JP2020523414A - Ｌｇｒ５に結合する抗体薬物複合体 - Google Patents

Abstract

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態は、ヒトＬＧＲ５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、抗体またはその抗原結合フラグメントはリンカーを介して薬物のような治療薬に複合体化する、抗体薬物複合体に関する。一部の実施形態は、そのような抗体薬物複合体を使用する治療方法、およびそのような抗体薬物複合体を調製する方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１７年６月１６日に出願された米国仮出願番号第６２／５２０，７２６号に対する優先権を主張するものであり、その内容全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本明細書で提供される方法および組成物の実施形態は、ヒトＬＧＲ５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、抗体またはその抗原結合フラグメントはリンカーを介して薬物のような治療薬に複合体化する、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。一部の実施形態は、そのようなＡＤＣを使用する治療方法、およびそのようなＡＤＣを調製する方法に関する。
配列表の参照
本出願は電子フォーマットの配列表と併せて出願されている。配列表は、およそ４０Ｋｂのサイズで２０１８年６月７日に作成された、ＢＩＯＮＯ１５ＷＯＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ＴＸＴと題するファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

ＧＰＲ４９／ＨＧ３８／ＦＥＸとしても知られたロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５（ＬＧＲ５）は、糖タンパク質ホルモン受容体と構造的に類似した受容体タンパク質の、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体（ＬＧＲ）／Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＲ）タンパク質ファミリーに属する。ＬＧＲは、３つのサブグループ、（１）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）受容体、を含む糖タンパク質ホルモン受容体、（２）リラキシン受容体ＬＧＲ７およびＬＧＲ８、および（３）ＬＲＧ４、ＬＧＲ５、およびＬＧＲ６に分割される。ＬＧＲ５は、腸、骨格筋、胎盤、脳、および脊髄を含むいくつかの組織で発現する。

本明細書で提供される方法および組成物の一部の実施形態は、ヒトロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５（ＬＧＲ５）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、抗体薬物複合体であって、抗体またはその抗原結合フラグメントはリンカーを介して薬物に複合体化する、抗体薬物複合体を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１）、またはその保存的変異、配列番号２５を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、またはその保存的変異、配列番号２７を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、またはその保存的変異、配列番号２９を含む軽鎖ＣＤＲ１、またはその保存的変異、配列番号３１を含む軽鎖ＣＤＲ２、またはその保存的変異、および配列番号３３を含む軽鎖ＣＤＲ３、またはその保存的変異、を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ１を含む。一部の実施形態では、抗ＬＧＲ５抗体またはその抗原結合フラグメントはＩｇＧ１を含む。
一部の実施形態では、リンカーは非開裂可能なリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは開裂可能なリンカーである。

一部の実施形態では、薬物は微小管阻害剤およびＤＮＡ損傷薬剤から選択される。一部の実施形態では、微小管阻害剤は、カバジタキセル、コルセミド、コルヒチン、クリプトフィシン、デメコルチン、ドセタキセル、２−メトキシエストラジオール、ドコダゾール、パクリタキセル、タッカロノリド、タキサン、およびビンブラスチンからなる群から選択される。一部の実施形態では、薬物は、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルドラスタチン１０、デュオカルマイシン、メイタンサノイド１、デュアルスタチン３（ｄｕａｌｓｔａｔｉｎ ３）、カリチアマイシン、およびデュオカマイシンからなる群から選択される。

本明細書で提供される方法および組成物の一部の実施形態は、本明細書で提供される抗体薬物複合体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。
本明細書で提供される方法および組成物の一部の実施形態は、がんを有する対象を治療する方法であって、本明細書で提供される抗体薬物複合体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。一部の実施形態では、がんは固形腫瘍を含む。一部の実施形態では、がんはがん幹細胞を含む。一部の実施形態では、がんは肺がん、乳がん、結腸がん、および膵臓がん、からなる群から選択される。一部の実施形態では、がんはトリプルネガティブ乳がん細胞、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＳＴＫ１１、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、およびＩＳＣＯからなる群から選択される遺伝子に突然変異を有する結腸がん細胞、ならびに小細胞肺がん細胞、からなる群から選択される細胞を含む。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。

一部の実施形態は、また、抗体薬物複合体と組み合わせて追加療法を投与することを含み、追加療法は、放射線療法および化学療法剤からなる群から選択される。一部の実施形態では、抗体薬物複合体の投与は、追加療法の投与と同時である。一部の実施形態では、化学療法剤はフォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、ＥＲＢＩＴＵＸ（セツキシマブ）、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤（ＮＶＰ）、およびＳＮ３８、からなる群から選択される。一部の実施形態では、追加療法はフォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを含む。

本明細書で提供される方法および組成物の一部の実施形態は、本明細書で提供される抗体薬物複合体を調製する方法であって、リンカーを薬物に連結すること、および、連結した薬物を抗体に複合体化することを含む方法、を含む。一部の実施形態はまた、複合体化抗体を精製することを含む。

一次抗ＬＧＲ５抗体（Ｃ１２）およびＮＣ−ＭＭＡＦが複合体化した二次ＡＤＣで処理した細胞の細胞生存率のグラフを示す図である。平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝２。 一次抗ＬＧＲ５抗体（Ｃ１２）およびＣＬ−ＭＤ１０が複合体化した二次ＡＤＣで処理した細胞の細胞生存率のグラフを示す図である。平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝２。 一次抗ＬＧＲ５抗体（Ｃ１２）およびＣＬ−ＭＭＡＥが複合体化した二次ＡＤＣで処理した細胞の細胞生存率のグラフを示す図である。平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝２。 一次抗ＬＧＲ５抗体（Ｃ１２）およびＣＬ−ＤＭＳＡが複合体化した二次ＡＤＣで処理した細胞の細胞生存率のグラフを示す図である。平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝２。 一次抗ＬＧＲ５抗体（Ｃ１２）およびＮＣ−ＤＭ１が複合体化した二次ＡＤＣで処理した細胞の細胞生存率のグラフを示す図である。平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝２。 一次抗ＬＧＲ５抗体（Ｃ１２）およびＣＫ−ＤＵＡ３が複合体化した二次ＡＤＣで処理した細胞の細胞生存率のグラフを示す図である。平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝２。 一次抗ＬＧＲ５抗体（Ｃ１２）およびＣＫ−ＣＡＬが複合体化した二次ＡＤＣで処理した細胞の細胞生存率のグラフを示す図である。平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝２。 異なる一次抗ＬＧＲ５抗体およびＮＣ−ＭＭＡＦが複合体化した二次ＡＤＣで処理した細胞の細胞生存率の一連のグラフを示す図である。異なる一次抗ＬＧＲ５抗体は、Ｃ１２（上部左パネル）、１８Ｇ７Ｃｈ（上部右パネル）、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１（下部左パネル）、および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（下部右パネル）を含んでいた。平均＋／−ＳＥＭ。 異なる一次抗ＬＧＲ５抗体およびＣＬ−ＤＭＳＡが複合体化した二次ＡＤＣで処理した細胞の腫瘍球形成の一連のグラフを示す図である。異なる一次抗ＬＧＲ５抗体は、Ｃ１２（上部左パネル）、１８Ｇ７Ｃｈ（上部右パネル）、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１（下部左パネル）、および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（下部右パネル）を含んでいた。平均＋／−ＳＥＭ。 デュオカルマイシン（左パネル）、またはＭＭＡＥ（右パネル）が複合体化した一次抗ＬＧＲ５抗体で処理した細胞の腫瘍球形成の一連のグラフを示す図である。平均＋／−ＳＥＭ。 ＭＭＡＥまたはＰＢＳが複合体化した抗ＬＧＲ５抗体（ＢＮＣ１０１）で処理した異種移植モデルにおける時間経過に伴う腫瘍体積のグラフ（ｎ＝６）を示す図である。 ＭＭＡＥ、ＭＯＰＣ−ＭＭＡＥ、またはＰＢＳが複合体化した抗ＬＧＲ５抗体（ＢＮＣ１０１）で処理した異種移植モデルにおける時間経過に伴う腫瘍体積のグラフ（ｎ＝６）を示す図である。 デュオカルマイシン、ＭＯＰＣ−デュオカルマイシン、またはＰＢＳが複合体化した抗ＬＧＲ５抗体（ＢＮＣ１０１）で処理した異種移植モデルにおける時間経過に伴う腫瘍体積のグラフ（ｎ＝６）を示す図である。 リンカーおよびＤＭＳＡの構造の例を示す図である。 抗体に連結するＤＭＳＡの構造の例を示す図である。

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態は、ヒトＬＧＲ５に特異的に結合し、治療薬に複合体化する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。治療薬は、リンカーを介して抗体またはその抗原結合フラグメントに結合する薬物であってもよい。一部の実施形態は、そのようなＡＤＣを使用する治療方法、およびそのようなＡＤＣを調製する方法に関する。

以下の参考文献、米国特許第９２２１９０６号、米国特許第９２２０７７４号、米国特許第９２２１９０７号、米国特許第９５４６２１４号、および米国特許第９６３１０２４号のそれぞれは、本明細書で提供される方法および組成物に有用な、ヒトＬＧＲ５に特異的に結合する抗体に関し、それぞれが明確にその内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、米国特許第９２２１９０６号、米国特許第９２２０７７４号、および米国特許第９２２１９０７号のそれぞれは、本明細書で提供される方法および組成物に有用な、ヒトＬＧＲ５に特異的に結合する抗体を開示する。米国特許第９５４６２１４号は、本明細書で提供される方法および組成物に有用な、ヒトＬＧＲ５に特異的に結合するヒト化抗体を開示する。

ＬＧＲ５は、腸内の正常な幹細胞および腫瘍発生細胞の高度に特異的なマーカーとして、系統追跡実験によって同定された。以前、Ｗｎｔの発現を抑制した後に発現が消失する約１５０個の遺伝子が同定された。これらの「Ｗｎｔ標的遺伝子」の包括的な特性解析により、ＬＧＲ５は陰窩基底部で増殖する１０〜１４個のくさび形細胞の集団で選択的に発現されることがわかった。これらの陰窩基底部円柱細胞は、候補幹細胞集団であることが以前に提案された。遺伝性のｌａｃＺ−ＬＧＲ５レポーター遺伝子を用いたインビボ系統追跡を使用して、ＬＧＲ５腸管幹細胞は、多能性で自己再生する成人腸管幹細胞の集団であり、陰窩基底部から始まり絨毛先端部まで伸長するｌａｃＺ＋子孫細胞の途切れないリボンを生じることが確認されている。

がん幹細胞（ＣＳＣ）でのＬＧＲ５の特異的発現は、ＣＳＣを選択的および効果的に標的とする機会を提供する。ＬＧＲ５は、正常組織と比較して、大腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん、および他の大部分の固形腫瘍で非常に過剰発現しているため、ＣＲＣ、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、胃がんおよび肝臓がんにおいてＣＳＣを標的とするための幅広い治療ウインドウを提供する。
がんにおけるＬＧＲ５の機能的役割がリボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）ノックダウン研究によって検証されてきた。ＣＲＣ腫瘍細胞株のパネルにおけるＬＧＲ５のノックダウンは、インビトロの軟寒天コロニーの増殖、およびインビボのＨＣＴ１１６結腸腫瘍異種移植の増殖も大幅に阻害した。ＬＧＲ５ ＲＮＡｉノックダウンは、続いてインビトロで患者由来のＣＲＣ腫瘍細胞からのＣＳＣコロニーの増殖も減少させることが示された（データは示さない）。最終的に、選別されたＬＧＲ５（＋）患者由来の異種移植ＣＲＣ腫瘍細胞は、対照ＬＧＲ５（−）細胞と比較して、インビボで高い腫瘍形成性を示すことがわかった。

ＣＳＣは、手術および標準治療化学療法で治療された多くのがん患者における腫瘍再発の高い発生率に関与すると考えられている。例えば、乳がん患者由来のＣＤ４４＋ ＣＳＣは化学療法後に濃縮されることがわかり、その高レベルのＣＳＣは化学療法に対する乏しい臨床反応と相関していた。同様に、転移性ＣＲＣにおいて、ＬＧＲ５発現は化学療法後の損傷した肝臓で上方制御され、化学療法に応答して増加したＬＧＲ５ ＣＳＣは転移性疾患を発生および／または悪化させることを示唆する。実際に、ＬＧＲ５の発現は、原発性ＣＲＣ腫瘍と比較して転移部位で大幅に大きいことがわかっている。

抗ＬＧＲ５抗体
本明細書で提供される方法および組成物の実施形態は、ヒトＬＧＲ５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、限定されないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えにより産生された抗体、細胞内発現抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィドが連結したＦｖ（ｓｄＦｖ）（二重特異性ｓｄＦｖを含む）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、およびエピトープ結合または上記いずれかの抗原結合フラグメント、ここで抗原はＬＧＲ５である、を含む。本明細書で提供されるいくつかの実施形態の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれ以上の多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよく、またはポリペプチドならびに異種ポリペプチドまたは固体支持体材料のような異種エピトープの両方に特異的であってもよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／０５７９３、Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991)、米国特許第４，４７４，８９３号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号、第５，５７３，９２０号、第５，６０１，８１９号、Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照されたく、それぞれの内容全体を参照により本明細書に組み込むものとする。

本明細書で使用される場合、ＬＧＲ５は、限定されないが、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００３６５８．１のポリペプチドを含むヒトＬＧＲ５、またはそのフラグメントを含み、これはＮＭ＿００３６６７．２内のコーディングヌクレオチド配列またはそのフラグメントによりコードされる。ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００３６５８．１のアミノ酸配列とエントリ全体、およびＮＭ＿００３６６７．２のヌクレオチド配列とエントリ全体は、その全体を参照により完全に本明細書に組み込むものとする。本明細書で企図されるＬＧＲ５フラグメントの例には、ＬＧＲ５細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞内ドメインおよびそれらの部分が含まれる。

一部の実施形態は、本明細書で提供される１８Ｇ７Ｃｈ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む抗ＬＧＲ５抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子を示す。一部の態様では、核酸分子は、本明細書で提供される抗体１８Ｇ７Ｃｈ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１のようなヒト化または完全にヒトモノクローナルの軽鎖または重鎖をコードする。
さまざまな実施形態は、本明細書で提供される１８Ｇ７Ｃｈ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む抗ＬＧＲ５抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする核酸分子または分子を含むベクターを対象にする。

さまざまな実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾できる。例えば、非グリコシル化抗体を作製できる（すなわち、抗体はグリコシル化がない）。グリコシル化は、例えば、標的抗原に対する抗体の親和性を高めるために変更することができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を変更することにより達成することができる。例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換を行って、１つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去し、それによりその部位のグリコシル化を除去することができる。そのような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高める場合がある。そのような方法は、米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載され、それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、抗体は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００３６５８．１（配列番号：４７）のヒトＬＧＲ５ポリペプチドまたはそのフラグメントと少なくとも６０％同一性、または少なくとも７０％同一性、または少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性、少なくとも９５％同一性、または少なくとも少なくとも９７％同一性、または少なくとも９９％同一性、または１００％同一性を有するＬＧＲ５ポリペプチドを含むまたはからなっているポリペプチドに特異的に結合する。そのようなフラグメントは、例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、または９００のＬＧＲ５ポリペプチドの連続または非連続アミノ酸、または前述の長さのいずれかの間にある任意の数の連続または非連続アミノ酸であり得る。
いくつかの実施形態では、抗体は抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、配列番号１３の重鎖アミノ酸配列および配列番号１１のＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、抗体は抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、配列番号１９を含む重鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態では、抗体は抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、配列番号１４の軽鎖配列を含む。他の実施形態では、抗体は抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、配列番号２１の軽鎖可変ドメインを含む。

一部の実施形態では、抗体は、上記配列の配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、上記配列の重鎖、軽鎖、または可変ドメインの２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、または１１８残基の範囲にわたって上記抗体配列と１００％同一である配列を含む。

一部の実施形態では、抗体は、抗体配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、抗体配列と８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、または１１１残基の範囲にわたって抗体配列と１００％同一である配列を含む。

一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＬＧＲ５抗体は、ＧＹＳＦＴＡＹＷ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＩＬＰＧＳＤＳＴ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、およびＡＲＳＧＹＹＧＳＳＱＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＬＧＲ５抗体は、ＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＬＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２、およびＱＱＮＡＥＤＰＲＴ（配列番号３３）を含む軽鎖ＣＤＲ３、を含む。

一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＬＧＲ５抗体は、（ａ）１、２、３、または４個のアミノ酸置換を有する上記配列のバリアントを含む重鎖ＣＤＲ１を含む。抗体は、また、１、２、３、または４個のアミノ酸置換を含むバリアントを有する重鎖ＣＤＲ２を有する場合がある。抗体は、また、１、２、３、または４個のアミノ酸置換を含むバリアントを有する重鎖ＣＤＲ３を有する場合がある。重鎖のこれらの修飾に加えて、抗体は、また、１、２、３、または４個のアミノ酸置換を含むバリアントを有する軽鎖ＣＤＲ１を有する場合がある。抗体は、また、１、２、３、または４個のアミノ酸置換を含むバリアントを有する軽鎖ＣＤＲ２を有する場合がある。抗体は、また、１、２、３、または４個のアミノ酸置換を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する場合がある。一部の実施形態では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。

一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＬＧＲ５抗体は、添付の配列表で本明細書に記載の配列と少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。抗体は、また、本明細書に記載の抗体配列と少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を有する場合がある。

２つのアミノ酸配列（または２つの核酸配列）の同一性パーセントは、例えば、最適な比較目的のために配列を整列させることにより決定できる（例えば、第１の配列の配列内にギャップを導入できる）。次いで、対応する位置のアミノ酸またはヌクレオチドが比較され、２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性パーセント＝同一位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列の実際の比較は、例えば数学的アルゴリズムを使用するなど、よく知られた方法で実行できる。そのような数学的アルゴリズムの具体的な、非限定的な例は、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)に記載され、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。そのようなアルゴリズムは、Schaffer et al., Nucleic Acids Res., 29:2994-3005 (2001)に記載されているように、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（バージョン２．２）に組み込まれ、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトのパラメータを使用することができる。２００２年４月１０日に入手可能になったhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。一実施形態では、探索されるデータベースは、非冗長な（ＮＲ）データベースであり、配列比較のためのパラメータは次のように設定される。フィルターなし、Ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ（期待値）１０、Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ（配列断片数）３、Ｍａｔｒｉｘ（マトリックス）はＢＬＯＳＵＭ６２、およびＧａｐ Ｃｏｓｔｓ（ギャップコスト）はＥｘｉｓｔｅｎｃｅ（存在）１１およびＥｘｔｅｎｓｉｏｎ（範囲）１を有する。

いくつかの実施形態は、また、本明細書で提供される１８Ｇ７Ｃｈ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含み、可変軽鎖（Ｖ_L）ドメインおよび／または可変重鎖（Ｖ_H）ドメインに１つまたは複数のアミノ酸残基置換を含む、上記抗体のバリアントを含む。いくつかは、また、１つまたは複数のＶ_LＣＤＲおよび／または１つまたは複数のＶ_HＣＤＲに１つまたは複数の追加のアミノ酸残基置換を持つ上記抗体のバリアントを含む。上記の抗体のＶ_Hドメイン、Ｖ_HＣＤＲ、Ｖ_Lドメインおよび／またはＶ_LＣＤＲに置換を導入することにより生成された抗体は、例えばＬＧＲ５に結合する能力についてインビトロおよびインビボで試験することができる（例えば、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅを含むがこれらに限定されないイムノアッセイによって）。

さまざまな実施形態は、本明細書で提供される１８Ｇ７Ｃｈ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つのような、ＬＧＲ５に特異的に結合する抗ＬＧＲ５抗体のＶ_Hドメイン、Ｖ_HＣＤＲ、Ｖ_Lドメイン、またはＶ_LＣＤＲの誘導体を含む、ＬＧＲ５に特異的に結合する抗体を含む。当業者に知られている標準的な技術を使用して、抗体をコードするヌクレオチド配列に突然変異（例えば、付加、欠失、および／または置換）を導入することができ、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発が、アミノ酸置換を生成するために日常的に使用されることを含む。一実施形態では、Ｖ_Hおよび／またはＶ_LＣＤＲ誘導体は、元のＶ_Hおよび／またはＶ_LＣＤＲと比較して、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換、を含む。別の実施形態では、Ｖ_Hおよび／またはＶ_L誘導体は、１つまたは複数の予測される非必須アミノ酸残基（すなわち、抗体がＬＧＲ５に特異的に結合するために不可欠ではないアミノ酸残基）で行われた保存的アミノ酸置換（例えば、上記を参照）を有する。あるいは、飽和突然変異誘発法などにより、Ｖ_Hおよび／またはＶ_LＣＤＲコード配列のすべてまたは一部に沿って突然変異を無作為に導入でき、得られた変異体を生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。突然変異誘発法の後に、コードされた抗体を発現させ、抗体の活性を決定することができる。

いくつかの実施形態は、また、ＬＧＲ５またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体を含み、抗体は、本明細書に記載のいずれかの抗体の可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含み、本明細書で提供される１８Ｇ７Ｃｈ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む。

他の実施形態は、本明細書で提供される１８Ｇ７Ｃｈ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つのような抗ＬＧＲ５抗体の任意の部分への保存的アミノ酸置換の導入を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、機能的に同等なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を表すことは当技術分野で周知である。保存的アミノ酸変化は、得られたペプチドのアミノ酸配列のサイレント変化をもたらす。例えば、同様の極性の１つまたは複数のアミノ酸が機能的同等物として働き、ペプチドのアミノ酸配列内でサイレントな変更をもたらす。電荷が中性で、残基をより小さい残基で置換する置換も、残基が異なるグループにある場合であっても（例えば、フェニルアラニンをより小さいイソロイシンで置換）「保存的置換」と考えられる場合がある。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。保存的アミノ酸置換のいくつかのファミリーを表１に示す。

一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＬＧＲ５抗体は、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、および前述の値のいずれかの範囲の間のＫＤでヒトＬＧＲ５に結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＬＧＲ５抗体は、約１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ未満、および前述の値のいずれかの範囲内の親和性でＬＧＲ５に結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＬＧＲ５抗体は、約０．０００１ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭより大きい、および前述の値のいずれかの範囲内の親和性でＬＧＲ５に結合する。

一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＬＧＲ５抗体は、配列番号４７のアミノ酸Ｔ１７５、Ｅ１７６、Ｑ１８０、Ｒ１８３、Ｓ１８６、Ａ１８７、Ｑ１８９、Ｄ２４７、Ｅ２４８、Ｔ２５１、Ｒ２５４、Ｓ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２６０を含む、またはからなる、または中にあるエピトープに結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＬＧＲ５抗体は、ロイシンリッチリピート６〜９を含む、またはからなる、または中にあるエピトープに結合する（例えば、Chen et al. Genes Dev. 27(12):1345-50を参照されたく、その内容全体を参照により組み込むものとする）。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＬＧＲ５抗体は、ＬＧＲ５細胞外ドメイン凸面を含む、またはからなる、または中にあるエピトープに結合する（例えば、Chen et al. Genes Dev. 27(12):1345-50を参照されたく、その内容全体を参照により組み込むものとする）。

ある種のヒト化抗ＬＧＲ５抗体
本明細書で提供される方法および組成物の一部の実施形態は、マウス抗体「１８Ｇ７．１」に由来のものを含む、ある種の抗ＬＧＲ５抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を含む。ヒト生殖系列配列は、ヒト化マウス抗体１８Ｇ７．１のアクセプターフレームワークとして使用された。最も近い生殖系列配列を見つけるために、最も類似した発現軽鎖および最も類似した重鎖は、ＮＣＩ ＩｇＢＬＡＳＴ（ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）により生殖系列配列のデータベースで同定された。この検索では、１８Ｇ７．１のＣＤＲ配列がマスクされた。最も適切な発現配列の選択には、標準残基と境界残基の配列同一性の確認、およびＣＤＲループ長の類似性の確認が含まれていた。
候補ヒト化配列と親マウスモノクローナル抗体１８Ｇ７．１との間の重要な構造的フレームワーク残基の潜在的な構造的競合を同定するために、３次元モデルが生成された。抗体構造の複合物を使用して、移植された候補ヒト化配列との相同性モデルを作成し、続いて分子エネルギーを最小化した。コンピュータソフトウェアＰｙｍｏｌを使用した構造解析を使用して、適切なフォールディングに悪影響を与える可能性のある残基を同定した。

この分析により、６個の候補ＶＨ鎖が構築され、１）フォールディングへの影響の可能性の分析に基づく、候補となるヒト化フレームワーク領域内に選択された置換を含む機能的ヒトフレームワーク、およびｉｉ）親１８Ｇ７．１マウス抗体ＣＤＲ（配列番号１、２、および３）が含まれた。ヒトＩｇＧ１定常領域にインフレームで融合した候補ＶＬ鎖および候補ＶＨ鎖を化学的に合成した。
同様に、２個の候補ＶＬ鎖が構築され、１）フォールディングへの影響の可能性の分析に基づく、候補となるヒト化フレームワーク領域内に選択された置換を含む機能的ヒトフレームワーク、およびｉｉ）親１８Ｇ７．１マウス抗体ＣＤＲ（配列番号４、５、および６）が含まれた。ヒトＩｇＧ１定常領域にインフレームで融合した候補ＶＬ鎖および候補ＶＨ鎖を化学的に合成した。

選択された候補バリアントのヒト化重鎖および軽鎖の組合せを、哺乳動物細胞への同時トランスフェクションにより機能性について試験した。上記の６個の候補ヒト化１８Ｇ７．１重鎖のそれぞれを、候補１８Ｇ７．１軽鎖の１つとＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトし、馴化培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性についてアッセイした。さらに、上記の３個の候補ヒト化１８Ｇ７．１重鎖を、第２の候補１８Ｇ７．１軽鎖とＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトし、馴化培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性についてアッセイした。１８Ｇ７Ｈ６として知られる１８Ｇ７．１候補の重鎖／軽鎖の組合せ（ヒト化バリアント）は、最も頑強な結合を示し、親和性成熟のために選択された。

選択されたヒト化バリアント１８Ｇ７Ｈ６の親和性を高めるために、アラニンスキャニング突然変異誘発法および飽和突然変異誘発法の組合せが用いられた。重鎖ＣＤＲ１および軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３の残基をアラニンに突然変異させ、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、得られた馴化培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性についてアッセイした。飽和突然変異誘発法を重鎖ＣＤＲ３で行い、ＣＤＲ３のすべての残基が、その位置の元のアミノ酸同一性を除く１９個の天然アミノ酸のそれぞれに突然変異した。変異体のそれぞれをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、得られた馴化培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性についてアッセイした。
これらの突然変異は、次第に３つのコンストラクトに組み込まれた。これらの３つのコンストラクトを次いでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、得られた馴化培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性についてアッセイした。２つのコンストラクト、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（ＢＮＣ１０１としても知られる）をさらなる特性評価のために選択した。表２に、抗体のある種の配列を示す。

１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のような抗ＬＧＲ５抗体のある種の特性は、米国特許第９５４６２１４号に開示され、明確にその内容全体が参照によって組み込まれる。ある種の特性は以下に要約される。
ある種の抗ＬＧＲ５抗体の特性
組換え体ＬＧＲ５を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）を使用したＦＡＣＳベースのアッセイでは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３はそれぞれ、ヒトＬＧＲ５結合についてＥＣ５０＜１０ｎＭであると決定された。他の研究では、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３はヒトおよびカニクイザルＬＧＲ５に強く結合するが、ラットまたはマウスＬＧＲ５には結合しないことがわかった。ＥＬＩＳＡベースのプレート結合アッセイでは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、３００ｐＭのＥＣ５０でＬＧＲ５細胞外ドメイン−ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質に結合することが決定された。

ＬＧＲ５の細胞表面発現レベルは、フローサイトメトリーを使用して、さまざまなヒト細胞株について決定された。ＣＴ１結腸直腸腫瘍細胞および膵臓がん細胞株Ｐａｎｃ−１、Ｃａｐａｎ２およびＣＦＰＡＣは、中でも最も高いＬＧＲ５発現体であった。中程度の発現レベルが、膵臓がん細胞株（ＡｓＰＣ−１、ＳＷ１９９０、ＨＰＡＦＩＩ）、シスプラチン耐性卵巣がん細胞株（ＯＶＣＡＲ８／ＣＰ、Ａ２７８０／ＣＰおよびＩｇｒｏｖ１／ＣＰ）ならびに結腸、乳房および卵巣がん細胞株（ＳＷ４８、Ｈｓ５７８ＴおよびＯＶＣＡＲ３）で観察された。低レベルであるが検出可能なレベルのＬＧＲ５細胞表面発現が、結腸（ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ）および乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）で観察された。表３は、さまざまな腫瘍細胞株に結合する１８Ｇ７Ｈ６Ａ３ ＦＡＣＳのデータを要約する。

１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の内部移行を、ＬＧＲ５を過剰発現しているＣＨＯ細胞で調べた。細胞を１００ｎＭの抗体を用いて４℃で３０分〜２時間染色し、過剰なＡｂを洗い流し、染色した細胞を４℃または３７℃でインキュベートした。さまざまな時点で、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８複合体化二次抗体で染色し、細胞表面に結合した抗体の内部移行を観測した。３７℃でインキュベーションすると、内部移行速度の測定値は、６．７０３±１．２８２分という表面局在化のｔ１／２の値であった。表面結合抗体のいくらかの減少が観察されたが、内部移行は、４℃でのインキュベーションにより大部分がブロックされた。

水素重水素交換質量分析を使用してエピトープマッピング実験を行い、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が結合するＬＧＲ５の特定の領域を特徴付けた。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、Ｘ線結晶学的研究で同定されたＲ−スポンジン結合部位の表面の反対側にある、ロイシンリッチリピート６〜９の凸面内で配列番号４７のアミノ酸Ｔ１７５、Ｅ１７６、Ｑ１８０、Ｒ１８３、Ｓ１８６、Ａ１８７、Ｑ１８９、Ｄ２４７、Ｅ２４８、Ｔ２５１、Ｒ２５４、Ｓ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２６０に結合することを、水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換データは示した。（例えば、Chen et al. Genes Dev. 27(12):1345-50を参照されたく、その内容全体を参照により組み込むものとする）。これらのデータは、Ｒ−スポンジンへのＬＧＲ５の結合に関与する残基が１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の結合に関与しないことを示している。これらの予備的な結果は、ＬＧＲ５の他の構造要素が、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の結合部位に関与している場合がある、という事実を排除するものではない。

ある種の抗ＬＧＲ５抗体のインビボ活性
マウスに移植されたステージＩＶの転移性結腸がん患者由来のヒト結腸ＣＴ１細胞を使用した異種移植モデルでは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、４回の投与（１５ｍｇ／ｋｇ、週に２回）の過程で、ＰＢＳおよびＭＯＰＣ抗体対照と比較してインビボで有意な抗腫瘍活性を示した。一方、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ１は抗腫瘍活性を示し、モノクローナル１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と親マウスキメラ１８Ｇ７Ｃｈ抗体の両方に優れた活性を示した。表４は、Ｌｇｒ５＋ Ａｂを１〜４回投与した後のＣＴ１腫瘍体積減少パーセント（グループ対ＭＯＰＣ）を示している。

マウスに移植されたステージＩＶの転移性結腸がん患者由来のヒト結腸ＣＴ３細胞を使用した異種移植モデルでは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１は抗腫瘍活性を示し、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、４回の投与（１５ｍｇ／ｋｇ、週に２回）後、ＰＢＳおよびＭＯＰＣ抗体対照と比較して有意な抗腫瘍活性を示した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、親マウスのキメラ１８Ｇ７Ｃｈ抗体よりも優れた活性を示し、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と同等の活性を示した。表５は、試験Ａｂをｎ回投与した後のＣＴ３腫瘍体積減少パーセント（グループ対ＭＯＰＣ）を示している。

ＣＳＣ条件下で増殖させたヒトＣＴ３細胞を使用した異種移植モデルで、ＦＯＬＦＩＲＩレジメンと組み合わせて１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を処理すると、腫瘍体積の分析から、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＦＯＬＦＩＲＩの投与によって、ＦＯＬＦＩＲＩのみと比較してＣＴ３腫瘍の成長がさらに減少することが示された。ＦＯＬＦＩＲＩと組み合わせて１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で処理したマウスから単離した細胞をマウスに再移植した。ＦＯＬＦＩＲＩ単独で処理したマウスから単離した細胞と比較して、移植した細胞は、腫瘍形成性を大幅に低下させた。さらに、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３ ＦＯＬＦＩＲＩの組合せから再移植された細胞は、ＦＯＬＦＩＲＩ単独と比較して、腫瘍増殖プロファイルが有意に遅く、進行までの時間が遅かった。これらのデータは、ＦＯＬＦＩＲＩと組み合わせて１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、腫瘍発生またはがん幹細胞集団を効果的に標的にしていることを示している。

ヒト膵臓ＡｓＰＣ−１細胞を使用した異種移植モデルでは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が単一薬剤として、移植後４１日目で、生理食塩水および／または対照ＩｇＧと比較して、マウスの腫瘍増殖を最大４０％近く阻害した。さらに、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とゲムシタビンとの組合せは、ゲムシタビン単独と比較して、ＡｓＰＣ−１モデルにおける腫瘍増殖を有意に阻害した（移植後６１日目で、最大３６％）。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は単一薬剤としても、６５日目までのＰＢＳおよび対照ＩｇＧと比較して、腫瘍増殖をある程度阻害した。

ヒト乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ３細胞を使用した異種移植モデルでは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ＰＢＳ（６０．７％腫瘍増殖阻害）またはＭＯＰＣ抗体（４９．３％腫瘍増殖阻害）対照と比較して、マウスにおいて有意な抗腫瘍活性示した。パクリタキセルと組み合わせて１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で処理したマウスから単離した細胞をマウスに移植した。パクリタキセル単独で処理したマウスから単離した細胞と比較して、そのような細胞は、腫瘍形成性を大幅に低下させた。さらに、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３およびパクリタキセル腫瘍から再移植された細胞は、パクリタキセル単独と比較して、腫瘍増殖プロファイルが有意に遅く、進行までの時間が遅かった。これらのデータは、パクリタキセルと組み合わせて１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、腫瘍発生またはがん幹細胞集団を効果的に標的にしていることを示している。

ヒト膵臓のＰＡＮＣ１細胞を使用した異種移植モデルでは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３単独でマウスにおける腫瘍増殖を阻害し（移植後７０日目で、最大３０％）、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とゲムシタビンとの組合せは、ゲムシタビン単独グループと比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した（移植後８０日目で、最大５２％）。ゲムシタビンと組み合わせて１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で処理したマウスから単離した細胞をマウスに移植した。ゲムシタビン単独で処理したマウスから単離した細胞と比較して、そのような細胞は、腫瘍形成性を大幅に低下させた。ゲムシタビンと１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の組合せで処理した再移植ＰＡＮＣ１腫瘍は、４５００個の細胞を移植したマウス（ゲムシタビンで４０％、対組合せで２０％）、および１３５００個の細胞を移植したマウス（ゲムシタビンで１００％、対組合せで７０％）でも生着頻度の低下を示した。これらのデータは、ゲムシタビンと組み合わせて１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、腫瘍発生またはがん幹細胞集団を効果的に標的にしていることを示している。

ヒト膵臓のＪＨ１０９細胞を使用した異種移植モデルでは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３処理単独では、マウスの腫瘍増殖に影響を及ぼさなかった。Ｎａｂパクリタキセルおよびゲムシタビン化学療法と組み合わせた１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、化学療法単独と比較して有意に高い程度の腫瘍阻害をもたらした。化学療法と組み合わせた１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、化学療法単独と比較して７７％高い腫瘍増殖阻害をもたらした。１８Ｇ７Ｈ７Ａ３化学療法の組合せで処理した３匹のマウスは、腫瘍が完全に根絶された。
ヒトＢＭＣＲＣ０８６細胞を使用した異種移植モデルでは、ＦＯＬＦＩＲＩと組み合わせた１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ＦＯＬＦＩＲＩ単独と比較してマウスにおいて有意な抗腫瘍活性を示した。
ＢＬＧ２９３腫瘍由来のヒト小細胞肺がん細胞を使用した異種移植モデルでは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ＰＢＳ（２４．９％腫瘍増殖阻害）またはＭＯＰＣ抗体（２４．７％腫瘍増殖阻害）対照と比較して、マウスにおいて有意な抗腫瘍活性示した。

抗体薬物複合体
本明細書で提供される方法および組成物の実施形態は、ＡＤＣを含む。そのような一部の実施形態では、ヒトＬＧＲ５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、薬物のような治療薬に複合体化する。一部の実施形態では、治療薬は細胞分裂阻害剤または細胞毒性薬剤を含む。一部の実施形態では、治療薬はＤＮＡ損傷薬剤または微小管阻害剤である。治療薬の例は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含むドラスタチンおよびアウリスタチン、α−アマニチン、β−アマニチン、またはγ−アマニチンのようなアマニチン、デュオカルマイシン誘導体のようなＤＮＡ副溝結合剤、修飾または二量体のピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチンのようなアルキル化剤、メアヤマイシンアナログまたは誘導体のようなスプライシング阻害剤、エポチロンアナログおよびパクリタキセルのような管状結合剤、ならびにカリチアマイシンおよびエスペラミシンのようなＤＮＡ損傷薬剤、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、および５−フルオロウラシルダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）のような代謝拮抗剤、ビンブラスチンおよびビンクリスチンのような抗有糸分裂剤、ならびにダウノルビシン（ダウノマイシンとしても知られる）およびドキソルビシンのようなアントラサイクリン、ならびに薬学的に許容される塩または溶媒和物、酸またはその誘導体を含む。一部の実施形態では、治療薬は、アロコルヒチン、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦのようなアウリスタチン、ハリコンドリンＢ、セマドチン、コルヒチン、コルヒチン（ｃｈｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）誘導体（Ｎ−ベンゾイル−デアセチルベンズアミド）、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、マイタンシン、ＤＭ１のようなマイタンシノイド、リゾキシン（ｒｈｏｚｏｘｉｎ）、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体（（２’−Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］グルタラマートパクリタキセル）、ドセタキセル、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ビンブラスチン硫酸塩、およびビンクリスチン硫酸塩のような抗有糸分裂剤を含む。一部の実施形態では、治療薬は、カルボコン、カルムスチン、クロルナファジン、クロロゾトシン、デュオカルマイシン、エボホスファミド、フォテムスチン、グルフォスファミド、ロムスチン、マンノスルファン、ニムスチン、フェナントリプラチン、ピポブロマン、ラニムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、チオＴＥＰＡ、トレオスルファン、トリアジコン、トリエチレンメラミン、および四硝酸トリプラチンのような抗腫瘍性アルキル化剤を含む。一部の実施形態では、治療薬は、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、モノメチルドラスタチン１０、デュオカルマイシン、メイタンサノイド１、デュアルスタチン３、カリチアマイシン、およびデュオカマイシンを含むことができる。一部の実施形態では、治療薬はＤＮＡ損傷薬剤または微小管阻害剤である。微小管阻害剤の例は、カバジタキセル、コルセミド、コルヒチン、クリプトフィシン、細胞骨格薬、デメコルチン、ドセタキセル、２−メトキシエストラジオール、ノコダゾール、パクリタキセル、タッカロノリド、タキサン、およびビンブラスチンを含む。本明細書で提供される方法および組成物で有用な治療薬のより多くの例は、米国特許出願公開第２０１７／０１３７５３３号、米国特許出願公開第２０１７／０１５８７６９号、米国特許出願公開第２０１７／０１５１３４４号、および米国特許出願公開第２０１７／０１３６１３０号に開示され、それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

そのような一部の実施形態では、ヒトＬＧＲ５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、リンカーを介して治療薬に複合体化する。一部の実施形態では、リンカーは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント上の単一部位に複数の薬剤を共有結合で連結するように多価であってもよく、または抗体もしくはその抗原結合フラグメント上の単一部位に単一の薬剤を共有結合で連結するように一価であってもよい。治療薬と本明細書で提供される抗体またはその抗原結合フラグメントとを連結するために有用なリンカーの例は、米国特許第７，２２３，８３７号、米国特許第８，５６８，７２８号、米国特許第８，５３５，６７８号、ＷＯ２００９／０７３４４５、ＷＯ２０１０／０６８７９５、ＷＯ２０１０／１３８７１９、ＷＯ２０１１／１２００５３、ＷＯ２０１１／１７１０２０、ＷＯ２０１３／０９６９０１、ＷＯ２０１４／００８３７５、ＷＯ２０１４／０９３３７９、ＷＯ２０１４／０９３３９４、およびＷＯ２０１４／０９３６４０に記載され、それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、リンカーは開裂可能なリンカーであり得る。開裂可能なリンカーには、化学的または酵素的に不安定または分解可能な結合が含まれる場合がある。開裂可能なリンカーは一般に、細胞質の減少、リソソーム内の酸性条件への曝露、または細胞内の特定のプロテアーゼまたは他の酵素による開裂のような、細胞内のプロセスに依存して治療薬を遊離させる。開裂可能なリンカーは一般に、化学的または酵素的に開裂可能な１つまたは複数の化学結合を組み込んでおり、リンカーの残りの部分は非開裂可能である。ある特定の実施形態では、リンカーは、ヒドラゾンおよび／またはジスルフィド基のような化学的に不安定な基を含む。化学的に不安定な基を含むリンカーは、血漿といくつかの細胞質コンパートメントとの間の異なる特性を利用する。ヒドラゾン含有リンカーの治療薬放出を促進するための細胞内条件は、エンドソームおよびリソソームの酸性環境であり、一方ジスルフィド含有リンカーは、高濃度のチオール、例えばグルタチオンを含む細胞質で還元される。ある特定の実施形態では、化学的に不安定な基を含むリンカーの血漿安定性を、化学的に不安定な基の近くの置換基を使用して立体障害を導入することによって高めてもよい。

一部の実施形態では、リンカーは非開裂可能なリンカーであり得る。非開裂可能なリンカーの場合、治療薬の放出は、血漿といくつかの細胞質コンパートメントとの間の異なる特性に依存しない場合がある。治療薬の放出は、抗原媒介エンドサイトーシスおよびリソソームコンパートメントへの送達を介したＡＤＣの内部移行後に起こると仮定され、抗体は細胞内のタンパク質分解によってアミノ酸のレベルまで分解される。このプロセスは、治療薬、リンカー、およびリンカーが共有結合したアミノ酸残基によって形成される薬物誘導体を放出する。非開裂可能なリンカーとの複合体からのアミノ酸薬物代謝物は、より親水性が高く、一般的に膜透過性が低いため、開裂可能なリンカーとの複合体と比較して、バイスタンダー効果と非特異的毒性が低くなる。一般的に、非開裂可能なリンカーを持つＡＤＣは、開裂可能なリンカーを持つＡＤＣよりも血液循環における安定性が高い。非開裂可能なリンカーは、アルキレン鎖であってもよく、または例えばポリアルキレングリコールポリマー、アミドポリマーに基づくものなどの性質のポリマーであってもよく、またはアルキレン鎖、ポリアルキレングリコールおよび／またはアミドポリマーのセグメントを含んでもよい。治療薬と本明細書で提供される抗体またはその抗原結合フラグメントとを連結するために有用な開裂可能および非開裂可能なリンカーの例は、米国特許出願公開第２０１７／０１５１３４４号に記載され、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。薬物を抗体またはその抗原結合フラグメントに連結する方法の例は、Behrens C.R. et al., MAbs. 2014 Jan 1; 6(1): 46-53、およびZhou q., et al, Anticancer Agents Med Chem. 2015;15(7):828-36に開示され、それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書で提供される方法および組成物の一部の実施形態は、ＡＤＣを調製することを含む。そのような一部の実施形態は、リンカーを治療薬に連結することを含むことができ、連結された治療薬は、リンカーを介して抗体またはその抗原結合フラグメントに複合体化することができる。そのような一部の実施形態は、リンカーを抗体またはその抗原結合フラグメントに連結することを含むことができ、連結された抗体またはその抗原結合フラグメントは、リンカーを介して治療薬に複合体化することができる。一部の実施形態はまた、ＡＤＣを精製することを含む。

治療方法
本明細書で提供される方法および組成物の一部の実施形態は、がんを有する対象を治療することを含む。本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」または「治療すること」とは、がんのような診断された病状または障害の治癒、減速、症状の軽減、および／または進行の停止という治療効果、およびがんのような標的の病状または障害の発症を予防および／または遅らせる予防的手段の両方を表すことができる。そのような一部の実施形態は、本明細書で提供されるＡＤＣの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。一部の実施形態では、がんは固形腫瘍を含む。一部の実施形態では、がんは肺がん、乳がん、結腸がん、および膵臓がんを含むことができる。一部の実施形態では、がんはトリプルネガティブ乳がん細胞、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＳＴＫ１１、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、およびＩＳＣＯからなる群から選択される遺伝子に突然変異を有する結腸がん細胞、ならびに小細胞肺がん細胞、のような細胞を含むことができる。一部の実施形態では、がんはがん幹細胞を含むことができる。一部の実施形態では、対象はヒトのような哺乳動物である。

一部の実施形態は、また、本明細書で提供されるＡＤＣと組み合わせて追加療法を投与することを含む。一部の実施形態では、追加療法は放射線療法および化学療法剤を含むことができる。一部の実施形態では、ＡＤＣの投与は、追加療法の投与と同時である。一部の実施形態では、化学療法剤はフォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、ＥＲＢＩＴＵＸ（セツキシマブ）、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤（ＮＶＰ）、およびＳＮ３８を含むことができる。一部の実施形態では、追加療法はフォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを含む。本明細書で提供される方法および組成物で有用な化学療法剤のより多くの例は、米国特許出願公開第２０１７／０１３７５３３号に開示され、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書で提供される方法および組成物の一部の実施形態は、腫瘍性細胞の増殖を阻害することを含む。そのような一部の実施形態は、細胞と本明細書で提供されるＡＤＣとを接触させることを含む。一部の実施形態では、腫瘍性細胞は肺がん細胞、乳がん細胞、結腸がん細胞、および膵臓がん細胞を含むことができる。一部の実施形態では、腫瘍性細胞はトリプルネガティブ乳がん細胞、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＳＴＫ１１、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、およびＩＳＣＯからなる群から選択される遺伝子に突然変異を有する結腸がん細胞、ならびに小細胞肺がん細胞、のような細胞を含むことができる。一部の実施形態では、腫瘍性細胞はがん幹細胞を含むことができる。一部の実施形態では、腫瘍性細胞はヒトのような哺乳動物である。一部の実施形態では、腫瘍性細胞はインビトロである。一部の実施形態では、腫瘍性細胞はインビボである。

本明細書で提供される一部の実施形態では、ＡＤＣは既知の技術を使用してさまざまに製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される治療用組成物は、ストレートで、または最小限の追加の構成要素と共に投与することができ、他のものは、適切な薬学的に許容される担体を含むように任意選択的に製剤化する場合がある。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当技術分野で周知であり、医薬製剤で使用するための商業的供給源から入手可能な賦形剤、ビヒクル、アジュバント、および希釈剤を含む（例えば、Gennaro (2003) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed., Mack Publishing; Ansel et al. (2004) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7.sup.th ed., Lippencott Williams and Wilkins; Kibbe et al. (2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3.sup.rd ed., Pharmaceutical Pressを参照されたい）。
本明細書で提供される方法および組成物の一部の実施形態は、非経口投与（例えば、注射による）に適したＡＤＣの製剤を含み、水性または非水性、等張性、パイロジェンフリー、滅菌液体（例えば、溶液、懸濁液）を含むことができ、活性成分が溶解、懸濁、または他の方法（例えば、リポソームまたは他の微粒子内）で提供される。

ある実施形態の特定の投与計画、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の対象、ならびに薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度、その他）のような経験的考慮事項に依存し得る。投与頻度の決定は、治療される状態の状態および重症度、治療される対象の年齢および一般的な健康状態などの考慮事項に基づいて主治医のような当業者が行ってもよい。投与頻度は、選択された組成物の有効性の評価および投与計画に基づいて、治療過程にわたって調整されてもよい。そのような評価は、特定の疾患、障害または状態のマーカーに基づいて行うことができる。個体ががんを有する実施形態では、これらは、触診または目視観察による腫瘍サイズの直接測定、Ｘ線または他の撮画技術による腫瘍サイズの間接測定、直接腫瘍生検および腫瘍試料の顕微鏡検査により評価される改善、本明細書に記載の方法にしたがって同定された代替バイオマーカーまたは抗原の測定、増殖性または腫瘍形成性細胞の数の減少、そのような腫瘍性細胞の減少の維持、腫瘍性細胞の増殖の減少、または転移の進行の遅延、を含む。

キット
本明細書で提供される方法および組成物の一部の実施形態は、キットを含む。一部の実施形態では、キットは本明細書で提供されるＡＤＣを含むことができる。一部の実施形態では、ＡＤＣは凍結乾燥されている。一部の実施形態では、ＡＤＣは水溶液中にある。一部の実施形態では、キットはＡＤＣの投与のための医薬品担体を含む。一部の実施形態では、キットは化学療法剤も含む。一部の実施形態では、化学療法剤は、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビンおよびＡｂｒａｘａｎｅから選択される。一部の実施形態では、キットは冷却剤のような、氷またはドライアイスのような、ＡＤＣの活性を維持するための構成要素を含む。

（例１）
複合体化二次抗体を用いた増殖アッセイ
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、およびヒトＬＧＲ５（ＣＨＯ−ＬＧＲ５）を発現しているＣＨＯ細胞を、一次ヒト抗ＬＧＲ５抗体（Ｃ１２）および一次抗体に結合する二次抗ヒト抗体薬物複合体（ＡＤＣ）で処理した。抗体Ｃ１２は、米国特許第９２２１９０６号に開示され、その内容全体が参照によって組み込まれる。細胞をＦ１２培地＋１０％ウシ胎児血清＋抗生物質／抗有糸分裂剤の９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルで播種して単層を形成した。ＡＤＣ（Ｍｏｒａｄｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を表６に列挙した。

表７に、細胞の処理に使用される一次抗体および二次ＡＤＣの濃度を示す。ＣＫ−ＣＡＬで処理した細胞は３０ｎＭ Ｃ１２では評価されず、ＣＫで処理した細胞は３０ｐＭ Ｃ１２では評価されなかった。

細胞生存率は、処理の３日後にＭＴＳ増殖アッセイを使用して決定した。簡潔に言えば、テトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩、ＭＴＳ］および電子カップリング試薬（フェナジンエトサルフェート、ＰＥＳ）が含まれた２０μｌ ＭＴＳ試薬を、９６ウェルプレートで増殖させた細胞に１００μｌの総体積まで添加した。プレートを３７℃で１〜４時間インキュベートし、細胞培地の吸光度を４９０ｎｍで測定した。４９０ｎｍの吸光度で測定したホルマザン生成物の量は、培養下の生細胞の数に正比例した。ＩＣ５０値も測定した。結果を図１Ａ〜１Ｇおよび表８に示す。

示されているように、Ｃ１２抗体とリジン開裂可能なカリチアマイシン（ＣＫ−ＣＡＬ）抗体との組合せは、最低ＩＣ５０スコアが０．０６０であった。モノメチルアウリスタチンＦに非開裂可能に結合した抗ヒト抗体（ＮＬ−ＭＭＡＦ）は、０．１４０という次に低いＩＣ５０値を示した。

（例２）
複合体化二次抗体を用いた増殖アッセイ
ＣＨＯおよびＣＨＯ−ＬＧＲ５を、さまざまな一次ヒト抗ＬＧＲ５抗体および二次抗ヒトＡＤＣ（ＮＬ−ＭＭＡＦ）で３日間処理した。例１に記載のＭＴＳアッセイを使用して、細胞生存率を測定した。一次抗体にはＣ１２、１８Ｇ７Ｃｈ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１、および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が含まれていた。細胞を処理するために使用した一次抗体および二次ＡＤＣの濃度を表９に列挙する。結果を図２および表１０に示す。

二次抗ヒトＡＤＣ（ＮＬ−ＭＭＡＦ）と共に試験した４つの一次抗体のそれぞれは、ヒトＬＧＲ５を発現しているＣＨＯの細胞生存率を低下させるのに効果的であった。

（例３）
ヒト細胞において複合体化二次抗体を用いた腫瘍球アッセイ
腫瘍球は、単一のがん幹細胞／前駆細胞の増殖から成長する固い球状の形成物である。細胞を血清フリーおよび／または非接着性条件で増殖させることにより、細胞集団から腫瘍球を誘導して成長させることができる。したがって、腫瘍球は、細胞集団内のがん幹細胞の数を示すことができる。ヒトＣＴ３細胞は、腫瘍球を形成するように誘導できるステージＩＶの転移性結腸がんの患者に由来する継代の少ない初代細胞であり、次の遺伝子、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＳＴＫ１１、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、およびＩＳＣＯに突然変異を含む。

ＬＧＲ５を発現するヒトＣＴ３細胞を通常の条件下で培養し、アクターゼ細胞解離試薬を使用して採取し、セルストレーナーに細胞を通すことにより単一細胞懸濁液が形成された。単一細胞懸濁液を、５００細胞／ウェルで、特定のがん幹細胞（ＣＳＣ）培地の９６ウェル低接着プレートに播種した。細胞をさまざまな一次ヒト抗ＬＧＲ５抗体と二次抗ヒトＡＤＣ（ＣＬ−ＤＭＳＡ）で、一次抗体と二次抗体の比は１：１で、以下の０．０３、０．１、０．３、１、３、および１０ｎＭの濃度で処理した。一次抗体にはＣ１２、１８Ｇ７Ｃｈ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１、および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が含まれていた。処理した細胞を７日間インキュベートし、腫瘍球の数を数えた。

結果を図３および表１１に示し、これらは一次抗体とＡＤＣ抗体とのそれぞれの組合せが、アッセイの期間にわたって形成された腫瘍球の数を減少させる、いくつかの活性を有したことを示している。Ｃ１２抗体とＡＤＣ抗体との組合せは、対照と比較して、低濃度の組合せで腫瘍球形成を減少させる活性が実質的にほとんどなかった。しかし、Ｃ１２抗体とＡＤＣ抗体との組合せは、３ｎＭを超える濃度で腫瘍球形成を阻害するのにますます効果的であった。１８Ｇ７Ｈ６Ａ１抗体とＡＤＣ抗体との組合せは、最低ＩＣ５０スコアが０．９３１ｎＭであった。

（例４）
ヒト細胞において複合体化抗ＬＧＲ５抗体を用いた腫瘍球アッセイ
腫瘍球アッセイを、開裂可能なリンカー（ＣＬ−ＤＭＳＡ）を介してデュオカルマイシン（ＤＭＳＡ）に複合体化したヒト抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（ＢＮＣ１０１）、または非開裂可能なリンカー（ＮＬ−ＭＭＡＥ）を介してモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に複合体化したヒト抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（ＢＮＣ１０１）のいずれかで処理したＬＧＲ５を発現しているヒトＣＴ１細胞で行った。ＣＴ１細胞は、腫瘍球を形成するように誘導できるステージＩＶの転移性結腸がんの患者に由来する継代の少ない初代細胞であり、次の遺伝子、Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ｐ５３およびＡＰＣに突然変異を含む。複合体化抗ＬＧＲ抗体、ならびにＣＬ−ＤＭＳＡおよびＮＬ−ＭＭＡＥと複合体化した対照ＭＯＰＣ抗体は、Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡによって調製された。細胞を例３に記載のように播種し、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、および３０ｎＭの複合体化１８Ｇ７Ｈ６Ａ３または対照ＭＯＰＣ抗体で処理した。７日後、腫瘍球を数えた。結果を図４および表１２に示し、これらはＣＬ−ＤＭＳＡまたはＮＬ−ＭＭＡＥのいずれかと複合体化した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のＩＣ５０濃度は、同一のリンカー薬物と複合体化した対照ＭＯＰＣ抗体のＩＣ５０濃度よりも少なくとも２桁低かったことを示す。ＣＬ−ＤＭＳＡと複合体化した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のＩＣ５０は、ＮＬ−ＭＭＡＥと複合体化した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のＩＣ５０より低かった。

（例５）
抗ＬＧＲ５薬物複合体による異種移植モデルのインビボ処理
７〜８週齢の雌ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に２０００個のＣＴ１細胞（１：１ ｍａｔｒｉｇｅｌ：培地）を接種した。腫瘍は成長し、２５日間で平均体積１２０〜１３０ｍｍ³になった。２５、３２、および３９日に、動物に異なるＡＤＣ処理を施した。ＡＤＣには、ＤＭＳＡまたはＭＭＡＥが複合体化した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（ＢＮＣ１０１）が含まれていた。ＤＭＳＡまたはＭＭＡＥが複合体化した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡから提供され、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ複合体化技術を使用したｖｃ−ＰＡＢ複合体化が含まれていた。図６Ａおよび６Ｂは、この実施例で使用されるものと実質的に同様のリンカーおよびＤＭＳＡの構造を図示する。図６Ａでは、構造は、ボックスに示されたＤＭＳＡを有するＭＡ−ＰＥＧ４−ｖｃＰＡＢ−ジアミノエチル−カルバモイル−デュオカルマイシンを含む。図６Ｂでは、ＤＭＳＡは抗体に連結している。対照抗体には、ＤＭＳＡまたはＭＭＡＥが複合体化したＭＯＰＣ抗体が含まれていた。

処理群には、ＰＢＳ、３ｍｇ／ｋｇ ＭＯＰＣ−デュオカルマイシン、１０ｍｇ／ｋｇ ＭＯＰＣ−デュオカルマイシン、３ｍｇ／ｋｇ ＭＯＰＣ−ＭＭＡＥ、１０ｍｇ／ｋｇ ＭＯＰＣ−ＭＭＡＥ、３ｍｇ／ｋｇ ＢＮＣ１０１−デュオカルマイシン、１０ｍｇ／ｋｇ ＢＮＣ１０１−デュオカルマイシン、３ｍｇ／ｋｇ ＢＮＣ１０１−ＭＭＡＥ、および１０ｍｇ／ｋｇ ＢＮＣ１０１−ＭＭＡＥ、（ｎ＝６）が含まれていた。自動デジタルキャリパーを使用し、腫瘍の長さと幅を３回測定した平均をとることによって、３〜４日ごとに腫瘍を測定した。実験は４２日目に終了し、腫瘍を回収してＦＡＣＳおよび腫瘍球形成アッセイのために解離させた。結果を図５Ａ〜５Ｃに示す。図５Ａは、ＭＭＡＥと複合体化した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３による処理が、ＰＢＳ対照による処理と比較して、４２日目に少なくとも約３７％腫瘍増殖を阻害したことを示している。図５Ｂおよび５Ｃは、ＭＭＡＥと複合体化した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（図５Ｂ）またはデュオカルマイシンと複合体化した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（図５Ｃ）のいずれかによる処理が、複合体化ＭＯＰＣ対照による処理と比較して、少なくとも４０日間腫瘍増殖を阻害するのに有効であることを示している。

ある実施形態
本明細書で提供されるある実施形態は、以下の態様を含む。
態様１：ヒトロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５（ＬＧＲ５）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、抗体薬物複合体であって、抗体またはその抗原結合フラグメントはリンカーを介して薬物に複合体化する、抗体薬物複合体。

態様２：抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１）、またはその保存的変異、配列番号２５を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、またはその保存的変異、配列番号２７を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、またはその保存的変異、配列番号２９を含む軽鎖ＣＤＲ１、またはその保存的変異、配列番号３１を含む軽鎖ＣＤＲ２、またはその保存的変異、配列番号３３を含む軽鎖ＣＤＲ３、またはその保存的変異、を含む、態様１に記載の抗体薬物複合体。
態様３：抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ１を含む、態様１に記載の抗体薬物複合体。
態様４：抗ＬＧＲ５抗体またはその抗原結合フラグメントはＩｇＧ１を含む、態様１から３までのいずれか１項に記載の抗体薬物複合体。
態様５：リンカーは非開裂可能なリンカーである、態様１から４までのいずれか１項に記載の抗体薬物複合体。

態様６：リンカーは開裂可能なリンカーである、態様１から４までのいずれか１項に記載の抗体薬物複合体。
態様７：薬物は微小管阻害剤およびＤＮＡ損傷薬剤から選択される、態様１から６までのいずれか１項に記載の抗体薬物複合体。
態様８：微小管阻害剤は、カバジタキセル、コルセミド、コルヒチン、クリプトフィシン、デメコルチン、ドセタキセル、２−メトキシエストラジオール、ドコダゾール、パクリタキセル、タッカロノリド、タキサン、およびビンブラスチンからなる群から選択される、態様７に記載の抗体薬物複合体。
態様９：薬物は、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルドラスタチン１０、デュオカルマイシン、メイタンサノイド１、デュアルスタチン３、カリチアマイシン、およびデュオカマイシンからなる群から選択される、態様１から６までのいずれか１項に記載の抗体薬物複合体。

態様１０：態様１から９までのいずれか１項に記載の抗体薬物複合体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
態様１１：がんを有する対象を治療する方法であって、態様１から９までのいずれか１項に記載の抗体薬物複合体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
態様１２：がんは固形腫瘍を含む、態様１１に記載の方法。
態様１３：がんはがん幹細胞を含む、態様１１に記載の方法。
態様１４：がんは肺がん、乳がん、結腸がん、および膵臓がん、からなる群から選択される、態様１１に記載の方法。
態様１５：がんはトリプルネガティブ乳がん細胞、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＳＴＫ１１、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、およびＩＳＣＯからなる群から選択される遺伝子に突然変異を有する結腸がん細胞、ならびに小細胞肺がん細胞、からなる群から選択される細胞を含む、態様１１に記載の方法。

態様１６：対象は哺乳動物である、態様１１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
態様１７：対象はヒトである、態様１１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
態様１８：抗体薬物複合体と組み合わせて追加療法を投与することを含み、追加療法は、放射線療法および化学療法剤からなる群から選択される、態様１１から１７までのいずれか１項に記載の方法。
態様１９：抗体薬物複合体の投与は、追加療法の投与と同時である、態様１８に記載の方法。

態様２０：化学療法剤はフォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、ＥＲＢＩＴＵＸ（セツキシマブ）、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤（ＮＶＰ）、およびＳＮ３８、からなる群から選択される、態様１８に記載の方法。
態様２１：追加療法はフォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを含む、態様１８に記載の方法。

態様２２：態様１から９までのいずれか１項に記載の抗体薬物複合体を調製する方法であって、リンカーを薬物に連結すること、および連結した薬物を抗体に複合体化すること、を含む方法。
態様２３：複合体化抗体を精製することを含む、態様２２に記載の方法。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「によって特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と同意語であり、包含的または非限定的であり、およびさらなる引用されていない要素または方法の工程を排除しない。

上述の説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示する。本発明は、方法および材料の変更と共に、製造方法および装置の変更の影響を受ける。このような変更は、本開示を考慮することから、または本明細書で開示された発明の実施から、当業者に明らかとなるであろう。したがって、本発明は、本明細書で開示された特定の実施形態に限定されることを意図したものではなく、本発明の真の範囲および精神に含まれるすべての修正および変更を対象とすることを意図したものである。

本明細書で引用されるすべての参考文献は、公開および未公開の出願、特許、ならびに参考文献を含むがこれに限定されるものではなく、その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられ、これによって本明細書の一部をなしている。参照により組み込まれる出版物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と相反する程度までは、本明細書は、任意のこのような相反するものにとって代わるか、および／または優先することが意図される。

Claims (22)

1. ヒトロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５（ＬＧＲ５）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、抗体薬物複合体であって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントがリンカーを介して薬物に複合体化しており、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
   配列番号２３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１）、またはその保存的変異、
   配列番号２５を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、またはその保存的変異、
   配列番号２７を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、またはその保存的変異、
   配列番号２９を含む軽鎖ＣＤＲ１、またはその保存的変異、
   配列番号３１を含む軽鎖ＣＤＲ２、またはその保存的変異、および
   配列番号３３を含む軽鎖ＣＤＲ３、またはその保存的変異、
   を含む、抗体薬物複合体。
2. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ１を含む、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
3. 抗ＬＧＲ５抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＩｇＧ１を含む、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
4. 前記リンカーが、非開裂可能なリンカーである、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
5. 前記リンカーが、開裂可能なリンカーである、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
6. 前記薬物が、微小管阻害剤およびＤＮＡ損傷薬剤から選択される、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
7. 前記微小管阻害剤が、カバジタキセル、コルセミド、コルヒチン、クリプトフィシン、デメコルチン、ドセタキセル、２−メトキシエストラジオール、ドコダゾール、パクリタキセル、タッカロノリド、タキサン、およびビンブラスチンからなる群から選択される、請求項６に記載の抗体薬物複合体。
8. 前記薬物が、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルドラスタチン１０、デュオカルマイシン、メイタンサノイド１、デュアルスタチン３、カリチアマイシン、およびデュオカマイシンからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
9. 請求項１から８までのいずれか１項に記載の抗体薬物複合体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
10. がんを有する対象を治療する方法であって、請求項１から８までのいずれか１項に記載の抗体薬物複合体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む前記方法。
11. 前記がんが、固形腫瘍を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記がんが、がん幹細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
13. 前記がんが、肺がん、乳がん、結腸がん、および膵臓がんからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
14. 前記がんが、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＳＴＫ１１、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、およびＩＳＣＯからなる群から選択される遺伝子に突然変異を有する結腸がん細胞、トリプルネガティブ乳がん細胞、ならびに小細胞肺がん細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
15. 前記対象が、哺乳動物である、請求項１０に記載の方法。
16. 前記対象が、ヒトである、請求項１５に記載の方法。
17. 抗体薬物複合体と組み合わせて追加療法を投与することを含み、前記追加療法が、放射線療法および化学療法剤からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
18. 抗体薬物複合体の投与が、追加療法の投与と同時である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記化学療法剤が、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、ＥＲＢＩＴＵＸ（セツキシマブ）、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤（ＮＶＰ）、およびＳＮ３８からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
20. 前記追加療法が、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを含む、請求項１７に記載の方法。
21. 請求項１から８までのいずれか１項に記載の抗体薬物複合体を調製する方法であって、
    リンカーを薬物に連結すること、および
    連結した薬物を抗体に複合体化すること、
    を含む方法。
22. 複合体化抗体を精製することを含む、請求項２１に記載の方法。

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