CN112679606B - 一种猪丹毒丝菌高免血清及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明创造提供了一种猪丹毒丝菌高免血清及其制备方法，所述的高免血清由猪丹毒丝菌1a型菌株为抗原配以中药免疫增强剂制备而得猪丹毒灭活疫苗进行免疫后获得，所述的中药免疫增强剂为人参多糖、黄芪多糖、当归多糖、淫羊藿多糖中的一种或多种。本发明创造所述的猪丹毒丝菌高免血清中中药免疫增强剂可增强机体的抗病能力、提高机体抗体水平，制备方法操作简单、成本低，可获得量大的高免血清。

Description

一种猪丹毒丝菌高免血清及其制备方法

技术领域

本发明创造属于兽用药生物技术领域，尤其是涉及一种猪丹毒丝菌高免血清及其制备方法。

背景技术

猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，俗称猪丹毒杆菌，该菌在自然界分布广泛，可引起猪及其他动物的丹毒病。在猪群中，猪丹毒丝菌引起的猪丹毒，是一种急性、热性传染病，临床表现为急性败血型、亚急性疹块型和慢性心内膜炎型。猪丹毒丝菌被分为1a型、1b型、2～24型和N型共26个血清型，从急性败血死亡的猪体内分离出的猪丹毒丝菌大多为1a型。20世纪80年代以前，猪丹毒曾是危害我国养猪业的三大传染病(猪瘟、猪丹毒、猪肺疫)之一。后来随着我国养殖业的发展和疫苗及抗生素的使用，20世纪90年代后期至21世纪很少有关于猪丹毒病例的报道。但2010年以来，猪丹毒又在我国多个省份呈散发性流行，且主要发生在规模化猪场，发病率也逐年呈上升趋势，给我国养猪业造成了严重的经济损失，同时也对人类健康构成一定程度威胁。

由于急性猪丹毒发病急、死亡率可高达80％-90％，因此急性猪丹毒的治疗尤为重要，而对于急性猪丹毒，采用高免血清配合抗生素进行对症治疗可取得较好的疗效。此外，高免血清还可用于鉴定猪丹毒丝菌的血清型。

发明内容

有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种猪丹毒丝菌高免血清及其制备方法。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种猪丹毒丝菌高免血清，由猪丹毒丝菌1a型菌株为抗原配以中药免疫增强剂制备而得猪丹毒灭活疫苗进行免疫后获得，所述的中药免疫增强剂为人参多糖、黄芪多糖、当归多糖、淫羊藿多糖中的一种或多种。

进一步的，所述中药免疫增强剂为人参多糖、黄芪多糖、当归多糖和淫羊藿多糖，所述人参多糖、黄芪多糖、当归多糖与淫羊藿多糖的质量比为(2-3)：1：1：1。

优选地，所述中药免疫增强剂为人参多糖、黄芪多糖、当归多糖和淫羊藿多糖，所述人参多糖、黄芪多糖、当归多糖与淫羊藿多糖的质量比为2：1：1：1。

进一步的，所述抗原与中药免疫增强剂的质量比为4：1。

进一步地，所述猪丹毒灭活疫苗中还包括佐剂，所述佐剂为矿物油佐剂或弗氏佐剂。

进一步的，所述猪丹毒灭活疫苗中还包括防腐剂，所述防腐剂为硫柳汞或苯酚。

进一步的，所述猪丹毒灭活疫苗中，猪丹毒丝菌1a型菌株的灭活菌体含量不少于3.0×10⁹CFU/mL。

本发明还提供一种上述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，具体包括如下步骤：

1)将猪丹毒丝菌1a型菌株进行培养并将菌液进行灭活；

2)将灭活后的菌液浓缩去除上清，洗涤后稀释，得到抗原液；

3)将抗原液与中药免疫增强剂、佐剂、防腐剂混合均匀，即得猪丹毒灭活疫苗；

4)使用猪丹毒灭活疫苗对仔猪进行1次基础免疫，21d后进行一次加强免疫，再间隔21d进行第二次加强免疫，免疫14d后使用猪丹毒丝菌1a型菌株进行一次攻毒，间隔14d后进行第二次攻毒；

5)第二次攻毒后14d，采集血液，分离血清，检验抗体效价，效价达到2¹⁰以上,对所有的仔猪颈动脉放血；

6)将收取的血液置于37℃恒温培养箱中1h，再置于4℃的冰箱中12-16h；然后以3000r/min的转速将采集的血液离心5min，分离出的上清即为血清，用0.22μm的滤膜进行过滤，分装，即得到猪丹毒丝菌的高免血清；

7)使用菌体ELISA方法对血清中的抗体水平进行检测，效价达到2¹⁰，即为猪丹毒丝菌高免血清。

进一步的，步骤1)中，所述菌液中猪丹毒丝菌1a型菌株的活菌含量不少于1.0×10⁹CFU/mL。

进一步的，步骤1)中，所述灭活采用甲醛或β-丙内酯灭活剂。

进一步的，步骤1)中，所述灭活采用甲醛灭活剂，甲醛灭活剂按照菌液总体积分数的0.25％-0.3％加入质量浓度为37％-40％的甲醛溶液；37-39℃灭活24-48h。

进一步的，步骤2)中，所述洗涤、稀释均可采用浓度为0.0l mol/L、pH值为7.2的无菌PBS溶液；洗涤后用无菌PBS溶液稀释菌体抗原。

进一步的，步骤3)中，所述中药免疫增强剂为人参多糖、黄芪多糖、当归多糖及淫羊藿多糖按照质量比为(2-3):1:1:1混合后得到，所述抗原液与中药免疫增强剂按4:1的质量比进行混合。

进一步的，步骤3)中的佐剂为矿物油佐剂，所述添加了中药免疫增强剂的抗原液与矿物油佐剂按照体积比为1:2的比例混合，室温下8000-10000r/min乳化5-10min，至其混合均匀。

进一步的，步骤3)中的佐剂为弗氏佐剂，将添加了中药免疫增强剂的抗原液与弗氏佐剂按照体积比为1:1的比例混合；室温下8000-10000r/min乳化5-10min，至其混合均匀。

进一步的，步骤3)中，所述防腐剂为硫柳汞，其添加量为抗原液体积的0.005％。

进一步的，步骤3)中，所述防腐剂为苯酚，其添加量为抗原液体积的0.3％。

进一步的，步骤3)中，所述猪丹毒灭活疫苗中含灭活的猪丹毒丝菌1a型菌株的菌体含量不少于3.0×10⁹CFU/mL。

进一步的，步骤4)中，所述免疫途径为颈部肌肉免疫，剂量为2mL/头。

进一步的，步骤7)中，所述抗体检测方法为菌体ELISA检测抗体，即将灭活后的菌体破碎至清亮、然后12000r/min离心10min，弃去细胞碎片，上清为ELISA检测用抗原。

高免血清的制备通常都是通过疫苗免疫来制备，疫苗的效果是高免血清中抗体效价高低的关键，疫苗的效果会受到多种因素的影响，通过在疫苗中添加中药免疫增强剂来提高疫苗的免疫效力是一种效果好、毒副作用小的方法。在前期，发明人从大量的中药免疫增强剂中筛选出了人参多糖、黄芪多糖、当归多糖及淫羊藿多糖来添加到猪丹毒灭活疫苗中来增强免疫作用。人参多糖能增强吞噬细胞的吞噬功能，增加抗体产生能力，刺激干扰素产生。黄芪多糖可以参与体液免疫，促进淋巴细胞的转化，增强机体免疫力，提高仔猪的生长性能。当归多糖不仅能激活T、B淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞，还能促进细胞因子生成，激活补体系统，促进抗体产生，对免疫系统发挥多方面的调节作用。淫羊藿多糖具有调节机体免疫功能、抗病毒、刺激抗体生成的作用。本申请发明人创新且意外地发现，将这四种多糖组合作为中药免疫增强剂来使用，得到的血清抗体效价高，能够得到大量的高免血清。

相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：

本发明创造所述的高免血清在猪丹毒灭活疫苗的制备过程中添加了人参多糖、黄芪多糖、当归多糖及淫羊藿多糖作为中药免疫增强剂与佐剂配合来增强机体的抗病能力、提高机体抗体水平，本发明还提供了一种效价高、操作简单、成本低、获得量大的高免血清的制备方法，用于配合急性猪丹毒的治疗及猪丹毒丝菌的血清型鉴定。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明创造。

实施例

利用猪丹毒丝菌1a型菌株制备猪丹毒灭活疫苗，包括以下步骤：

1.生产用种子制备

1)一级种子繁殖

将猪丹毒丝菌1a型菌株生产菌种接种于含10％新生牛血清的TSA培养基上，37℃恒温培养36h后挑选5个以上典型菌落，分别接种含10％新生牛血清的TSA培养基上，37℃培养24h，进行纯粹检验合格后，作为一级种子。在2～8℃保存，保存时间应不超过7日，继代不得超过5代。

2)二级种子繁殖

将菌株一级种子接种于含10％新生牛血清的TSB液体培养基中，放置于摇床上37℃、180r/min振荡培养14h，经检验合格后，作为二级种子。在2～8℃保存，使用期应不超过7日。

2.菌液培养

按玻璃瓶容积装入适量含10％新生牛血清的TSB液体培养基中，然后按1:100的比例将二级种子转接到新的TSB培养基中，经37℃、180r/min振荡培养16h后收获菌液。

3.活菌计数

按现行《中国兽药典》附录方法使用适宜于本菌生长的含10％新生牛血清的TSA培养基进行活菌计数。使用细菌瓶培养，猪丹毒丝菌1a型菌株的活菌含量不少于1.0×10⁹CFU/mL。

4.菌液灭活

将猪丹毒丝菌1a型菌株的培养液进行灭活，按菌液总量的0.3％(体积比)加入甲醛溶液(浓度为37％～40％)，在37℃灭活48h。

5.灭活检验

取灭活后的菌液0.2mL接种于适宜该菌生长的TSA培养基中(含10％新生牛血清)，同时取灭活菌液0.2mL按1:100的比例接种于适宜该菌生长的TSB液体培养基(含10％新生牛血清)，37℃连续培养7日，均无菌生长即为合格。

6.配苗

1)抗原的准备

用中空纤维超滤器将灭活检验合格的菌液浓缩去除上清(或用低温高速离心机将灭活检验合格的菌液离心去除上清)，并用无菌PBS(0.0l mol/L、pH值7.2)进行洗涤，根据灭活前活菌计数结果，使用无菌PBS(0.0l mol/L、pH值7.2)将菌体抗原稀释制成抗原混悬液。

2)配苗

油相：向矿物油中加入司本-80和硬脂酸铝，比例为93:6:1，充分混匀后121℃高压灭菌30min，冷却后备用。

水相：根据灭活前活菌计数结果，将浓缩抗原用无菌PBS(0.0l mol·L-1、pH值7.2)稀释制成抗原悬液，将终浓度为4％的吐温-80(已灭菌)加入抗原悬液中，搅拌直至吐温-80彻底溶解(边加边搅拌)制成水相-1；将加过吐温的抗原悬液与人参多糖、黄芪多糖、当归多糖及淫羊藿多糖(各组分添加比例为1:1:1:1)按4:1的比例进行混合制成水相-2；将加过吐温的抗原悬液与人参多糖、黄芪多糖、当归多糖及淫羊藿多糖(各组分添加比例为2:1:1:1)按4:1的比例进行混合制成水相-3。

乳化制备疫苗：加入的油相与水相的比例为2:1(即2份油相、1份水相)。先向搅拌器中加入2份油相，开动电机低速搅拌(30s)，然后缓缓加入1份水相，以8000～10000r/min乳化5～10min，在终止搅拌前按0.005％(体积百分数)的量加入硫柳汞，充分混匀。最终使疫苗中含灭活菌体含量不少于3.0×10⁹CFU/mL。

3)半成品检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果显示无菌生长。

4)分装

定量分装，加盖密封，2～8℃保存。

试验例1

实施例中猪丹毒灭活疫苗成品的检验：

1)性状

本品为白色均质乳剂，滴入水中呈油滴状不扩散，4℃放置3个月无分层及破乳情况。

2)装量检查

按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。

3)无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

4)安全检验

仔猪接种的安全性试验：采用按照实施例2的方法试制的9批(每种3批)猪丹毒灭活疫苗(批号：202001、202002、202003、202004、202005、202006、202007、202008、202009)分别对3～4周龄健康仔猪进行2倍剂量接种(4mL/头)，同时设立对照组接种无菌PBS(0.0lmol/L、pH值7.2)(4mL/头)，免疫部位为颈部肌肉，免疫后密切观察其临床症状及病理变化。

结果表明，9批疫苗接种仔猪均无因接种疫苗引起的精神状态和食欲异常、呕吐、腹泻甚至死亡等局部或全身不良反应。接种前与接种后一周内的体温测定结果表明，免疫组仔猪出现了短暂的体温升高，但在接种后24h体温平均升高不超过1℃，且在48h内恢复正常。观察期结束后，解剖观察各组试验仔猪免疫部位，9批疫苗组仔猪的免疫部位均无明显的疫苗残留、局部炎症和组织病变等现象，也无肉芽肿的形成，与对照组相比无明显差异。上述试验结果表明，实施例中猪丹毒灭活疫苗对使用最小日龄靶动物(3～4周龄仔猪)进行接种是安全的。

5)甲醛、硫柳汞残留量测定

按现行《中国兽药典》附录进行测定，符合规定。

试验例2

实施例中三种猪丹毒灭活疫苗成品的效力检验及抗体效价检测：

1)仔猪免疫攻毒

用4～5周龄健康仔猪25头，随机均分为5组(5头/组)，具体分组情况见表1。疫苗1组免疫不加中药免疫增强剂的疫苗，每头仔猪各颈部肌肉注射疫苗2mL进行免疫，在免疫21d后，再按相同方法接种相同的疫苗2mL进行加强免疫。疫苗2组和疫苗3组分别免疫中药免疫增强剂各组分添加比例为1:1:1:1的疫苗和中药免疫增强剂各组分添加比例为2:1:1:1的疫苗，分别在免疫21d后，再按相同方法接种相同的疫苗2mL进行加强免疫。对照组每次接种2mL无菌PBS作为空白对照组。健康组仔猪不接种作为健康对照组，隔离饲养，不攻毒。在第二次免疫14d后，将疫苗组和对照组通过耳缘静脉注射含约5LD₅₀剂量猪丹毒丝菌1a型亲本菌株菌液1mL(含活菌数为1.6×10⁵CFU)，逐日观察所有仔猪的发病情况至14日。结果见表1。

表1不同免疫组仔猪免疫保护效果

注：“——”表示不适用。

2)血清分离及抗体效价检测

首免前、第一次免疫后、第二次免疫后分别对每组仔猪进行颈静脉采血并分离血清。

将猪丹毒丝菌1a型菌株接种于含10％新生牛血清的TSA固体培养基上，37℃恒温培养24～48h，然后用接种环挑取单菌落纯化培养18～24h。挑取培养好的单菌落于含10％新生牛血清的TSB液体培养基中180r/min、37℃培养14h作为种子液，然后按1:100的比例将种子液转接到新的TSB液体培养基(含10％新生牛血清)中，37℃、180r/min振荡培养16h。向培养好的菌液中加入0.3％的甲醛溶液灭活48h，将灭活后的菌液4℃离心后弃上清收集菌体并用无菌的PBS缓冲液洗涤3次。将洗涤后的菌体按照1:5的比例浓缩并用无菌PBS缓冲液重悬即为菌体混悬液。按照超声破碎仪说明书将菌体混悬液破碎，至液体清亮，然后12000r/min离心10min，弃去细胞碎片，将上清分装到EP管中并置于4℃备用。

将96孔酶联反应板(每行12孔、每列8孔)的第一行(从下往上数)每孔加入包被液180μl，其余行每孔加入包被液100μl，再向第一行的每孔加入制备好的抗原20μl，吹打混匀后从第一行吸取100μl向上进行倍比稀释，最后一行弃去100μl，每个浓度包被1行。然后在37℃放置1h后再置于4℃过夜，取出用洗涤液洗涤3次(每次3min)。每孔加入100μl封闭液，37℃放置1h，取出再用洗涤液洗涤3次(每次3min)。然后在新的96孔酶联反应板的第一列(从左往右)每孔加入封闭液180μl，其余列每孔加入封闭液100μl，第一列每孔加入20μl血清，用移液枪从第一列吸取100μl向右倍比进行稀释，即每个浓度稀释一列。从每个孔中移取100μl稀释过的血清加入对应包被板孔中，37℃放置30min，取出后用洗涤液洗涤5次(每次3min)。然后每孔加入用封闭液稀释的(比例为1:5000)山羊抗猪IgG-HRP 100μl，37℃放置30min，取出再用洗涤液洗涤5次(每次3min)。每孔加入TMB显色液100μl，避光显色10min，然后每孔再加入TMB反应终止液100μl。放入酶标仪中在450nm波长下测OD值。

在96孔酶联反应板上每孔加入100μl按照最佳包被浓度稀释好的抗原，放于37℃1h后于4℃过夜，取出用洗涤液洗涤3次(每次3min)，每孔加入100μl封闭液，37℃放置1h，取出用洗涤液洗涤3次(每次3min)。在包被板孔中每孔加入100μl待检血清(用封闭液按照最佳稀释倍数稀释)，37℃放置30min后取出用洗涤液洗涤5次(每次3min)。然后每孔加入用封闭液稀释的(比例为1:5000)山羊抗猪IgG-HRP 100μl，37℃放置30min，取出后用洗涤液洗涤5次(每次3min)。每孔加入TMB显色液100μl，避光显色10min，每孔再加入100μl的TMB反应终止液。放入酶标仪中在450nm波长下测OD值，结果如表2所示。

表2不同免疫组仔猪血清中的抗体水平

组别	OD值	抗体效价
			疫苗1组	0.533	2<sup>3</sup>
疫苗2组	0.765	2<sup>5</sup>
			疫苗3组	0.885	2<sup>6</sup>
对照组	0.142	——

注：“——”表示不适用。

试验证明添加中药免疫增强剂疫苗组的免疫保护效力要明显强于不加中药免疫增强剂的疫苗组，且添加人参多糖、黄芪多糖、当归多糖及淫羊藿多糖(各组分添加比例为2:1:1:1)的疫苗组免疫保护效力更强，血清中抗体效价更高，因此将选择添加人参多糖、黄芪多糖、当归多糖及淫羊藿多糖(各组分添加比例为2:1:1:1)的疫苗进行高免血清的制备。

试验例3

根据试验例2的结果使用实施例中添加人参多糖、黄芪多糖、当归多糖及淫羊藿多糖(各组分添加比例为2:1:1:1)的猪丹毒灭活疫苗免疫仔猪制备高免血清。

1)仔猪免疫攻毒

用4～5周龄健康仔猪20头，随机均分为4组(5头/组)，具体分组情况见表3。第1组为疫苗免疫组，每头仔猪各颈部肌肉注射疫苗2mL进行基础免疫，分别在基础免疫21d和42d后，再按相同方法接种疫苗2mL进行两次加强免疫。第2组和第3组仔猪不接种疫苗，每次接种2mL无菌PBS作为空白对照组。第4组仔猪不接种作为健康对照组，隔离饲养，不攻毒。在加强免疫14d后，将第1组和第2组通过耳缘静脉注射含约5LD₅₀剂量猪丹毒丝菌1a型亲本菌株菌液1mL(含活菌数为1.2×10⁵CFU)，逐日观察所有仔猪的发病情况至14日，然后再对第1组和第3组通过耳缘静脉注射含约10LD₅₀剂量猪丹毒丝菌1a型亲本菌株菌液1mL(含活菌数为2.6×10⁵CFU)，逐日观察所有仔猪的发病情况至14日。结果见表3。

表3猪丹毒丝菌高免血清制备仔猪分组结果

注：“——”表示不适用。

2)血清分离及抗体效价检测

首免前、基础免疫后、第一次加强免疫后、第二次加强免疫后、第一次攻毒后、第二次攻毒后分别对每组仔猪进行颈静脉采血并分离血清。

通过菌体ELISA方法测定免疫仔猪血清中的抗体水平，方法见试验例2，结果见表4。抗体效价达到要求后，使用0.22μm的滤膜将血清进行过滤除菌，分装，即得到猪丹毒丝菌的高免血清。

表4免疫组仔猪不同免疫阶段血清中的抗体水平

试验证明，本发明中使用人参多糖、黄芪多糖、当归多糖及淫羊藿多糖(各组分添加比例为2:1:1:1)与抗原液混合并搭配良好的佐剂制备猪丹毒灭活疫苗对仔猪进行多次免疫并进行攻毒，可逐渐提高仔猪机体内的抗体水平，由此通过此方法可制备出抗体效价较高的高免血清。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种猪丹毒丝菌高免血清，其特征在于：由猪丹毒丝菌1a型菌株为抗原配以中药免疫增强剂制备而得猪丹毒灭活疫苗进行免疫后获得，所述中药免疫增强剂为人参多糖、黄芪多糖、当归多糖和淫羊藿多糖，所述人参多糖、黄芪多糖、当归多糖与淫羊藿多糖的质量比为2：1：1：1。

2.根据权利要求1所述的猪丹毒丝菌高免血清，其特征在于：所述抗原与中药免疫增强剂的质量比为4：1。

3.根据权利要求1所述的猪丹毒丝菌高免血清，其特征在于：所述猪丹毒灭活疫苗中还包括佐剂，所述佐剂为矿物油佐剂或弗氏佐剂。

4.根据权利要求1所述的猪丹毒丝菌高免血清，其特征在于：所述猪丹毒灭活疫苗中还包括防腐剂，所述防腐剂为硫柳汞或苯酚。

5.根据权利要求1所述的猪丹毒丝菌高免血清，其特征在于：所述猪丹毒灭活疫苗中，猪丹毒丝菌1a型菌株的灭活菌体含量不少于3.0×10⁹ CFU/mL。

6.一种权利要求1-5任一所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）将猪丹毒丝菌1a型菌株进行培养并将菌液进行灭活；

2）将灭活后的菌液浓缩去除上清，洗涤后稀释，得到抗原液；

3）将抗原液与中药免疫增强剂、佐剂、防腐剂混合均匀，即得猪丹毒灭活疫苗；

4）使用猪丹毒灭活疫苗对仔猪进行1次基础免疫，21 d后进行一次加强免疫，再间隔21d进行第二次加强免疫，免疫14 d后使用猪丹毒丝菌1a型菌株进行一次攻毒，间隔14 d后进行第二次攻毒；

5）第二次攻毒后14 d，采集血液，分离血清，检验抗体效价，效价达到2¹⁰以上,对所有的仔猪颈动脉放血；

6）将收取的血液置于37℃恒温培养箱中1h，再置于4℃的冰箱中12-16h；然后以3000r/min的转速将采集的血液离心5min，分离出的上清即为血清，用0.22μm的滤膜进行过滤，分装，即得到猪丹毒丝菌的高免血清；

7）使用菌体ELISA方法对血清中的抗体水平进行检测，效价达到2¹⁰，即为猪丹毒丝菌高免血清。

7.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述菌液中猪丹毒丝菌1a型菌株的活菌含量不少于1.0×10⁹ CFU/mL。

8.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述灭活采用甲醛或β-丙内酯灭活剂。

9.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述灭活采用甲醛灭活剂，甲醛灭活剂按照菌液总体积分数的0.25%-0.3%加入质量浓度为37%-40%的甲醛溶液；37-39℃灭活24-48 h。

10.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述洗涤、稀释均采用浓度为0.0l mol/L、pH值为7.2的无菌PBS溶液；洗涤后用无菌PBS溶液稀释菌体抗原。

11.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述中药免疫增强剂为人参多糖、黄芪多糖、当归多糖及淫羊藿多糖按照质量比为2:1:1:1混合后得到，所述抗原液与中药免疫增强剂按4:1的质量比进行混合。

12.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤3）中的佐剂为矿物油佐剂，所述中药免疫增强剂的抗原液与矿物油佐剂按照体积比为1:2的比例混合，室温下8000-10000 r/min乳化5-10 min，至其混合均匀。

13.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤3）中的佐剂为弗氏佐剂，将中药免疫增强剂的抗原液与弗氏佐剂按照体积比为1:1的比例混合；室温下8000-10000 r/min乳化5-10 min，至其混合均匀。

14.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述防腐剂为硫柳汞，其添加量为抗原液体积的0.005%。

15.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述防腐剂为苯酚，其添加量为抗原液体积的0.3%。

16.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述猪丹毒灭活疫苗中含灭活的猪丹毒丝菌1a型菌株的菌体含量不少于3.0×10⁹ CFU/mL。

17.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤4）中，所述免疫途径为颈部肌肉免疫，剂量为2 mL/头。

18.根据权利要求6所述猪丹毒丝菌高免血清的制备方法，其特征在于：步骤7）中，所述抗体检测方法为菌体ELISA检测抗体，即将灭活后的菌体破碎至清亮、然后12000 r/min离心10 min，弃去细胞碎片，上清为ELISA检测用抗原。