに変更されており；および／または
    −位置１７において、ＤはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｚ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹまたはＶに変更されており；および／または
    −位置１８において、ＹはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｚ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＶに変更されている、
    前記ポリペプチド。
  8. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、ここで：
    −ＣＤＲ１は、配列番号２７、２８、２５、２６、２３、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６および２４からなる群から選択され；
    −ＣＤＲ２は、配列番号４２、４３、４０、４１、３７、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、３８および３９からなる群からから選択され；および
    −ＣＤＲ３は、配列番号５６、１０７、５７、５４、１０６、５５、５２、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６および５３からなる群から選択される、
    前記ポリペプチド。
  9. 請求項１７に記載のポリペプチドであって、ＩＳＶＤが、以下からなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組み合わせを含む：
    −ＣＤＲ１は配列番号２７であり、ＣＤＲ２は配列番号４２であり、ＣＤＲ３は配列番号５６である；
    −ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４３であり、ＣＤＲ３は配列番号１０７である；
    −ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４３であり、ＣＤＲ３は配列番号５７である；
    −ＣＤＲ１は配列番号２５であり、ＣＤＲ２は配列番号４０であり、ＣＤＲ３は配列番号５４である；
    −ＣＤＲ１は配列番号２６であり、ＣＤＲ２は配列番号４１であり、ＣＤＲ３は配列番号１０６である；
    −ＣＤＲ１は配列番号２６であり、ＣＤＲ２は配列番号４１であり、ＣＤＲ３は配列番号５５である；
    −ＣＤＲ１は配列番号２３であり、ＣＤＲ２は配列番号３７であり、ＣＤＲ３は配列番号５２である；
    −ＣＤＲ１は配列番号２６であり、ＣＤＲ２は配列番号４８であり、ＣＤＲ３は配列番号６２である；
    −ＣＤＲ１は配列番号２６であり、ＣＤＲ２は配列番号４１であり、ＣＤＲ３は配列番号６３である；
    −ＣＤＲ１は配列番号２９であり、ＣＤＲ２は配列番号４４であり、ＣＤＲ３は配列番号５８である；
    −ＣＤＲ１は配列番号３０であり、ＣＤＲ２は配列番号４５であり、ＣＤＲ３は配列番号５８である；
    −ＣＤＲ１は配列番号３１であり、ＣＤＲ２は配列番号４６であり、ＣＤＲ３は配列番号５９である；
    −ＣＤＲ１は配列番号３２であり、ＣＤＲ２は配列番号４７であり、ＣＤＲ３は配列番号６０である；
    −ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号４１であり、ＣＤＲ３は配列番号６１である；
    −ＣＤＲ１は配列番号３４であり、ＣＤＲ２は配列番号４９であり、ＣＤＲ３は配列番号６４である；
    −ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号５０であり、ＣＤＲ３は配列番号６５である；
    −ＣＤＲ１は配列番号３６であり、ＣＤＲ２は配列番号５１であり、ＣＤＲ３は配列番号６６である；
    −ＣＤＲ１は配列番号２３であり、ＣＤＲ２は配列番号３９であり、ＣＤＲ３は配列番号５３である；および
    −ＣＤＲ１は配列番号２４であり、ＣＤＲ２は配列番号３８であり、ＣＤＲ３は配列番号５２である、
    前記ポリペプチド。
  10. ＩＳＶＤが、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなるか、または本質的にこれらからなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. ポリペプチドが、配列番号１であるか、または配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. ＣＤＲ１が配列番号２７であり、ＣＤＲ２が配列番号４２であり、ＣＤＲ３が配列番号５６である、請求項４、８、９および１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. ＩＳＶＤが、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７および８からなる群から選択される、請求項４〜１０および１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. ポリペプチドが、例えばKinExAによって決定される場合、ＫＤが１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１３Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、好ましくは最大で１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍもしくは１Ｅ−０９Ｍ未満、または１Ｅ−１０Ｍ未満、例えば５Ｅ−１１Ｍ、４Ｅ−１１Ｍ、３Ｅ−１１Ｍ、２Ｅ−１１Ｍ、１．７Ｅ−１１Ｍ、１Ｅ−１１Ｍなど、または５Ｅ−１２Ｍ、４Ｅ−１２Ｍ、３Ｅ−１２Ｍ、１Ｅ−１２Ｍで、ＭＭＰ１３に結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. ポリペプチドが、例えば競合ＥＬＩＳＡ、ＴＩＭＰ−２競合ＥＬＩＳＡ、蛍光発生ペプチドアッセイ、蛍光発生コラーゲンアッセイまたはコラーゲン分解アッセイによって決定される場合、ＩＣ５０が１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１１Ｍの間で、ＭＭＰ１３の活性を阻害する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. ポリペプチドが、ＩＣ５０が最大１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍ、５Ｅ−０９Ｍ、または４Ｅ−９Ｍ、３Ｅ−９Ｍ、２Ｅ−９Ｍ、例えば１Ｅ−９Ｍなどで、ＭＭＰ１３の活性を阻害する、請求項１５に記載のポリペプチド。
  17. ポリペプチドが、例えばＥＬＩＳＡにより決定される場合、ＥＣ５０が１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１１Ｍの間で、ＭＭＰ１３に結合する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  18. ポリペプチドが、例えばＳＰＲにより決定される場合、オフレートが５Ｅ−０４ｓ−１未満でＭＭＰ１３に結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  19. ＭＭＰ１３が、ヒトＭＭＰ１３、ラットＭＭＰ１３、イヌＭＭＰ１３、ウシＭＭＰ１３、カニクイザルＭＭＰ１３、好ましくはヒトＭＭＰ１３、好ましくは配列番号１１５である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. ポリペプチドが、ＭＭＰ１３の活性に拮抗する、例えば（ｉ）プロテアーゼ活性、好ましくはアグリカンおよび／またはコラーゲンの切断などに拮抗する、ここで前記コラーゲンは、好ましくはコラーゲンＩＩであり；（ｉｉ）ヘモペキシン様ドメインへのコラーゲンの結合に拮抗する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. ポリペプチドが、コラーゲンおよび／またはアグリカンへのＭＭＰ１３の結合を、少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上ブロックする、請求項２０に記載のポリペプチド。
  22. ポリペプチドが、ＭＭＰ１３のプロテアーゼ活性を阻害する、例えば、アグリカン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩＶおよび／またはゼラチンなどの基質のタンパク質分解を阻害し、ここで前記コラーゲンは、好ましくはＩＩ型コラーゲンである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 少なくとも２つのＩＳＶＤを含み、少なくとも１つのＩＳＶＤが、ＭＭＰ、好ましくはＭＭＰ１３に特異的に結合する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  24. 少なくとも２つのＩＳＶＤが、ＭＭＰ、好ましくはＭＭＰ１３に特異的に結合する、請求項２３に記載のポリペプチド。
  25. それぞれ個別にＭＭＰ１３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶＤを含む、ポリペプチドであって、ここで
    ａ）少なくとも「第１」ＩＳＶＤは、ＭＭＰ１３の第１の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、または立体構造に特異的に結合し；およびここで、
    ｂ）少なくとも「第２」ＩＳＶＤは、第１の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造とはそれぞれ異なる、ＭＭＰ１３の第２の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造に、特異的に結合する；
    前記ポリペプチド。
  26. ＭＭＰ１３に特異的に結合する「第１」ＩＳＶＤが、配列番号１１１、１１、１１０、１０、１１２、１２、１０９、９、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択される、請求項２５に記載のポリペプチド。
  27. ＭＭＰ１３に特異的に結合する「第２」ＩＳＶＤが、配列番号１、２、３、４、５、６、７および８からなる群から選択される、請求項２５または２６に記載のポリペプチド。
  28. 好ましくは配列番号１６６、１６７および１６８からなる群から選択される、アグリカンに特異的に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  29. アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  30. アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤが、同一でも異なっていてもよい、請求項２９に記載のポリペプチド。
  31. アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤが、配列番号１６６〜１６８からなる群から独立して選択される、請求項２９または３０に記載のポリペプチド。
  32. アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤが、ヒトアグリカン［配列番号１０５］に特異的に結合する、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  33. アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤが、イヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン；ブタアグリカン；マウスアグリカン、ウサギアグリカン；カニクイザルアグリカンおよび／またはアカゲザルアグリカンに特異的に結合する、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  34. アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤが、好ましくは軟骨および／または半月板などの軟骨組織に結合する、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  35. ポリペプチドが、少なくとも７日、例えば１４日、２１日、１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月間も、滑液（ＳＦ）において３７℃で安定性を有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  36. 血清アルブミンに結合するＩＳＶＤをさらに含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  37. 血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここでＣＤＲ１が配列番号１５７であり、ＣＤＲ２が配列番号１５８であり、ＣＤＲ３が配列番号１５９である、請求項３６に記載のポリペプチド。
  38. 血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、ＡＬＢ１３５（配列番号１９３）、ＡＬＢ１２９（配列番号１４４）、ＡＬＢ８（配列番号１４２）、ＡＬＢ２３（配列番号１４３）、およびＡＬＢ１３２（配列番号１４５）からなる群から選択される、請求項３７に記載のポリペプチド。
  39. 少なくとも２つのＩＳＶＤが、互いに直接連結されているか、またはリンカーを介して連結されている、請求項２３〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  40. リンカーが、配列番号１２５〜１４１からなる群から選択され、好ましくは配列番号１２９である、請求項３９に記載のポリペプチド。
  41. Ｃ末端伸長をさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  42. Ｃ末端伸長がＣ末端伸長（Ｘ）ｎであり、式中ｎは１〜１０、好ましくは１〜５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；および各Ｘは、独立して選択される（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から独立して選択される、請求項４１に記載のポリペプチド。
  43. ポリペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、１０９、１１０、１１１、１１２、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１または１９２のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  44. 例えばＭＭＰ１３活性が関与するところの、個体の疾患または障害を処置、予防する方法であって、方法が、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを、前記疾患または障害の症状を処置または予防するのに有効な量で前記個体に投与することを含む、前記方法。
  45. 疾患または障害が、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 医薬として使用するための、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  47. 関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーからなる症状を処置または予防する際に使用するための、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  48. 請求項１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７および８のいずれか１つにより表される少なくとも１つのポリペプチドの、ＭＭＰ１３への結合を交差ブロックするか、および／または、少なくとも、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７および８のいずれか１つにより表されるポリペプチドによって、ＭＭＰ１３への結合が交差ブロックされている、前記ポリペプチド。
  49. ポリペプチドであって、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７および８のいずれか１つにより表されるポリペプチドによるＭＭＰ１３への結合を、交差ブロックするか、および／または、少なくとも、配列番号１１１、１１、１１２、１２、１０９、９、１１０、１０、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２、３、４、５、６、７および８のいずれか１つにより表されるポリペプチドによって、ＭＭＰ１３への結合が交差ブロックされており、ここで、前記ポリペプチドは、ＭＭＰ１３に特異的に結合する少なくとも１つのＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂ、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、ここでＭＭＰ１３への結合が、ＭＭＰ１３の活性を調節する、前記ポリペプチド。
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