JP2019122379A - 細胞内貫通能を持ってｒｎａ干渉を誘導する核酸分子およびその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】新規構造の細胞内貫通能を有するＲＮＡｉ誘導核酸分子及びその用途の提供。【解決手段】ＲＮＡｉを誘導する二本鎖の核酸分子に含まれる少なくとも一つのヌクレオチドのホスフェートバックボーンが、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートに置換され、親油性化合物が結合された構造を有し、目的遺伝子抑制効率を有しながらも細胞伝達体なしに細胞内貫通能を有する新規構造の核酸分子、及び、これを利用した目的遺伝子の発現抑制方法。前記核酸分子構造は、コレステロール改変及びホスホロチオエート改変を導入することによって、細胞内貫通能を有し、標的部位にＲＮＡｉ誘導のための十分な量を伝達可能である。前記核酸分子は、従来のｓｉＲＮＡ分子に代わって、ｓｉＲＮＡを利用した癌及びウィルス感染治療などに活用できる。【選択図】図１２

Description

本発明は、新規構造の細胞内貫通能（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ）を持つＲＮＡｉ誘導核酸分子およびその用途に関し、より詳細にはＲＮＡｉを誘導する二本鎖の核酸分子に含まれている少なくとも一つのヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエート（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）または、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）に置換されて、親油性化合物（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）が結合された構造を持つようにして、優秀な目的遺伝子抑制効率を持ちながらも別途の細胞伝達体がなくても細胞内貫通能を持つ新しい構造の核酸分子およびこれを利用した目的遺伝子の発現抑制方法に関する。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）は、非常に特異的で、効率よく遺伝子発現を抑制できるメカニズムであり、これは標的遺伝子のｍＲＮＡと相同である配列を持つセンス鎖とこれと相補的な配列を持つアンチセンス鎖で構成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞等に導入して、標的遺伝子ｍＲＮＡの分解を誘導することで標的遺伝子の発現を抑制する。

このようなＲＮＡ干渉を誘導するｓｉＲＮＡは、塩基配列特異的に標的遺伝子の発現を抑制できる短い長さ（１９〜２１ｂｐ）の二本鎖ＲＮＡで、高い効率性と標的特異性に起因して現在治療が難しい癌、ウィルスの感染、および遺伝病など様々な疾病に対する治療剤として脚光を浴びている。ｓｉＲＮＡを利用した効果的な治療剤開発のためには、安定性、発現抑制効率（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、免疫反応、オフ−ターゲット効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ）等解決されなければならない様々な問題点があるが、その中でもインビボでの効果的な伝達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）が最も大きい困難と指摘されている。ｓｉＲＮＡは、ホスフェートバックボーン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）構造のために高い負の電荷を帯びており、細胞膜を通過できなく、その小さいサイズのために血液内で早く除去されて、実際の標的部位にＲＮＡｉ誘導のための十分量のｓｉＲＮＡを伝達するのに大きい困難を抱えている。

現在インビトロ伝達の場合、陽イオン性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ）と陽イオン性ポリマー（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を利用した高効率の伝達方法が多く開発されている（Ｓｉｏｕｄ Ｍ，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ＤＲ Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００３；３１２：１２２０−１２２５）。しかし、多くの場合インビボでは、インビトロほどの高い効率でｓｉＲＮＡを伝達しにくく、生体内に存在する種々のタンパク質との相互作用によってｓｉＲＮＡの伝達効率が減少する問題点がある（Ｂｏｌｃａｔｏ−Ｂｅｌｌｅｍｉｎ ＡＬ， Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ， Ｃｒｅｕｓａｔ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｉｃｋｙ ｏｖｅｒｈａｎｇｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｓｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ
ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２００７；１０４：１６０５０−１６０５５）。また、疾病が発生する部位と関係なく、伝達ビヒクル（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）の組成により肝や肺のような特定臓器に高く蓄積されて毒性を誘導する問題点を持っている。

一方、結合組織成長因子（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２）は、マトリックス細胞（ｍａｔｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ）
タンパク質の一つで、細胞の分化、成長、移行（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、ＥＣＭ産生（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）などで重要な役割を果たすと知られている。種々の臓器で繊維症を誘導して臓器の機能に損傷を起こす慢性線維性疾患の場合、線維性疾患が起きる組織でＣＴＧＦが過発現されることが確認され、皮膚の場合にはＣＴＧＦと繊維症の関係が比較的よく研究されている。正常皮膚では、ＣＴＧＦが基礎レベルで発現が抑制されているが、傷が発生する場合、一時的にＣＴＧＦの発現が増加することが観察された。これとは対照的に、ケロイドや局所（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）硬化症の場合、傷の治癒以後にもＣＴＧＦの過発現がずっと維持されることが明らかになり、アンチセンスなどを利用してＣＴＧＦの発現を抑制した場合繊維症およびケロイドの生成が抑制されて、ＣＴＧＦが繊維症および肥大傷跡の生成に重要な役割を果たしているとことが確認された（Ｓｉｓｃｏ Ｍ，Ｋｒｙｇｅｒ ＺＢ，Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ ＫＤ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２） ｍＲＮＡ ｌｉｍｉｔｓ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒｒｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ ２００８；１６：６６１−６７３．ＤＯＩ：ＷＲＲ４１６［ｐｉｉ］）。病理学的には、全長ＣＴＧＦ分子は、結合組織細胞の過多増殖および細胞外マトリックスの過多沈着がある状態に関与すると報告されている。さらにＣＴＧＦは、血管内皮細胞移動および増殖および血管新生に関連した状態とも関連があると当業界に知られている。このような状態と関連した疾病および障害には、例えば、皮膚および重要器官の繊維症、癌、および関連疾病および障害、例えば、全身硬化症、血管形成、アテローム性動脈硬化症、糖尿性腎症および腎臓性高血圧などが挙げられる。また、ＣＴＧＦは、創傷治癒、結合組織修復、骨および軟骨修復にも有用であると報告されている。このような側面から、ＣＴＧＦは、骨粗しょう症、骨関節炎、または、骨軟骨炎、関節炎、骨格障害、肥厚性瘢痕、火傷、血管性肥大症、または、音（ｓｏｕｎｄ）治癒のような障害において、骨、組織または軟骨形成の誘導因子として記載されている（例えば、文献（米国特許第５，８３７，２５８号参照）。

そこで、本発明者等は、インビトロおよびインビボでの効果的な伝達が可能な細胞内への貫通能を持つ新しい構造のＲＮＡｉを誘導する核酸分子を提供しようと鋭意努力した結果、ＲＮＡｉを誘導する二本鎖の核酸分子に含まれている少なくとも１種のヌクレオチドのホスフェートバックボーンをホスホロチオエートで置換させて、親油性化合物をコンジュゲーションさせた場合、インビボでも別途の細胞伝達体なしに優秀な目的遺伝子抑制効率を持ちながらも優秀な細胞内貫通能を持つことを確認して、本発明を完成した。

本背景技術の部分に記載された前記情報は、ただ本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであって、そこに本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとって既知の先行技術を形成する情報を含まないことがある。

米国特許第５，８３７，２５８号

Ｓｉｏｕｄ Ｍ，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ＤＲ Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００３；３１２：１２２０−１２２５ Ｂｏｌｃａｔｏ−Ｂｅｌｌｅｍｉｎ ＡＬ，Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ，Ｃｒｅｕｓａｔ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｉｃｋｙ ｏｖｅｒｈａｎｇｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｓｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２００７；１０４：１６０５０−１６０５５ Ｓｉｓｃｏ Ｍ，Ｋｒｙｇｅｒ ＺＢ， Ｏ‘Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ ＫＤ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２） ｍＲＮＡ ｌｉｍｉｔｓ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒｒｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ ２００８；１６：６６１−６７３．ＤＯＩ：ＷＲＲ４１６［ｐｉｉ］

本発明の目的は、インビトロおよびインビボでの効果的な伝達が可能な細胞内への貫通能を持つ新しい構造のＲＮＡｉを誘導する核酸分子およびその用途を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、標的核酸（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）と相補的な領域を含む第１鎖と、前記第１鎖と相補的結合を形成する第２鎖で構成されるＲＮＡｉ誘導用二本鎖核酸分子において、前記核酸分子に含まれている少なくとも一つのヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートまたは、ホスホロジチオエートで置換されていて、親油性化合物が結合されていることを特徴とする、細胞内貫通能を持つＲＮＡｉ誘導用核酸分子を提供する。

さらに本発明は、前記核酸分子を含有する遺伝子発現抑制用組成物を提供する。

さらに本発明は、前記核酸分子を細胞内導入させる工程を含む細胞内目的遺伝子の発現抑制方法を提供する。

さらに本発明は、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）をコードするｍＲＮＡを目的核酸とする前記核酸分子を含有するＣＴＧＦ関連疾病または障害の治療または予防用医薬組成物を提供する。

さらに本発明は、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）をコードするｍＲＮＡを目的核酸とする前記核酸分子を含有する医薬組成物を投与することを含む、ＣＴＧＦ関連疾病または障害の治療または予防方法を提供する。
さらに本発明は、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）をコードするｍＲＮＡと相補的な領域を含む第１鎖と、前記第１鎖と相補的結合を形成する第２鎖で構成されるＲＮＡｉ誘導用二本鎖核酸分子において、前記核酸分子に含まれている１〜３１個のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートまたは、ホスホロジチオエートで置換されていて、親油性化合物が結合されていて、前記ＲＮＡｉを誘導する二本鎖の核酸分子は、配列番号１４９および１５０の塩基対、配列番号１５１および１５２の塩基対、および配列番号１５３および１５４の塩基対で構成された群から選択された塩基対を持つことを特徴とする、細胞内貫通能を持つＣＴＧＦ発現抑制用核酸分子を提供する。

本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からより一層明白になる。

表１〜表３のＣＴＧＦを標的にする２４種の配列に対するｓｉＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ｌａｓｉＲＮＡ構造体の遺伝子抑制効率を示したグラフである。 コレステロール改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に係るｌａｓｉＲＮＡの細胞内吸収効率増加を示した蛍光顕微鏡観察写真である。 本発明に係るコレステロールおよびＰＳ改変されたｌａｓｉＲＮＡの構造を示した（下線：ＯＭｅ改変、＊：ＰＳ改変、Ｃｈｏｌ：コレステロール、Ｃｙ３：Ｃｙ３）。 ホスホロチオエート（ＰＳ）改変に係るｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡの細胞内の吸収効率増加を示した蛍光顕微鏡観察写真である。 ホスホロチオエート（ＰＳ）改変に係るｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡの遺伝子減少効果を比較したグラフである（各グラフは、３回繰り返し実験の平均とＳＤを示した）。 ＭｙＤ８８を標的にするｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ７の構造を示した（下線：ＯＭｅ改変、＊：ＰＳ改変、Ｃｈｏｌ：コレステロール）。 種々の細胞貫通性（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ）ｌａｓｉＲＮＡ（ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ）の遺伝子抑制効率を比較したグラフである（括弧の中のＣＴＧＦまたはＭｙＤ８８は、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡの標的遺伝子を示した）。 親油性化合物改変、すなわち疏水性改変に係る本発明に係る核酸分子の遺伝子抑制効率を示したグラフである。 アンチセンス鎖の長さに係る本発明に係る核酸分子の遺伝子抑制効率を示したグラフである。 ＰＳ２改変の構造である。 ホスフェートバックボーン改変に係る本発明に係る核酸分子の遺伝子抑制効率を示したグラフである。 本発明に係る核酸分子のインビボ標的遺伝子抑制効率を示したグラフである。 本発明に係る核酸分子の濃度別インビボ標的遺伝子抑制効率を示したグラフである。 本発明に係る核酸分子の期間別標的遺伝子抑制効率を示したグラフである。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明の詳細な説明などにおいて使用される主な用語の定義は、下記の通りである。

本願において「ＲＮＡｉ」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同である配列を持つ鎖とこれと相補的な配列を持つ鎖で構成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞等に導入して、標的遺伝子ｍＲＮＡの分解を誘導することで標的遺伝子の発現を抑制するメカニズムを意味する。

本願において「ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」とは、配列特異的に効率的な遺伝子発現抑制（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を媒介する短い二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を意味する。

本願において「アンチセンス鎖（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）」とは、関心が
ある標的核酸に実質的に、または１００％相補的なポリヌクレオチドであり、例えば、ｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）、ｍＲＮＡでないＲＮＡ配列（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｈｎＲＮＡ）または、コードまたは、非コードＤＮＡ配列と全体として、または一部として相補的であってもよい。本願において、アンチセンス鎖及びガイド鎖は、交換されて用いられる。

本願において「センス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）」とは、標的核酸と同じ核酸配列を持つポリヌクレオチドであり、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡでないＲＮＡ配列（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｈｎＲＮＡ）または、コードまたは、非コードＤＮＡ配列と全体として、または一部として同じポリヌクレオチドをいう。

本願において「遺伝子」とは、最広義の意味と見なされるべきであり、構造タンパク質または調節タンパク質を暗号化することができる。この時、調節タンパク質は転写因子、熱ショックタンパク質またはＤＮＡ／ＲＮＡ複製、転写及び／または翻訳に係るタンパク質を含む。また、本発明において、発現抑制の対象になる目的遺伝子は、ウイルスゲノムに内在するもので、動物遺伝子で統合されたり染色体外の構成要素として存在することができる。例えば、目的遺伝子はＨＩＶゲノム上の遺伝子であってもよい。この場合、ｓｉＲＮＡ分子はほ乳動物細胞内ＨＩＶ遺伝子の翻訳を不活性化させるのに有用である。

一観点において、本発明は、標的核酸と相補的な領域を含む第１鎖と、前記第１鎖と相補的結合を形成する第２鎖で構成されるＲＮＡｉ誘導用二本鎖核酸分子において、前記核酸分子に含まれている少なくとも一つのヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートまたは、ホスホロジチオエートで置換されていて、親油性化合物が結合されていることを特徴とする、細胞内貫通能を持つＲＮＡｉ誘導用核酸分子に関する。この時、第１鎖は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に対応して、第２鎖は、センス鎖に対応する。

本発明において、前記ＲＮＡｉを誘導する二本鎖の核酸分子で第１鎖は１６〜１２１ｎｔ、好ましくは２４〜１２１ｎｔの長さであってもよい。
第１鎖は、目的核酸と相補的な一部領域を含み、この時、目的核酸と相補的な一部領域を含む領域の長さは１６〜３１ｎｔ、１９〜３１ｎｔ、または、１９〜２１ｎｔであることを特徴とする。なお、第２鎖は、１３〜２５ｎｔ、１３〜２１ｎｔ、または、１６〜２１ｎｔの長さを持つことを特徴とする。

本発明において、好ましくは、前記ＲＮＡｉ誘導用二本鎖核酸分子は、標的核酸と相補的な一部領域を含む２４〜１２１ｎｔ長さの第１鎖と、前記第１鎖の標的核酸と相補的な一部領域と相補的結合を形成する領域を持つ１３〜２１ｎｔ長さの第２鎖で構成されることを特徴とする。

本発明の一実施例では、このような構造を持つ核酸分子をＣＴＧＦを標的にする２４種の配列に対し作製した結果、既存のｓｉＲＮＡに比べて全般的にさらに高い遺伝子発現抑制効率を示した傾向性があることを確認した。本発明者等は、前記のように第２鎖と相補的結合を形成しない長い一本鎖領域を持つＲＮＡｉを誘導する二本鎖の核酸分子、すなわち長いアンチセンス鎖を持つｓｉＲＮＡを‘ｌａｓｉＲＮＡ’と命名した。

ｌａｓｉＲＮＡは、既存のｓｉＲＮＡより短い二本鎖の長さを持ちながらも高い遺伝子抑制効率を持つ新規な構造の非対称形ＲＮＡｉ誘導構造である。また、長いオーバーハング構造のアンチセンスの役割に起因して、ｓｉＲＮＡやａｓｉＲＮＡに比べて増加した最大遺伝子抑制効率を持って、既存の構造に代わって治療剤開発に利用されると期待されて
いる。また、他の構造に比べてさらに長いオーバーハングの長さを持って、オーバーハングの様々な改変にも高い活性を維持する特性があって、比較的多くの化学的改変の自由な導入が可能で、多様な機能を追加できる特徴がある。

本発明において、前記第１鎖の標的核酸と相補的な一部領域の長さは、１９〜２１ｎｔであることを特徴とする。従って、前記第１鎖は第２鎖と結合しない一本鎖領域を含み、好ましくは、第１鎖は一本鎖領域にアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＤＮＡザイムで構成された群から選択される核酸オリゴヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする。

本発明において、前記第１鎖中、第２鎖と相補的結合を形成しない一本鎖領域は、直接または、リンカーによって前記第２鎖と相補的結合を形成する領域に連結され、この時、リンカーは、化学的リンカー（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｎｋｅｒ）であることを特徴とする。この時、前記化学的リンカーは、これに制限されるものではないが、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｉｅｔｙ）、ＰＮＡ（ＰＮＡ ｍｏｉｅｔｙ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｉｅｔｙ）、ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）または、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｉｅｔｙ）であることを特徴とする。

また、本発明において、前記第１鎖は、一本鎖領域に前記標的核酸と相補的な配列を追加で含有するか、相補的でない配列を含有することを特徴とし、相補的な場合において、本発明に係る核酸分子の二本鎖領域、即ちｓｉＲＮＡの標的核酸に相補的な領域と連続的に位置してもよく、遠く離れて位置してもよい。同様に、ｓｉＲＮＡが標的とする配列と前記一本鎖領域のリボザイムやＤＮＡザイムが標的とする配列は、連続的に位置してもよく、遠く離れて位置してもよい。また、前記第１鎖の一本鎖領域が前記ｓｉＲＮＡの標的遺伝子と相補的な配列を持つ場合において、一本鎖領域に含まれる配列がアンチセンスＤＮＡまたは、アンチセンスＲＮＡならば、その配列とｓｉＲＮＡの標的遺伝子の配列が、約７０〜８０％以上、好ましくは約８０〜９０％以上、さらに好ましくは約９５〜９９％以上相補的であることを特徴とし、一本鎖領域がリボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅならば、その配列とｓｉＲＮＡの標的遺伝子の配列が、約５０〜６０％以上相補的であることを特徴とする。

また、前記一本鎖領域は、５〜１００ｎｔであってもよい。５ｎｔ以下であれば、遺伝子発現抑制効率の増加効果が充分でなく、１００ｎｔ以上の場合、ＲＮＡ分子の合成効率が低下する。また、前記一本鎖領域は、好ましくは９〜１００ｎｔであり、または、５０ｎｔ以下の長さを持つことを特徴とし、さらに好ましくは１０〜１５ｎｔの長さを持つことを特徴とする。

本発明において、前記第１鎖で前記一本鎖領域を構成する塩基中少なくとも一つ以上が巨大（ｂｕｌｋｙ）塩基類似体（ｂａｓｅ ａｎａｌｏｇ）を含むことを特徴とする。フェニル基を持つデオキシアデノシン（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）誘導体のような巨大塩基類似体が拡張配列に含まれていれば、この拡張配列と相補的に結合するｍＲＮＡ鎖は巨大塩基類似体の位置で切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）が起きることになる。このような切断を誘導する巨大塩基類似体であれば制限なしに本発明に含まれてもよい。

本発明では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を標的ｍＲＮＡ配列と相補的に長く伸ばした核酸構造体の場合、５’末端の部分は、ＲＮＡｉ機序として作用し、同時に３’末端の部分は、アンチセンスメカニズムとして作用するか、５’末端ｓｉＲＮＡ部分を標的ｍＲＮＡに誘導する作用をすると予想した。この時、アンチセンス３’末端のｍＲＮＡに相補的な配列がＤＮＡの場合には、リボヌクレアーゼＨ依存的ｍＲＮＡ切断を誘導することがで
きる。また、アンチセンス３’末端の一本鎖領域を構成する塩基中少なくとも一つ以上が巨大塩基類似体を含むか、一本鎖領域がｍＲＮＡと結合してバルジ（ｂｕｌｇｅ）構造を形成する場合であっても切断を誘導できると予想した。また、第１鎖の一本鎖領域にリボザイムやＤＮＡザイムを導入した核酸分子の場合には相乗的切断（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）を誘導できると予想した。

１９〜２１ｎｔ長さのアンチセンス鎖及び１３〜１６ｎｔの長さのセンス鎖で構成されたｓｉＲＮＡ分子として、アンチセンス鎖の５’方向の末端が平滑末端であるｓｉＲＮＡ構造体は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖によるオフ−ターゲット効果の発生や他のＲＮＡｉ機序を阻害することなく優秀な標的遺伝子発現抑制効率を提供するもので（大韓民国公開特許１０−２００９−００６５８８０）、このようなｓｉＲＮＡに本発明に係る構造を適用させる場合、オフ−ターゲット効果を最小化しながら第１鎖の一本鎖領域に含まれる核酸オリゴヌクレオチドによる前記のような効果を同時に示すことができる。本願において「オフ−ターゲット効果」とは、本来ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖と相補的な配列を持つｍＲＮＡの分解を誘導して、当該ｍＲＮＡの遺伝子発現を抑制する効果を得るために用いられるものであるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡのセンス鎖によって他のｍＲＮＡの分解が発生する場合、センス鎖によって発生するこのような予想できない他のｍＲＮＡの分解乃至当該遺伝子の発現抑制効果、及びｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が誤ったターゲットとペアリングして他のｍＲＮＡの分解が発生するアンチセンス鎖による他のｍＲＮＡの分解が発生する当該遺伝子の発現抑制効果を全て含む。

本発明の一実施例では、コレステロール改変およびＰＳ改変を行って、コレステロールの結合がｌａｓｉＲＮＡの細胞貫通能を高めることが確認されたが、十分な数のＰＳが導入されない場合、コレステロールだけでは別途の細胞伝達体なしに効果的な標的遺伝子抑制を誘導するのに充分でないことを確認した。この時、ＰＳ改変の導入は、その導入個数に比例して細胞貫通能を高めることが明らかになったが、ＰＳ改変が多すぎる場合にはｌａｓｉＲＮＡがＲＮＡｉによる遺伝子抑制を誘導できないと確認された。したがって、細胞とともにインキュベートした後、遺伝子抑制効率の比較を介して最適化されたＰＳ改変の個数を確立した。すなわち、本発明に係る核酸分子は、１〜４８個、好ましくは１〜３１個、より好ましくは２〜１７個、さらに好ましくは４〜１７個、または、１２〜１７個のヌクレオチドのポスポペイトバックボーンがホスホロチオエートに置換されていることを特徴とする。

この時、前記核酸分子中第１鎖に含まれているヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートに置換されていることを特徴とし、また、前記第１鎖中目的核酸と相補的な領域以外の領域のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートに置換されていることを特徴とする。この時、第１鎖に含まれている１〜３１個、好ましくは１〜１７個、より好ましくは２〜１７個、さらに好ましくは４〜１７個、または、１２個〜１７個のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートに置換されていることを特徴とする。なお、前記核酸分子中第２鎖に含まれている１〜２１個、好ましくは１〜１７個、より好ましくは２〜１７個、さらに好ましくは４〜１７個、または、１２個〜１７個のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートに置換されていることを特徴とする。

この時、本発明の他の実施例では、ＰＳの代わりに図１０のようなＰＳ２改変を利用してもＰＳよりは減少した遺伝子抑制効能を示すが、従来ｓｉＲＮＡ構造に比べて向上した遺伝子抑制効率を持ってくることを確認することができた。そこで、本発明に係る核酸分子は、一つ以上のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロジチオエートに置換されていることを特徴とし、この時、好ましくは１〜４８個、より好ましくは１〜３１個、より一層好ましくは２〜１７個、さらに好ましくは４〜１７個、または、１２〜１７
個のヌクレオチドのホスフェートバックボーンが置換されていることを特徴とし、この時、第１鎖の１〜３１個、好ましくは１〜１７個、より好ましくは２〜１７個、さらに好ましくは４〜１７個、または、１２個〜１７個のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロジチオエートに置換されているか、第２鎖の１〜１７個、より好ましくは２〜１７個、さらに好ましくは４〜１７個、または、１２個〜１７個のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロジチオエートに置換されていることを特徴とする。

本発明において、親油性化合物は、疏水性改変をもたらすものであり、例えば、脂質、親油性ペプチドまたは親油性タンパク質などを利用することができる。この時、脂質としてはこれに制限されるものではないか、コレステロール、トコフェロールおよび、ステアリン酸、パルミチン酸などのような炭素数１０以上の長鎖脂肪酸などを利用することを特徴とする。なお、これに制限されるものではないが、前記コレステロールなどの親油性化合物は、前記核酸分子の第１鎖または第２鎖の５’末端または、３’末端に結合されてもよい。

本発明において、前記標的核酸は、これに限定されるものではないかが、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）、コードＤＮＡ配列及び非コードＤＮＡ配列等であってもよい。

本発明の核酸分子は、一般に合成されたものであるが、これに限定されない。即ち、本発明において、前記核酸分子は、化学的または、酵素学的に合成されたものであってもよい。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、標準組換え技法によって天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）遺伝子から誘導することができるが、この場合、発現を変化させる標的遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部分とヌクレオチド配列水準で実質的に相補的であることを特徴とする。

そこで、本発明に係る核酸分子は、化学的改変を含むことを特徴とする。前記化学的改変において、前記核酸分子に含まれる少なくとも１種のヌクレオチドのリボースの２’位置のヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基、及びアミノ基中のいずれか一つに置き換えられることを特徴とするが、これに制限されることなく核酸分子の伝達能を高めるなら、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−Ｒ、−Ｒ’ＯＲ、−ＳＨ、−ＳＲ、−Ｎ_３及びＣＮ（Ｒ＝アルキル基、アリール基、アルキレン基）中いずれか一つに置き換えられてもよい。また、前記化学的改変において、少なくとも１種のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがアルキルホスホネート型（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ｆｏｒｍ）、ホスホロアミデート型（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ ｆｏｒｍ）、及びボラノホスフェート型（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｏｒｍ）中いずれか一つに置き換えられてもよい。また、前記化学的改変は、前記核酸分子に含まれる少なくとも１種のヌクレオチドがＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、モルフォリノ（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）中いずれか一つに置き換えられることを特徴とし、前記化学的改変は、前記核酸分子が、脂質、細胞貫通性ペプチド及び細胞標的リガンドで構成された群から選択される一つ以上と結合することを特徴とする。

なお、本発明に係る核酸分子は、既にオリゴヌクレオチドを細胞内に効果的に伝達するものと知られている、リポソーム、陽イオン性ポリマー、抗体、アプタマー、ナノ粒子などの種々の伝達体および伝達方法と共に用いられて効率的にインビトロおよびインビボ伝達のために用いることができる。

一方、本発明の一実施例では、別途の伝達体がなくともＰＢＳのような溶液に溶かして
注射することだけでインビボで標的部位に９０％以上の高い遺伝子抑制効率を示して、本発明に係る核酸分子が別途の剤形化過程がなくとも注射剤形態の薬品に直ちに開発が可能であることを確認することができた。

本発明の実施例は、本発明に係るＲＮＡｉを誘導する核酸分子が効率的に目的遺伝子発現抑制効果を持っていることを提示しており、また他の観点において、本発明は、前記ＲＮＡｉ誘導用核酸分子を含有する遺伝子発現抑制用組成物に関する。この時、前記核酸分子は前記細胞伝達体が結合された核酸複合体の形態で含まれても良い。

本発明の実施例では、目的遺伝子としてＣＴＧＦをターゲットとするｓｉＲＮＡに対し本発明に係る核酸分子を適用させてその抑制効率が優秀で貫通能が優秀であることを確認したが、本発明に係る核酸分子構造は、その他の標的遺伝子をターゲットにする核酸分子を提供した場合にも同様の結果が得られることは、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者には自明である。

一方、前記遺伝子発現抑制用組成物は遺伝子発現抑制用キットの形態で提供できる。遺伝子発現抑制用キットは瓶、タブ（ｔｕｂ）、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、エンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、チューブ、アンプル（ａｍｐｏｕｌｅ）等のような形態であってもよく、これらは部分的にまたは全体的にプラスチック、ガラス、紙、ホイル、ワックスなどから形成される。容器は、最初は容器の一部であるか、または機械的、接着性、またはその他の手段によって、容器に付着できる、完全にまたは部分的に分離可能な栓を取り付けることができる。容器はまた注射針によって内容物に接近できる、ストッパーが取り付けられる。前記キットは外部パッケージを有することができ、外部パッケージは構成要素の使用に関する使用説明書を含んでもよい。

また他の観点において、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を利用して細胞内標的遺伝子の発現を抑制させる方法に関する。即ち、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を細胞内に導入させる段階を含む細胞内標的遺伝子の発現抑制方法に関する。

本発明において、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子の第１鎖は、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的であることを特徴とする。

本発明において、前記標的遺伝子は内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）遺伝子であるか導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）であってもよい。

この時、本発明に係る核酸分子は、必ずしも合成ｓｉＲＮＡに制限されなく、細胞内で発現ベクター等を利用して発現するｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡにも適用可能な長所がある。即ち、本発明に係る核酸分子は、細胞内で発現させることによって標的遺伝子の発現を抑制させることができる。従って、また他の観点において、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を細胞内で発現させる段階を含む細胞内標的遺伝子の発現抑制方法に関する。

一方、本発明に係る核酸分子は、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）をコードするｍＲＮＡを目的核酸にしてもよい。本発明の一実施例では、本発明に係る構造の核酸分子を導入することによってＣＴＧＦ発現を抑制することを確認した。従って、また他の観点において、本発明は、前記核酸分子を含有するＣＴＧＦ関連疾病または障害の治療または予防用医薬組成物に関する。さらに本発明は、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）をコードするｍＲＮＡを目的核酸とする前記核酸分子を含有する医薬組成物を投与することを含む、ＣＴＧＦ関連疾病または障害の治療または予防方法に関する。

それだけでなく、局所疾患に対する治療剤以外にも本発明に係る核酸分子は既に知らされた様々な細胞特異的な抗体、アプタマー、リガンドなどを共に用いて、望む部位でだけ遺伝子抑制効果を示す遺伝子調節治療剤の開発が可能であると期待される。

本発明に係る医薬組成物は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を単独で含んだり一つ以上の医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含んで医薬組成物で提供でき、前記核酸分子は疾患及びこれの重症程度、患者の年令、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間等により適切な医薬的に有効な量で医薬組成物に含まれる。

前記において「医薬的に許容される組成物」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される時、通常胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似する反応を起こさない組成物のことをいう。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、燐酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。

前記医薬組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤等をさらに含んでもよい。また、本発明の医薬組成物は、ほ乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように当業界に公示された方法を使って、剤形化される。剤形は滅菌注射溶液などの形態でありうる。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

≪実施例１：ＣＴＧＦをターゲットとしたＲＮＡｉを誘導する二本鎖の核酸分子のスクリーニング≫
効果的な自己伝達（ｓｅｌｆ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）構造のための種々の化学的改変の導入に先立ち、ＣＴＧＦを標的にする高効率のＲＮＡｉを誘導する二本鎖の核酸分子を確保するために、ＣＴＧＦに対する５０種の標的配列をデザインした後、スクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を進行した。

ｌａｓｉＲＮＡと既存ＲＮＡｉ誘導構造体とのＣＴＧＦ遺伝子抑制効率を比較するために、表１〜表３のように、各塩基配列を標的にするｓｉＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ｌａｓｉＲＮＡ構造体を合成した。表１〜表３はＣＴＧＦに対する２４種の配列に対するｓｉＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ｌａｓｉＲＮＡ構造体の塩基配列情報である（大文字：ＲＮＡ、小文字：ＤＮＡ）。各塩基配列および構造のＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現抑制効果をテストするために、各構造をＨａＣａＴ（ＡＴＣＣ）に１０ｎＭでトランスフェクションした後、リアルタイムＰＣＲでＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現程度を測定した。

すなわち、ＨａＣａｔ細胞を１００ｍｍペトリ皿に１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。Ｈａｃａｔの場合、トランスフェクションする直前に、１２ウェルプレートに８×１０^４個の細胞を播種した。一方、前記ｓｉＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ｌａｓｉＲＮＡの場合、１×ｓｉＲＮＡデュプレックスバッファー（ｄｕｐｌｅｘ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に適切な濃度で希釈して９０℃で２分、３７℃で１時間インキュベートした。アニーリングされたｓｉＲＮＡは、１０％ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した後、ＥｔＢｒで５分染色してＵＶトランスイルミネーターを介してバンドを確認した。これらは、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で提供する取扱説明書に基づいてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後、２４時間後にｍＲＮＡレベルを測定した。

この時、トランスフェクション後、Ｉｓｏｌ−ＲＮＡ溶解試薬（ｌｙｓｉｓ ｒｅａｇｅｎｔ）（５ＰＲＩＭＥ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、そのうち５００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡ合成に用いた。ｃＤＮＡは、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して提供されたプロトコルに基づいて合成された。合成されたｃＤＮＡは、希釈を介して濃度を低くした後、ステップワンリアルタイムＰＣＲシステム（ｓｔｅｐ ｏｎｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して提供されたプロトコルに基づいて、定量的なリアルタイムＰＣＲに利用した。標的遺伝子は、遺伝子に特異的なプライマーと共にパワーＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して確認した。実験に用いられたプライマー塩基配列は次のとおりである。

ＧＡＰＤＨ−ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＧＡＧ ＴＣＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＴＴＧ ＧＴＣ ＧＴ
−３’（配列番号１４５）
ＧＡＰＤＨ−ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＣ ＧＴＴ ＣＴＣ ＡＧ
−３’（配列番号１４６）
ＣＴＧＦ−ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＣＡＡ ＧＧＧ ＣＣＴ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＧＡ ＣＴ−
３’（配列番号１４７）
ＣＴＧＦ−ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＡＣＧ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＣＴ ＴＧＣ ＡＧ−
３’（配列番号１４８）

２４個の塩基配列に対するスクリーニングの結果、図１に示したように、合計２４個の塩基配列中１４個の配列でｌａｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡに比べて増加した活性（ｌａｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡ対比２０％以上増加した遺伝子抑制効率を示した場合）を持つことが確認されて、５種の配列ではｓｉＲＮＡがｌａｓｉＲＮＡに比べてさらに高い遺伝子抑制効率を示すことが明らかになり、ｌａｓｉＲＮＡが既存のｓｉＲＮＡに比べて全般的にさらに高い遺伝子発現抑制効率を示した傾向性を確認することができた。

特に、９０％以上の遺伝子抑制効率を示すｓｉＲＮＡとｌａｓｉＲＮＡに対するＩＣ５０測定の結果、９番と１６番塩基配列を標的にするｌａｓｉＲＮＡが最も低いＩＣ５０を持つことが確認されたが、この中で改変と自己伝達実験のための最終候補群として９番塩基配列を選び、これは下記の表４のとおりである。

≪実施例２：本発明に係る核酸分子の製造および細胞内取り込み収率の測定≫
２−１：コレステロール改変に係る影響
先に、コレステロール改変が、ｌａｓｉＲＮＡの伝達に及ぼす影響を調べるために、ｌａｓｉＲＮＡセンス鎖、すなわち第２鎖の５’末端をｃｙ３で標識した後、コレステロール有無に係る取り込み差を蛍光顕微鏡で確認した。すなわち、ＨｅＬａ細胞にｃｙ３で標識したｌａｓｉＲＮＡまたはｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ構造体を１μＭでインキュベートした後、３時間後に蛍光顕微鏡で観察して細胞内に伝達された程度を比較した。

先に、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を１００ｍｍペトリ皿に１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。

コレステロール改変させたｌａｓｉＲＮＡは、それぞれの一本鎖Ａｃｃｅｌｌ ｓｉＲＮＡデリバリー培地（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ Ａｃｃｅｌｌ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｅｄｉａ）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に適切な濃度で希釈して用い、コレステロールが適用された一本鎖は、アニーリング前に９０℃で２０〜３０秒間インキュベートした後用いた。センス鎖とアンチセンス鎖を混合した後、９０℃で３０秒、３７℃で１時間インキュベートして、アニーリングされたｓｉＲＮＡは、１０％ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した後、ＥｔＢｒで５分染色後、ＵＶトランスイルミネーターを介してバンドを確認した。

インキュベーションテストのために、ｌａｓｉＲＮＡを処理する２４時間前にカバーグラスボトムディッシュ（Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ−ｂｏｔｔｏｍ ｄｉｓｈ）（ＳＰＬ）に２×１０^５個のＨｅＬａ細胞を播種した。準備された皿の培養培地除去後、２ｍＬの１×ＤＰＢＳで二回洗浄した。３７℃ウォーターバスで予め暖めておいたＡｃｃｅｌｌ ｓｉＲＮＡデリバリー培地（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１００μＬに希釈して準備しておいたｓｉＲＮＡを入れて培養した。３時間後、Ａｃｃｅｌｌ培地を除去して１×ＤＰＢＳで二回洗浄した後、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４３（Ｓｉｇｍａ）（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ｇｉｂｃｏ）中）で３７℃で１０分間インキュベートして核を染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ除去後、１×ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で二回洗浄した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地に入れて顕微鏡（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ−Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１、ｓｏｆｔｗａｒｅ−ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）で細胞の蛍光を観察した。

その結果、図２に示したように、コレステロール改変によるｌａｓｉＲＮＡの細胞内への吸収効率を確認した結果、コレステロールがない場合には細胞内でｃｙ３蛍光がほとんど観察されなかったが、ｌａｓｉＲＮＡにコレステロールを結合したｌａｓｉＲＮＡ−ｃｈｏｌの場合には非常に強い蛍光を示すことが分かった。

これはｌａｓｉＲＮＡ構造がコレステロール改変を介して細胞内伝達（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）が増加することを示した。

２−２：ＰＳ改変に係る影響
追加的に、ホスホロチオエートを直接ｓｉＲＮＡに導入する改変を行う場合、ｌａｓｉＲＮＡの取り込み効率を増加させるのか確認するために、コレステロールを結合させたｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖、すなわち第１鎖の３’オーバーハングにＰＳ改変を導入して、ＰＳ改変に係るｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡの取り込み効率変化をテストした。ＨｅＬａ細胞にｃｙ３で標識したｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ（Ｎ）構造体を１μＭでインキュベートした後、３時間後に蛍光顕微鏡で観察して細胞内に伝達された程度を比較した。構造体の間の細胞貫通能の正確な比較のために、ｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ０が最小限の蛍光を見せる条件をセット後、他の構造体の蛍光強度を比較した。

これのために図３のように、Ｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡのアンチセンス３’末端を始め、０、４、７、１２、１７のＰＳ改変を導入した後、ＨｅＬａ細胞と共にインキュベートまたはトランスフェクションして、実施例２−１のように蛍光顕微鏡でＰＳ改変の個数に係る伝達効率の差を観察した。図３で、下線および赤色はＯＭｅ改変を、＊はＰＳ改変を、Ｃｈｏｌはコレステロールを、Ｃｙ３はＣｙ３蛍光物質を示す。

その結果、図４に示したように、ＰＳ改変がないｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ０の場合ＨｅＬａ細胞で蛍光がほとんど観察されなく、他のサンプルに比べて低い取り込み効率を示すことが確認された。

なお、ｌａｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖、すなわち第１鎖にＰＳ改変が増加するほど明るい蛍光を示すことが確認され、全サンプル中ＰＳが各１２、１７個の改変されたｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ１２、ｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ１７が最も明るい蛍光を示したことが確認されて、ｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡにＰＳ改変個数を増加させるほど内部化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）されたｌａｓｉＲＮＡの量が増加することが確認された。

≪実施例３：ＣＴＧＦ発現抑制効率測定≫
実施例２でＣｙ３−標識化ｌａｓｉＲＮＡを利用した内部化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａ
ｔｉｏｎ）実験の結果、ｌａｓｉＲＮＡ構造にコレステロールとＰＳ改変を直接導入して伝達ビヒクルや追加的な試薬がなくともｌａｓｉＲＮＡの効果的な細胞内伝達が可能であることが確認された。しかし、ｓｉＲＮＡに種々の化学的改変を導入する場合、ｓｉＲＮＡの活性を多少減少させたり、改変によりｓｉＲＮＡの活性が急激に減少すると知られているが、各改変がｌａｓｉＲＮＡの活性に及ぼす影響を調べるために、多様な構造のｌａｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした後、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの発現変化を測定して、各改変がｌａｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制に及ぼす影響を測定した。

ＰＳ改変がｌａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率に及ぼす影響を確認するために、様々な構造のＰＳ改変ｌａｓｉＲＮＡ［ｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ（Ｎ）］をＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした後、ＣＴＧＦ遺伝子の発現抑制効率を測定した。すなわち、ＨｅＬａ細胞にｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ（Ｎ）構造体を１０ｎＭでトランスフェクションした後、４８時間後にリアルタイムＰＣＲでＣＴＧＦ ｍＲＮＡの発現程度を測定した。

次に、実験時間２４時間前に２４ウェルプレートに２．５×１０^４個のＨｅＬａ細胞を播種した後、プロトコルに基づいて、リポフェクタミン２０００を利用して、各ｌａｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。この後４８時間の間、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した後、実施例１の方法によりｍＲＮＡレベルの発現を測定した。

その結果、図５に示したように、アンチセンス鎖にＰＳ改変が増加するにつれて遺伝子抑制効率が減少する傾向を示し、アンチセンスに１２個以上のＰＳ改変を導入した場合、若干の発現抑制活性の減少が観察された。アンチセンスに１７個の改変を導入したｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ１７の場合、遺伝子抑制効率が急激に減少して、ＣＴＧＦに対する発現抑制効果をほとんど示さないことが確認されてアンチセンスにＰＳは最大１７個の以下で用いることが好ましくアンチセンス鎖にそれ以上のＰＳ改変は自己伝達のための改変では適さないことを確認することができた。図５で、各グラフは、３回繰り返し実験の平均とＳＤを示した。

追加的に、ＰＳ改変の増加は、ｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡの自己細胞伝達効率を増加させるが、同時にその程度によりｌａｓｉＲＮＡの発現抑制活性を減少させる問題点がある。ビヒクルなしで最適の発現抑制を誘導する改変構造を確立するために、多様な個数のＰＳ改変を持つｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ（Ｎ）構造をＨｅＬａと共インキュベートした後、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡレベルを測定して遺伝子抑制効率を比較した。この時、０．１μＭ、０．３μＭ、および１μＭの濃度で各ｌａｓｉＲＮＡを処理し、ＭｙＤ８８を標的にするｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ７（図６、赤色：ＯＭｅ改変、＊：ＰＳ改変、Ｃｈｏｌ：コレステロール）を対照群として共に用いた。すなわち、ＨｅＬａ細胞にＣＴＧＦまたはＭｙＤ８８を標的にするｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ（Ｎ）構造体を共にインキュベートした後、４８時間後にリアルタイムＰＣＲでＣＴＧＦ ｍＲＮＡの発現程度を測定した。

その結果、図７に示したように、ｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ４の場合には最も高い濃度である１μＭでも約５５％程度の遺伝子抑制効率しか示すことができないことが明らかになり、ｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ７、ｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ１２の場合、１μＭでＣＴＧＦの発現を約９５％以上抑制することを確認することができた。より正確な遺伝子抑制効率比較のために、さらに低い濃度で各構造体をインキュベートした後、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡレベルを測定した結果では、ＰＳ１２が低い濃度でも最も効率的にＣＴＧＦ遺伝子の発現を抑制することが明らかになった。ｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ１７は、トランスフェクションした場合と同様に高い濃度（１μＭ）でインキュベートした場合でも５０％程度の遺伝子発現抑制効果しか持つことができないことが確認さ
れて、導入するＰＳ変形の数が多すぎるよりは伝達の増加とｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙの減少に係る適当なＰＳ改変個数の最適化が必要であることを確認することができた。また、ＭｙＤ８８を標的にするｃｈｏｌ−ｌａｓｉＲＮＡ−ＰＳ７の場合にはＣＴＧＦに対する遺伝子抑制効率が全く現れないので、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ構造体による遺伝子発現抑制が塩基配列特異的に起きることを確認することができた。

≪実施例４：他の親油性化合物改変に係る細胞内取り込み収率の測定≫
コレステロール以外に他の親油性化合物改変（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（すなわち、疎水性化合物改変（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ））を用いる場合の影響を調べるために、次の配列でサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）を目的遺伝子にした本発明に係るｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｌａｓｉＲＮＡ）を製造した。この時、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ−１はコレステロールが結合されたもので、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ−２はコレステロールの代わりに該当位置にトコフェノールを結合したもので、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ−３はコレステロールの代わりにセンス鎖の５’位置にステアリン酸を結合したものである。

＜ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）３１ｍｅｒ＞
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ３１ｎｔ：５’ＵＧＡ
ＡＡＡＵＧＵＵＧＡＵＣＵＣＣＵＵＵＣＣＵＡＡＧＡ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｔ ３’（配列番号
１６９）
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）Ｓｅｎｓｅ：５’ＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵ＊Ｃ＊Ａ＊ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．３’（配列番号１７０）
下線：ＯＭｅ改変、＊：ＰＳ（ホスホロチオエート結合）

Ａ５４９細胞株（ＡＴＣＣ）に前記ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ−１、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ−２、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ−３をそれぞれ３００ｍＭで実施例２と同様にインキュベートした後、２４時間後にリアルタイムＰＣＲでサバイビンｍＲＮＡの発現程度を測定した。各２回繰り返し実験の平均とＳＤを図８に示した。

トランスフェクション後、Ｉｓｏｌ−ＲＮＡ溶解試薬（５ＰＲＩＭＥ）を用いて全ＲＮＡを抽出して、そのうちの５００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡ合成に用いた。ｃＤＮＡは、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して提供されたプロトコルに基づいて合成された。合成されたｃＤＮＡは、希釈を介して濃度を低くした後、ステップワンリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して提供されたプロトコルに基づいて、定量的なリアルタイムＰＣＲに利用した。標的遺伝子は、遺伝子に特異的なプライマーと共にパワーＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ）を利用して確認した。実験に用いられたプライマー塩基配列は下記のとおりである。

Ｓｕｒｖｉｖｉｎ
Ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＧＣＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＴ−３’（配列
番号１７２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＡＣ ＴＴＴ ＣＡＡ ＧＡ−３’（配列
番号１７３）

その結果、図８に示したように、コレステロールを他の疏水性改変を誘導した場合にも高い効率で標的遺伝子を抑制する可能性があることを確認した。また、ステアリルの場合、センス鎖の５’末端に結合させたのにも係らず高い遺伝子抑制効率を示して本発明に係る核酸分子は、様々な位置に疏水性改変、すなわち親油性化合物を結合させた場合にも目的とする効果を得ることができることを確認した。

≪実施例５：アンチセンス鎖の長さに係る標的遺伝子抑制効率調査≫
本発明に係る核酸分子の第１鎖の長さに係る標的遺伝子抑制効率を調べるために、同じ１６ｎｔの第２鎖（センス鎖）に３１ｎｔアンチセンスまたは２１ｎｔのアンチセンスを組み合わせてｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡを作った後Ａ５４９細胞株に処理した。

＜ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）３１ｍｅｒ＞
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ３１ｎｔ：５’ＵＧＡ
ＡＡＡＵＧＵＵＧＡＵＣＵＣＣＵＵＵＣＣＵＡＡＧＡ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号１６９）
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）Ｓｅｎｓｅ：５’ＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵ＊Ｃ＊Ａ＊ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．３’（配列番号１７０）
＜ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）２１ｍｅｒ＞
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ２１ｎｔ：５’ＵＧＡ
ＡＡＡＵＧＵＵＧＡＵＣＵＣＣＵ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ３’（配列番号１７１）
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）Ｓｅｎｓｅ：５’ＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵ＊Ｃ＊Ａ＊ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．３’（配列番号１７０）
下線：ＯＭｅ改変、＊：ＰＳ（ホスホロチオエート結合）
＜ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）３１ｍｅｒ＞
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ３１ｎｔ：５’ＵＣＵＵＣＣＡ
ＧＵＣＧＧＵＡＡＧＣＣＧＣＧＡＧＧＧＣＡ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ３’（配列番号１７４）
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）Ｓｅｎｓｅ：５’ＣＴＴＡＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡ＊Ｇ＊Ａ＊ｃｈｏｌ．３’（配列番号１７５）
＜ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）２１ｍｅｒ＞
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ２１ｎｔ：５’ＵＣＵＵＣＣＡ
ＧＵＣＧＧＵＡＡＧＣ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ ３’（配列番号１７６）
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）Ｓｅｎｓｅ：５’ＣＴＴＡＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡ＊Ｇ＊Ａ＊ｃｈｏｌ．３’（配列番号１７５）
下線：ＯＭｅ改変、＊：ＰＳ（ホスホロチオエート結合）

すなわち、Ａ５４９細胞株（ＡＴＣＣ）に前記核酸分子をそれぞれ実施例１と同様の方法でトランスフェクションするか、実施例２と同様にインキュベートした後、２４時間後にリアルタイムＰＣＲで標的遺伝子ｍＲＮＡの発現程度を測定した。各２回繰り返し実験の平均とＳＤを図９に示した。図９Ａは、２１ｍｅｒアンチセンスを持つＣＴＧＦ標的ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を、９Ｂは、３１ｍｅｒアンチセンスを持つＣＴＧＦ標的ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を、９Ｃは、２１ｍｅｒアンチセンスを持つサバイビン標的ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を、９Ｄは、２１ｍｅｒアンチセンスを持つサバイビン標的ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡの遺伝子抑制効率を示した。ＣＴＧＦは、実施例１のプライマーを利用して抑制効率を測定して、サバイビンは、実施例４のプライマーを利用して抑制効率を測定した。
図９に示したように、ＣＴＧＦを標的とするｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡの場合、トランスフェクションとインキュベート共に３１ｎｔアンチセンスを持つ場合が２１ｎｔアンチセンスを持つ場合よりさらに高い標的遺伝子抑制効率を示し（図９Ａ−Ｂ）、サバイビンを標的とするｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡをインキュベートした場合にも同様に３１ｎｔアンチセンスの標的遺伝子抑制効率が高く観察されることを確認した。すなわち、本発明に係る核酸分子は、１９ｎｔ〜３１ｎｔの様々な長さのアンチセンス、すなわち第１鎖を持つ核酸分子のデザインが可能で、これを利用して効果的に標的遺伝子抑制が可能であるが、３１ｎｔの長さを持つ場合が２１ｎｔのアンチセンスより効率的に標的遺伝子抑制が可能であることが確認された。

≪実施例６：ＰＳ２改変に係る効果確認≫
核酸分子中一つ以上のヌクレオチドホスフェートバックボーンをホスホロチオエートに改変させたこと以外に図１０のような構造のホスホロジチオエート（ＰＳ２）に改変する場合、効果を下記の通り調べた。

すなわち、Ａ５４９細胞株に下記のｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）および下記のｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）において同じ位置でＰＳ改変の代わりにＰＳ２改変を導入したｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）−ＰＳ２を実施例１または２と同様の方法でトランスフェクションまたはインキュベートした後、２４時間後に実施例４と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行ってサバイビン遺伝子の発現程度を測定した。それぞれ２回繰り返し実験して、グラフに繰り返し実験の平均とＳＤを示した。

＜ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）＞
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ３１ｎｔ：５’ＵＧＡ
ＡＡＡＵＧＵＵＧＡＵＣＵＣＣＵＵＵＣＣＵＡＡＧＡ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号１６９）
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）Ｓｅｎｓｅ：５’ＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵ＊Ｃ＊Ａ＊ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．３’（配列番号１７０）
下線：ＯＭｅ改変、＊：ＰＳ（ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合）

その結果、図１１に示したように、追加的なイオウ改変（ｓｕｌｆｕｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＰＳ２）による向上した遺伝子抑制効果は観察されなく、既存のｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡより減少した遺伝子抑制効能を示すことが確認された。

≪実施例７：本発明に係る核酸分子のインビボターゲットでの遺伝子抑制効率測定≫
現在ＲＮＡｉ技術を利用した治療剤開発で最も困難なことの一つは、インビボでの効果的なＲＮＡ伝達技術の開発である。現在開発されている多くの伝達体技術をこのインビトロ上では、高い効率を持つ反面、インビボに適用された場合、その効率が顕著に減少する問題点を有している。これに対して、本発明に係る核酸分子がインビボでも高い遺伝子抑制効果を持つのか確認するために、別途の伝達体を用いることなくｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡだけをラットの皮膚に注射して標的遺伝子の発現抑制効果を比較した。

すなわち、ラットの皮膚にＰＢＳ、ｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）、またはｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）を図１２に表記された濃度のとおり１００μＬのＰＢＳに溶解して皮内注射した後、２４ｈ後に組織を回収して標的遺伝子の発現効率を測定した。この時、ゾレチル（Ｚｏｌｅｔｉｌ）及びロンパン（ｒｏｍｐｕｎ）溶液をラットの腹腔に注射して、麻酔後ラット（ＳＤラット、オリエントバイオ）の背中の部分を全除毛した。除毛された部位の皮膚に半径５ｍｍの円を描いた後、中心部位にインスリンシリンジ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｙｒｉｎｇｅ）（ＢＤ、３１Ｇ）で１００μＬのＰＢＳ、ｓｉＲＮＡ、またはｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡを皮内注射した。注射後、表記された日に８ｍｍ生検パンチ（ｂｉｏｐｓｙ ｐｕｎｃｈ）で皮膚組織を切り離して遺伝子発現分析を行った。用いられた核酸分子は下記のとおりである。

ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒａｔ：５’−ＵＣＵＵＣＣＡ
ＧＵＣＧＧＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＧＧＧＣＡ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ−３’（配列番号１７７）ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）Ｓｅｎｓｅ Ｒａｔ：５’−ＣＣＴＡＣＣＧＡＣＴＧ
ＧＡＡ＊Ｇ＊Ａ＊ｃｈｏｌｅｔｅｒｏｌ．３’（配列番号１７８）
下線：ＯＭｅ改変、＊：ＰＳ（ホスホロチオエート結合）
ｓｉＲＮＡとしては下記を利用した。
ｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＣＵＧＣＣＵＡＣＣＧＡＣＵＧＧＡ
ＡＧＡＴＴ−３’（配列番号１７９）
ｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）ｓｅｎｓｅ：５’−ＣＵＧＣＣＵＡＣＣＧＡＣＵＧＧＡＡＧＡＴＴ−３’（配列番号１８０）
下線：ＯＭｅ改変

この時、ＲＮｅａｓｙ線維性組織ミニキット（ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｎｉ ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、合計１μｇのＲＮＡをｃＤＮＡ合成に用いた。ｃＤＮＡは、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して提供されたプロトコルに基づいて合成された。合成されたｃＤＮＡは、希釈を介して濃度を低くした後、ステップワンリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して提供されたプロトコルに基づいて、定量的なリアルタイムＰＣＲに利用した。標的遺伝子は、遺伝子に特異的なプライマーと共にパワーＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して確認した。実験に用いられたプライマー塩基配列は下記のとおりである。図１２で各グラフは５回繰り返し実験の平均とＳＤを示した。

ＣＴＧＦ−Ｒａｔ
Ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＧＧＣ ＴＣＧ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＴ ＴＧ−３’（配列番号１８１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＣＧＧ ＧＡＡ ＡＴＧ ＣＴＧ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＴ−３’（配列
番号１８２）

ラットの皮膚にＰＢＳ、ｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）、またはｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）を表記された濃度のとおり１００μＬのＰＢＳに溶解して皮内注射した後、２４時間後に組織を回収して標的遺伝子の発現効率を測定した。各グラフは、５回繰り返し実験の平均とＳＤを示した。

その結果、図１２に示したように、ＰＢＳ、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）、またはｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）を処理した群に比べてｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）を処理した群でＣＴＧＦの発現が８０〜９０％以上減少して、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡがインビボでも高い効率で標的遺伝子抑制が可能であることを確認した。

追加的に、Ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡのインビボで遺伝子抑制効率を確認するために、前記と同様の方法で１００μｇ／インジェクション〜０．１μｇ／インジェクション区間のｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡをラットに注射した後、標的遺伝子の発現を測定した。

その結果、図１３に示したように、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）は、約０．３μｇ／インジェクションの低い濃度でも７０％以上の高い標的遺伝子抑制効率を持つことが確認され、約０．２１μｇ／インジェクションのＩＣ５０値を持つことが確認された。各グラフは２回繰り返し実験の平均とＳＤを示した。

追加的に、前記と同様の方法でｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）注射した後、１日、２日、３日、６日目に組織を分析して遺伝子発現を測定した。すなわち、１日目でｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）を皮内注射した後、表記された日に組織を切り離して、ＣＴＧＦの発現をリアルタイムＰＣＲで確認した。

その結果、図１４に示したように、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＦ）は少なくとも５日以上標的遺伝子の発現を抑制することが確認された。各グラフは、２回繰り返し実験の平均とＳＤを示した。

以上説明した通り、本発明に係る核酸分子構造は、コレステロール改変およびホスホロチオエート改変を共に導入することによって、優秀な遺伝子抑制効率を維持しながらも別途の細胞伝達体がなくても細胞内貫通能を持つことができて、実際の標的部位にＲＮＡｉ誘導のための十分な量に伝達できて、従来問題になったインビボ伝達問題を解消させることができる。そこで、本発明に係る核酸分子は、従来のｓｉＲＮＡ分子に代えてｓｉＲＮＡを利用した癌やウィルス感染治療などに活用することができて有用である。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims (24)

1. 標的核酸と相補的な領域を含む第１鎖と、前記第１鎖と相補的結合を形成する第２鎖で構成されるＲＮＡｉ誘導用二本鎖核酸分子において、前記核酸分子に含まれている少なくとも一つのヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートまたは、ホスホロジチオエートで置換されていて、親油性化合物が結合されていることを特徴とする、細胞内貫通能を持つＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
2. 前記ＲＮＡｉ誘導用二本鎖核酸分子は、標的核酸と相補的な一部領域を含む２４〜１２１ｎｔ長さの第１鎖と、前記第１鎖の標的核酸と相補的な一部領域と相補的結合を形成する領域を持つ１３〜２１ｎｔ長さの第２鎖で構成されることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
3. 前記第１鎖の５’方向の末端が平滑末端であることを特徴とする請求項２に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
4. 前記第１鎖の標的核酸と相補的な一部領域の長さは、１９〜３１ｎｔであることを特徴とする請求項２に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
5. １〜４８個のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートまたは、ホスホロジチオエートに置換されていることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
6. 前記核酸分子中第１鎖に含まれている１〜３１個のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートまたは、ホスホロジチオエートに置換されていることを特徴とする請求項５に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
7. 前記核酸分子中第２鎖に含まれている１〜１７個のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートまたは、ホスホロジチオエートに置換されていることを特徴とする請求項５に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
8. 前記第１鎖中目的核酸と相補的な領域以外の領域のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートまたは、ホスホロジチオエートに置換されていることを特徴とする請求項７に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
9. 前記核酸分子に含まれている少なくとも一つのヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートに置換されていることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
10. 前記親油性化合物は、脂質、親油性ペプチド及び親油性タンパク質で構成された群から選択されたことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
11. 前記脂質は、コレステロール、トコフェロールおよび、炭素数１０以上の長鎖脂肪酸で構成された群から選択されたことを特徴とする請求項１０に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
12. 前記親油性化合物は、前記核酸分子の第１鎖または第２鎖の末端に結合されていることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
13. 前記標的核酸は、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、コードＤＮＡ配列及び非
    コードＤＮＡ中いずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
14. 前記核酸分子に含まれる少なくとも１種のヌクレオチドのリボースの２’位置のヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基、及びアミノ基中いずれか一つに置き換えられることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
15. 前記核酸分子に含まれる少なくとも１種のヌクレオチドのホスフェートバックボーンが、アルキルホスホネート型）、ホスホロアミデート型、及びボラノホスフェート型中いずれか一つに置き換えられることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
16. 前記核酸分子に含まれる少なくとも１種のヌクレオチドがＬＮＡ、ＵＮＡ、モルフォリノ及びＰＮＡの中いずれか一つに置き換えられることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
17. 前記第１鎖で前記一本鎖領域を構成する塩基中少なくとも一つ以上が巨大塩基類似体を含むことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
18. 前記目的核酸は、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）をコードするｍＲＮＡであり、前記ＲＮＡｉを誘導する二本鎖の核酸分子は配列番号１４９および１５０の塩基対、配列番号１５１および１５２の塩基対、および配列番号１５３および１５４の塩基対で構成された群から選択された塩基対を持つことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
19. 請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸分子を含有する遺伝子発現抑制用組成物。
20. 請求項１〜１８のいずれかに記載の前記核酸分子を細胞内導入させる工程を含む細胞内目的遺伝子の発現抑制方法。
21. 結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）をコードするｍＲＮＡを目的核酸とする請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸分子を含有するＣＴＧＦ関連疾病または障害の治療または予防用医薬組成物。
22. 前記ＣＴＧＦ関連疾病または障害は、ケロイド、腎臓繊維症、強皮症、肺繊維症、肝繊維症、関節炎、高血圧、腎臓障害、血管形成関連障害、皮膚繊維症障害および心血管系障害からなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 前記核酸分子に配列番号１４９および１５０の塩基対、配列番号１５１および１５２の塩基対、および配列番号１５３および１５４の塩基対で構成された群から選択された塩基対を持つことを特徴とする請求項２１に記載の医薬組成物。
24. 結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）をコードするｍＲＮＡと相補的な領域を含む第１鎖と、前記第１鎖と相補的結合を形成する第２鎖で構成されるＲＮＡｉ誘導用二本鎖核酸分子において、前記核酸分子に含まれている１〜３１個のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエートまたは、ホスホロジチオエートで置換されていて、親油性化合物が結合されていて、前記ＲＮＡｉを誘導する二本鎖の核酸分子は、配列番号１５３および１５４の塩基対で構成された群から選択された塩基対を持つことを特徴とする、細胞内貫通能を持つＣＴＧＦ発現抑制用核酸分子。