JP2015129652A - 脳梗塞の診断マーカー及び診断キット - Google Patents
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Abstract
【課題】脳梗塞の診断を適切に行うことができる診断マーカーを提供する。
【解決手段】配列番号113に示すアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号79に示すアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号57に示すアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号63に示すアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも何れか１つを含むことを特徴とする。SLE患者血清を用いてプロトアレイ法によるスクリーニングを行い、該血清と陽性反応を示す複数のタンパク質を抗原タンパク質として同定して、本発明を完成させるに至った。
【選択図】なし
【解決手段】配列番号113に示すアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号79に示すアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号57に示すアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号63に示すアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも何れか１つを含むことを特徴とする。SLE患者血清を用いてプロトアレイ法によるスクリーニングを行い、該血清と陽性反応を示す複数のタンパク質を抗原タンパク質として同定して、本発明を完成させるに至った。
【選択図】なし
Description
本発明は、脳梗塞の診断マーカー及び診断キットに関する。
脳梗塞は、脳血管が閉塞又は狭窄することにより、脳虚血を来たし、脳組織が壊死した状態である。脳梗塞の原因は、主に血栓性、塞栓性及び血行力学性に分けられ、具体的にはアテローム血栓性脳梗塞、心原性脳梗塞、ラクナ梗塞、その他に分けられる。
いずれの場合も、閉塞又は狭窄した脳血管の下流の細胞が壊死するため、麻痺、言語障害、失明、めまい、失調、意識障害、高次脳機能障害を生じ、死に至ることも多い。
脳梗塞部位では、炎症関連物質や酸化ストレス、小胞体ストレス等により神経細胞やグリア細胞が障害され、脳梗塞巣が広範囲に伸展する。脳梗塞は、中枢神経機能障害を主徴とする神経変性疾患であり、神経細胞の変性・壊死に続く梗塞巣形成にいたる急性期脳梗塞と、梗塞巣形成から中枢神経障害の固定にいたる亜慢性期・慢性期脳梗塞とに病理学的・組織学的に分類される。
脳梗塞は日本における死因の第３位になっている脳卒中の主病型で死亡率の高い疾患であり、脳梗塞の診断を的確にできれば社会的に極めて有益である。
特許文献１には、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定する脳梗塞の診断方法が記載されている。また、特許文献２には、所定のSNPを決定することによる脳梗塞の診断方法が記載されている。
しかし、上述の技術は適切に脳梗塞を診断できるものではない。
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、脳梗塞の診断を適切に行うことができる診断マーカー、及び診断キットを提供することを目的とする。
本発明にかかる脳梗塞の診断マーカーは、配列番号113に示すアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号79に示すアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号57に示すアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号63に示すアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも何れか１つを含むことを特徴とする。
本発明にかかる脳梗塞の診断キットは、配列番号113に示すアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号79に示すアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号57に示すアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号63に示すアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも何れか１つを含むことを特徴とする。
本発明によれば、脳梗塞を適切に診断することができる。
全身性エリテマトーデス（Systemic lupus erythematosus: SLE）は典型的な自己免疫疾患であり、多彩な自己抗体の出現や免疫複合体の沈着による多臓器障害を呈する慢性炎症性疾患である。
SLEにおいては、Tリンパ球の機能異常とBリンパ球の活性化亢進により多種多様な自己抗体が出現することが知られている。SLE患者では、95％以上に抗核抗体が検出される。SLEに特異的な自己抗体として、抗ｄｓDNA抗体、抗Sm抗体があげられ、ループス腎炎との関連が強く、これらの存在が診断基準の一つとなっている。その他抗リン脂質抗体（血栓症、流死産）、抗U１RNP抗体（レイノー現象、肺高血圧）、抗SS-A抗体（ディスコイド疹、乾燥症状）、抗PCNA抗体・抗リボゾームP抗体（中枢神経症状）等SLEの臨床症状と関連した多くの自己抗体が出現する。
SLE患者の30〜40％は、抗カルジオリピン抗体やループス抗凝固因子といった抗リン脂質抗体をもち、血栓形成による脳梗塞や心筋梗塞の発症率が高くなっている。本発明者らは、SLE患者において出現している自己抗体の中で、脳梗塞及び心筋梗塞の診断に有益なタンパク質、特に脳梗塞の診断に有益なタンパク質が存在することを予想し、実験によりその存在を新知見として見いだし、かかる事実に基づいて本発明を完成させた。
即ち、本発明者らは、全身性エリテマトーデス患者血清を用いてプロトアレイ法によるスクリーニングを行い、該血清と陽性反応を示す複数のタンパク質を抗原タンパク質として同定し、それらの抗原タンパク質由来の合成ペプチドの中から脳梗塞や心筋梗塞の患者血清抗体と特異的に反応する４種類のペプチドを選別することに成功し、本発明を完成させるに至った。
本発明において、脳梗塞や心筋梗塞患者体液中の自己抗体と結合し、脳梗塞及び心筋梗塞の診断に用いることができる抗原ペプチドはそれぞれ以下に示すタンパク質に由来するものである。
配列番号113 SOSTDC1-156 (biotin-KITVVTACKCKRYTR)
配列番号79 CTNND1-211 (biotin-LRNVSSERSEARRKL)
配列番号57 CLDND1-69 (biotin-FRYNGTVGLWRRCIT)
配列番号63 CCNG2-231 (biotin-KKHSKINDTEFFYWR)
即ち、SOSTDC1(配列番号113)、CTNND1(配列番号79)、CLDND1(配列番号57)、CCNG2(配列番号63)は脳梗塞によく反応するペプチドである。
配列番号79 CTNND1-211 (biotin-LRNVSSERSEARRKL)
配列番号57 CLDND1-69 (biotin-FRYNGTVGLWRRCIT)
配列番号63 CCNG2-231 (biotin-KKHSKINDTEFFYWR)
即ち、SOSTDC1(配列番号113)、CTNND1(配列番号79)、CLDND1(配列番号57)、CCNG2(配列番号63)は脳梗塞によく反応するペプチドである。
また複数の疾患の観点から、上記４つのペプチドを検討すれば、SOSTDC1(配列番号113)は脳梗塞によく反応し、CTNND1(配列番号79)は心筋梗塞によく反応し、CLDND1(配列番号57)は脳梗塞と心筋梗塞とによく反応し、CCNG2(配列番号63)は糖尿病によく反応する。
それぞれのタンパク質については、以下の機能が知られている。
SOSTDC1：sclerostin domain containing 1 (Accession No. NM_015464)の略称。N端が糖化され、C端には cystine knot-like ドメインがあり、分泌される。bone morphogenetic protein (BMP)に直接結合し、BMPと受容体の結合を阻害し、BMPによる細胞増殖、分化、細胞死を抑制する。即ち、SOSTDC1はBMPのアンタゴニストとして働く。
CTNND1：catenin (cadherin-associated protein), delta 1 (Accession No. NM_001085458)の略称。Armadilloタンパク質ファミリーのメンバー。細胞接着タンパク質であるカドヘリンからのシグナルを細胞内に伝える働きをする。
CLDND1：claudin domain containing 1 (Accession No. NM_001040181)の略称。密着結合に関わるclaudinのドメインを持つタンパク質。CLDND1自体の機能は未知。
CCNG2：cyclin G2 (Accession No. NM_004354) の略称。サイクリンファミリーのメンバー。cdkを活性化し、細胞周期を調節する。特に、DNA傷害の後のG2/Mチェックポイントでの細胞周期停止に関与する。
また、本発明の抗原ペプチドには、配列番号113、79、57、及び63に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、脳梗塞又は心筋梗塞患者体液中の自己抗体と結合活性を有するペプチド又はタンパク質が含まれる。
上記の「脳梗塞又は心筋梗塞患者体液中の自己抗体」とは、脳梗塞又は心筋梗塞患者の体液中に存在し、脳梗塞又は心筋梗塞特異抗原ペプチドと結合する抗体IgGを意味する。また、「脳梗塞又は心筋梗塞患者体液中の自己抗体との結合活性」とは、例えば、脳梗塞又は心筋梗塞患者血清と反応させたとき抗原抗体反応により免疫複合体を形成することのできる抗原活性をいい、この活性は、例えば、ELISA法等により確認することができる。また、「脳梗塞又は心筋梗塞患者体液中の自己抗体との結合活性を有する」とは、上記の各配列番号に記載のアミノ酸配列を有するペプチドが保持する該活性と実質的に同等であることをいう。
脳梗塞の診断キットに用いられる本発明の抗原ペプチドは、脳梗塞患者体液(例えば、血清）中の自己抗体を認識し、結合する機能を有する。
脳梗塞特異抗原に対する自己抗体をマーカーとする場合、本発明の抗原ペプチドを被験試料と接触させ、該被験試料に存在する前記抗体を検出、定量することによって脳梗塞の診断を行うことができる。
また複数の疾患の観点からは、SOSTDC1(配列番号113)は脳梗塞によく反応し、CTNND1(配列番号79)は心筋梗塞によく反応し、CLDND1(配列番号57)は脳梗塞と心筋梗塞とによく反応し、CCNG2(配列番号63)は糖尿病によく反応するので、各配列番号で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを４種類組み合わせて用いて診断できる。
抗体検出用ELISA用の診断キットの場合は、構成試薬としては、例えば、本発明の抗原タンパク質、酵素標識したヒト免疫グロブリンに対する二次抗体、基質液等を含有する。抗原ペプチドは予め固相に固定化されていてもよく、あるいは用時に固相に固定化する形態であってもよい。この場合、診断キットに抗原ペプチドを固定化するための固相が含まれていてもよい。また、凝集反応用の診断キットの場合は、抗原ペプチドを固定化した担体粒子を含有する。また、本発明の抗原ペプチドは、これらの複数種を高密度に貼り付けたペプチドアレイとしてもよく、このようなペプチドアレイも本発明の診断キットに含まれる。この場合、キットには、質量分析計、測定・解析に必要なソフト、該ソフトを導入したコンピューター等が含まれていてよい。
被験試料としては、脳梗塞もしくは心筋梗塞特異抗原に対する自己抗体が検出可能なものであればいかなるものでもよいが、例えば、血液、血漿、血清、滑膜液、リンパ液、関節液、腹水、唾液、髄液、及びこれらから得られた分画成分等が挙げられる。
「診断」とは、被験者が脳梗塞又は心筋梗塞を発症しているか否かの判定、将来的に脳梗塞又は心筋梗塞を発症する危険性が存在するか否かの判定、治療の効果の判定、あるいは治療後に脳梗塞、あるいは心筋梗塞を再発する危険性が存在するか否かの判定を意味する。
脳梗塞あるいは心筋梗塞特異抗原に対する抗体マーカーが陽性とは、脳梗塞又は心筋梗塞患者体液中に特異的に存在する抗体の量あるいは濃度が、健常者又は他の自己免疫疾患の患者に比べて有意に高い抗体をいう。
SOSTDC1(配列番号113)、CTNND1(配列番号79)、CLDND1(配列番号57)、及び、CCNG2(配列番号63)の発現量の測定は、特に限定されるものではなく、単にペプチドの有無を検出するものであってもよく、またペプチドの発現量を相対的又は絶対的に決定するものでもよい。ペプチドの発現量の測定は、免疫学的手法によるのが好適であり、例えば、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素等による検出又は定量との組み合わせ（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、酵素免疫測定吸着法(ELISA)、ドット・ブロッティング法等により行うことができる。
本発明においては、上記のようにして測定される抗原抗体反応に基づく物理量を、脳梗塞又は心筋梗塞の臨床指標として利用する。脳梗塞又は心筋梗塞の患者における抗原−抗体複合体量は、健常者におけるそれと対比して、有意に増加し、また、疾患の治療が進むに伴って低下する。従って、この抗原−抗体複合体量及びその変化、特に抗原−抗体複合体量の経時的変化を臨床指標とすることによって、脳梗塞又は心筋梗塞の発症確率を推定することができる。
本発明の抗原ペプチドを用いて脳梗塞及び心筋梗塞を診断する方法を、好ましい態様としてエンザイムイムノアッセイ法、凝集性反応法、イムノクロマト法、AlphaLISA法を例にあげて具体的に説明する。
(1)エンザイムイムノアッセイ法
エンザイムイムノアッセイ法は、被験試料中の合成ペプチド抗原に対する自己抗体を、固相に固定化された抗原タンパク質と反応させ、ヒト免疫グロブリンに対する標識二次抗体を添加し、自己抗体に結合した標識二次抗体を測定することによって行う。
エンザイムイムノアッセイ法は、被験試料中の合成ペプチド抗原に対する自己抗体を、固相に固定化された抗原タンパク質と反応させ、ヒト免疫グロブリンに対する標識二次抗体を添加し、自己抗体に結合した標識二次抗体を測定することによって行う。
抗原ペプチドを固定化させる固相としては、例えばアビジン化ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、フッ素樹脂、ガラス、金属等が使用できる。担体の形状としては、プレート、ビーズ、セル、試験管等が挙げられる。好ましくは、エンザイムイムノアッセイ用のマイクロタイタープレート（96穴マイクロタイタープレート）等の市販の固相が使用できる。抗原ペプチドを予めビオチン化しておき、アビジン化した固相と接触させ、4〜37℃にて１〜24時間放置して抗原ペプチドを固定化する。このとき、非特異的吸着を防ぐために、1〜10%のアルブミン、ゼラチン、粉ミルク又はウシ胎児血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、又はトリス緩衝液（TBS）等の緩衝液をブロッキング溶液として用い、未吸着部分をブロッキングすることが好ましい。固定化後、固相を適当な緩衝液で洗浄する。
被験試料は、インキュベーションの前に10〜5000倍程度に希釈する。上記のようにして調製した固相に希釈した被験試料を添加し、インキュベーションすることにより、被験試料中に存在する脳梗塞、又は心筋梗塞特異抗体（一次抗体）を抗原と反応させる。インキュベーションは、4〜37℃にて1〜24時間、好ましくは16時間程度行う。反応後、反応液を除去し、固相を洗浄する。
次に、ヒト免疫グロブリンに対する二次抗体を添加する。二次抗体は、ヒト免疫グロブリンに対する抗体であり、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質等で標識したものを使用することができる。これらの中でも、酵素標識された二次抗体が好ましく、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ等の酵素で標識したヤギ抗ヒト免疫グロブリン、ウサギ抗ヒト免疫グロブリン、ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンを用いることができる。二次抗体はインキュベーションの前に1000〜10000倍程度に希釈する。反応は、4〜37℃にて1〜2時間程度行う。反応終了後、反応液を除去し、固相を洗浄する。
二次抗体の測定は、使用した二次抗体の標識物質の種類に応じて公知の方法に従って行うことができる。酵素標識された二次抗体を用いた場合は、選択した酵素に応じてそれぞれ公知の発色剤を添加することにより発色反応を行う。例えば、ペルオキシダーゼを用いる場合は、o-フェニレンジアミン、ABTS〔2,2'-アジノ-ビス-（3'-エチルベンゾジアゾリンスルホン酸）〕等の基質と過酸化水素とを、アルカリ性ホスファターゼを用いる場合は、p-ニトロフェニルリン酸、４−メチルウンベフェリルリン酸等の基質を、β-ガラクトシダーゼを用いる場合は、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド、４-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシド等の基質を発色剤として使用すればよい。被験試料中の自己抗体量に依存して生じた発色を、分光光度計、蛍光光度計等を用いて反応液の吸光度を測定することにより被験試料中の自己抗体を定量することができる。
(2)凝集反応法
凝集反応法は、被験試料中の脳梗塞又は心筋梗塞特異抗原に対する自己抗体を、担体粒子上に固定化された本発明の抗原ペプチドと反応させ、該抗原ペプチドと自己抗体との反応により生じる凝集を測定することにより行う。担体粒子としては、例えばポリスチレンラテックス、カオリン、ベントナイト、炭素末、ヒツジ、ニワトリ等の赤血球等を使用することができる。抗原ペプチドを担体粒子上に固定化する方法は公知の方法を適用することができる。例えば、タンニン酸、グルタルアルデヒド、ビスアゾベンジジン、カルボジイミド類、キノン類、塩化クロム類等のカップリング剤を使用する方法、物理的吸着による方法等により行うことができる。
凝集反応法は、被験試料中の脳梗塞又は心筋梗塞特異抗原に対する自己抗体を、担体粒子上に固定化された本発明の抗原ペプチドと反応させ、該抗原ペプチドと自己抗体との反応により生じる凝集を測定することにより行う。担体粒子としては、例えばポリスチレンラテックス、カオリン、ベントナイト、炭素末、ヒツジ、ニワトリ等の赤血球等を使用することができる。抗原ペプチドを担体粒子上に固定化する方法は公知の方法を適用することができる。例えば、タンニン酸、グルタルアルデヒド、ビスアゾベンジジン、カルボジイミド類、キノン類、塩化クロム類等のカップリング剤を使用する方法、物理的吸着による方法等により行うことができる。
凝集反応は、ラテックス凝集反応、受身凝集反応で通常用いられる方法に従って行えばよい。例えば、マイクロプレートのウェルに被験試料の希釈系列をつくり、各ウェルに本発明のタンパク質を固定化した担体粒子を加えて混合し、１〜２時間静置し、凝集反応を観察する。既知の抗体価を有する標準試料と比
較することにより被験試料中の自己抗体を定量することができる。
較することにより被験試料中の自己抗体を定量することができる。
(3)イムノクロマト法
イムノクロマト法は毛細管現象を応用した免疫測定法であり、例えばサンドイッチ法を利用したイムノクロマト法では、対象抗原に特異的に結合する第１抗体を特定の領域に固定した不溶性薄膜状支持体（例えば、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜など）中に、対象抗原と特異的に結合する標識化第２抗体と、対象抗原を含む可能性のある検体溶液とを展開し、不溶性薄膜状支持体の第１抗体を固定した領域上で、対象抗原との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色等の信号を検出し、対象抗原を測定する。なお、標識としては、例えば、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子を使用することができる。
イムノクロマト法は毛細管現象を応用した免疫測定法であり、例えばサンドイッチ法を利用したイムノクロマト法では、対象抗原に特異的に結合する第１抗体を特定の領域に固定した不溶性薄膜状支持体（例えば、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜など）中に、対象抗原と特異的に結合する標識化第２抗体と、対象抗原を含む可能性のある検体溶液とを展開し、不溶性薄膜状支持体の第１抗体を固定した領域上で、対象抗原との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色等の信号を検出し、対象抗原を測定する。なお、標識としては、例えば、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子を使用することができる。
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでな
い。
い。
（実施例１）SLE特異抗原の同定
(1)プロトアレイを用いた一次スクリーニング
SLE患者血清は本人又は家族の同意（インフォームドコンセント）を得て、独立行政法人 国立病院機構 下志津病院において採取した。脳梗塞患者血清、心筋梗塞患者血清、糖尿病患者血清及び健常者検体は千葉大学附属病院及び下志津病院において同様に採取した。
(1)プロトアレイを用いた一次スクリーニング
SLE患者血清は本人又は家族の同意（インフォームドコンセント）を得て、独立行政法人 国立病院機構 下志津病院において採取した。脳梗塞患者血清、心筋梗塞患者血清、糖尿病患者血清及び健常者検体は千葉大学附属病院及び下志津病院において同様に採取した。
一次スクリーニングとして、SLE患者血清（6検体）と健常者血清（5検体）を用いて、血清中の免疫グロブリンG抗体が結合する抗原タンパク質のスクリーニングを行なった。プロトアレイ法により患者血清5検体以上と反応し、健常者血清5検体以上と反応しない抗原タンパク質として、SOSTDC1、CTNND1等の67種類を同定した（表１）。
選別された抗原タンパク質について、抗原部位（エピトープ）を予測し、その配列を持つペプチド171種類を人工合成した（表２〜表５）。ペプチドのアミノ末端をビオチン化した未精製品を用いた。
それらの合成ペプチドを用いて、AlphaLISA法により、血清抗体レベルを測定した。その結果、健常者血清に比べ、SLE患者血清において以下の合成ペプチドに対する抗体レベルは有意に高かった。
配列番号113 SOSTDC1-156 (biotin-KITVVTACKCKRYTR)
配列番号79 CTNND1-211 (biotin-LRNVSSERSEARRKL)
配列番号57 CLDND1-69 (biotin-FRYNGTVGLWRRCIT)
配列番号63 CCNG2-231 (biotin-KKHSKINDTEFFYWR)
配列番号171 FOXJ2-426 (biotin-KMVNRLNWSSIEQSQ)
配列番号55 TFAM-231 (biotin-LRRTIKKQRKYGAEE)
配列番号128 TOP3B-628 (biotin-HRFMKYIQAKPSRLH)
配列番号87 MYBBP1A-1134 (biotin-LYWQAMKTLGVQRPK)
配列番号88 MYBBP1A-1306 (biotin-IRSPSLLQSGAKKKA)
配列番号76 KIF12-203 (biotin-CVSPSAQCLPETLST)
結果を表６及び表７に示す。表６及び表７は、AlphaLISA法で調べた血清抗体レベルを示すものであり、SLE患者と健常者とを比較して示している。表では、各グループの平均値、SD、平均値＋2SD（カットオフ値）、総数、陽性数、陽性率が示されている。健常者検体の値の平均値＋2SDをカットオフ値に設定した時の各グループの陽性数（P Positive No.）と陽性率（P Positive (%)）も示されている。P(SLE vs HD)は、健常者検体と各グループの t testのP値を示す。
配列番号79 CTNND1-211 (biotin-LRNVSSERSEARRKL)
配列番号57 CLDND1-69 (biotin-FRYNGTVGLWRRCIT)
配列番号63 CCNG2-231 (biotin-KKHSKINDTEFFYWR)
配列番号171 FOXJ2-426 (biotin-KMVNRLNWSSIEQSQ)
配列番号55 TFAM-231 (biotin-LRRTIKKQRKYGAEE)
配列番号128 TOP3B-628 (biotin-HRFMKYIQAKPSRLH)
配列番号87 MYBBP1A-1134 (biotin-LYWQAMKTLGVQRPK)
配列番号88 MYBBP1A-1306 (biotin-IRSPSLLQSGAKKKA)
配列番号76 KIF12-203 (biotin-CVSPSAQCLPETLST)
結果を表６及び表７に示す。表６及び表７は、AlphaLISA法で調べた血清抗体レベルを示すものであり、SLE患者と健常者とを比較して示している。表では、各グループの平均値、SD、平均値＋2SD（カットオフ値）、総数、陽性数、陽性率が示されている。健常者検体の値の平均値＋2SDをカットオフ値に設定した時の各グループの陽性数（P Positive No.）と陽性率（P Positive (%)）も示されている。P(SLE vs HD)は、健常者検体と各グループの t testのP値を示す。
(2)脳梗塞、心筋梗塞特異抗原の同定
次に、上記で選別されたペプチド抗原について、高純度（90％以上）のペプチドを合成した。それらに対する脳梗塞又は心筋梗塞の患者血清における抗体レベルを AlphaLISA 法により測定した。
次に、上記で選別されたペプチド抗原について、高純度（90％以上）のペプチドを合成した。それらに対する脳梗塞又は心筋梗塞の患者血清における抗体レベルを AlphaLISA 法により測定した。
その結果、SOSTDC1-156は脳梗塞検体において陽性率が高く、一方、CTNND1-211は心筋梗塞検体において陽性率が高く、CLDND1-69は脳梗塞と心筋梗塞のどちらにもよく反応していた（表８及び表９）。表８及び表９は、AlphaLISA法で調べた血清抗体レベルであり、脳梗塞患者、心筋梗塞患者と健常者との比較を示す。
また、CCNG2-231は糖尿病によく相関していることが判明した（表１０及び表１１）。表１０及び表１１は、AlphaLISA法で調べた血清抗体レベルであり、脳梗塞患者、心筋梗塞患者と健常者との比較を示す。
これらの結果から、SOSTDC1-156をA、CTNND1-211をB、CLDND1-69をC、CCNG2-231をDとすると、診断の一例であるが、AとCが陽性なら脳梗塞、BとCが陽性なら心筋梗塞の発症の可能性が高いと診断される。また、Dが陽性なら、その原因は糖尿病、またそれによる動脈硬化の進行である可能性が考えられる。診断例を表１２に示す。
脳梗塞や心筋梗塞の診断に有益である。
配列番号１〜１７１：合成ペプチド
Claims (4)
- 配列番号113に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号79に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号57に示すアミノ酸配列からなるペプチド、及び、
配列番号63に示すアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも何れか１つを含むことを特徴とする脳梗塞の診断マーカー。 - 配列番号113、79、57、及び63で表わされるアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか一つのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の脳梗塞の診断マーカー。
- 配列番号113に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号79に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号57に示すアミノ酸配列からなるペプチド、及び、
配列番号63に示すアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも何れか１つを含むことを特徴とする脳梗塞の診断キット。 - 配列番号113、79、57、及び63で表わされるアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか一つのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載の脳梗塞の診断キット。
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