JP2020124126A

JP2020124126A - 乳幼児用栄養組成物

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Publication number: JP2020124126A
Application number: JP2019016957A
Authority: JP
Inventors: 博文福留; Hirofumi Fukudome; 史彦酒井; Fumihiko Sakai
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2019-02-01
Publication date: 2020-08-20
Anticipated expiration: 2039-02-01
Also published as: JP7338978B2

Abstract

【課題】本発明はタンパク質量を母乳に近い２．４ｇ／１００ｋｃａｌ未満に収めつつ、シアル酸量を母乳レベルまで増加させた新たな乳幼児用栄養組成物、及びその製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明はシアル酸が２５０ｍｇ／１００ｇ固形以上であり、かつタンパク質量が２．４ｇ／１００ｋｃａｌ未満であることを特徴とする乳幼児用栄養組成物を提供する。さらに、上記に加えガラクト−Ｎ−ビオースが９０ｍｇ／１００ｇ固形以上である乳幼児用栄養組成物を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、乳幼児用栄養組成物に関する。

近年、乳幼児用栄養組成物に含まれる様々な成分は、可能な限り母乳の成分に近づけることが重要視されている。食品の国際規格を定めるコーデックス委員会（ＣＯＤＥＸ）、欧州食品安全機関（ＥＦＳＡ）、および厚生労働省では、乳幼児用調製粉乳に含まれるタンパク質、脂質、ビタミン、ミネラルなどの含量について、母乳に近似したある一定の規格範囲量を示している。

タンパク質については、以前は乳幼児用調製粉乳のタンパク質が母乳に比べて消化吸収性が劣る（低い利用効率）ことが考慮され、乳幼児用調製粉乳のタンパク質量は母乳よりも高めに設定されていた。しかし、乳児期の過剰なタンパク質摂取による生活習慣病発症リスクの増加が危惧されるようになり、現在では乳幼児用調製粉乳中のタンパク質量を減量する傾向にある。例えば、ＣＯＤＥＸでは乳幼児用調製粉乳中のタンパク質量を１．８〜３．０ｇ／１００ｋｃａｌ（非特許文献１）、ＥＦＳＡでは１．８〜２．５ｇ／１００ｋｃａｌ（非特許文献２）の規格範囲を示している。現在日本で許可を受けている乳幼児用調製粉乳の製品では、２．４ｇ／１００ｋｃａｌ未満である。

母乳中には乳児の健全な発育・生育を促す成分が豊富に含まれており、シアル酸はその一成分として注目されてきた。シアル酸は負に荷電した９炭糖の一つであり、母乳中ではオリゴ糖、糖タンパク質、糖脂質の分子形態で存在する。母乳中のシアル酸は、乳幼児の感染防御効果（特許文献１）、細菌毒素の中和効果（特許文献２）、ミネラル吸収促進作用（特許文献３）、脳機能発達効果（非特許文献３）、などの様々な機能性を担っている。しかし、牛乳はシアル酸量が少ないため、牛乳由来の乳素材を原材料とする乳幼児用栄養組成物では母乳に比べてシアル酸含量が非常に少なくなる。
具体的には、母乳中のシアル酸量は、７１４ｍｇ±６４ｍｇ／Ｌ（平均±標準誤差）と報告されており、これは、母乳の平均的な固形率が１２．１％として５９０ｍｇ／１００ｇ固形に相当する（非特許文献４）。井戸田らによる日本国内の母乳の一般成分（非特許文献５）、およびシアル酸含量（非特許文献６）の調査結果から算出した母乳の固形１００ｇあたりの総シアル酸量について、表１に示した。この結果から、母乳のシアル酸量は泌乳期の経過に伴って減少するが、泌乳期１２０日以降のシアル酸量は約２６０ｍｇ／１００ｇ固形で一定となる傾向が認められる。また、表１について、非乳期３〜４８２日までの総シアル酸濃度の加重平均値は、約３３０ｍｇ／１００ｇ固形である。以上から、乳幼児用栄養組成物のシアル酸量を母乳に近似させるには、２６０ｍｇ／１００ｇ固形以上が必要であり、好ましくは日本人の母乳の平均的なシアル酸量である３３０ｍｇ／１００ｇ固形以上が望ましく、さらに好ましくは非特許文献４に記載されている母乳の平均的なシアル酸量である５９０ｍｇ／１００ｇ固形以上が望ましいと考えられる。

一方、一般的な乳幼児用調製粉乳のシアル酸量は１９３ｍｇ／１００ｇ固形であり（非特許文献７）、前記の日本人の母乳中のシアル酸量の低値である２６０ｍｇ／１００ｇ固形からは６７ｍｇ／１００ｇ固形が不足し、母乳中シアル酸量の平均値である５９０ｍｇ／１００ｇ固形からは３９７ｍｇ／１００ｇ固形も不足している。牛乳中のシアル酸の９０％以上はタンパク質に結合した形態で存在するため、例えばＥＦＳＡ規格に従って乳幼児用調製粉乳中のタンパク質量を低下させると、それに伴ってシアル酸量も減少し、母乳と乳幼児用調製粉乳のシアル酸量はますます乖離してしまうという問題があった。

この問題に対して、遺伝子組み換えした微生物を利用して調製したシアル酸やシアル酸含有オリゴ糖を利用することが報告されているが（特許文献４）、遺伝子組換え技術を利用して調製したシアル酸を乳幼児用栄養組成物に使用することに対しては各国の法規制への適合状況や、遺伝子組換え技術そのものに対する消費者の受容性などの観点において、未だ産業上の利用において忌避感が持たれている。

ガラクト−Ｎ−ビオース（ＧＮＢ）は、オリゴ糖のひとつであり、最近プレバイオティクスとして注目されている。ビフィズス菌は消化管上皮細胞から産生されるムチンのコアI型のＯ結合型糖鎖ＧＮＢを切り出す菌体外酵素をもち、ムチンからＧＮＢを遊離させる（非特許文献８）。遊離したＧＮＢは特異的なＡＢＣ型のトランスポーターにより菌体内に取りこまれ、菌体内のＧＮＢを加リン酸分解するＧＮＢ／ＬＮＢホスホリラーゼにより代謝することで（非特許文献９）、ＧＮＢをエネルギー源として利用すると考えられている。この代謝経路はビフィズス菌以外の微生物からはほとんど見つかっておらず（非特許文献１０）、ビフィズス菌に選択的なオリゴ糖である。従って、ＧＮＢは乳児に有用なビフィズス菌を選択的に増やすオリゴ糖である。

一般的な乳幼児用調製粉乳中のＧＮＢ量の報告は見当たらないが、乳中ではＧＮＢはグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）に結合して存在する。ＧＭＰは、一般的な乳幼児用調製粉乳中のタンパク質の１４％であると報告されている（非特許文献１１）。また、ＧＭＰにはGalNAc-O-R、Galβ1-3GalNAc-O-R、Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc-O-R、Galβ1-3 (NeuAcα2-6) GalNAc-O-R、およびNeu5Acα2-3Galβ1-3 (Neu5Acα2-6) GalNAc-O-Rという５種類の糖鎖が結合するが、その結合割合（モル比）はそれぞれ０．８、６．３、１８．４、１８．５、および５６％と報告されている（非特許文献１２）。さらに、ＧＭＰ中のシアル酸は６％と報告されており、これらの報告を参考にＧＭＰ中のＧＮＢ量は５％と試算された。
これらの結果から一般的な乳幼児用調製粉乳中のＧＮＢ量は８２ｍｇ／１００ｇ固形と考えられた。これまでにＧＮＢを強化した乳幼児用調製粉乳は上市されていない。また、遺伝子組み換えした微生物を利用した製造法についても報告されていない。さらに今後報告があった場合でも、遺伝子組換え技術を利用して調製したＧＮＢを乳幼児用栄養組成物に使用することに対しては各国の法規制への適合状況や、遺伝子組換え技術そのものに対する消費者の受容性などの観点において、未だ産業上の利用において忌避感がもたれている。

特許第２５１４３７５号公報特許第２８２１７７０号公報特許第３３７２４９９号公報特許第４３１８５４９号公報特許第２６７３８２８号公報

STANDARD FOR INFANT FORMULA AND FORMULAS FOR SPECIAL MEDICAL PURPOSES INTENDED FOR INFANTS, CODEX STAN 72-1981, Formerly CAC/RS 72-1972. Adopted as a worldwide Standard in 1981. Amendment: 1983, 1985, 1987, 2011, 2015 and 2016. Revision: 2007. COMMISSION DELEGATED REGULATION (EU) 2016/127 of 25 September 2015 Sakai F et al., Journal of Applied Glycoscience, 53(4), 249-254, 2006 Qiao Y et al., The relationship between dietary vitamin A intake and the levels of sialic acid in the breast milk of lactating women. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2013;59(4):347-51. 井戸田正ほか：日本小児栄養消化器病学会雑誌、5:145-158, 1991. 井戸田正ほか：日本栄養・食糧学会誌、47：357-362, 1994. 乳児用調製粉乳「すこやかＭ１」（雪印ビーンスターク株式会社）缶表示値 Fujita K et al., Identification and molecular cloning of a novel glycoside hydrolase family of core 1 type O-glycan-specific endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase from Bifidobacterium longum. J Biol Chem. 2005; 280(45): 37415-22. Nakajima M et al., Identification of Lacto-N-Biose I Phosphorylase from Vibrio vulnificus CMCP6. Appl Environ Microbiol. 2008; 74(20): 6333-6337. 日高將文ほか：ビフィズス菌のヒトミルクオリゴ糖分解に関わるホスホリラーゼの結晶構造, PFNEWS、27:18-21, 2009. Bruck WM et al., Effects of bovine alpha-lactalbumin and casein glycomacropeptide-enriched infant formulae on faecal microbiota in healthy term infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2006; 43(5): 673-9. Saito T, & Itoh T et al., Variations and distributions of O-glycosidically linked sugar chains in bovine kappa-casein. J Dairy Sci. 2006; 43(5): 673-9.

本発明は上記背景技術に記載した課題を鑑み、タンパク質量を母乳に近い２．４ｇ／１００ｋｃａｌ未満に収めつつ、シアル酸量を母乳レベルまで増加させた新たな乳幼児用栄養組成物、及びその製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために、ＧＭＰに着目し、これを酵素処理及び膜処理をすることで特定範囲のシアル酸含量及びタンパク質含量のシアリル糖ペプチドを調製し配合することでタンパク質量及びシアル酸量を母乳に近づけた新たな乳幼児用調製粉乳を調製することができることを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を含むものである。
（１）シアル酸が２５０ｍｇ／１００ｇ固形以上であり、かつタンパク質量が２．４ｇ／１００ｋｃａｌ未満であることを特徴とする乳幼児用栄養組成物。
（２）さらに、ガラクト−Ｎ−ビオースが９０ｍｇ／１００ｇ固形以上である（１）に記載の乳幼児用栄養組成物。
（３）乳幼児用栄養組成物が乳幼児用調整粉乳である（1）又は（２）に記載の乳幼児用栄養組成物。
（４）シアリル糖ペプチドが配合された（１）〜（３）のいずれかに記載の乳幼児用栄養組成物。
（５）シアリル糖ペプチドが、シアル酸を８重量％以上含有し、ガラクト−Ｎ−ビオースを４重量％以上含有し、タンパク質量が８６重量％以下である（１）〜（４）のいずれかに記載の乳幼児用栄養組成物。
（６）前記シアリル糖ペプチドの分子量が７００以上３，０００以下である（１）〜（５）のいずれかに記載の乳幼児用栄養組成物。
（７）シアリル糖ペプチドは、スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドであって、前記糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、前記糖鎖の構成糖がシアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなる（１）〜（６）のいずれかに記載の乳幼児用栄養組成物。
（８）シアリル糖ペプチドを添加する工程を含む乳幼児用栄養組成物の製造方法であって、シアリル糖ペプチドが以下の構成を有することを特徴とする乳幼児用栄養組成物の製造方法。
スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドであって、
前記糖ペプチドの分子量が７００以上３，０００以下であり、
前記糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、
前記糖鎖の構成糖がシアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなり
前記シアル酸を８重量％以上含有し、
前記ガラクト-Ｎ-ビオースを４重量％以上含有し、
前記ペプチド鎖のタンパク質量が８６重量％以下である

本発明は、タンパク質量を母乳に近い２．４ｇ／１００ｋｃａｌ未満に収めつつ、シアル酸量を母乳レベルまで増加させた新たな乳幼児用栄養組成物、及びその製造方法を提供することができる。また、さらにＧＮＢ量についても従来の乳幼児用栄養組成物より増加した新たな乳幼児用栄養組成物、及びその製造方法を提供することができる。

（乳幼児用栄養組成物）
本発明の乳幼児用栄養組成物は、乳児用調製粉乳および調製液状乳、幼児用調製粉乳（フォローアップミルクおよびグローイングアップミルク）、低出生体重児用調製粉乳、牛乳アレルギー疾患用アレルゲン除去食品および乳糖不耐症用乳糖除去食品などであり、タンパク質、脂肪、糖質、ビタミン類及びミネラル類を主成分として構成されるものである。その他、さらに乳幼児用栄養組成物に配合することが可能な成分を含有しても良い。
本発明の乳幼児用栄養組成物は、シアル酸が２５０ｍｇ／１００ｇ固形以上、かつタンパク質量が２．４ｇ／１００ｋｃａｌ未満であることを特徴とするものである。シアル酸量が、２５０ｍｇ／１００ｇ固形未満では、日本人の母乳中のシアル酸量の低値より低くなるため栄養価に乏しく、タンパク質量が２．４ｇ／１００ｋｃａｌ以上では、乳児期の過剰なタンパク質摂取による生活習慣病発症リスクの増加の懸念から認可がされないため適当ではない。
本発明の乳幼児用栄養組成物中のシアル酸量は、さらに好ましくは３３０ｍｇ/１００ｇ固形以上であり、よりいっそう好ましくは５９０ｍｇ/１００ｇ固形以上である。
また、本発明の乳幼児用栄養組成物は、さらにＧＮＢが一般的な乳幼児調整粉乳よりも多く含まれていることが望ましく、好ましくは９０ｍｇ／１００ｇ固形以上であり、さらに好ましくは１００ｍｇ／１００ｇ固形以上であり、よりいっそう好ましくは１１９ｍｇ／１００ｇ固形以上である。
シアル酸及びタンパク質以外の成分の含量は、食品の国際規格を定めるコーデックス委員会（ＣＯＤＥＸ）、欧州食品安全機関（ＥＦＳＡ）、又は厚生労働省等で定める母乳に近似したある一定の規格範囲量となるよう調整すればよい。

（乳幼児用栄養組成物の製造方法）
本発明の乳幼児用栄養組成物の製造方法について、乳幼児用調製粉乳を例に以下説明する。まず、ＧＭＰを含む組成物を酵素処理及び膜処理をすることで特定範囲のシアル酸含量、ＧＮＢ含量、及びタンパク質含量のシアリル糖ペプチドを調製する。これを一般的な乳幼児用調整粉乳に配合することでタンパク質量及びシアル酸量を母乳に近づけた新たな乳幼児用調製粉乳を調製することができる。
すなわち、タンパク質源、糖質源、および前記のようにして得られたシアリル糖ペプチドをタンク内で水に溶解した。次に脂肪源を混合し、均質化後、濃縮し、噴霧乾燥により粉末化する。ビタミンやミネラルなどの微量成分は乳糖と混合後、噴霧乾燥した粉末と粉混合し本発明の乳幼児用調製粉乳を得ることができる。
上記ＧＭＰの酵素処理及び膜処理により、タンパク質含量をＧＭＰより低くしつつ、シアル酸含量及びＧＮＢ含量をＧＭＰより増加させることができる。タンパク質含量の低下とシアル酸量及びＧＮＢの増加とのバランスは、酵素処理の条件（酵素の種類、温度、時間等）や膜処理の条件（膜の分画分子量の違い等）により所望のシアリル糖ペプチドが得られるように適宜調整することができる。
一例としては、ＧＭＰを含む組成物をプロテアーゼまたは／およびペプチダーゼで処理した後に、酵素分解液を分画分子量５００から１０００の限外ろ過膜またはナノフィルトレーション膜で濃縮することで、シアル酸含量が８％以上、ＧＮＢ含量が４％以上、タンパク質量が８６％以下となるシアリル糖ペプチドを調製し、このシアリル糖ペプチドを一般的な乳幼児用調製粉乳（シアル酸：１９３ｍｇ／１００ｇ固形、ＧＮＢ：８２ｍｇ／１００ｇ、固形タンパク質：２．２８ｇ／１００ｋｃａｌ）に配合することで、タンパク質量を母乳に近い量にしつつ、シアル酸および／又はＧＮＢを強化した乳幼児用調製粉乳（シアル酸：２５０ｍｇ／１００ｇ固形以上、ＧＮＢ：９０ｍｇ／１００ｇ固形以上、タンパク質：２．４ｇ／１００ｋｃａｌ未満）を調製することができる。
なお、明細書中、シアリル糖ペプチドとは、シアル酸を糖鎖の構成として含む糖ペプチドをいう。

（ＧＭＰの製造方法）
ＧＭＰを含む組成物は、特許第２６７３８２８号などに記載の方法により調製することができる。すなわち、ＧＭＰを含有する乳原料物質、例えばチーズホエイ、ホエイタンパク質濃縮物、除タンパク質チーズホエイ等を、まずｐＨ４未満に調整した後、分画分子量１０，０００〜５０，０００の膜を用い、限外濾過処理をして透過液を得、好ましくは再度、該透過膜をｐＨ４以上に調整した後、分画分子量５０，０００以下の膜を用いて脱塩し濃縮することによりＧＭＰを調整する方法が挙げられる。また、乳質ホエイをｐＨ６．０以上に調整し４０〜７９℃で加熱処理したものを膜処理に付して乳清たんぱく質を除去し、ＧＭＰを濃縮液側に回収し、得られた濃縮液をｐＨ５．５以下にした後、再び膜処理に供してＧＭＰを透過液側に回収することによりＧＭＰ含有量の高い組成物を調製する方法を挙げることができる。
得られた組成物中のＧＭＰ量は、例えば、特許第３３７２４９９号の実施例に示されるようなウレア−ＳＤＳ電気泳動法により分析することができる。

（シアリル糖ペプチドの製造方法）
ＧＭＰをエンド型プロテアーゼまたはエキソ型プロテアーゼで処理する工程と、前記工程で得られた処理物を分画分子量５００以上３，０００以下の限外ろ過に供する処理工程を経ることにより本発明のシアリル糖ペプチド組成物を製造することができる。
糖ペプチド製造に用いるプロテアーゼの種類は、ペプチド結合を加水分解し、上記（シアリル糖ペプチド組成物）で記載したような分子量と糖鎖を有する糖ペプチドを得ることができるものであれば特に限定されるものではなく、１種類、又は複数のエンド型プロテアーゼ、エキソ型プロテアーゼを用いることができる。好ましくは、食品や医薬品の製造に使用可能な酵素がよく、アクチナーゼＥ（科研ファルマ）、アクチナーゼＡＳ（科研ファルマ）、ヌクレイシン（ＨＢＩ）、オリエンターゼＡＹ（ＨＢＩ）、スミチームＦＰ（新日本化学工業）、スミチームＳＰＰ−Ｇ（新日本化学工業）、プロテアーゼＡ（天野エンザイム）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム）、アルカラーゼ（ノボザイム）、フレーバザイム（ノボザイム）などを単独、あるいは組み合わせて使用することができる。
このようにして得られるシアリル糖ペプチドはどのようなものでも用いることができるが、以下の特徴を有するものを用いることが好ましい。
スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドであって、
（１）糖ペプチドの分子量が７００以上３，０００以下であり、
（２）糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、
（３）糖鎖の構成糖がシアル酸、N-アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなり
（４）シアル酸を８重量％以上含有し、
（５）ＧＮＢを４重量％以上含有し、
（６）タンパク質量が８６重量％以下である
シアリル糖ペプチド。

（タンパク質源）
タンパク質源としては、カゼイン、乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、乳清タンパク質分離物（ＷＰＩ）、αs-カゼイン、β−カゼイン、α−ラクトアルブミン、及びβ−ラクトグロブリンなどの乳タンパク質分画物、あるいは大豆タンパク質や小麦タンパク質などの植物タンパク質、さらにはこれらを種々の分解度まで酵素的に分解したペプチド、あるいはアミノ酸などを用いることができる。

（脂肪源）
脂肪源としては、乳脂肪、ラード、牛脂、又はカツオ油、マグロ油などを含む魚油などの動物性油脂、あるいは大豆油、菜種油、コーン油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、サフラワー油、エゴマ油、アマニ油、月見草油、ＭＣＴ、又は綿実油などの植物性油脂、さらにはこれらの分別油、水添油、エステル交換油などを用いることができる。

（糖質源）
糖質源としては、乳糖、麦芽糖、ブドウ糖、ショ糖、デキストリン、ガラクトシルラクトース、フラクトオリゴ糖、ラクチュロースなどのオリゴ糖、人工甘味料、可溶性多糖類、又は澱粉などを用いることができる。

（ビタミン及びミネラル源）
ビタミン及びミネラル源としては、『乳幼児食品を含む特殊用途食品のＣＯＤＥＸ規格及び関連衛生作業規則、CAC/VOL. IX−第１版及びSupplement 1, 2, 3, 4』（日本国際酪農連盟発行、１９９３年）、『1993年版指定品目食品添加物便覧（改訂第３１版）（食品と科学社発行、１９９３年）』、又は『届け出制食品添加物・食品素材天然物便覧（第１２版）』（食品と科学社発行、１９９２年）に記載のミネラル及びビタミン類のうち乳幼児食品に使用可能なものを用いることができる。
ビタミン類としては、例えばビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ類、葉酸、パントテン酸、β−カロチン、ニコチン酸アミドなどを挙げることができ、又、ミネラル類としてはカルシウム、マグネシウム、鉄、銅、亜鉛、ヨウ素、マンガン、セレンなどが挙げられる。

（シアル酸含量の測定方法）
５０μＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に、シアリル糖ペプチド濃度が２５０μｇ／ｍＬ、シアリダーゼ（コスモバイオ）の濃度が０．２Ｕ／ｍＬとなるように溶解する。溶液を３７℃で２４時間インキュベートした後に超純水で２〜１０倍に希釈し、遊離したシアル酸の濃度をＨＰＬＣで分析する。
シアル酸の測定は、例えば、ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１カラムを装着したＤＩＯＮＥＸＩＣＳ−５０００ＤＰシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)で行うことができる。検出器は電気化学検出器(パルスドアンペロメトリックモード)を用い、移動相には超純水（Ａ液）、２００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液（Ｂ液）、および６００ｍＭ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液（Ｃ液）の３液を流速１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。開始から７分間Ｂ液４５％およびＣ液１０％で通液し、その後１０分までにＢ液を３７．５％まで直線的に減少、Ｃ液を２５％まで直線的に増加させる。１０分から２０分にかけてはＢ液３７．５％、Ｃ液２５％で通液し、２０．１分から２５分はＢ液４５％およびＣ液１０％で通液する。濃度既知の標準品を用いて作成した検量線から試料中のシアル酸量を算出することができる。

（ＧＮＢ含量の測定方法）
５０μＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に、シアリル糖ペプチド濃度が２５０μｇ／ｍＬ、シアリダーゼ（コスモバイオ）の濃度が０．２Ｕ／ｍＬ、O-グリカナーゼ（Prozyme）の濃度が０．１２５Ｕ／ｍＬとなるように、酵素および基質を溶解する。
溶液をサーマルサイクラー（Ｔａｋａｒａ）により３７℃で２４時間インキュベートした後、氷冷により反応を停止した。反応液を超純水で２〜１０倍に希釈した後、遊離したシアル酸とＧＮＢの濃度をＨＰＬＣで分析する。
ＧＮＢの測定は、ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１カラムを装着したＤＩＯＮＥＸＩＣＳ−５０００ＤＰシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)で行うことができる。検出器は電気化学検出器(パルスドアンペロメトリックモード)を用い、移動相には超純水（Ａ液）、２００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液（Ｂ液）、および６００ｍＭ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液（Ｃ液）の３液を流速１ｍＬ／ｍｉｎで通液する。開始から１０分間Ｂ液５０％で溶出した後、２５分までにＣ液の割合を０％から１００％まで直線的に増加させ、３０分までＣ液１００％で溶出する。次に３０．１分でＢ液５０％とし、その後４５分までＢ液５０％で溶出する。濃度既知の標準品を用いて作成した検量線から試料中のＧＮＢ量を算出する。

（アミノ酸分析の方法）
アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、セリン、スレオニンおよびアスパラギン酸の１５種類のアミノ酸は、塩酸で加水分解後、ＪＬＣ−５００／Ｖ全自動高速アミノ酸分析機により分析する。シスチンおよびメチオニンは、過ギ酸溶液により加水分解後、ＪＬＣ−５００／Ｖ全自動高速アミノ酸分析機により分析する。トリプトファンは試料溶液に水酸化バリウム八水和物およびチオジエチレングリコールを加え、加熱した後、塩酸で加水分解し、ＨＰＬＣにより分析する。

（タンパク質量の算出）
ＧＭＰおよびシアリル糖ペプチドのタンパク質量は、アミノ酸分析から得られた総アミノ酸量の数値をタンパク質量とする。

以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実施例１〕本発明のシアリル糖ペプチド組成物の調製方法
１．ＧＭＰの製造方法
ホエイタンパク質濃縮物（サンラクトＮ−２、太陽化学製）１ｋｇを５０℃の水５０Ｌに溶解し、濃塩酸によりｐＨ３．５に調整した。これを、分画分子量２０，０００の限外ろ過膜（ＧＲ６１ＰＰ、ＤＤＳ製）を用い、５０℃、圧力０．４ＭＰａ、平均透過液流速５２．４Ｌ／ｍ^２・ｈにて限外ろ過を行なった。透過液量が４０Ｌに達した時点で濃縮液に５０℃の水４０Ｌを加え、連続して限外ろ過を行なった。以上の様にして連続運転を行い、透過液を１６０Ｌ得た。
得られた透過液に２５％苛性ソーダを加え、ｐＨ７．０とし、再度同じ条件、同じ限外ろ過膜で濃縮液が５Ｌになるまで限外ろ過を行い、脱塩濃縮した。続いて５０℃の水を加え、濃縮液量を常に１０Ｌに保ちながら、これまでと同じ条件、同じ限外ろ過膜でダイアフィルトレーションを行い、さらに脱塩した。このダイアフィルトレーションにより透過液量が８０Ｌに達した時点で濃縮液に水を加えるのをやめ、濃縮液量が２Ｌになるまで限外ろ過にて濃縮し、この濃縮液を乾燥し、ＧＭＰ５４ｇを得た。

２．シアリル糖ペプチド組成物の製造方法
上記１．で得られたＧＭＰを用い、３０ｋｇの５％ＧＭＰ溶液を調製した。これをアルカラーゼ（ノボザイム社製）およびフレーバザイム（ノボザイム社製）を添加して５０℃で４時間反応させた。これを、分画分子量１，０００の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行なった。濃縮液に水を加えて連続して限外ろ過を行なうことでダイアフィルトレーションを行ない、５倍の加水濃縮を行なった後に濃縮液画分を得た。この濃縮液を乾燥し、シアリル糖ペプチド組成物Ａを３００ｇ得た。さらに、加水濃縮を１０倍まで行なうことで得られたものをシアリル糖ペプチド組成物Ｂ（３００ｇ）とした。

３．シアル酸量、ＧＮＢ量、およびアミノ酸組成の分析
調製したＧＭＰおよびシアリル糖ペプチド組成物中のシアル酸量およびＧＮＢ量は、以下に記載した方法で測定した。
（１）すなわち、５０μＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に、シアリル糖ペプチド濃度が２５０μｇ／ｍＬ、シアリダーゼ（コスモバイオ）の濃度が０．２Ｕ／ｍＬ、O-グリカナーゼ（Prozyme）の濃度が０．１２５Ｕ／ｍＬとなるように、酵素および基質を溶解した。溶液をサーマルサイクラー（Ｔａｋａｒａ）により３７℃で２４時間インキュベートした後、氷冷により反応を停止した。反応液を超純水で２〜１０倍に希釈した後、遊離したシアル酸とＧＮＢの濃度をＨＰＬＣで分析した。ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１カラムを装着したＤＩＯＮＥＸＩＣＳ−５０００ＤＰシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)で行った。検出器は電気化学検出器(パルスドアンペロメトリックモード)を用い、移動相には超純水（Ａ液）、２００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液（Ｂ液）、および６００ｍＭ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液（Ｃ液）の３液を流速１ｍＬ／ｍｉｎで通液した。
（２）シアル酸の測定は、開始から７分間Ｂ液４５％およびＣ液１０％で通液し、その後１０分までにＢ液を３７．５％まで直線的に減少、Ｃ液を２５％まで直線的に増加させた。１０分から２０分にかけてはＢ液３７．５％、Ｃ液２５％で通液し、２０．１分から２５分はＢ液４５％およびＣ液１０％で通液した。濃度既知の標準品を用いて作成した検量線から試料中のシアル酸量を算出した。シアル酸量は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）量として算出した。
（３）ＧＮＢの測定は、開始から１０分間Ｂ液５０％で溶出した後、２５分までにＣ液の割合を０％から１００％まで直線的に増加させ、３０分までＣ液１００％で溶出した。次に３０．１分でＢ液５０％とし、その後４５分までＢ液５０％で溶出した。濃度既知の標準品を用いて作成した検量線から試料中のＧＮＢ量を算出した。
（４）調製したＧＭＰおよびシアリル糖ペプチド組成物中のアミノ酸組成は、一般的な食品成分中のアミノ酸組成分析法により分析した。総アミノ酸量をタンパク質量とした。
（５）分析結果
シアリル糖ペプチド組成物Ａは、シアル酸量が２０重量％、ＧＮＢ量が１１重量％、タンパク質量は６７重量％であり、シアリル糖ペプチド組成物Ｂは、シアル酸量が３６重量％、ＧＮＢ量が１９．８重量％、タンパク質量は４２重量％であった（表２）。また、調製したＧＭＰはシアル酸量が６．０重量％、ＧＮＢ量が５．０重量％、タンパク質量は８４重量％であった（表２）。
ＬＣ／ＭＳ分析で得られたＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルから、シアリル糖ペプチド組成物に含まれる糖ペプチドの糖鎖構造を推定した。検出した多くの糖ペプチドが、シアル酸を２分子結合したNeu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcの糖鎖構造（Glycan type 3, 4, 5, 6, 7）を有していたが、シアル酸が１分子であるNeu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc（Glycan type 1）やGalβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAc（Glycan type 2）も検出された。さらに、シアル酸のＯ−アセチル体であるＮ，Ｏ−ジアセチルノイラミン酸（O-Ac-Neu5Ac, Glycan type 4）、およびＮ，Ｏ，Ｏ−トリアセチルノイラミン酸（O- diAc-Neu5Ac, Glycan type 5）も検出された。また、一つのペプチド鎖に2本の糖鎖が結合した糖ペプチド（Glycan type 6, 7）も検出された。すなわち、検出したいずれの糖ペプチドもシアル酸を含む糖鎖が結合したペプチドであり、糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、糖鎖の構成糖がシアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなるものであった。また、ＭＳ／ＭＳスペクトル解析から検出したペプチド鎖の分子量は、７４５から２９２８の範囲であった。

〔実施例２〕シアリル糖ペプチド配合乳幼児用調製粉乳の調製
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、および実施例１で調製したシアリル糖ペプチド組成物Ａ３４０ｇを水５００ｋｇに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを粉混合し、最終的に乳幼児用調製粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳のシアル酸量は、２５０ｍｇ／１００g固形であり、ＧＮＢ量は１１４ｍｇ／１００ｇ固形以上、タンパク質量は２．２９ｇ／１００ｋｃａｌであった。

〔実施例３〕シアリル糖ペプチド配合乳幼児用調製粉乳の調製
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、および実施例１で調製したシアリル糖ペプチド組成物Ｂ１９０ｇを水５００ｋｇに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを粉混合し、最終的に乳幼児用調製粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳のシアル酸量は、２５０ｍｇ／１００ｇ固形であり、ＧＮＢ量は１１４ｍｇ／１００ｇ固形以上、タンパク質量は２．２７ｇ／１００ｋｃａｌであった。

〔実施例４〕シアリル糖ペプチド配合乳幼児用調製粉乳の調製
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、および実施例１で調製したシアリル糖ペプチド組成物Ｂ１１００ｇを水５００kgに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを混合し、最終的に乳幼児用調製粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳のシアル酸量は、５９０ｍｇ／１００ｇ固形であり、ＧＮＢ量は３００ｍｇ／１００ｇ固形以上、タンパク質量は２．３５ｇ/１００ｋｃａｌであった。

〔参考例１〕ＧＭＰ配合乳幼児用調製粉乳の調製
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、およびＧＭＰ１１２０ｇを水５００kgに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを粉混合し、最終的に乳幼児用調製粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳のシアル酸量は、２５０ｍｇ／１００ｇ固形であり、ＧＮＢ量は１２９ｍｇ／１００ｇ固形以上、タンパク質量は２．４１ｇ/１００ｋｃａｌであった。

〔参考例２〕ＧＭＰ配合乳幼児用調製粉乳の調製
ホエイ粉５２．７ｋｇ、脱脂乳２３９ｋｇ、およびＧＭＰ６６２０ｇを水５００kgに溶解し、この溶液に植物油２３．９ｋｇを混合し、均質化した。得られた溶液を殺菌し、定法により濃縮、乾燥して粉乳９９ｋｇを得た。粉乳とビタミンとミネラル成分１ｋｇを粉混合し、最終的に乳幼児用調製粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳のシアル酸量は、５９０ｍｇ／１００ｇ固形であり、ＧＮＢ量は４１３ｍｇ／１００ｇ固形以上、タンパク質量は３．３５ｇ/１００ｋｃａｌであった。

Claims

シアル酸が２５０ｍｇ／１００ｇ固形以上であり、かつタンパク質量が２．４ｇ／１００ｋｃａｌ未満であることを特徴とする乳幼児用栄養組成物。
さらに、ガラクト−Ｎ−ビオースが９０ｍｇ／１００ｇ固形以上である請求項１に記載の乳幼児用栄養組成物。
乳幼児用栄養組成物が乳幼児用調整粉乳である請求項1又は２に記載の乳幼児用栄養組成物。
シアリル糖ペプチドが配合された請求項１〜３のいずれかに記載の乳幼児用栄養組成物。
シアリル糖ペプチドが、シアル酸を８重量％以上含有し、ガラクト−Ｎ−ビオースを４重量％以上含有し、タンパク質量が８６重量％以下である請求項１〜４のいずれかに記載の乳幼児用栄養組成物。
前記シアリル糖ペプチドの分子量が７００以上３，０００以下である請求項１〜５のいずれかに記載の乳幼児用栄養組成物。
シアリル糖ペプチドは、スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドであって、前記糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、前記糖鎖の構成糖がシアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなる請求項１〜６のいずれかに記載の乳幼児用栄養組成物。
シアリル糖ペプチドを添加する工程を含む乳幼児用栄養組成物の製造方法であって、シアリル糖ペプチドが以下の構成を有することを特徴とする乳幼児用栄養組成物の製造方法。
スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドであって、
前記糖ペプチドの分子量が７００以上３，０００以下であり、
前記糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、
前記糖鎖の構成糖がシアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなり
前記シアル酸を８重量％以上含有し、
前記ガラクト-Ｎ-ビオースを４重量％以上含有し、
前記ペプチド鎖のタンパク質量が８６重量％以下である