CN114594273B

CN114594273B - 一种脑梗塞生物标记物及其应用

Info

Publication number: CN114594273B
Application number: CN202210495578.3A
Authority: CN
Inventors: 钟金; 胡学军; 曹利勤; 朱树勇
Original assignee: Shanghai Xiansai Biotechnology Co ltd; Shanghai Zhongqi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Xiansai Biotechnology Co ltd; Shanghai Zhongqi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-09
Filing date: 2022-05-09
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2042-05-09
Also published as: CN114594273A; CN116068191A

Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种脑梗塞生物标记物及其应用。具体技术方案为：一种脑梗塞生物标记，包括与脑梗塞相关的抗原蛋白片段，至少包括：ICAM1蛋白片段和/或MMP1蛋白片段。所述ICAM1蛋白片段的序列如SEQ ID NO.8，所述MMP1蛋白片段的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的抗原或其组合可用于测试来自受试者的生物学样品中针对上述抗原组合的自身抗体的存在或存在水平，从而高效、简便地评估所述受试者患有脑梗塞的风险。

Description

一种脑梗塞生物标记物及其应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种脑梗塞生物标记物及其应用。

背景技术

脑梗塞，又称缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke），是指因脑部血液供应障碍，缺血、缺氧所导致的局部性脑组织的缺血性坏死或软化。脑梗塞的临床常见类型有脑血栓形成、腔隙性梗死和脑栓塞等，脑梗塞占全部脑卒中的80%。脑梗塞作为一种突发性脑疾病可以发生在任何年龄，坏死程度随发生部位及大小不同而有差别。常见于45～70岁中老年人，发病急，多无前驱症状，极易导致死亡。治疗后容易留下严重的后遗症，易复发，严重的出现肢体功能障碍，语言障碍和智力障碍。脑梗塞不仅给人类健康和生命造成极大威胁，而且给患者、家庭及社会带来极大的痛苦和沉重的负担。

脑梗塞的黄金治疗时间为发病后1～3小时以内。及时诊断和治疗对降低治疗后遗症，减少病人死亡率具有决定性意义。目前对脑梗塞的诊断方式主要是临床症状，结合CT、MRI等检查方法。然而，脑梗塞起病4～6小时内，只有部分病例可见边界不清的稍低密度灶，而大部分的病例在24小时后才能显示边界较清的低密度灶，已经远远超过了治疗的黄金窗口期。即：现有检查手段都需要发病后较长时间才能检测到病灶，容易延误病情，给病人带来严重的后遗症。因此，临床急需能够快速检查甚至提前预警脑梗塞风险的有效工具。

然而，探索能够快速诊断脑梗塞的生物标志物，特别是便捷的血清标志物，仍然是一项艰巨的任务。有研究人员利用脑梗塞病人血清中脑部应急反应产生的代谢产物或血清中相关抗原蛋白的浓度变化来研究它们与脑梗塞的相关性。这些标志物与脑梗塞都有一定的相关性。但是也存在明显的不足：多数标志物特异性不理想，在很多其它疾病中也广泛存在；部分标志物分子较大，不能及时、有效地通过血脑屏障。而且，由于脑梗塞发病的原因多种多样，具体的机理也不明确，单一的自身抗体指标无法有效覆盖各种病例。因此，现有标志物尚无法直接在临床上进行应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种脑梗塞生物标记物及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种脑梗塞生物标记，包括与脑梗塞相关的抗原蛋白片段，至少包括：ICAM1蛋白片段和/或MMP1蛋白片段。

优选的，所述ICAM1蛋白片段的序列如SEQ ID NO.8；和/或，所述MMP1蛋白片段的序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，包括BDNF蛋白片段和ICAM1蛋白片段。

优选的，所述BDNF蛋白片段的序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，包括NF155蛋白片段，所述NF155蛋白片段的序列如SEQ ID NO.7所示。

优选的，包括NMDAR2A蛋白片段，所述NMDAR2A蛋白片段的序列如SEQ ID NO.9所示。

优选的，包括PRL蛋白片段和PDCD11蛋白片断，所述PRL蛋白片段的序列如SEQ IDNO.6所示，所述PDCD11蛋白片断的序列如SEQ ID NO.10所示。

优选的，包括NF155蛋白片段、NMDAR2A蛋白片段、NMDAR2B蛋白片段、PRL蛋白片段、PDCD11蛋白片段和LIMS4蛋白片段，所述NF155蛋白片段序列如SEQ ID NO.7所示，所述NMDAR2A蛋白片段序列如SEQ ID NO.9所示，所述NMDAR2B蛋白片段序列如SEQ ID NO.3所示，所述PRL蛋白片段序列如SEQ ID NO.6所示，所述PDCD11蛋白片断序列如SEQ ID NO.10所示，所述LIMS4蛋白片段序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，包括NF155蛋白片段、PRL蛋白片段、ICAM1蛋白片段、PDCD11蛋白片断和LIMS4蛋白片段和PUM3蛋白片段，所述NF155蛋白片段序列如SEQ ID NO.7所示，所述PRL蛋白片段序列如SEQ ID NO.6所示，所述ICAM1蛋白片段序列如SEQ ID NO.8所示，和/或，所述PDCD11蛋白片断序列如SEQ ID NO.10所示，所述LIMS4蛋白片段序列如SEQ ID NO.1所示，所述PUM3蛋白片段序列如SEQ ID NO.4所示。

相应的，利用所述脑梗塞生物标记制备的检测试纸、试剂、试剂盒。

本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种用于检测脑梗塞相关自身抗体的蛋白质抗原或抗原组合物，其中涉及的蛋白质抗原或其片段可利用人工合成或基因重组的方法制得。例如，合成蛋白质抗原或其片段的编码DNA，以合成DNA为模板，设计引物，通过PCR、酶切、连接等分子克隆手段，将所述蛋白质抗原或其片段的基因片段克隆到表达质粒上，然后通过大肠杆菌、酵母或细胞进行表达，再经过层析纯化得到目标蛋白。同时，还可选择性地在蛋白抗原或其片段上增加GST、AVI、HIS、c-myc等标签。增加这些标签可以方便的对蛋白质抗原进行提纯或标记，但本质上并不会改变抗原与其自身抗体的结合特性。

本发明提供的抗原或其组合可用于测试来自受试者的生物学样品中针对上述抗原组合的自身抗体的存在或存在水平，从而判断所述受试者是否患有脑梗塞。可用于预测所述受试者是否具有罹患脑梗塞的风险；评估所述受试者所患有的脑梗塞的进展；或者判断所述受试者是否具有再发生脑梗塞的风险，还可用于辅助鉴别脑出血与脑梗塞，指导临床药物的使用。其中，所述生物学样品可以是血清、血浆、全血、唾液、口腔粘膜拭子、尿液、淋巴液、脑脊液等。根据具体情况，所述生物学样品可经提取、稀释、富集等手段进行预处理。使用方法多样、简便易操作。在将本发明提供的抗原组合用于上述测试时，通过使所述抗原组合中的蛋白质或其片段与可能存在的相应自身抗体发生结合或相互作用，来测试该自身抗体的存在或存在水平。

本发明提供的蛋白质抗原或其组合还可用于制备脑梗塞相关自身抗体检测试剂或脑梗塞诊断试剂。应当理解的，所述蛋白质抗原组合还可用于制备脑梗塞相关自身抗体检测试剂盒，所述试剂盒可以参照本发明实施例中使用所述蛋白质抗原组合进行脑梗塞相关自身抗体检测时的方法和试剂制备，也可根据需要进行相应调整。

综上，本发明提供了一种蛋白质抗原组合，其可用于脑梗塞的检测或诊断，尤其适用于脑梗塞发病前的风险评估和预测；并可根据需要进一步制备为相关试剂或试剂盒。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。

实施例一：抗原的重组载体构建、表达和纯化

1、抗原的选择。选择表1所示与脑梗塞高度相关的抗原蛋白，其数据库ID具体如表1所示。需要说明的是，发明人团队并非只对如下抗原蛋白进行了相关的实验选择，而是出于篇幅考虑只展示了部分具有代表性的抗原蛋白。另外，与脑梗塞相关的抗原蛋白非常多，并非选择任意相关蛋白均可有效鉴别脑梗塞；发明人团队有自己独有的筛选方法，出于商业秘密考虑，本文对具体筛选方法不予公开。

表1 待测蛋白的数据库ID对应表

2、抗原重组载体的构建和表达。以人类cDNA文库（购自Invitrogen公司）或者全基因合成DNA为模板，分别设计引物，通过PCR、酶切、连接等分子克隆手段，将所述蛋白的基因片段克隆到pET28质粒上。同时，在蛋白N-端增加HIS、c-myc等标签，形成融合蛋白。将得到的重组表达载体通过DNA测序鉴定，确认包含正确的蛋白基因片段。需要说明的是：添加标签只是为了方便识别和提取蛋白，并未对蛋白作为抗原时的功能产生决定性影响，使用时，不添加标签或根据需要添加其它标签或采取其他标记/识别手段均可。

将上述包含蛋白基因片段的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取克隆接种至LB培养基中，37℃摇床培养。当菌体密度达到OD₆₀₀约为0.8时，降温至16℃，在每个LB培养基中加入0.1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG），诱导表达过夜，获得菌体。

3、抗原的纯化。离心收集诱导表达的所述菌体，用PBS漂洗两遍。用裂解液（每g菌体加5～10mL裂解液）重悬并分散菌体，冰浴，超声破碎菌体（超声功率200W，破碎5s，休息5s）。破碎后13000rpm，10℃，离心20分钟，取上清，经Ni柱亲和层析和分子筛层析两步纯化后，采用SDS-PAGE电泳分析，确认蛋白的分子量、纯度，用Bradford法测定浓度后，保存在-80℃备用。即获得纯化后的待测蛋白。

实施例二：从待测蛋白中筛选获得候选抗原

1、本实施例中使用的溶液和试剂如下：

（1）包被缓冲液为PBS缓冲液，pH7.4。其制备方法为：准确称取3.58g Na₂HPO₄·12H₂O、0.23g KH₂PO₄·2H₂O、0.2g KCl、8.0g NaCl，溶解于水中，加水定容至1L。

（2）封闭液/样本稀释液/抗体稀释液：将10g BSA（牛血清白蛋白）溶解于包被缓冲液中，加水定容至1L。

（3）洗涤液：现配现用，使用前在包被缓冲液中加入0.5% Tween20(V/V)，pH=7.4。

（4）TMB显色剂，购自KPL公司。

（5）终止液：1M盐酸。

2、固相包被待测蛋白。用包被缓冲液将实施例一获得的纯化后的各待测蛋白稀释至5μg/mL，加至96孔板，每孔50μL，4℃包被过夜。次日倒掉溶液，甩干，用洗涤液洗三次，每次每孔200μL。然后每孔加入200μL封闭液，室温孵育1h后，将封闭液倒掉，甩干，再用洗涤液洗三次，每次每孔200μL，并再次甩干；获得位于96孔板中的固相包被的抗原。

3、加入待测样本。将待测人血清用样本稀释液稀释100倍后，加入所述含待测蛋白的96孔板，每孔加稀释后的待测样本50μL。随后将96孔板置于微孔板振荡仪上，室温振荡孵育1h；甩干，用洗涤液洗三次，每次每孔200μL，并再次甩干。

4、加入酶标二抗。将1.0mg/mL辣根过氧化物酶标记的重组羊抗人免疫球蛋白G抗体(购自Jackson ImmunoResearch Inc.)用抗体稀释液稀释20000倍后，加入步骤3处理后的96孔板中，每孔加50μL。随后将96孔板置于微孔板振荡仪上，室温振荡孵育0.5h，将板甩干，用洗涤液洗三次，每次每孔200μL，并再次甩干。

5、显色反应及光密度值读数。在步骤4处理后的96孔板中，每孔加50μL TMB显色剂，振荡15s，室温下避光反应15min，再加入50μL终止液；然后用酶标仪读取450nm波长的吸收值，获得每个待测样本的检测信号（S）。

6、敏感性和特异性分析。分别取47例阳性样本（确诊为脑梗塞患者的血清）和48例阴性样本（健康受试者血清），按上述方法（450nm波长的吸收值）测定每个样本的检测信号(S)。以阴性样本为阴性参考样本，计算所有阴性参考样本检测信号(S)的平均值（M)及标准差(SD)，以M+3SD为Cut Off值。将检测信号(S)≥Cut Off值的样本（S≥M+3SD）定为阳性；将检测信号(S)＜Cut Off值的样本（S＜M+3SD）定为阴性。

基于样本阳性和阴性结果计算特异性和敏感性。其中，特异性是指健康受试者样本被正确地判定为阴性的比例，即在阴性样本中被正确地判定为阴性的数量除以阴性样本总数。敏感性是指脑梗塞患者样本被正确地判定为阳性的比例，即在阳性样本中被判定为阳性的数量除以阳性样本总数。通过计算得出使用每个被测蛋白作为抗原进行样本检测时的敏感性和特异性。结果如表2所示。

表2 各被测蛋白作为抗原的敏感性和特异性展示表

7、按下述标准：敏感性＞8%且特异性＞90%或敏感性＞5%且特异性＞98%，从上述各被测蛋白中选择筛选出敏感性和特异性较好的蛋白作为候选抗原。筛选结果如表3所示。

表3 从被测蛋白中筛选出的候选抗原展示表

实施例三：候选抗原的活性位点筛选

对实施例二获得的所述候选抗原的氨基酸序列及其结构进行分析，经大量前期试验后，从各所述候选抗原中选择不同的序列片段和抗原表位。所选择的序列片段如表4所示。

按照实施例一的方法，对表4中各蛋白片段进行表达载体构建、表达和纯化，得到构建后的蛋白片段，再按实施例二的方法检测各构建后的蛋白片段作为抗原时的敏感性和特异性。与实施例一相同的是，此处虽然也在各蛋白片段中添加了一些标签，但添加标签的目的主要在于便于提取和识别，并未对蛋白片段作为抗原的功能产生实质性影响。使用添加标签前后的蛋白均可实现发明目的，实际使用时，本领域技术人员可以根据需要选择是否添加标签、及添加标签的种类。因此，本发明全文只提供了添加标签前的蛋白列。测试结果如表4所示。

表4 各候选抗原上截取的序列片段及敏感性和特异性对应表

根据表4的结果，结合不同抗原在体内的分布，进一步筛选出10种蛋白质片段，作为区分脑梗塞患者和健康受试者的候选抗原。筛选结果如表5所示。

表5各候选抗原的敏感性和特异性对照表

实施例四：候选抗原组合检测脑梗塞样本的效果展示

1、根据表5的筛选结果，从10种所述候选蛋白抗原片段中选择形成不同的抗原组合，结果如表6所示。需要说明的是，发明人并非只进行了表6的组合试验；发明人经过大量前期试验后才获得表6中所示的各抗原组合，因篇幅限制，只选取了部分效果较优的组合。

表6 各抗原组合对照表

2、取脑梗塞患者血清样本2564例，取正常的健康受试者血清样本3576例。参照实施例二的检测方法，分别使用表6中各组抗原组合对上述各样本进行敏感性和特异性检测。

抗原组合中，单个抗原的阳性和阴性的定义方法参照实施例二。抗原组合的整体敏感性和特异性定义方法如下：

对于一个抗原组合，当某个血清样本采用该组合中的任意一个抗原得到的检测信号为阳性检测信号时，该血清样本为阳性样本；否则该血清样本为阴性样本。

基于上述阳性和阴性定义方法，检测获得一个抗原组合检测得到的阳性和阴性结果，进而计算该抗原组合在患者样本中的敏感性。

其中，敏感性是指在脑梗塞患者样本总共被正确地判定为阳性的比例，即在所有脑梗塞患者样本中被判定为阳性的数量除以所有脑梗塞患者样本总数；特异性是指健康受试者样本被正确地判定为阴性的比例，即在健康受试者样本中，健康受试者样本中被判定为阴性的数量除以健康受试者样本总数。

各组抗原组合检测获得的敏感性和特异性结果如表7所示。

表7 各抗原组合检测脑梗塞样本的敏感性和特异性结果对照表

组合	敏感性	特异性
			组合1	55%	98%
组合2	64%	96%
			组合3	72%	96%
组合4	77%	96%
			组合5	85%	96%
组合6	72%	96%
			组合7	74%	96%

需要说明的是：表7结果是对大量样本检测后获得的实际结果，并未对结果进行任何的选择、修饰，一定程度上可直接反应应用到临床上的结果。在后期应用时，还可根据需要，从本发明提供的理想候选抗原或抗原组合物中选择一种或多种，制作成诊断试剂盒。

实施例五：候选抗原组合区分脑出血和脑梗塞的效果展示

脑出血与脑梗塞这两种疾病的临床症状极为相似，区别诊断比较困难。但是两者的发病本质是不同的，需要采取的临床治疗措施也有很大差异。临床上如果出现误诊，则很可能会给病人带来无法挽回的后果甚至生命危险。因此，对两者进行有效鉴别和区分具有重要的临床意义。

取脑出血患者血清样本94例，取正常的健康受试者血清样本96例。参照实施例四的检测方法，分别使用表6中各组抗原组合对上述各样本进行敏感性和特异性检测。各组抗原组合检测获得的敏感性和特异性结果如表8所示。本实施例中，敏感性的定义为：在脑出血患者样本总共被正确地判定为阳性的比例，即在所有脑出血患者样本中被判定为阳性的数量除以所有脑出血患者样本总数；特异性是指健康受试者样本被正确地判定为阴性的比例，即在健康受试者样本中，健康受试者样本中被判定为阴性的数量除以健康受试者样本总数。

表8 各抗原组合检测脑出血样本的敏感性和特异性结果对照表

组合	敏感性	特异性
			组合1	6.3%	97%
组合2	8.3%	97%
			组合3	9.4%	97%
组合4	10.4%	97%
			组合5	9.4%	97%
组合6	8.3%	97%
			组合7	10.4%	97%

对照表7和表8的结果，我们可以看出：7组抗原组合对脑梗塞样本的检出率很高，其中组合5的敏感性最高，达到85%；而各组合对脑出血样本的检出率都较低，最高仅为10.4%。因此，各抗原组合均可区分脑梗塞与脑出血。

实施例六：候选抗原组合区分心肌梗死和脑梗塞的效果展示

心肌梗塞和脑梗塞的发病机制原理基本相同，都是由于动脉血管狭窄或阻塞导致供血不足而出现心肌细胞或脑细胞缺血性损伤。因此，临床上要区分这两种疾病也存在一定难度。本发明通过大量筛选，获得与脑部组织具有高度相关性，而又与心肌组织相关性较低的抗原或其片断，从而实现对两种疾病的区分检测。

取心肌梗死患者血清样本96例，取正常的健康受试者血清样本94例。参照实施例四的检测方法，分别使用表6中各组抗原组合对上述各样本进行敏感性和特异性检测。各组抗原组合检测获得的敏感性和特异性结果如表9所示。本实施例中，敏感性的定义为：在心肌梗死患者样本总共被正确地判定为阳性的比例，即在所有心肌梗死患者样本中被判定为阳性的数量除以所有心肌梗死患者样本总数；特异性是指健康受试者样本被正确地判定为阴性的比例，即在健康受试者样本中，健康受试者样本中被判定为阴性的数量除以健康受试者样本总数。

表9 各抗原组合检测心肌梗死样本的敏感性和特异性结果对照表

组合	敏感性	特异性
			组合1	7.3%	98%
组合2	7.3%	98%
			组合3	10.4%	97%
组合4	15.6%	95%
			组合5	14.6%	94%
组合6	12.5%	94%
			组合7	14.6%	94%

对照表7和表9的结果，我们可以看出：各组合对心肌梗死样本的检出率都较低，最高仅为15.6%。因此，各抗原组合均可有效区分脑梗塞与心肌梗死。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海众启生物科技有限公司

上海先赛生物科技有限公司

<120> 一种脑梗塞生物标记物及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> LIMS4(161-181)

<400> 1

Leu Cys Gln Glu Val Leu Ala Asp Ile Gly Phe Val Lys Asn Ala Gly

1 5 10 15

Arg His Leu Cys Arg

20

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> MMP1（363-469）

<400> 2

Asp Ile Tyr Ser Ser Phe Gly Phe Pro Arg Thr Val Lys His Ile Asp

1 5 10 15

Ala Ala Leu Ser Glu Glu Asn Thr Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Val Ala

20 25 30

Asn Lys Tyr Trp Arg Tyr Asp Glu Tyr Lys Arg Ser Met Asp Pro Gly

35 40 45

Tyr Pro Lys Met Ile Ala His Asp Phe Pro Gly Ile Gly His Lys Val

50 55 60

Asp Ala Val Phe Met Lys Asp Gly Phe Phe Tyr Phe Phe His Gly Thr

65 70 75 80

Arg Gln Tyr Lys Phe Asp Pro Lys Thr Lys Arg Ile Leu Thr Leu Gln

85 90 95

Lys Ala Asn Ser Trp Phe Asn Cys Arg Lys Asn

100 105

<210> 3

<211> 646

<212> PRT

<213> NMDAR2B（839-1484）

<400> 3

Glu His Leu Phe Tyr Trp Gln Phe Arg His Cys Phe Met Gly Val Cys

1 5 10 15

Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Phe Ser Ile Ser Arg Gly Ile Tyr Ser

20 25 30

Cys Ile His Gly Val Ala Ile Glu Glu Arg Gln Ser Val Met Asn Ser

35 40 45

Pro Thr Ala Thr Met Asn Asn Thr His Ser Asn Ile Leu Arg Leu Leu

50 55 60

Arg Thr Ala Lys Asn Met Ala Asn Leu Ser Gly Val Asn Gly Ser Pro

65 70 75 80

Gln Ser Ala Leu Asp Phe Ile Arg Arg Glu Ser Ser Val Tyr Asp Ile

85 90 95

Ser Glu His Arg Arg Ser Phe Thr His Ser Asp Cys Lys Ser Tyr Asn

100 105 110

Asn Pro Pro Cys Glu Glu Asn Leu Phe Ser Asp Tyr Ile Ser Glu Val

115 120 125

Glu Arg Thr Phe Gly Asn Leu Gln Leu Lys Asp Ser Asn Val Tyr Gln

130 135 140

Asp His Tyr His His His His Arg Pro His Ser Ile Gly Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ser Ile Asp Gly Leu Tyr Asp Cys Asp Asn Pro Pro Phe Thr Thr Gln

165 170 175

Ser Arg Ser Ile Ser Lys Lys Pro Leu Asp Ile Gly Leu Pro Ser Ser

180 185 190

Lys His Ser Gln Leu Ser Asp Leu Tyr Gly Lys Phe Ser Phe Lys Ser

195 200 205

Asp Arg Tyr Ser Gly His Asp Asp Leu Ile Arg Ser Asp Val Ser Asp

210 215 220

Ile Ser Thr His Thr Val Thr Tyr Gly Asn Ile Glu Gly Asn Ala Ala

225 230 235 240

Lys Arg Arg Lys Gln Gln Tyr Lys Asp Ser Leu Lys Lys Arg Pro Ala

245 250 255

Ser Ala Lys Ser Arg Arg Glu Phe Asp Glu Ile Glu Leu Ala Tyr Arg

260 265 270

Arg Arg Pro Pro Arg Ser Pro Asp His Lys Arg Tyr Phe Arg Asp Lys

275 280 285

Glu Gly Leu Arg Asp Phe Tyr Leu Asp Gln Phe Arg Thr Lys Glu Asn

290 295 300

Ser Pro His Trp Glu His Val Asp Leu Thr Asp Ile Tyr Lys Glu Arg

305 310 315 320

Ser Asp Asp Phe Lys Arg Asp Ser Val Ser Gly Gly Gly Pro Cys Thr

325 330 335

Asn Arg Ser His Ile Lys His Gly Thr Gly Asp Lys His Gly Val Val

340 345 350

Ser Gly Val Pro Ala Pro Trp Glu Lys Asn Leu Thr Asn Val Glu Trp

355 360 365

Glu Asp Arg Ser Gly Gly Asn Phe Cys Arg Ser Cys Pro Ser Lys Leu

370 375 380

His Asn Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Gln Asn Ser Gly Arg Gln Ala

385 390 395 400

Cys Ile Arg Cys Glu Ala Cys Lys Lys Ala Gly Asn Leu Tyr Asp Ile

405 410 415

Ser Glu Asp Asn Ser Leu Gln Glu Leu Asp Gln Pro Ala Ala Pro Val

420 425 430

Ala Val Thr Ser Asn Ala Ser Thr Thr Lys Tyr Pro Gln Ser Pro Thr

435 440 445

Asn Ser Lys Ala Gln Lys Lys Asn Arg Asn Lys Leu Arg Arg Gln His

450 455 460

Ser Tyr Asp Thr Phe Val Asp Leu Gln Lys Glu Glu Ala Ala Leu Ala

465 470 475 480

Pro Arg Ser Val Ser Leu Lys Asp Lys Gly Arg Phe Met Asp Gly Ser

485 490 495

Pro Tyr Ala His Met Phe Glu Met Ser Ala Gly Glu Ser Thr Phe Ala

500 505 510

Asn Asn Lys Ser Ser Val Pro Thr Ala Gly His His His His Asn Asn

515 520 525

Pro Gly Gly Gly Tyr Met Leu Ser Lys Ser Leu Tyr Pro Asp Arg Val

530 535 540

Thr Gln Asn Pro Phe Ile Pro Thr Phe Gly Asp Asp Gln Cys Leu Leu

545 550 555 560

His Gly Ser Lys Ser Tyr Phe Phe Arg Gln Pro Thr Val Ala Gly Ala

565 570 575

Ser Lys Ala Arg Pro Asp Phe Arg Ala Leu Val Thr Asn Lys Pro Val

580 585 590

Val Ser Ala Leu His Gly Ala Val Pro Ala Arg Phe Gln Lys Asp Ile

595 600 605

Cys Ile Gly Asn Gln Ser Asn Pro Cys Val Pro Asn Asn Lys Asn Pro

610 615 620

Arg Ala Phe Asn Gly Ser Ser Asn Gly His Val Tyr Glu Lys Leu Ser

625 630 635 640

Ser Ile Glu Ser Asp Val

645

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> PUM3(477-490)

<400> 4

Val Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Ser Ile Ser Pro Ala Leu Asp

1 5 10 15

<210> 5

<211> 110

<212> PRT

<213> BDNF（19-128）

<400> 5

Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr

1 5 10 15

Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys

20 25 30

Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val

35 40 45

Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu

50 55 60

Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser

65 70 75 80

Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys

85 90 95

Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg

100 105 110

<210> 6

<211> 194

<212> PRT

<213> PRL（33-226）

<400> 6

Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg Asp Leu Phe Asp

1 5 10 15

Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu Ser Ser Glu Met

20 25 30

Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg Gly Phe Ile Thr

35 40 45

Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala Thr Pro Glu Asp

50 55 60

Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe Leu Ser Leu Ile

65 70 75 80

Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr His Leu Val Thr

85 90 95

Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile Leu Ser Lys Ala

100 105 110

Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Leu

115 120 125

Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn Glu Ile Tyr Pro

130 135 140

Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp Glu Glu Ser Arg

145 150 155 160

Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg Arg Asp Ser His

165 170 175

Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg Ile Ile His Asn

180 185 190

Asn Asn

<210> 7

<211> 1007

<212> PRT

<213> NF155（25-1031）

<400> 7

Ile Glu Ile Pro Met Asp Leu Thr Gln Pro Pro Thr Ile Thr Lys Gln

1 5 10 15

Ser Val Lys Asp His Ile Val Asp Pro Arg Asp Asn Ile Leu Ile Glu

20 25 30

Cys Glu Ala Lys Gly Asn Pro Ala Pro Ser Phe His Trp Thr Arg Asn

35 40 45

Ser Arg Phe Phe Asn Ile Ala Lys Asp Pro Arg Val Ser Met Arg Arg

50 55 60

Arg Ser Gly Thr Leu Val Ile Asp Phe Arg Ser Gly Gly Arg Pro Glu

65 70 75 80

Glu Tyr Glu Gly Glu Tyr Gln Cys Phe Ala Arg Asn Lys Phe Gly Thr

85 90 95

Ala Leu Ser Asn Arg Ile Arg Leu Gln Val Ser Lys Ser Pro Leu Trp

100 105 110

Pro Lys Glu Asn Leu Asp Pro Val Val Val Gln Glu Gly Ala Pro Leu

115 120 125

Thr Leu Gln Cys Asn Pro Pro Pro Gly Leu Pro Ser Pro Val Ile Phe

130 135 140

Trp Met Ser Ser Ser Met Glu Pro Ile Thr Gln Asp Lys Arg Val Ser

145 150 155 160

Gln Gly His Asn Gly Asp Leu Tyr Phe Ser Asn Val Met Leu Gln Asp

165 170 175

Met Gln Thr Asp Tyr Ser Cys Asn Ala Arg Phe His Phe Thr His Thr

180 185 190

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225 230 235 240

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Lys Ala Ala Pro Tyr Trp Leu Asp Glu Pro Lys Asn Leu Ile Leu Ala

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Pro Asn Pro Asn Arg Glu Val Ala Gly Asp Thr Ile Ile Phe Arg Asp

370 375 380

Thr Gln Ile Ser Ser Arg Ala Val Tyr Gln Cys Asn Thr Ser Asn Glu

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485 490 495

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530 535 540

Leu Lys Asp Asp Glu Pro Leu Tyr Ile Gly Asn Arg Met Lys Lys Glu

545 550 555 560

Asp Asp Ser Leu Thr Ile Phe Gly Val Ala Glu Arg Asp Gln Gly Ser

565 570 575

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645 650 655

Val Asn Ser Ala Val Leu His Leu Ser Pro Tyr Val Asn Tyr Gln Phe

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Arg Val Ile Ala Val Asn Glu Val Gly Ser Ser His Pro Ser Leu Pro

675 680 685

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Asp Val Lys Gly Glu Gly Thr Arg Lys Asn Asn Met Glu Ile Thr Trp

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Thr Pro Met Asn Ala Thr Ser Ala Phe Gly Pro Asn Leu Arg Tyr Ile

725 730 735

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Gly Val Val Gly Arg Leu Phe Pro Tyr Ser Asn Tyr Lys Leu Glu Met

865 870 875 880

Val Val Val Asn Gly Arg Gly Asp Gly Pro Arg Ser Glu Thr Lys Glu

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Arg Lys Val Tyr Glu Leu Ser Asn Val Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met

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Thr Val Tyr Trp Thr Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Ser

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100 105 110

Gly Ala Pro Arg Ala Asn Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys

115 120 125

Glu Leu Lys Arg Glu Pro Ala Val Gly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr

130 135 140

Thr Val Leu Val Arg Arg Asp His His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg

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Thr Glu Leu Asp Leu Arg Pro Gln Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Thr

165 170 175

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180 185 190

Gln Leu Val Ser Pro Arg Val Leu Glu Val Asp Thr Gln Gly Thr Val

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Leu Ala Leu Gly Asp Gln Arg Leu Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Asn

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Asp Ser Phe Ser Ala Lys Ala Ser Val Ser Val Thr Ala Glu Asp Glu

245 250 255

Gly Thr Gln Arg Leu Thr Cys Ala Val Ile Leu Gly Asn Gln Ser Gln

260 265 270

Glu Thr Leu Gln Thr Val Thr Ile Tyr Ser Phe Pro Ala Pro Asn Val

275 280 285

Ile Leu Thr Lys Pro Glu Val Ser Glu Gly Thr Glu Val Thr Val Lys

290 295 300

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305 310 315 320

Gln Pro Leu Gly Pro Arg Ala Gln Leu Leu Leu Lys Ala Thr Pro Glu

325 330 335

Asp Asn Gly Arg Ser Phe Ser Cys Ser Ala Thr Leu Glu Val Ala Gly

340 345 350

Gln Leu Ile His Lys Asn Gln Thr Arg Glu Leu Arg Val Leu Tyr Gly

355 360 365

Pro Arg Leu Asp Glu Arg Asp Cys Pro Gly Asn Trp Thr Trp Pro Glu

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Asn Ser Gln Gln Thr Pro Met Cys Gln Ala Trp Gly Asn Pro Leu Pro

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Ser Val Thr Val Thr Arg Asp Leu Glu Gly Thr Tyr Leu Cys Arg Ala

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435 440 445

Ser Pro Arg Tyr Glu

450

<210> 9

<211> 640

<212> PRT

<213> NMDAR2A（825-1464）

<400> 9

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1 5 10 15

Phe Tyr Trp Lys Leu Arg Phe Cys Phe Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg

20 25 30

Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ile Ser Arg Gly Ile Tyr Ser Cys Ile His

35 40 45

Gly Val His Ile Glu Glu Lys Lys Lys Ser Pro Asp Phe Asn Leu Thr

50 55 60

Gly Ser Gln Ser Asn Met Leu Lys Leu Leu Arg Ser Ala Lys Asn Ile

65 70 75 80

Ser Ser Met Ser Asn Met Asn Ser Ser Arg Met Asp Ser Pro Lys Arg

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Ala Ala Asp Phe Ile Gln Arg Gly Ser Leu Ile Met Asp Met Val Ser

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Asp Lys Gly Asn Leu Met Tyr Ser Asp Asn Arg Ser Phe Gln Gly Lys

115 120 125

Glu Ser Ile Phe Gly Asp Asn Met Asn Glu Leu Gln Thr Phe Val Ala

130 135 140

Asn Arg Gln Lys Asp Asn Leu Asn Asn Tyr Val Phe Gln Gly Gln His

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Pro Leu Thr Leu Asn Glu Ser Asn Pro Asn Thr Val Glu Val Ala Val

165 170 175

Ser Thr Glu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Pro Arg Gln Leu Trp Lys Lys

180 185 190

Ser Val Asp Ser Ile Arg Gln Asp Ser Leu Ser Gln Asn Pro Val Ser

195 200 205

Gln Arg Asp Glu Ala Thr Ala Glu Asn Arg Thr His Ser Leu Lys Ser

210 215 220

Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Glu Met Ala His Ser Asp Ile Ser Glu Thr

225 230 235 240

Ser Asn Arg Ala Thr Cys His Arg Glu Pro Asp Asn Ser Lys Asn His

245 250 255

Lys Thr Lys Asp Asn Phe Lys Arg Ser Val Ala Ser Lys Tyr Pro Lys

260 265 270

Asp Cys Ser Glu Val Glu Arg Thr Tyr Leu Lys Thr Lys Ser Ser Ser

275 280 285

Pro Arg Asp Lys Ile Tyr Thr Ile Asp Gly Glu Lys Glu Pro Gly Phe

290 295 300

His Leu Asp Pro Pro Gln Phe Val Glu Asn Val Thr Leu Pro Glu Asn

305 310 315 320

Val Asp Phe Pro Asp Pro Tyr Gln Asp Pro Ser Glu Asn Phe Arg Lys

325 330 335

Gly Asp Ser Thr Leu Pro Met Asn Arg Asn Pro Leu His Asn Glu Glu

340 345 350

Gly Leu Ser Asn Asn Asp Gln Tyr Lys Leu Tyr Ser Lys His Phe Thr

355 360 365

Leu Lys Asp Lys Gly Ser Pro His Ser Glu Thr Ser Glu Arg Tyr Arg

370 375 380

Gln Asn Ser Thr His Cys Arg Ser Cys Leu Ser Asn Met Pro Thr Tyr

385 390 395 400

Ser Gly His Phe Thr Met Arg Ser Pro Phe Lys Cys Asp Ala Cys Leu

405 410 415

Arg Met Gly Asn Leu Tyr Asp Ile Asp Glu Asp Gln Met Leu Gln Glu

420 425 430

Thr Gly Asn Pro Ala Thr Gly Glu Gln Val Tyr Gln Gln Asp Trp Ala

435 440 445

Gln Asn Asn Ala Leu Gln Leu Gln Lys Asn Lys Leu Arg Ile Ser Arg

450 455 460

Gln His Ser Tyr Asp Asn Ile Val Asp Lys Pro Arg Glu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Ser Arg Pro Ser Arg Ser Ile Ser Leu Lys Asp Arg Glu Arg Leu Leu

485 490 495

Glu Gly Asn Phe Tyr Gly Ser Leu Phe Ser Val Pro Ser Ser Lys Leu

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Ser Gly Lys Lys Ser Ser Leu Phe Pro Gln Gly Leu Glu Asp Ser Lys

515 520 525

Arg Ser Lys Ser Leu Leu Pro Asp His Thr Ser Asp Asn Pro Phe Leu

530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

Leu Arg Ser Ser Leu Arg Ser Thr Ala Ser Tyr Cys Ser Arg Asp Ser

580 585 590

Arg Gly His Asn Asp Val Tyr Ile Ser Glu His Val Met Pro Tyr Ala

595 600 605

Ala Asn Lys Asn Asn Met Tyr Ser Thr Pro Arg Val Leu Asn Ser Cys

610 615 620

Ser Asn Arg Arg Val Tyr Lys Lys Met Pro Ser Ile Glu Ser Asp Val

625 630 635 640

<210> 10

<211> 131

<212> PRT

<213> PDCD11(1701-1831)

<400> 10

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Met Leu Lys Arg Phe Arg Gln Glu Lys Ala Val Trp Ile Lys Tyr Gly

20 25 30

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35 40 45

Gln Arg Ala Leu Glu Cys Leu Pro Ser Lys Glu His Val Asp Val Ile

50 55 60

Ala Lys Phe Ala Gln Leu Glu Phe Gln Leu Gly Asp Ala Glu Arg Ala

65 70 75 80

Lys Ala Ile Phe Glu Asn Thr Leu Ser Thr Tyr Pro Lys Arg Thr Asp

85 90 95

Val Trp Ser Val Tyr Ile Asp Met Thr Ile Lys His Gly Ser Gln Lys

100 105 110

Asp Val Arg Asp Ile Phe Glu Arg Val Ile His Leu Ser Leu Ala Pro

115 120 125

Lys Arg Met

130

Claims

1. 一种检测自身抗体的检测试剂在制备诊断脑梗塞的检测产品中的应用，其特征在于：所述检测试剂同时包括针对BDNF蛋白片段的自身抗体、ICAM1蛋白片段的自身抗体和MMP1蛋白片段的自身抗体的检测试剂，所述检测试剂包括BDNF蛋白片段、ICAM1蛋白片段和MMP1蛋白片段，所述MMP1蛋白片段的序列如SEQ ID NO.2所示，所述ICAM1蛋白片段的序列如SEQ ID NO.8所示，所述BDNF蛋白片段的序列如SEQ ID NO.5所示。

2. 根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述检测试剂还包括针对NF155蛋白片段的自身抗体的检测试剂，所述检测试剂还包括NF155蛋白片段，所述NF155蛋白片段的序列如SEQ ID NO.7所示。

3. 根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述检测试剂还包括针对NMDAR2A蛋白片段的自身抗体的检测试剂，所述检测试剂还包括NMDAR2A蛋白片段，所述NMDAR2A蛋白片段的序列如SEQ ID NO.9所示。

4. 根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述检测试剂还包括PRL蛋白片段的自身抗体和PDCD11蛋白片段的自身抗体的检测试剂，所述检测试剂还包括PRL蛋白片段和PDCD11蛋白片段，所述PRL蛋白片段的序列如SEQ ID NO.6所示，所述PDCD11蛋白片段的序列如SEQID NO.10所示。

5. 一种检测自身抗体的检测试剂在制备诊断脑梗塞的检测产品中的应用，其特征在于：所述检测试剂同时包括针对NF155蛋白片段的自身抗体、MMP1蛋白片段的自身抗体、PRL蛋白片段的自身抗体、ICAM1蛋白片段的自身抗体、PDCD11蛋白片段的自身抗体和LIMS4蛋白片段的自身抗体和PUM3蛋白片段的自身抗体的检测试剂，所述检测试剂包括：NF155蛋白片段、MMP1蛋白片段、PRL蛋白片段、ICAM1蛋白片段、PDCD11蛋白片段和LIMS4蛋白片段和PUM3蛋白片段；所述NF155蛋白片段序列如SEQ ID NO.7所示，所述PRL蛋白片段序列如SEQID NO.6所示，所述ICAM1蛋白片段序列如SEQ ID NO.8所示，所述PDCD11蛋白片段序列如SEQ ID NO.10所示，所述LIMS4蛋白片段序列如SEQ ID NO.1所示，所述PUM3蛋白片段序列如SEQ ID NO.4所示，所述MMP1蛋白片段的序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求1～5任意一项所述应用，其特征在于：所述检测产品为检测试纸、试剂、试剂盒中的任意一种。