JP2017511156A5 - - Google Patents

Claims (16)

1. 細菌ゲノム内の目標変異生成領域（ＩＭＲ）に変異を生成するためのプロセスであって、細菌がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含み、且つＩＭＲが細菌のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されることの可能なＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ／プロトスペーサーを含み、プロセスが：
   （ａ）前記細菌の集団を組換えベクターで形質転換するステップであって、組換えベクターが組換えエレメントを含み、組換えエレメントが：
   （ｉ）変異を含む置換エレメント、および
   （ｉｉ）置換エレメントに隣接する相同アームであって、細菌ゲノム内のＩＭＲの全体または一部を、置換エレメントを含むエレメントで置換することを促進することが可能な相同アームを含み、
   組換えエレメントがＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることの可能なＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ／プロトスペーサーを含まない、ステップ；
   （ｂ）細菌集団内の１つまたはそれ以上の細菌において、それらの細菌のゲノム内のＩＭＲの全体または一部が置換エレメントを含むエレメントによって置換され、これによりＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ／プロトスペーサーがそれらの細菌のゲノム内のＩＭＲから除去されるかまたはＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることが不可能となる条件下で、細菌集団を培養するステップ；
   （ｃ）前記集団におけるＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ／プロトスペーサーが除去されていないか、ｃｒＲＮＡによって認識されることが不可能となっていない任意の細菌のＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ／プロトスペーサーを標的としたｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な死滅ベクターで細菌集団を形質転換し、これによりｃｒＲＮＡによって認識されるそれらのＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ／プロトスペーサーのＣＡＳエンドヌクレアーゼ誘導開裂と、これに続くそれらの細菌の死滅を促進するステップ；および
   （ｄ）そのゲノムが変異を含む置換エレメントを含む１つまたはそれ以上の細菌を前記集団から選択するステップを含む、前記プロセス
2. 請求項１に記載のプロセスであって、前記細菌が非高度組換え誘導細菌である前記プロセス。
3. 請求項１または請求項２に記載のプロセスであって、ステップ（ｃ）に先立ち、１つまたはそれ以上の形質転換された細菌が分離され且つさらに継代培養されて１つまたはそれ以上のさらなる細菌集団を生成した後これを前記死滅ベクターで形質転換する前記プロセス。
4. 請求項１から３のうちいずれか１つに記載のプロセスであって、前記ＩＭＲ内の前記ＰＡＭ／プロトスペーサーが前記組換えエレメントにおいて：
   （ｉ）前記置換エレメント；
   （ｉｉ）前記上流相同アームと前記置換エレメントのオーバーラップ；
   （ｉｉｉ）前記下流相同アームと前記置換エレメントのオーバーラップ；
   （ｉｖ）前記上流相同アーム；または
   （ｖ）前記下流相同アームに対応するＤＮＡ領域内に存在する前記プロセス。
5. 請求項４に記載のプロセスであって、前記ＩＭＲ内の前記ＰＡＭ／プロトスペーサーが前記組換えエレメントにおいて：
   （ｉ）前記置換エレメント；
   （ｉｉ）前記上流相同アームと前記置換エレメントのオーバーラップ；または
   （ｉｉｉ）前記下流相同アームと前記置換エレメントのオーバーラップに対応するＤＮＡ領域内に存在する前記プロセス。
6. 請求項５に記載のプロセスであって、前記ＩＭＲ内の前記ＰＡＭ／プロトスペーサーが前記置換エレメントに対応するＤＮＡ領域内に存在する前記プロセス。
7. 前述の請求項のうちいずれか１つに記載のプロセスであって、前記死滅ベクターが：
   （ｉ） Ｃａｓリーダーエレメント
   （ｉｉ） 第１のＣａｓ直列反復エレメント
   （ｉｉｉ） 前記ＩＭＲ内の前記ＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とするｃｒＲＮＡを産生することの可能なＣａｓスペーサーエレメント；および
   （ｉｖ） 第２のＣａｓ直列反復エレメントを含む前記プロセス。
8. 前述の請求項のうちいずれか１つに記載のプロセスであって、前記変異が１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または挿入、または１つまたはそれ以上の置換、欠失または挿入の組み合わせである前記プロセス。
9. 請求項８に記載のプロセスであって、前記変異が前記ＰＡＭ／プロトスペーサー内にある前記プロセス。
10. 請求項８または請求項９に記載のプロセスであって、前記変異がＳＮＰである前記プロセス。
11. 前述の請求項のうちいずれか１つに記載のプロセスであって、前記細菌が内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する前記プロセス。
12. 前述の請求項のうちいずれか１つに記載のプロセスであって、前記細菌がＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する前記プロセス。
13. 前述の請求項のうちいずれか１つに記載のプロセスであって、前記細菌がグラム陽性菌である前記プロセス。
14. 前述の請求項のうちいずれか１つに記載のプロセスであって、前記細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ綱、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ目、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属であるかまたは細菌がＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目またはＢａｃｉｌｌｕｓ属である前記プロセス。
15. 請求項１４に記載のプロセスであって、前記細菌がＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ａｒｂｕｓｔｉ、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃ．ｎｏｖｙｉ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐａｌｍａｒｉｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｃ．ｍａｇｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ、Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ、Ｃ．ｈｏｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍおよびＣ．ｒｏｓｅｕｍからなる群から選択される前記プロセス。
16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセスによって細菌ゲノム内の目標変異生成領域（ＩＭＲ）に変異を生成することを含む、変異細菌を作製するためのプロセス。