JP6858305B2

JP6858305B2 - 関節リウマチを予防及び治療するための薬物の製造における選択性ｔｎｆｒ１拮抗ペプチドの使用

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Publication number: JP6858305B2
Application number: JP2020500945A
Authority: JP
Inventors: 一鳴陸; 潔王; 安李; 海龍江; 瑩瑩卞; 川張
Original assignee: Guilin Eight Plus One Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guilin Eight Plus One Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2018-03-02
Publication date: 2021-04-14
Anticipated expiration: 2038-03-02
Also published as: CN107090023B; JP2020511544A; EP3617223A4; EP3617223A1; WO2018171406A1; US20200188471A1; CN107090023A

Description

本発明は、生物医薬技術分野に関し、具体的には、マダラウミヘビ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｓｃｙａｎｏｃｉｎｃｔｕｓ）のヘビ毒に由来する選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びその関節リウマチにおける使用に関する。

関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）は、関節滑膜炎を特徴とする慢性自己免疫疾患である。主な臨床症状は、小関節滑膜の腫れや痛み、滑膜炎及び過形成による軟骨及び骨の侵食、関節の隙間が狭くなることであり、末期は、重度の骨破壊、吸収により、関節強直、奇形、機能障害が引き起こされる。アメリカでは、ＲＡは、人間の健康に影響を与える５つの主要な疾患（心血管疾患、アルツハイマー病、がん、エイズ、関節リウマチ）の一つであると考えられている。ＲＡはどの年齢でも発症する可能性があり、特に２０−５０歳で発症率が最も高い。世界中の約０．２４％の人がＲＡに苦しんでおり、非常に高い障害率及び予後不良を伴っている。（Ｃｒｏｓｓ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．，Ｈｏｙ，Ｄ．，Ｃａｒｍｏｎａ，Ｌ．，Ｗｏｌｆｅ，Ｆ．，Ｖｏｓ，Ｔ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．，Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｓ．，Ｌａｓｓｅｒｅ，Ｍ．，Ｊｏｈｎｓ，Ｎ．，Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ，Ｒ．，Ｗｏｏｌｆ，Ａ．，Ｍａｒｃｈ，Ｌ．，２０１４．Ｔｈｅｇｌｏｂａｌｂｕｒｄｅｎｏｆｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｅｓｔｉｍａｔｅｓｆｒｏｍｔｈｅｇｌｏｂａｌｂｕｒｄｅｎｏｆｄｉｓｅａｓｅ２０１０ｓｔｕｄｙ．Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．７３，１３１６−１３２．）。今までのところ、ＲＡの病因はまだ明らかではないが、遺伝的関節リウマチを予防及び治療するための薬物環境的要因は疾患の発症と密接に関連している。研究により、関節リウマチの重症度は、炎症性メディエーターに大きく影響されていることが分かった。主な炎症性メディエーターは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）及びインターロイキン−１（ＩＬ−１）などを含み、この中、ＴＮＦ−αは、ＲＡの発症メカニズムにおいて非常に重要な役割を果たす。現在、関節リウマチの臨床治療において、抗ＴＮＦ−α薬物、例えば、アダリムマブ、インフリキシマブなどは、良好な臨床効果を達成しており、症状を改善するとともに、関節の破壊を抑制することができる。しかし、このような抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体医薬品は、ＴＮＦ−αの生物学的機能を完全に遮断するため、生体の免疫自己安定機能及び免疫監視機能に影響を与え、多くの患者には、結核感染症、新しい自己免疫疾患、さらに腫瘍などのリスクをもたらす。

生体内のＴＮＦ−αの過剰発現及びＴＮＦ−α／ＴＮＦＲシグナル伝達経路の異常活性化は、関節リウマチなどの自己免疫疾患の発症及び進行に密接に関連している。ＲＡの発症メカニズムについての詳細な研究に伴い、より多くの研究は現在治療の標的をＴＮＦＲに変えている。しかし、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体と比較して、ＴＮＦＲの小分子拮抗薬の基礎研究関節リウマチを予防及び治療するための薬物応用研究の進歩が遅い。一般的に言えば、抗炎症の観点から、ＴＮＦＲ１は主に炎症誘発性シグナル関節リウマチを予防及び治療するための薬物アポトーシスシグナルを伝達するため、ＴＮＦＲ１伝達のシグナル伝達経路を選択的に遮断することによってＴＮＦ−αの生物学的機能を遮断することは、このような薬物の開発の焦点となっている。現在、臨床に適用可能な高度の選択性を有するＴＮＦＲ１拮抗薬がまだない。以前の研究において、我々の研究グループは、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｓｃｙａｎｏｃｉｎｃｔｕｓの毒液のファージディスプレイライブラリーを生物的に選択し、抗炎症活性ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１を得た（中国特許文献：ＣＮ１０３０３０６８７Ａ）。次いで、構造最適化により候補ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を取得た。ＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴に基づく生体高分子相互作用解析）及びＭＳＴ（マイクロスケール熱泳動）技術によりＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２との相互作用を分析した結果、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０はＴＮＦＲ１に直接結合することができ、かつＴＮＦ−α及びＴＮＦＲ２と結合せず、標的特異的であり、選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドであることが証明された。特許文献ＣＮ１０３０３０６８７Ａには、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１がＴＮＦ−αに関連する疾患を治療可能であることが開示されており、また、ＴＮＦ−αに関連する疾患が関節リウマチであることが開示されている。この先行技術のメカニズムに基づいて、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０が関節リウマチの治療に使用できることは、明確に導き出すことができない。

しかし、低分子ポリペプチドは、その相対分子量が比較的小さく、生体内で糸球体によって急速にろ過され、関連するプロテアーゼによって分解されやすいので、安定性が悪く、血漿半減期が短く、正常な生物学的機能を発揮できず、効果的な治療効果を奏することができないため、その開発と使用はある程度に制限される。この問題を解決するために、ポリペプチド薬物の修飾又は他の材料との融合による安定性の向上は、生物医薬分野において研究のホットスポットになっている。現在、ペプチド及びタンパク質に使用される化学修飾剤が数多くあり、その中で、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）及びその誘導体は最も広く使用されている修飾剤の一つである。ＰＥＧ修飾の利点は、主に（１）薬物動態特性の改善と血漿の半減期の延長、（２）溶解性と安定性（熱安定性、酸塩基耐性、変性剤耐性及びプロテアーゼ加水分解耐性）の向上、（３）免疫原性と毒性の低減、（４）体内の生物活性の向上を含む。現在、ＰＥＧ−ＴＮＦ−α抗体のＦａｂ断片、ＰＥＧ−赤血球生成促進ポリペプチドなどの多数のＰＥＧ化タンパク質及びポリペプチド類薬は、物臨床使用に承認されている。したがって、本発明者らは、以前の研究に基づいて、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の構造を修飾することにより、本発明の生成物であるＰＥＧ−ＳＮ１０を得た。本発明では、関節リウマチにおけるＰＥＧ−ＳＮ１０の役割を検討する。

本発明は、マダラウミヘビのヘビ毒に由来する選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及び関節リウマチにおけるその使用を提供することを目的とする。また、本発明のその他の目的は、ｍＰＥＧ２０００（モノメトキシポリエチレングリコール２０００）により修飾された選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、即ちＰＥＧ−ＳＮ１０の関節リウマチにおける使用を提供することである。

本発明者らは、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１（２２ＡＡ）を切断してＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０（１０ＡＡ）を得、表面プラズモン共鳴技術（ＳＰＲ）によりＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０（１０ＡＡ）がＴＮＦＲ１に結合することができ、結合能が約ＫＤ＝２．８μＭであり、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１とＴＮＦＲ１の結合能（ＫＤ＝３２μＭ）よりも高いことが高いことを発見した（江海龍、中国人民解放軍第二軍医大学２０１５年修士論文「ウミヘビのヘビ毒の抗炎症活性ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１の構造最適化と抗炎症メカニズムの研究」）。動物モデルの結果により、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０は、一定の抗炎症活性を有することを示しているが、ＴＮＦＲ１を選択的に拮抗できるか否かが不明である。

本発明では、ウシＩＩ型コラーゲン誘発関節リウマチ（ＣＩＡ）動物モデルを構築することにより、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０が関節リウマチの治療用途を有することが証明される。

本発明の第１態様によれば、アミノ酸配列が配列番号２に示される選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０が提供される。

前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の合成方法は、固相合成法によりＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を合成することであり、ＨＰＬＣ及びＭＳにより分析した結果、前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の分子量は１２５０．２９ダルトン、等電点は４．３９である。

本発明の第２態様によれば、ヌクレオチド配列が配列番号１に示される選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のコーディング遺伝子が提供される。

本発明の第３態様によれば、関節リウマチを予防及び治療するための薬物の製造における前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の使用が提供される。

好ましくは、前記関節リウマチを予防及び治療するための薬物は、選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を唯一の活性成分とするか、又は選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を含む医薬組成物である。

本発明の第４態様によれば、ｍＰＥＧ２０００（モノメトキシポリエチレングリコール２０００）により修飾された選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、即ちＰＥＧ−ＳＮ１０が提供される。前記ｍＰＥＧ２０００のカルボキシル基は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のペプチド鎖のＮ端にあるアスパラギン酸の遊離アミノ基に共有結合する。平均分子量が約２０００ダルトンのｍＰＥＧ（モノメトキシポリエチレングリコール）によりＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を修飾することにより、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の半減期及び安定性が向上する。前記ｍＰＥＧ２０００の構造式は、ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＯＯＨであり、前記ｎは重合度を示し、ｎ＝３５〜４５であり、その平均分子量は２０００ダルトンである。

本発明の第５態様によれば、関節リウマチを予防及び治療するための薬物の製造における前記ｍＰＥＧ２０００により修飾された選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＰＥＧ−ＳＮ１０の使用が提供される。

好ましくは、前記関節リウマチを予防及び治療するための薬物は、ＰＥＧ−ＳＮ１０を唯一の活性成分とするか、又はＰＥＧ−ＳＮ１０を含む医薬組成物である。

好ましくは、前記医薬組成物及び薬剤学的に許容される添加剤を用いて医薬製剤を製造する。

好ましくは、前記医薬製剤は、錠剤、顆粒剤、分散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、滴丸剤（ｄｒｉｐｐｉｎｇｐｉｌｌ）、注射剤、粉末注射剤又はエアロゾル剤などである。

好ましくは、前記関節リウマチを予防及び治療するための薬物は、ＴＮＦＲ１を選択的に拮抗する。

本発明では、ＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴に基づく生体高分子相互作用解析）及びＭＳＴ（マイクロ熱泳動）技術を使用し、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２の相互作用を分析することにより、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０がＴＮＦＲ１と直接結合することができ、ＴＮＦ−α及びＴＮＦＲ２と結合しないことを証明した。本発明では、ウシＩＩ型コラーゲン誘発関節リウマチ動物モデルを用いて本発明のポリペプチドの治療作用を観察した結果、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、腹腔内投与後にＣＩＡマウスの関節炎指数を効果的に低下させ、ＣＩＡマウス血清におけるコラーゲン特異的抗体ＩｇＧ及び炎症誘発性因子ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γのレベルを顕著に低下させ、抗炎症性因子ＩＬ−１０のレベルを顕著に向上させ、炎症性因子の作用により抗炎症作用を発揮することができる。ｍｉｃｒｏ−ＣＴスキャンは、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０がマウス骨梁の骨破壊の程度を顕著に改善できることを示す。骨破壊の観点から、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、顕著な抗炎症効果を有し、ＣＩＡマウスの関節損傷、滑膜過形成及び炎症性細胞浸潤を顕著に改善し、関節におけるＴＮＦ−αの発現量、破骨細胞の数を顕著に減少させることができる。関節の病理の観点から、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、顕著な抗炎症効果を有し、Ｔｈ１／Ｔｈ２及びＴｈ１７／Ｔｒｅｇの比率の不均衡を調節することができ、即ち、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、免疫調節により抗関節リウマチの作用を発揮することができる。

前記研究の結果は、選択制ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、いずれも良好な抗関節リウマチの作用を有することを示している。本発明は、関節リウマチを防止及び治療するための有効な薬物を提供する。

Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のＨＰＬＣ分析結果である。Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のＭＳ分析結果である。ＢＩＡｃｏｒｅ（ＳＰＲ技術）によるＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦＲ１との結合能の分析を示す。図３Ａは、ＳＮ１０とＴＮＦＲ１の相互作用を示し、結合解離定数ＫＤ値は約２．８μＭである。図３Ｂは、ＳＮ１０とＴＮＦ−αとが結合しないことを示す。図３Ｃは、ＴＮＦ−α−ＴＮＦＲ１結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す（ＴＮＦＲ１がチップ上にある）。図３Ｄは、ＴＮＦ−α−ＴＮＦＲ１結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す（ＴＮＦ−αがチップ上にある）。図３Ｅは、ＴＮＦ−α−ＴＮＦＲ２結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す。ＭＳＴ技術によるＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦＲ１との結合能の分析ことを示す。図４Ａは、ＳＮ１０とＴＮＦＲ１との相互作用を示し、結合解離定数ＫＤ値が約２．８μＭである。図４Ｂは、ＳＮ１０とＴＮＦ−αとが結合しないことを示す。図４Ｃは、ＳＮ１０とＴＮＦＲ２とが結合しないことを示す。図４Ｄは、ＴＮＦＲ１−ＴＮＦ−α結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す（ＴＮＦＲ１蛍光マーカー）。図４Ｅは、ＴＮＦＲ１−ＴＮＦ−α結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す（ＴＮＦ−α蛍光マーカー）。図４Ｆは、ＴＮＦＲ２−ＴＮＦ−α結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す（ＴＮＦＲ２蛍光マーカー）。ＣＩＡマウスの足の裏の腫脹に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の改善状況を示す。ＣＩＡマウス臨床スコアに対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の改善状況を示す。ＣＩＡマウスコラーゲン特異的抗体ＩｇＧ及び血清中の炎症性因子に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響（ｎ＝６）を示す。ＣＩＡマウス後肢関節に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す（ｎ＝１２）。ＣＩＡマウス骨梁に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す（ｎ＝１２）。ＣＩＡマウス骨梁パラメーターに対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す（ｎ＝１２）。ＣＩＡマウス足首関節病変病に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す組織切片ＨＥ染色光学顕微鏡写真である。図１１Ａは正常群、図１１Ｂはモデル群、図１１ＣはＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、図１１ＤはＰＥＧ−ＳＮ１０、図１１Ｅはインフリキシマブ群である。ＣＩＡマウスＴＮＦ−αの発現量に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。図１２Ａは正常群、図１２Ｂはモデル群、図１２ＣはＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、図１２ＤはＰＥＧ−ＳＮ１０、図１２Ｅはインフリキシマブ群である。ＣＩＡマウスＴＲＡＰの発現量に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。図１３Ａは正常群、図１３Ｂはモデル群、図１３ＣはＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、図１３ＤはＰＥＧ−ＳＮ１０、図１３Ｅはインフリキシマブ群である。ＣＩＡマウスＴｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３の発現量に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す（ｎ＝６）。ＣＩＡマウスＴｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３の発現量に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す（ｎ＝６）。ＣＩＡマウスＴ細胞におけるＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７の百分率に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す（ｎ＝６）。ＣＩＡマウスＴ細胞におけるＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７の百分率に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す（ｎ＝６）。

以下、実施例により本発明の具体的な実施形態を詳しく説明する。

以下の実施例中の実験方法は、特に明記しない限り、通常の方法である。

実施例１で製造されるＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を用いて実施例２−５の実験を行う。以下の実施例で用いられるＰＥＧ−ＳＮ１０は、強耀生物科技有限公司によって合成されたものであり、ＨＰＬＣにより検出した純度は９８％以上である。

（実施例１）
マダラウミヘビに由来する選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の合成

ポリペプチド固相合成技術によりＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を合成し、ＨＰＬＣ（図１）及びＭＳ（図２）によりその純度及び分子量を分析した結果、純度＞９７％、分子量１２５０．２９ｇ／ｍｏｌであった。

（実施例２）
ＢＩＡｃｏｒｅによるＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦＲ１との結合能の分析
１、ベースラインレベルに達するまで、泳動用緩衝液を１０μｌ／ｍｉｎの流速でＣＭ−５センシングチップに設けられたチャンネルに通過させた。
２、機器推奨緩衝液によりチップの各チャンネルの表面反応基を活性化した。
３、ＥＰ緩衝液でＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２の凍結乾燥粉末を溶解し、チップの表面に包まれるように一定の濃度で試料を注入し、さらに、１ｍｏｌ／Ｌのエタノールアミンでチップをブロックした。なお、適切な再生条件を選択するために、動力学曲線を測定する前に再生条件をテストする必要がある。
４、ベースラインが安定した後、一連の濃度のポリペプチドを注入し、中間濃度のポリペプチドを１回注射し、各濃度の応答値を記録した。

図３に示すように、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０は、ＴＮＦＲ１と直接作用することができ、ＴＮＦＲ１との結合能が約２．８μＭであり、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦ−αが結合せず、ＴＮＦＲ１とＴＮＦ−αとの相互作用を競合的に阻害することができる。

（実施例３）
ＭＳＴによるＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦＲ１との結合能の分析
１、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２との相互作用
１：１の希釈比率で一連のグラジエント濃度のＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を調製し、蛍光マーカーＴＮＦ−α／ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ２２００ｎＭとＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とを等体積で均一に混合した後、暗所で３０分間インキュベートし、次いで、毛細管で適量のサンプルを取って検出し、相対蛍光値の時間軌跡及び熱泳動（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の用量反応曲線を観察し、ソフトウェアＮＴＡｆｆｉｎｉｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｖ２．０．２によりシミュレートして親和性ＫＤ値を計算し、特異的結合の傾向があるか否かを判断した。

２、ＴＮＦ−αとのＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ２との結合に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の競合阻害作用
１：１の希釈比率で一連のグラジエント濃度のＴＮＦ−αを調製し、蛍光マーカーＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ２（２００ｎＭ）とＴＮＦ−αとを等体積で均一に混合した後、暗所で３０分間インキュベートし、次いで、毛細管で適量のサンプルを取って検出し、ソフトウェアによりシミュレートして陽性対照ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ２及びＴＮＦ−αのＫＤ値を求め、４００ｎＭのＴＮＦＲ１と４００μＭのＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を等体積で混合した後、さらに一連の濃度のＴＮＦ−αと等体積で混合し、３０分間インキュベートした後、毛細管で適量のサンプルを取って検出し、ソフトウェアによりシミュレートしてＫＤ値を求めた。Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０添加前後のＴＮＦ−α飽和濃度、応答値振幅及び親和性定数ＫＤ値の変化を比較した。

３、ＴＮＦ−αとＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ２との結合に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の競合阻害作用（方法は前記２と同じ）
図４に示すように、ＭＳＴ実験の結果から分かるように、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０は、標的特異的であり、ＴＮＦＲ１と直接相互作用することができ、ＴＮＦＲ１との結合能が約２．８μＭであり、ＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ２に結合せず、ＴＮＦＲ１のみに結合し、選択性を有し、ＴＮＦＲ１とＴＮＦ−αとの相互作用を競合的に阻害することができる。

（実施例４）
ＳＤラット体内のＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の血漿半減期の検出。
Ｇｅｎｚｙｍｅ社から購入したＥＬＩＳＡキットを用いて、製品説明書に従って測定した。ヘパリンで処理した５０μＬ毛細管により後眼窩から血清サンプルを採取し、処理後の１ｍｉｎ、２ｍｉｎ、３ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈに血液サンプルを収集した。２時間静置した後、サンプルを遠心分離し、得られた上澄みを検出まで−２０℃で貯蔵した。

表１に示すように、ＰＥＧで修飾したＰＥＧ−ＳＮ１０の血漿半減期は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の血漿半減期よりも長くなった。

実施例５：関節リウマチに対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の治療作用

一、実験動物
ＤＢＡ／１マウス、雄性、８〜１０週齢、体重１８〜２０ｇ、３０匹。

二、試薬
ウシＩＩ型コラーゲン（ＢｏｖｉｎｅＴｙｐｅ II Ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）、完全フロイントアジュバント（ＣｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ’ｓＡｄｊｕｖａｎｔ，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）、不完全フロイントアジュバント（ＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ’ｓＡｄｊｕｖａｎｔ，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ＩｇＧ抗体（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、マウスＩＬ−１７ＥＬＩＳＡ検出キット（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、マウスＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ^ＴＭ多因子（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ）フロー検出キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国）、Ｔｒｕｅ−Ｎｕｃｌｅａｒ^ＴＭＭｏｕｓｅＴｒｅｇＦｌｏｗ^ＴＭＫｉｔ（ＦＯＸＰ３ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８／ＣＤ４ＡＰＣ／ＣＤ２５ＰＥ、美国）、ＦＩＴＣａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、美国）、ＰＥ／Ｃｙ７ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、美国）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩＦＮ−γ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、美国）、ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ^ＴＭ５９４ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩＬ−４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、美国）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩＬ−１７Ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、美国）、ＦＯＸＰ３Ｆｉｘ／ＰｅｒｍＢｕｆｆｅｒ（４ｘ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、美国）。

三、実験方法
ＤＢＡ／１マウスを使用し、３日間の適応後、体重を測定し、モデルを構築し始めた。正常群として６匹ランダムに選び、残りは実験群とした。

０日目：ウシＩＩ型コラーゲン（４ｍｇ／ｍｌ）を取り、等体積のＣＦＡ（４ｍｇ／ｍｌ）とボルテックス混合した後（好ましくは、水に滴下されて分散しないまで）、１００ｕｌ／匹でマウスの尾根部に皮内注射した。

２１日目：ウシＩＩ型コラーゲン（４ｍｇ／ｍｌ）を取り、等体積のＩＦＡ（４ｍｇ／ｍｌ）とボルテックス混合した後（好ましくは、水に滴下されて分散しないまで）、１００ｕｌ／匹でマウスの尾根部に皮内注射した。３０日目にモデル構築が成功することが観察され、同日からモデル群（ＰＢＳ）、投与群−ＳＮ１０（１６００ｕｇ／ｋｇ）、投与群ＰＥＧ−ＳＮ１０（１６００ｕｇ／ｋｇ）、インフリキシマブ群（４ｍｇ／ｋｇ）に対して１回／日で腹腔内注射により１８日間連続して投与した。

四、実験結果
ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ５によりデータに対してＯｎｅ−ＷａｙＡＮＯＶＡ統計分析を行い、Ｐ＜０．０５である場合、差が統計学的に有意である。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。

１．マウス関節炎指数スコアに対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０の影響
図５、図６に示すように、初回予防接種の２９後、各群のマウスの関節炎指数は徐々に高くなり、つまり、炎症は徐々に悪化した。時間の経過につれて、マウス後肢の腫脹の程度は徐々に軽減したが、関節は強直又は奇形が発生し、最高スコアに達した。モデル群と比較して、投与群Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、いずれも関節炎指数が減少し、症状の進行が遅くなった。

２．ＣＩＡマウス血清中のコラーゲン特異的抗体及び炎症性因子に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０の影響

ＥＬＩＳＡキット及び多因子キットにより各群マウスの血清中のコラーゲン特異的抗体ＩｇＧ、炎症誘発性因子ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、及び抗炎症性因子ＩＬ−１０の含有量を測定した。各群の含有量を図７に示す。正常対照群と比較して、モデル群マウスの血清中のコラーゲン特異的抗体ＩｇＧ及び炎症誘発性因子ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γの含有量は顕著に高いが、抗炎症性因子ＩＬ−１０の含有量は正常群と差がない。モデル群と比較して、投与群Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０は、いずれも血清中のコラーゲン特異的抗体ＩｇＧ及び炎症誘発性因子ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γの含有量を顕著に減少させ、抗炎症性因子ＩＬ−１０の含有量を顕著に増加させることができる。

３．ＣＩＡマウス骨破壊に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０の影響のＭｉｃｒｏ−ＣＴ検出
図８に示すように、マウス後肢のＭｉｃｒｏ−ＣＴ検査結果から明らかであるように、正常群は、関節面が滑らかで、関節構造がはっきりと見え、ＣＩＡモデル群は、関節面が粗く、骨破壊が重度であり、投与群Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０及び陽性薬インフリキシマブ群は、骨破壊の程度が顕著に軽減された。

図９に示すように、マウス骨梁のＭｉｃｒｏ−ＣＴ結果から明らかであるように、正常群は、骨梁構造が完全であり、ＣＩＡモデル群は、正常群と比較して骨破壊が深刻であり、顕著な空洞があり、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０及び陽性薬インフリキシマブ群は、モデル群と比較して、骨破壊の程度が顕著に軽減された。

図１０に示すように、骨密度（ＢＭＤ）、骨体積／組織体積（ＢＶ／ＴＶ）、骨面積／組織体積（ＢＳ／ＴＶ）、骨梁の数（Ｔｈ．Ｎ）、骨梁の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨表面積／骨体積（ＢＳ／ＢＶ）、骨梁のパターンファクター（Ｔｂ．ｐｆ）、骨梁の分離度（Ｔｂ．ｓｐ）などの骨パラメーターを分析することにより、骨破壊に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０の緩和状況を分析した。結果から明らかであるように、正常群と比較して、モデル群は、骨密度（ＢＭＤ）、骨体積／組織体積（ＢＶ／ＴＶ）、骨面積／組織体積（ＢＳ／ＴＶ）、骨梁の数（Ｔｈ．Ｎ）、骨梁の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）などのパラメーターが顕著に低下し、骨表面積／骨体積（ＢＳ／ＢＶ）、骨梁のパターンファクター（Ｔｂ．ｐｆ）、骨梁の分離度（Ｔｂ．ｓｐ）などのパラメーターが顕著に向上し、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０群は、モデル群と比較して、骨密度（ＢＭＤ）、骨体積／組織体積（ＢＶ／ＴＶ）、骨面積／組織体積（ＢＳ／ＴＶ）、骨梁の数（Ｔｈ．Ｎ）、骨梁の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）などのパラメーターが顕著に向上し、骨表面積／骨体積（ＢＳ／ＢＶ）、骨梁のパターンファクター（Ｔｂ．ｐｆ）、骨梁の分離度（Ｔｂ．ｓｐ）などのパラメーターが顕著に低下した。

４．ＣＩＡマウス関節破壊に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０の影響のＨＥ染色観察
図１１に示すように、マウス関節のＨＥ染色結果から明らかであるように、正常群マウスでは、関節包滑膜組織が完全で、繊維膜がはっきりと見え、嚢胞腔に滲出が観察されず、滑膜関節リウマチを予防及び治療するための薬物滑膜組織には明らかな炎症細胞浸潤が観察されなかった。ＣＩＡモデル群では、重度の関節構造損傷、滑膜過形成、重度の軟骨損傷、重度の炎症性細胞浸潤が観察され、投与群Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０では、完全な関節構造、重度の滑膜過形成、関節リウマチを予防及び治療するための薬物より重度の炎症性細胞浸潤が観察された。ＰＥＧ−ＳＮ１０及びインフリキシマブでは、関節構造が完全であり、炎症性細胞浸潤が弱く、関節損傷が顕著に軽減した。

５．ＣＩＡマウスＴＮＦ−α発現量に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０の影響の免疫組織化学的観察
以前の結果は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０が標的特異的であり、ＴＮＦＲ１と特異的に結合できるが、ＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ２と結合せず、かつＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０がＴＮＦ−αとＴＮＦＲ１の結合を競合的に阻害できることを示した。これによって、ＴＮＦ−αの発現量は減少した。図１２に示すように、正常群と比較して、モデル群ＴＮＦ−αの発現量は増加し、モデル群と比較して、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０群の関節中のＴＮＦ−αの発現量は減少した。

６．関節中の破骨細胞に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０の影響のＴＲＡＰ染色観察
破骨細胞は、骨組織成分の一種であり、骨吸収の機能を果たす。破骨細胞は、骨芽細胞に機能的に対応している。酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）は、破骨細胞の特異的マーカー酵素であり、その発現と分泌は破骨細胞の分化と機能に密接に関連している。図１３に示すように、正常群と比較して、ＣＩＡモデル群マウスでは、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼが顕著に増加し、モデル群と比較して、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０が酒石酸抵抗性酸ホスファターゼの含有量を減少させ、破骨細胞の数を減少させることができ、これにより、骨組織に対する侵食が減少する。

７．ＣＩＡマウスＴｒｅｇ細胞中のＦｏｘｐ３の発現量に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０の影響
Ｔｒｅｇ細胞は、特殊な免疫調節細胞であり、免疫不応答性及び免疫抑制性の２つの特性を有する。細胞間での直接接触及び阻害性サイトカインの分泌などによりＢ細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞の活性及び機能を阻害することができ、自己免疫疾患の予防に非常に重要である。

証拠から分かるように、ＲＡ患者体内のＴｒｅｇ細胞の数が変化し、これは、Ｔｒｅｇ細胞の異常がＲＡの発症と密接に関連していることを示している。Ｆｏｘｐ３は、Ｔｒｅｇ細胞中で特異に発現し、Ｔｒｅｇの増殖及び機能に重要な役割を果たすため、Ｔｒｅｇのバイオマーカーとして適用できる。図１４、１５に示すように、モデル群と比較して、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０及びインフリキシマブ群は、いずれもＦｘｏｐ３の発現量が顕著に向上し、即ち、Ｔｒｅｇ細胞の数が増加し、免疫抑制作用が顕著に強くなる。これによって、関節リウマチの発症及び発展は阻害される。

８．ＣＩＡマウス脾臓中のＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７の発現量に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０の影響
Ｔｈ１は、主にＩＦＮ−γを分泌し、細胞性免疫応答を媒介し、炎症性因子の生成及びマクロファージの活性化を誘発し、主に自己免疫疾患の発生を誘発する。Ｔｈ２は、主にＩＬ−４を分泌し、液性免疫を媒介し、単球を阻害し、炎症性サイトカインの放出を促進する。また、Ｔｈ１／Ｔｈ２比の不均衡は、ＲＡの発症メカニズムに重要な役割を果たす。

研究から明らかであるように、Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ−１７を高度に分泌し、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αなどが分泌されるようにＦＬＳを刺激することにより、ＲＡの骨破壊及び組織の炎症性損傷へのＮＦ−κＢ受容体活性化因子リガンドの関与などを協働誘発する。脾臓細胞中のヘルパーＴ細胞の発現を測定することによりその作用を観察した。図１６、１７に示すように、モデル群と比較して、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０及びインフリキシマブ群では、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７の発現量が顕著に減少し、ＩＬ−４の発現量が増加し、つまり、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７の変化を調節することにより、炎症性因子の発現及び放出を阻害し、骨破壊を軽減する可能性がある。

以上の結果は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、II型コラーゲン誘発マウス関節リウマチ動物モデルを効果的に治療できることを示している。

以上本発明の好適な実施例を具体的に説明したが、本発明は、これらの実施例に限定されない。当業者は、本発明の趣旨から逸脱しない範囲で、多種の同等の変形又は置換を行うことができ、これらの同等の変形又は置換は、全て本発明の特許請求の範囲に含まれる。

Claims

関節リウマチを予防及び治療するための薬物の製造における選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の使用であって、
前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のコーディング遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなり、前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、使用。
前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の分子量は１２５０．２９ダルトンである、請求項１に記載の使用。
前記関節リウマチを予防及び治療するための薬物は、ＴＮＦＲ１を選択的に拮抗する、請求項１に記載の使用。
前記関節リウマチを予防及び治療するための薬物は、選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を唯一の活性成分とするか、又は選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を含む医薬組成物である、請求項１に記載の使用。
関節リウマチを予防及び治療するための薬物の製造におけるｍＰＥＧ２０００によって修飾された選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の使用であって、
前記ｍＰＥＧ２０００のカルボキシル基は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のペプチド鎖のＮ端にあるアスパラギン酸の遊離アミノ基に共有結合し、
前記Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、使用。
前記ｍＰＥＧ２０００の平均分子量は２０００ダルトンである、請求項５に記載の使用。
前記関節リウマチを予防及び治療するための薬物は、ＰＥＧ−ＳＮ１０を唯一の活性成分とするか、又はＰＥＧ−ＳＮ１０を含む医薬組成物である、請求項５に記載の使用。
前記医薬組成物及び薬剤学的に許容される添加剤を用いて医薬製剤を製造する、請求項４又は７に記載の使用。
前記医薬製剤は、錠剤、顆粒剤、分散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、滴丸剤、注射剤、粉末注射剤又はエアロゾル剤である、請求項８に記載の使用。