JP2017512479A - Ｌｇｒ５に結合するヒト化抗体 - Google Patents

Abstract

癌の治療のためのヒト化抗ＬＧＲ５抗体が本書で開示される。本書で開示される抗体は、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ１結合またはシグナリングを阻害することなくＬＧＲ５と結合し得、かつＲＳＰＯ１とは無関係であるＷｎｔを介したＬＧＲ５シグナリングを阻害し得る。例えばＬＧＲ５−ＲＳＰＯ結合またはシグナリングを阻害することなく、ＬＧＲ５と結合するための重鎖および軽鎖ポリペプチド配列もまた開示される。

Description

関連出願
本出願は、２０１４年１１月１８日に出願された米国仮出願番号６２／０８１４９７、２０１４年４月４日に出願された米国仮出願番号６１／９７５５８９の権利を主張し、これらの仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、概して、癌生物学の分野に関する。さらに詳細には、実施形態は、ＬＧＲ５に対するヒト化抗体および該抗体の用途に関する。いくつかの実施形態は、ＬＧＲ５に対するモノクローナル抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体、該抗体を発現するハイブリドーマまたはその他の細胞株、該抗体をコードする核酸を含む核酸およびベクター、ならびに該抗体を用いる癌幹細胞の成長を阻害する方法に関する。

配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、タイトルがＢＩＯＮＯ１０ＷＯ＿ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ＴＸＴであり、２０１５年４月２日に作成された、サイズが約４０Ｋｂのファイルとして提供されている。配列表の電子フォーマット中の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ＧＰＲ４９／ＨＧ３８／ＦＥＸとしても知られている、ロイシンリッチリピートを含むＧタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）は、ロイシンリッチリピートを含むＧタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）／糖タンパク質ホルモン受容体に構造的に類似している受容体タンパク質のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＲ）タンパク質ファミリーに属する。ＬＧＲは、３つのサブ群：（１）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）受容体を含む糖タンパク質ホルモン受容体；（２）リラキシン受容体ＬＧＲ７およびＬＧＲ８；ならびに（３）ＬＲＧ４、ＬＧＲ５、およびＬＧＲ６、に分けられている。ＬＧＲ５は、腸、骨格筋、胎盤、脳、および脊髄を含むいくつかの組織で発現される。

本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、ＬＧＲ５に結合するヒト化またはヒトモノクローナルを含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号２３またはその保存的変異型を含む重鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号２またはその保存的変異型を含む重鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号３またはその保存的変異型を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号４またはその保存的変異型を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、アミノ酸ＬＴＳまたはその保存的変異型を有する軽鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号３３またはその保存的変異型を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号１９または４８を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号２１または４９を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、ＬＧＲ５のアミノ酸Ｔ１７５、Ｅ１７６、Ｑ１８０、Ｒ１８３、Ｓ１８６、Ａ１８７、Ｑ１８９、Ｄ２４７、Ｅ２４８、Ｔ２５１、Ｒ２５４、Ｓ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２６０（配列番号４７）内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、該抗体は、ＬＧＲ５（配列番号４７）のロイシンリッチリピート６〜９内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、該抗体は、ＬＧＲ５の凸面上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態において
、該抗体は、ＲＳＰＯ−ＬＧＲ５結合部位に結合しない。いくつかの実施形態において、該抗体は、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ結合を阻害しない。いくつかの実施形態において、該抗体は、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯシグナリングを阻害しない。いくつかの実施形態において、該ＲＳＰＯは、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、およびＲＳＰＯ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該抗体は、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ−ＲＮＦ４３、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ−ＺＮＲＦ３、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ−ＬＲＰ６、ＬＧＲ５−ＮＯＲＲＩＮ−ＲＮＦ４３、ＬＧＲ５−ＮＯＲＲＩＮ−ＺＮＲＦ３、ＬＧＲ５−ＮＯＲＲＩＮ−ＬＲＰ６などの複合体の形成を阻害する。いくつかの実施形態において、該抗体は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を介したＬＧＲ５シグナリングを阻害する。いくつかの実施形態において、該抗体は、腫瘍中の分化マーカーの発現を誘発する。いくつかの実施形態において、該抗体は、腫瘍中の細胞の分化を誘発できる。いくつかの実施形態において、該抗体は、腫瘍の成長を阻害する。いくつかの実施形態において、該抗体は、腫瘍中の癌幹細胞の頻度を低減する。

本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、上記の抗体のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド分子を含む。本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つを含むベクターを含む。本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、上記のベクターのいずれか１つを含む宿主細胞を含む。本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、上記の宿主細胞のいずれか１つを培養して抗体を生産することを含む、抗体を生産する方法を含む。

本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、上記抗体のいずれか１つおよび薬剤的に許容できる担体を含む医薬組成物を含む。

本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、癌を有する対象を治療する方法であって、上記抗体のいずれか１つを対象に投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態は、該抗体との併用で化学療法剤を投与することも含む。いくつかの実施形態において、該化学療法剤は、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、およびアブラキサンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを、該抗体との併用で該対象に投与する。

いくつかの実施形態において、該治療は、該対象の生存率を、該治療後少なくとも３ヶ月間、該抗体で治療されていない対象の生存率と比べて上昇させる。いくつかの実施形態において、該対象の生存率が少なくとも６ヶ月間上昇する。いくつかの実施形態において、該対象の生存率が少なくとも１２ヶ月間上昇する。

いくつかの実施形態において、該治療は、該対象における該癌の再発リスクを、該抗体で治療されていない対象における該癌の再発リスクと比べて低減する。

いくつかの実施形態において、該治療は、該対象の末梢血中の腫瘍細胞のレベルを、該抗体で治療されていない対象の末梢血中の腫瘍細胞のレベルと比べて低減する。

いくつかの実施形態において、該癌は、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、および肺癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該癌は、ＡＰＣ変異を含む結腸癌、ＫＲＡＳ変異を含む結腸癌、転移性結腸直腸癌、転移性膵臓癌、トリプルネガティブ乳癌、および小細胞肺癌からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、該対象は、哺乳類である。いくつかの実施形態において、該対象は、ヒトである。

本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、癌を発生しやすい対象において、癌が発生するリスクを低減すること、癌の再発を防止すること、または癌を防止することのための方法であって、上記抗体のいずれか１つを該対象に投与することを含む方法を含む。

本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、癌を有する対象の生存率を上昇させる方法であって、上記抗体のいずれか１つを該対象に投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態において、該対象の生存率が、該治療後少なくとも３ヶ月間、該抗体で治療されていない対象の生存率と比べて上昇する。いくつかの実施形態において、該対象の生存率が少なくとも６ヶ月間上昇する。いくつかの実施形態において、該対象の生存率が少なくとも１２ヶ月間上昇する。

本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、対象において癌の再発リスクを低減する方法であって、上記抗体のいずれか１つを該対象に投与することを含む方法を含む。

本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、対象の末梢血において癌の腫瘍細胞のレベルを低減する方法であって、上記抗体のいずれか１つを該対象に投与することを含む方法を含む。

いくつかの実施形態は、化学療法剤を該抗体との併用で投与することも含む。いくつかの実施形態において、該化学療法剤は、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、およびアブラキサンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを、該抗体との併用で該対象に投与する。

いくつかの実施形態において、予測的臨床試験、遺伝分析、または家族歴分析により、該対象を、該癌を発生しやすいと判定する。

いくつかの実施形態において、該癌は、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、および肺癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該癌は、ＡＰＣ変異を含む結腸癌、ＫＲＡＳ変異を含む結腸癌、転移性結腸直腸癌、転移性膵臓癌、トリプルネガティブ乳癌、および小細胞肺癌からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、該対象は、哺乳類である。いくつかの実施形態において、該対象は、ヒトである。

本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、腫瘍を有する対象のための治療を選択する方法であって、（ａ）前記対象に化学療法剤を投与すること；（ｂ）前記腫瘍中でＬＧＲ５ポリペプチドまたはＬＧＲ５をコードする核酸のレベルの増加を確認すること；および（ｃ）上記抗体のいずれか１つを、前記腫瘍中でＬＧＲ５ポリペプチドまたはＬＧＲ５をコードする核酸のレベルが増加している前記対象に投与することを含む前記方法を含む。いくつかの実施形態において、該化学療法剤は、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、およびアブラキサンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該腫瘍は、結腸癌腫瘍、結腸直腸癌腫瘍、膵臓癌腫瘍、乳癌腫瘍、および肺癌腫瘍からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該腫瘍は、ＡＰＣ変異を含む結腸癌腫瘍、ＫＲＡＳ変異を含む結腸
癌腫瘍、転移性結腸直腸癌腫瘍、転移性膵臓癌腫瘍、トリプルネガティブ乳癌腫瘍、および小細胞肺癌腫瘍からなる群から選択される。

本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、上記抗体のいずれか１つを用いる治療の有効性を評価する方法であって、前記抗体で治療された腫瘍中のバイオマーカーのレベルを測定することを含む方法を含む。いくつかの実施形態において、該バイオマーカーは、核酸、または前記核酸がコードするポリペプチドであり、該バイオマーカーは、ＷＮＴ６、ＦＺＤ８、ＦＯＳＬ１、ＷＴ１１、ＮＦＡＴＣ１、ＦＺＤ５、ＦＺＤ２、ＦＲＺＢ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＦＺＤＢ、ＦＺＤ７、ＷＮＴ７Ｂ、ＦＢＸＷ１１、ＦＺＤ１、ＤＶＬ１、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＤＭ、ＣＴＮＮＢ１、ＡＬＤＯＣ、ＣＤＨ５、ＩＴＧＡ２、ＤＡＢ１、ＭＩＲ６５５、ＮＫＸ１−２、ＺＢＴＢ１１、ＩＴＰＫＡ、ＰＳＭＣ３ＩＰ、およびＢＡＫ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該腫瘍で治療されていない腫瘍中の該バイマーカーのレベルと比べた該バイマーカーのレベルの減少は、有効な治療を示す。いくつかの実施形態において、該バイマーカーは、ＷＮＴ６、ＦＺＤ８、ＦＯＳＬ１、ＷＴ１１、ＮＦＡＴＣ１、ＦＺＤ５、ＦＺＤ２、ＦＲＺＢ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＦＺＤＢ、ＦＺＤ７、ＷＮＴ７Ｂ、ＦＢＸＷ１１、ＦＺＤ１、ＤＶＬ１、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＤＭ、ＣＴＮＮＢ１、ＡＬＤＯＣ、ＣＤＨ５、およびＩＴＧＡ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該腫瘍で治療されていない腫瘍中の該バイマーカーのレベルと比べた該バイマーカーのレベルの増加は、有効な治療を示す。いくつかの実施形態において、該バイマーカーは、ＤＡＢ１、ＭＩＲ６５５、ＮＫＸ１−２、ＺＢＴＢ１１、ＩＴＰＫＡ、ＰＳＭＣ３ＩＰ、およびＢＡＫ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該腫瘍は、結腸癌腫瘍、結腸直腸癌腫瘍、膵臓癌腫瘍、乳癌腫瘍、および肺癌腫瘍からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該腫瘍は、ＡＰＣ変異を含む結腸癌腫瘍、ＫＲＡＳ変異を含む結腸癌腫瘍、転移性結腸直腸癌腫瘍、転移性膵臓癌腫瘍、トリプルネガティブ乳癌腫瘍、および小細胞肺癌腫瘍からなる群から選択される。

図１は、ヒト化モノクローナル抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のヒトＬＧＲ５（ＣＨＯ）への直接的なＦＡＣＳの結合を示すグラフである。 図２は、ＦＯＬＦＩＲＩが単独、および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３との併用でＣＴ３ ＣＲＣ腫瘍体積に与える影響を示すグラフである。 図３は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の治療がＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ３原発性腫瘍体積を顕著に低減したことを示すグラフである。 図４は、ＣＴ１またはＣＴ３腫瘍を有するマウスにおけるＦＯＬＦＩＲＩ治療が、ＬＧＲ５のアップレギュレーションをもたらすことを示すグラフを表す。 図５は、化学療法がＪＨ１０９腫瘍においてＬＧＲ５の（４倍を超える）アップレギュレーションをもたらすことを示す棒グラフである。 図６は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を化学療法（ゲムシタビン）との併用で投与したときに観察された１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の顕著な活性を示すグラフである。 図７は、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３がＣＴ１癌幹細胞集団における生存現象の数を低減することを示す点のプロットである。 図８は、ＦＯＬＦＩＲＩとの併用で抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したマウスから単離された細胞が、ＦＯＬＦＩＲＩ単独で治療したマウスから単離された細胞と比べて腫瘍形成能を大きく減少させたことを示す線グラフである。 図９は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＦＯＬＦＩＲＩの併用から再移植された細胞では、無増悪期間が顕著に延びていたことを示す線グラフである。 図１０は、ヒト化抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を化学療法（ＦＯＬＦＩＲＩ）との併用で予防的に投与したときに、ヒト化抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の顕著な活性が観察されることを示す線グラフである。 図１１は、ホスホ−Ｔｈｒ４１／Ｓｅｒ４５−β−カテニンイムノアッセイにより示された、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、インビボで腫瘍細胞中のＷｎｔシグナリングを阻害できるということを示す点のプロットである。 図１２は、可溶性抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の濃度の増加が、Ｗｎｔ３ａ＋ＲＳＰＯ２の併用によって、ＴＣＦ／ＬＥＦプロモーター駆動性ＧＦＰ発現の誘発に影響を与えなかったことを示す棒グラフであり、抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、ＲＳＰＯ駆動性ＴＣＦ／ＬＥＦプロモーターの活性化を阻害しないことを示す。ポジティブコントロール抗体Ｃ１２は、Ｗｎｔ３ａ／ＲＳＰＯ２駆動性ＴＣＦ／ＬＥＦプロモーターの活性化を阻害することが示されている。 図１３は、Ｒ−スポンジンが、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のＬＧＲ５への結合を阻害しないことを示す線グラフである。 図１４は、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のＬＧＲ５への結合が、三元複合体の形成を阻害することを示す棒グラフである。 図１５は、治療したサンプル中のＬＧＲ５の発現レベルを表す。 図１６は、治療したサンプル中のＣＴＮＮＢ１の発現レベル、およびｐ−β−カテニンの発現レベルを表す。 図１７は、様々な治療したサンプル中で区別的に発現された転写物を表す。 図１８は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３−（ＢＮＣ１０１）で治療された腫瘍中で区別的に発現された遺伝子を表す。 図１９は、ＦＯＬＦＩＲＩで治療された腫瘍中で区別的に発現された遺伝子を表す。 図２０は、併用で治療された腫瘍中で区別的に発現された遺伝子を表す。 図２１は、循環ＨＬＡ＋細胞中のＬＧＲ５のレベルを表す。 図２２Ａは、循環ＨＬＡ＋細胞中のＬＧＲ５のレベルを表す。 図２２Ｂは、循環ＨＬＡ＋細胞中のＬＧＲ５のレベルを表す。 図２３は、ゲムシタビン／アブラキサン、またはゲムシタビン／アブラキサンおよび１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したマウスの動物生存を示すグラフである。

詳細な説明
本出願のいくつかの実施形態は、ＬＲＧ５に特異的に結合するヒト化抗体、および該抗体を用いる癌幹細胞の成長を阻害する方法に関する。いくつかの実施形態において、該抗体は、特異的にＬＧＲ５に結合するが、Ｒ−ＳｐｏのＬＧＲ５への結合を阻害しない。他の実施形態は、ＬＧＲ５を介したＲ−Ｓｐｏシグナリングを阻害することなくＬＧＲ５に結合する抗体を含む。さらなる他の実施形態は、ＬＧＲ５に結合するが、ＬＧＲ５を介したＲ−Ｓｐｏ結合またはシグナリングのどちらも阻害しない抗体を含む。

別の実施形態は、ＬＧＲ５に結合し、かつ、Ｗｎｔ経路を介したＬＧＲ５シグナリングを阻害する抗体である。いくつかの実施形態において、これらの抗体は、Ｗｎｔ経路を介したＬＧＲ５シグナリングを阻害し得、ＲＳｐｏシグナリングとは無関係であり得る。

他の実施形態は、上記の抗体を使用して細胞または組織中のＬＧＲ５またはＲ−Ｓｐｏシグナリングを阻害する方法を含む。

ＬＧＲ５は、系列追跡研究により、腸内の正常な幹細胞および腫瘍イニシエーター細胞の特異性の高いマーカーとして同定された。これまでに、Ｗｎｔの発現の抑止後に発現が抑止される約１５０の遺伝子が同定された。これらの「Ｗｎｔ標的遺伝子」の包括的キャラクタリゼーションにより、ＬＧＲ５が陰窩基底部の１０〜１４個の増殖性楔形細胞群上
に選択的に発現されることが分かった。これまでに、これらの陰窩基底部円柱細胞は、候補幹細胞集団であると提唱された。遺伝性ｌａｃＺ−ＬＧＲ５受容体遺伝子を用いたインビボでの系列追跡を使用して、ＬＧＲ５腸管幹細胞が、陰窩基底部から始まり絨毛先端に広がるｌａｃＺ＋子孫細胞の連続したリボンを生じる、成体腸管幹細胞の多能性の自己複製集団であることが確認されている。

ＣＳＣ上でのＬＧＲ５の特異的発現は、選択的かつ効率的にＣＳＣを標的とするのに有利な条件を与える。ＬＧＲ５は、正常組織と比べて、ＣＲＣ、膵臓腫瘍、および他の大半の固体腫瘍でかなり過剰に発現されるため、ＣＲＣ、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、胃癌、および肝臓癌においてＣＳＣを標的とする広い治療域（therapeutic window）を与える。

ＬＧＲ５自体、分泌型Ｒ−スポンジンリガンドに結合してＬＧＲ５陽性細胞上のＷｎｔシグナルを選択的に増幅および増強するＷｎｔ−Ｆｚｄ−ＬＲＰ受容体複合体の条件的要素である。ＬＧＲ５がＷｎｔに非依存的な様式でシグナリングできるという証拠もある。また、関連する膜貫通ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチンリガーゼであるＺＮＲＦ３（ジンクおよびＲＩＮＧフィンガー（zinc and RING finger）３）またはＲＮＦ４３（ＲＩＮＧフィンガー４３）は、ＬＧＲ５＋幹細胞で特異的に発現され、フリッツルド（frizzled）受容体を選択的にユビキチン化することによりＷｎｔシグナルを低減し、これらのＷｎｔ受容体を分解の標的とする。Ｒ−スポンジンリガンドは、ＬＧＲ５と相互作用して膜貫通型ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３と三元複合体を形成する。これらの三元複合体の形成は、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３をＷｎｔ−Ｆｚｄ−ＬＲＰ複合体と隔絶し、標準および非標準Ｗｎｔシグナリングを安定化する。最後に、Ｎｏｒｒｉｎは、無名の関連生物学により、ＬＧＲファミリーに対する別のリガンドとして同定されている。

ＣＲＣにおけるゲートキーピング（gate keeping）変異は、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）の消失であり、結腸陰窩において幹細胞の自己複製と分化との間のバランスを調節するように通常作用するＷｎｔシグナリングの異常な活性化をもたらす。腸管幹細胞におけるＷｎｔシグナリングの調節異常は、悪性ＣＲＣの前駆体である結腸中の腺腫様ポリープの形成をもたらす。誘導性ＡＰＣ遺伝子ノックアウトマウスと、ＬＧＲ５幹細胞が４つ（ＧＦＰ／ＹＦＰ／ＥＣＦＰ／ＲＦＰ）の蛍光遺伝マーカーのうち１つで特異的かつランダムに標識されたマウスとを交雑するストラテジーを用いて、ＬＧＲ５幹細胞は、マウスのこれらの腸管腫瘍の源またはルーツであると確認された。ＡＰＣ欠損の誘導から４週間後に単色の腫瘍（すなわち、全てＧＦＰまたは全てＲＦＰ）が出現したことにより、これらの腫瘍が単一のＬＧＲ５幹細胞から生じたことが確認された。さらに、このモデルは、ＬＧＲ５幹細胞中の蛍光遺伝タグが異なる色に切り替えられるようにすることもできるので、赤い腫瘍を生じるＲＦＰ＋ＬＧＲ５癌幹細胞を、中程でＥＣＦＰ＋ＬＧＲ５癌幹細胞へと転換することができた。ＥＣＦＰ＋ＬＧＲ５癌幹細胞は、腫瘍をまだ播種していたが、同時に、それまでの全て赤色のＧＦＰ＋腫瘍塊を侵襲する青色の腫瘍細胞を生じさせていた。この切り替え実験は、ＬＧＲ５ ＣＳＣが腸管腫瘍の源であり、腸管腫瘍の成長を開始および播種できることのさらなる確証を与えただけでなく、ＬＧＲ５ ＣＳＣが腫瘍形成を持続的に維持する（すなわち、長期間の複製能を有する）ことについても確証を与えた。

癌におけるＬＧＲ５の機能的役割は、リボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）ノックダウン研究により確証されている。ＣＲＣ腫瘍細胞株パネルにおけるＬＧＲ５のノックダウンは、インビトロで軟寒天コロニーの成長を顕著に阻害し、インビボにおけるＨＣＴ１１６結腸腫瘍異種移植片の成長もまた顕著に阻害した。続いて、ＬＧＲ５ ＲＮＡｉノックダウンが、インビトロで患者由来ＣＲＣ腫瘍細胞からのＣＳＣコロニーの成長を低減することもまた示された（データは示されていない）。最後に、選別されたＬＧＲ５＋患者由来異種移植Ｃ
ＲＣ腫瘍細胞が、コントロールであるＬＧＲ５−細胞と比べてインビボで腫瘍形成能が高いことが分かった。

ＣＳＣは、手術および標準治療の化学療法で治療された多くの癌患者において腫瘍再発率が高いことの原因であると考えられている。例えば、乳癌患者からのＣＤ４４＋ ＣＳＣは、化学療法の後に多くなり、高いレベルのＣＳＣは、化学療法に対する臨床反応が悪いことと相関していることが分かった。同様に、転移性ＣＲＣにおいて、ＬＧＲ５の発現は、化学療法後に損傷した肝臓でアップレギュレーションされた。このことは、化学療法に応答して増加したＬＧＲ５ ＣＳＣが転移性疾患を開始および／または誘起することを示唆している。実際、ＬＧＲ５の発現は、原発性ＣＲＣ腫瘍と比べて転移部位において顕著に多いことが分かっている。

抗ＬＧＲ５抗体
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、限定はされないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組み替えにより生産された抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）（二重特異性ｓｄＦ
ｖを含む）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合断片を含む。本明細書に与えられるいくつかの実施形態の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、または三重以上の多重特異性であり得る。多重特異性抗体はポリペプチドの様々なエピトープに対して特異的であり得るか、またはポリペプチドと、異種のポリペプチドや固形支持材などの異種エピトープとの両方に対して特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公報国際公開第９３／１７７１５号；国際公開第９２／０８８０２号；国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／０５７９３号；Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991)；米国特許番号４，４７４，８９３；４，７１４，６８１；４，９２５，６４８；５，５７３，９２０；５，６０１，８１９；Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体を参照により
本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、ＬＧＲ５は、限定はされないが、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００３６５８．１のポリペプチドまたはその断片を含むヒトＬＧＲ５を含み、該ポリペプチドまたはその断片は、ＮＭ＿００３６６７．２内のコード塩基配列またはその断片によりコードされている。ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００３６５８．１のアミノ酸配列および全エントリー、ならびにＮＭ＿００３６６７．２の塩基配列および全エントリーは、その全体が参照により完全に組み込まれる。本明細書で考慮されるＬＧＲ５断片の例として、ＬＧＲ５外部ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞内ドメイン、およびこれらの一部分が挙げられる。

いくつかの実施形態は、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体を含む、抗ＬＧＲ５抗体の軽鎖および／または重鎖を生産するハイブリドーマに関する。一態様において、ハイブリドーマは、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１の軽鎖および／または重鎖などのヒト化抗体または完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖を生産する。

いくつかの実施形態は、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む、抗ＬＧＲ５抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子に関する。いくつかの態様において、核酸分子は、以下の実施例で生産され記載される抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１などのヒト化または完全ヒトモノクローナルの軽鎖または重鎖をコードする。

様々な実施形態は、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む、抗ＬＧＲ５抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする１つまたは複数の核酸分子を含むベクターに関する。

さまざまな実施形態において、抗体のグリコシル化が変更され得る。例えば、非グリコシル化された（aglycosylated）抗体が作製され得る（すなわち、抗体は、グリコシル化
されていない）。グリコシル化は、例えば、標的抗原に対する抗体の親和性を高めるように変更され得る。このような糖質の改変は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変えることにより達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１つ以上のアミノ酸置換がなされることにより、その部位でのグリコシル化を排除することができる。この非グリコシル化（aglycosylation）は、抗原に対する抗体の親和性を高め得る。このようなアプローチは、米国特許番号５，７１４，３５０および６，３５０，８６１にさらに詳細が記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態において、抗体は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００３６５８．１（配列番号４７）のヒトＬＧＲ５ポリペプチドまたはその断片と少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するＬＧＲ５ポリペプチドを含む、または前記ＬＧＲ５ポリペプチドからなるポリペプチドに特異的に結合する。該断片は、例えば、ＬＧＲ５ポリペプチドの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、もしくは９００の隣接もしくは非隣接アミノ酸、または任意の上記の長さの間にある任意の数の隣接もしくは非隣接アミノ酸であり得る。

いくつかの実施形態において、抗体は、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、配列番号１３の重鎖アミノ酸配列および配列番号１１のＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、配列番号１９を含む重鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、配列番号１４の軽鎖配列を含む。他の実施形態において、抗体は、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、配列番号２１の軽鎖可変ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、上記配列の配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、上記配列の重鎖、軽鎖、または可変ドメインの２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、または１１８残基に亘って上記抗体配列と１００％同一である配列を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、該抗体配列と８０％、８１％、８２％、８３％
、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、該抗体配列と８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、または１１１残基に亘って該抗体配列と１００％同一である配列を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＧＹＳＦＴＡＹＷ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＩＬＰＧＳＤＳＴ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、およびＡＲＳＧＹＹＧＳＳＱＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲｌ、ＬＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２、およびＱＱＮＡＥＤＰＲＴ（配列番号３３）を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、（ａ）１、２、３、または４つのアミノ酸置換を有する上記配列の変異型を含む重鎖ＣＤＲ１、を含む。該抗体は、１、２、３、または４つのアミノ酸置換を含む変異型を有する重鎖ＣＤＲ２も有しても良い。該抗体は、１、２、３、または４つのアミノ酸置換を含む変異型を有する重鎖ＣＤＲ３も有しても良い。重鎖のこれらの改変に加えて、該抗体は、１、２、３、または４つのアミノ酸置換を含む変異型を有する軽鎖ＣＤＲ１も有しても良い。該抗体は、１、２、３、または４つのアミノ酸置換を含む変異型を有する軽鎖ＣＤＲ２も有しても良い。該抗体は、１、２、３、または４つのアミノ酸置換を有する軽鎖ＣＤＲ３も有しても良い。いくつかの実施形態において、該アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。

いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、本願で添付の配列表において記載されている配列に対して少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む抗体を含む。該抗体は、本明細書に記載の抗体配列に対して少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域も有してもよい。

２つのアミノ酸配列（または２つの核酸配列）の同一性のパーセントは、例えば、最適な比較の目的で配列をアラインメントすることによって、求めることができる（例えば、ギャップを第１の配列の配列中に挿入し得る）。次に、対応する位置のアミノ酸またはヌクレオチドを比較する。２つの配列間の同一性のパーセントは、２つの配列に共通である同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の合計数×１００）。２つの配列の実際の比較は、周知の方法により、例えば数学アルゴリズムを使用して達成することができる。このような数学的アルゴリズムの具体的で非限定的な例は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)に記載されている。該アルゴリズムは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるSchaffer et al., Nucleic Acids Res., 29:2994-3005 (2001)に記載のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（バージョン２．２）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴプログラムおよびギャプド（Gapped）ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター（例えば、ＢＬＡＳＴＮ）を使用できる。２００２年４月１０日付けで利用可能なhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov
を参照されたい。一実施形態において、検索するデータベースは、非冗長性（ＮＲ）データベースであり、配列比較のためのパラメーターは、以下のように設定できる。フィルター（filter）なし；期待値（Expect value）は１０；ワードサイズ（Word Size）は３；
マトリックス（Matrix）はＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト（Gap Cost）は存在（Existence）が１１で伸長（Extension）が１。

いくつかの実施形態は、可変軽鎖（Ｖ_L）ドメインおよび／または可変重鎖（Ｖ_H）ドメイン中に１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む、上記の抗体の変異型も包含する。いくつかは、１つ以上のＶ_L ＣＤＲおよび／または１つ
以上のＶ_H ＣＤＲ中に１つ以上のさらなるアミノ酸残渣置換を有する上記抗体の変異型
も包含する。上記抗体のＶ_Hドメイン、Ｖ_H ＣＤＲ、Ｖ_Lドメイン、および／またはＶ_L ＣＤＲ中に置換を導入することによって生じさせた抗体を、例えばＬＧＲ５に結合する能力について、（例えば、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅを含むがこれらに限定はされないイムノアッセイにより）インビトロおよびインビボで試験できる。

様々な実施形態が、ＬＧＲ５に特異的に結合する、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つなどの、抗ＬＧＲ５抗体のＶ_Hドメイン、Ｖ_H ＣＤＲ、Ｖ_Lドメイン、またはＶ_L ＣＤＲの誘導体を含む、ＬＧＲ５に特異的に結合する抗体を含む。当業者に知られている標準的な技術を使用して、変異（例えば、付加、欠失、および／または置換）を抗体をコードする塩基配列中に導入することができ、例えば、部位特異的突然変異誘発法およびＰＣＲを介した突然変異誘発法が挙げられ、これらは、アミノ酸置換を生成させるために通常使用されている。一実施形態において、Ｖ_H ＣＤＲおよび／またはＶ_L ＣＤＲは、元のＶ_H Ｃ
ＤＲおよび／またはＶ_L ＣＤＲと比較して、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミ
ノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換を含む。別の実施形態において、Ｖ_H ＣＤＲおよび／またはＶ_L ＣＤＲ誘導体は、１つ以上の推定非必須アミノ酸残基（すなわち、抗体がＬＧＲ５に特異的に結合するのに重要ではないアミノ酸残基）で生じさせられた保存的アミノ酸置換（例えば、上述）を有する。あるいは、飽和突然変異誘発などにより、変異をＶ_H ＣＤＲおよび／またはＶ_L ＣＤＲコード配列の全体または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を生物活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定できる。突然変異誘発の後、コードされている抗体を発現させることができ、抗体の活性を測定できる。

いくつかの実施形態は、ＬＧＲ５またはその断片に特異的に結合する抗体もまた包含し、前記抗体は、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体を含む抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む、本明細書に記載のいずれかの抗体の可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列と、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む。

別の実施形態は、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つなどの抗ＬＧＲ５抗体の任意の部分での保存的アミノ酸置換の導入を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、機能的に同等のアミノ酸で置換するアミノ酸置換を意味することは、当業では周知である。保存的なアミノ酸の変化は、得られるペプチドのアミノ酸配列におけるサイレント変化をもたらす。例えば、類似した極性の１つ以上のアミノ酸は、機能的同等物として作用し、ペプチドのアミノ
酸配列内のサイレント改変をもたらす。より小さい残基で残基を置換する電荷的中性である置換を、残基が異なるグループに属していても（例えば、フェニルアラニンのより小さいイソロイシンでの置換）「保存的置換」とみなしても良い。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業で定義されている。保存的アミノ酸置換のいくつかのファミリーを表１に示す。

抗ＬＧＲ５抗体を用いた癌幹細胞の成長阻害
いくつかの実施形態は、抗ＬＧＲ５抗体を用いてインビトロとインビボで癌幹細胞の成長を阻害することに関する。いくつかの実施形態において、癌幹細胞の成長を阻害する方法は、有効量の抗ＬＧＲ５抗体を癌幹細胞に投与することを含み、前記有効量の抗ＬＧＲ５抗体は、癌幹細胞の成長を低減するのに十分である。

いくつかの実施形態において、癌幹細胞の成長を阻害する方法は、有効量の抗ＬＧＲ５抗体を癌幹細胞に投与することを含み、前記有効量の抗ＬＧＲ５抗体は、癌幹細胞の増殖の低減もしくは阻害、または癌幹細胞の成長の低減もしくは阻害に十分である。

いくつかの態様において、有効量の抗ＬＧＲ５抗体をインビトロで癌幹細胞に投与する。他の態様において、有効量の抗ＬＧＲ５抗体を、インビボで、該抗体の治療が必要な患者の癌幹細胞に投与する。

いくつかの実施形態において、ＬＧＲ５に対する抗体を、ＬＧＲ５へのＲ−Ｓｐｏ結合を阻害することなくＬＧＲ５シグナリングを阻害する方法で使用する。いくつかの実施形態において、ＬＧＲ５に対する抗体を、ＬＧＲ５を介したＲ−Ｓｐｏシグナリングを阻害することなくＬＧＲ５シグナリングを阻害する方法で使用する。いくつかの実施形態において、ＬＧＲ５に対する抗体を、ＬＧＲ５へのＲ−Ｓｐｏ結合またはＬＧＲ５を介したＲ−Ｓｐｏシグナリングを阻害することなくＬＧＲ５シグナリングを阻害する方法で使用する。いくつかの実施形態において、ＬＧＲ５に対する抗体を、Ｗｎｔを介したＬＧＲ５シグナリングを阻害する方法で使用する。いくつかの実施形態において、ＬＧＲ５に対する抗体を、ＲＳｐｏシグナリングとは無関係であるＷｎｔを介したＬＧＲ５シグナリングを阻害する方法で使用する。

本明細書で使用される場合、用語「癌幹細胞」は、広範囲または無限に増殖し得、かつ癌中の大部分の癌細胞を生じさせ得る細胞を意味する。いくつかの態様において、大部分の癌細胞とは、所与の癌中の癌細胞の大部分を意味する。説明のため、限定されるものではないが、癌幹細胞は、腫瘍の創始細胞、または癌の塊の大部分を含む癌細胞の前駆細胞であり得る。いくつかの態様において、癌幹細胞とは、細胞へのあらゆる追加的な変異が
ない状態で、外因性細胞増殖誘発剤または癌誘発剤を導入することなく、免疫障害を持つ個体に移植された場合に、分裂して１つ以上の腫瘍を形成する細胞を意味する。いくつかの態様において、癌幹細胞は、分裂して、さらなる癌幹細胞、および最終分化した癌細胞または癌組織を生じる。

いくつかの実施形態において、癌幹細胞の成長、増殖、または生存能力を、ＬＧＲ５−ＲＳｐｏ結合またはシグナリングを妨害することなく、阻害する。いくつかの実施形態において、癌幹細胞の成長、増殖、または生存能力を、Ｗｎｔを介したＬＧＲ５シグナリングを阻害または抑制することを介して、ＬＧＲ５−ＲＳｐｏ結合またはシグナリングを妨害することなく、阻害する。

癌幹細胞の成長阻害に関して使用される場合、用語「有効量」とは、癌幹細胞の成長を任意の程度低減するのに十分な抗ＬＧＲ５抗体の量を意味する。当業で公知の任意のアッセイを使用して、癌幹細胞の成長を測定できる。例えば、癌幹細胞の成長を、コロニー数、全細胞数、または細胞集団またはコロニーの体積／サイズにより測定できる。いくつかの実施形態において、癌幹細胞の成長を、実施例１で以下に記載の腫瘍スフィア成長アッセイにより測定できる。

特定の実施形態において、有効量の抗ＬＧＲ５抗体は、癌幹細胞の成長を阻害でき、癌幹細胞集団または腫瘍スフィアの成長が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％、または上記の数のうち任意の数の間の任意のパーセンテージ低減することにより測定される。いくつかの態様において、抗ＬＧＲ５抗体は、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つまたは組み合わせである。

例えば、いくつかの実施形態において、有効量の抗ＬＧＲ５抗体は、癌幹細胞の成長を阻害でき、癌幹細胞集団または腫瘍スフィアの成長が、少なくとも約５％〜９９％、５％〜８０％、５〜４０％、１０％〜９９％、１０〜８０％、１０〜６０％、１０％〜４０％、２０〜９９％、２０％〜８０％、２０％〜６０％、２０％〜４０％、５０％〜９８％、５０％〜８０％、または６０％〜９９％の低減することにより測定される。いくつかの態様において、抗ＬＧＲ５抗体は、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つまたは組み合わせである。

他の実施形態において、有効量の抗ＬＧＲ５抗体は、癌幹細胞の成長を阻害でき、癌幹細胞集団または腫瘍スフィアの成長が、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、１０、２５、５０、７５、１００、２００、もしくは１０００倍低減、または上記の数のうち任意の数の間の任意の倍率で低減することにより測定される。いくつかの態様において、抗ＬＧＲ５抗体は、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つまたは組み合わせである。

いくつかの実施形態において、癌幹細胞の成長を上記の任意の程度阻害するのに十分な抗ＬＧＲ５抗体の有効量は、約１ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、５００μＭ、５５０μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１ｍ
Ｍ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、１０００ｍＭ、１Ｍ、５Ｍ、１０Ｍ、１５Ｍ、２０Ｍ、２５Ｍ、３０Ｍ、３５Ｍ、４０Ｍ、４５Ｍ、５０Ｍ、７５Ｍ、１００Ｍ、または上記の濃度のうち任意の２つの間の任意の数の濃度である。いくつかの態様において、抗ＬＧＲ５抗体組成物は、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗体の両方を含んでも良い。

いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、および上記の値のうち任意の値の間の範囲のＫＤを有するヒトＬＧＲ５に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、約１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ未満、および上記の値のうち任意の値の範囲内の親和性を有するＬＧＲ５と結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、約０．０００１ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭを超える親和性、および上記の値のうち任意の値の範囲内の親和性を有するＬＧＲ５と結合する。

いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、配列番号４７のアミノ酸Ｔ１７５、Ｅ１７６、Ｑ１８０、Ｒ１８３、Ｓ１８６、Ａ１８７、Ｑ１８９、Ｄ２４７、Ｅ２４８、Ｔ２５１、Ｒ２５４、Ｓ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２６０を含む、または前記アミノ酸からなる、または前記アミノ酸内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ロイシンリッチリピート６〜９を含む、またはロイシンリッチリピート６〜９からなる、またはロイシンリッチリピート６〜９内のエピトープに結合する（例えば、参照によってその全体が組み込まれるChen
et al. Genes Dev. 27(12):1345-50参照）。いくつかの実施形態において、本明細書に
与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＬＧＲ５外部ドメインの凸面を含む、または前記凸面からなる、または前記凸面内のエピトープに結合する（例えば、参照によってその全体が組み込まれるChen et al. Genes Dev. 27(12):1345-50参照）。

いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ）タンパク質のＬＧＲ５への結合を顕著に阻害はしない。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＲＳＰＯ−ＬＧＲ５結合部位に結合しない。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＬＧＲ５への結合に関してＲＳＰＯと競争しない。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＷｎｔシグナリングのＲＳＰＯ活性化を顕著に阻害はしない。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ−ＲＮＦ４３複合体形成を阻害し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ−ＺＮＲＦ３複合体形成を阻害し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ−ＬＲＰ６複合体形成を阻害し得る。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯは、Ｒ−スポンジン−１（ＲＳＰＯ１）、Ｒ−スポンジン−２（ＲＳＰＯ２）、Ｒ−スポンジン−３（ＲＳＰＯ３）、およびＲ−スポンジン−４（ＲＳＰＯ４）を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＬＧＲ５−ＮＯＲＲＩＮ−ＲＮＦ４３複合体形成を阻害し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＬＧＲ５−ＮＯＲＲＩＮ−ＺＮＲＦ３複合体形成を阻害し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、ＬＧＲ５−ＮＯＲＲＩＮ−ＬＲＰ６複合体形成を阻害し得る。

いくつかの実施形態は、細胞中でＷｎｔ／β−カテニンシグナリングを阻害する方法を
含む。さらなる実施形態は、細胞中でＮＦ−κＢシグナリングを阻害する方法を含む。上記の方法の一部は、有効量の本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体に細胞を接触させることを含み得る。いくつかの実施形態において、該細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、該細胞は、結腸直腸腫瘍細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、または膵臓腫瘍細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、該腫瘍細胞は、上昇したレベルのＬＧＲ５タンパク質を発現し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体は、例えば癌幹細胞の数および／または頻度を低減することによって、腫瘍細胞の成長を阻害する。

いくつかの実施形態は、本明細書に与えられる治療有効量の抗ＬＧＲ５抗体を、前記抗体を必要とする対象に投与することを含む、癌を治療する方法を含む。いくつかの実施形態において、該癌は、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、およびトリプルネガティブ乳癌などの乳癌から選択される。いくつかの実施形態において、結腸直腸癌は、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子中に不活性化変異を含む、ＡＰＣ遺伝子中に不活性化変異を含まない、または野生型ＡＰＣ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、該癌は。いくつかの実施形態において、該癌は、上昇したレベルのＬＧＲ５タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、該癌は、上昇したレベルのＬＧＲ５を発現する結腸癌である。いくつかの実施形態において、該癌は、上昇したレベルのＬＧＲ５を発現する膵臓癌であり、いくつかの実施形態において、該癌は、上昇したレベルのＬＧＲ５を発現する乳癌である。

いくつかの実施形態は、対象において疾患を治療する方法を含み、前記疾患は、β−カテニンの活性化および／または異常なβ−カテニンシグナリングに関連している。いくつかの実施形態は、本明細書に与えられる治療有効量の抗ＬＧＲ５抗体を、前記抗体を必要とする対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態は、本明細書に与えられる治療有効量の抗ＬＧＲ５抗体を、それを必要とする対象に、少なくとも１つの追加の治療薬との併用で投与することを含む、疾患を治療する方法を含む。いくつかの実施形態において、該追加の治療薬は、化学療法剤を含む。いくつかの実施形態において、該追加の治療薬は、生物学的製剤を含む。いくつかの実施形態は、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体を化学療法剤および生物学的製剤との併用で投与することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体を化学療法剤との併用で投与することは、腫瘍などの癌中のＬＧＲ５の発現レベルを増加し得る。本明細書に与えられる方法のいくつかの実施形態は、腫瘍または癌中のＬＧＲ５タンパク質の発現レベルを測定することを含む。

本明細書に与えられる方法のいくつかの実施形態は、本明細書に与えられる抗ＬＧＲ５抗体を用いる治療の対象を特定することを含む。いくつかの実施形態は、ＬＧＲ５の発現レベルが正常な組織中の同じＬＧＲ５タンパク質の発現と比べて上昇している腫瘍を対象が有するかどうかを測定することを含む。いくつかの実施形態は、腫瘍においてＬＧＲ５の発現レベルが上昇している場合に、対象を治療対象として選択することを含む。いくつかの実施形態は、ＡＰＣ遺伝子中に不活性化変異を含む腫瘍を対象が有するかどうかを測定することを含む。いくつかの実施形態は、腫瘍がＡＰＣ遺伝子中に不活性化変異を含む場合に、対象を治療対象として選択することも含む。

上記に関連する方法、組成物、および関連の開示は、例えば、その内容がその全体で参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年５月１０日に公開されたＰＣＴ公報番号国際公開第２０１３／０６７０５５号、および例えば、その内容がその全体で参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年５月１０日に公開されたＰＣＴ公報番号国際公開第２０１３／０６７０５４号、および例えば、その内容がその全体で参照により本明細書に組
み込まれる、２０１３年５月１０日に公開されたＰＣＴ公報番号国際公開第２０１３／０６７０５７号、および例えば、その内容がその全体で参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年５月１０日に公開されたＰＣＴ公報番号国際公開第２０１３／０６７０６０号で与えられている。

キット
本明細書に与えられるいくつかの実施形態は、キットを含む。いくつかの実施形態において、該キットは、本明細書に与えられるヒト化抗体を含み得る。いくつかの実施形態において、該抗体は、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態において、該抗体は、水溶液中にある。いくつかの実施形態において、該キットは、該抗体を投与するための医薬担体を含む。いくつかの実施形態において、該キットは、化学療法剤も含む。いくつかの実施形態において、該化学療法剤は、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、およびアブラキサンから選択される。

本実施形態は、明瞭性と理解のために、ある程度詳細に記載されているが、当業者は、様々な形式的な変更および細部の変更が、本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることを理解するであろう。

ＬＧＲ５に対する抗体、該抗体を発現するハイブリドーマまたはその他の細胞株、該抗体をコードする核酸を含む核酸およびベクター、ならびに該抗体を用いて癌幹細胞の成長を阻害する方法に関する実施形態の概略が記載されているが、ただ説明のために与えられるものであって、限定することを意図されてはいない、ある具体的な実施例を参照することにより、さらなる理解が得られ得る。

実施例１−ＬＧＲ５抗体のヒト化
ヒト生殖系列配列を、マウス抗体１８Ｇ７．１をヒト化するための受容体フレームワークとして使用した。最も近い生殖系列配列を見つけるために、最も類似している発現軽鎖および最も類似している重鎖を、ＮＣＩ ＩｇＢＬＡＳＴ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）による生殖系列配列のデータベースで同定した。この検索では、１８Ｇ７．１のＣＤＲ配列をマスクした。最も適合する発現配列の選別は、規範（canonical）残基および界面（interface）残基の配列同一性のチェック、およびＣＤＲループ長に関する類似性のチェックを含んだ。

候補ヒト化配列と親マウスモノクローナル抗体１８Ｇ７．１との間の鍵となる構造フレームワーク残基における潜在的な構造的対立を同定するために、３次元モデルを作製した。抗体構造の複合体を使用して、グラフト化された候補ヒト化配列を有する相同性モデルを作製し、次いで分子エネルギーの最小化を行った。コンピューターソフトウェアのＰｙｍｏｌを使用する構造解析を使用して、適正なフォールディングにネガティブな影響を潜在的に与え得る残基を同定した。

この分析から、１）フォールディングへの影響可能性の分析に基づく候補ヒト化フレームワーク領域内に選択した置換を含む機能的ヒトフレームワーク、ならびにii）親１８Ｇ７．１マウス抗体ＣＤＲ（配列番号１、２、および３）、を含む６つの候補ＶＨ鎖を構築した。ヒトＩｇＧ１定常領域にインフレームで融合されたものを化学的に合成した。

同様に、１）フォールディングへの影響可能性の分析に基づく候補ヒト化フレームワーク領域内に選択した置換を含む機能的ヒトフレームワーク、ならびにii）親１８Ｇ７．１マウス抗体ＣＤＲ（配列番号４、５、および６）を含む２つの候補ＶＬ鎖を構築した。ヒトＩｇＧ１定常領域にインフレームで融合された候補ＶＬ鎖および候補ＶＨ鎖を化学的に
合成した。

選択した候補変異型ヒト化重鎖と軽鎖の組み合わせを、哺乳類細胞に同時トランスフェクションすることにより機能性について試験した。上記の６つの候補ヒト化１８Ｇ７．１重鎖それぞれを、候補１８Ｇ７．１軽鎖の１つと共にＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションし、条件培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性について分析した。また、上記の３つの候補ヒト化１８Ｇ７．１重鎖を、第２候補１８Ｇ７．１軽鎖と共にＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションし、条件培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性について分析した。１８Ｇ７Ｈ６として知られ、最も強い結合を呈す１８Ｇ７．１候補重鎖／軽鎖の組み合わせ（ヒト化変異型）を、親和性成熟のために選択した。

実施例２−ヒト化ＬＧＲ５抗体親和性成熟
選択したヒト化変異体１８Ｇ７Ｈ６の親和性を高めるために、アラニンスキャニング突然変異誘発法および飽和突然変異誘発法の併用を採用した。重鎖ＣＤＲ１ならびに軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３中の残基をアラニンに変異させ、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、得られた条件培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性について分析した。飽和突然変異誘発を重鎖ＣＤＲ３で行い、ＣＤＲ３中の各残基を、各位置に固有の元のアミノ酸以外の１９の天然に存在する各アミノ酸に変異させた。各変異体をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、得られた条件培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性について分析した。

これらの変異体を数を増やして組み込み、３つのコンストラクトにした。次に、これらの３つのコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、得られた条件培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性について分析した。２つのコンストラクト、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を、さらなるキャラクタリゼーションのために選択した。表１Ａは抗体の特定の配列を列挙している。

実施例３−ヒト化ＬＧＲ５抗体の製造
１８Ｇ７Ｈ６Ａ１、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３、および１８Ｇ７Ｃｈと呼ばれるキメラ１８Ｇ７．１（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃと融合している１８Ｇ７．１からのマウスＦａｂ）のためのＧＳ単一遺伝子ベクターを構築、増幅し、２００ｍｌの体積で、一過性トランスフェクションを使用して、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ）に一過性同時トランスフェクションし、発現評価を行った。次に、１８Ｇ７ＣＨについては５リットル、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の両方については２．５リットルの最終体積でのＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ細胞の大規模な一過性トランスフェクションを開始した。清澄化した培養上清を、ワンステップのプロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびエンドトキシン測定の形式での製品品質分析を、濃度が１ｍｇ／ｍｌの精製した物質を使用し、コントロールサンプルとしてのインハウス（in-house）のヒト抗体を含んで実施した。結果は、高純度の製品が回収されたことを示した（＞９５．７％）。

実施例４−ヒト化ＬＧＲ５抗体のための細胞株の構築
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３抗体を発現する安定なＧＳ−ＣＨＯトランスフェクタントプールを、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ宿主細胞を発現ベクターｐ１８Ｇ７Ｈ６Ａ３／ＤＧＶでトランスフェクションすることによって作製した。該抗体をコードする遺伝子を含むＤＧＶを構築、トランスフェクションし、続いて、ＦＡＣＳ法を使用して、トランスフェクタントプールを単一細胞選別することにより、結果的にクローンの細胞株を作製した。クローニング中にできた９６ウェルプレートを、単一コロニーの有無について毎週スクリーニングした。約２週間後、１０００のコロニーからの上清をＯｃｔｅｔ（登録商標）システム法を使用して抗体生産についてスクリーニングした。スクリーニングした１０００のコロニーのうち、９９１のコロニーは、検出可能なレベルの抗体を生産した。Ｏｃｔｅｔデータをランク付けし、生産性が最も高いコロニーを次の段階へ進めるために選択した。

最も高いランクのコロニーを、９６ディープウェルプレート、ＣＤ ＣＨＯ培地での懸濁培養へと進めさせ、続いて、二次培養培地に順応させた。バイオリアクタープロセスと出来るだけ似せた供給管理体制（feed regime）を使用して、選択した細胞株の生産を実
施した。培養物を１２日目に収集し、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム法を使用して抗体濃度についてアッセイを行った。収集した抗体濃度は、＜２０ｍｇ／Ｌ〜３０００ｍｇ／Ｌに亘った。さらなる評価のために、生産性選別でのランクの位置、細胞株が由来する親プール、および各細胞株が単一コロニーから生じた証拠に基づいて、２０の細胞株を選択した。２０の選択した細胞株の培養物を、９６ディープウェルプレートから振とうフラスコへと連続的に二次培養することによって拡大させた。「簡易」流加懸濁培養生産性選別におけるランクの位置に基づき、振とうフラスコ培養での所定の二次培養中に許容し得る成長特性を有する（所定の二次培養で一貫して１ｍＬ当り≧１×１０６生細胞）首位の細胞株を、２つの１０Ｌの実験室規模の攪拌槽型バイオリアクターでの評価のために選択した。この首位細胞株は、一貫して高成長と高い生存能力を示し、収集時でタイターが＞２０００ｍｇ／Ｌである。この細胞株を、マスターセルバンク（ＭＣＢ）の作製、および１０Ｌの実験室規模のバイオリアクターでの評価に使用した。

実施例５−ヒト化ＬＧＲ５抗体はヒトＬＧＲ５に結合する
ＦＡＣＳに基づくアッセイを使用して、精製した１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と、ＣＨＯ細胞表面で過剰発現している組み換え型ヒトＬＧＲ５との結合を測定した。ＣＨＯおよびＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞を、４℃で１８Ｇ７Ｈ６Ａ１または１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の段階希釈で染色し、表面染色をＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体で検出し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで分析した。ヒトＬＧＲ５の結合に対する１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のＥＣ５０は、＜１０ｎＭであった。コントロール抗体（ＭＯＰＣ）およびＬＧＲ５を有しない野生型ＣＨＯを、この実験でネガティブコントロールとして使用した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、野生型ＣＨＯとの結合を示さず、アイソタイプコントロールは、測定可能なヒトＬＧＲ５との結合を全く示さなかった。

１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の治療効果と安全性を調べるための動物モデル種候補を特定するために、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と種のホモログにより発現されるＬＧＲ５との交差反応性を、一連のインビトロの結合研究で測定した。図１を参照されたい。図に示されているように、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（ＢＮＣ１０１）は、ヒトおよびｃｙｎｏのＬＧＲ５に強く結合するが、ラットまたはマウスのＬＧＲ５には結合しないことが分かった。

実施例６−ヒト化ＬＧＲ５抗体と、プレートに結合している組み替え体であるヒトＬＧＲ５外部ドメインとの結合
１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とヒトＬＧＲ５との結合を、ＥＬＩＳＡをベースとするプレート結合アッセイを使用してインビトロで評価した。アッセイは、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ−ＣＨ１二次抗体を使用してＬＧＲ５が結合している抗体を検出して、ＥＬＩＳＡのプレートに結合している精製された組み替え体であるＬＧＲ５外部ドメイン−ＩｇＧ−Ｆｃ融合体との抗体の結合を測定した。ヒトＬＧＲ５−Ｆｃに対する１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のＥＣ５０は、３００ｐＭであることが分かった。

実施例７−腫瘍細胞上のヒト化ＬＧＲ５抗体の結合特性
異なるレベルのＬＧＲ５を発現するヒト癌細胞株に対する１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の結合特性を、フローサイトメトリーにより分析して、異種腫瘍集団上の１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の潜在的な標的化特性を判定した。複数の腫瘍細胞株におけるＬＧＲ５の発現レベルを、フローサイトメトリーにより定量した。

これらの研究で分析したヒト腫瘍細胞株は、結腸癌細胞株（ＣＴ１（Ｂｉｏｎｏｍｉｃｓ）、ＣＴ３（Ｂｉｏｎｏｍｉｃｓ）、ＤＬＤ１（ＡＴＣＣ）、Ｌｓ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ）、ＳＷ４８（ＡＴＣＣ）、ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ）、ＳＷ６２０（ＡＴＣＣ）、およびＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ））、トリプルネガティブ乳癌細胞株（
Ｈｓ５７８Ｔ（ＡＴＣＣ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ））、膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ）、ＢｘＰＣ３（ＡＴＣＣ）、Ｃａｐａｎ２（ＡＴＣＣ）、ＨＰＡＦＩＩ（ＡＴＣＣ）、ＳＷ１９９０（ＡＴＣＣ）、ＣＦＰＡＣ（ＡＴＣＣ）、Ｐａｎｃ１０．０５（ＡＴＣＣ）、およびＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ））、シスプラチン感受性卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ３（ＡＴＣＣ）およびＳＫ−ＯＶ−３（ＡＴＣＣ））、シスプラチン耐性卵巣癌細胞株（ＳＫ−ＯＶ−３／ＣＰ、ＯＶＣＡＲ８／ＣＰ、Ｉｇｒｏｖ１／ＣＰ、およびＡ２７８０／ＣＰ（ＴＧＥＮ））、ならびに肺腺癌細胞株ＨＯＰ６２（ＡＴＣＣ）を含んだ。

ほぼコンフルエントに成長した細胞を、ＴｒｙｐＬＥ細胞解離バッファー（ライフテクノロジーズ（Life Technologies））で剥がし、カウントし、９６ウェルＶ底プレートに
ウェル当り１×１０５細胞で播種した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を、１００ｎＭの出発濃度で、染色バッファー（ＰＢＳ／０．８％ウシ血清アルブミン）で段階希釈して試験した。サンプルを氷上で３０分間インキュベートし、次に、４℃で２分間１８００ｒｐｍで遠心分離し、染色バッファーで３回洗浄した。１：２５０に希釈した５０μｌの二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、染色バッファーの入った各対応するウェルに加えた。サンプルを氷上でさらに１５分間インキュベートし、次に、上記のように洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（ライフテクノロジーズ（Life Technologies））を含む１００μｌの染色バッファー中に再懸濁し、死細胞を除去
した。サンプルをＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson））およびＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ， Ｉｎｃ）ソフトウェアを使用して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。

複数の腫瘍細胞株におけるＬＧＲ５の細胞表面の発現レベルを、フローサイトメトリーにより定量した。ＣＴ１結腸直腸癌腫瘍細胞および膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１、Ｃａｐａｎ２、およびＣＦＰＡＣは、最も高いＬＧＲ５エクスプレッサー（expressor）に含まれ
た。中程度の発現レベルが、膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ−１、ＳＷ１９９０、ＨＰＡＦＩＩ）、シスプラチン耐性卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ８／ＣＰ、Ａ２７８０／ＣＰ、およびＩｇｒｏｖ１／ＣＰ）、ならびに結腸癌細胞株、乳癌細胞株、および卵巣癌細胞株（ＳＷ４８、Ｈｓ５７８Ｔ、およびＯＶＣＡＲ３）で観察された。低いが検出可能なレベルのＬＧＲ５の細胞表面の発現が、結腸癌細胞株（ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ）および乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）で観察された。表２は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の腫瘍細胞株とのＦＡＣＳの結合に関するデータを要約している。

実施例８−インビボでのヒト化抗ＬＧＲ５抗体による悪液質性結腸直腸腫瘍の成長阻害
ＣＴ１原発性ＣＲＣ異種移植モデルを、ステージIVの転移性結腸癌の患者から得た。この腫瘍のＤＮＡシークエンシングにより、Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ｐ５３、およびＡＰＣを含む複数の遺伝子において共通な結腸癌変異が特定された。０日目に、血清のない条件下で培養液中で維持した経代数の小さいＣＴ１腫瘍スフィアを、マトリゲルに含めて、ＳＣＩＤ／Ｂｇマウスに皮下注射し、週に二回、腫瘍サイズと体重についてモニタリングした。２５日目に、ＣＴ１皮下腫瘍が１２０ｍｍ³に達したときに、該腫瘍を１
０匹のマウスの群にランダムに分けた。マウスを、ＰＢＳ、コントロール抗体ＭＯＰＣ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３、またはヒト／マウスキメラ１８Ｇ７Ｃｈのいずれかで治療した。マウスに、２．５週間、ＢＩＷを１５ｍｇ／ｋｇで投与した（全部で５回投与）。

抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、４回の投与中（１５ｍｇ／ｋｇ，週に二回）、ＰＢＳおよびＭＯＰＣコントロール抗体と比較して、インビボで顕著な抗腫瘍活性を示した。抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ１は抗腫瘍活性を示したが、モノクローナル１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と親マウスキメラ１８Ｇ７Ｃｈ抗体の両方よりも優れた活性を示した。表３は、Ｌｇｒ５＋抗体の１〜４回目の投与後のＣＴ１腫瘍体積の減少のパーセント（群対ＭＯＰＣ）を示す。

実施例９−インビボでのヒト化抗ＬＧＲ５抗体による結腸直腸腫瘍の成長阻害
ＣＴ３原発性ＣＲＣ異種移植モデルを、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＳＴＫ１１、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、およびＩＳＣＯに変異を有するステージIIIのｍＣＲＣの患者から得た。経代数の小さい凍結保存したＣ
Ｔ３原発性異種移植腫瘍断片を、５匹のＳＣＩＤ／Ｂｇマウスへ移植した。ＣＴ３原発性異種移植片を有するＳＣＩＤマウス５匹からプールした平均〜１１５０ｍｍ³の腫瘍を、
移植後４１日目に除去し、解離し、マトリゲルに含めてＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスの皮下に再移植し、週に二回、腫瘍サイズと体重についてモニタリングした。腫瘍が平均で１３０ｍｍ³に達したときに、マウスをランダム化した（移植後３４日目）。マウスを、Ｐ
ＢＳ、コントロール抗体ＭＯＰＣ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１、またはヒト／マウスキメラ１８Ｇ７Ｃｈのいずれかで治療した。マウスに、３４日目から始めて２．５
週間、ＢＩＷを１５ｍｇ／ｋｇで投与した（５回投与）。全てのマウスを、終了まで、週に二回、体重および腫瘍サイズ、ならびに全身の健康状態および外見についてモニタリングした。

抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ１は抗腫瘍活性を示したが、モノクローナル１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、４回の投与後（１５ｍｇ／ｋｇ，週に二回）、ＰＢＳおよびＭＯＰＣコントロール抗体と比べて、顕著な抗腫瘍活性を示した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、親マウスキメラ１８Ｇ７Ｃｈ抗体よりも優れた活性を示し、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１とは同等の活性を示した。表４は、ｎ回の試験抗体投与後のＣＴ３腫瘍体積の減少のパーセント（群対ＭＯＰＣ）を示す。

実施例１０−インビボでのヒト化抗ＬＧＲ５抗体とＦＯＬＦＩＲＩの併用による結腸直腸腫瘍の成長阻害
ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスに、ＣＳＣ条件下で成長したＣＴ３細胞を移植した。移植後４０日目に、腫瘍が１６０ｍｍ³に達したときに、マウスを、１５日間５日おきに与え
られる（全部で３回投与）i）ＰＢＳ、ii）ＦＯＬＦＩＲＩ（５ＦＵ ３０ｍｇ／ｋｇ、
ロイコボリン９０ｍｇ／ｋｇ、およびイリノテカン２４ｍｇ／ｋｇ）、ならびにiii）Ｆ
ＯＬＦＩＲＩ（iiに記載）と１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（１５ｍｇ／ｋｇ，週に二回）の併用を含む治療群にランダムに分けた。腫瘍体積の分析は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＦＯＬＦＩＲＩの併用が、ＦＯＬＦＩＲＩレジメンに比べてＣＴ３腫瘍の成長を低減したことを示した。併用治療は、腫瘍体積を、６１、６５、６８、７１、および７５日目に、それぞれ、約５８％、５３％、４５％、３３％、および３７％減少させた（図２）。

実施例１１−インビボでのヒト化抗ＬＧＲ５抗体による膵臓癌腫瘍の成長阻害
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の単一剤としての有効性、または標準治療との併用での有効性を評価するために、膵臓癌異種移植モデルを試験した。ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスに、（１：１の比のマトリゲル＋ＲＰＭＩ中の）ＡｓＰＣ−１細胞を移植した。移植後２０日目に、腫瘍を、５つの群：i)ＰＢＳ、ii)ＭＯＰＣ（１５ｍｇ／ｋｇ，週に二回，腹腔内）、iii)
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（１５ｍｇ／ｋｇ，週に二回，腹腔内）、iv)ゲムシタビン（９０ｍｇ
／ｋｇ，週に二回，腹腔内）、およびv）上記用量のゲムシタビンおよび１８Ｇ７Ｈ６Ａ
３の同時併用、にランダムに分けた。

単剤としての１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、移植後４１日目で、生理食塩水および／またはコントロールＩｇＧと比べて、ほぼ４０％まで腫瘍の成長を阻害した。また、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とゲムシタビンの併用は、ゲムシタビン単独と比べて、ＡｓＰＣ−１モデルで腫瘍の成長を顕著に阻害した（移植後６１日目で３６％まで）。また、単剤としての１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、６５日目まで、ＰＢＳおよびコントロールＩｇＧと比べて、腫瘍の成長をある程度阻害した。

実施例１２−インビボでのヒト化抗ＬＧＲ５抗体によるトリプルネガティブ乳癌腫瘍の成長阻害
インビボでのこの研究を、経代数の小さいトリプルネガティブ乳癌細胞（ＥＲ−，ＰＲ−，ＨＥＲ２の過剰発現なし）を使用して実施した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ３細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ／抗−抗培養液を用いた接着培養で維持した。０日目に、ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスに、ＲＰＭＩ：マトリゲル（１：１）中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ３細胞株を第４（4th）乳房脂肪体内に注射し、週に二回、腫瘍サイズと体重
についてモニタリングした。２７日目に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ３腫瘍が〜１５５ｍｍ³に達したときに、該腫瘍を１０匹のマウスの４つの群にランダムに分けた。マウス
を、ＰＢＳ、コントロール抗体ＭＯＰＣ、または１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療した。マウスに、３．５週間、ＢＩＷを１５ｍｇ／ｋｇで投与した（全部で７回投与）。抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、ＰＢＳコントロール（６０．７％の腫瘍の成長阻害）またはＭＯＰＣコントロール抗体（４９．３％の腫瘍の成長阻害）と比べて、顕著な抗腫瘍活性を示したことが分かった（図３）。

実施例１３−ＳＮ３８またはＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤で治療した結腸直腸癌細胞におけるＬＧＲ５の発現誘導
ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４ｔ、ＬｏＶｏ、ＳＷ４８、ＳＷ４８０、およびＳＷ６２０を含むＣＲＣ細胞株のパネルを、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤（ＮＶＰ）、またはＳＮ３８（イリノテカンの活性代謝物）または５ＦＵ（５フルオロウラシル）を含む２つの異なる細胞毒性剤で治療した。細胞を１μｍの上記の薬剤で治療し、７２時間後に収集した。次に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７に結合している抗ＬＧＲ５モノクローナル抗体で細胞を染色し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを用いてフローサイトメトリーによりデータを分析した。

ＣＲＣ細胞株のフローサイトメトリー分析は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤で治療した場合に、ＬｏＶｏ、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４ｔ、ＳＷ４８、ＳＷ４８０、およびＳＷ６２０細胞でより高いＬＧＲ５の発現を示した。また、ＳＮ３８での治療は、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４ｔ、ＳＷ４８、およびＳＷ４８０細胞、特にＳＷ６２０細胞で、ＬＧＲ５の発現を促進した。しかしながら、５ＦＵの治療は、これらのどの細胞株においてもＬＧＲ５の発現を誘発せず、このことは、ＬＧＲ５の発現を制御する基礎にある機序が、これらの細胞株では異なることを示唆している。これらのデータは、治療がＬＧＲ５ネガティブ非癌幹細胞集団を主に標的としているので、ＬＧＲ５＋細胞が、上記の薬剤の治療に対してより抵抗性であることを示している。これらの薬剤での治療がこれらの細胞上のＬＧＲ５の発現をアップレギュレートするかどうかを理解するために、ＬＧＲ５細胞表面の発現を全細胞株でフローサイトメトリーにより分析した。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤で治療すると、ＬＧＲ５の発現は、ＬｏＶｏで顕著にアップレギュレートされた。これらのデータは、小分子阻害剤または細胞毒性剤での治療は、ＬＧＲ５ネガティブ細胞を標的とし、これらの細胞でＬＧＲ５の発現増加を引き起こすことを示す。

実施例１４−ＬＧＲ５の発現は、小分子阻害剤または細胞毒性剤で治療した膵臓癌細胞株で促進される
上記の発見をさらに発展させるために、ＬＧＲ５の発現を、ＣＲＣ細胞株に加えて、ｎａｂ−パクリタキセル、ゲムシタビン、およびタキソールを含み、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ、およびＧＳＫ３βの阻害剤などの膵臓癌に最も関連のある経路を標的とする小分子阻害剤も含む、関連する標準治療で治療した一連の膵臓癌細胞株で調べた。試験した膵臓細胞株は、ＡｓＰｃ１、ＨＰＡＦＩＩ、ＰＡＮＣ１、ＢｘＰＣ３、ＣＦＰＡＣ、ＰＡＮＣ１０．０５、Ｃａｐａｎ２、およびＳＷ１９９０を含む。フローサイトメトリーにより評価されているように、ｎａｂ−パクリタキセルでの治療は、ＰＡＮＣ１、ＢｘＰｃ３、およびＰＡＮＣ１０．０５でのＬＧＲ５のアップレギュレーションをもたらす。ゲムシタビン治療は、ＰＡＮＣ１でＬＧＲ５をアップレギュレートし、タキソール治療は、ＨＰＡＦＩＩでＬＧＲ５の発現増加をもたらす。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ治療は、ＣＦＰＡＣでＬＧＲ５のアッ
プレギュレーションをもたらし、ＭＥＫ阻害剤は、ＨＰＡＦＩＩおよびＳＷ１９９０でＬＧＲ５をアップレギュレートする。

実施例１５−ＬＧＲ５はＦＯＬＦＩＲＩレジメン（５ＦＵ、ロイコボリン、およびイリノテカン）で治療した結腸直腸癌腫瘍でアップレギュレートされる
化学療法治療が結腸直腸腫瘍でＬＧＲ５の発現を変えるかどうかを調べるために、マウスを５日おきに５ＦＵ（腹腔内に３０ｍｇ／ｋｇ）、ロイコボリン（９０ｍｇ／ｋｇ）、２つの異なる用量のイリノテカン（２４ｍｇ／ｋｇまたは８ｍｇ／ｋｇ）で治療した。これらの研究の結果は、ＣＴ３腫瘍は化学療法レジメンに対して感受性であるが、ＣＴ１腫瘍は、完全には退縮せず、該レジメンに対してある程度の抵抗性を示すことを示した（図４）。ＦＯＬＦＩＲＩ治療がＬＧＲ５発現に与える影響を調べるために、全ｍＲＮＡをＣＴ１およびＣＴ３患者由来腫瘍から抽出し、ＬＧＲ５の発現をｑＲＴ−ＰＣＲで測定し、各サンプル中のＬＧＲ５のＣｔ値（サイクル閾値）を対応するＧＡＰＤＨ転写産物から引いてＤＣＴ（デルタＣｔ）値を出すことによって分析した。データは、ＤＣＴの冪を２として表されている。ＬＧＲ５の存在量の分析は、ＬＧＲ５の転写産物が、対応する生理食塩水で治療した腫瘍と比べて、ＣＴ１腫瘍（約２倍分）およびＣＴ３腫瘍（およそ３．５倍）の両方で増加していることを示した。

実施例１６−ＬＧＲ５は、ゲムシタビン単独およびｎａｂ−パクリタキセルとの併用で治療した膵臓癌腫瘍でアップレートされる
膵臓癌の標準治療の化学療法治療が膵臓癌腫瘍でＬＧＲ５の発現を変えるかどうかを調べるために、（ＪＨ１０９原発性異種移植において）マウスをゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルの併用で週に二回治療した。最終分析で、腫瘍ｃＤＮＡを用いたｑＲＴ−ＰＣＲデータは、対応する生理食塩水で治療した腫瘍に比べて、化学療法で治療した腫瘍でＬＧＲ５の発現が顕著に増加したことを示した。このことは、標準治療での治療が、腫瘍細胞でのＬＧＲ５のアップレギュレーションをもたらすことを示している。

膵臓腫瘍の患者由来異種移植モデルであるＪＨ１０９モデルでのＬＧＲ５の発現。レシピエントで連続的に経代させたがインビトロの培養条件には全く曝していない腫瘍塊をマウスに移植した。腫瘍を有するマウスを化学療法レジメン（ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルの併用）で治療したことにより、腫瘍の成長が顕著に阻害された。結腸癌モデルと一致して、化学療法は、ＪＨ１０９腫瘍でのＬＧＲ５のアップレギュレーション（４倍超え）をもたらし、このことは、化学療法で治療すると癌幹細胞集団が強化されることをさらに示唆している。例えば、図５を参照されたい。

実施例１７−インビボでのヒト化抗ＬＧＲ５抗体による膵臓腫瘍の成長阻害 １８Ｇ７Ｈ６Ａ３の有効性を膵臓癌異種移植モデルでも調べた。ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスにＰＡＮＣ１細胞（１Ｅ６／マウス，皮下，１：１の比のマトリゲル＋ＲＰＭＩ中）を移植し、移植後４１日目に、治療群：i)ＰＢＳ、ii)ＩｇＧコントロール（１５ｍｇ／ｋｇ，週に
二回，腹腔内）、iii)１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（１５ｍｇ／ｋｇ，週に二回，腹腔内）、iv)ゲ
ムシタビン（９０ｍｇ／ｋｇ，週に二回，腹腔内）、およびv)ゲムシタビンと１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の同時併用（１５ｍｇ／ｋｇ，週に二回，腹腔内）にランダムに分けた。ゲムシタビンを、割り付けられた群に三週間投与し、腫瘍の成長を阻害した。全てのマウスを、週に二回、体重および腫瘍サイズ、ならびに全身の健康状態および外見についてモニタリングした。

腫瘍体積の分析は、ゲムシタビン単独の群と比べて、単剤としての１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の方が腫瘍の成長を阻害する傾向がある（移植後７０日目に３０％まで）一方で、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とゲムシタビンの併用が、ＰＡＮＣ１腫瘍の成長を顕著に阻害した（移植後８０
日目に５２％まで）ことを示した。図６を参照されたい。

この実施例において、化学療法（ゲムシタビン）との併用で投与された場合に観察される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の顕著な活性は、ゲムシタビン治療に応答した標的抗原ＬＧＲ５の発現増加に起因し得る。

実施例１８−インビボでのヒト化抗ＬＧＲ５抗体による前治療された膵臓腫瘍の成長阻害
細胞株に加えて、膵臓癌のＪＨ１０９原発性患者由来異種移植モデルにおいても、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の単剤としての有効性、または標準治療との併用での有効性を評価した。ＪＨ１０９異種移植モデルは、５−ＦＵ、ゲムシタビン、エルビタックス、および放射線療法を含む４つの治療レジメンを受けた患者由来である。元となる患者腫瘍は、インビトロでの培養には全く曝さずに免疫不全マウスで連続的に経代させた。ＪＨ１０９モデルにおける１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の有効性を試験するために、腫瘍を有するマウス（ｎ＝７）を、コントロールＩｇＧ（１５ｍｇ／ｋｇ，腹腔内，週に二回）、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３単剤（１５ｍｇ／ｋｇ，腹腔内，週に二回）、標準治療の化学療法（ゲムシタビン（５０ｍｇ／ｋｇ，腹腔内，週に一回；およびｎａｂ−パクリタキセル３０ｍｇ／ｋｇ，静脈内，週に一回、の併用）、化学療法とコントロールＩｇＧの併用、および化学療法と１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の併用で治療した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３モノクローナル抗体単独では腫瘍の成長に影響を与えなかったが、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＮａｂ−パクリタキセルおよびゲムシタビン化学療法との併用は、化学療法単独と比べて顕著に大きな程度の腫瘍の阻害をもたらした。化学療法との併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、化学療法単独と比べて７７％大きい腫瘍の成長阻害をもたらした。１８Ｇ７Ｈ７Ａ３と化学療法の併用で治療した３匹のマウスは、腫瘍が完全に根絶された（測定可能な腫瘍は検出されなかった）。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と化学療法の併用群では、治療中止後も腫瘍の成長の抑制が続き、１匹のマウスは、化学療法中止から３か月後、測定可能な腫瘍が依然として存在しなかった。本実施例において、化学療法（ゲムシタビン＋ｎａｂ−パクリタキセル）との併用で投与されたときに観察された１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の顕著な活性は、ゲムシタビンとｎａｂ−パクリタキセルの治療に応答した標的抗原ＬＧＲ５の発現増加に起因し得、化学療法治療後のインビボでの原発性腫瘍の再成長または再発を防止して、原発性腫瘍の大部分を根絶することを示している。

実施例１９−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療は癌幹細胞集団を低減する
フローサイトメトリー分析のために、５つの腫瘍各々からの細胞を、幹細胞に特異的なマーカーであるＣＤ４４およびＣＤ１６６に対する様々な抗体で染色した。マウス細胞のために腫瘍を解離、除去し、次に生細胞を数えた。解離した細胞を、フローサイトメトリーによる、細胞表面の幹細胞マーカーの発現分析に使用した。

ＣＤ１６６＋／ＣＤ４４＋、ＬＧＲ５＋／ＣＤ１６６＋、またはＬＧＲ５＋／ＣＤ１６６＋／ＣＤ４４＋亜集団により定義される癌幹細胞集団において減少があった（図７）。

実施例２０−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療は、インビボで結腸癌腫瘍の再発および癌幹細胞の頻度を低減する
ＦＯＬＦＩＲＩとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の効果を、結腸癌ＣＴ３モデル（実施例１０）で試験した。この原発性腫瘍の有効性研究の結果は、３サイクルのＦＯＬＦＩＲＩレジメンとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、ＦＯＬＦＩＲＩ単独と比べて、腫瘍の成長の低減に関して、より有効であったことを示した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＦＯＬＦＩＲＩの併用レジメンが癌幹細胞（ＣＳＣ）頻度の低減にも有効であるかどうかを判定するために、７８日目からの腫瘍を収集、解離、プールし、限界希釈アッセイで１０、３０、１００細胞／側腹部で腫瘍ナイーブ（tumor naive）ＣＢ１７．Ｓｃｉｄマウスの新しいコホート
に再移植した。次に、マウスを腫瘍の成長について週に二回モニタリングし、腫瘍をさらに治療することなく成長させた。

ＦＯＬＦＩＲＩとの併用で抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したマウスから単離した細胞は、ＦＯＬＦＩＲＩ単独で治療したマウスから単離した細胞と比べて、腫瘍形成能が大きく減少していた（図８）。また、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＦＯＬＦＩＲＩの併用から再移植した細胞は、ＦＯＬＦＩＲＩ単独と比べて、腫瘍成長特性が顕著に緩徐であり、無増悪期間が延びていた（図９）。最終的に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療は、線形回帰分析によると、４０日目で６倍癌幹細胞の頻度を低減させた（１８Ｇ７Ｈ６Ａ３／ＦＯＬＦＩＲＩでは１／８５６．３、対して、ＦＯＬＦＩＲＩでは１／１３８．６）。これらのデータは、ＦＯＬＦＩＲＩとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が腫瘍開始または癌幹細胞集団を効果的に標的とすることを示す。６８日目は、３０細胞／動物データの最終日であった。データは、ｐ＝０．００３９で有意であった。

実施例２１−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療は、インビボで膵臓癌腫瘍の再発および癌幹細胞の頻度を低減する
ゲムシタビンとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の効果を膵臓癌ＰＡＮＣ１モデルで試験した。この研究は、ゲムシタビンとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、ＰＡＮＣ１モデルで、ゲムシタビン単独と比べて、腫瘍の成長を顕著に阻害したことを示した。これらの治療群からの腫瘍細胞を収集、解離、プールし、限界希釈アッセイ（５００、１５００、４５００、または１３５００細胞／動物）でＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスの新しいコホートに再移植し、治療をせずに成長させた。

ゲムシタビンとの併用で抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したマウスから単離した細胞は、ゲムシタビン単独で治療したマウスから単離した細胞と比べて、限界希釈アッセイで腫瘍形成能が大きく減少していた。ゲムシタビンと１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の併用で治療され再移植されたＰＡＮＣ１腫瘍は、４５００の細胞を移植されたマウスにおいて（ゲムシタビンでは４０％、対して、併用では２０％）、および１３５００の細胞を移植されたマウスにおいても（ゲムシタビンでは１００％、対して、併用では７０％）、生着の頻度の低減を示した。直線回帰を使用したところ、ゲムシタビン移植腫瘍中の癌幹細胞の頻度は、併用群と比べて、ゲムシタビンで約１．５倍高かった（１４８８３中に１、対して、２１３３６中に１）。これらのデータは、ゲムシタビンとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、腫瘍の開始または癌幹細胞集団を効果的に標的とすることを示す。

ＰＡＮＣ１腫瘍に加えて、単剤としてのゲムシタビン、または１８Ｇ７Ｈ６Ａ３との併用でのゲムシタビンで治療したＡｓＰＣ−１腫瘍を有するマウスにおいても、生着の割合および癌幹細胞の頻度を限界希釈実験で（５００、１５００、４５００、および１３５００の細胞を使用して）分析した。治療後４０日目の腫瘍体積測定は、ゲムシタビン対併用において、４５００または１３５００の細胞を移植されたマウスのうち腫瘍を有するマウスの割合の低下を示した（それぞれ、４０％および８０％、対して、３０％および５０％）。癌幹細胞の頻度もまた、ゲムシタビンで併用群よりも１．５倍を超えて大きく、ゲムシタビンとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、膵臓癌中の癌幹細胞集団を標的としていることをさらに示している。

実施例２２−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療は、インビボでトリプルネガティブ乳癌腫瘍の再発および癌幹細胞の頻度を低減する
パクリタキセルとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の効果を、トリプルネガティブ乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ３モデル（実施例１２）で試験した。この研究は、パクリタキセルとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、パクリタキセル単独と比べて、腫瘍成長に対して軽度の相加的阻害作用を有することを示した。これらの腫瘍を収集、解離、プールし、限界希釈アッセイで１０、３０、１００細胞／側腹部でＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスの新しいコホートの再移植し、治療せずに成長させた。

パクリタキセルとの併用で抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したマウスから単離した細胞は、パクリタキセル単独で治療したマウスから単離した細胞と比べて、腫瘍形成能が大きく減少していた。また、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３＋パクリタキセル腫瘍から再移植された細胞は、パクリタキセル単独と比べて、腫瘍成長特性が顕著に緩徐であり、無増悪期間が延びていた。直線回帰分析によると、最終的に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３＋パクリタキセル治療は、癌幹細胞の頻度を低減した。これらのデータは、パクリタキセルとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、腫瘍の開始または癌幹細胞集団を効果的に標的とすることを示す。

実施例２３−ヒト化抗ＬＧＲ５抗体および化学療法を用いる予防的治療による、インビボでの転移性結腸直腸癌の成長阻害
インビボ研究を、結腸直腸癌患者のｌｉｖｅｒ ｍｅｔ由来の経代数の小さい結腸直腸癌細胞（ＢＭＣＲＣ０８６）を使用して実施した。０日目に、ＢＭＣＲＣ０８６細胞を解凍し、ＲＰＭＩ：マトリゲル（１：１）中で懸濁し、ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスの側背部に皮下注射した。動物を、週に二回、腫瘍サイズと体重についてモニタリングした。７日目に、マウスを、ＰＢＳ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３、ＦＯＬＦＩＲＩ、またはＦＯＬＦＩＲＩと１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の併用で治療した。マウスに、ＰＢＳおよび１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を投与し、１５ｍｇ／ｋｇで７．５週間ＢＩＷを投与した（１６回投与）。マウスに、ＦＯＬＦＩＲＩ（７、１２、１７、２２、２７、および３２日目に３０ｍｇ／ｋｇのフルオロウラシルおよび９０ｍｇ／ｋｇのロイコボリン；８、１３、１８、２３、２８、および３３日目に２４ｍｇ／ｋｇのイリノテカン）を４週間投与した（６回投与）。ＦＯＬＦＩＲＩとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ＦＯＬＦＩＲＩ単独と比べて、顕著な抗腫瘍活性を示した（図１０）。

実施例２４−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療は、Ｗｎｔシグナリング経路を阻害する
結腸癌ＣＴ１（実施例８）およびＣＴ３（実施例９）のインビボでの腫瘍有効性研究からの１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療した腫瘍を、ウエスタンブロット解析により特徴づけした。治療したマウス（群当りｎ＝５〜１０のマウス）各々からの腫瘍サンプルを、と殺後切除し、液体窒素で冷却した乳鉢中で直ちに凍結し、乳棒ですりつぶし（凍結粉砕）、液体窒素で急速凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。凍結粉砕した腫瘍を、氷冷溶解バッファー（ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含む還元（reducing）ＲＩＰＡバッファー）で３０分間氷上で時々ボルテックスしながら溶解した。腫瘍ライセートタンパク質を含む上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、次いで、複数のＷｎｔ−シグナルタンパク質（およびそれらのリン酸化形態）について、ウエスタンブロットした。ＣＴ１およびＣＴ３腫瘍のウエスタンブロットで、治療群間の顕著な相違が複数観察された。図１１において、ホスホ−Ｔｈｒ４１／Ｓｅｒ４５−β−カテニン（Ｗｎｔ−シグナルタンパク質）は、不活性なマーカーであり、その後分解し、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を呈するタンパク質の形態は、インビボで腫瘍細胞中のＬＧＲ５シグナリングを阻害できる。

実施例２５−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療は、インビトロでＷｎｔ−シグナリング経路を阻害しない
親ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞およびＬＧＲ５を安定に発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、ＴＣＦ−ＬＥＦレポーターベクターを含むレンチウイルス（ＧＦＰ Ｃｉｇｎａｌ，キアゲン（QIAGEN））を導入し、レポーターの安定な発現に関して選別した。親レポーター株およびＬＧＲ５安定発現レポーター株を、９６ウェルプレートに２５，０００／ウェルで播種し、一晩付着させ、血清不足にし、抗体または媒体で６時間処理し、次に、組み換えヒトＷｎｔ３ａ（３ｎＭ）および組み換えヒトＲ−スポンジンで１８時間処理した。ＴＣＦ／ＬＥＦレポーター細胞株の活性化における様々なＲ−スポンジンの活性の分析に基づき、Ｒ−スポンジン１〜３各々について２つの濃度、および１つの濃度のＲ−ｓｐｏ４を試験した（１００ｐＭ、３００ｐＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、または１０ｎＭ）。レポーターによ
り駆動されたＧＦＰシグナルをプレートリーダーで測定した。示された全実験は、３つの独立した実験（それぞれの実験を重複して行った）からの試験された各Ｒ−スポンジンに関する蓄積データである（データは平均値＋ＳＤである）。

図１２に示されているように、可溶性１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の濃度の増加は、Ｗｎｔ３ａ＋ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、またはＲＳＰＯ３の組み合わせによってＴＣＦ／ＬＥＦプロモーターにより駆動されるＧＦＰの発現誘導に影響を与えない。ＲＳＰＯおよびＷｎｔの存在下でＬＧＲ４およびＬＧＲ５の両方を介してシグナリング活性の誘導を阻害することが示されたポジティブコントロール抗体７６Ｃ１２もまた示されている。このデータは、抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、ＲＳＰＯにより駆動されるＴＣＦ／ＬＥＦプロモーターの活性化を阻害しないことを示す。

実施例２６−ヒト化ＬＧＲ５抗体は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）機構を介して腫瘍細胞を標的とする
ＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞をコンフルエントに成長させて、遠心沈殿し、ＰＢＳ中で再懸濁し、数を数えた。１００μＭの予め温めた（３７℃）ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）を含む別の管に一定分量の細胞（約１００ｋ）を加え、混合物を細胞インキュベーターで１５分間インキュベートした。ＣＦＳＥの最終濃度は、約１μＭであった。次に、細胞を洗浄し、予め温めた培養液中で再懸濁し、インキュベーターにさらに３０分間置き、次いで、ＰＢＳで洗浄した。次に、染色した細胞を１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（１００μＭ）で染色した。抗体とＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞の結合を確かめるために、いくつかの研究において、一定分量の細胞を二次ヤギ抗ヒトＰＥコンジュゲート抗体でも染色し、研究室内のｃａｌｉｂｕｒ機器で分析した。研究室内の光から保護された場所で室温で１５分間、Ｕ９３７細胞をＤＤＡＯ−ＳＥ（ＤＤＡＯスクシンイミジルエステル；１００Ｋの細胞に対して２μＭの染料）で染色した。次に、細胞は１ｍｌのＦＢＳ（ウシ胎仔血清）であり、次いで、光から保護された場所で５分間インキュベートした。次に、ＦＢＳ（１０％）を補充したＰＢＳで細胞を洗浄し、ＦＢＳ（２．５％）を補充したＲＰＭＩ中で再懸濁した。ＣＨＯ−ＬＧＲ５−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３標識細胞およびＵ９３７−ＤＤＡＯ−ＳＥ標識細胞の両方を、細胞インキュベーターで５時間共インキュベートし、研究室内のｃａｌｉｂｕｒ機器で分析した。ネガティブコントロールとして、一定分量のＣＨＯ−ＬＧＲ５−ＣＦＳＥ細胞（１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で染色していない）もＵ９３７と共に共インキュベートし、ｃａｌｉｂｕｒ機器で分析した。

フローサイトメトリーデータの分析は、ＣＦＳＥおよび１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で染色された大部分のＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞が生存可能であり、ｃａｌｉｂｕｒ機器で検出可能であることを示した。また、Ｕ９３７（Ｕ９３７（ヒト単核細胞株；エフェクター細胞）およびＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞の両方が染色したときに検出可能であり、個々に得られた。最後に、Ｕ９３７−ＤＤＡＯ−ＳＥおよびＣＨＯ−ＬＧＲ５−ＣＦＳＥ−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の共インキュベーションは、二重に陽性の細胞集団を特定したが、Ｕ９３７および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のないＣＨＯ−ＬＧＲ５−ＣＦＳＥの共インキュベーションは、二重に陽性の集団を生じなかった。二重に陽性の集団の存在は、（ＦｃＲを発現する)Ｕ９３７と（Ｆｃ部
分を発現する）ＣＨＯ−ＬＧＲ５−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の交差結合を示唆し、ＡＤＣＣが、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の抗腫瘍活性機構の一つであることをさらに示唆している。

実施例２７−ヒト化ＬＧＲ５抗体は、ＬＧＲ５を内在化する
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の内在化を、ＬＧＲ５を過剰発現するＣＨＯ細胞で調べた。３０分〜２時間４℃で、１００ｎＭの抗体で細胞を染色し、過剰なＡｂを洗浄し、染色細胞を４℃または３７℃のいずれかでインキュベートした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８がコンジュゲートされた二次抗体で細胞を染色し、様々な時点で細胞表面に結合した抗体の内在化をモニタリングした。３７℃でインキュベートした際、内在化速度は、測定された表面局在
の半減期の値（t1/2 value）が、６．７０３±１．２８２分であった。４℃でのインキュベーションにより、表面に結合した抗体のある程度の減少が観察されたが、内在化はほとんど阻害された。

実施例２８−ヒト化ＬＧＲ５抗体は、可溶性ＲＳＰＯとＬＧＲ５の結合を競争的に阻害はしない
ヒトＲ−スポンジン１／２／３／４タンパク質の存在下でのビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とｈＬＧＲ５−Ｆｃの相互作用を、競合ＥＬＩＳＡフォーマットを使用して調べた。９６ウェル高結合型ＥＬＩＳＡプレートに２μｇ／ｍＬでＬＧＲ５−Ｆｃを塗布し、４Ｃで一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋１％ＢＳＡでブロッキングした。ビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を結合バッファーで１μｇ／ｍＬに希釈した。ＬＧＲ５−Ｆｃとビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を事前に直接結合させたＥＬＩＳＡからＥＣ５０濃度より高いしっかりとしたシグナルを与える濃度を選択した。ビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と同時に、競合タンパク質をＥＬＩＳＡプレートに濃度を変えながら加えた。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号８９０８０３）を１：１，０００に希釈して検出に使用した。プレートをＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ）で顕色し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４プレートリーダーで４５０ｎｍでデータを収集した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６プログラムを使用してデータ分析を行った。ビオチン−モノクローナル抗体および競合剤の濃度に何らかの変更を施し、ＥＬＩＳＡを３回繰り返した。

ポジティブコントロールとして、ＬＧＲ５−Ｆｃをプレート上でビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とｈＬＧＲ５−Ｆｃの結合と競合させた。ビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とプレートに塗布されたＬＧＲ５−Ｆｃの結合を阻害する能力について、Ｒ−スポンジン１／２／３／４を試験した。タンパク質をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。該タンパク質は、哺乳類細胞で発現する完全長構築物である。最も高濃度のＲ−スポンジンタンパク質で、抗体とＬＧＲ５の結合の完全な阻害が観察された（図１３）。

実施例２９−ヒト化ＬＧＲ５抗体は、可溶性ＲＳＰＯとＬＧＲ５の結合を競争的に阻害はしない
リガンド単独（ＲＳＰＯまたはＮｏｒｒｉｎ）とＬＧＲ５の結合は、ＬＧＲ５シグナリングを誘発するのに十分ではない。むしろ、ＬＧＲ５は、複数の補助受容体と三重複合体を形成してシグナリングを駆動する。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３がＬＧＲ５三重複合体の形成に与える影響を調べるために、Ｒ−スポンジン１／２／３／４およびＮｏｒｒｉｎ存在下でのＬＧＲ５とＲＮＦ４３、ＺＮＲＦ３、およびＬＲＰ６との結合を、ＥＬＩＳＡフォーマットを使用して調べた。ＲＮＦ４３−Ｆｃ、ＺＮＲＦ３−Ｆｃ、およびＬＲＰ６−Ｆｃを、１×ＰＢＳ中４μｇ／ｍＬで９６ウェル高結合型プレートに塗布した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡでブロッキングした。ＬＧＲ５−Ｆｃを、全て１μｇ／ｍＬのＲ−スポンジン１／２／３／４または０．５μｇ／ｍＬのＮｏｒｒｉｎの存在下または非存在下で、一次（primary）バッファーで１μｇ／ｍＬに希釈した。Ｒ
−スポンジン１／２／３／４またはＮｏｒｒｉｎを、ＥＬＩＳＡプレートに加える前に、ｈＬＧＲ５−Ｆｃと共にプレインキュベートした。３つ組プレートを使用して、各条件について３回試験した。１：２，０００の抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（細胞シグナリング）を使用して結合したｈＬＧＲ５−Ｆｃを検出した。抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（ＪＩＲ）を１：１０，０００に希釈して検出に使用した。プレートをＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ）で顕色し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４プレートリーダーで４５０ｎｍでデータを収集した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６プログラムを使用してデータ分析を行った。ＬＧＲ５、リガンドであるＲＳＰＯまたはＮｏｒｒｉｎ、ならびに補助受容体（ＲＮＦ４３−Ｆｃ、ＺＮＲＦ３−Ｆｃ、およびＬＲＰ６−Ｆｃ）による三重複合体の形成が観察された。

次に、ＬＧＲ５−ＦｃとＲＳＰＯまたはＮｏｒｒｉｎとの存在下で、ＥＬＩＳＡプレートに１８Ｇ７Ｈ６Ａ３をさらに加えた。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ＲＳＰＯリガンドおよびＮｏｒｒｉｎリガンドの両方、ならびに３つの補助受容体全て（ＲＮＦ４３、ＺＮＲＦ３、およびＬＲＰ６）とのＬＧＲ５三重複合体の形成を顕著に低減した。図１４を参照されたい。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は直接的にも競合的にもリガンド結合と競合しないので、このデータは、アロステリックモデルの阻害の証拠である。

実施例３０−抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のエピトープマッピング
抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が結合するＬＧＲ５の特異的領域をさらに特徴づけるために、水素重水素交換質量分析を使用してエピトープマッピング実験を実施した。水素重水素交換実験を実施する前に、塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）の濃度を変えながら非重水素化バッファーで準備した試験消化を行い、ＬＧＲ５だけの最良のペプチドカバレッジ（peptide coverage）となるように、タンパク質分解条件を最適化した。ＤＸＭＳ用のペプシン消化として、サンプルを５℃で解凍し、次に、ブタのペプシン（Ｓｉｇｍａ）で満たしたプロテアーゼカラムで、流速１００μｌ／分で、０．０５％トリフルオロ酢酸を用いて、直ちに消化した。Ｃ１８トラップカラムでペプシン消化断片を収集し、Ｃ１８逆相カラム（Ｖｙｄａｃ）で６〜３８％のアセトニトリルの直線勾配中で分離した。カラム溶出物を、直接ＬＣＱ Ｃｌａｓｓｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ， Ｉｎｃ．）またはＱ−ＴＯＦ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）へとエレクトロスプレーした。ＭＳ／ＭＳデータセットからのペプシンにより生成したペプチドの測定を、ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ， Ｉｎｃ．）の使用によって容易化した。次に、ペプチドのこのセットを、ＤＸＭＳ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（カリフォルニア州モデストのＳｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）により、さらに確認した。様々な濃度のＧｄｎＨＣｌに関するペプチドカバレッジマップ（peptide coverage map）を比較し、個々のタンパク質またはタンパク質複合体に対して最良なカバレッジマップ（coverage map）を有する条件を、その後の重水素交換実験に使用した。上記のように、全工程を０℃で実施した。

タンパク質バッファー中のＬＧＲ５−Ｆｃまたは１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とプレインキュベートしたＬＧＲ５−ＦｃをＤ２Ｏバッファーと混合して最終濃度を５０％Ｄ２Ｏにすることにより、交換実験を開始した。混合物を０℃で１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００秒間インキュベートし、次に、氷冷したクエンチ溶液（０．９６％蟻酸，０〜０．８Ｍ塩酸グアニジン）を加えて交換反応をクエンチし、最終濃度が０．５８％ギ酸、０〜０．５Ｍ塩酸グアニンでｐＨが２．５のサンプルを得た。次に、サンプルを、直ちにドライアイス上で凍結し、−８０℃で保存した。ＤＸＭＳ実験のデータ処理は、上記の専門ソフトウェア（ＤＸＭＳ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ，Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）を使用した。

水素／重水素（Ｈ／Ｄ）−交換データは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の結合と、抗体と抗原の結合時の表面が露出した残基の埋め込みとに起因する溶媒露出における変化に関して詳細を提供する。ＨＤ交換データ分析は、Ｘ線結晶研究により特定されているように、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、Ｒ−スポンジン結合部位の面とは反対側のロイシンリッチリピート６〜９の凸面内で、配列番号４７のアミノ酸Ｔ１７５、Ｅ１７６、Ｑ１８０、Ｒ１８３、Ｓ１８６、Ａ１８７、Ｑ１８９、Ｄ２４７、Ｅ２４８、Ｔ２５１、Ｒ２５４、Ｓ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２６０と結合することを示す（例えば、その全体が参照により組み込まれる、Chen et al.Genes Dev.27(12):1345-50を参照されたい）。これらのデータは、ＬＧＲ５とＲ−
スポンジンの結合に関与する残基が、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３との結合には関与しないことを示す。これらの予備的な結果は、ＬＧＲ５中のその他の構造的要素が、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の結合部位に関与し得るという事実を排除するものではない。

実施例３１−結腸癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与
結腸癌に罹患しているヒト患者の集団を、化学療法で治療し、腫瘍体積をモニタリングする。平均腫瘍体積は、化学療法を開始すると、拡大が止まり、むしろ、減少することが観察される。持続期間を延長後、腫瘍体積は、安定化し、やがて増加し始める。

結腸癌に罹患している第２ヒト患者集団を、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を同時投与する化学療法で治療する。平均腫瘍体積をまたモニタリングする。腫瘍体積は、化学療法を開始すると、拡大が止まり、むしろ、減少することが観察される。腫瘍体積は、第１集団の腫瘍体積よりもかなり小さい最小体積に減少することが観察される。腫瘍サイズは、第１集団と比べて、大幅に延長した期間中、小さいままであることも分かる。

実施例３２−結腸癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ１の投与
結腸癌に罹患しているヒト患者の集団を、化学療法で治療し、腫瘍体積をモニタリングする。平均腫瘍体積は、化学療法を開始すると、拡大が止まり、むしろ、減少することが観察される。持続期間を延長後、腫瘍体積は、安定化し、やがて増加し始める。

結腸癌に罹患している第２ヒト患者集団を、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１を同時投与する化学療法で治療する。平均腫瘍体積をまたモニタリングする。腫瘍体積は、化学療法を開始すると、拡大が止まり、むしろ、減少することが観察される。腫瘍体積は、第１集団の腫瘍体積よりもかなり小さい最小体積に減少することが観察される。腫瘍サイズは、第１集団と比べて、大幅に延長した持続期間中、小さいままであることも分かる。

実施例３３−結腸癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与
結腸癌に罹患しているヒト患者の第１集団に、化学療法を単独投与する。結腸癌に罹患しているヒト患者の第２集団に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３との併用で化学療法を投与する。

第１集団は、腫瘍サイズおよび成長の一時的な低減を示し、その後、腫瘍の成長が再開し、徴候が戻る。化学療法治療後の腫瘍の成長は、後続の化学療法治療に対して不応性である。

第２集団は、腫瘍サイズの基礎レベルへの低減と、腫瘍の成長停止を示す。腫瘍の成長は、治療レジメン中または完了時に再開しない。レジメンの完了後、成長は再開せず、癌の徴候は、第２集団において、もはや存在しない。

実施例３４−結腸癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ１の投与
結腸癌に罹患しているヒト患者の第１集団に、化学療法を単独投与する。結腸癌に罹患しているヒト患者の第２集団に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１との併用で化学療法を投与する。

第１集団は、腫瘍サイズおよび成長の一時的な低減を示し、その後、腫瘍の成長が再開し、徴候が戻る。化学療法治療後の腫瘍の成長は、後続の化学療法治療に対して不応性である。

第２集団は、腫瘍サイズの基礎レベルへの低減と、腫瘍の成長停止を示す。腫瘍の成長は、治療レジメン中または完了時に再開しない。レジメンの完了後、成長は再開せず、癌の徴候は、第２集団において、もはや存在しない。

実施例３５−結腸癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与は生存率を上昇させる
結腸癌に罹患しているヒト患者の第１集団に、化学療法を単独投与する。結腸癌に罹患しているヒト患者の第２集団に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３との併用で化学療法を投与する。

治療後１セットの持続期間（１年）での患者生存率をモニタリングする。第２集団における患者生存率は、第１集団における患者生存率よりもかなり高いことが観察される。すなわち、第１集団の生存率と比べて、顕著に高い比率の第２集団が、治療後最初の１年を超えて生存する。

後期のインターバルで同様の観察を行う。第１のインターバルの生存者のうち第２群のメンバーは、第２のインターバル（治療後２年）まで生存する可能性が、治療後１年目に生存している第１群のメンバーよりも顕著に高いことが観察される。

実施例３６−結腸癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ１の投与は生存率を上昇させる
結腸癌に罹患しているヒト患者の第１集団に、化学療法を単独投与する。結腸癌に罹患しているヒト患者の第２集団に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１との併用で化学療法を投与する。

治療後１セットの持続期間（１年）での患者生存率をモニタリングする。第２集団における患者生存率は、第１集団における患者生存率よりもかなり高いことが観察される。すなわち、第１集団の生存率と比べて、顕著に高い比率の第２集団が、治療後最初の１年を超えて生存する。

後期のインターバルで同様の観察を行う。第１のインターバルの生存者のうち第２群のメンバーは、第２のインターバル（治療後２年）まで生存する可能性が、治療後１年目に生存している第１群のメンバーよりも顕著に高いことが観察される。

実施例３７−乳癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与
乳癌に罹患しているヒト患者の集団を、化学療法で治療し、腫瘍体積をモニタリングする。平均腫瘍体積は、化学療法を開始すると、拡大が止まり、むしろ、減少することが観察される。持続期間を延長後、腫瘍体積は、安定化し、やがて増加し始める。

乳癌に罹患している第２ヒト患者集団を、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を同時投与する化学療法で治療する。平均腫瘍体積をまたモニタリングする。腫瘍体積は、化学療法を開始すると、拡大が止まり、むしろ、減少することが観察される。腫瘍体積は、第１集団の腫瘍体積よりもかなり小さい最小体積に減少することが観察される。腫瘍サイズは、第１集団と比べて、大幅に延長した期間中、小さいままであることも分かる。

実施例３８−乳癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ１の投与
乳癌に罹患しているヒト患者の集団を、化学療法で治療し、腫瘍体積をモニタリングする。平均腫瘍体積は、化学療法を開始すると、拡大が止まり、むしろ、減少することが観察される。持続期間を延長後、腫瘍体積は、安定化し、やがて増加し始める。

乳癌に罹患している第２ヒト患者集団を、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１を同時投与する化学療法で治療する。平均腫瘍体積をまたモニタリングする。腫瘍体積は、化学療法を開始すると、拡大が止まり、むしろ、減少することが観察される。腫瘍体積は、第１集団の腫瘍体積よりもかなり小さい最小体積に減少することが観察される。腫瘍サイズは、第１集団と比べて、大幅に延長した期間中、小さいままであることも分かる。

実施例３９−乳癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与
乳癌に罹患しているヒト患者の第１集団に、化学療法を単独投与する。乳癌に罹患しているヒト患者の第２集団に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３との併用で化学療法を投与する。

第１集団は、腫瘍サイズおよび成長の一時的な低減を示し、その後、腫瘍の成長が再開
し、徴候が戻る。化学療法治療後の腫瘍の成長は、後続の化学療法治療に対して不応性である。

第２集団は、腫瘍サイズの基礎レベルへの低減と、腫瘍の成長停止を示す。腫瘍の成長は、治療レジメン中または完了時に再開しない。レジメンの完了後、成長は再開せず、癌の徴候は、第２集団において、もはや存在しない。

実施例４０−乳癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ１の投与
乳癌に罹患しているヒト患者の第１集団に、化学療法を単独投与する。乳癌に罹患しているヒト患者の第２集団に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１との併用で化学療法を投与する。

第１集団は、腫瘍サイズおよび成長の一時的な低減を示し、その後、腫瘍の成長が再開し、徴候が戻る。化学療法治療後の腫瘍の成長は、後続の化学療法治療に対して不応性である。

第２集団は、腫瘍サイズの基礎レベルへの低減と、腫瘍の成長停止を示す。腫瘍の成長は、治療レジメン中または完了時に再開しない。レジメンの完了後、成長は再開せず、癌の徴候は、第２集団において、もはや存在しない。

実施例４１−乳癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与は生存率を上昇させる
乳癌に罹患しているヒト患者の第１集団に、化学療法を単独投与する。乳癌に罹患しているヒト患者の第２集団に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３との併用で化学療法を投与する。

治療後１セットの持続期間（１年）での患者生存率をモニタリングする。第２集団における患者生存率は、第１集団における患者生存率よりもかなり高いことが観察される。すなわち、第１集団の生存率と比べて、顕著に高い比率の第２集団が、治療後最初の１年を超えて生存する。

後期のインターバルで同様の観察を行う。第１のインターバルの生存者のうち第２群のメンバーは、第２のインターバル（治療後２年）まで生存する可能性が、治療後１年目に生存している第１群のメンバーよりも顕著に高いことが観察される。

実施例４２−乳癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ１の投与は生存率を上昇させる
乳癌に罹患しているヒト患者の第１集団に、化学療法を単独投与する。乳癌に罹患しているヒト患者の第２集団に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１との併用で化学療法を投与する。

治療後１セットの持続期間（１年）での患者生存率をモニタリングする。第２集団における患者生存率は、第１集団の患者生存率よりもかなり高いことが観察される。すなわち、第１集団の生存率と比べて、顕著に高い比率の第２集団が、治療後最初の１年を超えて生存する。

後期のインターバルで同様の観察を行う。第１のインターバルの生存者のうち第２群のメンバーは、第２のインターバル（治療後２年）まで生存する可能性が、治療後１年で生存している第１群のメンバーよりも顕著に高いことが観察される。

実施例４３−結腸癌に罹患しているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与は副作用を低減する
結腸癌に罹患しているヒト患者の第１集団に、化学療法、およびＬＧＲ５−ＲＳＰＯ結
合およびシグナリングを阻害する抗ＬＧＲ５抗体を投与する。結腸癌に罹患しているヒト患者の第２集団に、化学療法および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を投与する。

第１集団は、ＬＧＲ５を介したＲＳＰＯ１シグナリングの干渉に関連した非治療的副作用を示す。これらの副作用は、患者の健康にとって有害である。

化学療法との併用で１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を投与された第２集団は、ＬＧＲ５を介したＲＳＰＯ１シグナリングの干渉に関連した非治療的副作用を示さない。

実施例４４−進行性ＣＲＣ腫瘍におけるＬＧＲ５の発現
ＬＧＲ５特異的プローブを用いるＲＮＡｓｃｏｐｅ技術を使用してＬＧＲ５転写産物の発現を調べた。ＬＧＲ５転写産物は、結腸、小腸、小脳、および膵臓を含む組織で検出可能であった。ＬＧＲ５転写産物は、ＣＴ１ ＣＲＣおよびＪＨ１０９膵臓腫瘍を含む患者由来異種移植片（ＰＤＸ）組織でも検出可能であった。早期（グレードI）対進行性（転
移性）病変を含む腫瘍発生の異なるステージで単離したＣＲＣ患者サンプルでＬＧＲ５の発現を調べた。ＣＲＣのグレードI、II、およびII病変でＬＧＲ５転写産物が発現されて
おり、ＣＲＣ転移性病変で高く発現されていた。

実施例４５−転移性患者由来膵臓異種移植片におけるＬＧＲ５４の発現
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）を使用して転移性患者由来膵臓異種移植片におけるＬＧＲ５の発現を調べた。腫瘍組織のサンプルを、数時間４℃でインキュベーション後、急速凍結するか、またはＲＮＡｌａｔｅｒ(キアゲン（Qiagen），カリフォルニア
州）を含む凍結保存バイアル（cryovial）に加え、−７０℃に移した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ抽出キット(キアゲン（Qiagen）、カリフォルニア州）を使用して全ＲＮＡを
抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIIIキット（ライフテクノロジーズ（Life Technologies），カリフォルニア州）および製造業者提供のプロトコールを使用してｃＤＮＡを合成した。ヒト特異的ＬＧＲ５およびＧＡＰＤＨプライマーを使用し、ＳｔｅｐＯｎｅサーモサイクラー（ライフテクノロジーズ（Life Technologies），カリフォルニア州）で以下の
温度条件：５０℃（２分）；９０℃（２分）および９０℃（１５秒）と６０℃（１分）を４０サイクル、および融解曲線評価（６５℃〜９５℃）、を使用して、ヒトＬＧＲ５転写産物量を測定した。ＬＧＲ５量を２＾δＣｔの式を使用して数量化した。

ＬＧＲ５は、転移性患者由来膵臓異種移植片において高く発現されていた。化学療法での治療は、膵臓腫瘍においてＬＧＲ５の発現増加をもたらした。ヒト特異的プライマーを使用すると、一連の患者由来膵臓異種移植片中のＬＧＲ５転写産物は、ＱＰＣＲを使用して測定可能であった。ＬＧＲ５は、ほとんどの腫瘍で検出可能であり、転移性腫瘍においてＬＧＲ５の発現が増加する傾向があり、このことはＬＧＲ５が進行性腫瘍形成で果たす役割をさらに示唆している。

ＪＨ１０９、ＡＳＰＣ１、およびＰＡＮＣ１を含む一連の膵臓腫瘍でＬＧＲ５の発現を調べた。標準治療（ＳＯＣ）での治療（ＪＨ１０９ではＧｅｍｚａｒおよびアブラキサン、ＰＡＮＣ１およびＡＳＰＣ１ではＧｅｍｚａｒ単独）は、上記の腫瘍の各々でＬＧＲ５の発現誘導をもたらした（図１５）。注目すべきことに、ＬＧＲ５の発現は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＳＯＣの併用で治療した腫瘍において、コントロール（生理食塩水またはＭＯＰＣ）に匹敵するレベルに減少した。これらのデータは、ＬＧＲ５の発現が、ＰＡＮＣ腫瘍において、併用療法（１８Ｇ７Ｈ６Ａ３＋ＳＯＣ）への応答のバイオマーカーとして役立ち得ることをさらに示す。

実施例４６−ＣＲＣおよび膵臓腫瘍においてＣＴＮＮＢ１は１８Ｇ７Ｈ６Ａ３標的遺伝子の１つである
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３にとってのＷｎｔ経路における標的候補を調べた。９６ウェルＰＣＲプレートに約８０のＷｎｔ経路遺伝子に対するプライマーを入れてＷｎｔ ＱＰＣＲプレート(キアゲン（Qiagen）、カリフォルニア州）を準備した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３またはＭ
ＯＰＣ（コントロール）で治療した腫瘍からのｃＤＮＡをプールし、Ｗｎｔプレート中でＱＰＣＲを実施した。各プレートにおけるデータを、対応するＧＡＰＤＨに対して標準化し、各遺伝子の量を２＾δＣｔの式を使用して測定した。何倍の差があるのかを測定するために、各１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療した腫瘍におけるデータを、ＭＯＰＣで治療した群からの対応する値で割った。１より大きい値または１より小さい値は、それぞれ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療した群におけるアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを示す。アップレギュレートされる遺伝子またはダウンレギュレートされる遺伝子の数の予備的評価は、腫瘍モデル両方（ＣＴ１およびＣＴ３）において、アップレギュレートされる遺伝子よりもダウンレギュレートされる遺伝子の方が多いことを示した。このことは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が遺伝子発現に対して阻害効果を有することを示唆している。詳細な分析により、ＦＺＤＢ、ＦＺＤ７、ＷＮＴ７Ｂ、ＦＢＸＷ１１、ＦＺＤ１、ＤＶＬ１、ＣＳＮＫ２Ａ１、およびＣＴＮＮＢ１を含むいくつかの区別的に発現される遺伝子を同定した。

子宮頚癌において、ＬＧＲ５の発現とＣＴＮＮＢ１の間に密接な関係があり得る。他の研究において、（ＬＧＲ５組み換えベクターを使用した）ＬＧＲ５の過剰発現、または（ｓｈＲＮＡを使用した）ＬＧＲ５のダウンレギュレーションは、それぞれＣＴＮＮＢ１のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションをもたらした（Chen Q, Cao HZ, Zheng PS.2014.Oncotarget 5:9092-105）。また、子宮頸癌患者からの免疫組織化学的ス
ライド分析は、ＬＧＲ５とＣＴＮＮＢ１の発現の間の顕著な相関を示した。この研究において、（転写産物レベルを測定するために）ＱＰＣＲおよび（タンパク質発現を評価するために）ウエスタンブロットを使用して、ＣＴＮＮＢ１の発現をさらに調べた。ヒト特異的プライマーを使用して、ＣＴＮＮＢ１の発現を膵臓腫瘍およびＣＲＣ腫瘍で調べた。実施例４５で説明したＬＧＲ５の発現と同様に、ＳＯＣでの治療は、ＣＴＮＮＢ１の発現を増加させ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＳＯＣの併用は、ＣＴＮＮＢ１の発現の減少をもたらした。また、ＣＴＮＮＢ１の発現は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したＣＴ１腫瘍において、約３５％低減された。従って、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３での治療は、ＣＴＮＮＢ１を阻害する。（Ｗｎｔ経路の活性がないことを示す）β−カテニンおよびホスホ−β−カテニンの発現を、ウエスタンブロット解析により調べた。ＡＳＰＣ１腫瘍におけるウエスタンブロットデータでは、単剤としての、またはＳＯＣとの併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３がｐβ−カテニンをアップレギュレートしており、このことは、これらの腫瘍におけるＷｎｔ経路の活性化の阻害を示唆しており、ウエスタンブロットデータはＱＰＣＲデータを確証した（図１６）。

ｐ−β−カテニン、ＧＳＫ−３β（全ＧＳＫ−３βおよびホスホＧＳＫ−３β）、およびＬＲＰ６を含むＷｎｔ経路のその他の成分を一連のＣＲＣ腫瘍、膵臓腫瘍、および乳房腫瘍で調べた。ウエスタンブロットデータの定量は、ＡＳＰＣ１およびＰＡＮＣ１腫瘍でＷｎｔ経路シグナリングの顕著な阻害を示し、その他のモデルにおいてＷｎｔ経路のダウンレギュレーションの傾向がある程度あることも明らかにした。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３での治療に応答しないＢＭＣＲＣ０８６腫瘍もまた、ＬＧＲ５およびのＷｎｔシグナリング経路成分の発現に関してネガティブであり、このことは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の作用機構が、特異的にＬＧＲ５を標的としており、Ｗｎｔシグナリングを阻害していることをさらに支持する。

ＡＳＰＣ１、ＰＡＮＣ１、およびＪＨ１０９を含む膵臓腫瘍でのＷｎｔ経路遺伝子の発現を調べた。インビボデータによると、ＰＡＮＣ１およびＡＳＰＣ１の両方において、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療した腫瘍対ＰＢＳで治療した腫瘍の間に、腫瘍体積の差があった。
対照的に、ＪＨ１０９腫瘍は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３単剤を用いた標準的治療レジメン、ＳＯＣ化学療法併用を用いた標準的治療レジメンのどちらにも応答しなかった。応答性細胞（ＰＡＮＣ１およびＡＳＰＣ１）ならびに非応答性細胞（ＪＨ１０９）におけるＷｎｔ遺伝子の発現の差を調べた。併用治療群において、Ｗｎｔ６、ＦＺＤ８、ＦＯＳＬ１、Ｗｎｔ１１、ＮＦＡＴＣ、およびＦＺＤ５は、併用治療されたＡＳＰＣ１腫瘍およびＰＡＮＣ１腫瘍の両方においてダウンレギュレートされ、ＪＨ１０９腫瘍においてアップレギュレートされた。膵臓データおよびＣＲＣデータの両方において、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ６、ＦＲＺＢ、およびＰＲＩＣＫＥＬを含む遺伝子は、ＰＡＮＣ１、ＡＳＰＣ１、ＣＴ１、およびＣＴ３細胞でダウンレギュレートされたが、ＪＨ１０９細胞ではダウンレギュレートされなかった。

遺伝子の系譜の分析により、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療された膵臓腫瘍で同時制御される、Ｗｎｔ１１、ＦＲＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＳＫ３Ｂ、ＦＺＤ８、およびＬＲＰ６を含む候補遺伝子が特定された。各治療における区別的に発現される転写産物の分析により、膵臓腫瘍において２倍を超えてアップレギュレート／ダウンレギュレートされる遺伝子も特定された（図１７）。Ｗｎｔ７Ａなどのいくつかの遺伝子は、全ての腫瘍で１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療された腫瘍対コントロールで治療された腫瘍で共通であった。

実施例４７−ＣＴ１腫瘍において１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は転写を阻害する
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が標的とする遺伝子の発現を早期腫瘍形成対末期腫瘍形成において調べた。マウスは、ＣＴ１を有する移植を受けたマウスであり、３日目、１０日目、および１７日目に、腫瘍をコントロール群、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３群、ＦＯＬＦＩＲＩ群、または併用群から収集した。各腫瘍からの全ＲＮＡを３日目に収集し、イルミナ（Illumina）のｈｕｍａｎ ｃｈｉｐを使用して遺伝子アレイハイブリダイゼーション用に準備した。区別的に発現される遺伝子（１．５または２倍より高い、ｐ＜０．０５）の全体的分析は、（単剤として、またはＦＯＬＦＩＲＩとの併用で)１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療された腫瘍にお
いて、アップレギュレートされる遺伝子よりもダウンレギュレートされる遺伝子の方が多いことを示した。このことは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３での治療は、細胞性転写機構全体に対してより抑制的な影響を有していた可能性があることを示唆した。ＰＣＡ（主成分分析）は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療された腫瘍およびコントロールで治療された腫瘍において、遺伝子発現全体に近接性があることも示した。しかしながら、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３をＦＯＬＦＩＲＩに加えたとき（すなわち、併用群）、併用対ＦＯＬＦＩＲＩの間に明確な隔たりがあり、このことは、ＬＧＲ５の標的化が、ＦＯＬＦＩＲＩで治療された腫瘍で顕著に遺伝子発現を変化させた可能性があることを示唆している。

１８Ｇ７Ｈ６Ａ３対媒体における区別的に発現される遺伝子の分析は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療された腫瘍においてダウンレギュレートされるＡＮＧＰＴ２、ＡＫＡＰ１２、およびＡＤＭなどのいくつかの腫瘍促進因子を特定した。また、ＤＡＢ１、ＭＩＲ６５５、ＮＫＸ１−２などのいくつかの腫瘍抑制因子が１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療された腫瘍においてアップレギュレートされた（図１８）。逆に、ＦＯＬＦＩＲＩ治療は、腫瘍促進因子（ＦＢＮ２、ＨＫＤＣ１、ＡＢＣＢ１、ＦＧＦ２）をアップレギュレートするようであり、ＴＲＩＢ３、ＡＴＦ３、およびＴＩＭＰ３などのいくつかの腫瘍抑制因子もアップレギュレートするようである（図１９）。ＦＯＬＦＩＲＩと１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の併用は、ＡＬＤＯＣ、ＣＤＨ５、ＩＴＧＡ２などの他の腫瘍促進因子のダウンレギュレーションをもたらし、ＺＢＴＢ１１、ＩＴＰＫＡ、ＰＳＭＣ３ＩＰ、およびＢＡＫ１などの他の腫瘍抑制因子のアップレギュレーションももたらした（図２０）。

実施例４８−患者由来膵臓異種移植片の同所モデルにおいて、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療は末梢血中のヒトＣＴＣを顕著に低減する
原発性腫瘍の成長および転移の阻害における１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の役割を調べるために、
ＬＧＲ５の発現を一連の患者由来膵臓異種移植サンプル、およびＰＡＮＣ１４２４細胞、およびＰＡＮＣ１４２７細胞で調べた。

ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病重篤複合免疫不全）マウスに腫瘍サンプルを皮下移植し、その後、インビボ研究用に指定されたレシピエントの膵臓に移植した。腫瘍体積を超音波で毎週測定し、〜１００ｍｍ³の腫瘍を有するマウスを有効性研究の対象とし、以下
の治療を施した：１−ＭＯＰＣアイソタイプ（１５ｍｇ／ｋｇを週に二回；腹腔内）；２−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（１５ｍｇ／ｋｇを週に二回；腹腔内）；３−ＳＯＣ（Ｇｅｍｚａｒを週に二回腹腔内に５０ｍｇ／ｋｇ、アブラキサンを週に二回静脈内に３０ｍｇ／ｋｇ）；４−上記用量での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＳＯＣの併用。研究の最後に、ＣＴＣ評価（フローサイトメトリーを使用）および循環ＤＮＡ評価のために腫瘍を有する各マウスから末梢血を収集した。フローサイトメトリーのために、血液サンプルをＲＢＣ溶解バッファー（ＡＣＫバッファー，ライフテクノロジーズ（Life Tech），カリフォルニア州）で製造業
者のプロトコールを使用して処理し、ヒトＨＬＡ−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カリフォルニア州）およびヒトＬＧＲ５−ＡＦ６４７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カリフォルニア州）で３０分間４℃で染色した。細胞を染色バッファー（ＰＢＳ−ＦＢＳ３％）で二回、および７ＡＡＤ（７−アミノアクチノマイシン）で洗浄し、その後、研究室内のＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ機器に取り込み、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ，カリフォルニア州）を使用してデータを分析した。

ＬＧＲ５は、様々な患者由来膵臓異種移植サンプルで発現されていた。ヒトＣＴＣは末梢血で検出された。ＨＬＡ＋細胞のパーセンテージは、ＭＯＰＣ対１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で顕著に変化はしなかったが、循環ＨＬＡ＋ＬＧＲ５＋細胞のパーセンテージは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したマウス（図２１）で顕著に低減されていた。

ＨＬＡ＋細胞のパーセンテージは、化学療法で治療したマウス対併用で治療したマウスで顕著に変化はしなかったが、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＳＯＣの併用は、同時設定および減量設定の両方において、ＨＬＡ＋ＬＧＲ５＋細胞をほぼ完全に除去した。（図２２Ａおよび図２２Ｂ）。（単剤としての、またはＳＯＣとの併用での）１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療は、患者由来膵臓異種移植の同所モデルにおいて、末梢血中のヒトＣＴＣを顕著に低減する。

実施例４９−その他のモデルにおけるＬＧＲ５の発現
カニクイザル（Cynomolgus macaques）（Ｃｙｎｏ）からの皮膚サンプルにおいて、フ
ローサイトメトリーおよびＲＮＡｓｃｏｐｅを使用して、ＬＧＦ５の発現を調べた。０日目、７日目、１４日目、および２１日目に、Ｃｙｎｏからの皮膚サンプルを、媒体または様々な用量の１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（Ｇ２：１０ｍｇ／ｋｇ；Ｇ３：５０ｍｇ／ｋｇ；およびＧ４：１５０ｍｇ／ｋｇ）で治療した。研究の最後に、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）および抗真菌性溶液（Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ １００Ｘ，ライフテクノロジーズ（Life Technologies），カリフォルニア州）を補充したＤＭＥＭ中に皮膚サンプ
ルを入れた。コラゲナーゼおよびサーモリシン（Ｌｉｂｅｒａｓｅ，Ｒｏｃｈ Ｉｎｃ，カリフォルニア州）の混合物を使用して皮膚サンプルを消化した。Ｌｉｂｅｒａｓｅとの一晩のインキュベーションと機械的破砕の後に皮膚前駆体（ＳＰ）を単離した。ＳＰをラット抗ヒトＬＧＲ５（ＡＦ６４７，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カリフォルニア州）で染色し、研究室内のｃａｌｉｂｕｒ機器で分析した。ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，カリフォルニア州）を使用したデータ分析は、ＬＧＲ５はＣｙｎｏのＳＰで検出可能であったが、（様々な用量の）１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療した群対媒体で治療した群の間でＬＧＲ５の頻度に顕著な差がなかったことを示した。ＲＮＡｓｃｏｐｅを使用したところ、ＬＧＲ５は、皮膚領域、特に毛包で検出可能であり、わずかではあったが皮膚の上皮細胞で検出可能であった。媒体で治療したサンプル対１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したサンプルでＬＧＲ５陽性領域に顕著な違いはなかった。

Ｃｙｎｏから単離した末梢血単球の遺伝子発現を調べた。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを使用して全ＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（ライフテクノロジーズ（Life Technologies），カリフォルニア州）を使用してｃＤＮＡを
合成した。各治療からのｃＤＮＡをプールし、ＲＴ² Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ
マスターミックス（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，マサチューセッツ州）に加えた。ケモカインまたは炎症性サイトカインに対するＣｙｎｏ ＱＰＣＲプライマーを含む９６ウェルプレートの各ウェルに最終混合物を加えた。ＰＣＲの温度プロフィールは、以下を含んだ：９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間と６０℃で１分間を４０サイクル、次いで融解曲線段階。対応するＧＡＰＤＨから引くことによって、各プレートにおけるデータ（Ｃｔ値）を標準化し、２＾ＤＣＴの式を使用して各転写産物量を計算した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３群のうちのいずれかの群対媒体で治療した群間で（２倍を超えて）区別的に発現される転写産物の数の分析は、遺伝子アレイデータと一致し、アップレギュレーションされた遺伝子よりもダウンレギュレートされた遺伝子の方がずっと多いことを示した。用量を漸増させると、アップレギュレートされた遺伝子は少なくなり、ダウンレギュレートされた遺伝子は多くなった。Ｃｙｎｏが最後に１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を投与されてから４週間の間治療を全く受けなかったＧ４回復（Ｇ４Ｒ）群では、アップレギュレートされた遺伝子の数とダウンレギュレートされた遺伝子の数がほとんど同じ数であった。詳細な分析により、発現が１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の用量と逆相関する、すなわち、１０ｍｇ／ｋｇで最も発現が高く、１５０ｍｇ／ｋｇで最も発現が低い、区別的に発現される遺伝子（ＣＣＬ１１、ＩＬ３、ＳＰＰ１、ＣＣＬ１３、ＣＸＣＬ６、およびＴＮＦＲＳＦ１１ｂ）を特定した。

複数の治療間で共通にダウンレギュレートされた遺伝子として、ＣＣＬ１、ＩＦＮγ、ＣＣＲ８、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ４が挙げられ、これらの一部は、Ｍ１またはＭ２マクロファージに多く含まれる。

実施例５０−インビボでのヒト化抗ＬＧＲ５抗体による小細胞肺癌腫瘍の成長阻害
患者由来小細胞肺癌異種移植モデル。ＢＬＧ２９３腫瘍から解離した腫瘍細胞をマトリゲルに含めてＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスに皮下移植し、週に二回、腫瘍サイズと体重についてモニタリングした。腫瘍が平均で１３０ｍｍ³に到達したときに、マウスをランダ
ム化した。マウスをＰＢＳ、コントロール抗体ＭＯＰＣ、または１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のいずれかで治療した。マウスにＢＩＷを１５ｍｇ／ｋｇで投与した。全てのマウスを、終了まで、週に二回、体重および腫瘍サイズ、ならびに全身の健康状態および外見についてモニタリングした。

１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ＰＢＳコントロール（２４．９％の腫瘍の成長阻害）およびＭＯＰＣコントロール抗体（２４．７％の腫瘍の成長阻害）と比べて、顕著な抗腫瘍活性を示した。

実施例５１−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、減量化学療法治療後に再発する膵臓腫瘍を有するマウスで生存率を上昇させる
Ｐａｎｃ１４２７（ＵＣＳＤ１４２７）腫瘍は、化学療法（ゲムシタビン／アブラキサン）および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を用いる治療により完全に縮小（退縮）した。腫瘍が退縮したときに、化学療法を解除し、マウスを１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療するか、治療を全くしなかった。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療した動物は、コントロール動物と比べて顕著に健康であり、コントロール動物では、一部のマウスは、跛行または体重減少など健康観察の結果が重篤であるため安楽死させなければならなかった。１５０日目に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および化学療法で治療した７／８のマウスが生存していたのに対し、化学療法単独で治療した４／８のマウスが生存していた。図２３は結果を要約している。

用語「含む（comprising）」は、本明細書で使用される場合、「含む（including）」
、「含む（containing）」、または「により特徴づけられる（characterized by）」と同義であり、包括的または非制限的であり、追加の記載されていない要素または方法の工程を除外しない。

上記の説明は、本発明のいくつかの方法および物品を開示する。本発明は、方法と物品への修正、および製造方法と設備への変更を許容し得る。このような修正は、本開示または本明細書に開示されている発明の実施を考察することにより、当業者にとって、明らかなものとなるであろう。従って、本発明が本明細書に開示されている具体的な実施形態に限定されることは意図されていないが、本発明が本発明の真の範囲と精神に含まれる全ての修正および代替を包含することが意図されている。

公開および非公開の出願、特許、および文献を含むが、これらに限定はされない本明細書に引用される全参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、それによって本明細書の一部を構成する。参照により組み込まれる出版物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する限りにおいて、本明細書は、あらゆるこのような矛盾する事柄を無効にする、および／または前記事柄に優先することが意図されている。

Claims (71)

1. ＬＧＲ５に結合するヒト化またはヒトモノクローナル抗体。
2. 前記抗体が、アミノ酸ＧＹＳＦＴＡＹＷ（配列番号２３）またはその保存的変異型を有する重鎖ＣＤＲ１を含む、請求項１に記載の抗体。
3. 前記抗体が、アミノ酸ＩＬＰＧＳＤＳＴ（配列番号２）またはその保存的変異型を有する重鎖ＣＤＲ２を含む、請求項１または２に記載の抗体。
4. 前記抗体が、アミノ酸ＡＲＳＧＹＹＧＳＳＱＹ（配列番号３）またはその保存的変異型を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
5. 前記抗体が、アミノ酸ＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦ（配列番号４）またはその保存的変異型を有する軽鎖ＣＤＲ１を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
6. 前記抗体が、アミノ酸ＬＴＳまたはその保存的変異型を有する軽鎖ＣＤＲ２を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
7. 前記抗体が、アミノ酸ＱＱＮＡＥＤＰＲＴ（配列番号３３）またはその保存的変異型を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
8. 前記抗体が、配列番号１９または４８を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
9. 前記抗体が、配列番号２１または４９を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
10. 前記抗体が、ＬＧＲ５のアミノ酸Ｔ１７５，Ｅ１７６，Ｑ１８０，Ｒ１８３，Ｓ１８６，Ａ１８７，Ｑ１８９，Ｄ２４７，Ｅ２４８，Ｔ２５１，Ｒ２５４，Ｓ２５７，Ｎ２５８，Ｋ２６０（配列番号４７）内のエピトープに結合する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
11. 前記抗体が、ＬＧＲ５（配列番号４７）のロイシンリッチリピート６〜９内のエピトープに結合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
12. 前記抗体が、ＬＧＲ５の凸面上のエピトープに結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
13. 前記抗体が、ＲＳＰＯ−ＬＧＲ５結合部位に結合しない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
14. 前記抗体が、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ結合を阻害しない、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
15. 前記抗体が、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯシグナリングを阻害しない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
16. 前記ＲＳＰＯが、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、およびＲＳＰＯ４からなる群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
17. 前記抗体が、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ−ＲＮＦ４３複合体形成を阻害する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体。
18. 前記抗体が、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ−ＺＮＲＦ３複合体形成を阻害する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体。
19. 前記抗体が、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ−ＬＲＰ６複合体形成を阻害する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体。
20. 前記抗体が、ＬＧＲ５−ＮＯＲＲＩＮ−ＲＮＦ４３複合体形成を阻害する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
21. 前記抗体が、ＬＧＲ５−ＮＯＲＲＩＮ−ＺＮＲＦ３複合体形成を阻害する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体。
22. 前記抗体が、ＬＧＲ５−ＮＯＲＲＩＮ−ＬＲＰ６複合体形成を阻害する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体。
23. 前記抗体が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を介したＬＧＲ５シグナリングを阻害する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の抗体。
24. 前記抗体が、腫瘍中の分化マーカーの発現を誘発する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
25. 前記抗体が、腫瘍中の細胞の分化を誘発できる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗体。
26. 前記抗体が、腫瘍の成長を阻害する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体。
27. 前記抗体が、腫瘍中の癌幹細胞の頻度を低減する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の抗体。
28. 請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド分子。
29. 請求項２８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
30. 請求項２９に記載のベクターを含む宿主細胞。
31. 請求項３０に記載の宿主細胞を培養して抗体を生産することを含む、前記抗体を生産する方法。
32. 請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体および薬剤的に許容できる担体を含む医薬組成物。
33. 癌を有する対象を治療する方法であって、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む前記方法。
34. 化学療法剤を前記抗体との併用で投与することをさらに含む、請求項３３に記載の方法
    。
35. 前記化学療法剤が、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、およびアブラキサンからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを、前記抗体との併用で前記対象に投与する、請求項３５に記載の方法。
37. 前記治療が、前記治療後少なくとも６ヶ月間前記対象の生存率を、前記抗体で治療されていない対象の生存率と比べて上昇させる、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記対象の生存率が少なくとも１２ヶ月間上昇する、請求項３７に記載の方法。
39. 前記治療が、前記対象における前記癌の再発リスクを、前記抗体で治療されていない対象における前記癌の再発リスクと比べて低減する、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記治療が、前記対象の末梢血中の腫瘍細胞のレベルを、前記抗体で治療されていない対象の末梢血中の腫瘍細胞のレベルと比べて低減する、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記癌が、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、および肺癌からなる群から選択される、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記癌が、ＡＰＣ変異を含む結腸癌、ＫＲＡＳ変異を含む結腸癌、転移性結腸直腸癌、転移性膵臓癌、トリプルネガティブ乳癌、および小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記対象が、哺乳類である、請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記対象が、ヒトである、請求項３３〜４３のいずれか１項に記載の方法。
45. 癌を発生しやすい対象において、前記癌が発生するリスクを低減すること、前記癌の再発を防止すること、または前記癌を防止することのための方法であって、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む前記方法。
46. 癌を有する対象の生存率を上昇させる方法であって、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む前記方法。
47. 前記対象の前記生存率が、治療後少なくとも３ヶ月間、前記抗体で治療されていない対象の生存率と比べて上昇する、請求項４６に記載の方法。
48. 前記対象の前記生存率が少なくとも６ヶ月間上昇する、請求項４６に記載の方法。
49. 前記対象の前記生存率が少なくとも１２ヶ月間上昇する、請求項４６に記載の方法。
50. 対象において癌の再発リスクを低減する方法であって、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む前記方法。
51. 対象の末梢血において癌の腫瘍細胞のレベルを低減する方法であって、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む前記方法。
52. 化学療法剤を前記抗体との併用で投与することをさらに含む、請求項４５〜５１のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記化学療法剤が、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、およびアブラキサンからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
54. 前記フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを、前記抗体との併用で前記対象に投与する、請求項５３に記載の方法。
55. 予測的臨床試験、遺伝分析、または家族歴分析により、前記対象を、前記癌を発生しやすいと判定する、請求項４５〜５４のいずれか１項に記載の方法。
56. 前記癌が、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、および肺癌からなる群から選択される、請求項４５〜５５のいずれか１項に記載の方法。
57. 前記癌が、ＡＰＣ変異を含む結腸癌、ＫＲＡＳ変異を含む結腸癌、転移性結腸直腸癌、転移性膵臓癌、トリプルネガティブ乳癌、および小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項４５〜５６のいずれか１項に記載の方法。
58. 前記対象が、哺乳類である、請求項４５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
59. 前記対象が、ヒトである、請求項４５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
60. 腫瘍を有する対象のための治療を選択する方法であって、
    （ａ）前記対象に化学療法剤を投与すること；
    （ｂ）前記腫瘍中でＬＧＲ５ポリペプチドまたはＬＧＲ５をコードする核酸のレベルの増加を確認すること；および
    （ｃ）請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体を、前記腫瘍中でＬＧＲ５ポリペプチドまたはＬＧＲ５をコードする核酸のレベルが増加している前記対象に投与すること、を含む前記方法。
61. 前記化学療法剤が、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、およびアブラキサンからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
62. 前記腫瘍が、結腸癌腫瘍、結腸直腸癌腫瘍、膵臓癌腫瘍、乳癌腫瘍、および肺癌腫瘍からなる群から選択される、請求項６０〜６１のいずれか１項に記載の方法。
63. 前記腫瘍が、ＡＰＣ変異を含む結腸癌腫瘍、ＫＲＡＳ変異を含む結腸癌腫瘍、転移性結腸直腸癌腫瘍、転移性膵臓癌腫瘍、トリプルネガティブ乳癌腫瘍、および小細胞肺癌腫瘍からなる群から選択される、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
64. 請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体を用いる治療の有効性を評価する方法であって、前記抗体で治療された腫瘍中のバイオマーカーのレベルを測定することを含む、前記方法。
65. 前記バイオマーカーが、核酸、または前記核酸がコードするポリペプチドであり、前記バイオマーカーが、ＷＮＴ６、ＦＺＤ８、ＦＯＳＬ１、ＷＴ１１、ＮＦＡＴＣ１、ＦＺＤ
    ５、ＦＺＤ２、ＦＲＺＢ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＦＺＤＢ、ＦＺＤ７、ＷＮＴ７Ｂ、ＦＢＸＷ１１、ＦＺＤ１、ＤＶＬ１、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＤＭ、ＣＴＮＮＢ１、ＡＬＤＯＣ、ＣＤＨ５、ＩＴＧＡ２、ＤＡＢ１、ＭＩＲ６５５、ＮＫＸ１−２、ＺＢＴＢ１１、ＩＴＰＫＡ、ＰＳＭＣ３ＩＰ、およびＢＡＫ１からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
66. 前記抗体で治療されていない腫瘍中の前記バイオマーカーのレベルと比べた前記バイオマーカーの前記レベルの減少が、有効な治療を示す、請求項６５に記載の方法。
67. 前記バイオマーカーが、ＷＮＴ６、ＦＺＤ８、ＦＯＳＬ１、ＷＴ１１、ＮＦＡＴＣ１、ＦＺＤ５、ＦＺＤ２、ＦＲＺＢ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＦＺＤＢ、ＦＺＤ７、ＷＮＴ７Ｂ、ＦＢＸＷ１１、ＦＺＤ１、ＤＶＬ１、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＤＭ、ＣＴＮＮＢ１、ＡＬＤＯＣ、ＣＤＨ５、およびＩＴＧＡ２からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
68. 前記抗体で治療されていない腫瘍中の前記バイオマーカーのレベルと比べた前記バイオマーカーの前記レベルの増加が、有効な治療を示す、請求項６５に記載の方法。
69. 前記バイオマーカーが、ＤＡＢ１、ＭＩＲ６５５、ＮＫＸ１−２、ＺＢＴＢ１１、ＩＴＰＫＡ、ＰＳＭＣ３ＩＰ、およびＢＡＫ１からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
70. 前記腫瘍が、結腸癌腫瘍、結腸直腸癌腫瘍、膵臓癌腫瘍、乳癌腫瘍、および肺癌腫瘍からなる群から選択される、請求項６４〜６９のいずれか１項に記載の方法。
71. 前記腫瘍が、ＡＰＣ変異を含む結腸癌腫瘍、ＫＲＡＳ変異を含む結腸癌腫瘍、転移性結腸直腸癌腫瘍、転移性膵臓癌腫瘍、トリプルネガティブ乳癌腫瘍、および小細胞肺癌腫瘍からなる群から選択される、請求項６４〜７０のいずれか１項に記載の方法。