JP2019527191A - 免疫増強剤、口蹄疫不活化ワクチンおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

本願は複数成分配合免疫増強剤およびその応用を開示する。本発明は複数成分配合免疫増強剤の製造および豚口蹄疫ワクチンへの応用に関する。本発明は豚口蹄疫ワクチンを研究の主体として、これをもとに、数種類の著しく免疫増強作用を有する免疫増強剤を選択して複数成分配合免疫増強剤に使用して、抗原／ワクチンと免疫増強剤を混合した後、ワクチン免疫豚を作製した。動物実験の結果から、本発明は著しく免疫増強作用を有し、複数成分配合免疫増強剤を含むワクチンを１回接種した後、抗体生成のウィンドウピリオドを７日間に短縮し、液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体力価が著しく高くなり、抗体の合格率が著しく上昇し、抗体持続期間を少なくとも７ヶ月まで延ばすことができ、かつ安全で、明らかな免疫副反応が認められなかった。【選択図】なし

Description

本発明は生物製薬領域に関し、特に免疫増強剤、口蹄疫不活化ワクチンおよびその製造方法に関する。

口蹄疫（Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ、ＦＭＤ）は口蹄疫ウィルス（Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ、ＦＭＤＶ）によって引き起こされる急性、熱性、高度接触感染性の伝染病である。口蹄疫ウィルスはｍｉＲＮＡウィルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、口蹄疫ウィルス属（Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）に属し、Ａ、Ｏ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３およびＡｓｉＡ１型の７つの血清型がある。また、それぞれの血清型にはいくつかの亜型が含まれる。当該ウィルスは各型間に交叉免疫性がないだけではなく、同一血清型の各亜型間にもわずか一部しか交叉免疫性がない。２０１２年、国務院弁公庁は国家中長期動物疫病予防と治療計画（２０１２−２０２０年）を頒布し、口蹄疫を優先的に予防および治療する病気の一つに認定している。

我が国（中国）では、口蹄疫ワクチンが強制免疫ワクチンに属しており、現在使用されている主なワクチンは不活化ワクチンであるが、抗体の生成が遅く、免疫期が短く、抗原スペクトルが狭く、不活化が不十分などの短所があった。現在、多くの研究者は不活化ワクチンの改善と新規開発、例えば新型流行ウィルス株、製造プロセスなどの研究に従事し、抗原を更に純化し、免疫効果をもっと良くし、アジュバントを更に有効にし、不活化の信頼性を更に高めるなどの研究が行われているが、それぞれのプロセスの研究期間と検証期間が長い。通常の豚口蹄疫ワクチンの接種回数として普通２〜３回が必要であるにもかかわらず、抗体持続期間はわずか３〜４ヶ月で、接種後の防御を高めても効力がわずか７０〜８０％しかない。そのため、口蹄疫ワクチンの品質を高める余地が大きく残されており、免疫増強剤の改善は実用可能な技術の一つである。

ゲンゲ属多糖類（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｈａｒｉｎ）には非特異免疫機能と体液性免疫機能を著しく強める効果がある。ゲンゲ属多糖類は有機体を誘導してインターフェロンを発生させることができ、有機体内でのウィルスの複製を阻害し、有機体の免疫機能を高めるとともに、リンパ細胞と網状内皮層細胞の生成を刺激および強化し、網状内皮層細胞とマクロファージの貪食機能を強めることができ、かつ体液、粘膜と細胞免疫に対して優れた促進および調節効果を有する。飼料添加剤として動物の養殖に応用した場合、動物の成長を促進し、有機体の抵抗力を高めるなどの効果がある。天然産物であるため原料が豊富で、価格が安く、長期にわたって使用しても組織細胞に対する毒性などの副作用が少なく、残留量も低い。しかし、飼料あるいは飲用水に添加する場合、基本使用量が少なくとも１グラム／日で多くの量が必要であるため、大量に消費し、かつ免疫増強効果が不確実で、評価しにくいなどの短所があった。

Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は哺乳動物の免疫細胞に存在する膜貫通タンパク質で、その主な免疫学機能として各種の異なる病原微生物の関連分子（ＴＬＲアゴニスト）を監視および識別し、先天性免疫反応を迅速に誘発し、抗原特異性獲得性免疫反応の基礎を築く。ＴＬＲアゴニストの動物用ワクチンへの応用はほとんど実験室研究の段階に留まっており、大量の研究結果からＴＬＲアゴニストはワクチンの免疫増強剤として用いることができることが明らかになっている。ワクチンにＴＬＲアゴニスト、例えばＣｐＧ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、イミキモドなどを添加した場合、明らかな免疫増強効果があった。そのうち、ＴＬＲ４アゴニストはすでに２００９年にＢ型肝炎とヒト乳頭腫ウイルスワクチンへの応用が認められている。

現在、応用における主なボトルネックとして数多くのＴＬＲアゴニストの製造にとても高いコストがかかる問題がある。

本発明が解決しようとする技術的課題は複数成分配合免疫増強剤を提供することである。本発明の目的は複数成分配合免疫増強剤を提供し、微量のＴＬＲアゴニストを使って、微量の漢方薬免疫増強剤であるゲンゲ属多糖類を配合することによって相乗増強効果をもたらし、免疫増強剤としてＴＬＲアゴニストを単独で使用するよりもコストを下げるうえ免疫効力を高める。口蹄疫ワクチンの免疫効果をさらに高めることによって、子豚の出荷までに１回の接種で済むと同時に、抗体生成のウィンドウピリオドを７日間に短縮し、抗体の持続期間を７ヶ月以上に延ばすことで養豚コストを著しく低減することができる。

本発明がもう一つ解決しようとする技術的課題は複数成分配合免疫増強剤の製造方法を提供することである。

本発明がさらに解決しようとする技術的課題は複数成分配合免疫増強剤を含む口蹄疫不活化ワクチンを提供することである。

本発明が最後に解決しようとする技術的課題は複数成分配合免疫増強剤を含む口蹄疫不活化ワクチンの製造方法を提供することである。

上述の問題を解決するために、本発明の解決手段として複数成分配合免疫増強剤を提供する。前記複数成分配合免疫増強剤は５〜５２０μｇ／ｍＬのモノホスホリルリピドＡ、１０〜５２０μｇ／ｍＬのムラミルジペプチド、１〜５２０μｇ／ｍＬのβ−グルカンおよび０．０５〜５．２ｍｇ／ｍＬのゲンゲ属多糖類を含むが、それらに限定されるものではない。

好ましくは、前記免疫増強剤は５〜５００μｇ／ｍＬのモノホスホリルリピドＡ、１０〜５００μｇ／ｍＬのムラミルジペプチド、１〜５００μｇ／ｍＬのβ−グルカンおよび０．０５〜５．０ｍｇ／ｍＬのゲンゲ属多糖類を含むが、それらに限定されるものではない。

好ましくは、前記免疫増強剤は１００〜５００μｇ／ｍＬのモノホスホリルリピドＡ、１００〜５００μｇ／ｍＬのムラミルジペプチド、５０〜５００μｇ／ｍＬのβ−グルカンおよび１〜５．０ｍｇ／ｍＬのゲンゲ属多糖類を含むが、それらに限定されるものではない。

本発明の内容は前記免疫増強剤の製造方法をさらに提供し、当該製造方法は、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルジペプチド、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類を含む溶液を調製し、ツイーン８０と混合して、水相溶液を得るステップ１と、ホワイトオイルとスパン８０を混合し、油相溶液を得るステップ２と、前記水相溶液と油相溶液を充分に混合して乳化した後、複数成分配合免疫増強剤のシャペロンワクチンを得るステップ３と、を含むが、それらに限定されるものではない。

また、本発明の内容は前記免疫増強剤のワクチン製造への応用を含む。

また、本発明の内容は前記複数成分配合免疫増強剤を含む口蹄疫不活化ワクチンを含む。

ここで、前記口蹄疫不活化ワクチンはまた不活化抗原溶液を含むが、それらに限定されるものではない。

ここで、前記口蹄疫不活化ワクチンの不活化抗原溶液と複数成分配合免疫増強剤の体積比は９：１〜８：１である。

ここで、前記不活化抗原溶液はＯ、Ａ、亜Ｉ型口蹄疫不活化抗原、ポリペプチドあるいはその他の遺伝子工学発現産物の一種あるいは数種類を含むが、それらに限定されるものではない。

本発明の内容は、前記複数成分配合免疫増強剤を含む口蹄疫不活化ワクチンの製造方法をさらに提供し、当該製造方法は、複数成分配合免疫増強剤と不活化抗原溶液を混合し、さらにツイーン８０と混合して水相溶液を得るステップ１、ホワイトオイルとスパン８０を混合し、油相溶液を得るステップ２と、油相と水相溶液を充分混合して複数成分配合免疫増強剤を含む口蹄疫不活化ワクチンを得るステップ３と、を含むが、それらに限定されるものではない。

本発明は既存の技術に比べて、以下の長所がある。

１．本発明は複数成分配合免疫増強剤を開発する。それを口蹄疫不活化ワクチンと混合して使用するとワクチンの効力を効果的に高めることができ、抗体の合格率と平均抗体レベルを高めることができるだけではなく、抗体生成のウィンドウピリオドを７日間に短縮することができると同時に、抗体持続期間を７ヶ月以上に延ばすことができる。

２．ゲンゲ属多糖類の原料が豊富で、価格が安く、長期にわたって使用しても組織細胞に対する毒性などの副作用が少なく、残留量が低い。少量のゲンゲ属多糖類を添加してもその他の３種類のＴＯＬＬ様受容体アゴニストの使用量を著しく減らすことができ、生産コストを９０％低減することができるにもかかわらず、免疫効果が低下しない。

３．本発明の複数成分配合免疫増強剤を口蹄疫不活化ワクチンとともに使用することによって、ワクチンの免疫効力を著しく高め、養豚場は自身の状況に応じてワクチンの免疫回数を減らすことができるため、養殖コストを減らし、豚のストレスを低減させることができる。

複数成分配合免疫増強剤を含むワクチンを接種した後の平均抗体レベルと抗体持続期間である。具体的には各グループの異なる複数成分配合免疫増強剤を含むＯ型ＦＭＤ不活化ワクチンを子豚に接種した後の異なる時点での平均液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体レベルを示している。

次に図面に合わせて本発明をさらに説明する。

（実施例１）複数成分配合免疫増強剤、口蹄疫ワクチンの調製
１．実験材料
モノホスホリルリピドＡ、ＭＰＬと略す。
ムラミルジペプチド、ＭＤＰと略す。
ＭＰＬ、ＭＤＰおよびβ−グルカンはすべてＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製のものを使用した。
ゲンゲ属多糖類は陝西正大生物科学技術有限公司製のものを使用した。
ＩＳＡ２０６は賽百克社製、ホワイトオイル、スパン、ツイーンは市販のものを使用した。

不活性した豚Ｏ型口蹄疫ウィルス毒液（豚Ｏ型口蹄疫ウィルスミャンマ９８株）は、ピロールによる不活性化処理を行い、１４６ｓ含有量は５．８７μｇ／ｍＬで、内モンゴル金宇集団のご厚意によるものである。
市販の口蹄疫Ｏ、Ａ、亜Ｉ三価ワクチンは内モンゴル金宇集団製のものを使用した。
６〜７週齢の健康で感染しやすい子豚、液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体力価≦１：８。

本発明では口蹄疫液相競合ＥＬＩＳＡ・サンドイッチ法試薬キット（蘭州獣医研究所）を用いて液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体の力価を測定した。

１．免疫増強剤の調製
免疫増強剤の主な成分は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類である。その製造方法としては各成分をｐＨ８．０の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶かした。

複数成分配合免疫増強剤１：ＭＰＬ、ＭＤＰ、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類の最終濃度をそれぞれ５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。

複数成分配合免疫増強剤２：ＭＰＬ、ＭＤＰ、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類の最終濃度をそれぞれ１００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。

複数成分配合免疫増強剤３：ＭＰＬ、ＭＤＰ、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類の最終濃度をそれぞれ５００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬおよび５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。

複数成分配合免疫増強剤４：ＭＰＬ、ＭＤＰ、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類の最終濃度をそれぞれ５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。

複数成分配合免疫増強剤５：ＭＰＬ、ＭＤＰ、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類の最終濃度をそれぞれ５００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。

免疫増強剤６：ゲンゲ属多糖類の最終濃度を２０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。

免疫増強剤７：ゲンゲ属多糖類の最終濃度を５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。

免疫増強剤８：ＭＰＬ、ＭＤＰおよびβ−グルカンの最終濃度をそれぞれ２ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬおよび０．２ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。

調製済みの複数成分配合免疫増強剤をろ過（０．２２μｍ濾過器）して除菌した後、それぞれ薬瓶に入れて４℃で保存した。

口蹄疫ワクチンの調製方法
方法１：複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチン、すなわち複数成分配合免疫増強剤とツイーンを体積比９６：４の割合で調製し、均一に混合して水相とし、ホワイトオイルとスパンを体積比９６：４の割合で混合して油相とし、水相：油相の体積比を１：２の割合でワクチンを調製し、調製したワクチンを複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンとした。複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンを使用する前に体積比１：９の割合で市販のワクチンと充分混合した。

方法２：複数成分配合免疫増強剤と不活性した豚Ｏ型口蹄疫ウィルス毒液を体積比１：９の割合で充分混合して、水相溶液を調製した。まずＩＳＡ２０６と水相溶液をそれぞれ室温で約３０分間放置した。ＩＳＡ２０６を乳化缶に入れて、２００回転／分の条件で、水相溶液を乳化缶に加えて、均一に攪拌した。２０００回転／分で１０分間攪拌して、ワクチンを得て、そのうち、水相とＩＳＡ２０６の体積比は４６：５４であった。

前記２つの方法を用いて調製したワクチンは、複数成分配合免疫増強剤の最終濃度が同じであれば、免疫効果も基本的に同じであるが、単に需要の異なるユーザーに便宜を図るためである。

当該実施例において、複数成分配合免疫増強剤の各組成に関して、指定された範囲内で柔軟に配合比を調整することができるが、ここではその詳細を省略する。

（実施例２）複数成分配合免疫増強剤の口蹄疫不活化ワクチンに対する免疫効力の評価
１．ワクチンの調製
当該実施例は実施例１の第２の方法に基づいて口蹄疫ワクチンを調製した。
複数成分配合免疫増強剤１と不活化抗原を１：９の割合で混合して水相溶液とし、ＩＳＡ２０６を乳化缶に入れて、２００回転／分の条件で、水相溶液を乳化缶に加えて、均一に攪拌して、２０００回転／分で１０分間攪拌した。得られた口蹄疫不活化ワクチンを、複数成分配合免疫増強剤を含むＦＭＤ不活化ワクチン１と称し、ＦＭＤ１と略す。
複数成分配合免疫増強剤２、３、４、５、６、７のワクチン製造方法は複数成分配合免疫増強剤１と同じで、複数成分配合免疫増強剤を含むＦＭＤ不活化ワクチン２、３、４、５、６、７を調製して、ＦＭＤ２、３、４、５、６、７と略す。

免疫増強剤８と不活化抗原を１：１の割合で混合して、得られた口蹄疫不活化ワクチンを、複数成分配合免疫増強剤を含むＦＭＤ不活化ワクチン８と称し、ＦＭＤ８と略す。（中国特許第ＺＬ２０１３１００４２９８３．０号明細書に基づいてワクチンの製造を行い、免疫増強剤と不活性化した豚口蹄疫ウィルスの毒液を体積比１：１の割合で混合して、水相溶液を得た。ＩＳＡ２０６と水相溶液をそれぞれ室温に約３０分を放置した。ＩＳＡ２０６を乳化缶に入れて、２００回転／分の条件で、水相溶液を乳化缶に加えて、均一に攪拌して、２０００回転／分で１０分間攪拌して、ワクチンを得た。）

０．１Ｍ ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌと不活化抗原を１：９の割合で混合して水相溶液とし、ＩＳＡ２０６を乳化缶に入れて、２００回転／分の条件で、水相溶液を乳化缶に加えて、均一に攪拌して、２０００回転／分で１０分間攪拌した。得られた口蹄疫不活化ワクチンをＦＭＤ対照ワクチンと称する。

２．グループ分け、免疫と抗体の測定
実験のグループ分けと接種：健康で感染しやすい子豚を無作為にグループに分けて、１つのグループを１０頭ずつにし、全部で６グループとした。各グループのワクチンをそれぞれ１つのグループの健康で感染しやすい子豚に、分量２ｍＬで接種した。

接種後採血：
接種後の抗体の生成状況を観察測定し、接種後７日、１４日、２１日および２８日目に、各グループの健康で感染しやすい子豚から採血して、血清を分離して、蘭州獣医研究所の液相競合ＥＬＩＳＡ・サンドイッチ法抗体試薬キットを用いて、ワクチン接種後の抗体の生成状況とウィンドウピリオドを観察測定した。

接種後の豚に対する抗体持続期間の観察測定を行い、それぞれ接種後２８日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、１８０日および２１０日目にそれぞれ採血し、蘭州獣医研究所の液相競合ＥＬＩＳＡ・サンドイッチ法抗体試薬キットを用いて、ワクチン接種後の抗体の生成状況を観察測定した。
（液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体の力価が２^６以上で合格とした。）

接種後の抗体の合格率を表１及び表２に示した。
接種後の平均抗体レベルを図１に示した。

表１から、ＦＭＤ対照ワクチンを接種した子豚は、接種後７日目に接種した１０頭の豚のうちに抗体がわずか２頭しか免疫合格ラインに達しておらず、合格率は２／１０であった。ゲンゲ属多糖類のみを添加した免疫増強剤グループＦＭＤ６で、高い分量で一定の免疫増強効果はあったが、理想的ではなく、ＦＭＤ１／ＦＭＤ２／ＦＭＤ３グループに比べると明らかに劣る（合格率は８／１０、８／１０および９／１０）。単独で低い分量のゲンゲ属多糖類グループ（ＦＭＤ７）の免疫増強効果が更に悪く、高い分量のゲンゲ属多糖類を異なる分量のＭＰＬ、ＭＤＰおよびβ−グルカンと配合した（ＦＭＤ４／ＦＭＤ５）場合、明らかな免疫増強効果が認められなかった。さらに低い分量のゲンゲ属多糖類を低い分量のＭＰＬ、ＭＤおよびβ−グルカンと配合した（ＦＭＤ１／ＦＭＤ２／ＦＭＤ３）場合、抗体のウィンドウピリオドを７日間に短縮し、７日間で８０％以上の抗体が合格ライン以上（液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体が２^６より大きい）に達し、かつ抗体の合格率（ＦＭＤ８と比較）が低下しないことが明らかになった。ＦＭＤ６グループも、明らかな免疫増強効果があったが、抗体生成のウィンドウピリオドにおいてＦＭＤ１／ＦＭＤ２／ＦＭＤ３より７日間遅れており、接種後１４日目の抗体合格率は複数成分配合免疫増強剤１／２／３（ＦＭＤ１／ＦＭＤ２／ＦＭＤ３）と同じレベルで、接種後１４日目の抗体合格率は対応する複数成分配合免疫増強剤１、２、３（ＦＭＤ１／ＦＭＤ２／ＦＭＤ３）グループ接種後７日目の合格率と同じレベルであった。

表２から、複数成分配合免疫増強剤処方１、２、３、つまりＦＭＤ１／ＦＭＤ２／ＦＭＤ３の３つのグループにおいて接種後にワクチンの抗体持続期間が明らかに長くなっており、接種後７ヶ月間を観察測定し続けたが、抗体の合格率が明らかに低下することなく、１０／１０に維持していた。ＦＭＤ対照ワクチンの最大合格率はほとんど３／１０程度で、ゲンゲ属多糖類グループ（ＦＭＤ６／ＦＭＤ７）は単独でも一定の免疫増強効果があったが、効果が明らかではなく、ＦＭＤ対照ワクチンと明らかな相違が認められなかった。

図１から、複数成分配合免疫増強剤１、２、３（ＦＭＤ１／ＦＭＤ２／ＦＭＤ３）グループと免疫増強剤８（ＦＭＤ８）グループはＦＭＤワクチンの免疫効力を著しく向上させ、抗体生成のウィンドウピリオドを短縮することができた。そのうち、複数成分配合免疫増強剤１、２、３（ＦＭＤ１／ＦＭＤ２／ＦＭＤ３）グループは接種後７日目で、平均液相ブロッキングＥＬＩＳＡの抗体レベルがすでに２^６より高く、対照ワクチングループの２^３よりはるかに高く、平均抗体レベルと抗体持続期間が著しく向上した。ゲンゲ属多糖類（ＦＭＤ６／ＦＭＤ７）単独と高い分量のゲンゲ属多糖類をＭＰＬ、ＭＤＰおよびβ−グルカンを配合したグループ（ＦＭＤ４／ＦＭＤ５）には明らかな免疫増強の効果は認められなかった。

そのため、複数成分配合免疫増強剤に添加した一定量のゲンゲ属多糖類とＭＰＬ、ＭＤＰおよびβ−グルカンとの相乗効果によって、子豚の抗原に対する免疫応答を著しく向上させ、抗体の合格率を高め、抗体の生成時間を早めることができる。これにより、ワクチン抗体を生成するためのウィンドウピリオドを接種後７日間に短縮し、ワクチンの免疫効果を高めることができた。

当該実施例において、免疫増強剤の各組成の配合比を指定された範囲内で柔軟に調整することができるが、ここではその詳細を省略する。

（実施例３）複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンの調製
１．複数成分配合免疫増強剤の調製
複数成分配合免疫増強剤の主な成分は、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルジペプチド、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類である。その製造方法として、主な成分をそれぞれｐＨ８．０の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶かした。

複数成分配合免疫増強剤９：ＭＰＬ、ＭＤＰ、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類の最終濃度をそれぞれ５．２μｇ／ｍＬ、１０．４μｇ／ｍＬ、１．０４μｇ／ｍＬと０．０５２ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。

複数成分配合免疫増強剤１０：ＭＰＬ、ＭＤＰ、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類の最終濃度をそれぞれ１０４μｇ／ｍＬ、１０４μｇ／ｍＬ、５２μｇ／ｍＬと１．０４ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。

複数成分配合免疫増強剤１１：ＭＰＬ、ＭＤＰ、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類の最終濃度をそれぞれ５２０μｇ／ｍＬ、５２０μｇ／ｍＬ、５２０μｇ／ｍＬと５．２ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。

調製した複数成分配合免疫増強剤をろ過（０．２２μｍ濾過器）して除菌した後、それぞれ薬瓶に入れて４℃で保存した。

２．複数成分配合免疫増強剤のシャペロンワクチンの調製
（１）複数成分配合免疫増強剤とツイーンを９６：４の割合で均一に混合して、水相を調製した。
（２）ホワイトオイルとスパンを９６：４の割合で均一に混合した。
（３）水相と油相を体積比１：２の割合で充分混合して複合免疫増強剤を含むシャペロンワクチンを調製した。

この方法で調製した複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンはそれぞれ複数成分配合免疫増強剤９、１０、１１に因んで複数成分配合免疫増強剤シャペロン９、１０、１１と命名した。

３．使用方法
複数成分配合免疫増強剤を含むシャペロンワクチン３００μＬと１頭分のワクチンを充分混合した後接種する。

当該実施例において、複数成分配合免疫増強剤の各組成の配合比を指定された範囲内で柔軟に調整することが可能で、使用体積も実際の需要に応じて調整することができるが、ここではその詳細を省略する。

（実施例４）複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンの市販Ｏ、Ａ、亜Ｉ三価ワクチンに対する免疫効力の評価
１．ワクチンの調製
複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンは実施例３で調製した３種類のシャペロンワクチンを用いた。

三価ワクチンはＯ、Ａ、亜Ｉ三価不活化ワクチン（規格品ワクチン）で、ロット番号は５２３５０３９、２０１５１２２４である。

２．グループ分け、接種と抗体の観察測定
実験のグループ分けおよび接種：健康で感染しやすい子豚を無作為にグループに分けて、各グループに１０頭ずつ、全部で４つのグループとした。
各グループのワクチンを１つのグループに含まれる健康で感染しやすい子豚に接種した。

接種後採血：
接種後の抗体の生成状況に対する観察測定：接種後７日、１４日、２１日と２８日目において、各グループの健康で感染しやすい子豚から採血し、血清を分離して、蘭州獣医研究所の液相競合ＥＬＩＳＡ・サンドイッチ法抗体試薬キットを用いてワクチン接種後の抗体の生成状況とウィンドウピリオドを観察測定した。

接種後免疫増強効果の良かった複数成分配合免疫増強剤グループに対する抗体持続期間を観察測定し、接種後２８日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、１８０日および２１０日目にそれぞれ採血し、蘭州獣医研究所の液相競合ＥＬＩＳＡ・サンドイッチ法抗体試薬キットを用いてワクチン接種後の抗体の生成状況を観察測定した。
（Ｏ型液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体力価が２^６以上であれば抗体を合格とし、Ａと亜Ｉ型液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体力価が２^７以上であれば抗体を合格とした。）

接種後の抗体合格率は表４と５に示した通りである。

表４から、三価ワクチンを接種した子豚は、接種後７日目の３つの血清型の抗体の合格率はわずか２０％、３０％と１０％であったが、複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチン９／１０／１１＋三価格ワクチンを接種した子豚は、接種後７日目の合格率はすでに７０〜９０％に達し、ウィンドウピリオドが著しく短縮され、液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体の合格率も著しく向上したことがわかった。

表５から、三価ワクチンを接種した子豚の抗体は接種後９０日齢から緩やかに下がり始めたが、複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチン９／１０／１１＋三価ワクチンを接種した子豚は、接種２８日後の抗体レベルがほぼ安定し、７ヶ月まで持続しても明らかな低下傾向が認められなかった。複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンを添加した免疫グループは、ワクチンの抗体持続期間が著しく長くなった。

以上のように、複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンはＯ、Ａ、亜Ｉ三価口蹄疫不活化ワクチンの免疫力価に著しく増強効果があることがわかった。Ｏ、Ａ、亜Ｉの３種類の血清型の抗体に明らかな免疫増強効果があるだけでなく、ワクチン抗体生成のウィンドウピリオドも７日間に短縮し、ワクチンの抗体持続期間を高めることができることが明らかになった。

（実施例５）複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンの市販ポリペプチドワクチンに対する免疫効力の評価
１．ワクチンの調製
複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンには実施例３で調整した３種類のシャペロンワクチンを用いた。
ポリペプチドワクチンのロット番号：（２０１４）０９０２９７５２２

２．グループ分け、接種と抗体の観察測定
実験のグループ分けと接種：健康で感染しやすい子豚を無作為にグループに分けて、各グループに１０頭ずつ、全部で４グループとした。
各グループのワクチンを１つのグループに含まれる健康で感染しやすい子豚に接種した。

接種後採血：
接種後の抗体の生成状況を観察測定し、接種後７日、１４日、２１日および２８日目に、各グループの健康で感染しやすい子豚から採血し、血清を分離して、蘭獣研の液相競合ＥＬＩＳＡ・サンドイッチ法抗体試薬キットおよび豚口蹄疫ウィルスＶＰＩ構造たんぱく質抗体検出ＥＬＩＳＡキット（ポリペプチド抗体の観察測定キットは上海申聯社のものを使用した）を用いて、ワクチン接種後の抗体の生成状況をそれぞれ観察測定した。

接種後の免疫増強効果のよかった複数成分配合免疫増強剤グループに対する抗体持続期間を観察測定し、接種後２８日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、１８０日および２１０日目にそれぞれ採血して、蘭州獣医研究所の液相競合ＥＬＩＳＡ・サンドイッチ法抗体試薬キットを用いて、ワクチン接種後の血清抗体の生成状況を観察測定した。
（液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体の力価が２^６以上であれば抗体を合格とし、ポリペプチド抗体の観察測定は試薬キットの基準を用いて陰・陽性を判定した。）

接種後の２種類の試薬キットで測定した抗体の合格率は表７と表８に示した通りである。

表７から、ポリペプチドワクチンを接種した子豚は、接種してから７日後のポリペプチド抗体の合格率は４／１０であったが、液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体の合格率は０であった。複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチン９／１０／１１＋ポリペプチドを接種した子豚は、接種後７日目のポリペプチドワクチンの抗体合格率は８／１０あるいは９／１０で、液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体の合格率も５／１０あるいは６／１０程度に向上した。蘭州獣医研究所の液相競合ＥＬＩＳＡ・サンドイッチ法抗体試薬キットの説明によると、液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体レベルは防御保護と一定の関連があり、特に抗体のレベルが高ければ高いほど、保護効力がよい。複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンはポリペプチド抗体生成のウィンドウピリオドを著しく短縮することができ、液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体の合格率を向上させることができることがわかった。

表８から、ポリペプチドを接種した子豚の抗体は接種後９０日齢から緩やかに低下しはじめたが、複数成分配合増強剤シャペロンワクチン９／１０／１１＋ポリペプチドワクチンを接種した子豚は、接種から２１日後に抗体レベルがほぼ安定しており、７ヶ月まで持続し、明らかな低下傾向が認められなかった。複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンを添加した免疫グループにおいては、ワクチンの抗体持続期間が著しく長くなることが明らかになった。

以上のように、複数成分配合免疫増強剤シャペロンワクチンは口蹄疫ポリペプチドワクチンの免疫効力の向上に明らかな促進作用があり、かつ液相ブロッキングＥＬＩＳＡ抗体の合格率を著しく向上させ、ワクチン抗体生成のウィンドウピリオドを著しく短縮し、ワクチンの抗体持続期間を延ばすことができることがわかった。

以上に記述した本発明の好ましい実施手段は、当該分野の普通の技術者にとって、本発明の原理を逸脱していない範囲で若干の補正や変更を加えることが可能であるが、これらの補正や変更も本発明の限定範囲と見なすべきであることが理解されたい。

（付記）
（付記１）
５〜５２０μｇ／ｍＬのモノホスホリルリピドＡと、１０〜５２０μｇ／ｍＬのムラミルジペプチドと、１〜５２０μｇ／ｍＬのβ−グルカンと、０．０５〜５．２ｍｇ／ｍＬのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、複数成分配合免疫増強剤。

（付記２）
５〜５００μｇ／ｍＬのモノホスホリルリピドＡと、１０〜５００μｇ／ｍＬのムラミルジペプチドと、１〜５００μｇ／ｍＬのβ−グルカンと、０．０５〜５．０ｍｇ／ｍＬのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、付記１に記載の複数成分配合免疫増強剤。

（付記３）
１００〜５００μｇ／ｍＬのモノホスホリルリピドＡと、１００〜５００μｇ／ｍＬのムラミルジペプチドと、５０〜５００μｇ／ｍＬのβ−グルカンと、１〜５．０ｍｇ／ｍＬのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、付記１に記載の複数成分配合免疫増強剤。

（付記４）
モノホスホリルリピドＡ、ムラミルジペプチド、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類を含む溶液を調製し、ツイーン８０と混合し、水相溶液を得るステップ１と、
ホワイトオイルとスパン８０を混合し、油相溶液を得るステップ２と、
前記水相溶液と前記油相溶液を混合して乳化した後、複数成分配合免疫増強剤を含むシャペロンワクチンを得るステップ３と、
を含むことを特徴とする、付記１ないし付記３のいずれか１つに記載の複数成分配合免疫増強剤の製造方法。

（付記５）
付記１ないし付記３のいずれか１つに記載の免疫増強剤のワクチン製造への応用。

（付記６）
付記１ないし付記３のいずれか１つに記載の複数成分配合免疫増強剤を含む口蹄疫不活化ワクチン。

（付記７）
不活化抗原溶液をさらに含むことを特徴とする、付記６に記載の口蹄疫不活化ワクチン。

（付記８）
前記不活化抗原溶液と前記複数成分配合免疫増強剤との体積比は９：１〜８：１であることを特徴とする、付記７に記載の口蹄疫不活化ワクチン。

（付記９）
前記不活化抗原溶液はＯ、Ａ、亜Ｉ型口蹄疫不活性化抗原、ポリペプチドあるいはその他の遺伝子工学発現産物の一種あるいは数種を含むことを特徴とする、付記７に記載の口蹄疫不活化ワクチン。

（付記１０）
複数成分配合免疫増強剤と不活化抗原溶液を混合した後、さらにツイーン８０と充分混合して水相溶液を得るステップ１と、
ホワイトオイルとスパン８０を混合して、油相溶液を得るステップ２と、
前記水相溶液と前記油相溶液を充分混合して複数成分配合免疫増強剤を含む口蹄疫不活化ワクチンを得るステップ３と、
を含むことを特徴とする、付記６に記載の複数成分配合免疫増強剤を含む口蹄疫不活化ワクチンの製造方法。

Claims (10)

1. ５〜５２０μｇ／ｍＬのモノホスホリルリピドＡと、１０〜５２０μｇ／ｍＬのムラミルジペプチドと、１〜５２０μｇ／ｍＬのβ−グルカンと、０．０５〜５．２ｍｇ／ｍＬのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、複数成分配合免疫増強剤。
2. ５〜５００μｇ／ｍＬのモノホスホリルリピドＡと、１０〜５００μｇ／ｍＬのムラミルジペプチドと、１〜５００μｇ／ｍＬのβ−グルカンと、０．０５〜５．０ｍｇ／ｍＬのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、請求項１に記載の複数成分配合免疫増強剤。
3. １００〜５００μｇ／ｍＬのモノホスホリルリピドＡと、１００〜５００μｇ／ｍＬのムラミルジペプチドと、５０〜５００μｇ／ｍＬのβ−グルカンと、１〜５．０ｍｇ／ｍＬのゲンゲ属多糖類と、を含むことを特徴とする、請求項１に記載の複数成分配合免疫増強剤。
4. モノホスホリルリピドＡ、ムラミルジペプチド、β−グルカンおよびゲンゲ属多糖類を含む溶液を調製し、ツイーン８０と混合し、水相溶液を得るステップ１と、
   ホワイトオイルとスパン８０を混合し、油相溶液を得るステップ２と、
   前記水相溶液と前記油相溶液を混合して乳化した後、複数成分配合免疫増強剤を含むシャペロンワクチンを得るステップ３と、
   を含むことを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の複数成分配合免疫増強剤の製造方法。
5. 請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の免疫増強剤のワクチン製造への応用。
6. 請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の複数成分配合免疫増強剤を含む口蹄疫不活化ワクチン。
7. 不活化抗原溶液をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の口蹄疫不活化ワクチン。
8. 前記不活化抗原溶液と前記複数成分配合免疫増強剤との体積比は９：１〜８：１であることを特徴とする、請求項７に記載の口蹄疫不活化ワクチン。
9. 前記不活化抗原溶液はＯ、Ａ、亜Ｉ型口蹄疫不活性化抗原、ポリペプチドあるいはその他の遺伝子工学発現産物の一種あるいは数種を含むことを特徴とする、請求項７に記載の口蹄疫不活化ワクチン。
10. 複数成分配合免疫増強剤と不活化抗原溶液を混合した後、さらにツイーン８０と充分混合して水相溶液を得るステップ１と、
    ホワイトオイルとスパン８０を混合して、油相溶液を得るステップ２と、
    前記水相溶液と前記油相溶液を充分混合して複数成分配合免疫増強剤を含む口蹄疫不活化ワクチンを得るステップ３と、
    を含むことを特徴とする、請求項６に記載の複数成分配合免疫増強剤を含む口蹄疫不活化ワクチンの製造方法。