JP2016503290A - 遺伝子薬物療法のための新規試薬 - Google Patents

Abstract

本発明は、遺伝物質を細胞内の酸性コンパートメントから離すように誘導できる第１の因子および微小管またはそのネットワークを安定化できる第２の因子を含む遺伝物質で細胞をトランスフェクトするための組成物に関する。本発明はまた、疾患を治療するための医薬の製造における組成物の使用、遺伝物質を細胞内に送達するための方法およびキットに関する。【選択図】なし

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１２年１０月２９日に出願された米国仮出願番号６１／７１９，９０８の優先権の利益を主張し、その内容は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本開示は遺伝物質で細胞をトランスフェクトするための組成物に関する。特に、本発明は、遺伝物質を細胞内の酸性コンパートメントから離すように誘導できる第１の因子および微小管またはそのネットワークを安定化できる第２の因子を含むことを使用して細胞をトランスフェクトすることに関する。

ｐＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｈＲＮＡの遺伝子送達は、現在、少しの治療選択肢しか存在しない、神経変性疾患および脊髄損傷を含む破壊障害の治療についての可能性を与える。しかしながら、核酸ベースの治療は依然として、生物学の新規カテゴリーとして開発の初期段階のままである。遺伝子送達の有効性は細胞の内部へのこれらの分子の送達を必要とし、送達ストラテジーについての重要な課題を示している。ウイルスキャリアの臨床応用に関連する不都合な点を考慮して、既存の非ウイルスキャリアは分化したニューロンをほとんどトランスフェクトしないので、非ウイルス遺伝子送達は、減少した免疫原性、大きなサイズの導入遺伝子を収容する能力、改善された安全性および製造の容易さに起因して魅力的な代替案として役立つ。

既製のトランスフェクション因子であるポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）は、インビボおよびインビトロでニューロンを含む、様々な細胞種類をトランスフェクトするために使用されている。ＬＰＥＩのカチオン性と共に、ナノ粒子内のＬＰＥＩ濃縮ＤＮＡは、細胞表面上の負に帯電しているヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合することによって細胞内へのこれらのベクターの進入を促進すると考えられる。内在化後、ＬＰＥＩ／ＤＮＡナノ複合体は細胞の核周辺領域に輸送されると考えられる。次いでＬＰＥＩは、ポリマーからＤＮＡを放出し、続いてＤＮＡを核内に取り込む、「プロトン−スポンジ効果」によってエンドソームを回避すると仮定される。

ＬＰＥＩを使用したプロトコルを最適化することによって、分化したニューロンのトランスフェクション効率および細胞生存率を増加させる最近の試みはある程度の成功を収めている。非神経細胞、初代ニューロンおよび神経細胞株において高トランスフェクション効率を制限する内在機構を識別する試みがなされている。神経細胞を含む、分裂していない、有糸分裂後細胞の不十分なトランスフェクションは、多くの場合、核転座におけるｐＤＮＡの推定される不能性に起因すると考えられる。さらに、内在化および細胞内障壁は、分化した神経細胞においてトランスフェクションを制限すると考えられた。取り込みを増加させることによって、多くの神経細胞は、かろうじてだが（全細胞集団の２％〜６％）、導入遺伝子を発現することが見出された。これまで、非ウイルスキャリアを使用して、分化したニューロンにおいて高いトランスフェクション効率を達成する目標が依然として達成されていないままであり、このような特性を有するさらに多くの新規ポリマーを生成する試みが継続している。

癌、自己免疫疾患、および神経変性疾患などの種々の破壊疾患についての診断の有意な改善および治療におけるイノベーションにも関わらず、これらの障害の有効な治療は依然として多くの課題を呈している。現在、低いトランスフェクションおよび送達効果は薬物−遺伝子療法の適用を制限している。この満たされてない要求は、エキソビボおよびインビボで遺伝子送達を向上させる方法の開発ならびにこの技術を使用したガレノス（ｇａｌｅｎｉｃｓ）のその後の開発を必要とする。

したがって、本開示の目的は上述の不都合な点を改善し、改善されたトランスフェクション効率を提供することである。

第１の態様において、本発明は、遺伝物質を細胞内の酸性コンパートメントから離すように誘導できる第１の因子および微小管またはそのネットワークを安定化できる第２の因子を含む遺伝物質で細胞をトランスフェクトするための組成物を提供する。

第２の態様において、本発明は、組成物と共に遺伝物質を投与する工程を含む、細胞内に遺伝物質を送達する方法を提供する。

第３の態様において、本発明は、癌、ＳＭＡ、骨肉腫、白血病、血液癌、鎌状赤血球障害、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ＨＩＶ、遺伝的疾患、糖尿病、心疾患および神経変性疾患からなる群から選択される疾患を治療するための医薬の製造における組成物の使用を提供する。

第４の態様において、本明細書に記載されている第１の因子、および本明細書に記載されている第２の因子を含む組成物が提供される。

第５の態様において、本発明は、本明細書に記載されている組成物および使用説明書を含むキットを提供する。

本発明は、非限定的な例および添付の図面と併せて考慮される場合、詳細な説明を参照してより良く理解される。

ＴｒａｆＥｎ（商標）の可能な効果の概略図を示す。これは、酸性コンパートメントから離れるようにポリプレックスの向きを特異的に変え（工程１）、化学増感剤（例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、タキサン）の使用によって安定化される微小管ネットワーク上に経路を変える（工程２）、ｃｈｅｍｏＲｅ−ルータの最適化した混合物を含む。化学増感剤は遺伝子産物と相乗作用して、有益な治療効果を達成する（工程３）。ＴｒａｆＥｎ（商標）はまた、治療物質の細胞内輸送を改善するために使用され得る。 ＴｒａｆＥｎ（商標）の組成の概略を示す。これは、ｃｈｅｍｏＲｅ−ルータおよび微小管標的化学増感剤の最適化した混合物を含む。ＴｒａｆＥｎ（商標）は、遺伝産物によりトランスフェクション効率および相乗作用を向上させて、有益な治療効果を達成することが示される。 微小管ネットワーク修飾因子の効果を示す。（Ａ）は、微小管の動的変化性（ｄｙｎａｍｉｃｉｔｙ）が、チューブリンアセチル化またはチューブリン結合剤（ＴＢＡ）によって阻害されることを示す。化学療法剤、タキサンなどのＴＢＡはチューブリンに結合するが、ＨＤＡＣ６およびＳｉｒｔｕｉｎ２の阻害は微小管の脱アセチル化を防ぎ；微小管の安定化を導く。（Ｂ）ヒストン脱アセチル化阻害剤（ＨＤＡＣｉ）の可能な効果を示す。これらは、保護遺伝子の抑制解除および炎症性遺伝子の発現の阻害を含む、可能な複数の機構によって心不全の病的状態を軽減するように見える。ＨＤＡＣｉの他の非転写効果は、サルコメア（ｓａｃｒｏｍｅｒｉｃ）タンパク質のアセチル化の向上ならびに自食作用およびアポトーシスについての経路の阻害を含み得る。 ＴｒａｆＥｎ（商標）の相乗効果および新規遺伝子−薬物療法の併用治療としてのその使用を示す概略図を示す。以前の図２に示されているように、ＴｒａｆＥｎ（商標）を構成する成分は、微小管を標的とする化学増感剤およびｃｈｅｍｏＲｅ−ルータである。これらの成分の両方は、遺伝子導入プロセスを支援し、向上させるために相互作用し、その結果、標的遺伝子の遺伝子発現の上方制御または下方制御が起こり得る。化学増感剤と共に、遺伝子発現のこの制御は、限定されないが、細胞再プログラミング、幹細胞分化、アポトーシス効果、抗血管新生効果、抗炎症効果および／または神経保護効果であり得る、所望の治療効果を生じ得る。 凝集したポリプレックスがトランスフェクトした、天然であるが、分化していない神経細胞効率のデータを示す。Ａ．細胞を、トランスフェクションの４８時間前に５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、１０μＭのオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）または１０μＭのホルスコリン（ＦＳＫ）によって分化した。天然および分化した細胞を、軽度の遠心分離を使用してポリプレックス（Ｎ／Ｐ＝２０）でトランスフェクトした。緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現する細胞の百分率を、トランスフェクションの４８時間後、ＦＡＣＳによって定量した。Ｂ．トランスフェクションの４８時間後に獲得した代表的な蛍光イメージ（下の列）。Ｃ．１０μＭのＲＡで処理したＥＧＦＰ陽性（＋）および陰性（−）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞（天然および分化した表現型）の百分率を、蛍光および明視野画像を数えることによって決定した。細胞体の長さの２倍の神経突起を保有する細胞を分化した表現型とみなした。示したデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４であった。 ポリプレックスの内在化が分化後に影響を与えなかったことを示す顕微鏡写真およびヒストグラムを示す。Ａ．天然および分化したＮｅｕｒｏ２ＡおよびＮＧ−１０８細胞を、軽度の遠心分離手順を使用してローダミン−ｐＤＮＡポリプレックス（Ｎ／Ｐ＝２０）でトランスフェクトした。４時間のインキュベーション後、細胞画像を、０．４％トリパンブルーでクエンチする前後に得た。バーは１０μｍを表す。Ｂ．ポリプレックス（Ｎ／Ｐ＝２０）によるトランスフェクション後の種々の時点において、細胞をｐＡＡ／ＤＮＡｓｅで処理して細胞外ｐＤＮＡを除去した。細胞をトリプシン処理し、ｑＰＣＲによる内在化したＤＮＡの定量前にｐＡＡ／尿素溶解緩衝液で処理した。示したデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３であった。 ＰＫＣが、天然であるが、分化していない神経細胞におけるポリプレックスの取り込みに関与していることを示すデータを示す。Ａ．天然および分化した（１０μＭ ＲＡ）Ｎｅｕｒｏ２ａを、トランスフェクションの４５分前に、２．５μｇ／ｍｌのロットレリン、５μｇ／ｍｌのフィリピンＩＩＩまたは３０μｇ／ｍｌのダイナソールで処理した。ＤＭＳＯ／０．５％ ＦＢＳを処理のための対照として使用した。ポリプレックス（Ｎ／Ｐ＝２０）によるトランスフェクション後、細胞を４℃または３７℃にて４時間インキュベートした。細胞外ｐＤＮＡをｐＡＡ／ＤＮＡｓｅにより除去し、細胞をトリプシン処理した。次いで、試料をｐＡＡ／尿素溶解緩衝液で処理し、ｐＤＮＡの絶対コピー数をｑＰＣＲによって定量した。同様の実験において、天然のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を、トランスフェクションの２４時間後、３７℃にてインキュベートした。Ｂ．トランスフェクションの４８時間後に獲得した、代表的な蛍光画像（下の列）。Ｃ．ＥＧＦＰを発現する細胞の百分率を計数した。トランスフェクション効率の有意差を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４であった。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．００５。 天然および分化した神経細胞において異なって局在化したポリプレックスを示す、顕微鏡画像および棒グラフを示す。Ａ．天然および分化した（１０μＭ ＲＡ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、遠心分離トランスフェクション手順でＬＰＥＩ／ＦＩＴＣ−ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を使用してトランスフェクトした。クエンチング試薬ＥｔＢｒ（２０μｇ／ｍｌ）をトランスフェクションの４時間後に添加した。細胞画像を、ＥｔＢｒによるクエンチの前後に得た。バーは５μｍを表す。Ｂ．細胞を、Ｎ／Ｐ＝２０にて予め複合体化したＬＰＥＩ／ＦＩＴＣ−またはローダミン−ｐＤＮＡによってトランスフェクトした。標識したｐＤＮＡに会合した細胞の百分率を、トランスフェクションの４時間後または２４時間後にて、ＥｔＢｒまたはトリパンブルーにより細胞外蛍光をクエンチした後に獲得した。天然および分化したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるＦＩＴＣ／ローダミン（ＦＩＴＣ／Ｒｈｏ）の比を計算した。Ｃ．ＬＰＥＩ／ローダミン−ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）による天然および分化したＮｅｕｒｏ２Ａのトランスフェクションの４時間後、培養培地を除去し、５０ｎＭ ＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒグリーンＤＮＤ−２６を含有する１×ＰＢＳを補充し、共焦点顕微鏡を使用して可視化する前にインキュベーションを５分間継続した。単一細胞の画像を１００倍で捕捉した。アスタリスクは、標識したコンパートメントによるポリプレックスの共局在化を示した。Ｄ．ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒグリーンＤＮＤ−２６によるローダミンの共局在化したピクセルを分析した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝２０）であった。 ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳによって促進される、ポリプレックスのエンドソーム回避がトランスフェクションを非常に向上させることを示すデータを可視化する。Ａ．ＲＡで分化したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を、遠心分離トランスフェクション手順でＮ／Ｐ＝２０にてＬＰＥＩ／ｐＤＮＡによってトランスフェクションした。ＨＥＰＥＳにおける予め複合体化したＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ（９：２のモル比）を、トランスフェクションの直後、培養培地に加えた。トランスフェクション効率を、２４時間後、蛍光および明視野画像を数えることによって分析した。細胞体の長さの２倍の神経突起を有するＥＧＦＰ陽性細胞の百分率を、群平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝４）として示した。Ｂ．インキュベーションの終わりに捕捉した代表的な画像を示した。Ｃ．天然および分化したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を、ＬＰＥＩ／ローダミン−ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）によりトランスフェクトした。次いで、酸性コンパートメントを、トランスフェクションの４時間後、ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒグリーンで標識した。単一細胞の画像を１００倍で捕捉した。Ｄ．共局在化ピクセルを分析した。データを群平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝２０）として示した。 ポリプレックスのエンドソーム回避後の向上した輸送は、トランスフェクションを非常に改善したデータを示す、ヒストグラムおよび顕微鏡写真を示す。天然および分化した（１０μｍ ＲＡ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞または初代皮質ニューロン（ＤＩＶ３）を、遠心分離トランスフェクション手順を使用してＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）でトランスフェクトした。Ａ．分化したＮｅｕｒｏ２Ａについて、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳの存在／非存在下で、ツバスタチンＡ（５μＭ）をトランスフェクションの１時間後に加え、さらに２４時間インキュベートした。天然Ｎｕｅｒｏ２Ａ（黒色のバー）について、全細胞集団を数えた。分化したＮｅｕｒｏ２Ａ（灰色のバー）について、細胞体の長さの２倍の神経突起を有する細胞を数えた。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝４）として示した。トランスフェクトした分化細胞の代表的な画像（２０倍）（左のパネル）。Ｂ．初代皮質ニューロンを、ポリプレックスに最初に曝し、続いて種々の濃度のＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡ（１６μＭ）を含有するｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に曝した。処理を２４時間後に終了し、細胞を新鮮なｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中でさらに４８時間インキュベートした。トランスフェクション効率をＦＡＣＳによって定量し、平均±ｓ．ｄ（ｎ＝３）として表した。代表的な画像（２０倍）を示した。トランスフェクション効率の有意差を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．００５。 Ｎ／Ｐ比の増加が細胞生存率を低下させたことを可視化するヒストグラムを示す。天然および分化したＡ．Ｎｅｕｒｏ２ＡおよびＢ．ＮＧ−１０８細胞を、種々のＮ／Ｐ比でＬＰＥＩと複合体化したｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ＥＶ７１でトランスフェクトした。ボーラストランスフェクションにおいて、細胞をトランスフェクション混合物に４時間、曝した。細胞生存率を、新鮮な培地中での４８時間のインキュベーション後、ＭＴＳアッセイによって測定した。データ点を対照（Ｎ／Ｐ＝０）および群平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝６）の百分率として表した。対照（Ｎ／Ｐ＝０）に対する細胞生存率の有意差を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．００５。 軽度の遠心分離により改善したトランスフェクション効率を示すヒストグラムを示す。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、インキュベーションの終わりに遠心分離を用いてまたは用いずに、異なる時点にわたってＡ．Ｎ／Ｐ＝２０およびＢ．種々のＮ／Ｐ比を使用してＬＰＥＩ／ｐＤＮＡでトランスフェクトした。ＥＧＦＰ陽性細胞の百分率を、トランスフェクションの４８時間後、ＦＡＣＳによって定量した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４である。 散布図および顕微鏡写真を使用して、ポリプレックスがＤＭＥＭ中で凝集し、沈殿したことを示す。２５分にわたって動的光散乱によって測定した、ＨＥＰＥＳまたはＤＭＥＭ中のポリプレックス（Ｎ／Ｐ＝２０）サイズの成長の動態解析。Ｂ．ＬＰＥＩ／ＦＩＴＣ−ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を調製し、ＨＥＰＥＳまたはＤＭＥＭのいずれかで１５分間インキュベートした。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞の非存在または存在下で、トランスフェクション混合物を遠心分離した。ＤＩＣおよび蛍光の代表的な融合画像を示した。バーは１０μＭを表す。 軽度の遠心分離および短いインキュベーション時間の結果、低い毒性で高いトランスフェクション効率が生じたデータを示す。天然および分化したＡ．Ｎｅｕｒｏ２ＡおよびＢ．ＮＧ−１０８細胞を、遠心分離トランスフェクション手順を使用して種々のＮ／Ｐ比にてＬＰＥＩ／ｐＤＮＡでトランスフェクトした。細胞生存率およびトランスフェクション効率を、細胞生存率アッセイおよびＦＡＣＳのそれぞれを使用してトランスフェクションの４８時間後、測定した。示したトランスフェクション効率および細胞生存率はそれぞれ、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）および平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝６）であった。 ｐＡＡ／尿素溶解緩衝液が効果的にポリプレックスを解離した棒グラフおよびゲル電気泳動の画像を示す。Ａ．異なる溶液（水、ｐＡＡ、尿素溶解緩衝液およびｐＡＡ／尿素溶解緩衝液）中のプラスミド（１０^６コピー）をｑＰＣＲによって定量し、対照（水中にｐＤＮＡ）に正規化した。使用した溶解溶液はｑＰＣＲの増幅効果に影響を与えなかった。異なるＮ／Ｐ比におけるＬＰＥＩ／ｐＤＮＡを、９５℃にて３０分間、ｐＡＡ／尿素溶解緩衝液または水で処理した。続いて、試料をＢ．ゲル遅延アッセイおよびＣ．ｑＰＣＲによって分析した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）であった。 ポリプレックスの細胞結合が神経分化後、影響を与えなかったことを示すヒストグラムを示す。Ａ．Ｎｅｕｒｏ２ＡおよびＢ．ＮＧ−１０８を、遠心分離トランスフェクション手順によりＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）によってトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後の異なる時点で収集し、ｐＡＡ／尿素溶解緩衝液で処理した。細胞にと会合するｐＤＮＡの絶対コピー数を、リアルタイムｑＰＣＲを使用して定量した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３であった。 トリパンブルーが、表面結合ＬＰＥＩ−Ｒｈｏ標識化ＤＮＡ複合体を効果的にクエンチした明視野画像を示す。ＬＰＥＩ／ローダミン−ｐＤＮＡ複合体（Ｎ／Ｐ＝２０）は最初にＮｅｕｒｏ２Ａ細胞上に沈殿した。次に、トランスフェクション混合物を氷冷した完全な培地に置き換え、さらに４℃にて４時間インキュベートした。次いで、トリパンブルーを加えた。細胞画像を０．４％トリパンブルーによるクエンチの前後に得た。内在化は４℃で阻害したので、表面結合蛍光標識ＤＮＡは効果的にクエンチした。バーは２０μｍを表す。 ＤＮＡｓｅが表面結合ポリプレックスを効果的に除去することを示す、棒グラフとして示したデータおよび蛍光画像。Ａ．ＤＭＥＭ中で予め複合体化したＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）は、遠心分離後、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞上に沈殿した。細胞を４℃または３７℃にて４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ中のｐＡＡ／ＤＮａｓｅで処理して、細胞外ｐＤＮＡを除去した。２時間後、細胞をトリプシン処理により収集し、ｑＰＣＲを使用して内在化したｐＤＮＡを定量する前に、ｐＡＡ／尿素溶解緩衝液で処理した。示したデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４であった。Ｂ．ポリプレックスの沈殿後、ウェルをＰＢＳで１回洗浄し、（ｐＡＡ／ＤＮＡｓｅを有するまたは有さないＤＭＥＭ）を補充した。表面結合ポリプレックスを、１×ＰＢＳ中で染色するＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ Ｉによって可視化し、５分間インキュベートした。ＰＢＳでの１時間の洗浄後、画像を１０倍で捕捉した。代表的な画像を示した。 ＰＫＣ阻害剤がトランスフェクションを実質的に減少させたことを示す蛍光画像を示す。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、トランスフェクションの４５分前にＧＯ６９８３（２μＭ）で処理した。トランスフェクション混合物（Ｎ／Ｐ＝２０においてＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ）を、０．５％ＦＢＳおよびＧＯ６９８３（２μＭ）を含有するＤＭＥＭに置き換えた。代表的な画像（トランスフェクションの２４時間後に獲得した）を示した。 ＰＫＣが、天然であるが、分化していない神経細胞のポリプレックスの取り込みに関与することを示す、データを可視化し、ここでヒストグラムおよび蛍光画像として示す。Ａ．天然および分化した（１０μＭ ＦＳＫ）ＮＧ−１０８を、トランスフェクションの４５分前に、ロットレリン、フィリピンＩＩＩまたはダイナソールで処理した。ＤＭＳＯ／０．５％ＦＢＳを処理についての対照として使用した。トランスフェクション後（Ｎ／Ｐ＝２０においてＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ）、細胞を４℃または３７℃にて４時間インキュベートした。細胞外ｐＤＮＡをｐＡＡ／ＤＮＡｓｅによって除去し、細胞をトリプシン処理した。次いで、試料をｐＡＡ／尿素溶解緩衝液で処理し、ｐＤＮＡの絶対コピー数をｑＰＣＲによって定量した。同様の実験において、天然ＮＧ−１０８細胞をトランスフェクションの２４時間後に３７℃にてインキュベートした。Ｂ．代表的な画像を示し、Ｃ．ＥＧＦＰを発現する細胞の百分率を手動の細胞カウントによって獲得した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４であった。 ＦＩＴＣ−ｐＤＮＡの蛍光が、天然の神経細胞ではない、分化した細胞においてクエンチしたことを示す顕微鏡画像を示す。Ａ．天然および分化した（１０μＭ ＦＳＫ）ＮＧ−１０８細胞を、ＬＰＥＩ／ＦＩＴＣ−ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）によってトランスフェクトした。クエンチング試薬、ＥｔＢｒ（２０μｇ／ｍｌ）をトランスフェクションの４時間後に加えた。細胞画像をＥｔＢｒによるクエンチの前後に得た。バーは５μｍを表す。Ｂ．細胞を、予め複合体化したＬＰＥＩ／ＦＩＴＣ−またはローダミン−ｐＤＮＡによってトランスフェクトした。標識ｐＤＮＡに会合する細胞の百分率を、トランスフェクションの４または２４時間後、ＥｔＢｒまたはトリパンブルーによる細胞外蛍光のクエンチ後に獲得した。天然および分化したＮＧ−１０８細胞のＦＩＴＣ／Ｒｈｏの比を計算した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝２０であった。 ＦＩＴＣ−ｐＤＮＡの蛍光が初代皮質ニューロンにおいてクエンチされることを示すデータを示す。Ａ．初代皮質ニューロンを、ＬＰＥＩ／ＦＩＴＣ−ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）によってトランスフェクトした。クエンチング試薬、ＥｔＢｒ（２０μｇ／ｍｌ）をトランスフェクションの４時間後に加えた。細胞画像をＥｔＢｒによるクエンチの前後に得た。バーは５μｍを表す。Ｂ．細胞を、予め複合体化したＬＰＥＩ／ＦＩＴＣ−またはローダミン−ｐＤＮＡによりトランスフェクトした。標識ｐＤＮＡに会合した細胞の百分率を、トランスフェクションの４時間または２４時間後にＥｔＢｒまたはトリパンブルーによる細胞外蛍光のクエンチ後に獲得した。初代皮質ニューロンにおけるＦＩＴＣ／Ｒｈｏの比を計算した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝２０であった。 ポリプレックスが天然および分化した神経細胞において異なって局在化していることを示すヒストグラムを示す。ＬＰＥＩ／ローダミン−ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を使用して、遠心分離トランスフェクション手順により天然または分化した（１０μＭ ＦＳＫ）ＮＧ−１０８細胞をトランスフェクトした。４時間後、培養培地を除去し、５０ｎＭ ＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒグリーンＤＮＤ−２６を含有する１×ＰＢＳを補充し、共焦点顕微鏡法によって観察する前に５分間インキュベーションを継続した。単一細胞の画像を１００倍で捕捉した。ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒグリーンＤＮＤ−２６によりローダミンの共局在化したピクセルを分析した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝２０であった。 神経細胞分化後に増加した酸性コンパートメントの量を可視化するヒストグラムを示す。天然および分化した（１０μＭ ＲＡ）Ｎｅｕｒｏ２Ａを、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒグリーンを含有するＰＢＳ中でインキュベートした。標識した酸性コンパートメントの全ピクセルを、Ｚスタック画像（全細胞）のピクセルを合計することによって得た。全ピクセル／細胞の有意差を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。示したデータは、各表現型について平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝２０であった。^＊＊、Ｐ＜０．００５。 ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳの添加後に発生する、標識ｐＤＮＡのエンドソーム放出を示す、顕微鏡画像を示す。分化したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞をＬＥＰＩ／ローダミン−ｐＤＮＡ複合体（Ｎ／Ｐ＝２０）でトランスフェクトし、さらに４時間インキュベートした。次いで、ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒグリーンおよびＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳを加え、画像を２０分間連続して得た。リアルタイムトラッキングにより、酸性コンパートメントからのポリプレックス（アスタリスクで示した）の放出を実証した。測定バーは５μｍを表す。 ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳの効果が時間依存性であることを示す、ヒストグラムを示す。ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を使用して、分化した（１０μＭ ＲＡ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をトランスフェクトした。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳをトランスフェクション後の異なる時点において加えた。トランスフェクション効率は、インキュベーションの２４時間後、ＥＧＦＰ＋細胞についての蛍光および明視野画像を数えることによって獲得した。細胞体の長さの２倍の神経突起を有するＥＧＦＰ陽性細胞の百分率を平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝４）として示した。トランスフェクション効率の有意差を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。^＊＊、ｐ＜０．００５。 棒グラフを示し、そのデータは市販の試薬がトランスフェクションの累積増加を示さなかったことを示す。予め複合体化したＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を使用して、分化した（１０μＭ ＲＡ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をトランスフェクトした。クロロキン（２５μＭまたは１００μＭ）、ＰＬＵＳ試薬（１０μＬまたは２０μＬ）またはＩＮＦ７融合ペプチド（１０μｇまたは２０μｇ）をトランスフェクション後に加えた。トランスフェクション効率および細胞生存率は、インキュベーションの４８時間後、ＥＧＦＰ＋細胞についての蛍光および明視野画像を数えることによって獲得した。細胞体の長さの２倍の神経突起を有するＥＧＦＰ陽性細胞の百分率を、平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）として示した。対照（ポリプレックスのみ）に対する細胞生存率の有意差（細胞の％／画像）を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．００５。 ＬＰＥＩ／融合試薬−ｐＤＮＡ複合体はトランスフェクションの有意な改善を生じなかったことを示す、棒グラフを示す。プラスミドＤＮＡ（２μｇ）を、ＬＰＥＩ（Ｎ／Ｐ＝２０）との複合体化の１５分前に、ＰＬＵＳ試薬（１０μＬまたは２０μＬ）またはＩＮＦ７融合ペプチド（１０μｇまたは２０μｇ）とインキュベートした。次いでポリプレックスを使用して、分化した（１０μＭ ＲＡ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション効率および細胞生存率は、インキュベーションの４８時間後、ＥＧＦＰ＋細胞について蛍光および明視野画像を数えることによって獲得した。細胞体の長さの２倍である神経突起を有するＥＧＦＰ陽性細胞の百分率を、平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）として示した。対照に対する細胞生存率の有意差を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。^＊＊、ｐ＜０．００５。 ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡとのインキュベーションの最小時間が高トランスフェクション効率に必要とされることを棒グラフとしてを示す。ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を使用して、分化したＮｅｕｒｏ２Ａ（２０μＭ ＲＡによって刺激した）をトランスフェクトした。細胞を、６、８または１２時間、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡ（５、１０または２０μＭ）で処理した。化学物質を完全培地で置き換えることによって除去し、さらに細胞を４８時間インキュベートした。トランスフェクション効率はＥＧＦＰ＋細胞についての蛍光および明視野画像を数えることによって獲得した。データを群平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）として示した。トランスフェクション効率の有意差を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。^＊、ｐ＜０．０５。 ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡの向上したトランスフェクション効率が、全てではないがいくつかのカチオン性担体によって媒介されたデータを示すヒストグラムを示す。ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）、ＰＡＭＡＭ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝１０）、ＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅ ＨＰ／ｐＤＮＡ（３μＬ：１μｇのｐＤＮＡ）およびＦｕｇｅｎｅ ＨＤ（１．５μＬ：１μｇのｐＤＮＡ）を使用して、未分化および分化したＮｅｕｒｏ２Ａ（１０μＭ ＲＡ）をトランスフェクトした。細胞をＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ、ツバスタチンＡ（１０μＭ）またはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡ（１０μＭ）で１２時間処理した。対照はＤＮＡ複合体のみに曝した細胞を示す。化学物質を完全培地と置き換えることによって除去し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。トランスフェクション効率は、ＥＧＦＰ＋細胞についての蛍光および明視野画像を数えることによって獲得した。データを群平均±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）として示した。トランスフェクション効率の有意差を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。^＊、ｐ＜０．０５。 トリクロスタチンＡがトランスフェクションを向上させたデータを示すグラフを示す。ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を分化した（１０μＭ ＲＡ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクションのために使用した。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳの存在下で、トリクロスタチンＡ（５０および１００ｎＭ）をトランスフェクションの１時間後に加えた。トランスフェクション効率は、インキュベーションの２４時間後、ＥＧＦＰ＋細胞についての蛍光および明視野画像を数えることによって２４時間後に獲得した。細胞体の長さの２倍の神経突起を有するＥＧＦＰ陽性細胞の百分率を平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）として示した。 ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡが、初代皮質ニューロンにおいて高いトランスフェクション効率および低い毒性を導くことを示すデータを表すヒストグラムを示す。ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を使用して、遠心分離トランスフェクション手順によって初代皮質ニューロンをトランスフェクトした。細胞を、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡ（１６μＭ）を含有するｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で２４時間インキュベートした。化学物質を新鮮なｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地と置き換えることによって除去し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。Ａ．細胞生存率は、明視野画像当たりの細胞の総数を数え、対照（ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡを有さない）によって正規化することによって得た。データを群平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）として示す。Ｂ．ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳの存在下で、ツバスタチンＡ（１６μＭ）を、トランスフェクションの直後、１、２および３時間後、初代皮質ニューロン培養物に加えた。トランスフェクション効率を、４８時間後、ＦＡＣＳ分析によって定量し、平均±ｓ．ｄ（ｎ＝３）として示した。トランスフェクション効率の有意差を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．００５。 ＨＤＡＣ６阻害およびパクリタキセルによる処理の結果、チューブリンアセチル化を生じた顕微鏡写真を示す。分化したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞（１０μＭ ＲＡで前処理した）を、ツバスタチンＡ（１０μＭ）、ＴＳＡ（５０ｎＭ）、パクリタキセル（２５ｎＭ）、ＳＡＨＡ（５μＭ）、エンチノスタット（１０μＭ）またはタセジナリン（５０μＭ）などのＨＤＡＣ阻害物質に２時間、曝した。次いで、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、アセチル化α−チューブリンおよびβ−チューブリンについて共染色した。個々および融合したチャネルの共焦点画像を示す。バーは２０μｍを表す。さらに、表は、試薬およびそれらのそれぞれの標的、ならびに実験が行われた濃度を示す。 ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＨＤＡＣ６標的阻害物質による処理が前例のないトランスフェクション効率を生じたことを示すデータを示す。ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を使用して、遠心分離トランスフェクション手順によって、分化した神経細胞（１０μＭ ＲＡ）をトランスフェクトした。次いで、細胞をＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡ（１０μＭ）、ＴＳＡ（５０ｎＭ）、パクリタキセル（２５ｎＭ）、ＳＡＨＡ（５μＭ）、エンチオスタット（１０μＭ）またはタセジナリン（５０μＭ）に１２時間曝した。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳに曝した細胞を対照として与えた。トランスフェクション効率を、４８時間後、ＦＡＣＳ分析によって定量し、平均±ｓ．ｄ（ｎ＝３）として示した。トランスフェクション効率の有意差を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．００５。 チューブリンアセチル化に対するツバスタチンＡの一過性効果である顕微鏡写真を示す。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞をツバスタチンＡ（１０μＭ）で１２時間処理した。次いで、化学物質を完全培地と置き換えることによって除去し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。種々の時点で、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、アセチル化α−チューブリン（緑）および核（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、青）を染色した。代表的な画像を示した。バーは２０μｍを表す。 神経突起伸長が、ＬＰＥＩ媒介性トランスフェクションによって影響を受けなかったことを示すデータを示す。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡ（１０μＭ）の存在または非存在下でＬＰＥＩ−ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）によってトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後、細胞培養培地を除去し、１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭと置き換えた。６時間後、神経細胞分化を、１０μＭ ＲＡ／１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭによって刺激した。インキュベーションの４８時間後、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、核（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、青）を染色し、インペリアルプロテイン染色した（ｉｍｐｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｉｎ）。Ａ．代表的な画像の顕微鏡写真を示す。バーは５０μｍを表す。Ｂ．ＨＣＡ画像によって測定した平均神経突起の長さを示すヒストグラムを示し、ピクセル±ｓ．ｅ．ｍの平均として示す（ｎ＝８０〜１００、生物学的に４連）。 ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡのウォッシュアウト後の代謝全体の回復を示す、種々の線グラフを示す。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡ（１０μＭ）の存在または非存在下でＬＰＥＩ−ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）によってトランスフェクトした。陰性対照は実験全体にわたって処理していない細胞を示す。トランスフェクションの１２時間後、化学物質を新鮮な完全培地と置き換えることによって除去した。次いで細胞を４、２４および４８時間後に採取し、Ａ．ＴＣＡサイクル、Ｂ．解糖、Ｃ．グリコーゲン代謝、Ｄ．ヌクレオチド代謝、Ｅ．リン脂質合成およびＦ．トリプトファン代謝を含む種々の経路についてＬＣ／ＭＳ分析に供した。各時点において、定量的な３連の（ｑｕａｎｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）陰性対照（Ｃ）、ポリプレックスに曝した細胞（Ｐ）ならびにポリプレックス、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡの両方に曝した細胞（Ｔ）を採取した。陰性対照に対する相対倍変化を、ＡＴＰ読み取りに対する各代謝産物の正規化後に得て、平均±ｓ．ｄ．（ｎ＝４）として示した。相対倍変化の有意差を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。^＊、ｐ＜０．０５。 ポリプレックス沈殿に関連するデータを可視化するヒストグラムを示す。ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（種々のＮ／Ｐ比）を、ＤＭＥＭ中で１５分または４時間、インキュベートした。インキュベーションの終わりに、いくつかの試料を遠心分離し、全て後でｐＡＡ／尿素溶解緩衝液で処理した。上清中のｐＤＮＡの量をｑＰＣＲによって測定した（Ｎ／Ｐ＝０である場合、対照に正規化した）。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３であった。 トランスフェクションに対する凝集したポリプレックスの貢献を試験する際に使用した実験設計の概略図を示す。ＤＭＥＭ（０．２２μｍを通して濾過したまたは濾過していない）中で予め複合体化したＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）をＮｅｕｒｏ２ａ細胞の存在または非存在下で遠心分離した。トランスフェクション混合物を完全培地と置き換え、４８時間インキュベートした。トランスフェクション効率をフローサイトメトリーによって定量した。 凝集したポリプレックス媒介性トランスフェクション効率を示す棒グラフを示す。Ａ．Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、ボーラスまたは沈殿物媒介性トランスフェクション手順によってＤＭＥＭ（濾過したまたは濾過していない）中で予め複合体化したＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）でトランスフェクトした。トランスフェクション効率をＦＡＣＳによって４８時間後、定量した。示したデータは平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３である。Ｂ．Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、沈殿物媒介性トランスフェクション手順によってＮ／Ｐ＝０、１０、２０において種々の量のｐＤＮＡと複合体化したＬＰＥＩによってトランスフェクトした。トランスフェクション効率をＦＡＣＳによってインキュベーションの４８時間後に定量した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３であった。 凝集したポリプレックスが０．２２μＭフィルタによって除去されたことを示すデータを示す。ＨＥＰＥＳにおいて予め複合体化したＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を濾過した。その後、濃縮したＤＭＥＭ（１８倍）を１×ＤＭＥＭの最終濃度で濾液に加え、１５分間インキュベートした。次いで混合物（濾過したまたは濾過していない）を加えて、Ｎｕｅｒｏ２Ａ細胞を播種し、遠心分離した。細胞は濾液（挿入物）を使用してトランスフェクトされなかった。トランスフェクション効率をＦＡＣＳによって４８時間後、定量した。示したデータは平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝４であった。さらに、行った実験設計の概略図を示す。 ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡが広範囲にＤＭＥＭを凝集したことを示すデータをヒストグラムの形態で示す。２５ｍＭ ＨＥＰＥＳまたはＤＭＥＭ中のＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を１５分間インキュベートした。濾過（ＨＥＰＥＳ＋１８×ＤＭＥＭ）の第２の工程をしたまたはしていない１８×ＤＭＥＭに加えたＨＥＰＥＳ中の濾過（ＨＥＰＥＳまたはＤＭＥＭ）したまたは濾過していないｐＤＮＡの絶対コピー数を、ｐＡＡ／尿素溶解緩衝液による処理後、ｑＰＣＲによって定量した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３であった。 ヒストグラムを示し、そのデータは、ｐＤＮＡが表面結合凝集体から効果的に放出されなかったことを示す。Ｎｅｕｒｏ２Ａの存在または非存在下で、ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）のトランスフェクション混合物を遠心分離し、完全培地を補充した。種々の時点にて、細胞をトリプシン処理によって収集し、上清を回収した。次いで試料をｐＡＡ／尿素溶解緩衝液で処理した。ｐＤＮＡの絶対コピー数をｑＰＣＲによって定量し、対照、Ｎ／Ｐ＝０によって正規化した。示したデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３であった。 ポリマーベースのトランスフェクションを向上させる際のＴｒａｆＥｎ（商標）の効果を実証する。これは、異なる細胞および細胞種類、例えばヒト神経膠腫／乳癌細胞株、ヒト間充織幹細胞（ｈＭＳＣ）、マウスＡｂｅｌｓｏｎ白血病ウイルスにより誘導された腫瘍細胞（ＲＡＷ２６４．７）、ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ３）、ヒト黒色腫細胞（Ｍ１４）およびマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）で試験した。細胞をＰＥＩＭＡＸ／２μｇ ＰＭＡＸＧＦＰ（ＬＯＮＺＡ）でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をＴｒａＥｎ（商標）試薬の存在または非存在下で培養培地中でインキュベートした。４８時間後、ＧＦＰ＋細胞を、ＦＡＣＳ分析またはＩｍａｇｅ Ｊを使用した半自動化細胞カウントによって分析した。ヒストグラムはＧＦＰ＋細胞の百分率を示し、エラーバーは、生物学的に３連または技術的に２連のＳ．Ｅ．Ｍを表す。代表的な画像を示す（青、核；緑、ＧＦＰ）。 ポリマーベースのトランスフェクションの向上におけるＴｒａｆＥｎ（商標）の効果を示す。ＭＥＦおよびＭ１４細胞を、種々のトランスフェクション試薬と複合体化したＥＶ７１−ｐＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトした。２つのプロトコル−ＭＩおよびＩＰを使用してトランスフェクションを行った。ＭＩは製造業者の指示書を指す。ＩＰはインハウスプロトコルを指し、それは明細書、例えば図３９に記載されている沈殿物媒介性トランスフェクションである。ＩＰ＋ＴｒａｆＥｎ（商標）は、トランスフェクション後の培養培地中のＴｒａｆＥｎ（商標）試薬の添加を指す。ここでヒストグラムは、各々、異なるトランスフェクション試薬を使用した各手順についてのＧＦＰ＋細胞の百分率（％）を表す。 ＰＴＢ１の効果的なノックダウンを示すヒストグラムを示す。ＨｅＬａ細胞を、スクランブル３００１２（対照）、およびＰＴＢ ｓｈＲＮＡ、すなわちＴＲ３０２２１８Ａ ８８６５（１）、ＴＲ３０２２１８Ｂ ８８６６（２）、ＴＲ３０２２１８Ｃ ８８６７（３）、またはＴＲ３０２２１８Ｄ ８８６８（４）でトランスフェクトした。ｓｈＲＮＡは、ＴｒａｆＥｎ（商標）（ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ＋１０μＭツバスタチンＡ）の存在または非存在下でＰＥＩＭＡＸ（Ｎ／Ｐ＝１０）によって送達された。処理の３日後、細胞をｑＰＣＲ分析のために収集した。グラフは、ＧＡＰＤＨに対する正規化後の対照に対するＰＴＢ１の倍変化を示す。 迅速な分化転換を生じる、ＰＴＢの効果的なノックダウンを示す顕微鏡写真を示す。ＨｅＬａ細胞を、スクランブル３００１２（対照）、ＰＭＡＸＧＦＰ（対照）およびＴＲ３０２２１８Ｃ ８８６７でトランスフェクトした。ｓｈＲＮＡは、ＴｒａｆＥｎ（商標）（ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ＋１０μＭツバスタチンＡ）の存在または非存在下でＰＥＩＭＡＸ（Ｎ／Ｐ＝１０）によって送達された。トランスフェクション後、細胞をピューロマイシンで処理し、Ｎ３培地（神経細胞用の培地）中で培養した。画像を最大で８日目に捕捉した。次いで、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｔｕｊ抗体で染色した。 低／高発現を示す細胞の百分率（％）およびＧＦＰ＋細胞の全％を表すグラフを示す。さらに、各条件についてのＦＡＣＳ分析およびトランスフェクト細胞の代表的な画像を示す。エラーバーはｎ＝３の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ＋ＳＡＨＡで処理した細胞と、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳまたはＳＡＨＡで処理した細胞との間のトランスフェクション効率の統計的有意性を、両側スチューデントｔ検定を使用して得た；^＊、ｐ＜０．０１。トランスフェクションの向上におけるＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＳＡＨＡまたはツバスタチンＡの組み合わせ効果。Ｕ２５１ＭＧ細胞を、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよび／またはＨＤＡＣｉ（１０μＭツバスタチンＡ、５μＭ ＳＡＨＡ）の存在または非存在下でＮ／Ｐ＝１０において１．５μｇのＰＭＡＸＧＦＰと複合体化したＰＥＩＭＡＸでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培養培地をＳＡＨＡ／ツバスタチンＡを有するまたは有さない新鮮な培地と置き換え、さらに４８時間インキュベートした。次に、細胞を収集し、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析によって分析した。 ｐ５３およびトランスフェクションエンハンサーの相乗効果を示す蛍光顕微鏡写真およびヒストグラムを示す。細胞を１．５μｇのＰＭＡＸＧＦＰまたはｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｐ５３（ｐ５３）でトランスフェクトした。トランスフェクションエンハンサー（ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ［Ｄ］および５μＭ ＳＡＨＡ）を、トランスフェクション後、培養培地に加えた。トランスフェクションの２４時間後、培養培地をＳＡＨＡを有するまたは有さない新鮮な培地と置き換え、さらに４８時間インキュベートした。次いで、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。蛍光画像を捕捉し、核の数をＩｍａｇｅ Ｊで数えた。生存細胞の百分率は陰性対照（−ｖｅ）に対する細胞の％を表す。下のパネルは各条件からの代表的な画像を表す。エラーバーはｎ＝３の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）を表す。独立スチューデントｔ検定を、Ｐ５３、ＤおよびＳＡＨＡで処理した細胞と、いずれか１つの試薬で処理した細胞との間の統計的有意性を調べるために実施した。^＊＊、ｐ＜０．００１。 ＳＡＨＡとのＵ２５１ＭＧ細胞の長時間のインキュベーション後の生存細胞の百分率（％）およびこれらの細胞の蛍光画像を示すグラフを示し、これは細胞死を増加させなかったことを示す。細胞をｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｐ５３（ｐ５３）でトランスフェクトした。トランスフェクションエンハンサー（ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよび５μＭ ＳＡＨＡ）をトランスフェクション後の培養培地に加えた。細胞をさらに４８、７２および９６時間、ＳＡＨＡで処理した。次に、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。蛍光画像を捕捉し、核の数をＩｍａｇｅ Ｊで数えた。生存細胞の百分率は、ｐ５３のみでトランスフェクトした細胞に対する細胞の％を表す。下のパネルは各条件からの代表的な画像を含む。独立スチューデントｔ検定を実施して、４８時間および７２時間または９６時間、ＳＡＨＡで処理した細胞の間の統計的有意性を調べた。^＊＊、ｐ＜０．００１。 ツバスタチンＡではなくＳＡＨＡとｐ５３の相乗的細胞毒性効果を示す、グラフおよび付随する蛍光画像を示す。細胞を、ＰＭＡＸＧＦＰまたはｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｐ５３（ｐ５３）でトランスフェクトした。トランスフェクションエンハンサー（ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ［Ｄ］、１０μＭツバスタチンＡ［Ｔ］および５μＭ ＳＡＨＡ）を、トランスフェクション後、個々にまたは組み合わせて培養培地に加えた。培養培地を、ツバスタチンＡまたはＳＡＨＡを有するまたは有さない新鮮な培地を置き換え、さらに４８時間インキュベートした。次いで、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。蛍光画像を捕捉し、核の数をＩｍａｇｅ Ｊで数えた。生存細胞の百分率はＰＭＡＸＧＦＰでトランスフェクトした細胞に対する細胞の％を表す。下のパネルは各条件からの代表的な画像からなる。エラーバーはｎ＝３の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。独立スチューデントｔ検定を実施して、２つの処理条件の間の統計的有意性を調べた。^＊＊、ｐ＜０．００１。 ＴＭＺＲ−Ｕ２５１ＭＧおよびＧＳＣの両方における有意な細胞死を誘導する際のＳＡＨＡとｐ５３の相乗効果を示す蛍光顕微鏡写真およびヒストグラムを示す。（Ａ）ＴＭＺＲ−Ｕ２５１ＭＧおよび（Ｂ）ＧＳＣ細胞を、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ［Ｄ］およびＳＡＨＡの存在下で個々にまたは組み合わせてＰＭＡＸＧＦＰおよびｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｐ５３（ｐ５３）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２２時間後、細胞培地を、ＴＭＺＲ−Ｕ２５１ＭＧについてＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ／４０μＭ ＴＭＺおよびＧＳＣについてＳＡＨＡを有するまたは有さないＤＭＥＭ／血清補充と置き換えた。細胞をさらに４８時間インキュベートした。細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。画像をＩｍａｇｅ Ｊによって分析した。代表的な画像を示す。グラフは、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳのみ（陰性対照＋Ｄ）に曝した対照細胞に対する細胞の％の平均を示す。エラーバーはｎ＝３の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。独立スチューデントｔ検定を実施して、対照とｐ５３トランスフェクト細胞との間の統計的有意性を調べた。^＊＊、ｐ＜０．００１。 トランスフェクションの向上に対するＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）の効果を可視化する蛍光顕微鏡写真およびヒストグラムを示す。ヒト胎児ＭＳＣ細胞を、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよび／またはＨＤＡＣｉ（１００ｎＭ トリコスタチンＡ）の非存在または存在下でＮ／Ｐ＝１０において１．５μｇのＰＭＡＸＧＦＰと複合体化したＰＥＩＭＡＸでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培養培地を、トリコスタチンＡを有するまたは有さない新鮮な培地と置き換え、さらに４８時間インキュベートした。次に細胞を収集し、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析によって分析した。グラフはＧＦＰ＋細胞の％を表す。エラーバーはｎ＝３の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）を表す。ポリプレックスのみに曝された細胞と他の条件との間のトランスフェクション効率の統計的有意性が両側スチューデントｔ検定を使用して得られた；^＊、ｐ＜０．０１。各条件のトランスフェクト細胞の代表的な画像を示す。 種々の処理条件下のヒトＭＳＣにおけるＢＭＰ２の発現レベルを示すヒストグラムを示す。ヒト胎児ＭＳＣ細胞を、Ｎ／Ｐ＝１０（ＢＭＰ２）にてＰＥＩＭＡＸ複合体化ＰＭＡＸＧＦＰ（対照）またはＰＭＡＸＧＦＰ−ＢＭＰ２（ＰＭＡＸＧＰＦベクター内でクローニングしたヒトＢＭＰ２）でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ、５μＭツバスタチンＡおよび１５０ｎＭ ＴＳＡを組み合わせてまたは個々に用いてまたは用いずに処理した。トランスフェクションの２４時間後、培養培地をＨＤＡＣｉを含有する新鮮な培地と置き換えた。インキュベーションの４８時間後、細胞をトリプシン処理し、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収し、ＤＮＡ汚染を回避した。１マイクログラム（μｇ）の全ＲＮＡを逆転写し、ＢＭＰ２の発現を、ｑＰＣＲを使用して測定した。ＢＭＰ２の閾値サイクル（Ｃ_ｔｓ）をハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに正規化した。ＰＥＩＭＡＸ／ＰＭＡＸＧＦＰでトランスフェクトした細胞を陰性対照（対照）として与える。グラフは陰性対照に対するＢＭＰ２発現の倍変化を示す。エラーバーは平均のＳ．Ｅ．Ｍを表す（ｎ＝３）。独立スチューデントｔ検定を使用して、処理条件の間の統計的有意性を検査した。^＊、ｐ＜０．０１。 インキュベーションの２１日までのヒトＭＳＣのＧＦＰ発現の明視野および蛍光画像を示す。ヒト胎児ＭＳＣ細胞を、Ｎ／Ｐ＝１０にてＰＥＩＭＡＸ／ＰＭＡＸＧＦＰ複合体でトランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよび１５０ｎＭ ＴＳＡを有するまたは有さない新鮮な培地と置き換えた。トランスフェクションの３日後、培地を新鮮な培養培地と置き換えた。明視野および蛍光画像をトランスフェクションの２、７、１４および２１日後に得た。代表的な画像を示す。 トランスフェクション後、３から２１日までのＭＳＣ細胞の明視野画像を示す。ＭＳＣ細胞を、ＰＭＡＸＧＦＰまたはＰＭＡＸＧＦＰ−ＢＭＰ２のＰＥＩＭＡＸ媒介性送達でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよび１５０ｎＭ ＴＳＡで個々にまたは組み合わせて処理した。トランスフェクションの７２時間後、培養培地を、（Ａ）増殖培地アルファ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳまたは（Ｂ）骨形成分化培地（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ β−グリセロホスフェート、１０ｎＭ デキサメタゾン、および０．２ｍＭアスコルビン酸を補足したアルファ−ＭＥＭ）と置き換えた。次いで細胞をさらにインキュベートし、それぞれの培地を３日毎に置き換えた。 トランスフェクションの向上におけるＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＳＡＨＡまたはツバスタチンＡの組み合わせ効果を可視化する顕微鏡写真画像（明視野および蛍光）および棒グラフおよびＦＡＣＳ分析グラフを示す。ＰＣ３細胞を、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ［Ｄ］および／またはＨＤＡＣｉ（２０μＭツバスタチンＡ［Ｔ］、５μＭ ＳＡＨＡ）の非存在または存在下でＮ／Ｐ＝２０にて１．５μｇのＰＭＡＸＧＦＰと複合体化したＰＥＩＭＡＸでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培養培地をＳＡＨＡ／ツバスタチンＡを有するまたは有さない新鮮な培地と置き換え、さらに４８時間インキュベートした。次に、細胞を収集し、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析によって分析した。棒グラフはＧＦＰの低／高発現およびＧＦＰ＋細胞の全％を示すとみなされる細胞の百分率（％）を示す。各条件のＦＡＣＳ分析およびトランスフェクト細胞の代表的な画像を示す。エラーバーはｎ＝３の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。 種々の処理条件下のＰＣ３細胞内のＧＭ−ＣＳＦの発現レベルを示すヒストグラムを示す。ヒトＰＣ３細胞を、Ｎ／Ｐ＝２０においてＰＥＩＭＡＸ複合体化ＰＭＡＸＧＦＰ（対照）またはＰＭＡＸＧＦＰ−ＧＭ−ＣＳＦ（ＰＭＡＸＧＰＦベクター内でクローニングしたヒトＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ）でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ［Ｄ］および５μＭ ＳＡＨＡを用いてまたは用いずに個々にまたは組み合わせて［ＴｒａｆＥｎ（商標）］処理した。トランスフェクションの２４時間後、培養培地を、ＨＤＡＣｉを含有する新鮮な培地と置き換えた。インキュベーションの４８時間後、細胞をトリプシン処理し、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して個々に回収してＤＮＡ汚染を回避した。１マイクログラム（μｇ）の全ＲＮＡを逆転写し、ＧＭ−ＣＳＦの発現をｑＰＣＲを使用して測定した。ＧＭ−ＣＳＦの閾値サイクル（Ｃ_ｔｓ）をハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに正規化した。トランスフェクトしていない細胞を対照（Ｃｔｒｌ）として与える。 ＳＡＨＡがＰＣ３細胞におけるＭＩＣＡおよびＮＫＧ２Ｄの上方制御を誘導したことを視覚化するヒストグラムを示す。ヒトＰＣ３（前立腺癌）細胞を５μＭ ＳＡＨＡで８、２０および４８時間処理した。インキュベーションの終わりに、細胞を収集し、ＰＣＲ分析に供した。ＳＡＨＡ（陰性８時間）に曝していない細胞を対照として与える。ここでヒストグラムは、ＧＡＰＤＨによる正規化後の対照に対する倍変化を表した。 ＨａＦのトランスフェクションについての高いＮ／Ｐ比を示す。細胞を、沈殿物媒介性トランスフェクションプロトコルを使用して種々のＮ／Ｐ比にてＰＥＩＭＡＸ／２μｇ ＰＭＡＸＧＦＰによりトランスフェクトした。４８時間後、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーにより分析した。ＧＦＰを発現した細胞の百分率を示し、エラーはｎ＝３についてのＳ．Ｄ．を表す。 高トランスフェクションが、ＨａＦの効果的な再プログラミングを生じたことを示すデータを示す。（Ａ）線維芽細胞を、ＰＥＩＭＡＸ（Ｎ／Ｐ＝５０）、２μｇ ＰＭＡＸＧＦＰと複合体化したリポフェクタミンまたはサティスフェクションでトランスフェクトした。インキュベーションの４８時間後、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリー分析によって分析した。グラフはＧＦＰ＋細胞（ｎ＝３）の平均％を示す。ＧＦＰ＋細胞の蛍光画像を示す。（Ｂ、Ｃ）線維芽細胞を、Ｎ／Ｐ＝５０にて２μｇ ＰＭＡＸＧＦＰまたは多シストロン性ＯＳＫＭ（Ａｄｄｇｅｎｅ：２０３２８）と複合体化したＰＥＩＭＡＸでトランスフェクトした。次に、トランスフェクション混合物を、ＴｒａｆＥｎ（商標）（ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ＋１０μＭ ツバスタチンＡ）を有するまたは有さない培養培地と置き換えた。２日後、培地を新鮮な培養培地（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）と置き換えた。２４時間のインキュベーション後、全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙキットを用いて単離し、ｑＰＣＲ分析に供した。グラフは、ＧＡＰＤＨに対する正規化後、対照（ＰＭＡＸＧＦＰでトランスフェクトした細胞）に対するＯＳＫＭの発現を表す。実験の第２のセットについて、細胞をさらに７日間インキュベートした。実験の終わりに、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｏｃｔ４抗体で染色した。 ＶＰＡがＨａＦにおいてＫＬＦ４およびｃ−Ｍｙｃの上方制御を誘導したことを示すヒストグラムを示す。線維芽細胞を３日間まで１ｍＭ ＶＰＡで処理した。インキュベーションの終わりに、細胞を収集し、ＰＣＲ分析に供した。ＶＰＡ（３日）に曝していない細胞を対照として与える。グラフは、ＧＡＰＤＨでの正規化後、対照に対する倍変化を示す。

本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、限定されないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、非天然または合成核酸、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはそれらの組み合わせを含む、１つ以上のヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはそれらの断片を含む分子を指定する。核酸は、一本鎖、または部分的もしくは完全に二本鎖（デュプレックス）であってもよい。デュプレックス核酸は、ホモデュプレックスであっても、ヘテロデュプレックスであってもよい。「リボ核酸」（ＲＮＡ）という用語は、遺伝子の調節、コーディング、デコーディングおよび発現において重要な役割を果たす生体分子を指す。各リボ核酸は、ヌクレオチド、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）およびリボース糖のいずれかからなる。リボ核酸配列は、糖−リン酸骨格を生じる、これらの核酸の鎖からなる。同時に、「デオキシリボ核酸」という用語に関して、（ＤＮＡ）は、完全なヌクレオチドを形成するために糖／リン酸に結合したアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはチミジン（Ｔ）のいずれかからなる生体分子を指す。

本明細書で使用する場合、「単離した」という用語は、ヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、プライマー、またはオリゴヌクレオチドまたは他の配列が、他の核酸または他の不純物から実質的または本質的に遊離していることを意味する。

本明細書で使用する場合、「単位複製配列」、「増幅された産物」または「増幅産物」とは、増幅反応の産物を指す。単位複製配列の例は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ギャップＬＣＲ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写により媒介される増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などの結果として産生されるヌクレオチド配列である。

「プライマー」という用語は、本明細書において、例えば、ＰＣＲまたはＲＣＡ技術においてプライマーとして使用され得る任意の一本鎖オリゴヌクレオチド配列を意味するように使用される。したがって、本開示に係る「プライマー」とは、（フォワードプライマーについて）コピーされる核酸鎖と実質的に同一であるか、または（リバースプライマーについて）コピーされる核酸鎖の実質的に逆相補体であるプライマー伸長産物の合成のための開始点として作用できる一本鎖オリゴヌクレオチド配列を指す。プライマーは、例えば、ＰＣＲ技術における使用に好適であり得る。一本鎖は、例えば、一本鎖ヌクレオチド配列によって形成されるヘアピン構造を含む。プライマー、例えばその長さおよび特定の配列の設計は、標的ヌクレオチド配列の性質およびプライマーが使用される条件、例えば温度およびイオン強度に依存する。

プライマーは、本明細書に記載されるヌクレオチド配列からなってもよいか、または本明細書に記載される配列を含むかもしくはその範囲内である１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００もしくはそれ以上のヌクレオチドからなってもよい。但し、それらは、ストリンジェントな条件下で標的核酸配列を特異的に結合するのに適している。一実施形態において、プライマー配列は３５ヌクレオチド長未満であり、例えばプライマー配列は、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０ヌクレオチド長未満である。プライマーまたはプローブの長さまたは配列のわずかな修飾が、所与の状況下で必要とされる特異性および感受性を維持するために実施されてもよい。本開示の一実施形態において、本明細書に記載されるプローブおよび／またはプライマーは、例えばいずれかの方向において、１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド長、長くてもよく、または１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド長、短くてもよい。プライマー配列は当該分野において周知の方法を使用して合成され得る。

本明細書で使用する場合、「増幅」という用語は、増幅反応、例えば、特異的標的ヌクレオチド配列を増幅するために使用される酵素により媒介される反応を指す。標的ヌクレオチド配列を増幅することによって、反応は、単位複製配列、増幅された産物または増幅産物を産生するために標的ヌクレオチド配列のより多くのコピーを産生する。増幅反応の一例は「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」である。ＰＣＲは、ポリメラーゼ酵素、プライマーのセット、例えば、フォワードおよびリバースプライマーのセットならびに必要とされ得る任意の追加のプライマーならびに４種のデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）を含有する混合物中でサーマルサイクラーを用いて実施される。

本明細書で使用する場合、「治療遺伝子」および遺伝子治療という用語は、多くの場合、他の障害に対する治療と同様に、遺伝的障害に対する治療を指す。遺伝子治療は、特定の遺伝的障害を有する人々の細胞内へインビボでの遺伝子の正常なコピーの挿入を含んでもよい。この治療は、欠損化合物を置換することまたは過活動経路を遮断することを含んでもよい。遺伝子治療はまた、遺伝子を停止させることを含んでもよい。遺伝子組換えがまた、エキソビボ遺伝子治療において使用されてもよい。例えば、ヒト幹細胞、免疫細胞または癌細胞は、種々の用途のために遺伝的に修飾されてもよい。細胞は、分化、分化転換または再プログラミングを誘導するように修飾される。また、細胞は治療タンパク質を送達するビヒクルとして役立つように修飾されてもよい。例えば、間充織幹細胞がＢＭＰ２を過剰発現するように修飾されてもよい。

「ポリプレックス」という用語は、遺伝物質およびカチオン種の複合体を指す。遺伝物質対カチオン種（核酸：ポリマー（Ｎ／Ｐ））の比は、約０〜約１０００、約０〜約９００、約０〜約８００、約０〜約７００、約０〜約６００、約０〜約５００、約０〜約４００、約０〜約３００、約０〜約２００、約０〜約１００、約０〜約７５、約０〜約５０、約０〜約２５、約０〜約２０、約０〜約１５、約０〜約１０、および約０〜約５からなる群から選択されてもよい。

化学療法剤としても知られている「抗癌剤」という用語は、ヒトの身体の癌を治療するために使用される薬剤を指す。それらの作用方法に基づいた群に定義される、異なる種類の化学療法剤が存在する。当該分野において知られている化学療法剤の異なる群の例は以下の通りである：アルキル化抗腫瘍薬、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤および細胞毒性抗生物質。これらの薬剤は、静脈内、経口または髄腔内で患者に投与され得る。分離式四肢灌流もまた、特定の場合において化学療法のための公知の送達法である。

「タキサン」という用語は、イチイ属（ｇｅｎｕｓ Ｔａｘｕｓ）（イチイ（ｙｅｗ））の植物によって産生されるジテルペンのクラスを指す。タキサンベースの化学療法レジメンは癌患者のために広範に処方される。パクリタキセルおよびドセタキセルを含むタキサンは、微小管安定化を促進し、中期から後期への移行を中断させる。これは細胞分裂の進行を遮断し、有糸分裂チェックポイントの長期間の活性化は、アポトーシスまたはＧ期への逆転を誘導し、最終的に細胞死を引き起こす。タキサンは、クレモフォールＥＬ（登録商標）、Ｔａｘｏｐｒｅｘｉｎ（登録商標）（ドコサヘキサン酸−パクリタキセル）、ＸｙｔｏｔａｘＴＭ（パクリタキセルポリグルメックス）、ＴＯＣＯＳＯＬ（登録商標）パクリタキセル、ＢＭＳ−１８４４７６、ＤＪ−９２７、ＢＭＳ−２７５１８３、ＲＰＲ１０９８８１Ａ、Ｏｒｔａｔａｘｅｌ、Ｇｅｎｅｘｏｌ（コポリマーの組み合わせ）、ＬＥＰ（リポソーム封入パクリタキセル）およびビタミンＥエマルション中のタキソールからなる群から選択されてもよい。

本明細書で使用する場合、「エポチロン」という用語は、癌治療のための薬物の新たに出現したクラスを表す。エポチロンクラスについての作用機構は、有糸分裂の遮断およびアポトーシスの誘導であるタキサンと同様である。それにも関わらず、エポチロン（Ｅｐｉｔｈｉｌｏｎｅ）が、タキサンより有効であり、副作用が弱いことが示された。さらに、それらの良好な水溶性により、心臓機能に影響を与えることが示されたクレモフォール（パクリタキセルの安定化剤）の交換が可能である。

「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」（ＨＤＡＣｉ）という用語は、ヒストンデアセチラーゼの機能を妨げる化合物のクラスを指す。ＨＤＡＣｉはまた、後成的修飾因子としても知られている。例えば、後成的パターンを修飾することによって、ＳＡＨＡおよびＴＳＡは、免疫修飾およびアポトーシスなどの種々の活性を提示することが示されている。ＨＤＡＣｉの臨床的使用は抗癌治療に広範に関連しているが、ＨＤＡＣｉはまた、神経変性疾患、抗炎症薬および心筋の保護のための治療的介入としても調べられている。より最近、ＨＤＡＣｉは、幹細胞の自己複製を促進し、分化を向上すること、ならびに体細胞の再プログラミング効果を増加することが実証されている。ＨＤＡＣはまた、ヒストンのアセチル化状態の調節を介してクロマチンの維持および機能に関連することが知られている。有益には、ヒストン修飾、ＨＤＡＣｉに対する所与のこのような全体の効果は、増殖、分化、生存およびＤＮＡ修復に関与する遺伝子の転写を含む、生理学的プロセスの広範囲のレパートリーに影響を及ぼす。

「ＴｒａｆＥｎ（商標）」という用語は、輸送エンハンサーを示し、遺伝物質または遺伝物質を含有する複合体を、効果的なトランスフェクションのための産生経路に誘導する２つの薬剤に関する。特に、ＴｒａｆＥＮ（商標）は、酸性コンパートメントから離すように遺伝物質を誘導できる第１の因子および微小管またはそのネットワークを安定化できる第２の因子を含むことを使用して細胞を輸送することに関する。ＴｒａｆＥｎ（商標）の用途は、特定の治療効果を達成するように組成物を合理的に設計することによって細胞をさらに化学的感受性にするように拡大されてもよい。上記の第１の因子はまた、「ｃｈｅｍｏＲｅ−ルータ」とも称され得る。

「被験体」または「個体」は、生きている多細胞脊椎動物である。本開示の文脈において、被験体は、非ヒト動物、例えばマウス、コットンラット、非ヒト霊長類などの実験被験体であってもよい。あるいは、被験体はヒト被験体であってもよい。

本明細書で使用する場合、「生物材料」または「生物試料」という用語は、本明細書に定義される検体を含む、任意の材料または試料を指す。このような試料は、例えば、便、全血、血清、血漿、骨髄、涙、唾液、鼻分泌液、痰、耳分泌液、生殖器分泌液、乳分泌液、ミルク、初乳、胎盤液、羊水、汗、滑液、腹水、脳脊髄液、胆汁、胃液、房水、硝子体内液、胃腸液、滲出液、浸出液、胸膜液、心膜液、精液、上気道液、腹水、免疫反応の部位から採取された体液、プールされた回収部位から収集された体液、気管支洗浄液、尿、例えば全ての適切な器官、例えば肺、筋肉、脳、肝臓、皮膚、膵臓、胃などに由来する生検材料、有核細胞試料、粘膜面、髪または皮膚に関連する流体に由来するまたはそれらを含む試料を含む。

「治療」、「治療的介入」および「療法」という用語は、（文脈が他に示さない限り）本明細書において交換可能に使用されてもよく、これらの用語は、治療的治療および予防的または防御的手段を指し、標的とする病状または病態を予防または遅延（減少）させることを目的とする。腫瘍治療において、治療は、腫瘍細胞の病状を直接減少させることができるか、または腫瘍細胞を、他の治療因子、例えば放射線および／または化学療法による治療に対して、より感受性にする。腫瘍治療の目的または結果は、例えば、以下のうちの１つ以上を含んでもよい：（１）腫瘍増殖の阻害（すなわち、減少、遅延または完全な停止）；（２）症状または腫瘍細胞の減少または排除；（３）腫瘍サイズの減少；（４）隣接する末梢器官および／または組織内への腫瘍細胞浸潤の阻害；（５）転移の阻害；（６）必ずではないが、腫瘍退縮または拒絶を生じ得る抗腫瘍反応の向上；（７）増加した生存時間；および（８）治療後の所与の時点における減少した死亡率。治療は、単一の因子または因子の組み合わせ（２つ超）による治療を伴ってもよい。本明細書で使用する場合、「因子」は、例えば、薬物／化合物または治療するための他の手段、例えば放射線治療または手術を広範に指す。治療の例は、外科的介入、肝移植、免疫療法、所与の薬物または薬物の組み合わせによる化学療法、放射線治療、非アジュバント治療、ダイエット、ビタミン治療、ホルモン治療、遺伝子治療、細胞治療、抗体治療などを含む。「治療」という用語はまた、例えば薬物スクリーニングまたは臨床試験の間の実験的治療を含む。

さらに、本明細書に利用される用語および表現は、説明の観点で使用され、限定ではなく、このような用語および表現の使用は、示され、記載される特徴のあらゆる等価物またはそれらの部分を排除しないことを意図し、種々の修飾が、請求される本発明の範囲内で可能であることは認識される。したがって、本発明は、特に好ましい実施形態ならびに本明細書で具現化される本発明の任意選択の特徴、修飾および変形によって開示されるが、本明細書に開示されているものは当業者に再分類されてもよく、そのような修飾および変形は本発明の範囲内であるとみなされることは理解されるべきである。

本発明は、ここで広範及び一般的に説明されてきた。狭範な種及び一般公開される亜属の分類の各々は、本発明の一部を形成する。これは、切り取られた題材が特異的に本明細書で列挙されるべきか否かにかかわらず、任意の主題を類概念から除去するような但し書き又は消極的限定を伴う本発明の一般的記述を含む。

他の実施例は以下の請求項の範囲内のものである。加えて、本発明の特徴や態様はマルクーシュグループの観点において記載されている場合、本発明はまたマルクーシュグループの個々のメンバーあるいは下位集団のメンバーの観点において記載されることを、当業者は認識する。

本発明の詳細な説明
本発明を説明する前に、本発明は、特定の実施形態に限定されず、従って変更されてもよいことが理解される。また、本発明は添付の請求項のみに限定されるため、本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することを意図しないことが理解される。

遺伝物質、例えば、プラスミドＤＮＡおよびｓｈＲＮＡを送達する場合、高いトランスフェクション効率を達成することにより、限定されないが、癌、神経変性疾患および炎症性疾患（現在、これらについての少しの治療選択肢が存在する）を含む、複数の破壊障害の治療の可能性を与える。現在、低いトランスフェクションおよび送達効率により、薬物−遺伝子治療の用途が制限されている。エキソビボおよびインビボで遺伝子送達を向上させるこの技術を使用するガレノスおよび方法の開発はこの業界において満たされていない必要性を表している。

有益には、本開示は、遺伝子送達を劇的に向上させ、同時に多くの種類の感染しにくい細胞に化学的に感受性なるように設計される生体適合性試薬（ＴｒａｆＥｎ（商標））の特有の組成物を提供する。本明細書に記載される薬物−遺伝子の組み合わせは、微小管を標的とする化学増感剤およびｃｈｅｍｏＲｅ−ルータのクラスが治療遺伝子の送達を増加させるストラテジーに関する。ＴｒａｆＥｎ（商標）および治療遺伝子の相乗効果により、優れた治療効果が生じると考えられる。以下の実施例にさらに記載されるように、化学増感剤の製剤は、非産生酸性コンパートメントから離れるように担体／ＤＮＡ複合体を特異的に再誘導し、次いでそれらを化学増感剤の使用により安定化された微小管ネットワークの上に再度経路設定する融合分子の最適化した混合物を含有してもよい。

したがって、本開示は、遺伝物質で細胞をトランスフェクトする組成物であって、遺伝物質を細胞内の酸性コンパートメントから離すように誘導できる第１の因子および微小管またはそのネットワークを安定化できる第２の因子を含む、組成物を提供する。

一実施形態において、第１の因子は、遺伝物質を細胞の非産生酸性コンパートメントから離すように誘導できる。別の実施形態において、第１の因子は、限定されないが、脂質、ペプチド融合因子またはそれらの組み合わせであってもよい。

一実施形態において、脂質融合因子は、ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳ、ＤＰＰＣおよびＤＯＰＣならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。

一実施形態において、ペプチド融合因子は、限定されないが、赤血球凝集素（ＨＡ２−ペプチド）、インフルエンザ由来の融合ペプチドｄｉＩＮＦ−７およびジフテリア毒素のＴドメイン、ポリカチオン性ペプチド（ポリリシンおよびポリアルギニンなど）またはそれらの組み合わせの少なくともいずれか一つであってもよい。

一実施形態において、上述のペプチド融合因子は、脂質の結合によって化学的に修飾されてもよい。

一実施形態において、上述のペプチドは、核酸または合成担体、例えばカチオン性ポリマーなどの生体分子の結合によって化学的に修飾されてもよい。

一実施形態において、第２の因子は、チューブリンアセチル化を増強できる。別の実施形態において、第２の因子は、治療剤に対する細胞の感受性を増強でき、および／または宿主の遺伝状態を修飾できる。

一実施形態において、上述の第２の因子は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、チューブリン結合因子（ＴＢＡ）、微小管ネットワーク安定性に直接的または間接的に影響を及ぼすことができるｓｉＲＮＡから選択されてもよい。ＨＤＡＣｉは、ツバスタチンＡ、ベリノスタット、ブフェキサマク、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＳＡＨＡ（ボリノスタット）、スクリプタイド、トリコスタチンＡ、バルプロ酸、Ｂ２、サレルミド、サーチノールおよびそれらの組み合わせから選択されてもよい。

一例において、本発明の第２の因子のＴＢＡは、タキサン、エポチロン、およびそれらの組み合わせから選択されてもよいことが示される。タキサンは、パクリタキセル、ドセタキセルまたはそれらの組み合わせであってもよい。

さらなる例において、タキサンは、クレモフォールＥＬ（登録商標）、Ｔａｘｏｐｒｅｘｉｎ（登録商標）（ドコサヘキサン酸−パクリタキセル）、ＸｙｔｏｔａｘＴＭ（パクリタキセルポリグルメクス）、ＴＯＣＯＳＯＬ（登録商標）パクリタキセル、ＢＭＳ−１８４４７６、ＤＪ−９２７、ＢＭＳ−２７５１８３、ＲＰＲ１０９８８１Ａ、Ｏｒｔａｔａｘｅｌ、Ｇｅｎｅｘｏｌ（コポリマーの組み合わせ）、ＬＥＰ（リポソーム封入パクリタキセル）およびビタミンＲエマルション中のタキソールからなら群から選択されてもよい。

一例において、エポチロンは、パツピロン、イクサベピロン、ＢＭＳ３１０７０５、サゴピロン（ｓａｇｏｉｌｏｎｅ）、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、またはそれらの組み合わせであってもよい。

一実施形態において、化学増感剤は、微小管ネットワーク安定性に直接的または間接的に影響を及ぼすことができるヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、チューブリン結合剤、タキサンおよびｓｉＲＮＡであってもよい。

有益には、本開示に使用される化学増感剤は、インビボで抗腫瘍効果、抗炎症効果、抗血管新生効果または神経保護効果を有することが知られている。

一実施形態において、遺伝物質は少なくとも１つのカチオン種に結合されてもよい。カチオン種は、ポリエチレンイミン、ポリカチオン性両親媒性物質、ＤＥＡＥ−デキストラン、カチオン性ポリマー、それらの誘導体およびそれらの組み合わせから選択されてもよい。さらに、カチオン種は、デンドリマー、分枝ポリエチレンイミン（ＢＰＥＩ）、直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ＸｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ（登録商標）、およびそれらの組み合わせなどのカチオン性ポリマーであってもよい。一実施形態において、カチオン種はＬＰＥＩである。

一実施形態において、遺伝物質対カチオン種である核酸：ポリマー（Ｎ／Ｐ）比は、約０〜約１０００、約０〜約９００、約０〜約８００、約０〜約７００、約０〜約６００、約０〜約５００、約０〜約４００、約０〜約３００、約０〜約２００、約０〜約１００、約０〜約７５、約０〜約５０、約０〜約２５、約０〜約１５、約０〜約１０、約０〜約５からなる群から選択されてもよい。一実施形態において、遺伝物質：カチオン種である核酸：ポリマー（Ｎ／Ｐ）比は２０であってもよい。

一実施形態において、Ｎ／Ｐ比は組成物内にポリプレックスを形成する遺伝物質：カチオン種の比である。

別の実施形態において、遺伝物質は核酸配列であってもよい。別の実施形態において、核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。

一実施形態において、細胞は分化または未分化細胞である。一実施形態において、細胞は、神経系細胞、肝細胞、造血細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞、腫瘍細胞、虚血組織細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、皮膚細胞およびそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。

一実施形態において、細胞は生物試料から単離されてもよい。一実施形態において、生体物質は、新鮮な組織、凍結組織、パラフィンで保存された組織および／またはエタノールで保存された組織の試料からなる群から選択されてもよい。別の実施形態において、生体物質は、全血またはそれらの成分、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、滑液、精液、腹水腫瘍液、母乳、羊水、口腔スミアおよび膿汁からなる群から選択されてもよい。

一実施形態において、第１の因子および第２の因子は、同時、別々または連続して細胞に提供されてもよい。一実施形態において、第１の因子および第２の因子は、遺伝物質での細胞のトランスフェクションの第１の時間内に提供される。あるいは、第１の因子および第２の因子は、遺伝物質での細胞のトランスフェクションの約２、３、４、５、６、７、８、９、１０時間以内に提供されてもよい。

一実施形態において、第２の因子は第１の因子の後に提供されてもよい。一実施形態において、第２の因子は、本明細書に記載される２つ以上の治療剤を含んでもよい。

一実施形態において、本明細書に記載される組成物は遺伝子治療に使用されてもよい。

一実施形態において、本明細書に記載される組成物は治療剤をさらに含んでもよい。治療剤は化学療法剤であってもよい。一実施形態において、化学療法剤は、タキサン、パクリタキセル、ドセタキセルおよびエポチロン、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。

一実施形態において、本明細書に記載される遺伝物質および組成物を投与することを含む、遺伝子治療を必要とする患者を治療する方法が提供される。

別の実施形態において、癌、ＳＭＡ、骨肉腫、白血病、血液癌、鎌状赤血球障害、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ＨＩＶ、遺伝的疾患、糖尿病、単一遺伝子疾患、感染性神経疾患、眼疾患、炎症性疾患、心疾患および神経変性疾患からなる群から選択される疾患を治療するための医薬の製造における本明細書に記載される組成物の使用が提供される。

さらなる実施形態において、本明細書に記載される組成物は、遺伝子マーキングのために使用されてもよい。

一実施形態において、細胞内に遺伝物質を送達する方法であって、本明細書に記載される組成物と共に遺伝物質を投与する工程を含む、方法が提供される。その方法は、インビトロまたはエキソビボまたはインサイチュで実施されてもよい。

一実施形態において、本明細書において、本明細書に定義される第１の因子および本明細書に定義される第２の因子を含む組成物が提供される。

別の実施形態において、本明細書に定義される第１の因子および本明細書に定義される第２の因子と、本明細書に定義される治療剤と、使用説明書とを含むキットが提供される。

本開示は治療遺伝子または遺伝物質をさらに含む。以下の実施例に例示されるように、この遺伝物質は、限定されないが、いずれか一つの遺伝子またはその部分をコードし、次いで標的配列との相互作用により、可能な限り発現を向上させることによって、または可能な限り発現を低下させることによって、標的遺伝子上で治療効果を有する細胞内に侵入する核酸配列からなってもよい。治療遺伝子を含む遺伝物質は、本明細書に示され、記載されるいずれかの正確な配列と異なってもよいことは理解されるべきである。したがって、本発明は、本発明の方法に従う配列機能である限り、示される配列の欠失、付加および置換を意図する。本発明の目的のために、遺伝物質を定量する任意の方法が本発明の文脈における使用に適し、多くが当該分野において知られている。例えば、遺伝物質は、当該分野に公知の技術、例えば、制限酵素消化、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、アガロースゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーなどを使用して単離されてもよい。さらに、単離された遺伝物質は、限定されないが、分光光度分析、蛍光標識、定量的ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲとしても知られているｑＰＣＲ）および例えばトランスフェクション後に遺伝子発現レベルを決定するためのＤＮＡマイクロアレイ（ＣＨＩＰ）分析であってもよい、当該分野において公知の方法を使用して定量されてもよい。開示される全ての方法が任意の可能な順序で連続して使用されてもよい。

本明細書に記載される組成物は多くの異なる用途に使用され得、それらの全ては特有のアプローチとしてＴｒａｆＥｎ（商標）を使用し／その使用に関し、微小管修飾活性及び／又は後成的修飾活性を有する遺伝子及び薬物（例えばＨＤＡＣｉ）の両方の同時効果が、以下に記載される全ての領域に有用であり得る。

細胞治療は、年齢、疾患、損傷または先天性欠損症に起因して損失した、正常な機能を修復するために細胞を導入するプロセスを指す。幹細胞および免疫細胞および癌細胞を含む、細胞ベースの治療の多くの形態が存在する。さらに、ＨＤＡＣｉは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）内での幹細胞分化および体細胞の再プログラミングにおけるプロセスに影響を与えることが知られており、細胞ベースの治療におけるＴｒａｆＥｎ（商標）の用途を広げている。これらの細胞ベースの治療は、限定されないが、幹細胞の適用、例えば、修飾された集団を分離するための陰性もしくは陽性選択、ならびに／または例えば、制御されていない細胞集団を全滅させるために外部刺激を使用できるように自殺遺伝子を幹細胞集団内に挿入した場合、幹細胞およびそれらの子孫の成長の抑制に利用され得る。本発明についてのさらなる用途はまた、用途に応じて、治療遺伝子の長期間または一時的な発現を必要とし得る、遺伝子産物を送達するための幹細胞の修飾であってもよい。創傷治癒、骨再生、血管形成、および中枢神経系障害の修復のような場合、一過性発現が好ましい例である。他方で、遺伝的疾患を修復するために、持続的遺伝子発現が必要とされる。

本発明の別の可能な適用は、本発明によって媒介される遺伝子移動を介して幹細胞における分化を調節することである。幹細胞への遺伝子移動の別の可能な適用は遺伝シグナルを提供することであり、当該分野において知られている分化プロトコルの結果を改善する。機能（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）の獲得（プラスミドＤＮＡ）又は損失により細胞分化を誘導する可能性は、分化細胞のより純粋な集団を導くので、種々の種類の幹細胞（限定されないが、人工多能性幹細胞、間充織幹細胞、神経幹細胞、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ＡＳＣ、造血幹細胞（ＨＳＣ）および間充織幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、免疫細胞（Ｔ細胞機能の向上）、癌細胞（癌ワクチン接種のため）および遺伝子組換えされたそれらのバリエーション、ニューロン、小膠細胞、星状膠細胞であってもよい）の使用の検査を導くことが知られている細胞ベースの治療において細胞を分化および再プログラミングする臨床用途として、本発明の特に魅力的な例になる。

細胞ベースおよび遺伝子治療／療法のための本明細書に記載される組成物の可能な適用は、限定されないが、以下の疾患：ＳＭＡ（ｉＰＳ細胞ベースの治療による）、骨癌、白血病、血液癌、癌（抗血管形成、細胞増殖の停止）、鎌状赤血球障害およびウィスコット・アルドリッチ症候群についてのＨＳＣ治療、癌、ＨＩＶ感染および遺伝疾患についての遺伝子治療、損傷組織の修復、糖尿病（Ｔ１ＤおよびＴ２Ｄ）、心疾患、神経変性疾患、例えばパーキンソン病のいずれか一つの治療および療法である。

本明細書に記載される組成物はまた、細胞を再プログラミングするため、および／または細胞の分化転換の方法としてさらに使用され得る。当該分野において知られている遺伝的手段は種々の細胞種類において再プログラミングプロセスを開始することが確立されている。

さらに、ＨＤＡＣｉは分化転換を促進するのに可能な役割を果たすことができると示唆されている。ＨＤＡＣｉは、通常ＳＯＸ９を欠く肝細胞においてＳＯＸ９の発現を誘導することが当該分野において示されている。ＳＯＸ９の異常な発現は、通常、軟骨形成の間に見出される、ＣＯＬ２Ａ１およびＣＯＭＰ１の発現を誘導した。これらの観察により、代表的でない状況に対する典型的な開発プロセスの再開発が、ＨＤＡＣｉを用いた細胞の処理によって開始され得ることが実証される。

実施例１：軽度の遠心分離により改善されたトランスフェクション効率および神経細胞における減少した細胞毒性
神経細胞のトランスフェクションについての最適なプロトコルを確立するために、ボーラストランスフェクションに対する細胞毒性（細胞は、一定時間、ポリプレックスの定義された組成物に曝露された）を最初に調べた。ポリプレックスのＮ／Ｐ比の増加は、血清の存在下でさえも、天然Ｎｅｕｒｏ２ＡおよびＮＧ−１０８細胞の細胞生存率を減少させることが見出された（図１１）。高いＮ／Ｐ比における細胞毒性は、毒性の遊離ポリマーに対する細胞の長時間の曝露に起因し、インキュベーションの時間を短縮することにより、毒性は減少するはずであると仮定した。しかしながら、トランスフェクション効率は、短時間のインキュベーション（１５分または１時間、図１２ａ）で顕著に減少した。軽度の遠心分離はトランスフェクションを改善することが以前に報告されていた。次に、このアプローチは、短時間のインキュベーションでトランスフェクションを改善する試みとして調べられた。仮定されるように、軽度の遠心分離と併せた短時間のインキュベーション（１５分）の結果、ボーラストランスフェクションに匹敵するトランスフェクション効率が生じた（図１２ｂ）。以前に報告されているように、ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡポリプレックスは凝集し、塩を含有する生理的培地中で広範囲にわたって沈殿することが見出され（図１３）、トランスフェクションにおける軽度の遠心分離の有益な効果を説明できる。

実施例２：形成したポリプレックスは凝集し、軽度の遠心分離によって沈殿した。
予想されるように、動的光散乱研究により、ナノサイズＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（約１００ｎｍ）が、ＤＭＥＭ中に配置される場合、サイズを急速に増加させることが示され（図１３）、高塩条件における低いコロイド安定性および凝集の形成と一致する（Ｗｉｇｈｔｍａｎ， Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，２００１．３（４）：ｐ．３６２−７２；Ｍｉｓｈｒａ，Ｓ．，Ｐ．Ｗｅｂｓｔｅｒ， ａｎｄ Ｍ．Ｅ． Ｄａｖｉｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００４．８３（３）：ｐ．９７−１１１）。経時的なこれらの大きな凝集の沈殿は、ダルベッコ最小必須培地ＤＭＥＭ中（ＨＥＰＥＳ中ではない）のＬＰＥＩ／ｐＤＮＡポリプレックスのインキュベーション後に細胞培養プレートの表面に見出される別の粒子の存在が原因しているようであった（図１３ｂ）。ウェルの表面上のこれらの大きな異種粒子（＞０．５μｍ）は、細胞の非存在下でさえも観察され、細胞遺物の可能性が排除される。上清中のｐＤＮＡの量を定量するために、ｐＤＮＡをポリプレックスから効果的に放出し、ｑＰＣＲによって測定した。遠心分離後、上清中のｐＤＮＡの量は顕著に減少し、ＤＭＥＭ中のポリプレックスの沈殿を示す（図３８）。まとめると、これらの観察により、経時的に基質上に凝集したポリプレックスの沈殿が示され、これらの凝集の沈殿は軽度の遠心分離によって増加した。

実施例３：遠心分離により増加したトランスフェクションの結果、天然であるが分化していない神経細胞内への効果的な遺伝子送達が生じた。
次いでこのアプローチを、分化したＮｅｕｒｏ２ＡおよびＮＧ−１０８をトランスフェクトするために適用した。両方の細胞株を分化するように薬理学的に誘導し、トランスフェクションの前に複雑な神経突起伸長を示した（図５ｂ）。興味深いことに、両方の分化した細胞の種類は同じ天然の細胞と比較して不十分にトランスフェクトした（図５ａ、ｂ）。実際に、ＥＧＦＰ陽性細胞のほとんどは未分化の表現型を示し、ＥＧＦＰ陽性細胞の約３％のみが、細胞体の長さの２倍の神経突起を有することが見出された（図５ｃ）。Ｎ／Ｐ比の増加（１０から５０）はトランスフェクション効率を増加させなかった。天然の細胞と同様に、トランスフェクション後、分化細胞においてわずかな毒性が観察された（図１４）。まとめると、これらの観察により、分化した神経細胞は、一致する天然の細胞と比較してＬＰＥＩ／ｐＤＮＡポリプレックスによるトランスフェクションに不応性であることが実証された。

実施例４：ポリプレックスの細胞結合および内在化は神経分化後に影響を与えなかった。
ＤＮＡ取り込みが神経分化に影響を与えるかどうかを評価するために、細胞に会合するＤＮＡの総量を、分化したおよび天然の細胞における定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって測定した。細胞に会合するｐＤＮＡの量を定量するために、ｐＤＮＡをポリプレックスから効果的に放出し、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって測定した（図１５ｂ、ｃ）。ポリプレックスからｐＤＮＡを放出するために使用した溶解溶液はｑＰＣＲ反応に影響を与えなかった（図１５ａ）。同じ量のＤＮＡ（約１０^６コピー／細胞）は天然および分化した細胞に経時的に会合し（図１６）、ポリプレックスは、細胞の分化状態に関わらず、同様に等しく会合することが示される。ポリプレックスが分化細胞中で内在化したかどうかを調べるために、細胞をローダミン−ｐＤＮＡでトランスフェクトした。細胞外ポリプレックスの蛍光を、トリパンブルーを使用して効果的にクエンチした（図１７）。興味深いことに、細胞内蛍光信号強度を天然および分化した細胞の両方において有意なレベルで検出した（図６ａ）。この観察はｑＰＣＲによってさらに確認され、トランスフェクションの４、２４および４８時間後、天然および分化した細胞に内在化した同じ量のｐＤＮＡを示した（図６ｂ）。細胞外ｐＤＮＡを、ｑＰＣＲ測定前にｐＡＡ／ＤＮａｓｅ処理により効果的に除去した（図１８）。これらの結果は、凝集したポリプレックスの細胞会合／取り込みが、神経分化後、顕著に異ならなかったことを示唆した。

実施例５：ＰＫＣに関与する、天然であるが、分化していない神経細胞におけるポリプレックス内在化。
明確な生化学的機構が、天然および分化した細胞におけるポリプレックスの取り込みに関与し得るという仮説を試験するために、種々のシグナル伝達経路の寄与を薬理学的に調べた。ダイナソール、ダイナミンＧＴＰａｓｅ活性の阻害剤は、分化したおよび天然のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるポリプレックスの取り込みを顕著に阻害した。フィリピンＩＩＩ、コレステロール隔離因子は、表現型のいずれにおいてもポリプレックスの取り込みに影響を与えなかった。興味深いことに、ロットレリン、プロテインキナーゼＣ阻害剤は、天然であるが、分化していない細胞において顕著にポリプレックスの取り込みを減少させた（図７ａ）。導入遺伝子の発現に対するこれらの阻害剤の効果は同様に相関した（図７ｂおよびｃ）。トランスフェクションに対するＰＫＣ阻害の効果を、別のＰＬＣ阻害剤、ＧＯ６９８３によりさらに確認した（図１９）。同様の観察をまた、ＮＧ−１０８細胞で行った（図２０）。ポリプレックスの内在化におけるＰＫＣの特異的な関与は、細胞輸送機構が神経分化に対して変化するという示唆と一致する。

実施例６：沈殿したポリプレックスは生物学的に利用可能であり、効果的なトランスフェクションを媒介した。
粒径は、エンドソーム取り込み、細胞内輸送および核侵入に影響を与え、サイズ依存性は異なる細胞種類および用途において異なり得ると考えられる。トランスフェクションに対するサイズの寄与を扱うために、ＤＭＥＭ中の予め複合体化したＬＰＥＩ／ｐＤＮＡを最初に０．２２μｍフィルタに通した。次いで濾液を使用して細胞をトランスフェクトした（図３９における実験の設計を参照のこと）。興味深いことに、トランスフェクション溶液からのポリプレックス凝集体の除去はトランスフェクションをほぼ完全に無効にした（図４０ａ）。対称的に、ＨＥＰＥＳ中の予め複合体化したＬＰＥＩ／ｐＤＮＡの濾液（ポリプレックスの平均サイズ＜２００ｎｍ）は、ＤＭＥＭ中でインキュベーション後、効果的に細胞をトランスフェクトできた（図４１）。さらに、ＤＭＥＭ中のＨＥＰＥＳ濾液のインキュベーションにおける第２の濾過工程はトランスフェクションを無効にした。これらの見解は、ポリプレックスが高塩培地中でのみ凝集し、効果的なトランスフェクションに重要であるという仮説を支持した。同時に、濾液中のｐＤＮＡの量は顕著に減少し、大きな凝集したポリプレックス（＞２００ｎｍ）が濾過により効果的に除去されたことを示唆した（図４２）。次に、基質の表面上に沈殿した示唆された凝集したポリプレックスは細胞を効果的にトランスフェクトできるという仮説を試験した。凝集したポリプレックスはウェルの表面上に軽度の遠心分離によって最初に沈殿し、上清を除去し、ウェルを培地で洗浄した。次いでＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を、沈殿したポリプレックス凝集体で予めロードしたこれらの表面上に直接播種した。興味深いことに、細胞は効果的にトランスフェクトし、これらの沈殿した凝集体が高度に生物学的に利用可能であり（図４０ａ）、トランスフェクトした細胞の百分率はポリプレックス中のｐＤＮＡの量と相関することが示唆される（図４０ｂ）。上記の観察により、このような大きな凝集体が細胞により内在化した方法に関する問題が導かれた。表面固定化ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡポリプレックスは、有意な量のナノサイズポリプレックスを培地中に放出することによってトランスフェクションを媒介するので、ポリプレックスは細胞により内在化され得ることが提案される。表面に沈殿した凝集体が有意な量のｐＤＮＡを培地中に放出するという仮説を試験するために、培養系におけるｐＤＮＡの分布を４８時間にわたって測定した。細胞の存在または非存在下で、培地中に放出されるｐＤＮＡの量は、４８時間のインキュベーションにわたってウェルに見出されるｐＤＮＡの全量の１％未満であり、ｐＤＮＡが表面結合凝集体から効果的に放出されなかったことを示唆している（図４３）。

実施例７：細胞内プラスミドＤＮＡは分化した神経細胞における酸性コンパートメントに局在化した。
初代ニューロンにおけるＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体およびアデノウイルスの細胞内挙動の比較により、アデノウイルスではなく、ポリプレックスが、ポリプレックスの不十分なトランスフェクション効率の原因の可能性がある、酸性コンパートメント内で隔離されることが見出されたことが示される。トランスフェクションは、天然であるが、分化していない細胞において高い効率であることが見出されたので（図５ａ）、ポリプレックスの細胞内輸送の変化が重要な理由であり得ると仮定した。この仮説を試験するために、ポリプレックスの細胞内局在化を調べるフルオレセインのｐＨ感受性を利用した。

細胞外蛍光をエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）によってクエンチした後、天然細胞の大部分において明確な蛍光を観察したが、ＦＩＴＣ−ｐＤＮＡを含有するポリプレックスでトランスフェクトした場合、分化細胞において顕著に減少した（図８ａ）。ｐＤＮＡが細胞内に取り込まれたことを検証するために、ローダミン−ｐＤＮＡ（ｐＨ非感受性）を含有するポリプレックスを、天然および分化した細胞の両方内に同様にトランスフェクトした。ローダミン−ｐＤＮＡは天然および分化した細胞の大部分において観察され、両方の表現型がポリプレックスを効果的に内在化したことがさらに示唆される（図６）。ＦＩＴＣ−ｐＤＮＡまたはローダミン−ｐＤＮＡを含有する細胞の百分率は天然細胞において同じであったが、ＦＩＴＣ／Ｒｈｏ比は分化細胞において顕著に低く、細胞内ＦＩＴＣをクエンチすることを示す（図８ｂ）。まとめると、これらのデータにより、分化したが、天然でない細胞における酸性コンパートメントにおけるポリプレックスの隔離が示唆される。これが一般的な現象であるかどうかを試験するために、同様の実験を分化したＮＧ−１０８細胞および初代皮質ニューロンに対して行った。一貫して、ＦＩＴＣのクエンチが観察され（図２１および２２）、酸性コンパートメントへのポリプレックス輸送が、分化したニューロンの不十分なトランスフェクションの原因となる重要な要因であり得ることが示唆される。

分化細胞における酸性コンパートメントへのｐＤＮＡの輸送を検証するために、ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒグリーン標識した酸性コンパートメントによるｐＤＮＡの共局在化を、共焦点画像を使用して可視化した。酸性コンパートメントへのローダミン−ｐＤＮＡの局在化をトランスフェクションの４時間後に観察し、Ｎｅｕｒｏ２Ａ（図８ｃ、ｄ）およびＮＧ−１０８細胞（図２３）の両方において時間（２４時間）と共に増加した。細胞当たりの標識した酸性コンパートメントの全ピクセル数は分化細胞において顕著に高くなったことは留意すべきである（図２４）。これらの結果により、分化したニューロンにおける直接または間接的な酸性コンパートメントへのポリプレックスの細胞内輸送が、不十分なトランスフェクション効率に部分的に寄与し得ることが示唆される。

実施例８：酸性コンパートメントからのポリプレックスの回避は分化細胞においてトランスフェクションを向上させる。
酸性コンパートメントからのポリプレックスの回避はトランスフェクション効率を増加させ得ることが仮定された。ｐＨ感受性ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳの添加により、分化したニューロンにおいてトランスフェクション効率の１０倍の増加が生じた（図９ａおよびｂ）。ＤＯＰＥ／ＣＨＭＥＳの融合効果を調べるために、酸性コンパートメントへのポリプレックスの輸送を標識したｐＤＮＡで調べた。予想されるように、酸性コンパートメントに局在したＤＮＡの量は、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳによる処理後、劇的に減少し（図９ｃおよびｄ）、天然細胞において観察された細胞内局在プロファイルと同様であった。コンパートメントからのポリプレックスの放出のリアルタイム輸送（図２５）は、酸性コンパートメントからのポリプレックスの回避を促進するＤＯＰＥ／ＣＨＥＭの能力を明確に明らかにした。加えて、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳの効果は一時的であることが見出され、化学物質が遠心分離の直後に加えられた場合、最適効果が達成された（図２６）。明確に、分化したニューロンにおける酸性コンパートメントへのポリプレックスの局在化は不十分なトランスフェクションを導き、融合脂質を使用したポリプレックスのエンドソーム回避を向上させることによって改善され得る。

また、エンドソームの融合を阻害し、小胞性の内部を緩衝することによってＤＮＡの酵素分解を減少することが知られているリソソーム作用化合物である、クロロキンは、トランスフェクションの累積的向上を示さなかったことに留意されたい。ＰＬＵＳ（商標）試薬およびＩＮＦ７融合ペプチドをトランスフェクション後に培養物に加えた場合、ＰＬＵＳ（商標）試薬およびＩＮＦ７融合ペプチドを用いて同様の観察が見出された（図２７）。さらに、ＬＰＥＩはＰＬＵＳ試薬により予め複合体化したｐＤＮＡの送達を媒介し、ＩＮＦ７融合ペプチドは分化したニューロン細胞においてトランスフェクションを改善しなかった（図２８）。

実施例９：向上した微小管媒介性輸送およびポリプレックスのエンドソーム回避により分化細胞の効果的なトランスフェクションが可能になった。
微小管媒介性輸送は、核に対するポリマー／ｐＤＮＡ輸送において役割を果たすことが知られている。酸性コンパートメントからポリプレックスを放出する際の能力を用いて、次に、トランスフェクション効率をさらに向上させるためのストラテジーとして細胞内輸送の化学療法メディエータの影響を調べた。特に、カーゴの微小管媒介性細胞内輸送を向上させるツバスタチンＡ、ヒストンデアセチラーゼ−６（ＨＤＡＣ６）阻害剤を評価した。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡの同時投与の結果、ＥＧＦＰ陽性分化Ｎｅｕｒｏ２Ａの数（約７０％）の非常に顕著な増加が生じた（図１０ａおよびｂ）。経時変化研究により、１２時間のＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡに対する細胞の最小曝露が高いトランスフェクション効率に必要とされることが明らかになった（図２９）。興味深いことに、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡの組み合わせ効果は担体依存性であることが見出され、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤではなく、ＬＰＥＩ、ＰＡＭＡＭおよびＸｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＸＰを使用した場合、トランスフェクションの向上が発生した（図３０）。さらに、ツバスタチンＡ、代替のＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳの存在下でトランスフェクション効率を大いに向上させた（図３１）。次に、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭおよびツバスタチンＡの同時投与を用いて、凝集したポリプレックスを沈殿させるための軽度の遠心分離のストラテジーを初代皮質ニューロンにおいて評価した。注目すべきことに、これらの有糸分裂後皮質ニューロンの７５％近くが、顕著な細胞毒性を有さず（図３２ａ）にトランスフェクトした（図１０ｃおよびｄ）。最適なトランスフェクションは、試薬がトランスフェクションの第１の時間内に同時投与された場合にのみ、発生することに留意されたい（図３２ｂ）。効果的なトランスフェクションについての微小管安定化の有意性をさらに確認するために、チューブリンアセチル化およびトランスフェクションに対するパクリタキセルおよび種々のＨＤＡＣｉの効果を調べた。以前の報告と一致して、ＨＤＡＣ６標的小分子（ツバスタチンＡ、ＴＳＡ、バリノスタット／ＳＡＨＡ）およびエンチオスタット、タセダナリンではなく、パクリタキセルはチューブリンアセチル化を顕著に向上させた（図３３）。細胞をＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびチューブリンアセチル化を誘導した小分子で処理した場合、トランスフェクションに対するさらなる効果が観察された（図３４）。まとめると、これらのデータにより、エンドソーム回避および微小管安定化は、一致した機構によりトランスフェクションを向上させたことが示唆された。

導入遺伝子発現の向上は、エンドソーム輸送および微小管ネットワークの安定化に対して作用するＴｒａｆＥｎ（商標）の組み合わせによって達成された。トランスフェクション向上に対するＴｒａｆＥｎ（商標）の効果を、細胞種類、遺伝子キャリア、遺伝物質およびＨＤＡＣｉを含む種々の条件において試験した。

実施例１０：種々の細胞種類において異なるＴｒａｆＥｎ（商標）の効果。種々の細胞種類およびさらに同じ組織起源の細胞株は、異なるトランスフェクション効率を示すことが知られている。ＴｒａｆＥｎ（商標）の原理の見解を拡張することによって、トランスフェクションの顕著な向上がまた、いくつかの細胞種類で観察され（図４４）、協調したエンドソーム放出および微小管ネットワークの安定化がトランスフェクション効率に顕著に寄与するというさらなる証拠が導かれた。さらに、このアプローチは、トランスフェクション効率を制御することによって導入遺伝子の匹敵する発現レベルと同じ組織源の細胞株モデルを産生できる。

実施例１１：ＴｒａｆＥｎ（商標）は、種々の市販の遺伝子キャリアのトランスフェクションを向上させた。
ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡの組み合わせ効果はまた、ＬＰＥＩ以外の多くの市販のポリマーのトランスフェクション効率を向上することが見出された（図４５）。トランスフェクション実験を製造業者のプロトコルに従って行った場合、ＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅ ＨＰを除いて全ての市販の試薬は不十分な性能であった。製造業者のプロトコルを、沈殿媒介性トランスフェクションワークフローに置き換えた場合、トランスフェクション向上を観察した。ＴｒａｆＥｎ（商標）試薬を加えることによってさらなる向上が達成された。種々のポリマーのエンドソーム回避および微小管輸送を促進することによるトランスフェクションの向上により、異なるキャリアのトランスフェクション機構が同様であり得ることが示唆される。

実施例１２：ＴｒａｆＥｎ（商標）はｓｈＲＮＡのトランスフェクションを向上させた。
遺伝子操作は、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）による遺伝子ノックダウンのいずれかを使用する遺伝子過剰発現によって達成され得る。今まで、ｓｈＲＮＡのライブラリーは、哺乳動物細胞における所望の遺伝子の発現を抑制するために設計された。例えば、ｓｈＲＮＡによるＰＴＢの抑制は、細胞再プログラミングを引き起こし、複数の細胞種類をニューロン様細胞に分化形質転換することが報告された。遺伝子ノックダウンに対するＴｒａｆＥｎ（商標）効果を実証するために、ＴｒａｆＥｎ（商標）の存在下でＲＮＡ結合ポリピリミジントラクト結合（ＰＴＢ）タンパク質の効果的な抑制を示す事例研究を示す。ＨｅＬａ細胞（子宮癌細胞株）におけるＰＴＢ１のｍＲＮＡレベルをトランスフェクション後に調べた。明らかに、ノックダウン効率は、ＴｒａｆＥｎ（商標）の存在下で、より効果的である（バー１〜４、図４６）。ニューロン様細胞で迅速な分化転換プロセスに寄与する効果的な遺伝子ノックダウンを処理の８日後に観察した（図４７）。

実施例１３：遺伝子−薬物組み合わせストラテジー
ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳを使用して非産生エンドソーム経路から経路を変更する時間依存性と、微小管ネットワーク安定因子ＨＤＡＣ６阻害剤との効果を組み合わせることによって、トランスフェクションの向上を多くの細胞種類において実証した。トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）およびバリノスタット（ＳＡＨＡ）などのいくつかのＨＤＡＣ阻害剤は、微小管を標的化することによってトランスフェクションを向上させ、同時に後成的修飾活性を与える。ヒストンおよび非ヒストンアセチル化状態に対するこれらの物質の効果は種々の臨床用途に関与する。例えば、ＨＤＡＣｉは、癌の治療剤の細胞毒性効果を増加させるため（Ａ）、幹細胞の分化を誘導するため（Ｂ）、癌ワクチンの免疫原性を増加させるため（Ｃ）、再プログラミングプロセスを向上させるため（Ｄ）の化学増感剤として使用される。ＨＤＡＣｉの広範囲の臨床用途の実現は、トランスフェクション効率を増加させると共に薬物−遺伝子組み合わせ効果ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＨＤＡＣ６阻害剤の作用の可能性を調べる研究を導き（１および２、図１）、ＨＤＡＣｉは後成的修飾により導入遺伝子の効果を増大し得る（３、図１）。つまり、遺伝子−薬物の組み合わせストラテジーは導入遺伝子発現を同時に増加させ、ＨＤＡＣｉの相乗効果は治療効果をさらに強調し得る。

実施例１４：ｐ５３過剰発現および高い細胞毒性を誘導するＳＡＨＡの相乗効果。
遺伝子治療などの単一の抗癌剤およびＨＤＡＣｉ単独による治療は、多くの場合、固形腫瘍を有する患者にとって制限された臨床的有意性を示すことが知られている。例えば、ｐ５３補充療法などの単一の治療剤およびＳＡＨＡによる抗癌レジメンは不十分な臨床結果を示し、他の癌治療剤との新規組合せレジメンの開発を促す。ｐ５３は、細胞周期の調節、ＤＮＡ修復およびアポトーシスの活性化を含む、多数の機能に関与することが知られている。ｐ５３補充療法の効果は神経膠腫において試験され、この癌の３０〜６０％はｐ５３において変異を有することが見出された。今まで行われた多くの前臨床および臨床研究にも関わらず、第Ｉ相試験を超えて進んだものはない。他方で、ＳＡＨＡは、組み合わせ療法において大きな興奮を集めないが、単剤療法として適度の臨床有益性を示す。ＳＡＨＡは正常細胞に対して最小毒性効果を有する濃度で広範囲の癌細胞において有力な抗腫瘍効果を与えることが示されている。ＳＡＨＡの内在する抗癌機構はまだ不明確であるが、増殖停止、遊走阻止および細胞死を生じる遺伝子発現を変化させる後成的修飾を与える可能性がある。研究は、ＳＡＨＡが、アポトーシス遺伝子（Ｂａｘ、Ｂｉｍ、Ｂｍｆ、Ｂｉｋ、シトクロムＣおよびＳｍａｃ）の上方制御およびアポトーシス遺伝子（ＸＩＡＰおよびサバイビン）の下方制御を誘導したことを示している。他の研究は、ＳＡＨＡにより誘導される細胞死の感受性がｐ５３によって調節されたことを示している。これらの観察により、ｐ５３によるＳＡＨＡの可能な相乗効果が示唆され、それにより、可能な組み合わせ遺伝子−薬物効果が示唆される。薬物−遺伝子の組み合わせ（ＴｒａｆＥｎ（商標））の相乗効果を例示するために、組み合わされたｐ５３およびＨＤＡＣｉ治療の治療結果をＵ２５１ＭＧ神経膠腫細胞株（Ｕ２５１ＭＧ）において調べた。本明細書に提示されるストラテジーは、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＳＡＨＡによって向上したｐ５３トランスフェクション効率の組み合わせ効果を実証し、ＳＡＨＡの化合物はまた、後成的効果を生じ得る。最初に、トランスフェクション向上に対するＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＳＡＨＡの効果をＵ２５１ＭＧ神経膠腫細胞（ｐ５３変異体）において確認した（図４８）。トランスフェクション後、単一または組み合わせの種々の試薬（ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ、ツバスタチンＡおよびＳＡＨＡ）による細胞の処理の結果、トランスフェクション効率の顕著な向上が生じた。興味深いことに、全ての場合、高レベルのＧＦＰ（ＲＦＵによって測定した）を発現する細胞の百分率（％）はトランスフェクションエンハンサーの存在下で顕著に増加した。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡ／ＳＡＨＡの同時投与は、単一試薬による処理より優れた効果を示した。次に、ｐ５３とトランスフェクションエンハンサーとの組み合わせ効果を調べた。陰性対照（−ｖｅ）と比較して、細胞生存率に様々な程度まで影響を与えた（図４９）。細胞数の顕著な減少を、ＰＭＡＸＧＦＰ過剰発現ではなく、ｐ５３で観察し、細胞死がｐ５３依存性であることが示唆される（他の研究によって示唆されているようにアポトーシス経路を介する可能性がある）。ｐ５３による細胞死のさらなる増分が、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ、非毒性融合脂質の存在下で見出され、それにより、トランスフェクション効率を改善することによって細胞の向上した殺傷の証拠を提供する。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳまたはＳＡＨＡで処理したＵ２５１ＭＧのトランスフェクション効率は同等であったが（図４８）、ｐ５３およびＳＡＨＡの組み合わせにより、Ｕ２５１ＭＧ細胞の多くの細胞死が生じた。この観察は抗癌作用に対するＳＡＨＡの報告された化学増感効果と一致する。興味深いことに、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＳＡＨＡの存在下での細胞へのｐ５３送達により、トランスフェクションエンハンサーが個々に加えられる他の条件より優れた細胞毒性効果（細胞数の約９５％の減少を有する）が示された。このデータは、抗癌剤および導入遺伝子産物が互いに相乗効果し、治療結果を増大するという本発明者らの仮説を支持した。さらに、ＳＡＨＡとのインキュベーションの時間の増加は細胞数をさらに減少させなかった（図５０）。次に、ツバスタチンＡ（細胞質ＨＤＡＣ６特異的阻害剤）の効果を、ｐ５３により誘導される細胞死に対するＳＡＨＡの後成的調節の寄与をさらに確認するためにＳＡＨＡと比較した（図５１）。ＳＡＨＡと異なり、ツバスタチンＡはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳと比較して細胞数の大きな減少を生じなかった。予想されるように、ツバスタチンＡおよびＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳによるｐ５３のトランスフェクションは、ＳＡＨＡの使用で観察された薬物−遺伝子組み合わせ効果に寄与しなかった。

証拠を蓄積することにより、神経膠腫の不均一性は機能不全を治療する重要な理由となる可能性であることが示唆される。これまで、ＴＭＺ耐性細胞および癌幹細胞として知られている２つの亜集団が識別されている。亜集団の両方はＴＭＺへの遊走および耐性などの侵襲性癌の表現型を示す発生した遺伝機構を有する。癌幹細胞の仮説は耐性に起因する治療についての課題として十分に認識されている。これらの細胞は幹細胞様特性を示し、異種腫瘍塊を生成できる。最近の研究は、神経膠腫における小数の癌幹細胞（ＧＳＣ）の存在を支持する。これらの細胞は放射線治療および化学療法に耐性があるので、それらは再発性腫瘍を生成するのに十分である。次に、ｐ５３、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＳＡＨＡを使用した遺伝子−薬物の組み合わせの相乗効果を、４０μＭ ＴＭＺ（ＴＭＺＲ−Ｕ２５１ＭＧ）およびＧＳＣに耐性があるＵ２５１ＭＧ細胞において試験した（図５２）。明らかに、このストラテジーは、ＴＭＺＲ−Ｕ２５１ＭＧおよびＧＣＳそれぞれの細胞数の８９．１％および９１．７％の減少を生じる、優れた細胞毒性効果を有する。興味深いことに、ｐ５３のみの過剰発現の結果、ＴＭＺＲ−Ｕ２５１ＭＧの顕著な細胞死が生じたが、ＧＳＣにおいて効果は有さない。これは報告されておらず、初めてｐ５３の過剰発現の効果が親のＴＭＺ耐性細胞およびＧＳにおいて試験された。

実施例１５：骨形成分化を誘導するためのＢＭＰ２過剰発現およびＴＳＡの相乗効果。
幹細胞の臨床用途を実現するために、幹細胞を、非自己幹細胞に由来する細胞の免疫原性を避け、薬物送達ビヒクルとして機能し、移植後の細胞の増殖を調節するように調節された様式で分化するように誘導する技術を確立しなければならない。遺伝子送達はこれらの課題を扱うために生体信号を送達するための有望な手段である。幹細胞技術におけるＴｒａｆＥｎ（商標）遺伝子−薬物の組み合わせの適用を間充織幹細胞（ＭＳＣ）で例示した。

薬物−遺伝子の組み合わせ効果を調べるために、ＭＳＣをトランスフェクトする際のＴＳＡ（ＨＤＡＣ６阻害剤および後成的修飾因子）の効果を最初に試験した（図５３）。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＴＳＡの個々の添加はトランスフェクションの顕著な向上を導いたが、組み合わせて使用した場合、さらなる向上は観察されなかった。次に、ＭＳＣにおけるＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよび／またはＨＤＡＣｉ（ＴＳＡ、ツバスタチンＡ）の存在または非存在下でのＢＭＰ２の発現レベルを、薬物−遺伝子の組み合わせ効果を試験するためにｑＰＣＲを使用して定量した（図５４）。ＢＭＰ２の発現レベルの顕著な増加が、ＰＭＡＸＧＦＰ−ＢＭＰ２（ＢＭＰ２）によるトランスフェクションの３日後に観察された（陰性対照より約１３，０００倍高い）。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ（ＢＭＰ２＋ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ）またはツバスタチンＡ（ＢＭＰ２＋５μＭ ツバスタチンＡ）の添加により、ＢＭＰ２発現が約２０，０００倍向上した。驚くべきことに、ＴＳＡによる治療はＢＭＰ２発現をさらに向上させなかった（ＢＭＰ２＋１５０ｎＭ ＴＳＡ）。興味深いことに、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＴＳＡの組み合わせは、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡの組み合わせ（約８０，０００倍）より、ＢＭＰ２過剰発現に対してかなり優れた効果を誘発した（対照と比較して約２００，０００倍）。これらの予測されない結果は、ＢＭＰ２発現を向上させるのにチューブリンネットワークを単に安定化する以外にＴＳＡの別個の機能を示し、これは、特定のＨＤＡＣｉを使用することによって遺伝子−薬物の組み合わせの新規効果を識別する機会として役立ち得る。ＭＳＣ培養における最大２１日までの導入遺伝子の延長した発現を、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＴＳＡで処理した細胞で観察したことに留意されたい（図５５）。この見解は、治療製品の延長した放出を有する潜在的に有効な細胞治療を示す。さらなる特性付けおよび機能分析が、ＢＭＰ２放出および骨形成を検証するのに必要とされるが、本発明者らは、骨形成規定培地中に維持された細胞中で研究の終わりに広範囲のカルシウム沈着を観察したが（図５６Ｂ）、増殖培地では観察しなかった（図５６Ａ）。

実施例１６：癌細胞の免疫原性を改善するためのＧＭ−ＣＳＦ過剰発現およびＳＡＨＡの相乗効果。
癌ワクチンは、自己複製（手術後の患者から取り除いた）または同種異系（樹立癌細胞株）のいずれかの遺伝子組換え腫瘍細胞から生成できる。遺伝子組換え後、細胞を放射線によって不活性化し、腫瘍細胞に対してレシピエントの免疫反応を誘導するために患者に皮下または皮内に注入した。既存の細胞株などの同種異系細胞の利用は、大規模生産のために標準化され得る、維持され、制限のない十分に特性付けされた細胞源を提供する。それはまた、臨床結果の比較分析のための臨床ロット用の単一のバッチを提供でき、患者の癌細胞を連続して収集する必要性を取り除く。さらに、コストおよび作業を増加させ得る、オーダーメードの個々の癌ワクチンの必要性はもはやない。今まで、最も進行性の細胞株ベースの癌ワクチンはＧＶＡＸであり、転移性前立腺癌治療のためのＧＭ−ＣＳＦ遺伝子で修飾されたＰＣ３細胞を含む。修飾されたＰＣ３細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化でき、免疫反応を誘導できる。他方で、ＨＤＡＣｉは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩタンパク質、同時刺激／接着分子の発現を増加させることによって腫瘍細胞の免疫原性を増加できる。さらに、ＳＡＨＡおよびＴＳＡなどのＨＤＡＣｉによる処置は、正常細胞ではなく、癌細胞の表面上のＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの向上した提示に関連することが見出された。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢは、免疫受容体、ナチュラルキラー細胞タンパク質群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）の活性化を誘導し、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞；ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞）に対して癌細胞の増加した感受性を生じる。ここで、本発明者らは、ＰＣ３細胞の免疫原性の増加においてＧＭ−ＣＳＦおよびＳＡＨＡの組み合わせを試験することを目的とする。このＴｒａｆＥｎ（商標）遺伝子−薬物ストラテジーは、ＡＰＣおよびＮＫ細胞の両方を活性化できるＰＣ３癌ワクチンを生成できる。

ＰＣ３をトランスフェクトする際のＳＡＨＡ（ＨＤＡＣ６阻害剤および後成的修飾因子）の効果を最初に試験した（図５７）。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ、ツバスタチンＡおよびＴＳＡの個々の添加により、トランスフェクションの顕著な向上が導かれたが、組み合わせて使用した場合、さらなる向上は観察されなかった。次に、ＰＣ３中のＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよび／またはＳＡＨＡの存在または非存在下でのＧＭ−ＣＳＦの発現レベルを、薬物−遺伝子の組み合わせ効果を試験するためにｑＰＣＲを使用して定量した（図５８）。ＧＭ−ＣＳＦの発現レベルの顕著な増加が、ＰＭＡＸＧＦＰ−ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭＣＳＦ）によるトランスフェクションの３日後に観察された（対照（ｃｔｒｌ）に対して約８，０００倍）。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ（ＧＭＣＳＦ＋ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ）またはＳＡＨＡ（ＧＭＣＳＦ＋５μＭ ＳＡＨＡ）の添加により、ＧＭＣＳＦ発現がそれぞれ約９０００倍および約１４，０００倍向上した。興味深いことに、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＳＡＨＡの組み合わせは、ＧＭ−ＣＳＦ過剰発現に対してかなり優れた効果を誘発した（対照（ｃｔｒｌ）と比較して約３０，０００倍）。これらの予測されない結果は、ＧＭ−ＣＳＦ発現を向上させる際にチューブリンネットワークを単に安定化する以外にＳＡＨＡの別個の機能を示す。ＴｒａｆＥｎ（商標）でのＧＭ−ＣＳＦ発現による増分に加えて、ＳＡＨＡは、処置の４８時間までにＭＩＣＡおよびＮＫＧ２Ｄの上方制御を誘導した（図５９）。この観察は複数の細胞株に対するＳＡＨＡの効果の報告と一致する。ＭＩＣＡおよびＮＫＧ２Ｄの増加した発現はＮＫ細胞の活性化の原因であった。まとめると、これらのデータにより、ＡＰＣ（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＮＫ細胞（ＭＩＣＡ）の両方を活性化する癌ワクチンを生成するための有望なストラテジーとしてＴｒａｆＥｎ（商標）遺伝子−薬物の組み合わせが示唆される。

実施例１７：ヒト線維芽細胞の再プログラミング効率を増加させるためのＯＳＫＭ過剰発現およびＶＰＡ／ツバスタチンＡの相乗効果
再プログラミングは、あまり分化していない状態への分化細胞のスイッチを含む、細胞状態転換のプロセスを示す。遺伝的手段は種々の細胞種類において再プログラミングプロセスを開始するように確立されている。例えば、Ｙａｍａｎａｋａらは、４つのトランスフェクション因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃを首尾良く識別し、線維芽細胞からｉＰＳＣを十分に生成した。再プログラミングした細胞源の臨床使用においていくつかの問題がある。ウイルスベクターの使用は、腫瘍形成および免疫発生の危険性を導入し得る。別の問題は導入遺伝子の組み込みによって誘導される腫瘍形成の危険性である。特に、ｃ−Ｍｙｃ、周知の癌遺伝子の過剰発現、およびその再活性化は腫瘍形成を引き起こし得る。再プログラミングしたカクテルからのｃ−Ｍｙｃの除去は再プログラミング効率を大いに減少させる。興味深いことに、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４の両方の機能は、バルプロ酸（ＶＰＡ）などのＨＤＡＣｉで細胞を処理することによって補償され得る。

ＰＥＩＭＡＸの高いＮ／Ｐ比がヒト成体線維芽細胞（ＨａＦ）のトランスフェクションに必要とされる（図６０）。増加したＮ／Ｐ（５０〜７０）はトランスフェクションのさらなる改善を生じず、細胞内トランスフェクション障壁の存在を示唆している。ＴｒａｆＥｎ（商標）（ＰＥＩＭＡＸ−Ｎ／Ｐ＝５０、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ＋１０μＭツバスタチンＡ）の添加により、ＧＦＰを発現した細胞の百分率の劇的な増分が生じた（約７０％）。反対に、トランスフェクション事象は、リポフェクタミンおよびサティスフェクションにより媒介されるトランスフェクションで検出されなかった（図６１Ａ）。ポリシストロン性発現ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ：２０３２８）を送達するためにＴｒａｆＥｎ（商標）製剤を使用して、ｃＭｙｃ、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４の発現レベルは、対照（ＰＭＡＸＧＦＰ）と比較して約４０００、約４５００、約４８００および約５４００倍高いことが見出された。ＴｒａｆＥｎ（商標）の非存在下で、ＯＳＫＭレベルは対照と比較して約１０００倍であった（図６１Ｂ）。高レベルの発現は、ｉＰＳＣ様コロニーの急速な形成に寄与し得る。トランスフェクションの９日後、ＴｒａｆＥｎ（商標）ガレノスでトランスフェクトした細胞培養中でコロニーを観察した（図６１Ｃ）。一方、ｃＭｙｃおよびＫＬＦ４の発現の阻害に対するＶＰＡの効果を調べた（図６２）。ｃＭｙｃおよびＫＬＦ４の両方の発現の漸増を最大７２時間で観察した。まとめると、これらのデータは、非ウイルスに基づいた方法を使用してヒトの成体線維芽細胞における効果的な再プログラミングプロセスを誘導するための有望なストラテジーとしてＴｒａｆＥｎ（商標）遺伝子−薬物の組み合わせを示唆している。

考察
本発明者らが知る限り、これが、非ウイルスキャリアを使用して、分化した神経細胞株および初代皮質ニューロンをトランスフェクトする際に予想外の高い効率を実証した最初の報告である。合理的なストラテジーは凝集したポリプレックスの軽度の遠心分離を含み、エンドソーム回避を促進し、微小管輸送を向上させた。適合した天然および分化した神経細胞モデルの選択および信頼できる定量的手段の開発は、非ウイルスキャリアを使用して、分化したニューロンにおけるこれまで認識されていなかったトランスフェクション障壁の識別および軽減を大いに促進した。

分化したニューロンは物理的ストレスおよび細胞内環境の変化に感受性があり、これらの細胞のトランスフェクションを重要な課題にする。ポリプレックスに対する細胞の曝露を制限することによって、および軽度の遠心分離によって、トランスフェクション効率および細胞生存率は顕著に増加した。軽度な遠心分離は高塩培地中で形成される凝集したポリプレックスを沈殿すると考えられる（図１３および３８〜４３）。ポリプレックスは高塩培地中で本質的に不安定であるようである。基質上に沈殿したポリプレックスは培地中に有意なレベルで放出されず（図４３）、観察は以前の報告と一致しない。したがって、沈殿したポリプレックスは細胞表面または細胞培養基質から直接取り込まれ得、基質に対するニューロン移動、運動および接着におけるエンドサイトーシスプロセスの決定的な関与を示す最近の結果と一致する。効果的なトランスフェクションを媒介する際の沈殿した凝集したポリプレックスの決定的な役割を補足のセクションの下で考察した（図１３および３８〜４３）。

相当な努力が非ウイルスキャリアの取り込みおよび細胞内輸送の機構をより良く理解するために行われた。ＬＰＥＩ−ポリプレックスの取り込みは、カベオラおよびクラスリン媒介性エンドサイトーシスを含む複数の経路を含むことが示されている。クラスリン媒介性およびカベオリン媒介性エンドサイトーシスの正確なサイズの制限は現在不明確である（１２０〜５００ｎｍ）。最近の証拠により、哺乳動物細胞の首尾良いトランスフェクションを生じる、ロットレリン感受性および非選択的マクロピノサイトーシス経路によるさらに大きいＬＰＥＩ−ポリプレックスの取り込みが実証された。予想外に、分化した神経細胞ではなく、天然細胞においてＤＮＡの取り込みはＰＫＣに感受性があり、ポリプレックスの取り込み経路および細胞内輸送の変化を示し、これは酸性コンパートメント内のポリプレックスの異なる局在化に起因し得る。

以前の報告と対照的に、ＤＮＡの定量的取り込みは天然と分化した神経細胞との間で同等である。同様のレベルの取り込みにも関わらず、分化した神経細胞は不十分にトランスフェクトした。この発見は、適度な改善のみで満たされたＲＧＤ、ＨＩＶ ＴＡＴ、Ｔｅｔ−１、ＨＧＰで修飾されたポリマーを使用して取り込みを向上させることによって分化したニューロンにおいてトランスフェクションを増加させる試みである以前の報告と一致する。興味深いことに、ポリプレックスの異なる局在化が、天然と分化したニューロン細胞との間で観察された。以前の報告と一致して、ポリプレックスは分化したニューロンにおいて酸性コンパートメント内に隔離した。ＬＰＥＩは「プロトンスポンジ効果」を与えると考えられるが、ＬＰＥＩ−ポリプレックスは、神経分化において酸性コンパートメント内に捕捉され、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳの添加により、このコンパートメントから標識ＤＮＡを放出したことが見出された。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳによる標識したｐＤＮＡのエンドソーム回避およびトランスフェクション効率の劇的な向上は、予想されず、ポリプレックスのエンドソーム回避が重要であるという考えと一致する。酸性エンドソーム環境内のＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳのｐＨ依存性不安定化は、膜融合を生じる膜相転移を生じ、最終的にサイトゾル内の内容物を放出すると考えられる。クロロキンを含む他の市販のエンドソーム標的試薬はトランスフェクション効率に対する効果を有さないことに留意されたい。

いくつかのウイルスと同様に、ポリプレックスは細胞質を通して核まで輸送するために微小管ネットワークを利用することが示されている。したがって、微小管の安定化は、トランスフェクションを向上させる、ダイニンおよびキネシンモーターの多くの動員を生じる。微小管ネットワークの安定化と共に、融合脂質を使用して効果的なエンドソーム回避を促進する能力は、ポリマー媒介性トランスフェクションを向上させるための魅力的な相乗効果のストラテジーとして役立つ。実際に、微小管安定化が誘導された場合、相乗効果が観察された。明らかに、この合理的なアプローチを用いて、分化した神経細胞および初代ニューロンにおける高いトランスフェクション効率がここで達成された。興味深いことに、融合脂質およびツバスタチンＡにより向上したトランスフェクションの効果は相乗的であり、時間的に制御され、ポリプレックスの細胞内輸送が分化したニューロンにおいて確実に制御されることが示唆される。ポリプレックスはエンドサイトーシスの初期の段階で放出され、ＤＮＡの分解または非産生経路へのポリプレックスの輸送を防ぐために細胞内に輸送されることが必要とされ得る。

組み合わせ試薬および本明細書に記載されるストラテジーを使用して障壁の寄与を合理的に軽減することによって、他のカチオン性ポリマーおよび誘導体が、ここで、細胞膜上で集合し、選択的細胞内輸送経路の標的化を誘導する自己集合超分子を促進するコロイド状の安定なポリプレックスを利用することによって、インビトロおよびインビボで神経細胞トランスフェクションのために首尾良く使用され得ることは驚くべきことではない。この示唆と一致して、有意なトランスフェクション効率が、他のカチオン性ポリマー（例えばデンドリマーおよびＢＰＥＩ）およびカチオン性ポリマーベースの遺伝子送達に扱いにくい周知の非神経細胞種で観察された（図３０、図４４および図４５）。また、融合試薬およびＨＤＡＣ阻害剤の使用は、全体的な細胞プロセスに対して長期間の効果を引き起こさなかったことに留意されたい。

トランスフェクションに対する障壁を制限することの解明により、インビトロで分化した神経細胞内への非常に効果的な遺伝子送達の合理的なアプローチが導かれた。ｐＨ感受性脂質を使用してエンドソームにより放出されたポリプレックスの経路を再設定し、微小管媒介性輸送を向上させることによって、高レベルのトランスフェクションが分化した神経細胞および初代皮質ニューロンにおいて達成された。凝集したポリプレックスの輸送において今までこれらの認識されていない変化は、天然および分化したニューロンのトランスフェクション効率の相違についての可能な説明を提供できる。したがって、この研究は、カチオン性ポリマーを使用してインビトロでの分化した神経細胞内への遺伝子トランスフェクションのための相乗作用する非ウイルスキャリアおよび最適化したガレノスの合理的な設計ついての有用な洞察を提供する。

融合因子、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／ヘミコハク酸コレステリル（ＣＨＥＭＳ）は遺伝子送達を改善した。融合因子は、膜相転移および膜融合を生じる、酸性エンドソーム環境内のＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳのｐＨ依存性不安定化を介してエンドソーム回避を促進する。さらなる例に示されるように、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭは、非産生酸性コンパートメントから離すようにキャリア／ＤＮＡ複合体の方向を特異的に変更するので、向上したトランスフェクション効率を導く。ＤＯＰＥと同様の特性を有する融合因子は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む。いくつかのペプチドは、血球凝集素（ＨＡ２−ペプチド）、インフルエンザ由来の融合ペプチドｄｉＩＮＦ−７、ジフテリア毒素のＴドメインおよびポリカチオン性ペプチド、例えばポリリシンおよびポリアルギニンなどと同様に融合特性を有することが見出された。

種々の疾患を有する患者における一次および二次治療として微小管標的化因子および後成的修飾因子の使用は当該分野において知られている。本開示はさらに、微小管標的化因子および後成的修飾因子の使用を包含する。ここで、微小管標的化化学増感剤（Ｍｔ−Ｃ）は、チューブリン結合因子（ＴＢＡ）およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）として分類される（図３）。

チューブリン結合因子の２つの主要なクラス、タキサンおよびエポチロンは当該分野において知られている。ＴＢＡは、有糸分裂遮断およびアポトーシスを導く、微小管の動態を抑性できる。タキサンは、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテレ）またはそれらの組み合わせを含み得る。タキサンのようなエポチロンは、細胞毒性およびやがて細胞死を生じる、Ｇ２−Ｍ移行期において細胞周期停止を誘導することによって細胞分裂を防ぐことが当該分野において知られている。当該分野において知られているエポチロン類似体は、パツピロン、イキサベピロン、ＢＭＳ３１０７０５、サガピロン、ＫＯＳ−８６２およびＫＯＳ−１５８４であることが当該分野において知られている。

以下の表１はＨＤＡＣ／サーチュインに対する阻害効果を有するＨＤＡＣｉを示す。当該分野において知られているＨＤＡＣｉは、微小管標的化および／または後成的修飾活性を有することが示されている。ＨＤＡＣｉは微小管のアセチル化を促進するためにＨＤＡＣ６およびサーチュイン２を阻害し、微小管ネットワークの安定化を生じる。アセチル化は微小管の安定性に関連していると繰り返して主張され、「アセチル化微小管」という用語は、しばしば、「安定な微小管」と同意語として使用される。ＴＢＡの効果と同様に、ＨＤＡＣｉは、微小管の動態を停止し、抗癌作用を与えることが知られている。ボリノスタットのようないくつかのＨＤＡＣｉは、複数のＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ１、２、３および６）を阻害し、免疫修飾およびアポトーシスなどの種々の活性を示す。ＨＤＡＣはヒストンのアセチル化状態の調節を介してクロマチンの維持および機能に関与する。さらに、ＨＤＡＣｉは、ＨＤＡＣファミリーが、増殖、分化、生存およびＤＮＡ修復に関与する遺伝子の転写を含む、生理学的プロセスの広範囲のレパートリーに影響を与えるので、多様な機能を有することが知られている。

より最近、ＨＤＡＣｉは、造血幹細胞の自己再生を促進し、神経幹細胞の分化を向上させ、体細胞の再プログラミングの効率を増加させることが実証されている。

ＨＤＡＣ６阻害は、非神経細胞における微小管の動態および神経細胞における神経突起伸長に影響を与えることが知られている。従って、微小管動態、ニューロン新生および全体の細胞代謝を含む神経細胞の細胞プロセスに対するツバスタチンＡの長期の効果の可能性は注意深い解明に値する。明らかに、ツバスタチンＡによる処置はチューブリンアセチル化に対して一時的な効果（＜２４時間）を生じる（図３５）。さらに、本明細書に記載されるトランスフェクションの実例は神経細胞の神経突起伸長（図３６）および全体の代謝（図３７）について維持される変化を生じなかった。

ＭＳＣは、単離され、エキソビボで増殖され得、存在する組織の細胞に適切に分化し、損傷組織を修復し、正常な機能を回復し得る、成体の間質幹細胞の異種サブセットである。骨形成、軟骨形成、および脂質生成細胞種類に対するこれらの分化可能性以外に、研究により、ニューロン、腎臓および他の細胞種類も生成するＭＳＣの能力が実証されている。ＢＭＰ２発現ベクターのウイルス媒介性送達は、分化プロトコルの結果を改善するために遺伝子シグナルを提供することによって、骨形成原細胞内にこのような幹細胞を誘導するように開発されている。分化細胞を生成するための細胞源としてのＭＳＣの使用に加えて、それは遺伝子／薬物送達ビヒクルとして作用するように試験されている。ＭＳＣは組織修飾を促進するようにＢＭＰ２で遺伝子組換えされた。他方で、ＭＳＣの分化を向上させるために新たに出現したアプローチはＨＤＡＣｉによる直接的な処置である。ＴＳＡ、ＳＡＨＡおよびバルプロ酸などのＨＤＡＣｉがＭＳＣの骨形成分化を促進できることが多数の報告において示唆されている。これらのＨＤＡＣｉは、ＢＭＰ２、ＲＵＮＸ、オステリクス（ｏｓｔｅｒｉｘ）およびオステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）などの骨形成促進因子の上方制御を生じる後成的変化を誘導した。今まで、ＢＭＰ２トランスフェクションおよびＴＳＡの相乗効果は試験されていなかった。

方法
細胞培養
Ｎｅｕｒｏ２Ａ（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１３１ＴＭ）を安定に発現したＧＦＲα２ａ細胞およびラット初代皮質ニューロンを以前に記載されているように培養し、維持した（Ｙｏｏｎｇ，Ｌ．Ｆ．、Ｇ．ＷａｎおよびＨ．Ｐ．Ｔｏｏ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００９．４１（４）：ｐ．４６４−７３；Ｚｈｏｕ，Ｌ．およびＨ．Ｐ．Ｔｏｏ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、２０１１、６（６）：ｐ．ｅ２１６８０）。非神経細胞は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ｂ２７におけるニューロン成長の＜０．５％の細胞集団を含む（Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ、１９９３．３５（５）：ｐ５６７−７６）。ＤＩＶ３（インビトロで３日）で、初代ニューロンをトランスフェクトした。分化した神経細胞のトランスフェクションについて、Ｎｅｕｒｏ２ＡおよびＮＧ−１０８細胞を、トランスフェクションの４８時間前に１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で５０ｎｇ／ｍｌのグリア細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、１０μＭのオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）または１０μＭのホルスコリン（ＦＳＫ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で分化した。

ＴｒａｆＥｎ（商標）の生成
最初に、脂質成分（例えばＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳ）をクロロホルム中に溶解した。これらの成分を、意図した用途および融合リポソームを形成するために使用される脂質の種類に応じて特定の比率（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）で混合した。次いで溶媒を蒸発させ、それによりガラス管の底でＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳを含む脂質膜の形成を促進した。脂質膜を激しく撹拌することによって２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中で再構成し、その後、脂質溶液をバッチ型の超音波破砕機において２分間超音波処理した。この脂質溶液は第１の因子を構成する。次いでＴｒａｆＥｎ（商標）組成物を、本開示に定義されている第１の因子と第２の因子を混合することによって調製する。参照されるＴｒａｆＥｎ（商標）組成物はまた、融合リポソームの代わりに融合ペプチドの使用を想定する。

トランスフェクション手順
ＥＧＦＰを発現するプラスミドＤＮＡを製造業者の指示書（Ｇｅｎｅａｉｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｔａｉｗａｎ）に従って精製した。ＬＰＥＩ（２５ｋＤａ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を、異なるＮ／Ｐ比にて２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中のｐＤＮＡに加え、室温にて１５分間インキュベートした。次いでＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合物を完全培地（１：１０）に加えてトランスフェクション混合物（２μｇ／ｍｌにてｐＤＮＡ）を調製した。バルクトランスフェクション（遠心分離を用いるまたは用いない）のために、細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクション混合物を培養物中の細胞に加え、２８０ｇにて５分間遠心分離した。次いでトランスフェクション混合物を完全培地に置き換え、細胞をさらにインキュベートした。分化細胞のトランスフェクションのために、トランスフェクション混合物を、対応する分化試薬を含有するＤＭＥＭ（１％ＦＢＳ）と置き換えた。トランスフェクション効率（ＥＧＦＰ陽性細胞の百分率）を、示した期間のインキュベーション後、手動計数または蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析のいずれかによって定量した。

阻害剤を使用した研究について、細胞を、トランスフェクションの４５分前に、ＤＭＥＭ（０．５％ＦＢＳ）中のダイナソール（３０μｇ／ｍｌ）、フィリピンＩＩＩ（５μｇ／ｍｌ）またはロットレリン（２．５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。細胞を、トランスフェクション後、対応する阻害剤を含有するＤＭＥＭ（０．５％ＦＢＳ）中でさらにインキュベートした。使用した濃度において、細胞死の証拠は存在しなかった。

分化したニューロンにおけるトランスフェクションを改善するために、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびツバスタチンＡ（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＵＳＡ）を使用した。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ（９：２のモル比）（Ｐｏｌａｒ Ａｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ）を含む脂質膜が、溶媒であるクロロホルムの蒸発後、ガラス管の底に形成した。脂質膜を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中で再構成し、バッチ型超音波破砕機（Ｂｒａｎｄｓｏｎ ２２００）において２分間超音波処理した。脂質溶液を、トランスフェクション後、種々の示した時間において細胞培養物に加えた。トランスフェクションの１時間後、ツバスタチンＡ（５または１６μＭ）を培養培地に加えた。培地を含有する阻害剤を２４時間後、新鮮な培地と置き換えた。

フローサイトメトリー分析
トランスフェクション後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、ＰＢＳ中で再懸濁した。細胞集団を、４０μｍメッシュを通して濾過することによって除去した。ＥＧＦＰを発現する細胞の百分率をＦＡＣＳ分析（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって定量し、ＷｉｎＭＤＩ（Ｖ２．９）を使用して生データを分析した。１つの試料当たり少なくとも１０，０００個の細胞を分析した。

ＤＮＡを定量するためのリアルタイムｑＰＣＲ
細胞により内在化したＤＮＡを定量するために、上清を除去し、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、４℃にて２時間、ｐＡＡ／ＤＮＡｓｅを含有するＤＭＥＭ中でインキュベートした。次に、細胞をトリプシン処理し、ｐＡＡ／尿素溶解緩衝液で処理する。ｐＡＡ／尿素溶解緩衝液およびｐＡＡ／ＤＮａｓｅによるＤＮＡ放出の効率を評価した（図１５および１８の補足）。沈殿したポリプレックスのみとのトリプシンのインキュベーション後のＤＮＡの定量により、トリプシン画分に検出された有意でない量のｐＤＮＡが明らかになった（データは示さず）。ＥＧＦＰに特異的なプライマー、フォワードプライマー（５’−３’、ＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣ）およびリバースプライマー（５’−３’、ＧＡＣＣＡＴＧＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＴ）を使用した。ｐＤＮＡのＰＣＲ定量を以前に記載されているように実施した（Ｙｏｏｎｇ，Ｌ．Ｆ．、Ｇ．Ｗａｎ、およびＨ．Ｐ．Ｔｏｏ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００９．４１（４）：ｐ．４６４−７３）。補間によるプラスミド標準を使用してｐＤＮＡの絶対量を決定した。

画像化研究
ＦＩＴＣ−およびローダミン−ｐＤＮＡを製造業者の推奨（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、ＵＳＡ）に従って調製した。ＥＧＦＰの発現を蛍光標識したｐＤＮＡでトランスフェクトした細胞中で観察した（データは示さず）。ＦＩＴＣ−またはローダミン−ｐＤＮＡを内在化したポリプレックスの可視化のために使用し、標識したｐＤＮＡの細胞外蛍光を、トランスフェクションの４時間後、ＥｔＢｒ（２０μｇ／ｍｌ）または０．４％トリパンブルーのそれぞれでクエンチした。細胞画像を、蛍光検出（Ｚｅｉｓｓ ｃｅｌｌ ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１）を備えた倒立Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を用いてクエンチの前後に得、処理した（Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｌ．４．７）。トリパンブルーのクエンチ効率を調べた（図７の補足）。ローダミン−ｐＤＮＡおよび酸性コンパートメントの共局在化を研究するために、細胞をＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒグリーンＤＮＤ−２６（５０ｎＭ）と５分間インキュベートした。画像をＺｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で捕捉した。共局在化したピクセルをＺｅｉｓｓ ＺＥＮソフトウェア（ｖ２０１０）で分析した。

細胞生存アッセイ
天然および分化した神経細胞の細胞生存に対するＬＰＥＩにより媒介されたトランスフェクションの影響を評価するために、Ｎｅｕｒｏ２ＡおよびＮＧ−１０８細胞を、トランスフェクションの４８時間前に９６ウェルプレート中でＧＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＲＡ（１０μＭ）およびＦｓｋ（１０μＭ）で分化した。次いで細胞を１５分または４時間、ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（種々のＮ／Ｐ比にて）に曝露した。２８０ｇにて５分間の遠心分離を用いてまたは用いずに、トランスフェクション混合物を完全培地と置き換え、４８時間インキュベートした。培養培地を、１００μｌのＤＭＥＭおよび２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）と置き換えた。３７℃でのインキュベーションの１時間後、４９０ｎｍにおける吸光度を、９６ウェルマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ６８０、Ｂｉｏｒａｄ）を使用して記録した。

ＤＮＡ放出アッセイ
ＤＮＡを以下の手順によって収集した：（１）上清中のＤＮＡを定量するために、上清をｐＡＡ／尿素緩衝液で処理してＤＮＡを放出した；（２）細胞と会合したＤＮＡを定量するために、上清を除去し、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、その後、トリプシン処理により収集し、ｐＡＡ／尿素溶解緩衝液で処理した；（３）細胞により内在化したＤＮＡを定量するために、上清を除去し、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、４℃にて２時間、ｐＡＡ／ＤＮＡｓｅを含有するＤＭＥＭ中でインキュベートした。次に、細胞をトリプシン処理し、ｐＡＡ／尿素溶解緩衝液−ポリアクリル酸（ｐＡＡ、Ｓｉｇｍａ、Ｍｗ：８０００；１０ｎｇのｐＡＡ／ｐＤＮＡのｎｇ；ｐＡＡにおける３２カルボキシル基／ｐＤＮＡにおける１リン酸基）、０．５Ｍの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび４Ｍの尿素を用いて９５℃にて３０分間処理した。ＬＰＥＩからｐＤＮＡの置き換えのために競合試薬としてｐＡＡを使用した。２つの異なるアプローチ−ＤＮＡ遅延アッセイおよびｑＰＣＲを使用してｐＤＮＡ解離の効率を可視化／定量した。ＤＮＡ複合体を、エチジウムブロマイドで染色した０．８％アガロースゲル中で電気泳動し（１００Ｖ、２０分）、ＵＶトランスイルミネーターで可視化した。

表面結合ｐＤＮＡの除去
トランスフェクション後、細胞（６ウェルプレート中）を、４℃にて２時間、ｐＡＡ（１０ｎｇのｐＡＡ／ｐＤＮＡのｎｇ）、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、６ｍＭ ＭｇＣｌ_２および４単位／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮＡｓｅ）を含有する４００μｌの無血清ＤＭＥＭとインキュベートした。この配合物を表面結合ｐＤＮＡの完全な放出および分解のために最適化した。ＬＰＥＩと複合体化したプラスミドＤＮＡを、ｐＡＡにより置換し、ＣａＣｌ_２およびＭｇＣｌ_２の存在下でＤＮＡｓｅ Ｉにより分解した。４℃でのインキュベーションにより、細胞によるＤＮＡｓｅの内在化を防いだ。ＲＴ−ｑＰＣＲおよび画像化研究により、このアプローチを使用した表面結合ｐＤＮＡの効果的な除去を確認した（図１８の補足）。

動的光散乱
ＬＰＥＩ／ｐＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝２０）を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳまたはＤＭＥＭ中で調製した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用した動的光散乱によって粒径を測定した。

沈殿物媒介性トランスフェクション
沈殿物媒介性トランスフェクションのために、トランスフェクション混合物を培養プレート（完全培地で２４時間プレコートした）に移し、示した時間、インキュベートした（遠心分離を用いたまたは用いていない）。トランスフェクション混合物を除去し、細胞を播種した。トランスフェクションの４８時間後、手動計数またはＦＡＣＳ分析のいずれかによってトランスフェクション効率（ＥＧＦＰ陽性細胞の百分率）を定量した。

免疫細胞化学
対照および１０μＭの分化したＮｅｕｒｏ２ａ細胞を、室温にて２０分間、１×ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定し、続いて、１×ＰＢＳ中の０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中で透過した。次いで、細胞を固定した試料を、３７℃にて３０分間、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／１×ＰＢＳ中の正常なヤギ血清（１：１０；Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で遮断した。次いで細胞を、３７℃にて２時間、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１％ ＢＳＡ／１×ＰＢＳ中のアセチル化α−チューブリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔ７４５１、１：２００希釈）またはＴｕＪ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ１１９５、１：５０希釈）に対する一次抗体とインキュベートし、１×ＰＢＳ中で３回洗浄した。続いて、細胞を、３７℃にて２時間、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／１％ ＢＳＡ／１×ＰＢＳ中で１：２００希釈したヤギ抗マウス蛍光二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ ４８８／５９６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）とインキュベートした。細胞を１×ＰＢＳ中で３回洗浄し、標本にした。Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１共焦点顕微鏡システム（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０を使用して画像収集を実施した。全ての画像を同一のレーザおよび光学設定で取得した。

ＬＣ−ＭＳによる代謝産物アッセイ
細胞（６ウェルプレート中で培養した、約１００万の細胞）を２ｍＬの氷冷ＨＰＬＣ水により急速にリンスした。次いで、細胞の代謝産物の状態を、ＨＰＬＣ水の吸引後、培養プレートを液体窒素に供することによってクエンチした。１分のインキュベーション後、２５０μＬの氷冷メタノール：クロロホルム（９：１比）を抽出目的のために各ウェルに加え、細胞を細胞スクレーパー（Ｇｒｅｅｎｐｉａ Ｔｅｃｈ．）（Ｌｏｒｅｎｚ，Ｍ．Ａ．、Ｃ．Ｆ．Ｂｕｒａｎｔ、およびＲ．Ｔ．Ｋｅｎｎｅｄｙ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２０１１．８３（９）：ｐ．３４０６−１４）で破砕した。抽出物を、０．１ｍｍのガラスビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔ）を含有する１．５ｍＬの微量遠心分離管に移した。代謝産物を効果的に放出するために、試料を、２分間、Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ（Ｂｉｏ Ｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｃ．）に供した。その後、抽出物を１６０００ｇにて３分間、遠心分離によりペレット化した。上清をオートサンプラーバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈ．）に移し、分析した。

ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ）−（ＴＯＦ）ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒＯＴＯＦ ＩＩ）プラットフォームを使用して代謝産物を分析した。−５００Ｖエンドプレート電圧および４５００Ｖキャピラリー電圧を用いてネガティブモードで５０〜８００ｍ／ｚで走査するために、エレクトロスプレーイオン化を使用し、（ＴＯＦ）質量分析を操作した。１バールの噴霧器のガスを提供した。乾燥ガスの速度および乾燥ガスの温度をそれぞれ９ｍＬ／分および２００℃に調整した。獲得したデータ（５０〜８００ｍ／ｚ）から、ｍ／ｚの範囲（使用中のＭＳ機器での０．０６ｍ／ｄ幅、平均ｍ／ｚ分布幅）を抽出した。続いて、保持時間を各中間体について決定し、製造業者のソフトウェアを使用してピーク面積を各代謝産物について調べた。

ＡＴＰに対する各代謝産物の相対量を計算した。ＡＴＰは、最も豊富な代謝産物であり、５％未満の係数変化で各時点において試料にわたって安定であるので、それを正規化群として使用した。正規化後、各時点における陰性対照に対する代謝産物の相対倍変化を計算した。

Claims (39)

1. 遺伝物質を細胞内の酸性コンパートメントから離すように誘導できる第１の因子および微小管またはそのネットワークを安定化できる第２の因子を含む遺伝物質で細胞をトランスフェクトするための組成物。
2. 前記第１の因子が、前記遺伝物質を細胞の非産生酸性コンパートメントから離すように誘導できる、請求項１に記載の組成物。
3. 前記第１の因子が、脂質融合因子および／またはペプチド融合因子である、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記脂質融合因子が、ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳ、ＤＰＰＣおよびＤＯＰＣならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
5. 前記ペプチド融合因子が、赤血球凝集素（ＨＡ２−ペプチド）、インフルエンザ由来の融合ペプチドｄｉＩＮＦ−７およびジフテリア毒素のＴドメイン、ポリカチオン性ペプチド（ポリリシンおよびポリアルギニンなど）ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
6. 前記ペプチド融合因子が、生体分子、脂質、核酸および合成担体からなる群から選択される結合によって化学的に修飾される、請求項３または請求項５に記載の組成物。
7. 前記第２の因子が、チューブリンアセチル化を増強できる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記第２の因子が、治療剤に対する細胞の感受性を増強でき、および／または宿主の遺伝状態を修飾できる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記第２の因子が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、チューブリン結合因子（ＴＢＡ）、微小管ネットワーク安定性に直接的または間接的に影響を及ぼすことができるｓｉＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記ＨＤＡＣｉが、ツバスタチンＡ、ベリノスタット、ブフェキサマク、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＳＡＨＡ（ボリノスタット）、スクリプタイド、トリコスタチンＡ、バルプロ酸、Ｂ２、サレルミド、サーチノール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
11. 前記ＴＢＡが、タキサン、エポチロン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
12. 前記タキサンが、パクリタキセル、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記エポチロンが、パツピロン、イクサベピロン、ＢＭＳ３１０７０５、サゴピロン、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
14. 前記遺伝物質が、少なくとも１つのカチオン種に結合される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記カチオン種が、ポリエチレンイミン、ポリカチオン性両親媒性物質、ＤＥＡＥ−デキストラン、カチオン性ポリマー、それらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記カチオン種が、デンドリマー、分枝ポリエチレンイミン（ＢＰＥＩ）、直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ＸｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＸＰＨＰ（登録商標）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるカチオン性ポリマーである、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記カチオン種がＬＰＥＩである、請求項１６に記載の組成物。
18. 遺伝物質対カチオン種である核酸：ポリマー（Ｎ／Ｐ）比が、約０〜約１０００、約０〜約５００、約０〜約１００、約０〜約５０および約０〜約２０からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
19. 前記Ｎ／Ｐ比が、前記組成物内にポリプレックスを形成する遺伝物質対カチオン種の比である、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記遺伝物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
21. 前記細胞が、分化細胞または未分化細胞である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. 前記細胞が、神経系細胞、肝細胞、造血細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞、腫瘍細胞、虚血組織細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
23. 前記第１の因子および前記第２の因子が、同時、別々または連続して細胞に提供される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
24. 前記第１の因子および前記第２の因子が、前記遺伝物質での細胞のトランスフェクションの第１の時間内に提供される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
25. 前記第２の因子が、前記第１の因子の後に提供される、請求項２４に記載の組成物。
26. 遺伝子治療に使用するための請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
27. 治療剤をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
28. 前記治療剤が化学療法剤である、請求項２７に記載の組成物。
29. 前記化学療法剤が、パクリタキセル、ドセタキセルおよびエポチロン、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物。
30. 癌、ＳＭＡ、骨肉腫、白血病、血液癌、鎌状赤血球障害、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ＨＩＶ、遺伝的疾患、糖尿病、単一遺伝子疾患、感染性神経疾患、眼疾患、炎症性疾患、心疾患および神経変性疾患からなる群から選択される疾患を治療するための医薬の製造における請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
31. 前記第１の因子および前記第２の因子が、同時、別々または連続して投与される、請求項３０に記載の使用。
32. 前記第１の因子および前記第２の因子が、前記遺伝物質での細胞のトランスフェクションの第１の時間内に提供される、請求項３１に記載の使用。
33. 前記第２の因子が、前記第１の因子の後に提供される、請求項３２に記載の使用。
34. 請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物と共に遺伝物質を投与する工程を含む、遺伝物質を細胞内に送達する方法。
35. 前記第１の因子および前記第２の因子が、同時、別々または連続して投与される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記第１の因子および前記第２の因子が、前記遺伝物質での細胞のトランスフェクションの第１の時間内に提供される、請求項３５に記載の方法。
37. 前記第２の因子が前記第１の因子の後に提供される、請求項３６に記載の方法。
38. 請求項１〜２９のいずれか一項に記載の第１の因子、および請求項１〜２９のいずれか一項に記載の第２の因子を含む、組成物。
39. 請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。