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JP2014520869A - 長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ｌｈ）化合物 - Google Patents

長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ｌｈ）化合物 Download PDF

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Abstract

本発明は、医薬的に許容可能な分子に結合したＬＨアゴニストを含んでなる長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物であって、その医薬的に許容可能な分子によって、前記ＬＨ化合物と同じ様に投与されたＬＨアゴニストのインビボ血漿内半減期と比較して前記ＬＨアゴニスト又は前記ＬＨ化合物のインビボ血漿内半減期が実質的に増加している黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物に関する。本発明は、インビトロ受精、卵細胞質内精子注入、子宮内授精及び体外成熟などの生殖補助技術と併せて用いられ得る調節卵巣刺激のための方法に関する。他の態様では、本発明は、卵胞形成を誘導するための方法、及び黄体に黄体機能を補充するための方法に関する。
【選択図】無し

Description

本発明は、医薬的に許容し得る分子に連結されたＬＨアゴニストを含んで成る、長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物、並びにそのようなＬＨ化合物の調製法及び使用法に関する。これらのＬＨ化合物は長期的な作用特性を有し、生殖能力の促進又は不妊症の治療のための、並びに低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の男児及び停留精巣を有する青年に使用するため等の生殖補助医療法において有用である。改変ＬＨは長期的な作用特性を有し、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）との併用において、無排卵の女性で卵胞発達を誘導するのに、又は哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期で調節卵巣刺激法を誘導するのに、有用である。さらに、本発明は調節卵巣刺激法のための方法に関し、該方法は、体外受精（ＩＶＦ）、卵細胞質内精子注入法（intra cytoplasmatic sperm injection：ＩＣＳＩ）、子宮内受精法（ＩＵＩ）、体外成熟培養法（ＩＶＭ）、及び排卵誘発法（induction of oculation）等の生殖補助医療と併せて使用することができる。他の態様では、本発明は卵胞形成を誘導する方法、並びに黄体期補助及び妊娠期補助を黄体に与える方法に関する。
生殖補助医療（ＡＲＴ）法は、卵胞の成長及び成熟を刺激するために、典型的には、外来性ゴナドトロピンによる処置を必要とする。ゴナドトロピンが無排卵女性の治療に利用される場合、その目的は正常な月経周期を再現することであり、その時、一つの優性卵胞が排卵誘導前に成熟する。対照的に、体外受精（ＩＶＦ）を受けている女性では、調節卵巣刺激法（ＣＯＳ）を使用して、複数の卵胞の成長及び成熟を刺激し、複数の卵母細胞を生じさせ、それを後にＩＶＦ法のため回収する。
複数の卵胞の発育を保証するＡＲＴ、ＣＯＳに関連して、患者が妊娠する可能性をできるだけ高くすることは不可欠である。複数の卵胞を成育させるために、ＦＳＨ血中濃度は、自然状態である３〜４日よりも長く、応答性卵胞の生育を誘発する生理学的閾値を越える必要がある。これは外因性ＦＳＨの投与、又は脳下垂体を操作して増量させたＦＳＨを分泌させることにより達成され、ＣＯＳが正しく行われることで体外受精用に過剰な成熟卵母細胞を容易に獲得することができる。
卵胞の生育刺激に加え、ＦＳＨの重要な機能は顆粒膜細胞上のＬＨ受容体の発達を刺激することである。ＬＨ受容体は、即時に卵胞を取り囲みながら卵胞膜細胞に構成的に発現し、とりわけ、顆粒膜細胞層でエストロゲンに変換されるアンドロゲン（すなわちアンドロステンジオンとテストステロン）の産生を引き起こすが、ＬＨ受容体は卵胞の顆粒膜細胞層でも重要な機能を有している。卵胞発育において、ＬＨ受容体がいつ顆粒膜細胞に発現されるかは、現在のところ正確には分かっていない。
正常な月経周期において、ＬＨ受容体は脳下垂体から放出されたＬＨ活性によってのみ活性化されるが、本質的には妊娠関連タンパク質であるｈＣＧもＬＨ受容体に結合してこれを刺激する。ｈＣＧはＬＨより長い半減期を持ち、（アンプル内の等用量のＬＨとｈＣＧからの）蓄積されたｈＣＧの生体内活性は、通常ＬＨより６〜８倍高いものと見なされている（Stockman PGW et al. Fertil Steril 1993;60:175, Giudice E et al. J Clin Res 2001;4:27）。
ＣＯＳ用の調製物にはＦＳＨのみを含有するものがあるが、一方で、ＦＳＨ及びＬＨ様活性の組み合わせ（すなわちＬＨ若しくはｈＣＧ単独、又はＬＨ及びｈＣＧの混合物）を含有するものもある。例えば、Menopurは尿由来のＦＳＨ及びＬＨ様活性を含有する。これらの調製物において、生体内受容体を介したＬＨ様生物活性の約９５％はｈＣＧに由来するが、これはｈＣＧの長い半減期のためである（Van den Hooven H et al. RBM Online 2003; 7: 547）。組換えＬＨも、ＣＯＳの付属として、純粋形態で利用可能である（例えば、Luveris、Merck-Serono社、ドイツ、ダルムシュタット）。ただし、ＣＯＳ用のｈＣＧはＦＳＨを含有する製品の存在下でのみ利用可能であり、ＣＯＳ関連で使用される少量では販売されていない。
ＣＯＳに関連してＬＨ活性を利用する臨床的利点は、過去１０年間大いに議論されてきた。いくつかのメタ分析により、本質的にｈＣＧを介して与えられるＬＨ様活性の付加が、純粋ＦＳＨ単独と比べてＩＶＦ出産成功率（baby-take-home rate）を増加させることが示唆されているが、この問題は解明されていない（AI-Inany HG et al., Reprod Biomed Online. 2008;16: 81-88, Westergaard LW, Cochrane Database Syst Rev 2003;1:CD003973., Al-Inany HG et al., Gynecol Endocrinol. 2009;25:372-8）。複雑性の付加は、最も頻繁に使用されるｈＣＧ含有ＦＳＨのＦＳＨアイソフォームの特性（すなわちMenopur（尿由来ＦＳＨ、ＬＨ及びｈＣＧを含有する高純度のｈＭＧ））と、純粋ＦＳＨ（すなわち組換えＦＳＨ、Puregon又はGonal F）との間の違いとなる。しかし、付加ＬＨ様活性が有用となる閾値未満にＬＨレベルが低減され得ることは疑いのないことであり、また処置の結果に負の影響が表れ始める閾値限界も存在する。従って、ＬＨ様活性は、理想的には狭い治療域のままであるべきである。
ＬＨとＣＧは非常に相同性がある。ＬＨと比較して、ＣＧは、ＣＧのより長い半減期に重要であると示されているＣ末端グリコシル化伸長部を有している。ヒトＬＨとｈＣＧは配列において８０％以上の相同性がある。ＬＨ及びｈＣＧはどちらもＬＨ受容体に結合しそれを活性化するが、両ホルモンはそれらのオリゴ糖組成において異なる、１つのファミリーのイソホルモンとして存在する。異なるアイソフォームのそれぞれは特異な様式で受容体に影響を与え、一様でない細胞応答を発現し得（Burgon PG et al., Endocrinology, 1996;137:4827; Stanton PG et al., Mol Cell Endocrinol. 1996;125:133-141.）、異なるＦＳＨアイソフォームについても同様に示されている（Barrios-de-Tomasi J, et al. Mol Cell Endocrinol. 2002;186:189-98, Yding Andersen C & Ezcurra D, Reproductive Biology Insights 2011:4, 1-10）。従って、ＬＨ及びｈＣＧのより繊細な微調整された効果は実際には異なる場合がある。ストックホルムにおけるＥＳＨＲＥカンファレンス（２０１１年７月）で発表された最近の研究は、ＬＨがｈＣＧよりもずっと速く作用するが、受容体レベルでは全体的に効率が劣ることを示した（L. Casarini et al., ESHRE Stockholm 2011 - P312, Universita degli Studi di Modena, Italy）。ｈＣＧは排卵後およそ８日目の胚の着床に続いて分泌される妊娠関連タンパク質である。ｈＣＧは黄体を刺激し、活性のままにして、プロゲステロン及び妊娠が確立するのに必要な他の物質の分泌を黄体に継続させることができる。月経周期のその瞬間でのＬＨレベルがかなりの量であるという事実にもかかわらず、このレベルでは黄体をさらに刺激するには不十分であり、女性が妊娠しなければ、黄体が退行し、月経出血が発生し、新しい月経周期が開始する。ＬＨ及びｈＣＧ間のこの違いは、しばらくの間解決されない問題であったが、現在ではＬＨ受容体（ＬＨ−Ｒ）が黄体期中に変化することが示されている。機能的な完全長受容体は、ｈＣＧが存在する場合にその発現を維持するのに対し、ＬＨはそれを達成することができない（Dickinson RE et al., Endocrinology 150: 2873-2881, 2009）。このことは、黄体期におけるＬＨ及びｈＣＧの作用の違いを示しており、また、ＬＨ及びｈＣＧが月経周期の卵胞期の受容体レベルで異なる作用を発現することも示唆し得る。
ヒト顆粒膜細胞上でのＬＨ−Ｒ発現は、ＣＯＳに関連したごく少量の許容量のＦＳＨの存在によって、直径約１０〜１２ミリメートルから排卵までの卵胞発育を充分に駆動することは、現在ではよく理解されている（Blockheel et al., 2009; Filicori et a., 1999）。それに関して、この刺激は、ＦＳＨレベルが卵胞期の後半に減弱する一方で、ＬＨレベルはまったく一定のままである、自然な月経周期条件に類似している。ＬＨがゴナトロピンの月経中期サージ前の、排卵前卵胞からの顆粒膜細胞におけるエストラジオール産生に対し非常に強い刺激作用を有することが示されている。卵胞の最終成熟のためのより自然な環境を与える能力は、受精、胚発生及び着床を維持するより良い能力を有する卵母細胞を提供することであり得、その結果、より良好な生殖結果がもたらされる。
ＣＯＳの最も深刻な副作用の一つは、卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）の発症であり、これは生命にかかわる恐れのある状態である。最近の研究では、現在、最終的な卵胞成熟を誘発するアゴニストの使用により、生殖結果を損なうことなく、ＯＨＳＳをほぼ完全に排除することが可能であることが示されている（Humaidan P, Kol S, Papanikolaou E; Copenhagen GnRH Agonist Triggering Workshop Group. GnRH agonist for triggering of final oocyte maturation: time for a change of practice? Hum Reprod Update. 2011;17:510-24. PMID:21450755）。ＧｎＲＨアンタゴニストにより下方制御される脳下垂体機能と組み合わせて、ＧｎＲＨアゴニストのボーラス投与を拮抗剤と置き換えることが可能であり、突発的なゴナドトロピン放出を引き起こし、これが後に排卵誘発シグナルとして利用される。しかし、その突然的な増加の後に、アゴニストは脳下垂体の下方制御を引き起こし、それにより卵巣に対する刺激信号が除去される。これらの刺激の除去は、ＯＨＳＳリスクも低減させる。しかし、この抑制には黄体の機能に対して深刻な負の影響もあり、生殖結果は許容できないほどに低い。そのため黄体の特定の機能を維持するために、卵母細胞回収時及び後の黄体期にｈＣＧ（１５００ＩＵ）のボーラス投与を与える試みがなされ、成功した。あるいは、ＬＨの連日注射は、黄体期を回復させ、良好な生殖結果をもたらし得る（A novel method of luteal supplementation with recombinant luteinizing hormone when a gonadotropin-releasing hormone agonist is used instead of human chorionic gonadotropin for ovulation triggering: a randomized prospective proof of concept study. Papanikolaou EG, Verpoest W, Fatemi H, Tarlatzis B, Devroey P, Tournaye H. Fertil Steril. 2011 Mar 1;95(3):1174-7. Epub 2010 Oct 27. PMID: 20979997）。
ＡＲＴの最近の進歩にもかかわらず、外因性ゴナドトロピンによる卵巣刺激は、一つにはゴナドトロピン処置に対する個々の応答が多様であるために、一様には成功してはいない。この多様性は患者の管理を複雑にし、多子出産及び生命にかかわる恐れのある合併症を引き起こす可能性がある。
ゴナドトロピンは構造的に関連した糖タンパク質ホルモンのファミリーを形成している。典型的なメンバーには、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ；フォリトロピン）、黄体形成ホルモン（ＬＨ；ルトロピン）及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ；甲状腺刺激ホルモン）が含まれる。ＦＳＨ、ＬＨ及びＴＳＨは、ほとんどの脊椎動物種に存在し、脳下垂体により合成され、分泌される。ＣＧは、現在のところ霊長類（例えばヒト）、及びウマでのみ見つかっており、胎盤組織によって合成される。ＦＳＨ及びＬＨは、女性における卵胞成熟及び黄体形成、並びに男性における精巣の成熟、及び精子形成に不可欠な脳下垂体ホルモンである。ゴナドトロピンは、視床下部ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の制御の下、脳下垂体により分泌される。卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）は、卵胞成熟（卵胞発育）及び黄体形成に不可欠な脳下垂体ホルモンである。ＦＳＨは自然な月経周期初期での卵胞の補充（例えば、卵胞の初期成長）に必要とされ、またＦＳＨは中盤及び後期の卵胞発育の補助も行う。
近年、ゴナドトロピンの非常に高純度の調製物が、組換えＤＮＡ技術の使用を通じて利用可能となった（例えばBoime et al., Seminars in Reproductive Endocrinology 10, 45-50, 1992: "Expression of recombinant human FSH, LH and CG in mammalian cells"参照）。組換えゴナドトロピンは均質であり、例えば、再現性のある生化学的及び生物学的特性を有している。すべてのサブユニットに対して、ゲノム及びｃＤＮＡクローンが調製され、それらの一次構造が解明された。さらに、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞には、ヒトゴナドトロピンサブユニット遺伝子が導入され、これらの細胞がインタクトな二量体を分泌可能であることが示された（例えば、Keene et al (1989), J.Biol.Chem., 264, 4769-4775; Van Wezenbeek et al (1990), in From clone to Clinic (eds Crommelin D. J. A. and Schellekens H.), 245-251）。例えば組換えＦＳＨの生化学的特徴及び生物学的特徴は、天然ＦＳＨの特徴とほぼ同一であることが示されている（Mannaerts et al (1991), Endocrinology, 129, 2623-2630）。さらに、組換えＦＳＨを用いて調節された卵巣の過排卵後に、妊娠が達成された（Germond et al (1992), Lancet, 339 ,1170; Devroey et al (1992), Lancet, 339, 1170-1171）。
ゴナドトロピンは天然源（例えばヒトの尿）から単離することもでき、あるいは、ゴナドトロピンは（バイオ）合成法（組換えＤＮＡ技術と比較）によって調製することができる。
ゴナドトロピンは臨床的実施において広く使用されており、ＷＨＯグループＩＩ及びグループＩの無排卵女性を治療している（世界保健機関技術報告書514, (1973)）。従来、卵胞の発育はｈＭＧ（ヒト閉経期ゴナドトロピン）又はｕ−ｈＦＳＨ（尿由来ヒト卵胞刺激ホルモン）を７５〜１５０ＩＵ／日で投与することにより誘導される。この投与量は、数日（通常５日）後、７５ＩＵずつ増やされる。４５０ＩＵ／日を超えることはほとんどない。少なくとも１つの卵胞が少なくとも１８ｍｍの平均直径を有し、且つ２つ以下の卵胞が少なくとも１６ｍｍの平均直径を有する場合、高用量（例えば５０００ＩＵ）のｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）が投与されて、排卵が誘発される。２０年以上もの間この「従来のプロトコル」が用いられ、功を奏してきた。しかし、従来のプロトコルは、多嚢胞性卵巣を有する患者又は多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）の患者を中心に、いくつかのリスクを及ぼす。
これらのリスクにはＯＨＳＳの発症、及び比較的高い多胎妊娠の発症率が含まれる（Schenker et al, Fertil. Steril. 35: 105-123 (1981)）。多胎妊娠の大半は双子であるが、英国では、排卵誘発は高次多子出産（high rank multiple birth）の３分の１の原因になっている（Levene et al, Br. J Obstet. Gynacol. 99: 607-613 (1992)）。
超音波（ＵＳ）による処置及び血清エストラジオール評価（Ｅ２）の間に注意深くモニターすることによって、これらのリスクは減少されるが、すべての患者においてそれらを防止できているわけではない。これらの問題は、非生理的な多卵胞発育につながる、１つの優性卵胞を成長させることの難しさに直接関係している。
ＦＳＨは、無排卵女性とＣＯＳを受けている女性において、卵巣発育を誘導するために治療的に投与される。従来の排卵刺激法では、ＦＳＨが、治療の全体を通して卵母細胞が回収される直前まで投与される。ＦＳＨによるこの継続的刺激は、通常複数の卵胞発育を引き起こし、排卵を誘導するｈＣＧの外からのボーラス投与との組み合わせで、潜在的に致死性の状態であるＯＨＳＳをもたらす可能性がある。現在、ＣＯＳは１００．０００回の刺激サイクルにつき約３回の割合で、他の点では健康な患者にとって、致命的であると推定されている。ＦＳＨの投与量を減少させることで、ＯＨＳＳのリスクを減らすことができるが、低ＦＳＨ投与量では卵胞数に不足が生じ、それにより生殖補助医療の成功率は下がる。
ＬＨは通常の月経周期の全ての段階で機能する。ＬＨが卵胞の卵胞膜細胞を刺激することにより、卵胞顆粒膜細胞におけるアロマターゼ系によりエストロゲンへと変換されるアンドロゲン基質が生産される。卵胞成熟後期の間、排卵前のおよそ５〜７日目に、大型卵胞は顆粒膜細胞上にＬＨ受容体を発現し始め、これにより、卵胞は継続的成熟と発育のために、ＬＨに対して応答するようになる。Hillier et al., Mol. Cell Endocrinol. 100:51 (1994), Campbell et al. J. Reprod. Fertil. 117:244 (1999)。正常な月経周期では、次に月経中期のＬＨサージによって、卵胞成熟及び排卵の最終段階が誘発される。排卵は、月経中期ＬＨサージの後、２４〜４８時間以内に生じる。そして、月経周期の第二段階である黄体期に、ＬＨは、子宮に着床及び妊娠の準備させる際、卵巣の黄体におけるエストロゲン及びプロゲステロンの産生を刺激する。
卵巣刺激プロトコルにおいて、ｈＣＧ及びＬＨは同じ受容体を介して作用するため、ｈＣＧはＬＨ活性の供給源として働く。Filicori et al. Human Reprod. 17:2009 (2002a); Martin et al., Fertil. Steril. 76: 0-49 (2002)。文献ではｈＣＧ及びＬＨは代替できるものとして扱われる傾向があるが、ｈＣＧはＬＨと比較してより長い半減期を持つため、生体内ではＬＨよりも強力である。実際に、科学文献は概して、天然由来ゴナドトロピン調製物におけるＬＨ活性源の決定について言及していない。
文献は、排卵刺激の全体を通じてＦＳＨと組み合わせてＬＨ活性又は低用量ｈＣＧを使用することを開示しているが、ＬＨ活性補充の有効量及びタイミングに関する手引きには欠けている。例えば、Martin et al, Fertil. Steril. 76: 0-49 (2002)の要約では、排卵刺激中の２．５μｇの組換えｈＣＧの連日投与（血清ｈＣＧレベルを１〜３ｍＩＵ／ｍＬに維持）が開示されている。Gordon et al.では、０、１、２５及び７５ＩＵのＬＨ活性と共に７５ＩＵのＦＳＨを投与することが開示されている。Human Reprod. 12 (Suppl. 1): 52 (1997a); 同書: 53 (1997b)。
公表された研究では、ＦＳＨのＬＨに対する割合が１５０：０、１５０：３７、１５０：７５、１５０、１５０である、刺激全体を通じたＬＨ活性の投与が開示されている。Filicori et al. (2002a)。さらに、前記文献では、５０ＩＵ ｈＣＧ／日のＦＳＨ刺激（Filicori et al., J. Clin. Endocrinol. & Metabol. 84: 2659 (1999)）補充及びプロトコルが記載されており、プロトコルでは、１５０ＩＵのＦＳＨが７日間投与され、その後、１５０：０、５０：５０、２５：１００及び０：２００のＦＳＨ対ｈＣＧ比で処置が行われる（同書87:1156 (2002c)及びＵＳ２００８０１０８５７１）。
過去１０年の間に、新しいプロトコル（「長期低用量プロトコル」）が設計され、ゴナドトロピン療法の合併症発生率をさらに減らすために試験された（Seibel et al, Int. J Fertil., 29: 338-339 (1984); Buvat et al, Fertil. Steril., 52: 553-559 (1989); Hamilton-Fairley et al, Human Reprod. 6: 1095- 1099 (1991); Sagle et al, Fertil Steril., 55: 56-60 (1991); Shoham et al, Fertil. Steril., 55: 1051-1056 (1991); Meldrum, Fertil Steril., 55: 1039-1040 (1991)）。このプロトコルは、低用量のＦＳＨ又はｈＭＧ（７５ＩＵ／日）で開始され、処置の７日目、好ましくは１４日目まで用量の調節はない。投与量調節が必要な場合、調節は、３７．５ＩＵだけ増加させていくことにより為される。さらに、後の増加のそれぞれは、所与の投与量での７日間の処置後にのみ、実施することができる。この長期低用量プロトコルのコンセプトは、単一卵胞形成を促進するのに必要なＦＳＨの閾値を発見することにある。現在までに有望な結果が発表されており、このアプローチが排卵前卵胞の平均数、排卵前の平均のＥ２レベル及び黄体中期の卵巣の大きさを小さくすることが示されている。
しかし、長期低用量プロトコルの使用にもかかわらず、過剰反応が原因で、いくつかの治療周期はなお中止されなければならない（例えば、１６ｍｍ以上の平均直径を有する卵胞が４個以上存在する場合）。さらに、多胎妊娠率は、従来のプロトコルと比較して明らかに改善されてはいるが、自然受胎周期よりもなお高く、すなわち、自然周期における１．５％を対照として、誘導された排卵においては５〜１０％である。これは、誘導周期のたった約三分の二〜四分の三でしか単一排卵前卵胞の発育が得られないことと、ｈＣＧ投与日に排卵前卵胞の数を評価する際に１５ｍｍ以下の平均直径を有する卵胞が通常考慮されないという事実によるものである（Buvat et al, FertiL Steril., 52: 553-559 (1989); Hamilton-Fairley et al, Human Reprod. 6: 1095-1099 (1991)）。しかし、ｈＣＧ投与日に１４〜１５ｍｍ、又はそれよりも小さい平均直径を有する卵胞が、排卵して、健康で受精可能な卵母細胞の放出をもたらすかどうかは、明らかになっていない。従って、多胎妊娠及び周期解除の割合が減少するように、ＦＳＨ誘導卵胞発生処置を改善することが望ましいであろう。
胞状卵胞成長はＦＳＨによって誘導される。一生を通じ閉経期まで継続的に、いくつかの卵胞が成長期に入るが、排卵前状態の完熟段階に達する前に退行及び萎縮消失によって中断される（Hillier, Hum. Reprod., 9: 181-191 (1994)）。成長期の間、大部分の卵胞は、充分なＦＳＨ濃度に曝されているという条件で、萎縮消失からレスキューされ得る。萎縮消失を防止し、卵胞のさらなる成長を促進するために必要なＦＳＨレベルは、「ＦＳＨ閾値」レベルと呼ばれる（Brown, Aus. NZJ Obstet. Gynecol., 18: 47-55 (1987)。ＦＳＨ閾値レベルは時間によって異なり、所与の時点で、目下成長期にある卵胞は異なるＦＳＨ閾値レベルを有する。これが「長期間低用量」プロトコルの基礎となる理論的根拠である。最少数の卵胞の閾値レベルを発見し、可能であれば単一排卵を達成するために、ＦＳＨ用量の漸進的かつ慎重な増加が用いられる。
ＬＨも、卵胞の優先性及び単一排卵の現象に寄与していることが知られている。実際に、いくらかのＬＨは卵胞発生間のＥ２合成に必須であるが、過剰なＬＨ暴露は卵胞の萎縮消失を誘発し、顆粒膜細胞の増殖を抑制することが示されている。従って、卵胞発育が要求するＬＨ刺激には限度があるように思われ、それを超えると正常な卵胞発生が中止されてしまう。これが、「ＬＨ許容限度（LH ceiling）」という概念である（Hillier, Hum. Reprod., 9: 181-191 (1994))。所与の時点で目下成長期にある卵胞は異なるＬＨ許容限度レベルを有することが考えられる。より成熟した卵胞ほど、それより未成熟な卵胞よりも、ＬＨの退縮作用に対して抵抗性があることが示唆される。
段階的に増量するプロトコルを用いて、ＦＳＨ単独又はｈＭＧにより処置されたＷＨＯグループＩ無排卵症の２つの症例が報告された（Glasier et al, Journal of /-Endocrinology, 119 A-159 (1988)）。「ＦＳＨ単独」周期は、ｈＭＧ周期よりもずっと数が多い成熟卵胞を有したが、これは、二次卵胞の萎縮消失におけるＬＨの役割を裏付け得るものである。後に、２つの比較試験が発表された。１０人の低ゴナドトロピン性性機能低下症女性における最初の交差研究では、排卵前のＥ２レベルに関して著しい差異が記録されたが、卵胞数は報告されなかった（Couzinet et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 66: 552-556 (1988)）。９人の低ゴナドトロピン性性機能低下症女性における第二の交差研究では、ｈＣＧ投与日に１６ｍｍ超の平均直径を有する卵胞の平均数が２．０であったことが報告された（ｈＭＧ処置周期で０．７、そしてＦＳＨ処置周期で１．２（Shoham et al, FertiL Steril., 55: 1051-1056 (1991)）。より小さな卵胞の数に関する情報は入手できない。
最近になって、１５０ＩＵのｈＦＳＨ（ヒトＦＳＨ）及び７５ＩＵのｒ−ｈＬＨ（組換えヒトＬＨ）を、測定できないほど低いＦＳＨ、ＬＨ及びＥ２の血清中濃度を有する１人の患者に投与した結果が発表された（Hall et al, The Lancet, 344 (8918): 334-335 (1994)）。ｒ−ｈＬＨ及びｒ−ｈＦＳＨの投与によって、ｈＦＳＨ単独投与と比較した場合に、Ｅ２レベルの上昇が引き起こされ、直径１０ｍｍ以上の卵胞の総数が減少した。しかし、大型卵胞の数は、容認できないほど高い多胎妊娠率を示すのに充分なほど、多いままであった。
さらなる試験では、ｒ−ｈＬＨ（３００ＩＵ／日又は７５０ＩＵ／日の用量で）及びｒ−ｈＦＳＨを、子宮内着床前に複数卵胞発生を刺激するためにＦＳＨで処置された後の排卵が正常な女性に投与した際の影響が比較された（Sullivan et al, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 84,228-232, 1999)）。結果は、卵胞の数及び大きさの測定は為されなかったが、血清Ｅ２レベルがＬＨを与えられた女性において上昇したこと、並びに７５０ＩＵ／日のＬＨを与えられた群において多胎妊娠が発生したことを示している。
文献には、ＦＳＨ及びＬＨ活性を両方含有する他の組成物、並びにＬＨ活性と組み合わせたＦＳＨの使用が記載されている。例えば、２０００年１１月１６日に公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ００／６７７７８号は、無排卵の女性において卵胞発生を誘導するための、ＦＳＨと組み合わせたＬＨ又は等量のｈＣＧの使用を対象とする。より具体的には、前記'７７８出願（'778 application）は、１００〜１５００ＩＵ／日（４頁２６〜２９行）の用量での、及び１：１．５〜１：２０（同頁、１６〜１８行）の範囲のＦＳＨ：ＬＨ比での、ＬＨ又は「生物活性を有するその類似体」の投与を開示している。
米国特許第５，９２９，０２８号は、一つ又は複数の天然又は組換えゴナドトロピン（例えばＦＳＨ、ＬＨ、及びｈＣＧ）を含有する液剤を対象とする。前記’０２８特許（'028 patent）は、ＦＳＨ及びＬＨ活性をおよそ１：１の比で有するヒト閉経期ゴナドトロピン（ｈＭＧ）の天然由来組成物について論じているが、市販のｈＭＧ調製物の１：１比以外のＦＳＨのＬＨ活性に対する比については言及していない。
さらに、ＦＳＨ及びＬＨの両方を含有する市販製剤がある。７５ＩＵのＦＳＨを７５ＩＵのＬＨ活性と共に含有するヒト由来調製物（Pergonal、Humegon、Menogon、Repronex、及びMenopur）、及び７５ＩＵのＦＳＨを２５又は３５ＩＵのＬＨ活性と共に含有するヒト由来調製物（Normegon及びPergogreen）を利用することができる。
しかし定説では、「過剰な」ＬＨレベルは、不明確ではあるが、卵胞の萎縮消失、顆粒膜細胞増殖の抑制、及び早期黄体化をもたらす。概して、Filicori, Fertil. Steril. 79: 253 (2003)を参照。最近の研究ではそうでないことが示唆されているが、当該分野では、ＬＨ活性レベルはある範囲内でなければならず、「ＬＨ許容限度」を超える又はそれ未満のＬＨ活性レベルは正常な卵胞発生を損なうという見解が続いている。Shoham, Fertil. Steril. 70: 1170 (2002)。
要約すると、排卵誘発の間にＦＳＨをＬＨ活性で補うことにより、適切な卵胞発生を達成するための処置時間及び使用されるゴナドトロピンの量は減少されるという公表された証拠がある。Filicori et al. (1999), (2002b)。一方で、「高い」ＬＨ活性レベルは卵胞発生に負の影響を与えるという考えも存続している。
ＣＯＳプロトコルにおける数多くの進歩にもかかわらず、ＯＨＳＳの発症を排除するための、後の着床率を向上させるための、並びに生殖補助医療を受けている女性のための利便性及び安全性を向上させるための、さらなる改善が必要である。
その考えにより、調節卵巣刺激の全体を通じてＦＳＨを投与することを含む、従来の卵巣刺激のパラダイムが導かれた。外来性ＬＨ活性は、卵胞発生の初期から中期の間は、不要とみなされ、有害でさえあるとみなされる。従って、卵巣刺激の従来の手法は、典型的には７５〜３００ＩＵ／日でのＦＳＨ単独処置を伴う。この従来のプロトコルでは、卵胞がある発育段階に達した後にのみ排卵を誘導するために、ＬＨ活性は投与される。ＬＨ活性が治療の全体を通じて投与されるようになったのはごく最近であり、この文脈において有効なＬＨ活性の最適な量及びタイミングについては依然として議論が分かれている。
男児が正常な生殖能力を発達させるためには、両方の精巣が、陰嚢内のより低い温度で、身体の外側に位置している必要がある。一方又は両方の精巣が長期間体温のままでいると、生殖能力が損なわれる場合があり、成人期において機能的な精子細胞を産生する能力が阻害される場合がある。停留精巣による生殖能力に対する負の影響を低減するために、精巣は通常、手術によって、又は精巣を陰嚢に移動させるｈＣＧを用いたホルモン治療によって、陰嚢へと身体内移動される。ｈＣＧは、ライディッヒ細胞を刺激してアンドロゲンを産生させることによって、精巣のステロイドホルモン産生を刺激する。精巣を陰嚢へと移動させる際の、レベルが上昇したアンドロゲンの正確な作用機序は、正確には分かっていない。
男児において少なくとも一方の精巣が停留する発生頻度は、満期男児の約３％、そして早産男児の３０％である。しかしながら、生後１年の間に体内精巣の大部分は自ら陰嚢内に到達するため（ほとんどは３ヵ月以内）、停留精巣の真の発生率は全体の約１％となる。ｈＣＧの作用は充分に文書で裏付けられているが、患者の年齢、治療スケジュール、及び移動精巣を含める可能性の違いから、かなりの多岐にわたる結果が報告されており、真の効能は分かっていない。週２回与えられる３〜１５回の投与にわたる、いくつかの異なる投与計画が報告されている（５週間に亘っての１０回の注射が一般的）。最も一般的なスケジュールの一つでは、年少乳児で２５０ＩＵ／用量、６歳以下の小児で５００ＩＵ／用量、及びで７歳以上の個人で１０００ＩＵ／用量が処方される。
低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する男性は、脳下垂体でのゴナドトロピンＬＨ及びＦＳＨの放出が実行できない。種々の遺伝子異常が、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）放出不全をもたらす視床下部異常を引き起こし、それが次に、脳下垂体にＦＳＨ及びＬＨの放出を減少させ得る。そのような状態の１つに、およそ１：１０．０００の男性及び１：５０．０００の女性に発症するいわゆるカルマン症候群がある。生殖能力への影響以外での、男性及び女性両方に対する主な健康問題は骨粗鬆症である。
ＬＨのレベルが低い場合、男性におけるアンドロゲン産生は減少し、それらの男性はしばしば無精子症であり、男性特徴の減少を示す。治療は、欠乏したホルモンの回復に焦点が当てられる。ｈＣＧ又はテストステロンが男性に投与される。いくつかの異なるテストステロン調製物が利用可能であり；より広く使用されるテストステロン調製物は１ヶ月間隔での投与を必要とするのみである。しかし、これらの男性において精子産生及び生殖能力を誘導するためにはｈＣＧの併用投与が必要となるが、これは血流を介して精巣に届く、体外から投与されたテストステロンが、精子産生を引き起こすのに充分な精巣内レベルにほとんど達しないためである。しばしばＦＳＨ投与との併用で精子産生を誘発するのに充分なだけ、精巣のアンドロゲン産生を刺激するために、ｈＣＧを使用することはより効果的であると思われる。精原段階から完全成熟した精子までの精子産生は６０〜７０日かかるため、精子産生を開始させるためのｈＣＧの複数回注射を伴う、しばしば長期に亘る過程となる。
本発明者らは、哺乳類動物においてＬＨ受容体を刺激及び活性化し、そして、
ａ）成熟中の卵母細胞が成熟を完了して減数分裂を再開することができる、直径が約５〜６ｍｍから、例えば１０ｍｍから最大で約３０ｍｍまでの胞状卵胞を生じさせるのに充分であり、
ｂ）青年期早期の生後約１年の雄の子、又は性成熟期の雌対象及び雄対象の両方においてアンドロゲン産生を引き起こすのに充分であり、
ｃ）低ゴナドトロピン性（hypogonadothrophic）で性機能低下性の雌対象及び雄対象の両方においてステロイド産生を補助するのに充分であり、
ｄ）哺乳類胚盤胞の移植を可能とするように子宮内膜及び子宮を調節するため、近排卵期、排卵期、及び後排卵期の哺乳類対象においてプロゲステロンを持続させるのに充分であり、
ｅ）子宮内膜及び子宮を移植に備えさせるため、近排卵期、排卵期、及び後排卵期の哺乳類対象においてプロゲステロンを持続させるのに充分であり、
ｆ）精子産生を誘発し、そして、アンドロゲン産生を増加させるため、低ゴナドトロピン性で性機能低下症の男性においてアンドロゲン産生を引き起こすのに充分であり、
ｇ）精巣の陰嚢への再配置を誘発させるため、停留精巣を有する少年においてアンドロゲン産生を引き起こすのに充分であり、
ｈ）流産のリスクを減少させるため、再発性の妊娠を有する女性においてプロゲステロン産生を引き起こすのに充分である
哺乳類ＣＧ又はＬＨ、例えばヒトＣＧ又はヒトＬＨの生体成分及び濃度を提供する改変哺乳類ＣＧ又はＬＨ、例えばヒトＣＧ又はヒトＬＨが、（ｂを除き）現行のＡＲＴのプラットフォームの改良にとって重要であることを理解している。
従って、広範な態様では、本発明は、医薬的に許容可能な分子に結合したＬＨアゴニストを含んでなる長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物であって、その医薬的に許容可能な分子によって、前記ＬＨ化合物と同じように投与されたＬＨアゴニストのインビボ血漿内半減期と比較して前記ＬＨアゴニスト又は前記ＬＨ化合物のインビボ血漿内半減期が実質的に増加している黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物に関する。
別の態様では、本発明は、医薬的に許容可能な分子に結合したＬＨアゴニストを含んでなる長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物であって、その医薬的に許容可能な分子によって、内在性絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）のインビボ血漿内半減期と比較して前記ＬＨアゴニスト又は前記ＬＨ化合物のインビボ血漿内半減期が実質的に増加している黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物に関する。
さらなる態様では、本発明は、哺乳類の新生児型Ｆｃ受容体、トランスフェリン及びｎが８〜２２であるＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ−に結合する分子並びに高分子から選択される医薬的に許容可能な分子に結合した哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体を含んでなる長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物に関する。
ＬＨアゴニストは哺乳類起源のものであってよく、そして、ヒトＣＧ、及びウマ科動物のＣＧ、例えばウマＣＧなどの哺乳類動物ＣＧ、又はヒトＬＨ、ウシＬＨ、ブタＬＨ、ウマＬＨ、ヒツジＬＨ、イヌＬＨ、ネコＬＨ、及びヤギＬＨなどの哺乳類動物ＬＨから選択され得る。ＬＨアゴニストは哺乳類ＬＨアゴニストの類似体であってもよく、通常その類似体は絨毛性ゴナドトロピン又は黄体形成ホルモンなどのＬＨアゴニストの対応する哺乳類配列に対して少なくとも８０％の同一性、例えば、少なくとも８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性を有する。
ＬＨアゴニストは非哺乳類起源のものであってもよく、そして、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質から選択され得る。
ＬＨアゴニストは別の分子、好ましくは医薬的に許容可能な分子に結合しており、そして、ＬＨ化合物と呼称されるものが本改変化合物である。ＬＨアゴニストは、先行技術文献に記載されるような様々な方法で、例えば、限定されないが、二官能性リンカーを介した化学結合、ｈＣＧ又はｈＬＨなどのＬＨアゴニストのＮ末端又はＣ末端のアルブミンなどの医薬的に許容可能な分子への結合による遺伝子技術で、医薬的に許容可能な分子に結合され得る。特に、アルブミン、例えばヒトアルブミンのＮ末端をｈＣＧ若しくはｈＬＨのα鎖のＣ末端、又はｈＣＧ若しくはｈＬＨのβ鎖のＣ末端に結合することができ、又はアルブミン、例えばヒトアルブミンのＣ末端をｈＣＧ若しくはｈＬＨのα鎖のＮ末端、又はｈＣＧ若しくはｈＬＨのβ鎖のＮ末端に結合することができる。アルブミンとｈＣＧ鎖又はＬＨ鎖の間にリンカー配列を挿入することができる。ｈＣＧ及び／又はｈＬＨのその２つの鎖、すなわち、α鎖及びβ鎖はリンカーペプチドを介して連結され得、そうして１つのポリペプチド配列が産生され、次にそのポリペプチド配列が、例えば化学的連結又は遺伝的連結により、医薬的に許容可能な分子に連結され得る。
ＬＨアゴニストは安定なリンカー又はより不安定なリンカーを介して医薬的に許容可能な分子に結合され得る。いくつかのリンカーが当技術分野において知られており、それらのリンカーには二官能性ＰＥＧ分子（例えば、Paige et.al Pharmaceutical Research, vol. 12, no. 12, 1995を参照のこと）、加水分解性リンカー（Shechter et al Bioconjugate Chem. 2005, 16, 913-920 及び International Journal of Peptide Research and Therapeutics, Vol. 13, Nos. 1-2, June 2007 及び国際公開第２００９０９５４７９号）、ＰＤＰＨ及びＥＭＣＨ（例えば、国際公開第２０１００９２１３５号を参照のこと）が含まれる。ｈＣＧなどのＬＨアゴニストの医薬的に許容可能な分子への化学的結合（２つ以上の分子の結合）がＬＨの機能活性を大いに低減させる特殊な場合では、機能性ＬＨアゴニストを放出し得るより不安定なリンカーを使用することが好ましい場合がある。
ＬＨアゴニストはグリコシル化されてよく、その場合、医薬的に許容可能な分子への結合はそのような糖部分を介したものであり得、又は糖部分が挿入され、ＬＨアゴニストと医薬的に許容可能な分子の間に連結部を作製するために使用され得る。
ＬＨアゴニストは１つ以上の医薬的に許容可能な分子に結合していてよく、又は、１つの医薬的に許容可能な分子が１つ以上のＬＨアゴニストに結合していてよく、通常ＬＨアゴニストは１つ、又は２つの医薬的に許容可能な分子、好ましくは１つの医薬的に許容可能な分子に結合している。例えば、１つのｈＣＧは１つのアルブミン、例えばヒトアルブミン又は改変アルブミンに結合している。
本発明のＬＨ化合物のさらなる利点は、医薬的に許容可能な分子が黄体（ＣＬ）の形成と維持を補助するのに充分な血清濃度のＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物を提供することである。そのような利点は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）処置との関連で月経周期の卵胞期の間に、好ましくはＦＳＨ処置の開始後５〜１０日の間にＬＨ化合物が注射されるときに得られる。
本発明のＬＨ化合物の一層さらなる利点は、医薬的に許容可能な分子がＣＬからの充分なプロゲステロン放出を刺激する濃度のＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物を提供することである。そのような利点は、ＦＳＨ処置との関連で月経周期の卵胞期の間に、好ましくはＦＳＨ処置の開始後５〜１０日の間に、又は排卵誘発との関連で、又は胚移植との関連で、又は黄体期若しくは妊娠期のある時にＬＨ化合物が注射されるときに得られる。
本発明のさらなる態様は、ＬＨ化合物、及び随意で医薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含んでなる医薬組成物に関する。そのような組成物は１つ以上のＬＨ化合物を含んでいてよい。
本発明の一層さらなる態様は、生殖補助技術処置、例えばＩＶＦ処置若しくはＩＣＳＩ処置などの哺乳類対象の不妊治療、又は精巣の下降不全の治療において使用される、又は、低ゴナドトロピン性（hypoganadotropic）の性機能低下症におけるステロイド産生の増加に使用される本発明のＬＨ化合物に関する。ＬＨ化合物は通常、哺乳類対象の生殖能力の促進に使用される。
本発明は、本発明のＬＨ化合物を必要とする哺乳類動物にそのＬＨ化合物を投与することを含んでなる哺乳類対象の不妊治療の方法にも関する。
また、本発明は、本発明のＬＨ化合物を必要とする哺乳類動物にそのＬＨ化合物を投与することを含んでなる哺乳類対象の生殖能力を促進する方法に関する。
さらに、本発明者らは、医薬的に許容可能な分子に結合した哺乳類ＬＨ又はその類似体、例えばアルブミンに融合した、又は哺乳類抗体のＦｃ断片若しくは哺乳類抗体のＦｃ断片の変異体に融合した、又はアシル化基若しくはＰＥＧと複合体化した、例えば、ヒトＬＨを含んでなる長期作用性改変ＬＨが、哺乳類動物においてＬＨ受容体を刺激及び活性化し、そして、哺乳類動物において２時間から４８時間まで、通常４時間から２８時間まで、例えば６〜８時間である哺乳類ＬＨ若しくはその類似体、又は前記改変ＬＨのインビボ血漿内半減期をもたらすことを理解している。卵胞期に、又は黄体期の補助として投与された改変ＬＨが安全性、治療転帰及び患者の利便性を改善すると考えられている。本発明の長期作用性改変哺乳類ＬＨであって、その明示されたインビボ半減期を有するこの長期作用性改変哺乳類ＬＨはＦＳＨとの組合せで特に有用である。
従って、本発明のさらなる態様は、本発明の改変ＬＨとＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子を含んでなる医薬組成物に関する。その医薬組成物は、改変ＬＨとＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子の両方を含んでなる１つの組成物であり得、又は別々の組成物として改変ＬＨとＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子を含んでなる部分からなるキットであり得、その場合、そのような組成物は同時、断続的又は別々に投与され得る。
本発明は、哺乳類動物において２時間から４８時間までのインビボ血漿内半減期を哺乳類のＬＨ若しくはその類似体、又は改変ＬＨにもたらす医薬的に許容可能な分子に結合した哺乳類ＬＨ又はその類似体を含んでなる改変ＬＨであって、哺乳類雌対象の無排卵症の治療において卵胞発生、例えば少卵胞形成（paucifolliculogenesis）若しくは単一卵胞形成（unifolliculogenesis）を誘導するために、又は哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期にＣＯＳを導入するためにＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子と組み合わせて同時、断続的又は別々に使用される改変ＬＨにも関する。
本発明は、哺乳類雌対象の無排卵症の治療において卵胞発生、例えば少卵胞形成（paucifolliculogenesis）又は単一卵胞形成（unifolliculogenesis）を誘導する方法、又は哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期にＣＯＳを導入する方法であって、哺乳類動物において２時間から４８時間までのインビボ血漿内半減期を哺乳類のＬＨ若しくはその類似体、又は改変ＬＨにもたらす医薬的に許容可能な分子に結合した哺乳類ＬＨ又はその類似体を含んでなる改変ＬＨの有効量を、その改変ＬＨを必要とする哺乳類動物にＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子と組み合わせて同時に、断続的に、又は別々に投与することを含んでなる方法にも関する。
さらなる態様では、本発明は、ＣＬによるプロゲステロン産出を強化するため、及び子供の分娩率を高めるため、不育症を有する女性に妊娠の最初の１２週間の間にＬＨ化合物を投与することに関する。
従って、さらなる態様では、本発明は、哺乳類動物において２時間から４８時間まで、通常４時間から２８時間まで、例えば６〜８時間のインビボ血漿内半減期を哺乳類のＬＨ若しくはその類似体、又は改変ＬＨにもたらす医薬的に許容可能な分子に結合した哺乳類ＬＨ又はその類似体を含んでなる改変ＬＨに関する。上述のように、そのような改変ＬＨはＦＳＨ処置との組合せにおいて特に有用である。
哺乳類ＬＨは哺乳類動物のＬＨ、例えば霊長類のＬＨ（例えば類人猿（abe）又はサルＬＨ）、ヒトＬＨ、及びウマＬＨから選択され得る。ＬＨは哺乳類ＬＨの類似体であってもよく、そして、通常その類似体は前記ＬＨの対応する哺乳類配列に対して少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性を有する。
哺乳類ＬＨは別の分子、好ましくは医薬的に許容可能な分子に結合しており、そして、本明細書において改変ＬＨと呼称されるものが本改変ＬＨである。哺乳類ＬＨは、先行技術文献に記載されるような様々な方法で、例えば、限定されないが、二官能性リンカーを介した化学結合、ＬＨ、例えばｈＬＨのＮ末端又はＣ末端のアルブミンなどの医薬的に許容可能な分子への結合による遺伝子技術で、医薬的に許容可能な分子に結合され得る。特に、アルブミン、例えばヒトアルブミンのＮ末端をｈＬＨのα鎖のＮ末端又はｈＬＨのβ鎖のＣ末端に結合することができる。ｈＬＨのその２つの鎖、すなわち、α鎖及びβ鎖はリンカーペプチドを介して連結され得、そうして１つのポリペプチド配列が産生され、次にそのポリペプチド配列が、例えば化学的連結又は遺伝的連結により、医薬的に許容可能な分子に連結され得る。
哺乳類ＬＨは安定なリンカー又はより不安定なリンカーを介して医薬的に許容可能な分子に結合され得る。いくつかのリンカーが当技術分野において知られており、それらのリンカーには二官能性ＰＥＧ分子（例えば、Paige et.al Pharmaceutical Research, vol. 12, no. 12, 1995を参照のこと）、加水分解性リンカー（Shechter et al Bioconjugate Chem. 2005, 16, 913-920 及び International Journal of Peptide Research and Therapeutics, Vol. 13, Nos. 1-2, June 2007 及び国際公開第２００９０９５４７９号）、ＰＤＰＨ及びＥＭＣＨ（例えば、国際公開第２０１００９２１３５号を参照のこと）が含まれる。ｈＬＨなどの哺乳類ＬＨの医薬的に許容可能な分子への化学的結合（２つ以上の分子の結合）がＬＨの機能活性を大いに低減させる特殊な場合では、哺乳類ＬＨを放出し得るより不安定なリンカーを使用することが好ましい場合がある。
哺乳類ＬＨはグリコシル化されてよく、その場合、医薬的に許容可能な分子への結合はそのような糖部分を介したものであり得、又は糖部分が挿入され、ＬＨアゴニストと医薬的に許容可能な分子の間に連結部を作製するために使用され得る。
哺乳類ＬＨは１つ以上の医薬的に許容可能な分子に結合していてよく、又は、１つの医薬的に許容可能な分子が１つ以上の哺乳類ＬＨに結合していてよく、通常哺乳類ＬＨは１〜５つの、例えば、１つ又は２つの医薬的に許容可能な分子に結合している。例えば、１つのｈＬＨは１つのアルブミン、例えばヒトアルブミン又は改変アルブミンに結合している。
本発明のさらなる態様は、本発明のＬＨ、及び随意で医薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含んでなる医薬組成物に関する。そのような組成物は１つ以上の改変ＬＨを含み得る。
本発明の一層さらなる態様は、女性のヒトにおける生殖補助医療のための方法であって、
ａ．月経周期の第１〜第３周日にＦＳＨを投与することにより刺激を開始すること、
ｂ．前記の刺激を開始して第４〜第７日から排卵誘発までＧｎＲＨアンタゴニストを投与すること、
ｃ．前記の刺激を開始して第１〜第９日からの期間において、排卵誘発まで卵胞発生を刺激するのに充分な少なくとも1回投与量のＬＨアゴニストを投与することにより、前記女性にＬＨアゴニストを供給すること、
ｄ．少なくとも１つの卵胞が１２〜１４ｍｍの直径を有するときにＦＳＨの投与を中断すること、
ｅ．少なくとも１つの卵胞が少なくとも１５ｍｍの直径を有するときに少なくとも1回投与量のＧｎＲＨアゴニストを用いて排卵を誘導すること、
を含んでなる前記方法を提供する。
本発明の刺激法は、適切な数の卵胞が補充されたときにＦＳＨ投与を中断することにより、及び比較的未熟な卵胞がさらに発達することなく、最大の卵胞の成熟を確実にするためにこの時点でｈＣＧ（又はＬＨ）投与に切り替えることにより公知の方法を改善することを求めるものである。排卵時における多数の未熟な卵胞がＯＨＳＳのリスクを上昇させることが、当技術分野において知られている。
ＯＨＳＳのリスクは、ＧｎＲＨアゴニスト誘発剤注射を使用して排卵を誘発し、そうして排卵を誘発するために高投与量のｈＣＧを投与する必要性を除去することによりさらに低下する。
本発明の好ましい実施形態では、卵胞刺激の間に投与されるｈＣＧは長期作用性ｈＣＧ又は長期作用性ＬＨである。長期作用性ｈＣＧ又はＬＨの使用にはいくつかの利点がある。注射の回数が減少するので、患者コンプライアンスが改善することは明らかである。ｈＣＧ又はＬＨが蓄積する危険性は、そのタンパク質が卵胞期の間に１回だけ、又は２回だけ投与されるときは無いので、この長期作用性ｈＣＧ又はＬＨの使用がＯＨＳＳのリスクがさらにずっと減少し得ることも予期される。
長期作用性ｈＣＧ又はＬＨが前記刺激法の最初の数日のうちの１日に単回用量として投与され得ることも考えられる。薬品、例えば組換えタンパク質をボーラス注射すると、ほとんど常に血清レベルが最初に上昇し、その後、その薬品の血清半減期に応じて安定した率で低下するより低いレベルにまで血清レベルが下落する。前記刺激法の最初の数日の間、ｈＣＧ又はＬＨの受容体は顆粒膜細胞では未だ活性が無く、周囲を覆う莢膜細胞では構成的に発現している。この卵胞発生のステージで提供されるＬＨ活性により、莢膜細胞によるアンドロゲンの産出が強化される可能性がある。これらのアンドロゲンは顆粒膜細胞に影響して顆粒膜細胞のＦＳＨ受容体発現を増強し、それにより外部より投与されたＦＳＨに対して顆粒膜細胞をより敏感にし、それにより卵胞の健康を改善する可能性がある（Eilso Nielsen M, Rasmussen IA, Kristensen SG, Christensen ST, MoIlgard K, Wreford Andersen E, Byskov AG, Yding Andersen C: Expression of Androgen-receptor mRNA in granulosa cells from human small antral follicles and the corresponding follicular fluid concentrations of androgens are positively correlated to granulosa cell FSH receptor mRNA expression. Mol. Hum. Reprod. 2011;17:63-70. PMID: 20843821）。このことは、ｈＣＧのボーラス注射により生じる血清濃度の上昇が顆粒膜細胞の応答性を改善し、そして、前記受容体が顆粒膜細胞で活性化する前にその血清濃度の上昇が終了し得ることを意味する。この後、ｈＣＧのより適切で安定な血清レベルを適正な卵胞の成熟及び発達のために得ることができる。
本発明のいくつかの実施形態では、刺激期間において投与された長期作用性ｈＣＧ又はＬＨ投与は排卵まで卵胞発生を補助するためにのみ充分である。他の実施形態では、前記投与量は本発明により黄体期を補助するのにも充分である。
代替法では、排卵誘発は、比較的低いｈＣＧの投与量であって、２０００ＩＵ以下、例えば１５００ＩＵ以下、例えば１０００ＩＵ以下、例えば７５０ＩＵ、５００ＩＵ、又は２００ＩＵである投与量を投与することにより行われる。投与量は１０００ＩＵと２０００ＩＵの間であることが好ましい。排卵誘発はＧｎＲＨアゴニストの共投与を含むこともできる。この代替法では、排卵誘発のためのｈＣＧの投与量が先行技術における排卵誘発のために用いられる投与量よりも著しく少ないため、ＯＨＳＳのリスクも本質的に低い。
別の態様では、本発明は、生殖補助医療を受けている雌に黄体機能を補充する方法であって、黄体期の間に、少なくとも排卵後２週間までＬＨアゴニストを投与することを含んでなる前記方法に関する。
この態様によれば、ＬＨアゴニストは排卵時又は採卵時のあたりから投与され、そして、黄体期の間は投与が続く。ＬＨアゴニスト投与が少なくとも排卵後２８日まで続くことが好ましい。
黄体期の間に投与されるＬＨアゴニストは、本明細書に記載されるようなＬＨ又はＬＨ類似体又はＬＨ変異体であることが好ましい。
ＬＨ及びｈＣＧ並びに長期作用性型のこれらのホルモンは、本願に記載されるような投与量及び間隔で投与され得る。前記の雌は本発明による生殖補助医療を受けた雌であり得る。前記雌は、排卵の誘発のためにｈＣＧのボーラス注射を受けた雌を含む、先行技術による調節卵巣刺激を受けた雌でもあり得る。後者の雌は、排卵誘発後約１週間の間、黄体機能を補充する充分な血清レベルのｈＣＧを有する。
好ましい実施形態では、ＬＨアゴニストは排卵後少なくとも６週間、例えば７週間、例えば８週間、例えば９週間、例えば受精後１０週間まで投与される。
長期作用性ｈＣＧ又は長期作用性ＬＨは、排卵誘発期及び／又は黄体期及び／又は妊娠期の間に１日おきに、例えば２日おきに、例えば３日おきに、例えば４日おきに、例えば５日おきに、例えば６日おきに、例えば７日おきに、例えば８日おきに、例えば９日おきに投与され得る。
長期作用性ｈＣＧ又は長期作用性ＬＨは、排卵誘発期及び／又は続いて起きる黄体期及び／又は続いて起きる妊娠期の間に１３日おきに、例えば２０日おきに、例えば毎月又はそれよりずっと少ない頻度で投与されてもよい。
本発明の調節卵巣刺激方法により概して次のパラメータのうちの１つ以上を含む改善がもたらされる：生化学的妊娠、生児出産、着床率の向上、胚保持率の向上、流産率の低下、子宮外妊娠流産率の減少、ＯＨＳＳ発症の減少、及び黄体期におけるプロゲステロン投与の必要性の減少又は喪失による利便性の向上。
本発明の卵胞刺激法は、インビトロ受精（ＩＶＦ）、卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）を介したインビトロ受精、子宮内授精（ＩＵＩ）、体外成熟（ＩＶＭ）、又は排卵のみなど、それらから得られる他の形態と併せて用いられ得る。
黄体機能を補充するための方法は、上記の刺激法の何れかと併せて、又はプロゲステロンレベルを刺激する必要があるあらゆる妊娠の試み、若しくは実際の妊娠との関連で用いられ得る。
さらなる態様では、本発明は、卵胞形成を誘導し、続いて起きる胚の着床を補助するための方法であって、
ａ．月経周期の第１〜第３周日にＦＳＨを投与することにより刺激を開始すること、
ｂ．前記の刺激を開始して第４〜第７日から排卵までＧｎＲＨアンタゴニストを投与すること、
ｃ．第１〜第９日からの期間において、排卵まで卵胞発生を刺激するのに充分である少なくとも1回投与量のｈＣＧを投与することにより、ＬＨアゴニストを投与すること、
ｄ．少なくとも１つの卵胞が１２〜１４ｍｍの平均直径を有するときにＦＳＨの投与を勇断すること、及び
ｅ．排卵後７〜１０日に少なくとも２０ｎｍｏｌ／Ｌの血清プロゲステロン濃度を生じさせるのに充分な1回投与量以上のＬＨアゴニストを投与することにより、黄体機能を補充すること
を含んでなる方法に関する。
この方法により、単一卵胞形成（monofolliculogenesis）又は少卵胞形成（paucifolliculogenesis）が起こり得る。その方法は無排卵症の女性における卵胞発生の刺激のために用いられることもできる。その方法はｈＣＧ誘発剤注射又はＧｎＲＨ誘発剤注射をＣＯＳ法の一部として用いる排卵誘発を含むこともできる。
本発明のさらなる態様は、安定的な濃度のアンドロゲンを供給し、そして、そのような若い少年に投与される注射の回数を減らすために、これらの少年にＬＨ化合物を供給することである。
本発明の一層さらなる態様は、精子産生を引き起こし、許容可能なレベルにアンドロゲンを維持するほど充分に精巣によるアンドロゲン産生を誘発することができる安定的な濃度のｈＣＧを供給するために、低ゴナドトロピン性の性機能低下症を有するそのような男性にＬＨ化合物を供給することである。
先行技術において知られている通りのｈＣＧ／ＧｎＲＨａを用いる典型的な短期アンタゴニスト法の模式図。図は月経周期の第１日から排卵誘発まで毎日のＦＳＨ投与を模式的に示す。一日用量のＧｎＲＨアンタゴニストが、およそ第６日に始まり排卵誘発まで投与される。卵胞が直径１６〜１８ｍｍのサイズに達したときにｈＣＧ又はＧｎＲＨアゴニストのボーラス注射により排卵が引き起こされる。３６時間後、卵母細胞が採取される。２日後、１つ以上の受精した胚が子宮に戻される。黄体機能を補充するためにプロゲステロンが例えば膣内投与又は筋肉内投与される。 ｈＣＧ／ＧｎＲＨアゴニスト誘発を用いる代替短期アゴニスト法の模式図。本方法は、本方法の第１日での長期作用性ＦＳＨ（コリフォリトロピン）の投与に基づく。第６日又は第７日以降、一日量の組換え又は尿由来ＦＳＨを投与してコリフォリトロピンを補う。ＧｎＲＨアンタゴニスト、誘発及び黄体機能補充は図１ａの通り。 長期持続性ＦＳＨ、例えばコリフォリトロピンの１回のボーラス注射により（複数の）一日量のＦＳＨが置き換えられている、本発明の例となるＣＯＳ法。卵胞発生は長期作用性ｈＣＧ（Ｓ−ｈＣＧ）の投与により補助され、その長期作用性ｈＣＧ（Ｓ−ｈＣＧ）は卵胞の直径に応じておよそ第６日に投与される。ＧｎＲＨアンタゴニストは本方法の第６日あたりから投与され、ＧｎＲＨアゴニストを使用して排卵が誘発される。黄体機能は、プロゲステロンにより、又は本発明の黄体に関する方法を用いることにより（図４ａ又は４ｂ）補充され得る。 本発明による一例となる調節卵巣刺激（ＣＯＳ）法の模式図。ＦＳＨは一日量の尿由来ＦＳＨ又は組換えＦＳＨとして投与される。ＦＳＨ投与は、およそ１２〜１４ｍｍの卵胞のサイズに対応する第６日あたりから中断される。ＧｎＲＨアンタゴニストの一日量が、第６日に開始して排卵誘発まで投与される。第６日に長期作用性（長期持続性）ｈＣＧ又は長期作用性ＬＨのボーラス注射が投与される。ＧｎＲＨアゴニストの投与により排卵が引き起こされる。黄体機能補充は示されておらず、黄体期の間に図１ａのようにプロゲステロンの投与により、又はｈＣＧ若しくは長期作用性ｈＣＧ若しくはＬＨ若しくは長期作用性ＬＨの１回以上の皮下注射からなる投与により黄体機能補充が達成され得る。 卵胞の補充が一日量の組換えＦＳＨ又は尿由来ＦＳＨにより補助される、本発明の例となるＣＯＳ法。卵胞発生は、およそ１２〜１４ｍｍの卵胞サイズに対応する約第６日から一日量のｈＣＧ又はＬＨにより補助される。ＧｎＲＨアンタゴニストの一日量が、第６日から開始して排卵誘発まで投与される。ＧｎＲＨアゴニストの投与により排卵が引き起こされる。黄体機能補充は示されておらず、黄体期の間に図１ａのようにプロゲステロンの投与により、又はｈＣＧ若しくは長期作用性ｈＣＧ若しくはＬＨ若しくは長期作用性ＬＨの１回以上の皮下注射からなる投与により黄体機能補充が達成され得る。妊娠した場合、妊娠第５〜１０週まで黄体機能補充が継続され得る。 本発明の例となるＣＯＳ法。図２ｂの方法と比較して、長期作用性（長期持続性）ｈＣＧ又はＬＨの投与を黄体期まで継続して黄体機能を補充する。妊娠した場合、黄体機能は、妊娠第５〜第１０週まで黄体機能が補充され得る。 本発明の例となるＣＯＳ法。図３ａの方法と比較して、ｈＣＧ又はＬＨは組換え又は尿由来のｈＣＧ又はＬＨの毎日の注射として投与される。ｈＣＧは等価の投与量のＬＨで置き換えられてもよい。妊娠した場合、黄体機能は、妊娠第５〜第１０週まで黄体機能が補充され得る。 本発明の例となるＣＯＳ法。図３ｂの方法と比較して、ｈＣＧ／ＬＨ投与は既に月経周期の第２日からｈＣＧ又はＬＨの毎日の注射として始まる。あるいは、一日量は長期作用性ｈＣＧ又は長期作用性ＬＨの等価の投与量の１回以上の注射により置き換えられ得る。妊娠した場合、黄体機能は、妊娠第５〜第１０週まで黄体機能が補充され得る。 黄体機能補充を示す、本発明の例となる方法。（図中に示されていない）前記の刺激法に無関係に、一日量の尿由来又は組換えＬＨ又はｈＣＧが、排卵後のおよそ第２日に始まる黄体期の間に黄体機能を補充する。雌が妊娠している場合、妊娠第５週まで、例えば、妊娠第１０週まで、黄体機能が補充され得る。 黄体機能補充を示す、本発明の例となる方法。（図中に示されていない）前記の刺激法に無関係に、２〜７日ごとに投与される１用量以上の長期作用性ＬＨ又は長期作用性ｈＣＧが、排卵後のおよそ第２日に始まる黄体期の間に黄体機能を補充する。雌が妊娠している場合、妊娠第５週まで、例えば、妊娠第１０週まで、黄体機能補充が継続し得る。 様々な種に由来するゴナドトロピンα鎖のClustalX2アラインメント。配列は、Uniprotデータベースより引き出された。Uniprot識別名及び受託番号は次のとおりである。ヒト GLHA_HUMAN P01215マウス GLHA_MOUSE P01216ラット GLHA_RAT P11962 完全に保存されている残基は黒色の背景で強調されており、対応するアミノ酸残基はアラインメントの下に大文字で示されている。半保存的残基は灰色の背景で示されており、アラインメントの下に小文字で示されている。 ClustalX2 (Larkin,M.A., Blackshields, G., Brown, N.P., Chenna, R., McGettigan, P.A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I.M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J.D., Gibson, T.J., Higgins, D.G. (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23:2947-2948.)を用いて実行されたアラインメント。 様々な種に由来する黄体形成ホルモンβ鎖のClustalX2アラインメント。配列は、Uniprotデータベースより引き出された。Uniprot識別名及び受託番号は次のとおりである。ヒト： LSHB_HUMAN P01229マウス： LSHB_MOUSE O09108ラット： LSHB_RAT P01230ゴリラ： LSHB_GORGO Q2Q1P1チンパンジー： LSHB_PANTR Q2Q1P2 様々な種に由来する卵胞刺激ホルモンβ鎖のClustalX2アラインメント。配列は、Uniprotデータベースより引き出された。Uniprot識別名及び受託番号は次のとおりである。フォリトロピン・サブユニットβヒト： FSHB_HUMAN P01225マウス： FSNB_MOUSE Q60687ラット： FSHB_RAT P18427ゴリラ： FSHB_GORGO A1BN60チンパンジー： FSHB_PANTR Q2PUH2 ｒＨＡとｈＣＧを対照として用いる複合体１の非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ ｒＨＡと様々な濃度のｈＣＧを対照として用いる複合体１の還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ 精製した複合体１のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析 ｒＨＡとｈＣＧを対照として用いる複合体３の非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ ｒＨＡと様々な濃度のｈＣＧを対照として用いる複合体３の還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ 精製した複合体３のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析 ｒＨＡとｈＣＧを対照として用いる複合体４の非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ ｒＨＡと様々な濃度のｈＣＧを対照として用いる複合体４の還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ 精製した複合体４のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析 Ｋ４７３Ｐ−ｒＨＡとｈＣＧを対照として用いる複合体３Ｖ１の非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ Ｋ５７３Ｐ−ｒＨＡと様々な濃度のｈＣＧを対照として用いる複合体３Ｖ１の還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ 精製した複合体３Ｖ１のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析 Ｋ５７３Ｐ−ｒＨＡとｈＣＧを対照として用いる複合体４Ｖ１の非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ Ｋ５７３Ｐ−ｒＨＡと様々な濃度のｈＣＧを対照として用いる複合体４Ｖ１の還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ 精製した複合体４Ｖ１のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析 増幅した単一の遺伝子ベクターの形質移入前の確認 抗ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を使用する生成物１〜１０のウエスタンブロット 抗ゴナドトロピン共通αサブユニットを使用する生成物１〜１０のウエスタンブロット 抗ｈＣＧβサブユニットを使用する生成物１〜１０のウエスタンブロット 生成物１〜１０のＳＤＳ ＰＡＧＥ（非還元及び還元）分析 生成物１１〜１２のＳＤＳ ＰＡＧＥ（非還元及び還元）分析 ｈＣＧ、複合体３及び複合体４のインビトロ活性の測定 ｈＣＧ、複合体３ｖｌ、複合体４Ｖ１、生成物１１及び生成物１２のインビトロ活性の測定 ｈＣＧ、生成物２、生成物３、生成物４及び生成物５のインビトロ活性の測定 ｈＣＧ、生成物７、生成物８、生成物９及び生成物１０のインビトロ活性の測定 ４日間の毎日の投薬の後のｈＣＧのインビボ活性の測定 ４日間の毎日の投薬の後のｈＣＧ及び複合体３のインビボ活性の測定 ４日間の毎日の投薬の後のｈＣＧ及び複合体３のインビボ活性の測定 ４日間の毎日の投薬の後のｈＣＧ、複合体３及び複合体４のインビボ活性の測定 ４日間の毎日の投薬の後のｈＣＧ、複合体３Ｖ１及び複合体４Ｖ１のインビボ活性の測定 ４日間の毎日の投薬の後のｈＣＧ、生成物２、生成物３及び生成物８のインビボ活性の測定 ４日間の毎日の投薬の後のｈＣＧ、生成物１１及び生成物ｌ２のインビボ活性の測定 ４日間の毎日の投薬の後のｈＣＧ、生成物４、生成物５及び生成物１０のインビボ活性の測定 ４日間の毎日の投薬の後のｈＣＧ及び生成物７のインビボ活性の測定 第１日での１回のボーラス注射の後のｈＣＧ、複合体３、生成物１１及び生成物１２のインビボ活性の測定 下垂体を切除した雄ラットにおけるｈＣＧ、複合体３及び複合体３Ｖ１の薬物動態学的データ（線形目盛） 下垂体を切除した雄ラットにおけるｈＣＧ、複合体３及び複合体３Ｖ１の薬物動態学的データ（対数目盛） ｈＣＧ、複合体３及び複合体３Ｖ１の検量線 下垂体を切除した雄ラットにおけるｈＣＧ、複合体３及び複合体３Ｖ１の終末相半減期の計算 下垂体を切除した雄ラットにおけるｈＣＧ、複合体４Ｖ１、生成物１１及び生成物１２の薬物動態学的データ（線形目盛） 下垂体を切除した雄ラットにおけるｈＣＧ、複合体４Ｖ１、生成物１１及び生成物１２の薬物動態学的データ（対数目盛） ｈＣＧ、複合体４Ｖ１、生成物１１及び生成物１２の検量線 下垂体を切除した雄ラットにおけるｈＣＧ、複合体４Ｖ１、生成物１１及び生成物１２の終末相半減期の計算 下垂体を切除した雄ラットにおける生成物７及び生成物１０の薬物動態学的データ（線形目盛） 下垂体を切除した雄ラットにおける生成物７及び生成物１０の薬物動態学的データ（対数目盛） 生成物７及び生成物１０の検量線 下垂体を切除した雄ラットにおける生成物７及び生成物１０の終末相半減期の計算 正常な成体の雄ラットにおけるｈＣＧ、ＬＨ、複合体３、複合体３Ｖ１、生成物２、生成物３及び生成物７の薬物動態学的データ（線形目盛） 正常な成体の雄ラットにおけるｈＣＧ、ＬＨ、複合体３、複合体３Ｖ１、生成物２、生成物３及び生成物７の薬物動態学的データ（対数目盛） ＬＨ及び生成物７の検量線 正常な成体の雄ラットにおけるｈＣＧ、ＬＨ、複合体３、複合体３Ｖ１、生成物２、生成物３及び生成物７の終末相半減期の計算
定義
本文において、「ＬＨアゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト等の哺乳動物の黄体形成ホルモン受容体に結合し、それを活性化する、哺乳類又は非哺乳類起源の分子を意味する。ＬＨアゴニストは、有機小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質であり得、合成法、組換え法によって生成することができ、又は組織若しくは体液から得ることができる。「ＬＨアゴニスト」という用語には、本明細書で使用される場合、医薬的に許容し得るその塩も含まれる。「ＬＨアゴニスト」という用語には、ｈＬＨ、ｈＬＨ類似体及びｈＬＨ変異体、並びに長期作用性ｈＬＨが含まれる。前記用語には、ｈＣＧ、ｈＣＧ類似体及びｈＣＧ変異体、並びに長期作用性ｈＣＧも含まれる。
本明細書で使用される場合、「ＩＵ比」は、ある成分のＩＵの数値の、別の成分のＩＵの数値に対する比である。現在、ゴナドトロピンを生物学的なＩＵの代わりに（質量／ｇ）で表せることは、注目に値する。この場合、新しい数値をＩＵに変換するには、換算係数を用いることが必要となる。本明細書で使用される場合、哺乳動物における体内血漿中濃度は、ＥＬＩＳＡ又は当業者に既知の別の免疫学的方法によって測定され、１リットル当たりのＩＵ（ＩＵ／Ｌと交換可能に使用される）で表される。
本文において、「長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物」又は「ＬＨ化合物」という用語（これらの用語は本明細書の全体を通じて同義的に使用される）は、本明細書で使用される場合、医薬的に許容し得る分子に連結されたＬＨアゴニストを意味し、例えば、ｈＣＧ又はｈＬＨの特性を改変する目的でｈＣＧ又はｈＬＨに結合された医薬的に許容し得る分子を有するｈＣＧ又はｈＬＨである。「ＬＨ化合物」という用語には、本明細書で使用される場合、医薬的に許容し得るその塩も含まれる。
本文において、「改変黄体形成ホルモン」又は「改変ＬＨ」という用語（これらの用語は本明細書の全体を通じて同義的に使用される）は、本明細書で使用される場合、医薬的に許容し得る分子に連結された哺乳類ＬＨを意味し、例えば、ｈＬＨの特性を改変する目的でｈＬＨに結合された医薬的に許容し得る分子を有するｈＬＨである。「改変ＬＨ」という用語には、本明細書で使用される場合、医薬的に許容し得るその塩も含まれる。
本文において、「哺乳類新生児Ｆｃ受容体に対し結合性を有する分子」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳類新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する親和性、例えば強親和性、弱親和性又は中親和性等を有する、いかなる医薬的に許容し得る分子をも意味する。ＦｃＲｎは成体上皮組織において活性であり、腸管腔、肺気道、鼻腔面、膣表面、結腸表面及び直腸表面（米国特許第６，４８５，７２６号）で発現される。ＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＩｇＧ、Ｆｃ断片）から成る融合タンパク質は、ＦｃＲｎによって上皮性関門を通過して効率良く運搬され得るため、所望の治療用分子を全身投与するための非侵襲的手段を提供する。さらに、ＦｃＲｎ結合パートナーを含んで成る融合タンパク質は形質膜陥入し、ＦｃＲｎを発現している細胞によって保護される。分解の標的となる代わりに、これらの融合タンパク質は再度血行中に排出されて再循環し、それによって、これらのタンパク質の体内半減期は増加される。治療用タンパク質の効能を向上させるための１つのアプローチは、その血中滞留性を増加させることにより、より高い血中濃度、より低頻度の投与及び投与量の減少を可能にすることである。アルブミン融合体若しくは複合体の半減期、又はＦｃ融合体若しくは複合体の半減期は、ある場合においては、ＦｃＲｎへの、そのｐＨ依存的な結合に依存する。内皮細胞の表面上に発現されるＦｃＲｎは、ｐＨ依存的にアルブミン及び／又はＦｃと結合し、それを分解から保護する。ｐＨ６．０でそれぞれの野生型よりも強力にＦｃＲｎに選択的に結合するが、ｐＨ７．４では結合しない、いくつかのアルブミン変異体又はＦｃ断片変異体は、種々の動物モデルにおいてより長い終末相半減期を示す。Ｆｃを含有する分子に関して、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの境界に位置するいくつかの変異、例えば、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J Biol Chem. 279(8):6213-6）及び２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels. Nat Biotechnol. 23(10):1283-8）は、ＦｃＲｎに対する結合親和性及びＦｃ変異体を含有する分子の体内半減期を増加させることが示されている。しかし、ＦｃＲｎ結合性の増加と半減期の向上との間に、常に直接的な関係があるわけではない（Datta-Mannan A. et al., 2007. Humanized IgG1 Variants with Differential Binding Properties to the Neonatal Fc Receptor : Relationship to Pharmacokinetics in Mice and Primates. Drug Metab. Dispos. 35: 86-94）。ヒトアルブミンの変異体も、同様に、ＦｃＲｎに対する結合親和性及びアルブミン変異体含有分子の体内半減期を増加することを示している（ＷＯ２０１０／０９２１３５及びＷＯ２０１１／０５１４８９参照）。
本文において、「哺乳類抗体のＦｃ断片」という用語は、本明細書で使用される場合、定常領域、すなわち哺乳類抗体又はその断片のＦｃ断片を意味し、そのような哺乳類抗体は、霊長類（例えばヒト、類人猿、又はサル）；ウマ科（例えばウマ）等の哺乳動物に由来するＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥから選択され得る。典型的な哺乳類抗体のＦｃ断片は、ヒト抗体の組換えＦｃ断片、例えば、ヒトＩｇＧ抗体の組換えＦｃ断片である。対象タンパク質又はその断片に連結された免疫グロブリン定常領域から成る融合タンパク質の作製については、記述がある（例えば、米国特許第５，１５５，０２７号、同第５，４２８，１３０号、同第５，４８０，９８１号、及び同第５，８０８，０２９号参照）。これらの分子は、通常、連結された対象分子に関連する生物活性及びエフェクター機能の両方、又は免疫グロブリン定常領域に関連するいくつかの他の所望の特徴を有する。免疫グロブリンのＦｃ部分を含んで成る融合タンパク質は、増加された安定性、延長された血中半減期（Capon et al. (1989) Nature 337:525参照）及び新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）等のＦｃ受容体に対する結合性（米国特許第６，０８６，８７５号、同第６，０３０，６１３号、及び同第６，４８５，７２６号）を含む、いくつかの望ましい特性を融合タンパク質に与え得る。
本文において、「哺乳類抗体のＦｃ断片の変異体」又は「Ｆｃ変異体」という用語（本明細書の全体を通じて同義的に使用される）は、本明細書で使用される場合、Ｆｃ断片の一つ若しくは複数のアミノ酸残基（例えば１〜１０個のアミノ酸残基）が他のアミノ酸残基によって置換されている、及び／又は一つ若しくは複数のアミノ酸残基（例えば１〜１０個のアミノ酸残基）がＦｃ断片から欠失している、及び／又は一つ若しくは複数のアミノ酸残基（例えば１〜１０個のアミノ酸残基）がＦｃ断片に付加されている、及び／又はＦｃ断片中の一つ若しくは複数のアミノ酸残基（例えば１〜１０個のアミノ酸残基）が改変されている、哺乳類抗体のＦｃ断片を意味する。そのようなアミノ酸残基の付加又は欠失は、例えば、Ｆｃ断片のＮ末端及び／又はＦｃ断片のＣ末端で起こり得る。Ｆｃ変異体とは、天然Ｆｃから改変されているが、サルベージ受容体（salvage receptor）ＦｃＲｎに対する結合部位をなお含んで成る分子又は配列を指す（ＷＯ９７／３４６３１）。天然とは、人為的に改変されていないＦｃを指す。ＷＯ９６／３２４７８には、好ましいＦｃ変異体、及びサルベージ受容体との相互作用が記載されている。従って、一実施形態における「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含む。さらに、天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要とされない構造的特徴又は生物活性を与えてしまうことから除去され得る部位を含んで成る。従って、Ｆｃ変異体は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞内で発現される際のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、又は（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与える、又は関与する、一つ又は複数の天然Ｆｃの部位又は残基を欠いた分子又は配列を含んで成る。ＩｇＧのＦｃ領域を部位特異的変異誘発等の周知の手順に従って改変することで、ＦｃＲｎが結合する改変されたＩｇＧ又はＦｃ断片又はその部分を得ることができる。そのような改変には、ＦｃＲｎへの結合性を保存する、又は増強さえする、ＦｃＲｎ接触部位から離れた位置での改変及び接触部位内での改変が含まれる。例えば、以下の、ヒトＩｇＧ１のＦｃ（Ｆｃｙ１）内の単一アミノ酸残基は、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合親和性の有意な喪失無しに、置換され得る：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ、及びＫ４４７Ａ。ここで、例えばＰ２３８Ａは、２３８位でアラニンによって置換された野生型プロリンを表す。アラニンに加えて、他のアミノ酸も、上記の特定の位置で野生型アミノ酸と置換され得る。変異をＦｃに単独で導入することで、天然Ｆｃとは異なるＦｃＲｎ結合パートナーを２００種以上生み出すことができる。さらに、これらの個々の変異のうちの２つ、３つ、又はそれより多くの組み合わせを同時に導入して、数百種のより多くのＦｃＲｎ結合パートナーを生じさせることができる。上記変異のうちのいくつかは、ＦｃＲｎ結合パートナーに新しい機能性を与え得る。例えば、一実施形態では、Ｎ２９７Ａが組み込まれることで、高度に保存されたＮ−糖鎖付加部位が除去される。この変異の影響は、免疫エフェクター細胞への結合性を低減し、免疫原性を潜在的に低減することにより、ＦｃＲｎ結合パートナーの血中半減期を延長すること、並びに、ＦｃＲｎ結合パートナーを、ＦｃＲｎに対する親和性を損なうことなく、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩＡ、ＦｃｙＲＩＩＢ、及びＦｃｙＲＩＩＩＡに結合できなくすること、である（Routledge et al. (1995) Transplantation 60:847; Friend et al. (1999) Transplantation 68:1632; Shields et al. (1995)J Bioi. Chern. 276:6591）。さらに、少なくとも３つのヒトＦｃγ受容体が、ＩｇＧ上の下ヒンジ領域内の結合部位（通常アミノ酸２３４〜２３７）を認識するようである。従って、新しい機能性及び潜在的な低減された免疫原性の別の例は、例えば、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸２３３〜２３６「ＥＬＬＧ」を、ＩｇＧ２由来の対応配列「ＰＶＡ」で置換すること（１つのアミノ酸欠失を有する）等による、この領域の変異から生じ得る。種々のエフェクター機能を仲介するＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、及びＦｃｙＲＩＩＩは、そのような変異が導入された場合、ＩｇＧ１に結合しないことが示されている（Ward and Ghetie (1995) Therapeutic Immunology 2:77およびArmour et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613）。上記の変異により生じる新しい機能性のさらなる例としては、いくつかの場合で、ＦｃＲｎに対する親和性が、野生型の親和性を超えて、増加され得る。この増加した親和性は、「結合」速度の増加、「解離」速度の減少、又は「結合」速度の増加及び「解離」速度の減少の両方を示し得る。ＦｃＲｎに対する親和性の増加を与えることが考えられる変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、及びＮ４３４Ａが含まれる（Shields et al. (2001) J. Bioi. Chern. 276:6591）。さらに、Ｆｃ断片のそのような変異体には、限定はされないが、例えばAtwell et all J. Mol. Biol. (1997), 270, 26-35 and in Ridgway et al Protein Engineering, vol. 9, no. 7, pp 617-621, 1996に記載の「ノブと穴（knob-into-hole）」又は「ＫｎＨ」技術が含まれる。「ノブと穴」又は「ＫｎＨ」技術という用語は、本明細書で使用される場合、２つのポリペプチドが相互作用する境界で、隆起（ノブ）を一方のポリペプチドに導入し、空洞（穴）をもう一方のポリペプチドに導入することにより、インビトロ又はインビボでの２つのポリペプチドの対合を方向づける技術を指す。例えば、ＫｎＨは、Ｆｃ：Ｆｃ結合接触部分、ＣＬ：ＣＨＩ接触部分又は抗体のＶＨ：ＶＬ接触部分に導入されている（例えば、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＵＳ１２／８１１，２０７、ＵＳ２０１００２８６３７４、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１及びZhu et al. (1997) Protein Science 6:781-788）。これは、多特異的抗体又はヘテロ二量体Ｆｃ融合分子の製造中、２つの異なる重鎖の対合を促進する際に特に有用である。例えば、Ｆｃ領域内にＫｎＨを有する多特異的抗体は、各Ｆｃ領域に連結した１つの可変領域をさらに含んで成り得、又は類似の若しくは異なる軽鎖可変領域と対合する異なる重鎖可変領域を含んで成り得る。ＫｎＨ技術を使用して、２つの異なる受容体細胞外ドメイン、又は異なる標的認識配列を含んで成るいかなる他のポリペプチド配列を対合させることもできる（例えば、アフィボディ（affibody）、ぺプチボディ（peptibod）及び他のＦｃ融合体を含む）。ＫｎＨ技術を使用して、Ｆｃ融合体における、例えばＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧ又はＴＳＨの様なゴナドトロピン分子内の２つの異なる鎖を対合させることもできる。
本文において、「医薬的に許容し得る塩」という用語は、処置される哺乳類対象に対して有害でない塩を示すことが意図されている。そのような塩としては、医薬的に許容し得る酸付加塩、医薬的に許容し得る金属塩、アンモニウム塩及びアルキル化アンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩としては、無機酸及び有機酸の塩が挙げられる。適切な無機酸の代表例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸等が挙げられる。適切な有機酸の代表例としては、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモン酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、ｐ‐アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。医薬的に許容し得る無機酸付加塩又は有機酸付加塩のさらなる例としては、J. Pharm. Sci. 66, 2, (1977)（参照によって本明細書に組み込まれる）中に列挙される医薬的に許容し得る塩が挙げられる。金属塩の例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。アンモニウム塩及びアルキル化アンモニウム塩の例としては、アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、エチルアンモニウム塩、ヒドロキシエチルアンモニウム塩、ジエチルアンモニウム塩、ブチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等が挙げられる。
本文において、「絨毛性ゴナドトロピン」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳類起源の絨毛性ゴナドトロピン（例えば、霊長類（例えばヒト）絨毛性ゴナドトロピン又はウマ科絨毛性ゴナドトロピン（例えばウマ絨毛性ゴナドトロピン））、及び組換え絨毛性ゴナドトロピン（例えば組換えヒト絨毛性ゴナドトロピン）、並びにそのような絨毛性ゴナドトロピンの類似体を意味する。本明細書で使用される場合、「ＣＧ」及び「絨毛性ゴナドトロピン」は置き換え可能である。ＣＧがｈＣＧ及び組換えｈＣＧ等の哺乳類絨毛性ゴナドトロピンの類似体である場合、前記類似体は、ＣＧ（例えばｈＣＧ）配列内の一つ若しくは複数のアミノ酸残基を別の天然若しくは非天然アミノ酸で置換することにより；及び／又は一つ若しくは複数の天然若しくは非天然アミノ酸をＣＧ（例えばｈＣＧ）配列に付加することにより；及び／又は一つ若しくは複数のアミノ酸残基をＣＧ（例えばｈＣＧ）配列から欠失させることにより得られる化合物であることが理解され、これらのステップのいずれにも、所望により、一つ又は複数のアミノ酸残基のさらなる誘導体化が後に続いてもよい。特に、１つのアミノ酸残基が同じ群に由来する別のアミノ酸残基により、すなわち類似の特性を有する別のアミノ酸残基により置換されるという意味では、そのような置換は保存的である。アミノ酸は、その特性に基づき、以下の群に好都合に分類されてもよい：塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えばグルタミン、システイン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン及びバリン）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）及び低分子アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）。典型的に、ＣＧはｈＣＧと少なくとも８０％の同一性を有し、典型的に、ｈＣＧのＣＧインビボ活性の少なくとも２０％を有する。
本文において、「黄体形成ホルモン」又は「哺乳類黄体形成ホルモン」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳類起源の黄体形成ホルモン（例えば霊長類（例えばヒト）、又はウマ黄体形成ホルモン）、及び組換え黄体形成ホルモン（例えば組換えヒト、ウマ、類人猿（abe）、又はサル黄体形成ホルモン）、並びにそのような黄体形成ホルモンの類似体を意味する。本明細書で使用される場合、「ＬＨ」及び「黄体形成ホルモン」は置き換え可能である。ＬＨがｈＬＨ及び組換えｈＬＨ等の哺乳類黄体形成ホルモンの類似体である場合、前記類似体は、ＬＨ（例えばｈＬＨ）配列内の一つ若しくは複数のアミノ酸残基を別の天然若しくは非天然アミノ酸で置換することにより；及び／又は一つ若しくは複数の天然若しくは非天然アミノ酸をＬＨ（例えばｈＬＨ）配列に付加することにより；及び／又は一つ若しくは複数のアミノ酸残基をＬＨ（例えばｈＬＨ）配列から欠失させることにより得られる化合物であることが理解され、これらのステップのいずれにも、所望により、一つ又は複数のアミノ酸残基のさらなる誘導体化が後に続いてもよい。特に、１つのアミノ酸残基が同じ群に由来する別のアミノ酸残基により、すなわち類似の特性を有する別のアミノ酸残基により置換されるという意味では、そのような置換は保存的である。アミノ酸は、その特性に基づき、以下の群に好都合に分類されてもよい：塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えばグルタミン、システイン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン及びバリン）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）及び低分子アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）。典型的に、ＬＨはｈＬＨと少なくとも８０％の同一性を有し、典型的に、ｈＬＨのＬＨインビボ活性の少なくとも２０％を有する。本発明の目的上、ｈＬＨ、ｈＬＨ類似体及び変異体、並びに長期作用性ｈＬＨは、ｈＣＧ、ｈＣＧ類似体及びｈＣＧ変異体、並びに長期作用性ｈＣＧを含まない。
本文において、「卵胞刺激ホルモン」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳類起源の卵胞刺激ホルモン（例えばヒト、ウマ、ウシ、又はブタの卵胞刺激ホルモン）、及び組換え卵胞刺激ホルモン（例えば組換えヒト、ウマ、ウシ、又はブタ卵胞刺激ホルモン）、並びにそのような卵胞刺激ホルモンの類似体を意味する。本明細書で使用される場合、「FSH」及び「卵胞刺激ホルモン」は置き換え可能である。卵胞成長の刺激に関して、ＦＳＨは、体外由来でもよく、あるいは、例えば、下垂体に対してエストラジオール拮抗剤として作用するクエン酸クロミフェンを与えることにより、女性の体内で通常よりも多量に産生されてもよい。
ＦＳＨがｈＦＳＨ及び組換えｈＦＳＨ等の哺乳類卵胞刺激ホルモンの類似体である場合、前記類似体は、ＦＳＨ（例えばｈＦＳＨ）配列内の一つ若しくは複数のアミノ酸残基を別の天然若しくは非天然アミノ酸で置換することにより；及び／又は一つ若しくは複数の天然若しくは非天然アミノ酸をＦＳＨ（例えばｈＦＳＨ）配列に付加することにより；及び／又は一つ若しくは複数のアミノ酸残基をＦＳＨ（例えばｈＦＳＨ）配列から欠失させることにより得られる化合物であることが理解され、これらのステップのいずれにも、所望により、一つ又は複数のアミノ酸残基のさらなる誘導体化が後に続いてもよい。特に、１つのアミノ酸残基が同じ群に由来する別のアミノ酸残基により、すなわち類似の特性を有する別のアミノ酸残基により置換されるという意味では、そのような置換は保存的である。アミノ酸は、その特性に基づき、以下の群に好都合に分類されてもよい：塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えばグルタミン、システイン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン及びバリン）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）及び低分子アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）。組換え生成されたＦＳＨ又はＦＳＨ類似体は、典型的には、ヒト細胞株又はハムスター細胞株等の哺乳類細胞株（例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、及びＨＥＫから選択される細胞株）に由来する。典型的に、ＦＳＨはｈＦＳＨと少なくとも８０％の同一性を有し、典型的に、ｈＦＳＨのＦＳＨインビボ活性の少なくとも２０％を有する。
「ＦＳＨ活性を有する分子」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物に投与された場合に、ＦＳＨ受容体に結合し、該受容体を活性化する分子を意味し、例えば、そのような分子は、限定はされないが、有機小分子のいずいれか１つから選択されてもよい。
本文において、「リンカー」という用語は、本明細書で使用される場合、ＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）と医薬的に許容し得る分子とを隔てる、原子価結合又は多官能性部分（例えば二官能性部分）を意味する。多官能性部分（例えば二又は三官能性）は、ＬＨ化合物（例えば改変ＬＨ）を作出するために、一つ又は複数のＬＨアゴニスト（例えば一つ又は複数の哺乳類ＬＨ）に共有結合的に連結され、且つ一つ又は複数の医薬的に許容し得る分子に共有結合的に連結される。リンカーは安定であり得るが、これは、重要な化学反応（例えば加水分解）が治療期間を通して生理的条件（例えば３７℃の温度及びｐＨ７．４）下で起こらないということを意味する。このことは、当該技術分野において既知の安定性試験によって決定することができる。リンカーは不安定であり得るが、これは、化学結合が、典型的には加水分解によって、生理的に適切な条件下（例えば３７℃の温度及びｐＨ７．４）で、切断されることを意味する。このことは、当該技術分野において既知の安定性試験によって決定することができる。リンカーは化学的なリンカーであってもよく、これは、生細胞外で有機化学によって生成されることを意味する。リンカーは糖部分（例えばタンパク質に対するグリコシル化）であってもよく、又は化学的に調製されて、ＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）と医薬的に許容し得る分子とを連結するのに使用されてもよい。リンカーは、ジスルフィド架橋、例えば、ＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）及び医薬的に許容し得る分子のそれぞれにおける２つのシステイン（Ｃｙｓ）アミノ酸残基間の−Ｓ−Ｓ−結合であってもよい。リンカーは融合リンカーであってもよく、これは、ＬＨ化合物（例えば改変ＬＨ）が、単一のポリペプチド又はタンパク質として生細胞内で発現され得ることを意味する。リンカーは、ＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）と、化学的部分を有する医薬的に許容し得る分子とを隔てる親水性リンカーであってもよく、該親水性リンカーは、３０〜５０％がＮ又はＯのいずれかである少なくとも５個の水素以外の原子を含んで成る。リンカーは、ＵＳ６５１５１００、ＵＳ７１２２１８９、ＵＳ７７００５５１、ＷＯ２００４０８９２８０、ＷＯ２００６１３８５７２及びＷＯ２００９０９５４７９に記載の様に、加水分解性であってもよい。本発明におけるリンカーとして有用な典型的な化合物としては、ジカルボン酸、マレミドヒドラジド（malemido hydrazide）、ＰＤＰＨ、ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＧＭＢＳ、カルボン酸ヒドラジド、及び小ペプチドを含む群から選択される化合物が挙げられる。本発明に記載のリンカーとして有用な化合物のより具体的な例としては、（ａ）コハク酸、グルタル酸、及びアジピン酸等のジカルボン酸；（ｂ）Ｎ−［マレイミドカプロン酸］ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、Ｎ−［マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＭＰＨ又はＢＭＰＨ）、４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド、及びＮ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）等のマレイミドヒドラジド；（ｃ）ＮＨＳ−３−マレイミドプロピオネートスクシンイミドエステル（ＭＰＳ−ＥＤＡ）；（ｄ）スルフヒドリル（sulfurhydryl）反応性タンパク質に結合した（３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド）等のＰＤＰＨリンカー；（ｅ）Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、（ｆ）スクシニミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、（ｇ）Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、並びに（ｈ）２〜５個の炭素原子から選択されるカルボン酸ヒドラジドが挙げられる。他の非ペプチドリンカーも可能である。例えば、ｍが２〜２０から選択される整数である−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）−等のアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ）、ＣＮ、ＮＨ2、フェニル等の立体的に障害にならないあらゆる基によって、さらに置換されていてもよい。好ましい非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカーである。本発明記載の有用なさらなるリンカーは、米国特許第６，６６０，８４３号に記載されている。医薬的に許容し得る分子がＬＨアゴニストと融合している本発明のＬＨ化合物は、所望により少なくとも１つのペプチドリンカーを含んでいてもよい。一実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された、２０種の天然に存在するアミノ酸から選択されるアミノ酸から成る。種々の実施形態では、リンカーは、１〜５個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１０〜５０個のアミノ酸、５０〜１００個のアミノ酸、又は１００〜２００個のアミノ酸を含んで成り得る。一実施形態では、前記アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択される。一実施形態では、リンカーは、グリシン及びアラニン等の立体的な障害にならないアミノ酸で大部分が構成されている。一実施形態では、リンカーは配列Ｇｎ（−（Ｇｌｙ）ｎ−と同義）を含んで成り得る。一実施形態では、リンカーは配列（ＧＧＳ）ｎ又は（ＧＧＧＧＳ）ｎを含んで成り得る。いずれの場合にも、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０等の整数である。リンカーの例としては、限定はされないが、ＧＧＧ、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号５９）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号６０）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５７）が挙げられる。一実施形態では、リンカーは８アミノ酸のリンカーＥＦＡＧＡＡＡＶ（配列番号５６）である。
ＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）及び医薬的に許容し得る分子、並びに所望により、介在する多官能性リンカー（二官能性リンカー）等の、２つ以上の分子を連結するための様々な手法が、先行技術において入手可能であり、本明細書で適切な参考文献はＷＯ０１５８４９３であり、その参考文献に列挙及び引用された全ての関連文書も含まれる。
本文において、「医薬的に許容し得る分子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）に連結された場合に、ＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）、又はＬＨ化合物（例えば改変ＬＨ）の血中半減期を延長させる、有機小分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、受容体、グリコシル化（glycosylation）、糖類、高分子（例えばポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、核酸（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）、ホルモンのうちのいずれか１つから選択される分子を意味する。典型的には、医薬的に許容し得る分子は、限定はされないが、アルブミン（例えばヒトアルブミン、組換えアルブミン）、又はＰＥＧ等の高分子（例えば分子量が少なくとも１０ｋＤａ（例えば１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ）のＰＥＧ）である。さらに、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類抗体のＦｃ断片、トランスフェリン、アルブミン（例えばヒトアルブミン、組換えアルブミン、アルブミン変異体）、ｎが８〜２２であるＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ−、又はＰＥＧ等の高分子（例えば分子量が少なくとも５ｋＤａ（例えば１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、典型的には１０〜４０ｋＤａ）のＰＥＧ）から選択されてもよい。
本文において、「生体内血漿内半減期」という用語は、その通常の意味で使用され、すなわち、生体系におけるＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）、又はＬＨ化合物（例えば改変ＬＨ）の量が、生物学的プロセスにより、その値の２分の１に減少するのに必要な時間である。
「血漿内半減期」又は「半減期」と同義的に使用され得る「血中半減期（serum half-life）」という用語は、その通常の意味で使用され、すなわち、生体系におけるＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）、又はＬＨ化合物（例えば改変ＬＨ）、組換え若しくは尿由来ｈＣＧ若しくはＬＨ若しくはＦＳＨ、又は長期作用性ｈＣＧ、長期作用性ＬＨ若しくは長期作用性ＦＳＨの量がその濃度の２分の１に減少するために必要な時間である。従って、本明細書で使用される場合、「血中半減期」は、体内血中半減期を意味する。血中半減期の決定は、しばしば、機能半減期を決定するよりもより単純であり、血中半減期の規模は、通常、体内機能半減期の規模の良い指標である。血中半減期は、哺乳動物において、より好ましくはヒト科の１種（例えばオラウータン、チンパンジー又はゴリラ）において、より好ましくはヒトにおいて、測定されることが好ましい。本出願で言及される血中半減期は、ヒトにおいて決定された半減期である。半減期又は半減期におけるあらゆる変化の指標は、げっ歯類（例えばマウス又はラット又はハムスター）において得ることもできる。さらに、ヒトと同じ範囲の体重、又はげっ歯類：好ましくはサル、イヌ、ブタ、若しくはウシ（仔ウシ）よりもヒトの体重により近い体重を有する、より大型の哺乳動物において、半減期を測定することができる。組換え又は尿由来ゴナドトロピン（ＦＳＨ、ＬＨ又はｈＣＧ）よりもより長い半減期を有するゴナドトロピンは、本発明に記載の「長期作用性」と見なされる。
血漿内半減期に関連して使用される「延長した」という用語は、同等の条件下で決定された、ＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）の半減期と比較して、ＬＨ化合物（例えば改変ＬＨ）の関連半減期が統計的に有意に延長されることを示すために使用される。例えば、関連半減期は、少なくとも約２５％だけ、例えば少なくとも約５０％だけ、例えば、少なくとも約１００％、１５０％、２００％、２５０％、又は５００％だけ、延長され得る。文献に記載されるいくつかの方法で生体内血漿内半減期の測定を行うことができる。生体内血漿内半減期の延長は、クリアランスの減少として、又は平均滞留時間（ＭＲＴ）の延長として、定量され得る。適切なアッセイで決定されたクリアランスが、ＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）のクリアランスの７０％未満、例えば５０％未満、例えば２０％未満、例えば１０％未満に減少した本発明のＬＨ化合物（例えば改変ＬＨ）は、延長された生体内血漿内半減期を有すると考えられる。適切なアッセイにおいて、ＭＲＴが、ＬＨアゴニスト（例えば哺乳類ＬＨ）のＭＲＴの１３０％超、例えば１５０％超、例えば２００％超、例えば５００％超に増加した本発明のＬＨ化合物（例えば改変ＬＨ）は、延長された生体内血漿内半減期を有すると考えられる。適切な試験動物を使用する標準的な薬物動態研究において、クリアランス及び平均滞留時間を評価することができる。所与のタンパク質に適切な試験動物を選択することは、当業者の能力の範囲内である。ヒトでの試験が、もちろん、最終的な試験である。適切な試験動物としては、正常な、Sprague-Dawley系雄ラット、マウス及びカニクイザルが挙げられる。典型的には、マウス及びラットは単回皮下ボーラス注射をされ、一方、サルは単回皮下ボーラス注射又は単回静注投与量注射をされ得る。注射される量は試験動物によって異なる。その後、クリアランス及びＭＲＴの評価用に、１〜１０日目に亘って、必要に応じて（アッセイの感度に応じて、３０日間にもなり得る）血液試料が採血される。血液試料はＥＬＩＳＡ法又は他の免疫学的方法によって好都合に分析される。
本文において、「哺乳類起源」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物から得らたものを意味し、従って哺乳類起源のＬＨアゴニストは、例えば哺乳動物の組織若しくは血液から得られるヒトＣＧ若しくはヒトＬＨであり得るか、又は、組換えタンパク質、組換えポリペプチド等の組換え法によって得られるものであり得、例えば、哺乳類起源のＬＨアゴニストは、組換え哺乳類ＣＧ若しくは組換え哺乳類ＬＨ（例えば組換えヒトＣＧ又はＬＨ）であり得る。
本文において、「非哺乳類起源」という用語は、本明細書で使用される場合、合成ペプチド、オリゴペプチド及びポリペプチド又は有機小分子等の、哺乳動物ではない供給源から得られたものを意味し、例えば、非哺乳類起源のＬＨアゴニストは、ＬＨ受容体と結合しそれを活性化する有機小分子又は５〜２０アミノ酸の短ペプチドであり得る。
本文において、「血漿中濃度」という用語本明細書で使用される場合、ＬＨアゴニスト注射後のあらゆる特定の時点においての、血流中で測定することができる濃度を意味する。
本文において、「注射」という用語は、本明細書で使用される場合、注射器又は他の投与装置を用いる、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射又は静脈内注射等の非経口経路による投与を意味する。
本文において、「ＦＳＨ処置」という用語は、本明細書で使用される場合、標準的な卵胞刺激ホルモン処置を意味する。ＦＳＨは、自然月経周期の開始時の卵胞補充（すなわち、初期の卵胞の増殖）に必要とされ、中期及び後期の卵胞形成も補佐する。ＦＳＨは治療のために投与されて、無排卵の女性及びＣＯＳを受けている女性において、卵胞形成を誘導する。従来の排卵刺激法では、ＦＳＨは、卵母細胞が回収される時まで、治療の全体を通して投与される。
本文において、「類似体（analog）」又は「類似体（analogue）」（本明細書の全体を通じて同義的に使用される）という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチド若しくはタンパク質の一つ若しくは複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されている、及び／又は一つ若しくは複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失されている、及び／又は一つ若しくは複数のアミノ酸残基がポリペプチド若しくはタンパク質に付加されている、ポリペプチド又はタンパク質を意味する。アミノ酸残基のそのような付加又は欠失は、例えば、ペプチドのＮ末端で、及び／又はペプチドのＣ末端で起こり得る。単純な体系を用いて類似体を記載することができる：例えば、変異Ｒ１３３Ｃを含むｈＣＧ類似体は、ｈＣＧの１３３位の自然発生的なＲがＣで置換されている類似体を指定する。別の例では、変異Ｌ１２１Ｃを含むｈＬＨ類似体は、ｈＬＨβ鎖の１２１位の自然発生的なＬがＣで置換されている類似体を指定する。ポリペプチドタンパク質類似体又はタンパク質類似体の式は、ＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ命名法に従って用いられる、アミノ酸に対する標準的な一文字略語を用いて記される。
本文において、「同一性」という用語は、本明細書で使用される場合、配列比較によって決定される、２つ以上のタンパク質の配列間の関係を指す。当該技術分野においては、「同一性」は、２つ以上のアミノ酸残基から成る文字列の間の一致数によって決定される、タンパク質間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、特定の数学モデル又はコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により対処される、ギャップアラインメント（仮にあれば）を有する２つ以上の配列のより小さい方の間の、完全一致率を量るものである。関連タンパク質の同一性は、既知の方法により容易に算出することができる。そのような方法としては、限定はされないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48, 1073, (1988)に記載のものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験配列間で最も大きな一致が得られるように設計される。同一性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ、例えばＧＡＰ（Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12, 387, (1984); Genetics Computer Group、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, (1990)）が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及び他の供給源（BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al.、上記）から公的に入手可能である。よく知られているSmith‐Watermanアルゴリズムを使用して、同一性を決定することもできる。例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（Genetics Computer Group、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、パーセント配列同一性が決定される２つのタンパク質を、それらの各アミノ酸が最適マッチングするように整列させる（アルゴリズムにより決定される「一致範囲」）。ギャップ開始ペナルティ（３×平均対角（average diagonal）として算出され、ここで「平均対角」は、使用されている比較マトリックスの対角の平均である；「対角（diagonal）」は、特定の比較マトリックスによって各々の完全アミノ酸一致に割り当てられるスコア又は数値である）及びギャップ伸長ペナルティ（通常、｛分数（１／１０）｝×ギャップ開始ペナルティである）、ならびにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスは、前記アルゴリズムと組み合わせて用いられる。また、標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについてはDayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978)を参照；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについてはHenikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89, 10915-10919, (1992)を参照）が、アルゴリズムによって使用される。タンパク質配列比較のための好ましいパラメータには以下が含まれる：アルゴリズム：Needleman et al., J. Mol. Biol, 48, 443-453, (1970)；比較マトリックス：Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919, (1992)からのBLOSUM6２；ギャップペナルティ：１２、ギャップ長ペナルティ：４、類似性の閾値：０。ＧＡＰプログラムは上記パラメータを用いると有用である。前記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いたタンパク質比較（末端ギャップにはペナルティ無し）のための初期パラメータである。アミノ酸配列相同性／同一性は、例えば、初期パラメータを使用するClustalWプログラム（バージョン１．８、１９９９年６月）を用いて、整列された配列から好都合に決定され（Thompson et al., 1994, ClustalW: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680）、ＧＥＮＥＤＯＣ（バージョン２．５）を用いて解析される（Nicholas et al., 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW.NEWS 4:14; Nicholas, K. B. and Nicholas H. B. Jr. 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation）。
哺乳類種の循環血液中で最も量が多いタンパク質成分は血清アルブミンである。血清アルブミンは通常、全血の１００ミリリットル当たりおよそ３〜４．５グラムの濃度で存在する。血清アルブミンは、循環系でいくつかの重要な機能を有するおよそ７０，０００ダルトン（Ｄａ）の血液タンパク質である。血清アルブミンは、血液中に存在する種々の有機分子の輸送体として、血流中の脂肪酸及びビリルビン等の種々の代謝産物の主な輸送体として、並びに、その存在量から、循環血液の浸透圧調節因子として、機能する。本文において、「アルブミン」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳類起源又は非哺乳類起源のアルブミンを意味し、例えば、Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-552110-3)に記載されるヒト血清アルブミン、又は組換えヒトアルブミン、又は改変アルブミン（例えばＷＯ２０１１０５１４８９及びＷＯ２０１００９２１３５に記載のように改変されたヒトアルブミン）である。
ＷＯ２０１１０５１４８９の記述は、親アルブミンと比較して変化した血漿内半減期を有する親アルブミンの変異体に関する。また、本発明は前記変異アルブミンを含んで成る融合ポリペプチド及び複合体にも関する。
ＷＯ２０１００９２１３５では、アルブミンの三次元構造に基づき、遊離チオール基を有する一つ又は複数のシステイン残基を有する変異ポリペプチド（変異タンパク質）（以後、「チオ−アルブミン」と称す）が設計された。変異ポリペプチドは、システイン残基の硫黄原子を介して、生物活性化合物等の結合パートナーに結合していてもよい。
ＷＯ２００５０５４２８６の記述は、アルブミン（限定はされないが、アルブミンの断片又は変異体）に融合された、血小板新生特性又は抗炎症性特性を示すインターロイキン１１（ＩＬ−１１）（限定はされないが、その断片及び変異体も含む）を含んで成るタンパク質に関する。
ＷＯ２００４０８３２４５では、ＮＳ患者において天然に産生されたアルブミンよりも長い半減期を有する作用物質について記述されており、該作用物質は第二ポリペプチドに結合したアルブミン様第一ポリペプチドを含んで成る。
ＷＯ０３０６６６８１では、高度に精製された組換えヒト血清アルブミンの添加によって安定化される非アルブミンタンパク質を含んで成る組成物について記述されている。非アルブミンタンパク質は第ＶＩＩＩ因子であり得る。
本文において、「高分子」という用語は、本明細書で使用される場合、高分子がヒトアルブミン又は別の多量な血漿タンパク質である場合を除いて、単量体のいずれもアミノ酸残基ではない、２つ以上の単量体の共有結合によって形成される分子を意味する。「高分子」という用語は、「高分子」という用語と置き換え可能に使用され得る。前記用語は、インビトロでのグリコシル化により結合される炭水化物分子を包含することが意図される。Ｎ−又はＯ−グリコシル化（以下にさらに記載される）等のインビボでのグリコシル化により結合される炭水化物分子は、本明細書では「オリゴ糖部分」と称される。高分子の数が明白に示される以外、本発明で使用される「高分子（a polymer）」、「高分子（a polymer molecule）」、「高分子（the polymer）」又は「高分子（the polymer molecule）」への全ての言及は、一つ又は複数の高分子への言及であるものとする。高分子は水溶性高分子であっても不水溶性高分子であってもよい（例えばＰＥＧ部分）。ＰＥＧ部分は、５００Ｄａ〜２００．０００Ｄａの範囲、例えば５００Ｄａ〜１００．０００Ｄａの範囲、例えば２０００Ｄａ〜５０．０００Ｄａの範囲から選択される平均サイズを有し得る。そのようなＰＥＧ分子は、とりわけ、Shearwater社から得ることができる。
本文において、「医薬組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明のＬＨ化合物（例えば改変ＬＨ）、及び／又は本発明の改変ＬＨ及びＦＳＨ、並びに所望により一つ又は複数の医薬的に許容し得る担体又は賦形剤を含有する組成物を意味し、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, E. W. Martin編集, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Paに記載される従来技術によって調製することができる。組成物は、従来の形態、例えばカプセル剤、錠剤、エアロゾル、液剤、懸濁剤又は局所適用剤（topical applications）であってよい。典型的には、本発明の医薬組成物は、非経口投与（例えば、静脈内又は皮下注射による）用に製剤化することができ、追加の保存剤を含むアンプル、充填済み注射器、少量点滴又は多回投与用容器中に、単位用量形態で存在し得る。組成物は、油性又は水性のビヒクル中で、懸濁剤、液剤、又は乳剤等の形態をとり得る（例えば、水性ポリエチレングリコール中の液剤）。油性担体若しくは非水担体、希釈剤、溶媒又はビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、及び注射用有機酸エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられ、保存剤、湿潤剤、乳化剤若しくは懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤等の製剤化剤（formulatory agent）を含有していてもよい。あるいは、活性成分は、無菌固体の無菌的単離によって、又は適切なビヒクル（例えば、無菌の発熱性物質除去水）で使用前に構成するための、溶液からの凍結乾燥によって得られる、粉末形態であってもよい。非経口製剤で有用な油剤としては、石油、動物油、植物油、又は合成油が挙げられる。そのような製剤で有用な油剤の具体例としては、ピーナッツ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリン、及びミネラルオイルが挙げられる。非経口製剤で使用するのに適切な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。非経口製剤は、典型的には、溶液中に約０．０００１〜約２５重量％（例えば約０．５〜約２５重量％）の活性成分を含有する。保存剤及び緩衝液を使用してもよい。注射部位での刺激作用を最少化又は除去するために、そのような組成物は、約１２〜約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する一つ又は複数の非イオン性界面活性剤を含有していてもよい。そのような製剤における界面活性剤の含量は、典型的には、約０．０００００１〜約１５重量％、例えば約０．０００００１〜約５重量％又は約５〜約１５重量％の範囲である。適切な界面活性剤としては、ソルビタンモノオレート等のポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、及び酸化プロピレンとプロピレングリコールの縮合によって形成される疎水性塩基を有するエチレンオキシドの高分子量付加体が挙げられる。非経口製剤は単位用量又は複数回用量シール容器（例えばアンプル及びバイアル）中におくことができ、使用直前に注射のために無菌液体賦形剤（例えば、水）の添加のみを必要とする、凍結乾燥した状態で保存することができる。
本文において、「生殖補助医療」という用語は、本明細書で使用される場合、自然に、又は卵母細胞及び精子を回収して体外受精を行うことにより、妊娠する可能性を高めることを目的とする方法を意味し、該方法は、体外受精（ＩＶＦ）を介して、又は卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、子宮内受精法（ＩＵＩ）、体外成熟培養法（ＩＶＭ）、若しくはそれらから派生した他の形態であり得る。
本明細書で使用される（同義的に使用される）、「不育症」又は「習慣性流産」という用語は、妊娠可能な女性の約１％に起こり、不育症の女性は、３回以上の妊娠において、妊娠の試みが成功せず、妊娠が妊娠１２週目前に中絶された女性である。多数の要因が同様の臨床像をもたらし得るが、子宮内の胚の付着及び初期着床は局所的なホルモン環境によって絶妙に制御されているため、内分泌障害は妊娠初期での中絶に頻繁に関与する。子宮は、エストロゲン及びプロゲステロンによって刺激されて、着床前期中に重要な発生変化を起こす。ＣＬによって分泌されるプロゲステロンは着床及び妊娠継続の成功のために重要である。従って、ＣＬによる不十分なプロゲステロン分泌に関連する状態は、妊娠の結果に悪影響を及ぼす可能性がある。
「ボーラス」という用語は、本明細書で使用される場合、血液、血清又は血漿中の化合物の濃度を有効なレベルにまで上昇させるために与えられる、化合物の投与である。前記投与は、経口投与、吸入、静脈内投与、筋肉内注射、くも膜下腔内注射又は皮下注射を含むいかなる投与経路によっても与えることができる。
「ゴナドトロピン」という用語は、本明細書で使用される場合、ヘテロ二量体の糖タンパク質のグループに属する自然発生的なホルモンであり、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）（例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン）が含まれる。これらのホルモンはオスおよびメスの生殖腺機能を調節する。これらの自然発生的なホルモンはそれぞれ、２つの非共有結合性的に連結したサブユニット：ＦＳＨ、ＬＨ及びｈＣＧに共通しているαサブユニット、並びに各ホルモンに特有であり、各ホルモンに生物学的特異性を付与するβサブユニット、から成る。全ての自然発生的ゴナドトロピンにおいて、各サブユニットはアスパラギン結合型（Ｎ結合型）オリゴ糖側鎖を有する。共通のヒトホルモンαサブユニットにおいて、これらは５２位及び７８位（配列番号１）で結合している。ヒトＦＳＨ及びｈＣＧの両方において、２本のＮ結合型オリゴ糖側鎖が、ＦＳＨ内の７位及び２４位（配列番号１０）でβサブユニットに結合している。
本発明の好ましいゴナドトロピンのα鎖は、配列番号１、２、又は３に対して少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される。変異体は、配列番号１の位置及び空間に、保存されたシステイン残基を含んで成ることが好ましい。特に好ましい実施形態では、ゴナドトロピンは配列番号１を有するヒトαサブユニットを含んで成る。
全ての糖タンパク質と同様に、オリゴ糖構造における変動がゴナドトロピンで生じ、これによって、脳下垂体内及び血流中に存在する一連のアイソフォームがもたらされる。さらに、シアル酸による末端炭水化物「キャップ形成」の程度に差異がある。アイソフォームは、シアル化されたＮ結合型オリゴ糖の数及び分布によって大部分は決定される電荷に基づいて、分類することができる。高度にシアル化された形態は、より酸性のｐＨを有し、「酸性の」と称される。あまりシアル化されていない形態は比較的高いｐＨを有し、「塩基性の」と称される。
これらの構造的な差異の結果として、ゴナドトロピンアイソフォームは、標的細胞受容体へのそれらの結合能において異なっている。シアリル化の程度は、循環血液中でのそれらの生存能に影響を与える。例えば、ＦＳＨの場合、強酸性／シアル化アイソフォームは、動物モデルにおいてかなりより長い血中半減期を有する。
日数‐本発明のプロトコルは月経周期のある時点から開始される。月経周期の１日目は、月経の初日である。刺激プロトコルの日にちに参照がなされる場合、１日目はＦＳＨの最初の投与量が投与される日である。刺激プロトコルの２日目はその後の日等（the day after etc）である。黄体期では、日数は排卵日又は採卵日のいずれかから算出される。
卵胞サイズ‐婦人科における卵胞体積の超音波検査によって、卵巣機能を測定することができる。卵胞直径の測定は超音波検査を用いて通例通りに行われる。今日、卵胞体積は、三次元的に再構築された超音波画像から、迅速且つ自動的に測定することもできる（Salama S, Arbo E, Lamazou F, Levailllant JM, Frydman R, Fanchin R (2010年4月)。Reproducibility and reliability of automated volumetric measurement of single preovulatory follicles using SonoAVC". Fertil. Steril. 93 (6): 2069-73)。
尿由来（Urine-derived）又は尿の（urinary）。前記用語は同義的に使用される。前記用語は尿から精製されたゴナドトロピンの起源を指す。
本文において、「不妊症治療」という用語は、本明細書で使用される場合、不妊夫婦の女性又は独身女性が妊娠するのを補助する方法を意味する。
本文において、「生殖能力の促進」という用語は、本明細書で使用される場合、夫婦、女性又は男性の生殖能力を増強する方法を意味する。
本文において、「哺乳類対象」、「哺乳動物」又は「哺乳類の」という用語（これらの用語は本明細書の全体を通じて同義的に使用される）は、本明細書で使用される場合、ヒト、雌ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ及びヤギ等のいかなる哺乳動物をも意味する。
「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語、並びに本発明を記述する状況において使用される同様の指示対象は、本明細書で特に明記されない限り、又は内容が明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。
ＬＨ化合物の「有効量」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物において生殖能力を促進するのに充分な、又は治療を必要とする哺乳動物において不妊症を治療するのに充分な、ＬＨ化合物の投与量を意味する。これを達成するのに適した量が「有効量」と定義される。それぞれの目的に対する有効量は、状態の重症度並びに対象の体重及び全身状態に依存する。当然のことながら、適切な用量の決定は、通例の実験法を用いて、値のマトリックスを作成し、そのマトリックス内の様々な点を試験することにより達成することができ、これは全て、熟練した医師又は獣医師の通常の技量の範囲内である。ｈＣＧ投与の典型的な投与量は、５０〜５００ＩＵ／日、又は同様の生物学的効果を与えるＬＨ化合物の投与量である。
改変ＬＨの「有効量」とは、本明細書で使用される場合、哺乳類雌対象の無排卵治療において、少数の卵胞形成（paucifolliculogenesis）若しくは１個の卵胞形成（unifolliculogenesis）等の、卵胞発生の誘導を補助するのに充分な、又は、治療を必要とする哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期においてＣＯＳの誘導を補助するのに充分な、改変ＬＨの投与量を意味する。本明細書に記載のように改変ＬＨはＦＳＨに関連して使用されることが意図されているため、改変ＬＨはこの治療においてＦＳＨと共に「補助」を行う。これを達成するのに適した量が「有効量」と定義される。それぞれの目的に対する有効量は、状態の重症度並びに対象の体重及び全身状態に依存する。当然のことながら、適切な用量の決定は、通例の実験法を用いて、値のマトリックスを作成し、そのマトリックス内の様々な点を試験することにより達成することができ、これは全て、熟練した医師又は獣医師の通常の技量の範囲内である。ｈＦＳＨ投与の典型的な投与量は５０〜５００ＩＵ／日、又は同様の生物学的効果を与えるＦＳＨ活性を有する分子の投与量である。
「アシル化基（acylation group）」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−基を意味し、式中、Ｒは、所望により一つ又は複数のＯ、Ｎ、Ｓ、又はＰを含んで成る、直鎖状又は分岐鎖状の、飽和又は不飽和の炭素鎖から選択され、例えば、直鎖又は分岐鎖状のアルカンカルボン酸（alkane carboxylic acid）である。適切なアシル化基の様々な例がＷＯ２００６／０３７８１０、ＷＯ００／３４３３１、ＷＯ２００６／０９７５３７、ＷＯ２０１１／０８０１０３に記載されている。具体的には、適切なアシル化基の例は、ｎが４〜４０（例えば８〜２２）であるＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ−の構造を有し、例えば、ＣＨ3（ＣＨ2）8ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）9ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）10ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）11ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）12ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）13ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）15ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）17ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）18ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）19ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）20ＣＯ−、ＣＨ3（ＣＨ2）21ＣＯ−及びＣＨ3（ＣＨ2）22ＣＯ−から成る群から選択されるアシル化基である。適切なアシル化基のさらなる例は、ｎが４〜４０（例えば１２〜２０）であるＨＯＯＣ−（ＣＨ2）nＣＯ−の構造を有し、典型的には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）14ＣＯ−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）15ＣＯ−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）16ＣＯ−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）17ＣＯ−及びＨＯＯＣ−（ＣＨ2）18ＣＯ−である。アシル化基のさらなる例についてはＵＳ５９０５１４０も参照されたい。
「治療」及び「治療する」という用語は、改変ＬＨに関連して本明細書で使用される場合、哺乳類雌対象の無排卵治療において卵胞発生を誘導すること、又は哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期においてＣＯＳを誘導することを目的とした、患者の管理及び治療を意味する。
「治療」及び「治療する」という用語は、ＬＨ化合物に関連して本明細書で使用される場合、不妊症治療又は生殖能力促進を目的とした、患者の管理及び治療を意味する。治療される患者は、好ましくは哺乳動物；特にヒトであるが、哺乳動物にはイヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ヒツジ及びブタ等の動物も含まれる。
長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン化合物
本発明は、医薬的に許容し得る分子に連結されたＬＨアゴニストを含んで成る、長期作用性で生物学的活性が有るＬＨ化合物に関し、ＬＨ化合物の投与は、ＡＲＴ法に関連させて、特に卵胞期に、１回又は２回行うことができる。これは、現在のＡＲＴ法に優るかなりの利点であり、不妊症治療の改善をもたらすものである。
さらに、本発明は、医薬的に許容し得る分子に連結されたＬＨアゴニストを含んで成る、長期作用性で生物学的活性が有るＬＨ化合物に関し、ＬＨ化合物の投与は、黄体期及び妊娠期の補助を維持するために、ＡＲＴ法に関連させて一定間隔で行うことができる。これは、現在のＡＲＴ法に優るかなりの利点であり、不妊症治療の改善をもたらすものである。
広範な局面において、本発明は、ＬＨ化合物と同様に投与されたＬＨアゴニストの生体内血漿内半減期と比較して、実質的に延長されたＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の生体内血漿内半減期を与える、医薬的に許容し得る分子に連結されたＬＨアゴニストを含んで成る、長期作用性で生物学的活性が有るＬＨ化合物に関する。
別の広範な局面において、本発明は、内因性ＣＧの生体内血漿内半減期と比較して実質的に延長されたＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の生体内血漿内半減期を与える、医薬的に許容し得る分子に連結されたＬＨアゴニストを含んで成る、長期作用性で生物学的活性が有るＬＨ化合物に関する。
さらに別の局面において、本発明は、哺乳類新生児Ｆｃ受容体に対し結合性を有する分子、トランスフェリン及びｎが８〜２２のＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ−並びに高分子から選択される医薬的に許容し得る分子に連結された哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体を含んで成る、長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物に関する。
一実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類新生児Ｆｃ受容体に対し結合性を有する分子から選択される。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、ヒトアルブミン、組換えヒトアルブミン、哺乳類ＦｃＲｎへの結合能が増加した改変型ヒトアルブミン、哺乳類ＦｃＲｎへの結合能が増加した改変型組換えアルブミン等のアルブミンから選択される。典型的には、医薬的に許容し得る分子は、組換えヒトアルブミン（配列番号２０）から選択される。典型的には、医薬的に許容し得る分子は、組換えＫ５７３Ｐヒトアルブミン（配列番号２１）から選択される。
さらに別の実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、組換え哺乳類抗体のＦｃ断片等の、哺乳類抗体のＦｃ断片から選択される。典型的には、医薬的に許容し得る分子は、配列番号２２から選択される。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、組換え哺乳類抗体のＦｃ断片の変異体等の、哺乳類抗体のＦｃ断片の変異体から選択される。典型的には、医薬的に許容し得る分子は、配列番号２２に対して、少なくとも８０％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一である、配列番号２２を除いた配列から選択される。
さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストは、有機小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質から選択することができ、合成法、組換え法により生産するか、又は組織若しくは血液から得ることができる。特定の実施形態では、ＬＨアゴニストは非哺乳類起源である。別の特定の実施形態では、ＬＨアゴニストは哺乳類起源であり、例えば、組換え法により得られたタンパク質である。
さらに別の実施形態では、哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体は、組換え哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は組換え哺乳類ＬＨ若しくはその類似体から選択される。
さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストは、哺乳類ＣＧ又は哺乳類ＬＨから選択される。ＬＨアゴニストが哺乳類ＣＧである場合、哺乳類ＣＧは、典型的には霊長類ＣＧ（例えばヒトＣＧ又は類人猿（abe）ＣＧ又はサルＣＧ）であるが、ウマ科ＣＧ（例えばウマＣＧ）等の、他の哺乳類種からも選択され得る。ＬＨアゴニストが哺乳類ＬＨである場合、哺乳類ＬＨは、典型的にはヒトＬＨ、類人猿（abe）ＬＨ又はサルＬＨ等の霊長類ＬＨ；雌ウシＬＨの配列；ブタＬＨの配列；ウマ科ＬＨ（例えばウマＬＨ）の配列；ヒツジＬＨの配列；イヌＬＨの配列；ネコＬＨの配列；及びヤギＬＨの配列である。典型的には、ＬＨアゴニストはヒトＣＧである。
さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストは、哺乳類ＣＧの類似体又は哺乳類ＬＨの類似体から選択される。ＬＨアゴニストが哺乳類ＣＧの類似体である場合、該類似体は、対応する哺乳類絨毛性ゴナドトロピン配列に対して少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一である。典型的には、ＬＨアゴニストは、対応するヒト絨毛性ゴナドトロピン配列に対して少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一である、ヒトＣＧの類似体である。ＬＨアゴニストが哺乳類ＬＨの類似体である場合、該類似体は、哺乳類黄体形成ホルモン配列に対して、少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一である。典型的には、ＬＨアゴニストは、対応するヒト黄体形成ホルモン配列に対して少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一である、ヒトＬＨの類似体である。
ＬＨアゴニストが、ポリペプチド又はタンパク質（例えば哺乳類ＣＧの類似体又は哺乳類ＬＨの類似体等）から選択される場合、ＬＨアゴニストはグリコシル化されていてもよい。典型的には、ＬＨアゴニストはグリコシル化されたｈＣＧである。
ＬＨ化合物それ自体がグリコシル化されていてもよく、グリコシル化はＬＨアゴニスト上又は医薬的に許容し得る分子上で起こっていてもよく、この場合、前記分子はポリペプチド又はタンパク質（例えばヒトアルブミン）から選択される。
ＬＨアゴニストは、直接的に原子価結合を介して又は間接的にリンカーを介して等、様々な様式で医薬的に許容し得る分子に連結されていてもよく、リンカーは、典型的には二官能性リンカーであるが、多官能性リンカーであってもよい。さらなる実施形態では、リンカーは、化学的なリンカー、糖部分、ジスルフィド架橋、融合リンカー、親水性リンカー、加水分解性リンカーから選択される。さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストはペプチドリンカーを介して医薬的に許容し得る分子に融合される。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞又は酵母細胞等の宿主細胞からＬＨ化合物を発現させることにより１つのポリペプチド又はタンパク質を生成するために、ＬＨアゴニストは医薬的に許容し得る分子に直接的に融合される。さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストは安定なリンカーを介して医薬的に許容し得る分子に連結される。別の実施形態ではＬＨアゴニストは不安定なリンカーを介して医薬的に許容し得る分子に連結される。
従って、ＬＨアゴニストは先行技術において周知の技術を用いる様々な方法で医薬的に許容し得る分子に連結されてもよく、また本発明は、一つ又は複数のＬＨアゴニストが一つ又は複数の医薬的に許容し得る分子に連結されている状態、例えば、２つのＬＨアゴニストが１つの医薬的に許容し得る分子に連結されている、又は１つのＬＨアゴニストが２つの医薬的に許容し得る分子に連結されている状態も含む。さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストは１つ又は２つの医薬的に許容し得る分子、好ましくは１つの医薬的に許容し得る分子に連結されている。
さらなる実施形態では、哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体は、医薬的に許容し得る分子に連結されており、ここでリンカーは、化学的なリンカー、所望により二官能性リンカーから選択される。典型的には、化学的なリンカーは、糖部分、ジスルフィド架橋、親水性リンカー、加水分解性リンカー、ジカルボン酸、カルボン酸ヒドラジド、マレイミドヒドラジド、ＰＤＰＨ、ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＧＭＢＳ、アルキルリンカー、及びＰＥＧリンカーから選択される。さらに別の実施形態では、化学的なリンカーは、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、Ｎ−［マレイミドカプロン酸］ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、Ｎ−［マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＭＰＨ又はＢＭＰＨ）、４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド、Ｎ−［ｋ‐マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、ＮＨＳ−３−マレイミドプロピオン酸スクシンイミドエステル（ＭＰＳ−ＥＤＡ）、スルフヒドリル（sulfurhydryl）反応性タンパク質に結合した（３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド）、Ｎ‐スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシニミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、２〜５個の炭素原子を有するカルボン酸ヒドラジド、ｍが２〜２０の整数である−ＮＨ−（ＣＨ２）m−Ｃ（Ｏ）−から選択され、所望により、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ2、又はフェニル等の立体的に障害にならないあらゆる基で置換されている。
さらなる実施形態では、哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体は、医薬的に許容し得る分子に、直接的、化学的に連結されている。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体のα鎖に連結されている。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体のβ鎖に連結されている。
さらに別の実施形態では、哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体は、アルブミン、哺乳類抗体のＦｃ断片、又は哺乳類抗体のＦｃ断片の変異体等の哺乳類新生児Ｆｃ受容体に対し結合性を有する分子から選択される医薬的に許容し得る分子と、所望によりペプチドリンカーを介して融合している。
さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１個のアミノ酸、例えば１〜２００個のアミノ酸、典型的には１〜５０個のアミノ酸を有し、ここでアミノ酸は２０種の天然に存在するアミノ酸から選択される。典型的には、ペプチドリンカーは１〜４０個のアミノ酸、例えば１〜３０個、例えば１〜２０個、例えば１〜１０個のアミノ酸を有する。
さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択されるアミノ酸で構成されているリンカーから選択される。典型的には、ペプチドリンカーは、大部分は立体的な障害にならないアミノ酸（例えばグリシン及びアラニン）で構成されている。特に、ペプチドリンカーは、ｎが１〜５０の整数である−（Ｇ）ｎ−、（ＧＧＳ）ｎ又は（ＧＧＧＧＳ）ｎから選択される配列を含んで成る。典型的には、ｎは１〜１０から選択される整数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。
さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧ、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号５９）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号６０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５７）及びＥＦＡＧＡＡＡＶ（配列番号５６）から選択される。
別の実施形態では、哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体は、医薬的に許容し得る分子と直接的に融合している。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は哺乳類ＣＧ又はその類似体のＮ末端に融合している。
さらに別の実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＬＨ又はその類似体のＮ末端に融合している。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＣＧ又はその類似体のα鎖のＮ末端に融合している。
さらに別の実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＬＨ又はその類似体のα鎖のＮ末端に融合している。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＣＧ又はその類似体のβ鎖のＮ末端に融合している。
さらに別の実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＬＨ又はその類似体のβ鎖のＮ末端に融合している。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、は、哺乳類ＣＧ又はその類似体のＣ末端と融合している。
さらに別の実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＬＨ又はその類似体のＣ末端と融合している。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＣＧ又はその類似体のα鎖のＣ末端と融合している。
さらに別の実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＬＨ又はその類似体のα鎖のＣ末端と融合している。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＣＧ又はその類似体のβ鎖のＣ末端と融合している。
さらに別の実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類ＬＨ又はその類似体のβ鎖のＣ末端と融合している。
さらなる実施形態では、哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体は、１つの哺乳類ＣＧ又はその類似体から選択される。典型的には、１つのｈＣＧである。
さらに別の実施形態では、哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体は、１つの哺乳類ＬＨ又はその類似体から選択される。典型的には、１つのｈＬＨである。
さらなる実施形態では、哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体は、２つの哺乳類ＣＧ若しくはその類似体から選択される。典型的には、２つのｈＣＧである。
さらに別の実施形態では、哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体は、２つの哺乳類ＬＨ又はその類似体から選択される。典型的には、２つのｈＬＨである。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、１つの医薬的に許容し得る分子から選択される。典型的には、１つのアルブミン又は１つのＦｃ断片又は１つのＦｃ断片の変異体である。
さらに別の実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、２つの医薬的に許容し得る分子から選択される。典型的には、２つのアルブミン若しくは２つのＦｃ断片若しくは２つのＦｃ断片の変異体、又はそれらの組み合わせである。
本発明の好ましいＬＨ化合物は、複合体１（ｈＣＧ−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ複合体）、複合体３（ｈＣＧ−ＳＰＤＰ−ｒＨＡ複合体）、複合体４（ＥＤＣ活性化型ｈＣＧ−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ複合体）、複合体３Ｖ１（ｈＣＧ−ＳＰＤＰ−ｒＨＡ−Ｋ５７３Ｐ複合体）、及び複合体４Ｖ１（ＥＤＣ活性化型ｈＣＧ−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−Ｋ５７３Ｐ複合体）から選択される。
本発明の他の好ましいＬＨ化合物は、配列番号９及び配列番号２６から成る生成物２、配列番号１及び配列番号２８から成る生成物３、配列番号９及び配列番号２７から成る生成物４、配列番号１及び配列番号２９から成る生成物５、配列番号４及び配列番号２６から成る生成物７、配列番号１及び配列番号３０から成る生成物８、配列番号４及び配列番号２７から成る生成物９、配列番号１及び配列番号３１から成る生成物１０、配列番号３２及び配列番号３３から成る生成物１１、配列番号３２及び配列番号３４から成る生成物１２、配列番号３２及び配列番号６１から成る生成物１３、並びに配列番号３２及び配列番号６２から成る生成物１４から選択される。
ＡＲＴ法に関連させて１回又は２回投与することができるＬＨ化合物を生成するために、そのようなＬＨ化合物は、哺乳動物に投与される場合、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、例えば１．５倍〜２５倍延長された生体内血漿内半減期を有するＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物をもたらすべきである。
さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストは、少なくとも２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、例えば２〜２０日間の生体内血漿内半減期を有する。さらなる実施形態では、ＬＨ化合物は、少なくとも２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、例えば２〜２０日間の生体内血漿内半減期を有する。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、胞状卵胞を直径約１０ｍｍから、成熟中の卵母細胞が成熟を終了させて減数分裂の再開が準備され得る排卵前期（すなわち直径約１５〜３０ｍｍ）まで駆動するのに充分な、ＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の生物学的な身体組成又は濃度を与える。
さらに別の実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、男児（male offspring）誕生から約１年後の初期青年期（early adolescent）において、又は女性対象及び男性対象では思春期において、アンドロゲン産生を駆動するのに充分な、ＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の生物学的な身体組成又は濃度を与える。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、低ゴナドトロピン性性機能低下症の対象を補助するのに充分な、ＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の生物学的な身体組成又は濃度を与える。
さらに別の実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類の胚盤胞の着床を避けるため、又は可能にするために、子宮内膜及び子宮を調節することを目的として、哺乳類対象の排卵前後期、排卵期、及び黄体期におけるプロゲステロンを維持するのに充分な、ＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の生物学的な身体組成又は濃度を与える。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、子宮内膜及び子宮に着床の準備をさせることを目的として、哺乳類対象の排卵前後期、排卵期、及び黄体期におけるプロゲステロンを維持するのに充分な、ＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の生物学的な身体組成又は濃度を与える。
さらに別の実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、月経周期の卵胞期中にＦＳＨ処置に関連して、好ましくはＦＳＨ処置開始から５〜１０日後に注射がなされた場合、ＣＬの形成及び維持を補助する血漿中濃度の、ＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物を与える。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、月経周期の卵胞期中にＦＳＨ処置に関連して、好ましくはＦＳＨ処置開始から５〜１０日後に注射がなされた後に、ＣＬからの充分なプロゲステロン放出を刺激する濃度の、ＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物を与える。
さらに別の実施形態では、Roopenian et.al., "FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age", Nature reviews, Immunology, vol. 7, p. 715.725, sept. 2007に記載されているように、医薬的に許容し得る分子は新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合性（例えばｐＨ依存的な結合性）を有し、ＬＨ化合物がリソソーム分解を回避することを可能にする。
ＦｃＲｎに対して結合性を有する、典型的な医薬的に許容し得る分子はアルブミンから選択され、例えば、ＦｃＲｎに対する結合性が増加した改変型アルブミン、ヒトアルブミン、又は組換えヒトアルブミンである。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、有機小分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、受容体、グリコシル化（glycosylation）、アシル化基、糖類、高分子（例えばポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、核酸（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）、及びホルモンのうちのいずれか１つから選択される。典型的には、医薬的に許容し得る分子は、限定はされないが、哺乳類抗体のＦｃ断片、トランスフェリン、アルブミン（例えばヒトアルブミン、組換えアルブミン、アルブミンの変異体）；アシル化基（例えばｎが８〜２２のＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ−）；又はＰＥＧ等の高分子（例えば分子量が少なくとも５ｋＤａ、例えば１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、典型的には１０〜４０ｋＤａであるＰＥＧ）から選択される。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は高分子から選択され、例えばＰＥＧである。典型的には、ＰＥＧ部分は、５００Ｄａ〜２００．０００Ｄａ、例えば５００Ｄａ〜１００．０００Ｄａ、例えば２０００Ｄａ〜５０．０００Ｄａの範囲から選択される平均サイズを有し得る。
本発明のさらなる態様は、本発明のＬＨ化合物、及び所望により医薬的に許容し得る担体又は賦形剤を含んで成る医薬組成物に関する。典型的には、医薬組成物は注射用であり、例えば皮下注射用である。
ＡＲＴ法に関連させて、不妊症治療又は生殖能力促進における２つ以上の薬剤を、同時に又は順次に投与することができる。従って、不妊症治療又は生殖能力促進において通常使用される一つ又は複数の他の治療的活性化合物と組み合わせて、不妊症治療のために、又は生殖能力を促進する際に、ＡＲＴ法において本発明のＬＨ化合物を使用すること（例えばＩＶＦ又はＩＣＳＩ）は、本発明の範囲内である。類推により、不妊症治療用又は生殖能力促進用の薬剤の製造において、不妊症治療又は生殖能力促進に通常使用される他の治療的活性化合物と組み合わせて、本発明のＬＨ化合物を使用することも本発明の範囲内である。
本発明のさらなる態様は、生殖補助医療処置（例えばＩＶＦ又はＩＣＳＩ処置）又は精巣下降不全（maldecensus of the testes）等の、哺乳類対象の不妊症治療又は生殖能力促進で使用するための、本発明のＬＨ化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、雌哺乳動物における生殖補助医療のための方法で使用するための本発明のＬＨ化合物に関し、ここで、ＬＨ化合物は、卵胞期中にある投与量で１回、２回、３回又は４回投与され、その投与量は卵胞発生を補助するのに充分な量である。ＬＨ化合物は単回ボーラス投与として投与することができる。一実施形態では、投与量は黄体機能補充を与えるのにも充分な量である。
本発明のさらに別の態様は、雌哺乳動物における生殖補助医療のための方法で使用するための本発明のＬＨ化合物に関し、ここで、ＬＨ化合物は、少なくとも排卵後２週目までの黄体期中に、ある投与量で１回、２回、３回又は４回投与さる。ＬＨ化合物は単回ボーラス投与として投与することができる。一実施形態では、ＬＨ化合物は排卵後に初めて投与される。
本発明のさらなる態様は、雌哺乳動物における生殖補助医療のための方法で使用するための本発明のＬＨ化合物に関し、ここで、ＬＨ化合物は、少なくとも排卵後２週目までの妊娠期中、ある投与量で１回、２回、３回又は４回投与される。ＬＨ化合物は単回ボーラス投与として投与することができる。一実施形態では、ＬＨ化合物は排卵後に初めて投与される。
本発明のさらに別の態様は、雌哺乳動物における不育症の治療法で使用するための本発明のＬＨ化合物に関し、ここで、ＬＨ化合物は、受胎後１２週目までの妊娠初期の間、ある投与量で１回、２回、３回若しくは４回又はそれより多い回数投与される。ＬＨ化合物は単回ボーラス投与として投与することができる。一実施形態では、ＬＨ化合物は排卵後に初めて投与される。
本発明のさらなる態様は、プロゲステロン産生を増強し、妊娠成功率を最適化する方法で使用するための、本発明のＬＨ化合物に関し、ここで、ＬＨ化合物は、妊娠の最初の１２週間、ある投与量で１回、２回、３回若しくは４回又はそれより多い回数投与される。ＬＨ化合物は単回ボーラス投与として投与することができる。一実施形態では、ＬＨ化合物は排卵後に初めて投与される。
本発明のさらなる態様は、雌哺乳動物における生殖補助医療のための方法で使用するための本発明のＬＨ化合物に関し、ここでＬＨ化合物は、排卵誘発に関連して、ある投与量で１回又は２回投与される、ＬＨ化合物は単回ボーラス投与として投与することができる。
排卵誘発に関連して、種々の治療レジメンを使用することができる。一実施形態では、ＧｎＲＨアゴニストが排卵誘発のために使用される。別の実施形態では、ｈＣＧが排卵誘発のために使用される。
本発明のさらなる態様は、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の雄哺乳類対象の生殖能力促進又は不妊症治療で使用するための、本発明のＬＨ化合物に関する。
本発明のさらに別の態様は、停留精巣を有する若年又は青年期の雄哺乳類対象の生殖能力促進又は不妊症治療で使用するための、本発明のＬＨ化合物に関する。
本発明のさらに別の態様は、治療を必要とする哺乳動物に、有効量の本発明のＬＨ化合物を投与することを含む、哺乳類対象の不妊症治療の方法に関する。
本発明のさらなる態様は、治療を必要とする哺乳動物に、有効量の本発明のＬＨ化合物を投与することを含む、哺乳類対象の生殖能力を促進する方法に関する。
さらなる実施形態では、哺乳類対象は、ヒト、雌ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ及びヤギから選択され、典型的にはヒト対象である。
さらなる態様では、本発明は、医薬的に許容し得る分子に連結されたＬＨアゴニストを含んで成る、長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物、例えば本明細書に開示される本発明の複合体のうちのいずれか１つを調製する方法に関し、該方法は、ＬＨアゴニストと医薬的に許容し得る分子に結合したリンカーとを反応させること、又はＬＨアゴニストとリンカーとを反応させてそれから前記リンカーを医薬的に許容し得る分子に結合させること、又はリンカーと医薬的に許容し得る分子とを反応させてそれからＬＨアゴニストと医薬的に許容し得る分子に結合したリンカーとを反応させることを含んで成り、又はＬＨアゴニスト及び医薬的に許容し得る分子を宿主細胞から発現させることによるものである。
長期作用性の改変型哺乳類ＬＨ
本発明は、哺乳動物におけるＬＨ受容体を作動及び活性化し、哺乳動物内で２〜４８時間である哺乳類ＬＨ若しくはその類似体、又は改変型ＬＨの生体内血漿内半減期を与える、長期作用性の改変型哺乳類ＬＨ、例えばアルブミンと融合された、又はアシル化基若しくはＰＥＧに結合した、例えば連結されたヒトＬＨに関する。卵胞期に与えられる、又は黄体期補助として与えられる改変型ＬＨは、患者の利便性及び治療成績を改善すると考えられている。
さらに、長期作用性の改変型哺乳類ＬＨの使用は、着床した胚から分泌される高度にグリコシル化されたｈＣＧが及ぼす特異作用を妨げず、患者は、可能な限り早期の都合の良い時に、通常の妊娠検査を使用することで妊婦しているかどうかを検知することが可能である。
まとめると、これらの発見は、受容体レベルでのＬＨの特異作用が循環血液中に一定に存在することと相まり維持される、長期作用性の改変型哺乳類ＬＨ調製物が、月経周期の卵胞期におけるＣＯＳを最適化することで、最終治療成績を最適化することができることを示している。
広範な局面において、本発明は、哺乳動物内で２〜４８時間である哺乳類ＬＨ若しくはその類似体又は改変型ＬＨの生体内血漿内半減期を与える、医薬的に許容し得る分子に連結された哺乳類ＬＨ若しくはその類似体を含んで成る改変型ＬＨに関する。
本発明のさらなる態様は、哺乳類雌対象の無排卵治療において卵胞発生（例えば少数の卵胞形成若しくは単一卵胞形成）を誘導するために、又は哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期においてＣＯＳを誘導するために同時に、順次に又は別々に使用するためのＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子と組み合わせて使用するための、哺乳類新生児Ｆｃ受容体に対し結合性を有する分子、トランスフェリン及びｎが８〜２２であるＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ−並びに高分子から選択される医薬的に許容し得る分子に連結された哺乳類ＬＨ又はその類似体を含んで成る、長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物に関する。
一実施形態では、ＦＳＨは哺乳類雌対象での体外由来である。別の実施形態では、ＦＳＨは哺乳類雌対象において体外的に産生される。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類新生児Ｆｃ受容体に対し結合性を有する分子（例えばアルブミン（例えばヒトアルブミン、組換えヒトアルブミン、哺乳類ＦｃＲｎへの結合能が増加した改変型ヒトアルブミン、哺乳類ＦｃＲｎへの結合能が増加した改変型組換えアルブミン））；哺乳類抗体のＦｃ断片（例えば哺乳類抗体の組換えＦｃ断片）；及び哺乳類抗体のＦｃ断片の変異体から選択される。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、哺乳類雌対象内で２〜４８時間である、哺乳類ＬＨ若しくはその類似体、又は改変型ＬＨの生体内血漿内半減期を与える。
さらなる実施形態では、哺乳類ＬＨは、少なくとも、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間の生体内血漿内半減期を有し、該生体内血漿内半減期は、例えば４〜４８時間、５〜４０時間、６〜３６時間、７〜３０時間、８〜２８時間、９〜２６時間、又は１０〜２４時間であり、典型的には６〜８時間である。さらなる実施形態では、改変型ＬＨは、少なくとも、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間の生体内血漿内半減期を有し、該生体内血漿内半減期は、例えば４〜４８時間、５〜４０時間、６〜３６時間、７〜３０時間、８〜２８時間、９〜２６時間、又は１０〜２４時間であり、典型的には６〜８時間である。
改変型ＬＨが哺乳動物へ投与された後、充分な体内血漿中濃度が達成され、且つその体内血漿中濃度が、哺乳類雌対象の無排卵治療において卵胞発生を誘導する際、又は哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期においてＣＯＳを誘導する際に改変型ＬＨが作用を与えるのにかかる時間維持されることは、重要である。さらなる実施形態では、本発明の改変型ＬＨは、２〜３０ＩＵ／Ｌの範囲の、例えば２〜４ＩＵ／Ｌ、４〜８ＩＵ／Ｌ、８〜１４ＩＵ／Ｌ、１４〜２０ＩＵ／Ｌ、又は２０〜３０ＩＵ／Ｌの、哺乳動物における改変型ＬＨ、哺乳類ＬＨ又はその混合物の体内血漿中濃度を与える。
哺乳類ＬＨ又はその類似体は、組換え体であっても合成体であっても、あるいはそれらの組み合わせであってもよく、自動化された製法による合成を含む標準的な化学的手法等の合成法によって生成してもよく、組換え法によって生成してもよく、あるいは尿、組織又は血液から得てもよい。さらなる実施形態では、哺乳類ＬＨは組換えＬＨである。さらに別の実施形態では、哺乳類ＬＨは組換えヒトＬＨ（ｒｈＬＨ）である。
さらなる実施形態では、哺乳類ＬＨは、ヒトＬＨの配列、雌ウシＬＨの配列、ブタＬＨの配列、ウマＬＨの配列、ヒツジＬＨの配列、イヌＬＨの配列、ネコＬＨの配列、及びヤギＬＨの配列から選択されてもよい。
さらに別の実施形態では、哺乳類ＬＨ類似体は組換えＬＨである。組換え法によって生成することができる哺乳類ＬＨ類似体は、典型的には、対応する哺乳類ＬＨ配列に対して少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一である哺乳類ＬＨ類似体から選択される。例えば、哺乳類ＬＨ類似体は、ヒトＬＨ配列に対して少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一であるヒトＬＨ類似体から選択される。又は、哺乳類ＬＨ類似体は、ウマＬＨ配列に対し少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一であるウマＬＨ類似体から選択される。
哺乳類ＬＨ又は哺乳類ＬＨ類似体は、本発明において使用される場合、グリコシル化されていてもよい。典型的には、哺乳類ＬＨ又は類似体はグリコシル化されており、例えば、グリコシル化ｈＬＨである。
改変型ＬＨそれ自体がグリコシル化されていてもよく、グリコシル化は哺乳類ＬＨ上又は医薬的に許容し得る分子上で起こっていてもよく、この場合、前記分子はポリペプチド又はタンパク質（例えばヒトアルブミン）から選択される。哺乳類ＬＨ又はその類似体は、直接的に原子価結合を介して又は間接的にリンカーを介して等、様々な様式で医薬的に許容し得る分子に連結されていてもよく、リンカーは、典型的には二官能性リンカーであが、多官能性リンカーであってもよい。さらなる実施形態では、リンカーは、化学的なリンカー、糖部分、ジスルフィド架橋、融合リンカー、親水性リンカー、加水分解性リンカーから選択される。さらなる実施形態では、哺乳類ＬＨ又はその類似体は、ペプチドリンカーを介して医薬的に許容し得る分子に融合される。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞又は酵母細胞等の宿主細胞から改変型ＬＨを発現させることにより１つのポリペプチド又はタンパク質を生成するために、哺乳類ＬＨ又はその類似体は医薬的に許容し得る分子に直接的に融合される。さらなる実施形態では、哺乳類ＬＨ又はその類似体は、安定なリンカーを介して医薬的に許容し得る分子に連結される。別の実施形態では、哺乳類ＬＨ又はその類似体は、不安定なリンカーを介して医薬的に許容し得る分子に連結される。
従って、哺乳類ＬＨ又はその類似体は先行技術において周知の技術を用いる様々な方法で医薬的に許容し得る分子に連結されてもよく、また本発明は、一つ又は複数の哺乳類ＬＨ又はその類似体が一つ又は複数の医薬的に許容し得る分子に連結されている状態、例えば、２つの哺乳類ＬＨ又はその類似体が１つの医薬的に許容し得る分子に連結されている、又は１つの哺乳類ＬＨ又はその類似体が２つの医薬的に許容し得る分子に連結されている状態も含む。さらなる実施形態では、哺乳類ＬＨ又はその類似体は１つ又は２つの医薬的に許容し得る分子、例えば１つの医薬的に許容し得る分子に連結されている。
さらに別の実施形態では、Roopenian et.al., "FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age", Nature reviews, Immunology, vol. 7, p. 715.725, sept. 2007に記載されているように、医薬的に許容し得る分子は新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合性（例えばｐＨ依存的な結合性）を有し、改変型ＬＨがリソソーム分解を回避することを可能にする。
ＦｃＲｎに対して結合性を有する、典型的な医薬的に許容し得る分子はアルブミンから選択され、例えば、ＦｃＲｎに対する結合性が増加若しくは低減した改変型アルブミン、ヒトアルブミン、又は組換えヒトアルブミンである。
さらなる実施形態では、医薬的に許容し得る分子は、有機小分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、受容体、グリコシル化（glycosylation）、アシル化基、糖類、高分子（例えばポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、核酸（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）、及びホルモンのうちのいずれか１つから選択される。典型的には、医薬的に許容し得る分子は、限定はされないが、哺乳類抗体のＦｃ断片、トランスフェリン、アルブミン（例えばヒトアルブミン、組換えアルブミン、アルブミンの変異体）；アシル化基（例えばｎが８〜２２のＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ−）；又はＰＥＧ等の高分子（例えば分子量が少なくとも５ｋＤａ、例えば１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、典型的には１０〜４０ｋＤａであるＰＥＧ）から選択される。
本発明のさらなる態様は、本発明の改変型ＬＨ、及び所望により医薬的に許容し得る担体又は賦形剤を含んで成る医薬組成物に関する。
ＡＲＴ法に関連して、具体的には上記で説明した卵胞発生又はＣＯＳの誘導に関連して、２つ以上の薬剤を同時に又は順次に投与してもよい。従って、不妊症治療又は生殖能力促進において通常使用される一つ又は複数の他の治療的活性化合物と組み合わせて、不妊症治療のために、又は生殖能力を促進する際に、ＡＲＴ法において本発明の改変型ＬＨを使用すること（例えばCOS誘導）は、本発明の範囲内である。
さらなる態様では、本発明は、哺乳類雌対象の無排卵治療において卵胞発生（例えば少数の卵胞形成若しくは単一卵胞形成）を誘導するために、又は哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期においてＣＯＳを誘導するために同時に、順次に又は別々に使用するためのＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子と組み合わせて使用するための、医薬的に許容し得る分子に連結された哺乳類ＬＨ又はその類似体を含んで成り、哺乳動物内で２〜４８時間である哺乳類ＬＨ若しくはその類似体、又は改変型ＬＨの生体内血漿内半減期を与える、改変型ＬＨに関する。一実施形態では、ＦＳＨは哺乳類ＦＳＨ（例えばヒトＦＳＨ）から選択され、具体的には組換えＦＳＨ（例えばｒｈＦＳＨ）である。特定の実施形態では、ＦＳＨはPuregon、Gonal F、Elonva、Fostinorm、Bravelle、Menopurから選択される。
さらなる実施形態では、哺乳類雌対象の無排卵治療において卵胞発生（例えば少数の卵胞形成又は単一卵胞形成）を誘導するために、本発明の改変型ＬＨ及びＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子は併用される。さらに別の実施形態では、哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期においてＣＯＳを誘導するために、本発明の改変型ＬＨ及びＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子は併用される。典型的には、卵胞発生又はＣＯＳ誘導の際、本発明の改変型ＬＨ及びＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子は、２０：１〜１：２０のＩＵ比範囲（ＦＳＨ：改変型ＬＨ）で投与される。さらなる実施形態では、ＦＳＨ：改変型ＬＨは１８：１〜１：１８、１５：１〜１：１５、１２：１〜１：１２、９：１〜１：９、５：１〜１：５（例えば４：１〜１：４）のＩＵ比範囲で投与される。
上記の通りＦＳＨ及び改変型ＬＨは同時に、順次に又は別々に投与することができるが、組み合わせは典型的には、同じであってもよい別々の剤形（例えばキット中の２つの別々な注射剤（例えば皮下注射剤））で改変型ＬＨ及びＦＳＨを含んで成るキット部分として、又は本発明の改変型ＬＨ及びＦＳＨ若しくはＦＳＨ活性を有する分子、並びに所望により医薬的に許容し得る担体若しくは賦形剤を含んで成る医薬組成物として、一緒に投与される。改変型ＬＨ及びＦＳＨが皮下、好ましくは前腹壁に、投与されることが好ましい。非経口投与用の製剤は通常無菌である。非経口投与に適用される医薬製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を目的の哺乳類対象の血液と等張にする溶質を含有していてもよい水性及び非水性の無菌注射液が挙げられ；懸濁化剤及び粘稠化剤を含んでいてもよい水性及び非水性の無菌懸濁剤も本発明の範囲内である。製剤は単位用量容器又は複数回用量容器（例えば密閉アンプル及び密閉バイアル）中に存在していてもよく、使用直前に注射のために無菌液体担体（例えば、水）の添加のみを必要とする、凍結乾燥した状態で保存されてもよい。即時注射用の溶剤及び懸濁剤は、無菌の散剤、粒剤及び錠剤から調製することができる。製剤は、充填済み注射器、自動注入装置又は複数回用量自動注入装置（multidose auto-injector）を介して投与することができる。典型的に、ＬＨ化合物及びＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子は、医薬組成物中で同時に使用することを目的として提供される。
本発明のさらに別の態様は、哺乳類雌対象の無排卵治療において卵胞発生（例えば少数の卵胞形成又は単一卵胞形成）を誘導する、又は哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期においてＣＯＳを誘導する方法に関し、該方法は、治療を必要とする哺乳動物に、有効量の本発明の改変型ＬＨを、ＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子と併用して同時に、順次に又は別々に、投与することを含む。さらなる実施形態では、ＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子は、哺乳類ＦＳＨ（例えばヒトＦＳＨ）から選択され、具体的には組換えＦＳＨ（例えばｒｈＦＳＨ）である。
さらなる実施形態では、哺乳類対象は、ヒト、雌ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ及びヤギから選択され、典型的にはヒト対象である。
さらなる態様では、本発明は、哺乳動物内で２〜４８時間である、哺乳類ＬＨ若しくはその類似体又は改変型ＬＨの生体内血漿内半減期を与える医薬的に許容し得る分子に連結された哺乳類ＬＨ若しくはその類似体を含む、本明細書に開示される本発明の複合体のうちのいずいれか１つ等の、本発明の改変型ＬＨを調製する方法に関し、該方法は、哺乳類ＬＨ若しくはその類似体と医薬的に許容し得る分子に結合したリンカーとを反応させること、又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体とリンカーとを反応させてそれから前記リンカーを医薬的に許容し得る分子に結合させること、又はリンカーと医薬的に許容し得る分子とを反応させてそれから哺乳類ＬＨ若しくはその類似体と医薬的に許容し得る分子に結合したリンカーとを反応させることを含み、あるいは宿主細胞から哺乳類ＬＨ若しくはその類似体及び医薬的に許容し得る分子を発現させることによるものである。
本発明の方法
図１ａ及び図１ｂは、先行技術において知られているような、調節卵巣刺激法のためのプロトコルを説明している。図１ａ中のプロトコルは、月経周期の１〜３日目での組換えＦＳＨ又は尿由来ＦＳＨ（FSH, recombinant or urinary）の投与から開始されている。ＦＳＨを排卵誘発まで１日投与量で投与する。およそ６日目から、ＧｎＲＨアンタゴニストを投与して、排卵誘発前の早発性ＬＨサージを回避する。５，０００〜１０，０００ＩＵの組換えｈＣＧのトリガーショットを投与することにより、排卵を誘発する。あるいは、ＧｎＲＨアゴニスト誘発によって排卵を誘発させてもよい。これは、典型的には、１〜３個の卵胞が１７ｍｍの大きさを有する場合になされる。黄体機能補充を与えるために、胚移植の日から開始して、プロゲステロンを経膣的又は筋肉内に投与する。プロゲステロン投与を少なくとも刺激プロトコルの２８日目まで継続する。多くの場合、妊娠の５週目まで、又はさらには１０週目まで、プロゲステロンを投与する。
図１ｂでは、１〜６日目におけるＦＳＨの１日投与量を、長期作用性ＦＳＨ（コリフォリトロピン）の１回投与量に置き換える。５〜７日目あたりで、コリフォリトロピンの血清中濃度は減少したら、組換えＦＳＨ又は尿由来ＦＳＨの１日投与量を排卵誘発まで与える。コリフォリトロピンを使用する利点は、女性が、２〜５又は６日目に診療所に来診してＦＳＨの注射を受ける必要がないことである。
図２ａは、長期作用性ゴナドトロピン投与に基づく、本発明に記載の刺激プロトコルの一実施形態の略図である。この場合、コリフォリトロピンα等の長期作用性ＦＳＨを月経周期１〜３日目に投与する。コリフォリトロピンの場合、投与量は、女性あたり１００μｇ及び１５０μｇであり得る。ＦＳＨの血清中濃度が卵胞期の後期で減少することで、さらには卵胞補充（follicle recruitment）が卵胞期の後期で有意に低減するように、投与量及び血中半減期を選択する。これは、発生のために刺激される卵胞の数を減少させることで、ＯＨＳＳのリスクを低減することに役立つ。
既知のプロトコルと同様に、刺激プロトコルの４〜７日目から開始して、ＧｎＲＨアンタゴニストを投与する。刺激プロトコルの６日目又はそれより早くに、長期作用性ｈＣＧの１回投与量を投与することにより、卵胞発育を刺激する。長期作用性ＬＨを使用することもできる。長期作用性ｈＣＧ又はＬＨの投与量は、卵胞発生を刺激するのに充分であり、且つＯＨＳＳのリスクを低減するために充分に低い。長期作用性ｈＣＧ又はＬＨを、４〜１５ＩＵ／リットルの血清中濃度で得られる応答と同様の生物学的反応を与える投与量で投与する。ＯＨＳＳのリスクをさらに低減するために、少なくとも１個の卵胞が少なくとも１５ｍｍの直径を有する場合、好ましくは３個の卵胞が１７ｍｍの直径を有する場合は、ＧｎＲＨアゴニストのトリガーショットを使用して排卵を誘導する。皮下又は鼻腔内投与する場合の適切な投与量は０．１〜１ｍｇの範囲である。既知のプロトコル（図２ａに図示）の通りにプロゲステロンを投与することによって、又は本明細書に記載され図示（図４ａ及び４ｂ）される通りにＬＨアゴニストを投与することによって、黄体補充を与えることができる。
図２ｂは本発明のプロトコルを図示しており、プロトコルでは、組換えＦＳＨ又は尿由来ＦＳＨを１日目からおよそ６日目までの連日注射として投与することによって、卵胞形成が刺激される。好ましいＦＳＨの１日投与量は１５０〜２２５ＩＵ／日である。ＦＳＨ投与を中止する正確な日にちは、ＵＶスキャニング及び卵胞直径の測定によって決定される。少なくとも１個の卵胞が１２〜１４ｍｍの直径に達したら、ＦＳＨ投与を中止し、長期作用性ｈＣＧ又はＬＨの単回投与量を投与して、上記と同様に卵胞発生を刺激する。図２ａに記載されるのと同様の、卵母細胞誘導及び黄体機能補充。図２ｂの投与計画では、図２ａに記載の通りにＧｎＲＨアンタゴニスト及びＧｎＲＨアゴニストを投与する。
図２ｃは本発明のプロトコルを図示しており、プロトコルでは、ＦＳＨの１日投与量を図２ｂと同様に投与することによって、及びおよそ６日目から開始して、ｈＣＧ又はＬＨの１日投与量を投与することによって、卵胞形成及び卵胞発生が刺激される。卵胞期中のｈＣＧの適切な投与量には、２５〜４００ＩＵ／日（例えば５０〜３００ＩＵ／日）、より好ましくは１００〜３００（例えば１５０〜２５０、例えば１７５〜２２５ＩＵ／日）が含まれる。図２ｃの投与計画では、図２ａの記載と同様にＧｎＲＨアンタゴニスト及びアゴニストが投与される。黄体機能補充は図２ｃに図示されていないが、図４ａ又は４ｂに図示されるように、プロゲステロン投与又はＬＨ／ｈＣＧ投与のいずれかによるものであり得る。
図３ａに図示される長期作用性（持続性）ｈＣＧ又はＬＨの投与に基づく別のプロトコルでは、ＦＳＨ、ＧｎＲＨアンタゴニスト及びＧｎＲＨアゴニストは、図２ｂ中のプロトコルの記載と同様に投与される。例えば卵胞期の約６日目から開始し、少なくとも妊娠検査まで継続して、長期作用性ｈＣＧ又はＬＨを２〜７日間の間隔を置いて（５日で図示）投与することによって、卵胞発育及び黄体機能補充を与える。妊娠の場合、長期作用性ＬＨ又はｈＣＧの投与を５週目まで、例えば妊娠１０週目まで継続することができる。卵胞期中の長期作用性ｈＣＧ又はＬＨの適切な投与量は、４〜１５ＩＵ／リットルの血清中濃度で得られる応答と同様の生物学的反応が得られる投与量である。
別のプロトコルでは、組換え又は尿由来ｈＣＧ又はＬＨが、卵胞期中及び黄体期を通して１日投与量で投与される（図３ｂ及び３ｃ）。図はｈＣＧ投与を図示しているが、ＬＨが投与されることも同様に考えられる。ｈＣＧの投与刺激の６日目に開始してもよいが、より早期（例えば刺激の２日目）に同様に開始してもよい。卵胞期中の尿由来又は組換えｈＣＧの適切な投与量には、２５〜４００ＩＵ／日（例えば５０〜３００ＩＵ／日）、より好ましくは１００〜３００（例えば１５０〜２５０、例えば１７５〜２２５ＩＵ／日）が含まれる。黄体期では、組換え又は尿由来ｈＣＧの投与は生化学的妊娠の誤検出をもたらし得るため、ＬＨ又はＬＨ類似体若しくは変異体を使用することが好ましい。側方流装置妊娠検査の大部分が、尿由来ｈＣＧの検出に依存している。黄体期における組換え又は尿由来ｈＣＧの適切な投与量には、２５〜４００ＩＵ ｈＣＧ／日、好ましくは５０〜２００ＩＵ ｈＣＧ／日、例えば７５〜２００、例えば１００〜１５０又は１２０〜１７０ＩＵ／日が含まれる。
図３ｃ中のプロトコルは別の本発明のプロトコルを図示しており、そこではｈＣＧ（又はＬＨ）が刺激プロトコルの２日目から既に投与される。その他の点では、プロトコルは図３ｂのプロトコルと同一である。図３ｂ及び３ｃ中のプロトコルの卵胞刺激は、長期作用性ｈＣＧ又は長期作用性ＬＨを用いて行うこともでき、それらは刺激プロトコルの１、２、又は３日目に単回投与量として投与される。
図４ａ及び４ｂは本発明に記載の黄体機能補充のためのプロトコルを図示している。図示された実施形態（図４ａ）によれば、ＬＨ（又はｈＣＧ）の１日投与量を卵母細胞回収時あたりから投与し、プロトコルの２８日目まで継続させることによって、黄体機能補充は与えられる。黄体機能補充のための組換え又は尿由来ＬＨの好ましい投与量範囲には、１００〜６００ＩＵ ＬＨ／日、好ましくは１５０〜４５０ＩＵ ＬＨ／日、例えば２００〜４００ＩＵ ＬＨ／日、例えば２５０〜３５０ＩＵ／日の１日投与量が挙げられる。組換え又は尿由来ｈＣＧの好ましい投与量範囲には、２５〜４００ＩＵ ｈＣＧ／日、好ましくは５０〜２００ＩＵ ｈＣＧ／日、例えば７５〜２００、例えば１００〜１５０又は１２０〜１７０ＩＵ／日が含まれる。
黄体補充は少なくとも排卵後２週目まで継続されるが、妊娠５又は１０週目まで継続してもよい。
長期作用性ＬＨ又は長期作用性ｈＣＧを黄体期中に１回又は複数回、好ましい１日投与量のＬＨを投与することによって達成される応答と同様の生物学的反応を与える投与量で、投与することによって同様の結果が達成され得る。黄体機能補充プロトコルは、いかなるタイプのＡＲＴとも併用して使用することができる。
独立請求項で定義される本発明の発明概念から逸脱しない限り、本発明の種々のプロトコルを様々に組み合わせることができる。
ＦＳＨ
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、人体の発生、成長、思春期の成熟、及び生殖過程を制御している。男性及び女性の両方において、ＦＳＨは生殖細胞の成熟を刺激する。男性においては、ＦＳＨは、インヒビンを分泌するようにセルトリ細胞を誘導し、セルトリ−セルトリ密着結合（閉鎖帯）の形成を刺激する。女性においては、ＦＳＨは、卵巣中の未成熟な卵胞の成長及び補充を刺激する。初期（小）胞状卵胞では、ＦＳＨは、卵胞をアポトーシス（卵胞及び卵母細胞の体細胞のプログラム死）から救出する主な生存因子である。黄体期−卵胞期の過渡期に、プロゲステロン及びエストロゲン（主にエストラジオール）の血清中濃度は減少し、もはやＦＳＨの放出を抑制しなくなるため、ＦＳＨはおよそ３日目（１日目は月経周期の初日）にピークを迎える。
ＦＳＨはヘテロ二量体の糖タンパク質である。各単量体単位はアミノ酸側鎖に共有結合的に連結した一つ又は複数のオリゴ糖鎖を有するタンパク質分子であり；これらの単量体単位のうち２つが完全な機能的タンパク質をつくる。タンパク質二量体は２つのポリペプチド単位、標識化されたα及びβサブユニットを含有する。ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、及びｈＣＧのαサブユニットは同一であり、９２個のアミノ酸を含有する（図５参照）。ＦＳＨは１１８個のアミノ酸からなるαβサブユニット（ＦＳＨＢ）を有し、αβサブユニットは、ＦＳＨの特異な生物学的作用を与え、ＦＳＨ受容体との相互作用に関与している。ホルモンの糖部分は、フコース、ガラクトース、マンノース、ガラクトサミン、グルコサミン、及びシアル酸から成り、後者になるほどＦＳＨの生物学的半減期にとって重要である。ＦＳＨの半減期は３〜４時間である。
αサブユニットの遺伝子は染色体６ｐ２１．１〜２３に位置している。前記遺伝子は様々な細胞型で発現される。ＦＳＨβサブユニットの遺伝子は染色体１１ｐ１３に位置しており、下垂体細胞のゴナドトロピン産生細胞で発現され、ＧｎＲＨによって制御され、インヒビンによって阻害され、アクチビンによって増強される。
本発明の好ましいＦＳＨのβ鎖は、配列番号１０、１１、１２、１３、又は１５に対して少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される。変異体は、配列番号１０の前記位置及び空間に、保存されたシステイン残基を含んで成ることが好ましい。特に好ましい実施形態では、ＦＳＨは配列番号１０を有するヒトαサブユニットを含んで成る。
ＦＳＨを生物学的活性が有る類似体、又は内因性ＦＳＨ分泌を刺激する化合物で置き換えてよいことは、当業者によって理解される。この後者のクラスには、アロマターゼ阻害薬、及び抗エストロゲン（例えばタモキシフェン及びクエン酸クロミフェン（ＣＣ））が含まれる。これらの化合物は、視床下部でエストロゲンによって発現される負のフィードバックを排除することによって（ＣＣ及びタモキシフェンと同様にエストロゲン受容体を作動することにより、又はアロマターゼ阻害薬と同様にエストロゲン濃度を大幅に減少させることにより）、内在性ＦＳＨ分泌を刺激する。ＦＳＨ類似体の他の種類には、例えば、ＷＯ９６／０５２２４に記載されているような、βサブユニットがｈＣＧのＣＴＰと融合しており、それが、ＦＳＨαサブユニットと融合している一本鎖ＦＳＨ類似体（一本鎖ＦＳＨ−ＣＴＰ）が含まれる。
さらなる実施形態では、ＦＳＨは、哺乳類ＦＳＨの類似体又は哺乳類ＦＳＨの類似体から選択される。ＦＳＨが哺乳類ＦＳＨの類似体である場合、該類似体は対応する哺乳類ＦＳＨ配列に対して少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一である。配列同一性はＦＳＨのα鎖及びβ鎖の両方に当てはまる。
２つの最も一般的に使用される形態は、尿由来ヒト閉経期ゴナドトロピン（ＦＳＨ及びＬＨ活性を含む）及び組換えＦＳＨ（ＦＳＨ活性を含むがＬＨ活性は含まない）である。現在使用されているＦＳＨ調製は全て半減期が比較的短いため、ＩＶＦのために刺激された女性における複数卵胞発生の誘導のための臨床プロトコルは、連日注射を必要とする。延長された半減期を示す、ＦＳＨの長期作用性の型の使用は、ＦＳＨの連日注射の代わりに使用され得る。
ＦＳＨ活性は、通常、薬局方に従ってＩＵ単位で与えられる。現在、ＦＳＨの純粋な調製物を製造することもでき、その活性は質量単位で与えられる（例えばμｇ／バイアル）。本発明では、ＩＵ単位で与えられた活性が他の単位で与えられたＦＳＨ活性と相関することが理解される。
本発明の一実施形態では、ＦＳＨは長期作用性ＦＳＨである。長期作用性であることにより、タンパク質が、組換え又は尿由来ＦＳＨの血中半減期の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、より好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも７倍、より好ましくは少なくとも１０倍、例えば少なくとも１５倍、例えば少なくとも２０倍、例えば少なくとも２５倍、例えば少なくとも３０倍、４０倍若しくは５０倍又はそれより長い血中半減期を有することが意図される。
好ましくは、長期作用性ＦＳＨの半減期は７２時間以内、例えば４８時間である。これにより、卵胞形成の後期でＦＳＨ投与を調節することが容易になる。
長期作用性ＦＳＨは、例えばＦＳＨ−ＣＴＰであり得るが、これはＷＯ９３／０６８４４に記載されており、野生型ＦＳＨαサブユニット、及びそのカルボキシル末端でｈＣＧのβサブユニットのカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）に融合している（天然ｈＣＧβ配列、配列番号９の１４５位に対し残基１１８）野生型ヒトＦＳＨβサブユニット（配列番号１０）から成るβサブユニットを有する。得られたβサブユニットは配列番号１５の配列を有する。
コリフォリトロピンαは組換えＤＮＡ技術によりＣＨＯ細胞内で産生される糖タンパク質である。コリフォリトロピンαは、（rec）ＦＳＨと同じ薬力学的特性を有するが、著しく長いＦＳＨ活性の持続時間を有する持続性卵胞刺激物質として設計される。複数卵胞発育を惹起し最大で１週間持続させるその能力のために、コリフォリトロピン（Elonva（登録商標））の推奨用量の単回皮下注射は、ＣＯＳ治療周期におけるいずれの毎日の（rec）ＦＳＨ調製物の、最初の７回の注射のうちの数回又は全てにとって代わり得る。ＦＳＨ活性の長い持続時間は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のβサブユニットのカルボキシ末端ペプチドを、ヒトＦＳＨのβ鎖（配列番号１０）に付加することにより達成された。コリフォリトロピンαはいずれの固有のＬＨ／ｈＣＧ活性も示さない。コリフォリトロピンαは６９時間（５９〜７９時間）の平均排出半減期を有する。
コリフォリトロピンを、４０〜２４０μｇ／雌哺乳動物、例えば６０〜２２０μｇ／雌哺乳動物、例えば８０〜２００μｇ／雌哺乳動物、例えば１００〜１８０μｇ／雌哺乳動物、又は例えば１００〜１５０μｇ／雌の単回ボーラス投与として投与できることが好ましい。別の実施形態では、コリフォリトロピンを、４０〜１２０μｇ／雌哺乳動物、例えば６０〜１００μｇ／雌哺乳動物、又は例えば７０〜９０μｇ／雌哺乳動物の単回ボーラス投与として投与することができる。さらに別の実施形態では、コリフォリトロピンを、１２０〜２４０μｇ／雌哺乳動物、例えば１４０〜２２０μｇ／雌哺乳動物、例えば１６０〜２００μｇ／雌哺乳動物又は例えば１７０〜１９０μｇ／雌哺乳動物の単回ボーラス投与として投与する。コリフォリトロピンは、６０ｋｇ以下の女性に対しては１００μｇ、及び６０ｋｇ超の女性に対しては１５０μｇの投与量が認可されている。
単回ボーラス投与としてのコリフォリトロピンの投与は、月経周期の１〜３日目であることが好ましく、例えば、月経周期の１日目、２日目又は３日目である。
従って、好ましい一実施形態では、ＦＳＨは、月経周期の１〜３日目に４０〜２４０μｇ／雌哺乳動物の単回ボーラス投与として投与されることが好ましい、長期作用性ＦＳＨ（例えばコリフォリトロピン）である。
ＦＳＨ（又は類似体）がＣＯＳ技術又は投与計画と併せて使用される本発明の態様では、適切な用量及び投与計画は当業者に明らかであり、あらゆる適切な用量及び投与計画を使用することができる。
例えば、ＦＳＨは、卵胞期中に、１〜５０ＩＵ ＦＳＨ／リットル、例えば２〜４０ＩＵ ＦＳＨ／リットル、例えば３〜３５ＩＵ ＦＳＨ／リットル、例えば４〜３０ＩＵ ＦＳＨ／リットル、例えば５〜２５ＩＵ ＦＳＨ／リットル、例えば７〜２０ＩＵ ＦＳＨ／、例えば１０〜１５ＩＵ ＦＳＨ／リットルの血清中濃度を与える投与量で投与することができる。
ＦＳＨを、卵胞期中に、５〜２５ＩＵ ＦＳＨ／リットル、好ましくは１０〜１５ＩＵ／リットルの血清中濃度を与える投与量で投与することが好ましい。
一実施形態では、ＦＳＨを、５０〜６００ＩＵ ＦＳＨ／日、好ましくは１００〜３００ＩＵ ＦＳＨ／日、例えば１５０〜２２５ＩＵ／日の１日投与量で投与することができる。ＦＳＨへの応答に減少を示している何人かの患者においては、最大６００ＩＵ ＦＳＨ／日の用量を使用することが望ましい場合がある。典型的な投与計画は以下の通りである：患者は１５０ＩＵ ＦＳＨ／日から開始する。卵胞発生適切な場合、１５０ＩＵ ＦＳＨ／日の用量を維持することができる。卵胞発生が不適切な場合、用量を２２５、３００、３７５、４５０、５２５又は６００ＩＵ ＦＳＨ／日に増加することができる。理想的には、ＦＳＨの累積投与量は６０００ＩＵ／周期を超えるべきではない。
本発明の方法で使用されるＦＳＨはいかなる供給源に由来してもよい。そのような供給源は排卵誘発及びＣＯＳ法の分野における当業者には周知である。尿由来ＦＳＨ調製物、例えばＦＳＨ及びＬＨ活性を１：１の比で含むｈＭＧを使用することができる。
従って、本発明の一実施形態では、５０〜６００ＩＵ ＦＳＨ／日、好ましくは１００〜３００ＩＵ ＦＳＨ／日、例えば１５０〜２２５ＩＵ／日の１日投与量で投与される、ＦＳＨは組換え又は尿由来ＦＳＨである。
ＦＳＨを、月経周期の周期１〜３日目、例えば、月経周期の例えば周期１日目、例えば周期２日目又は例えば周期３日目に開始して、投与することができる。
少なくとも１個の卵胞が１２〜１４ｍｍ、例えば１２〜１３ｍｍ又は例えば１３〜１４ｍｍの直径を有する場合、ＦＳＨの投与を中止する。ＦＳＨの投与は、例えば月経周期の周期４、５、７又は８日目に中止され得る。本発明の典型例では、月経周期の周期６日目にＦＳＨの投与は中止される。ＦＳＨ投与を中止する目的は、さらなる卵胞形成を停止し、最も大きな卵胞が成熟することを可能にすることである。卵胞数とＯＨＳＳのリスクの間に相関関係があることが当該技術分野において知られている。
投与されたＦＳＨが組換えＦＳＨ又は尿由来ＦＳＨである場合、ＦＳＨ投与の中止は、単に、さらなるＦＳＨが投与されないことを必要とするだけである。ＦＳＨの血清中濃度はその後、卵胞形成を刺激しないレベルにまで一両日の間に減少する。長期作用性ＦＳＨ、例えばコリフォリトロピンαを投与する場合、ＦＳＨ投与の中止は、血清中ＦＳＨ活性のレベルが、最初の卵胞が上記の直径に到達した１日又は２日後に卵胞形成を刺激しないように、投与が中止されるべきであることを意味する。例えばコリフォリトロピンαの投与の場合、刺激プロトコルの初日にコリフォリトロピンαのちょうど１回投与量を投与することが好ましい。さらなる卵胞形成が必要となった場合、組換えＦＳＨ又は尿由来ＦＳＨを、刺激周期の後期、ただし卵胞が１２〜１４ｍｍの大きさに到達する前に投与することができる。このようにして、ＦＳＨの血清中濃度をより簡単に調節することができる。
概して、ＩＵ又はμｇ／リットル単位で測定される血清中ＦＳＨ活性レベルは、刺激プロトコルの最初の１〜６日の間に、血清中濃度の５０％未満、より好ましくは２５％未満、例えば１０％未満であるレベルにまで減少するべきである。
黄体形成ホルモン（ＬＨ）
ＬＨは、脳下垂体前葉により産生される、雄及び雌の両方の生殖に必須なホルモンである。女性においては、月経時に、ＦＳＨは卵胞発育を惹起し、特に顆粒膜細胞に影響を与える。エストロゲンの増加と共に、漸増量のエストラジオールを産生する成熟卵胞上に、ＬＨ受容体も発現される。結果的に、卵胞の成熟時には、エストロゲン増加は、視床下部境界（hypothalamic interface）を介して、「正のフィードバック」効果、２４〜４８時間に亘るＬＨの放出をもたらす。この「ＬＨサージ」は排卵を引き起こすことにより、卵を放出させるだけでなく、残留卵胞の黄体への転換も惹起し、これが次に、プロゲステロンを産生して、起こり得る着床に向けて子宮内膜を準備させる。ＬＨは黄体機能を最初の２週間維持するために必要である。妊娠の場合、黄体機能は、新たに確立された妊娠からのｈＣＧ（ＬＨに非常によく似たホルモン）の作用によってさらに維持される。ＬＨはアンドロゲン及びエストラジオール産生のためのホルモン前駆体を供給する卵巣内の卵胞膜細胞を補助する。ＬＨはヘテロ二量体の糖タンパク質である。各単量体単位はアミノ酸側鎖に共有結合的に連結された一つ又は複数のオリゴ糖鎖を有するタンパク質分子であり；これらの単量体単位のうちの２つが完全な機能的タンパク質をつくる。タンパク質二量体は２つのポリペプチド単位、標識化されたα及びβサブユニットを含有する。ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、及びｈＣＧのαサブユニットは同一であり、９２個のアミノ酸を含有する。ＬＨは１４１個のアミノ酸からなるβサブユニット（ＬＨＢ）を有し、βサブユニットは、ＦＳＨの特異な生物学的作用を与え、ＬＨ受容体との相互作用に関与している。このβサブユニットは、ｈＣＧのβサブユニットのアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を含有し、共に同じ受容体を刺激する。しかし、ｈＣＧβサブユニットはさらなる２４個のアミノ酸を含有しており、２つのホルモンはそれらの糖部分の組成において異なる。
本発明のＬＨのβ鎖は、配列番号４、５、６、７、及び８に対して少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される。変異体は、配列番号４の位置及び空間における保存されたシステイン残基を含んで成ることが好ましい。特に好ましい実施形態では、ＬＨは配列番号４を有するヒトαサブユニットを含んで成る。
これらのオリゴ糖の異なる組成が、生理活性並びに分解及び排出の速度に影響を与える。ＬＨの生物学的半減期は２０分であり、これはＦＳＨの生物学的半減期（３〜４時間）及びｈＣＧの生物学的半減期（２４〜３０時間）よりもかなり短い。
ＬＨを生物学的活性が有る類似体、又は内因性ＬＨ分泌を刺激する化合物で置き換えてよいことは、当業者によって理解される。ＬＨの類似体には、ＬＨと同じ生理的、生化学的又は生物学的効果を発現し、及び／又はＬＨと同じ受容体に結合する全ての分子が含まれる。いくつかのＬＨ類似体には一本鎖ＬＨも含まれ得る。ｈＣＧはいくつかの生理作用をＬＨと共有していることが知られている。ＬＨ類似体のいくつかの例は、例えば欧州特許第ＥＰ０３２２２２６号（Applied Research Systems社）、ＷＯ９２／２２５６８（ニュージャージー医科歯科大学）、ＷＯ９６／０５２２４（ワシントン大学）、ＷＯ９０／０９８００（ワシントン大学）、ＷＯ９３／０６８４４（ワシントン大学）、ＷＯ９８／４３９９９（ワシントン大学）、ＷＯ９９／２５８４９（ワシントン大学）、ＷＯ００／６１５８６（Akzo Nobel社）に記載されている。
ＬＨ及びその類似体又はＬＨアゴニストは、有機小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質から選択され得、合成法、組換え法によって産生することができ、又はその天然源、例えば尿、組織若しくは血液から得ることができる。
特定の一実施形態では、ＬＨアゴニストは組換えＬＨ又は尿由来ＬＨである。別の実施形態では、ＬＨアゴニストは非哺乳類起源である。別の特定の実施形態では、ＬＨアゴニストは哺乳類起源であり、例えば組換え法によって得られるタンパク質である。さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストは、哺乳類絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）又は哺乳類ＬＨから選択される。ＬＨアゴニストが哺乳類ＣＧである場合、ＬＨアゴニストは典型的には霊長類ＣＧ（例えばヒトＣＧ）であるが、他の哺乳類種（例えばウマＣＧ）から選択されてもよい。
さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストは、哺乳類ＬＨの類似体又は哺乳類ＬＨの類似体から選択される。ＬＨアゴニストが哺乳類ＬＨ類似体である場合、類似体は、哺乳類黄体形成ホルモン配列に対し少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一であることが好ましい。配列変化はα鎖、β鎖又は両方で起こり得る。ＬＨアゴニストは、対応するヒト絨毛性ゴナドトロピン配列に対して少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一であるヒトＣＧ類似体であり得る。ＬＨアゴニストが哺乳類ＬＨ類似体である場合、類似体は哺乳類黄体形成ホルモン配列に対して少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一である。典型的には、ＬＨアゴニストは、対応するヒト黄体形成ホルモン配列に対して、少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一であるヒトＬＨ類似体である。
ＬＨアゴニストは、ポリペプチド又はタンパク質（例えば哺乳類ＣＧ類似体又は哺乳類ＬＨ類似体）から選択される場合、グリコシル化されていてもよい。典型的には、ＬＨアゴニストはグリコシル化されたｈＣＧである。ＬＨ化合物それ自体がグリコシル化されていてもよく、グリコシル化はＬＨアゴニスト上又は医薬的に許容し得る分子上で起こっていてもよく、この場合、前記分子はポリペプチド又はタンパク質（例えばヒトアルブミン）から選択される。ＬＨアゴニストは、直接的に原子価結合を介して又は間接的にリンカーを介して等、様々な様式で医薬的に許容し得る分子に連結されていてもよく、リンカーは、典型的には二官能性リンカーであが、多官能性リンカーであってもよい。さらなる実施形態では、リンカーは、化学的なリンカー、糖部分、ジスルフィド架橋、融合リンカー、親水性リンカー、加水分解性リンカーから選択される。さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストはペプチドリンカーを介して医薬的に許容し得る分子に融合される。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞又は酵母細胞等の宿主細胞からＬＨを発現させることにより１つのポリペプチド又はタンパク質を生成するために、ＬＨアゴニストは医薬的に許容し得る分子に直接的に融合される。さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストは、安定なリンカーを介して医薬的に許容し得る分子に連結される。別の実施形態では、ＬＨアゴニストは、不安定なリンカーを介して医薬的に許容し得る分子に連結される。従って、ＬＨアゴニストは先行技術において周知の技術を用いる様々な方法で医薬的に許容し得る分子に連結することができ、本発明は、一つ又は複数のＬＨアゴニストが一つ又は複数の医薬的に許容し得る分子に連結されている（例えば２つのＬＨアゴニストが１つの医薬的に許容し得る分子に連結されている、又は１つのＬＨアゴニストが２つの医薬的に許容し得る分子に連結されている）状態も含む。さらなる実施形態では、ＬＨアゴニストは、１つ又は２つの医薬的に許容し得る分子、好ましくは１つの医薬的に許容し得る分子に連結されている。
ＬＨアゴニストが哺乳類ＬＨである場合、ＬＨアゴニストは典型的にはヒトＬＨであるが、他の哺乳類種（例えば雌ウシＬＨ、ブタＬＨ、ウマＬＨ、ヒツジＬＨ、イヌＬＨ、ネコＬＨ、及びヤギＬＨ）から選択されてもよい。典型的には、ＬＨアゴニストはヒトＬＨ又はヒトｈＣＧである。通常、ＩＶＦは胚移植後の最初の２週間、プロゲステロンを用いる毎日黄体補充処置を含む。周期の２８日目に妊娠が確認された場合、プロゲステロンを用いる毎日黄体補充処置をさらに５〜１０週間延長することができる。しかし、本発明では、ＬＨの投与はプロゲステロンを用いたこの毎日処置と置き換えることができる。ＬＨアゴニストの１回又は複数回の投与量を投与することにより黄体期及び妊娠期を補助することは、卵母細胞のより良い発生、より健康な卵母細胞、胚の着床及び保持の向上、生化学的妊娠リスクの低減をもたらし、ＯＨＳＳのリスクを低減し得る。
一実施形態では、黄体機能補充のために単独で使用されるＬＨアゴニストはＬＨ類似体であって、ｈＣＧでもｈＣＧ類似体でもない。これは第一に、黄体期におけるｈＣＧの投与が、黄体により分泌された尿中ｈＣＧの検出を通常含む生化学的妊娠検査の妨げになり得るためである。さらに、黄体期にｈＣＧの代わりにＬＨを投与することは、その２つのタンパク質の異なる受容体親和性により、ＯＨＳＳを発症するリスクを低減することが期待される。
別の実施形態では、妊娠期補助（gestational support）のために単独で使用されるＬＨアゴニストはＬＨ類似体であり、ｈＣＧでもｈＣＧ類似体でもない。これは第一に、妊娠期におけるｈＣＧの投与が、黄体により分泌された尿中ｈＣＧの検出を通常含む生化学的妊娠検査の妨げになり得るためである。さらに、妊娠期にｈＣＧの代わりにＬＨを投与することは、その２つのタンパク質の異なる受容体親和性により、ＯＨＳＳを発症するリスクを低減することが期待される。
ＬＨ及びｈＣＧはどちらもＬＨ受容体に結合しそれを活性化するが、両ホルモンはそれらのオリゴ糖組成において異なる、１つのファミリーのイソホルモンとして存在する。異なるアイソフォームのそれぞれは特異な様式で受容体に影響を与え、一様でない細胞応答を発現し得（Burgon PG et al., Endocrinology, 1996;137:4827; Stanton PG et al., Mol Cell Endocrinol. 1996;125:133-141.）、異なるＦＳＨアイソフォームについても同様に示されている（Barrios-de-Tomasi J, et al. Mol Cell Endocrinol. 2002;186:189-98, Yding Andersen C & Ezcurra D, Reproductive Biology Insights 2011:4, 1-10）。従って、ＬＨ及びｈＣＧのより繊細な微調整された効果は実際には異なる場合がある。ストックホルムにおけるＥＳＨＲＥカンファレンス（２０１１年７月）で発表された最近の研究は、ＬＨがｈＣＧよりもずっと速く作用するが、受容体レベルでは全体的に効率が劣ることを実際に示した（L. Casarini et al., ESHRE Stockholm 2011 - P312, Universita degli Studi di Modena, Italy）。Peter Humaindan教授による発表（ESHRE Stockholm 2011）において、ＣＯＳ中に組換えＬＨを組換えＦＳＨに加えることにより、等用量のｈＣＧを加えた場合と比較して、得られる卵母細胞が有意に増加することがさらに示され、このことは受容体レベルでの特異なＬＨの効果を示唆している。ｈＣＧは受胎後およそ８日目の胚の着床に続いて分泌される妊娠関連タンパク質である。ｈＣＧは黄体を刺激し、活性のままにして、プロゲステロン及び妊娠が確立するのに必要な他の物質の分泌を黄体に継続させることができる。ｈＣＧが着床した胚から分泌され始めるとき、ＬＨはかなりの量で存在するが、これらのレベルは黄体をさらに刺激するのには不十分であり、女性が妊娠しなければ黄体は退縮し、月経出血が起こり、新しい月経周期が開始される。このように、この段階ではｈＣＧは優先的に黄体を刺激する。ＬＨ及びｈＣＧ間のこの違いは、しばらくの間解決されない問題であったが、現在ではＬＨ受容体（ＬＨ−Ｒ）が黄体期中に変化することが示されている。機能的な完全長受容体は、ｈＣＧが存在する場合にその発現を維持するのに対し、ＬＨはそれを達成することができない（Dickinson RE et al., Endocrinology 150: 2873-2881, 2009）。このことは、黄体期におけるＬＨ及びｈＣＧの作用の違いを示している。
本明細書に記載の雌哺乳動物における生殖補助医療の方法は、一実施形態では、現在のプロゲステロン黄体補充に取って代わる、ＬＨアゴニストの一回又は複数回の投与量を投与することによる黄体補充を与えることをさらに含んで成り得る。
ＬＨ活性は、通常、薬局方に従ってＩＵ単位で与えられる。現在では、ＬＨの純粋な調製物を製造することもでき、その活性は質量単位で与えられる（例えばμｇ／バイアル）。本発明では、ＩＵ単位で与えられた活性が他の単位（例えばモル単位）で与えられたＬＨ活性と相関することが理解される。
尿由来ＬＨ又は組換えＬＨ又は長期作用性ＬＨを、ｈＣＧ（尿由来又は組換え又は長期作用性）の代わりに、本明細書に記載の尿由来ｈＣＧ及び組換えｈＣＧの投与量により与えられる生物学的反応と等しい応答を与える投与量で、卵胞期中に投与することができる。
ＬＨアゴニストの一回又は複数回の投与量は、少なくとも５ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば少なくとも１０ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば少なくとも１５ｎｍｏｌ／Ｌ又は例えば少なくとも２０ｎｍｏｌ／Ｌの血清中プロゲステロン濃度を、少なくとも排卵又は採卵後５日目まで、少なくとも採卵後１０日目まで、好ましくは少なくとも１４日目まで、より好ましくは少なくとも２１日目まで、より好ましくは少なくとも排卵又は採卵後２８日目まで、与えるのに充分であるべきである。排卵又は採卵後２８日目を超えて、例えば５週目まで、例えば６週目まで、例えば７週目まで、例えば８週目まで、例えば９週目まで、例えば１０週目まで、又はそれより長く、ＬＨアゴニストの投与を継続できることが好ましい。
好ましい特定の一実施形態では、生殖補助医療のための方法は、採卵後７日目に少なくとも２０ｎｍｏｌ／Ｌの血清中プロゲステロン濃度を与えるのに充分な、ＬＨアゴニストの一回又は複数回の投与量を投与することによって、黄体機能補充を与えることをさらに含んで成る。
黄体期における一回又は複数回の投与量は、少なくとも２０ｎｍｏｌ／Ｌの血清中プロゲステロンレベルを、少なくとも採卵後１０日目まで、好ましくは少なくとも１４日目まで、より好ましくは少なくとも２１日目まで、より好ましくは少なくとも採卵後２８日目まで維持するのに充分であることが好ましい。
投与されたＬＨアゴニストは、黄体期中に４〜１２ＩＵ 組換え又は尿由来ＬＨ／リットルの血清中濃度、より好ましくは４〜１２ＩＵ／Ｌ（例えば８〜１２ＩＵ／Ｌ）の血清中濃度により与えられる応答と同様の生物学的反応を与えるのに充分であることが好ましい。
好ましい実施形態では、組換え又は尿由来ＬＨは黄体期中に１００〜６００ＩＵ ＬＨ／日、好ましくは１５０〜４５０ＩＵ ＬＨ／日、例えば２００〜４００ＩＵ ＬＨ／日、例えば２５０〜３５０ＩＵ／日の１日投与量で投与される。
ＬＨアゴニストは一実施形態では長い血中半減期を示す長期作用性ＬＨであり得る。長期作用性ＬＨは、ＬＨ化合物として同様に投与されたＬＨアゴニストの血中半減期と比較した場合に、又は、内在性絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生体内血漿内半減期と比較した場合に、実質的に延長されたＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の血中半減期を与える化学的部分（医薬的に許容し得る分子）に連結されたＬＨ又はＬＨアゴニストを含んで成り得る。卵胞期に与えられる、又は黄体補充として与えられる改変型ＬＨは、従来のプロゲステロン投与と比較した場合に、患者の利便性及び治療成績を向上させると考えられている。
好ましい一実施形態では、ＬＨアゴニストは化学的部分に連結された黄体形成ホルモンを含んで成る長期作用性ＬＨである。別の好ましい実施形態では、ＬＨアゴニストは化学的部分に連結されたヒト絨毛性ゴナドトロピンを含んで成る長期作用性ｈＣＧである。
生殖補助医療（ＡＲＴ）法に関連して、黄体期中に１回又は２回投与することができる長期作用性ＬＨ化合物を生成するために、そのような長期作用性ＬＨ化合物は、哺乳動物に投与された場合、ＬＨの半減期の少なくとも１．５倍、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも６倍又は例えばＬＨの半減期の１．５倍〜２５倍の血中半減期を有するＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物をもたらすべきである。
好ましい実施形態では、ＬＨアゴニストは化学的部分に連結された黄体形成ホルモンを含んで成る長期作用性ＬＨであり、該長期作用性ＬＨはＬＨの半減期の少なくとも６倍の血中半減期を有する。
長期作用性ＬＨが化学的部分に連結したヒト絨毛性ゴナドトロピンを含んで成る場合、長期作用性ＬＨの血中半減期は、例えば、ｈＣＧの半減期の少なくとも１．２倍、例えばｈＣＧの半減期の少なくとも１．３倍、ｈＣＧの半減期の少なくとも１．５倍、ｈＣＧの半減期の少なくとも２倍又は例えばｈＣＧの半減期の少なくとも３倍であり得る。
好ましい一実施形態では、ＬＨアゴニストは、化学的部分に連結したヒト絨毛性ゴナドトロピンを含んで成り、ｈＣＧの半減期の少なくとも１．５倍の血中半減期を有する長期作用性ｈＣＧであり得る。
生化学的妊娠が検出される前に黄体補充を女性に与える。胚着床及び妊娠は不確実であり得るため、女性は特定の周期に妊娠しない場合がある。従って、雌哺乳動物はさらなる刺激又は排卵周期を経る必要がある場合がある。その雌哺乳動物が次の周期に新たな処置を受けなければならない場合にＬＨアゴニストのレベルが後の排卵又は刺激周期を妨げ得るレベル未満に落ちることができるように、黄体期中に投与されるＬＨアゴニストの半減期は１０日間以内、好ましくは５日間以内であることが好ましい。
長期作用性ＬＨ及びｈＣＧの例は付属の実施例で示される。
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、受胎後の発生中の胚により、及びその後のシンシチウム栄養芽層（胎盤の一部）によりつくらる、妊娠中に産生される糖タンパク質ホルモンである。ｈＣＧの役割は卵巣の黄体の分解を防ぎ、それによってヒトの妊娠中に非常に重要なプロゲステロン産生を維持することである。ｈＣＧはさらなる機能を有し得る。例えば、ｈＣＧは母児免疫寛容に影響を与えると考えられている。通常、初期妊娠検査はｈＣＧの検出又は測定に基づいている。
ヒト絨毛性ゴナドトロピンはＬＨＣＧ受容体と相互作用し、妊娠開始時の黄体保持を促進し、黄体にプロゲステロンホルモンを分泌させる。子宮が成長中の胎児を保持できるように、プロゲステロンは子宮を血管及び毛細血管から成る厚い内層で肥厚させる。その高い負電荷により、ｈＣＧは母親の免疫細胞を撃退し、第一期の胎児を保護し得る。また、ｈＣＧは局所的な母体免疫寛容の発達のための、胎盤性関連要素（placental link）であり得ると仮定されてきた。例えば、ｈＣＧ処理された子宮内膜細胞はＴ細胞アポトーシス（Ｔ細胞の溶解）の増殖を誘導する。これらの結果は、ｈＣＧが栄養膜周囲の（peritrophoblastic）免疫寛容の発達に関連している可能性があり、栄養膜浸潤を促進する可能性があることを示唆しており、これにより、子宮内膜における胎児発生が促進されることが知られている。ｈＣＧレベルが妊婦におけるつわりの重症度にも関連していることが示唆されている。
ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、３６．７ｋＤａの分子量を有する、２４４個のアミノ酸から成る糖タンパク質である。ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のものと同じαサブユニット、及びｈＣＧに特有のβサブユニット（配列番号９）を有するヘテロ二量体である。
αサブユニットは９２アミノ酸長である。ｈＣＧのβサブユニットは、染色体１９ｑ１３．３−ＣＧＢ（１、２、３、５、７、８）上に縦列及び逆位の対の状態で配置されている、６つの高度の相同性を示す遺伝子群によってコードされる１４５個のアミノ酸を含有する。これら２つのサブユニットは、高い表面積／体積比（球の２．８倍）で囲まれた小さな疎水性コアをつくる。外側のアミノ酸の大部分は親水性である。
本発明の好ましいｈＣＧのβ鎖は、配列番号９に対して少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される。変異体は、配列番号９の位置及び空間における保存されたシステイン残基を含んで成ることが好ましい。特に好ましい実施形態では、ｈＣＧは配列番号９を有するヒトαサブユニットを含んで成る。
ｈＣＧは、βサブユニット中の、配列番号９のアミノ酸１１２〜１４５から成るＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）の存在によって、ＬＨと区別され得る。免疫学的に、及び配列決定によって、区別をすることができる。
ｈＣＧの作用に実質的に影響を与えるいかなる物質（特に他のゴナドトロピン）も混入していないという条件で、使用されるｈＣＧはいかなる供給源に由来してもよい。組換えｈＣＧ（ｒｈＣＧ）を使用することが、その高い純度のために、好ましいが、尿由来ｈＣＧを使用してもよい。同様の条件が、本発明で使用するためのｈＣＧの供給源に当てはまる。
ｈＣＧ活性は、通常、薬局方に従ってＩＵ単位で与えられる。現在では、ｈＣＧの純粋な調製物を製造することもでき、その活性は質量単位で与えられる（例えばμｇ／バイアル）。本発明では、ＩＵ単位で与えられた活性が他の単位（例えばモル単位）で与えられたｈＣＧ活性と相関することが理解される。
ｈＣＧの類似体には、ｈＣＧと同じ生理的、生化学的又は生物学的効果を発現し、及び／又はｈＣＧと同じ受容体に結合する全ての分子が含まれる。黄体形成ホルモン（ＬＨ）はｈＣＧといくつかの生理作用を共有することが知られている。いくつかのｈＣＧ類似体には、βサブユニットのＣ末端がαサブユニットのＮ末端と融合している一本鎖ｈＣＧが含まれる（Sugahara et al., PNAS, 92, 1995, 2041-2045）。類似体のその他の例は、例えば欧州特許第ＥＰ０３２２２２６号（Applied Research Systems社）、ＷＯ９２／２２５６８（ニュージャージー医科歯科大学）、ＷＯ９６／０５２２４（ワシントン大学）、ＷＯ９０／０９８００（ワシントン大学）、ＷＯ９３／０６８４４（ワシントン大学）、ＷＯ９８／４３９９９（ワシントン大学）、ＷＯ９９／２５８４９（ワシントン大学）に記載されている。
不妊治療に関して、ヒト絨毛性ゴナドトロピンは黄体形成ホルモンの代わりの排卵誘導物質として親として（parentally）広く使用されている。一つ又は複数の成熟卵胞の存在下において、ｈＣＧの投与により排卵を引き起こすことができる。排卵はｈＣＧ注射の２４〜３６時間後に起こるため、この時系列を利用するように手順の予定を立てることができる。従って、ＩＶＦを受ける患者は、通常、排卵過程を引き起こすためにｈＣＧを与えられるが、注射の約３６時間後、卵子が実際に卵巣から放出されるであろう数時間前に、患者の卵子は回収される。
本発明の方法では、刺激又は月経周期の１〜９日目の期間に、排卵誘発まで卵胞発生を刺激するのに充分な少なくとも１回投与量のｈＣＧが投与される。投与されるｈＣＧは、黄体期中に４〜１５ＩＵ ＬＨ／リットルの血清中濃度、より好ましくは４〜１２、又は５〜１２、例えば５〜８ＩＵ／Ｌの血清中濃度により与えられる反応と同様の生物学的反応を与えるのに充分であることが好ましい。
上記のように、ｈＣＧは組換え体又は尿由来であってよい。従って、一実施形態では、１日投与量の組換え又は尿由来ｈＣＧとしてｈＣＧは投与される。ｈＣＧの連日投与は、例えば、卵胞成熟が引き起こされるまで、又は通常のｈＣＧボーラスにより排卵が誘導／誘発されるまで、行うことができる。
卵胞期中のｈＣＧの連日投与について、投与量は、２５〜４０００ＩＵ ｈＣＧ／日の範囲内、好ましくは２５〜１０００ＩＵ ｈＣＧ／日、より好ましくは３０〜１０００又は３０〜５００ＩＵ ｈＣＧ／日、最も好ましくは２５〜４００ＩＵ／日、例えば５０〜３００ＩＵ／日、より好ましくは１００〜３００、例えば１５０〜２５０、例えば１７５〜２２５ＩＵ／日の範囲内であるべきである。ｈＣＧを、排卵が引き起こされるまでより低頻度で、例えば２日毎、３日毎、又は４日毎、好ましくは２日毎に、投与することも可能である。そのような投与計画では、上記でまとめたような用量を使用することができるが、尤も、５０〜４００ＩＵ ｈＣＧの用量が好ましい。
従って、好ましい一実施形態では、ｈＣＧの１日投与量は、黄体期に投与される場合、２５〜４００ＩＵ ｈＣＧ／日、好ましくは５０〜２００ ＩＵｈＣＧ／日、例えば７５〜２００、例えば１００〜１５０又は１２０〜１７０ＩＵ／日である。
本発明の一実施形態では、ｈＣＧは長い血中半減期を示す長期作用性ｈＣＧである。長期作用性ｈＣＧは、長期作用性ｈＣＧと同様に投与されたｈＣＧの血中半減期と比較した場合に実質的に延長されたｈＣＧ化合物の血中半減期を与える医薬的に許容し得る分子等の化学的部分に連結されたｈＣＧを含んで成り得る。
長期作用性ｈＣＧの半減期は、例えば、ｈＣＧの半減期の少なくとも１．２倍、例えばｈＣＧの半減期の少なくとも１．３倍、ｈＣＧの半減期の少なくとも１．５倍、ｈＣＧの半減期の少なくとも２倍又は例えばｈＣＧの半減期の少なくとも３倍であり得る。
好ましい一実施形態では、ｈＣＧは、ｈＣＧの半減期の少なくとも１．５倍の血中半減期を有する長期作用性ｈＣＧである。
一実施形態では、長期作用性ｈＣＧは、排卵誘発段階並びに／又は後の黄体期及び／若しくは妊娠期の間、２日毎、例えば３日毎、例えば４日毎、例えば５日毎、例えば６日毎、例えば７日毎、例えば８日毎、例えば９日毎、例えば１０日毎に投与される。さらなる実施形態では、長期作用性ｈＣＧは、排卵誘発段階並びに／又は後の黄体期及び／若しくは後の妊娠期の間、１４日毎、例えば２１日毎、例えば月毎、又はより少ない頻度ででさえ、投与することもできる。上記のように、黄体期にはｈＣＧ投与からＬＨ投与にきり替えることが好ましい。一実施形態では、長期作用性ｈＣＧは卵胞期中に単回ボーラス投与として投与され、その投与量は卵胞発生を補助するのに充分であり、好ましくは黄体機能補充を与えるのに充分でもある。
本発明の一実施形態では、長期作用性ｈＣＧは、少なくとも１個の卵胞が少なくとも８ｍｍ、例えば少なくとも９ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、例えば少なくとも１１ｍｍ、例えば少なくとも１３ｍｍ、少なくとも１４ｍｍ又は例えば少なくとも１５ｍｍの直径を有する場合に、単回ボーラス投与として投与される。
好ましい一実施形態では、長期作用性ｈＣＧは、少なくとも１個の卵胞が少なくとも１２ｍｍの直径を有する場合に単回ボーラス投与として投与される。
一実施形態では、長期作用性ｈＣＧは、ＦＳＨの投与中に単回ボーラス投与として投与される。
卵胞期におけるｈＣＧ投与量は、卵胞期中に１〜１２ＩＵ ｈＣＧ／リットルの血清中濃度により与えられる反応と同様の生物学的反応を与えるのに充分であることが好ましい。
ｈＣＧが組換え体又は尿由来である場合、ｈＣＧは２５〜３００ＩＵ ｈＣＧ／日、好ましくは５０〜２００、例えば１２５〜２００ＩＵ／日、例えば１５０〜２００ＩＵ／日の１日投与量で投与されることが好ましい。
ｈＣＧは卵胞期の５日目から排卵誘発まで毎日投与されることが好ましい。
さらに、ｈＣＧは卵胞期の２日目から投与されてもよく、それによりｈＣＧは卵胞期の２日目から排卵まで投与されることとなる。
排卵誘発
排卵誘発処置の正確な投与時期は卵胞直径のＵＶ測定により決定される。典型的には、誘発処置は少なくとも１個の卵胞が少なくとも１５ｍｍの平均直径を有する場合に行われる。誘発処置は少なくとも１個の卵胞が１６ｍｍ、より好ましくは１７ｍｍの直径を有する場合に行われることが好ましい。多くの場合、誘発処置は少なくとも２個の卵胞が指示サイズに達した時、より好ましくは少なくとも３個の卵胞が指示サイズに達した時に行われる。特に好ましい実施形態では、排卵誘発は４個以上の卵胞が１７ｍｍの直径を有する場合に誘導される。本発明の一つの態様では、排卵は、本明細書に記載される治療効果のある投与量のＧｎＲＨアゴニストを投与することによって誘発される。本発明の別の態様では、排卵は、比較的少ない投与量のｈＣＧ又はｈＣＧ類似体若しくはｈＣＧ変異体又は長期作用性ｈＣＧによって誘発される。組換えｈＣＧ又は尿由来ｈＣＧが使用される場合、誘発を起こす投与量は２０００ＩＵ以下、例えば１５００ＩＵ以下、例えば１０００ＩＵ以下である。少ない投与量のｈＣＧ又は類似体／変異体／長期作用性ｈＣＧを、ある投与量のＧｎＲＨアゴニストで補うことができる。
ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト
ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨアゴニスト、ＧｎＲＨ‐Ａ）は、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体と相互作用してその生物学的応答である下垂体ホルモンＦＳＨ及びＬＨの放出を発現する視床下部神経ホルモンＧｎＲＨの後に設計された合成ペプチドである。アゴニストはＧｎＲＨ受容体から素早く解離しない。結果として、ＧｎＲＨアゴニストを最初に投与すると、ＦＳＨ及びＬＨの分泌が増加する（いわゆる「フレア効果（flare effect）」）。しかしおよそ１０日後に、受容体の内部移行による受容体の下方制御を介して、著しい性機能低下効果（すなわちＦＳＨ及びＬＨの減少）が達成される。概して、この誘発型の可逆的な性腺機能低下症が治療目標となる。
本発明の一つの態様では、ＧｎＲＨアゴニストは排卵を誘発するために投与される。
承認されたＧｎＲＨアゴニストの例としては、ロイプロリド（Lupron、Eligard）；ブセレリン（Suprefact、Suprecor）；ナファレリン（Synarel）；ヒストレリン（histerelin）（Supprelin）；ゴセレリン（Zoladex）；デスロレリン（Suprelorin、Ovuplant）；トリプトレリンが挙げられる。
適切な用量及び投与計画は当業者には明らかであり、いかなる適切な用量及び投与計画も使用することができる。アゴニストは、皮下に、又は鼻内噴霧によって投与することができる。
例として、一般的に使用され治療効果のあるブセレリン投与量は、０．５ｍｇ（皮下）又は０．２ｍｇ（鼻腔内）である。トリプトレリンは０．２ｍｇの投与量で皮下投与することができ、ロイプロリドは１．０ｍｇの投与量で皮下投与することができる。
ゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニスト
ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アンタゴニスト（受容体遮断薬）は、天然ＧｎＲＨ（視床下部のニューロンによってつくられるホルモン）に構造が似ているが拮抗作用を有する、一種の化合物である。ＧｎＲＨアンタゴニストは複数の、しばしば合成により生成されたアミノ酸から成るペプチド分子である。ＧｎＲＨアンタゴニストは、ＧｎＲＨ受容体への結合において天然ＧｎＲＨと競合し、それによって体内におけるＧｎＲＨの作用を低減又は遮断する。
ＧｎＲＨアンタゴニストは、脳下垂体におけるＧｎＲＨ受容体に競合的且つ可逆的に結合し、その下垂体からの黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を遮断する。女性において、ＬＨの減少は、その後に卵巣からのエストロゲン放出の抑制をもたらす。
視床下部の‐下垂体‐性腺（ＨＰＧＡ）の初期刺激を引き起こし、エストロゲンレベルにおけるサージをもたらすＧｎＲＨアゴニストと異なり、ＧｎＲＨアンタゴニストは即時発現的な作用を有しており、初期サージ無しで急速に性ホルモンレベルを低減する。
本発明の方法で使用するのに適切な、現在承認されているＧｎＲＨアンタゴニストには、以下が含まれる：セトロレリクス；ガニレリクス；アバレリックス；デガレリクス。適切な用量及び投与計画は当業者には明らかであり、いかなる適切な用量及び投与計画も使用することができる。
実施形態が本発明の１つ又は複数の特定の態様に関すると明記されていない限り、上記実施形態並びに以下に記載される実施形態は、本明細書に記載の態様のうちのいずれか１つ、並びに本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つを参照しているとみなされるべきである。
本明細書で引用された、刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個別に且つ具体的に参照によって本明細書に組み込まれることを示され、その全体が本明細書に記述されたのと同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
全ての見出し及び小見出しは本明細書で便宜のために使用されるだけであり、何であれ本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
その全ての可能な変形形態における前記構成要素のいかなる組み合わせも、本明細書で特に明記しない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
本明細書における数値範囲の記述は、本明細書で特に指定されない限りは、その範囲内に含まれる一つ一つの数値を個別に参照する速記法として役立つことのみを意図しており、一つ一つの数値は、本明細書に個別に列挙されたかの如く、本明細書に組み込まれる。特に明記しない限り、本明細書に記載される全ての正確な数値は、対応する近似値の代表である（例えば、特定の要素又は測定値に関して与えられた正確な例示的数値は全て、適切な場合に「約」で修飾される対応する近似的測定値も与えると見なすことができる）。
本明細書に記載の方法は全て、本明細書で特に指定しない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、あらゆる適切な順番で行うことができる。
本明細書に記載される、何らかの例、又は例示的な言葉（例えば「等」）の使用は全て、特に明記しない限り、単により良く本発明を説明することを意図しているだけであって、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中のいかなる言葉も、何らかの要素が本発明の実施に不可欠であることを示していると、そのように明記されていない限り、解釈されるべきではない。
本明細書における特許文献の引用及び組込みは、便宜のためだけに為され、係る特許文献の有効性、特許性及び／又は実施可能性に関するいかなる見解も反映しない。
１つ又は複数の要素に関する、「を含んで成る（comprising）」、「を有する（having）」、「を含む（including）」又は「を含有する（containing）」等の用語を用いている、本発明のあらゆる態様又は実施形態に関する本明細書における記述は、本明細書で特に明記しない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、その特定の１つ又は複数の要素「から成る（consists of）」、その特定の１つ又は複数の要素「から実質的になる（consists essentially of）」、又はその特定の１つ又は複数の要素「を実質的に含んで成る（substantially comprises）」本発明の類似の態様又は実施形態に裏付けを与えることを意図している（例えば、特定の要素を含んで成ると本明細書に記載される組成物は、本明細書で特に明記しない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、その要素から成る組成物も記載していると理解されるべきである）。
本発明には、準拠法が許容する範囲で最大限に、本願に提供された態様又は特許請求の範囲に記載される発明の主題の全ての変更形態及び等価物も含まれる。
本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、以下の実施例は保護の範囲を限定するものとと解釈されるべきではない。上記及び下記実施例で開示される特徴は、単独でも、そしていかなるその組み合わせにおいても、その多様な形態において本発明を実現するための材料であり得る。
実施形態の列挙
１． 長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物は、ＬＨ化合物と同様に投与されたＬＨアゴニストの生体内血漿内半減期と比較して実質的に延長されたＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の生体内血漿内半減期を与える医薬的に許容し得る分子に連結されたＬＨアゴニストを含んで成る。
２． ＬＨアゴニストが哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体（例えば組換えｈＬＨ又はｈＧＨ）から選択される、実施形態１のＬＨ化合物。
３． ＬＨアゴニストが所望により二官能性リンカーを介して医薬的に許容し得る分子に化学的に連結された、実施形態１〜２のいずれか１つに記載のＬＨ化合物。
４． 医薬的に許容し得る分子が、胞状卵胞を直径約１０ｍｍから、成熟卵母細胞が成熟を完了して減数分裂が再開可能となる直径約１５〜３０ｍｍの排卵前期まで駆動するのに充分なＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の生物学的な身体組成又は濃度を与える、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のＬＨ化合物。
５． 医薬的に許容し得る分子が、低ゴナドトロピン性性機能低下症の対象を補助するのに充分なＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の生物学的な身体組成又は濃度を与える、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のＬＨ化合物。
６． 医薬的に許容し得る分子が、哺乳類胚盤胞の着床を回避又は可能にするために子宮内膜及び子宮を調節することを目的として、哺乳類対象の排卵前後期、排卵期、及び黄体期におけるプロゲステロンを維持するのに充分なＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の生物学的な身体組成又は濃度を与える、実施形態１〜６のうちのいずれか１つに記載のＬＨ化合物。
７． 医薬的に許容し得る分子が、月経周期の卵胞期中にＦＳＨ処置に関連して、好ましくは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）処置開始から５〜１０日後に注射がなされた場合、黄体（ＣＬ）の形成及び維持を補助するＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物の血漿中濃度を与える、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のＬＨ化合物。
８． ＬＨアゴニストが、ヒトＣＧ又はヒトＬＨの配列、雌ウシＣＧ又は雌ウシＬＨの配列、ブタＣＧ又はブタＬＨの配列、ウマＣＧ又はウマＬＨの配列、ヒツジＣＧ又はヒツジＬＨの配列、イヌＣＧ又はイヌＬＨの配列、ネコＣＧ又はネコＬＨの配列、ヤギＣＧ又はヤギＬＨの配列から選択される、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のＬＨ化合物。
９． 類似体が対応する哺乳類の絨毛性ゴナドトロピン又は黄体形成ホルモンの配列に対して少なくとも８０％同一、例えば８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のＬＨ化合物。
１０． ＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物が少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、例えば１．５倍〜２５倍に延長された生体内血漿内半減期を有する、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のＬＨ化合物。
１１． ＬＨアゴニスト又はＬＨ化合物がグリコシル化されている、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のＬＨ化合物。
１２． 医薬的に許容し得る分子が、アルブミン又は高分子、例えばＦｃＲｎに対する結合性が増加した改変型アルブミン、ヒトアルブミン、組換えヒトアルブミン又はＰＥＧから選択される、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のＬＨ化合物。
１３． 実施形態１〜１２のうちのいずれか１つに記載のＬＨ化合物を含んで成る、医薬組成物。
１４． 哺乳類対象の生殖能力促進（例えば生殖補助医療法）に使用するための、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のＬＨ化合物。
１５． 哺乳動物内で２〜４８時間である哺乳類ＬＨ若しくはその類似体又は改変型ＬＨの生体内血漿内半減期を与える医薬的に許容し得る分子に連結された哺乳類ＬＨ若しくはその類似体を含んで成る、改変黄体形成ホルモン。
１６． 哺乳動物内で２〜３０ＩＵ／Ｌの範囲の改変型ＬＨ、哺乳類ＬＨ又はその混合物の体内血漿中濃度を与えるための、実施形態１５に記載の改変型ＬＨ。
１７． 哺乳類ＬＨ又はその類似体が組換えＬＨ（例えばｒｈＬＨ）である、実施形態１５〜１６のうちのいずれか１つに記載の改変型ＬＨ。
１８． 改変型ＬＨが、対応する哺乳類ＬＨ配列に対して少なくとも８０％同一である哺乳類ＬＨ類似体を含んで成る、実施形態１５〜１７のうちのいずれか１つに記載の改変型ＬＨ。
１９． 哺乳類ＬＨがヒトＬＨの配列及びウマＬＨの配列から選択される、実施形態１５〜１８のうちのいずれか１つに記載の改変型ＬＨ。
２０． 医薬的に許容し得る分子が、有機小分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、受容体、グリコシル化（glycosylation）、アシル化基、糖類、高分子（例えばポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、核酸（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）、ホルモンのうちのいずれか１つから選択され、典型的には、医薬的に許容し得る分子は、限定はされないが、アルブミン、例えばヒトアルブミン、組換えアルブミン、アルブミン変異体、ｎが４〜４０であるＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ−、又は高分子、例えばＰＥＧ（例えば分子量が少なくとも５ｋＤａ、例えば１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、典型的には１０〜４０ｋＤａであるＰＥＧ）である、前述の実施形態１５〜１９のうちのいずれか１つに記載の改変型ＬＨ。
２１． 哺乳類ＬＨ若しくはその類似体が、所望により二官能性リンカーを介して医薬的に許容し得る分子に化学的に連結している、又は、所望によりペプチドリンカーを介して医薬的に許容し得る分子と融合している、前述の実施形態１５〜２０のうちのいずれか１つに記載の改変型ＬＨ。
２２． 哺乳類ＬＨ若しくはその類似体又は改変型ＬＨがグリコシル化されている、実施形態１５〜２１のうちのいずれか１つに記載の改変型ＬＨ。
２３． 哺乳類ＬＨ又はその類似体が１つ又は２つの医薬的に許容し得る分子、好ましくは１つの医薬的に許容し得る分子に連結している、実施形態１５〜２２のうちのいずれか１つに記載の改変型ＬＨ。
２４． 実施形態１５〜２３のうちのいずれか１つに記載の改変型ＬＨを含んで成る、医薬組成物。
２５． 実施形態１５〜２３のうちのいずれか１つに記載の改変型ＬＨ、及びＦＳＨ、又はＦＳＨ活性を有する分子を含んで成る、医薬組成物。
２６． 同時に、順次に又は別々に使用して、哺乳類雌対象の無排卵治療において卵胞発生（例えば少数の卵胞形成又は単一卵胞形成）を誘導するための、又は哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期においてＣＯＳを誘導するための、ＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子と組み合わせて使用するための、実施形態１５〜２３のうちのいずれか１つに記載の改変型ＬＨ。
２７． ＦＳＨ：ＬＨの投与（ＩＵ比）が２０：１〜１：２０の範囲である、実施形態２６に記載の改変型ＬＨ。
２８． ＦＳＨが哺乳類ＦＳＨ（例えばヒトＦＳＨ、具体的には組換えＦＳＨ（例えばｒｈＦＳＨ））から選択される、実施形態２５〜２７のうちのいずれか１つに記載の改変型ＬＨ。
長期作用性ｈＣＧの作製方法
長期作用性ｈＣＧは、新生児型Ｆｃ受容体への親和性の向上又は低下を選択して、ヒト血清アルブミン又はヒト血清アルブミンの変異体へのｈＣＧの化学複合体化により作製される。
化学複合体化は、高い共有結合による安定性を有するリンカー、及び通常不安的な化学結合の加水分解によりアルブミン分子から活性成分を放出する可能性を有する低い共有結合による安定性を有するリンカーを含む、当技術分野において公知の多数の異なる化学及びリンカーを用いて行われ得る。
アルブミン分子上の適切な付着基は下の表から明らかである。
例えば国際公開第２０１００９２１３５号に記載される方法、特にｈＣＧへのヒドラゾン結合を介してアルブミンをｈＣＧに結合するためにＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド）を使用する方法により、アルブミン分子上の遊離システイン残基（Ｃｙｓ３４）に結合することが特に適切である。別の態様では、ｈＣＧへのヒドラゾン結合を介してアルブミンをｈＣＧに結合するためにＥＭＣＨ（（３，３’−Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド）を使用する国際公開第２０１００９２１３５号における方法が用いられる。
ｈＣＧ分子上の適切な付着基は上の表内のものを含み、そして、ｈＣＧ分子のグリコシル化部分への結合のための化学を含む。そのグリコシル化部分への結合は、これらのグリコシル化部分はｈＣＧ受容体との直接的相互作用を有しないと予想され、それにより、結合が機能に干渉しないので、好ましい。
さらに別の結合技術がNeoseにより説明されており（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１２６８３８号）、その技術は酵素による糖複合体化を用いる。この技術は適切なリンカーを使用して例えばアルブミンをｈＣＧに結合するために用いられ得る。
ｈＣＧ分子への化学複合体化が機能活性を強く低下させる特殊な場合では、機能性ｈＣＧを放出することができる不安定性リンカーを使用することが好ましい。１つだけのアルブミン分子をｈＣＧ分子に結合させることが好ましい。
別の例では、ｈＣＧとアルブミン分子の結合は、その２つの分子の遺伝的融合によって行われ得る。ｈＣＧ分子は２つの鎖を有するので、４つの異なる配向の可能性が存在する：
アルブミン−ｈＣＧ（α鎖）
アルブミン−ｈＣＧ（β鎖）
ｈＣＧ（α鎖）−アルブミン
ｈＣＧ（β鎖）−アルブミン。
Merck Serono社により生産される製品 Ovitrelle（登録商標）内の充填済み注射筒に封入されている組換えｈＣＧは、２５０μｇの組換えｈＣＧを有する０．５ｍＬの溶液を含んで利用可能である。透析とゲル濾過により製剤用賦形剤を取り除くことができる。アルブミン又はアルブミン変異体は、国際公開第２０１００９２１３５号に記載されるように作製され得る。ｈＣＧ及びアルブミンは、国際公開第２０１００９２１３５号に記載されるようにＰＤＰＨ化学又はＥＭＣＨ化学を用いて複合体化され得る。
配列及び配列のUniProt（www.uniprot.orq）識別名（名称）及びＡＣ（受託番号）のリスト
糖タンパク質ホルモンのα鎖：
ヒト GLHA_HUMAN P01215 配列番号１
マウス GLHA_MOUSE P01216 配列番号２
ラット GLHA_RAT P11962 配列番号３
黄体形成ホルモンβ鎖：
ヒト： LSHB_HUMAN P01229 配列番号４
マウス： LSHB_MOUSE O09108 配列番号５
ラット： LSHB_RAT P01230 配列番号６
ゴリラ： LSHB_GORGO Q2Q1P1 配列番号７
チンパンジー： LSHB_PANTR Q2Q1P2 配列番号８
コリオゴナドトロピンβ（ｈＣＧ−Ｂ）：
ヒト： CGHB_HUMAN P01233 配列番号９
卵胞刺激ホルモン
フォリトロピン・サブユニットβ
ヒト： FSHB_HUMAN P01225 配列番号１０
マウス： FSNB_MOUSE Q60687 配列番号１１
ラット： FSHB_RAT P18427 配列番号１２
ゴリラ： FSHB_GORGO A1BN60 配列番号１３
チンパンジー： FSHB_PANTR Q2PUH2 配列番号１４
コリフォリトロピンα
コリフォリトロピンαはゴナドトロピンα鎖（配列番号１）及びＦＳＨのβ鎖＋ｈＣＧのＣ末端２８アミノ酸（太字）からなる。
配列番号１５
長期作用性ｈＬＨの作製方法
長期作用性ｈＬＨは、新生児型Ｆｃ受容体への親和性の向上又は低下を選択して、ヒト血清アルブミン又はヒト血清アルブミンの変異体へのｈＬＨの化学複合体化により作製される。
化学複合体化は、高い共有結合による安定性を有するリンカー、及び通常不安的な化学結合の加水分解によりアルブミン分子から活性成分を放出する可能性を有する低い共有結合による安定性を有するリンカーを含む、当技術分野において公知の多数の異なる化学及びリンカーを用いて行われ得る。アルブミン分子上の適切な付着基は下の表から明らかである。
例えば国際公開第２０１００９２１３５号に記載される方法、特にｈＣＧへのヒドラゾン結合を介してアルブミンをｈＣＧに結合するためにＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド）を使用する方法により、アルブミン分子上の遊離システイン残基（Ｃｙｓ３４）に結合することが特に適切である。別の態様では、ｈＬＨへのヒドラゾン結合を介してアルブミンをｈＣＧに結合するためにＥＭＣＨ（（３，３’−Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド）を使用する国際公開第２０１００９２１３５号における方法が用いられる。
ｈＬＨ分子上の適切な付着基は上の表内のものを含み、そして、ｈＬＨ分子のグリコシル化部分への結合のための化学を含む。そのグリコシル化部分への結合は、これらのグリコシル化部分はｈＬＨ受容体との直接的相互作用を有しないと予想され、それにより、結合が機能に干渉しないので、好ましい。
さらに別の結合技術がNeoseにより説明されており（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１２６８３８号を参照のこと）、それは酵素による糖複合体化を用いる。この技術は適切なリンカーを使用して例えばアルブミンをｈＬＨに結合するために用いられ得る。
ｈＬＨ分子への化学複合体化が機能活性を強く低下させる特殊な場合では、機能性ｈＬＨＣＧを放出することができる不安定性リンカーを使用することが好ましい。１つだけのアルブミン分子をｈＬＨ分子に結合させることが好ましい。
別の例では、ｈＬＨとアルブミン分子の結合はその２つの分子の遺伝的融合によって行われ得る。ｈＬＨ分子は２つの鎖を有するので、４つの異なる配向の可能性が存在する：
アルブミン−ｈＬＨ（α鎖）
アルブミン−ｈＬＨ（β鎖）
ｈＬＨ（α鎖）−アルブミン
ｈＬＨ（β鎖）−アルブミン。
EMD Serono社により生産される製品Luveris（登録商標）内の凍結乾燥粉末として封入されている組換えｈＬＨが利用可能であり、そして、８２．５ＩＵの組換えｈＬＨを含む１．０ｍＬの溶液に再構成され得る。透析とゲル濾過により製剤用賦形剤を取り除くことができる。アルブミン又はアルブミン変異体は、国際公開第２０１００９２１３５号に記載されるように作製され得る。組換えＬＨ及びアルブミンは、国際公開第２０１００９２１３５号に記載されるようにＰＤＰＨ化学又はＥＭＣＨ化学を用いて複合体化され得る。
ＳＰＡ−ＰＥＧのｈＬＨ又はその変異体への共有結合
下（「溶液中でのｈＬＨ及びその変異体のＰＥＧ化」）で説明されるように、ヒトＬＨ及びその変異体はＳＰＡ−ＰＥＧ５０００、ＳＰＡ−ＰＥＧ１２０００及びＳＰＡ−ＰＥＧ２００００（NOF Corporation社）に共有結合される。
溶液中でのｈＬＨ及びその変異体のＰＥＧ化
ヒトＬＨ及びその変異体は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）中に２５０μｇ／ｍｌの濃度でＰＥＧ化される。余剰なＰＥＧはモル単位でそのタンパク質上のＰＥＧ化部位に関して５〜１００倍である。反応混合物をサーモ・ミキサーに設置し、３７℃、１２００ｒｐｍで３０分間保温する。３０分後に、過剰量のグリシンを添加して反応を停止する。
反応混合物から過剰なＰＥＧ、グリシン及び他の副産物を除去するために陽イオン交換クロマトグラフィーを適用する。ＰＥＧ化反応混合物を２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）でイオン強度が７ｍＳ／ｃｍ未満になるまで希釈する。５Ｎ ＨＣＩを使用してｐＨを２．５に調節する。その混合物を２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）で平衡化したSP sepharose FFカラムにかける。４カラム体積の平衡化緩衝液を用いて結合しなかった物質をカラムから洗い落とす。ＰＥＧ化タンパク質は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウムを添加することにより、３カラム体積中に溶出される。１０ｋＤａの分子量カットオフ（ｍｗｃｏ）を有するVivaSpin濃縮装置を使用して純粋なＰＥＧ化ｈＬＨを濃縮し、緩衝液交換を行う。
ｈＣＧと組換えヒトアルブミン又はヒトアルブミンのＫ５７３Ｐ変異体との１：１複合体の作製と特徴の解析
材料
組換えヒトアルブミン（Recombumin、Novozymes Biopharma社）は２００ｍｇ／ｍｌの溶液として供与された。大本のバイアルをクリーンベンチ内で５０本の１ｍｌのアリコットに分割した。アリコットを凍結して保存した。
国際公開第２０１１０５１４８９号に記載されるように組換えヒトアルブミン変異体Ｋ５７３Ｐを作製することができる。その化合物（１１２ｍｇ／ｍｌ）を凍結して保存した。
組換えｈＣＧをOvitrelle製品（Merck Serono社）から作製し、GE Healthcare社の使い捨てPD-10脱塩カラムを使用する緩衝液交換により、各複合体について説明されているように製剤用賦形剤を除去した。
ＰＤＰＨ（（３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド）、ＥＭＣＨ（Ｎ−［マレイミドカプロン酸］ヒドラジド））、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）及びＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド）をThermo Fisher Scientific 社より購入した。
他の全ての化学及び材料は標準的な研究用品質のものであった。
方法
サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
分析ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、多波長検出器を取り付けられたAgilent HP1100機を使用して行われた。使用した分析用カラムは、
TSK- SWXLガードカラムを使用するTSK g3000 SWXL (7.8mm（内径） x 30cm （長さ）)
TSK- SWXLガードカラムを使用するTSK g3000 SWXL (7.5mm（内径） x 60cm （長さ）)
であった。分取ＨＰＬＣは、Waters HPLCシステムを使用して行われた。使用した分取カラムは、
Superdex 200 26/600 Hiload
Superdex 200 10/300 GL
であった。全てのカラムには、別途説明されない限り、０．２μｍの濾過を行ったｐＨ７．４のＰＢＳを流した。検出は２８０ｎｍであった。
典型的な溶出条件／分析時間は下の表に示されている。
ＳＤＳ非還元ゲル
ＳＤＳ非還元ゲルの最適な分離/分解は、Novex ４〜１２％トリス‐グリシンゲルを使用して達成された。泳動緩衝液はトリス酢酸ＳＤＳ泳動緩衝液であった。試料調製は以下の通りであった。
５μｌのＬＤＳ試料緩衝液を１５μｌの試料に添加した。室温で５分間保温すること。
１０μｌの試料をゲルに負荷した。
全てのゲルは１５０Ｖの定圧で泳動し、泳動時間は約６０分であった。
ゲルを脱イオン水で５分間洗浄し、Gel Code Blue Safe-Stain (ThermoFisher社)を使用して染色し、そして、脱イオン水を用いて脱色した。
ＳＤＳ還元ゲル
ＳＤＳ非還元ゲルの最適な分離/分解は、Novex ４〜１２％トリス‐グリシンゲルを使用して達成された。泳動緩衝液はトリス‐グリシンＳＤＳ泳動緩衝液であった。試料は以下の通りであった。
５μｌのＬＤＳ試料緩衝液
２μｌのNuPAGE還元剤
１５μｌの試料。
試料を８５℃まで２分間加熱し、そして、１０μｌの試料をゲルに負荷した。全てのゲルは１５０Ｖの定圧で泳動し、泳動時間は約６０分であった。非還元ゲルのように、ゲルを洗浄し、染色／脱色した。
分光光度法（Ａ２８０）
測定は、島津UV-160分光光度計と１ｃｍの水晶製のマイクロキュベットを使用して２２０〜３２０ｎｍの範囲にわたり、試料緩衝液に対するベースライン補正の後に行った。
エンドトキシンの測定
エンドトキシンの測定は、Charles River 社製Portable Test System（ＰＴＳ）を使用し、１〜０．０１ＥＵ／ｍＬの濃度について行った。試料を分散剤に１／１０の割合で希釈（０．０５ｍＬの試料＋０．１ｍＬの分散剤＋０．３５ｍＬのＬＡＬ水）した後に分析した。ＰＴＳエンドトキシンカートリッジを使用して、希釈後の試料を分析した。
Ａ：複合体１の作製
複合体１は、ＰＤＰＨについて製造業者によって説明されるように、ＰＤＰＨリンカーをｈＣＧ上の酸化シアル酸へ複合体化し、ｒＨＡの遊離システインへのジスルフィド結合形成を介してｒＨＡへｈＣＧ−ＰＤＰＨをさらに結合させることにより作製されたｈＣＧ−ＰＤＰＨ−アルブミン複合体（１：１：１）である。
ｈＣＧの調製
３０本の注射筒内のOvitrelleをまとめ（総計１５ｍｌ、７．５ｍｇのｈＣＧ）、vivaspin 500遠心濃縮器を卓上遠心機で１３，０００ｒｐｍで使用して約５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で平衡化した３本のPD-10脱塩カラムを使用して濃縮溶液の緩衝液を交換した。５００μｌの溶液を各カラムに負荷し、２．５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。ｈＣＧを１ｍｌのＰＢＳに溶出した。緩衝液交換したｈＣＧの濃度を、１ｍｇ／ｍｌの溶液について０．４５９の吸光係数を用いるＡ２８０測定により決定した。
ｈＣＧの過ヨウ素酸酸化
過ヨウ素酸ナトリウムの１ｍｇ／ｍｌの水溶液を調製した。この水溶液を冷ｈＣＧ溶液（４４μｌ／ｍｇのｈＣＧ）に添加し、ホイルに包んで遮光し、氷上に３５分間静置した。反応しなかった過ヨウ素酸塩を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で平衡化した２本のＰＤ−１０脱塩カラムを使用して反応混合物から除去した。反応混合物を２本の等量のアリコットに分割し、カラムに負荷し、ＰＢＳを使用して総量で２．５ｍｌになるように洗浄した。酸化ｈＣＧを５００μｌのＰＢＳのアリコットに溶出した。タンパク質含有ピーク画分をＡ２８０測定により特定し、プールした。ｈＣＧ濃度をＡ２８０測定により決定した。酸化ｈＣＧ溶液を、vivaspin 500遠心濃縮器を使用して約８ｍｇ／ｍｌのｈＣＧまで濃縮した。
酸化ｈＣＧのＰＤＰＨとの反応
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中にＰＤＰＨの１００ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。この溶液を、ＰＤＰＨが３２．５倍のモル過剰量になるように酸化ｈＣＧ溶液に添加し（３μｌのＰＤＰＨ溶液／ｍｇのｈＣＧ）、穏やかに混合し、そして、２５℃の水槽に３時間静置した。反応しなかった架橋剤を除去するために、反応混合物をＰＢＳに平衡化したPD-10カラムに負荷し、ＰＢＳを使用して総量で２．５ｍｌになるように洗浄した。ｈＣＧ−ＰＤＰＨを５００μｌのＰＢＳのアリコットに溶出した。ピーク画分をＡ２８０測定により特定し、プールした。
ｒＨＡの調製
ｈＣＧ−ＰＤＰＨとの反応前に組換えｒＨＡを精製してｒＨＡ二量体を除去した。ｒＨＡ（５００μｌ）をSuperdex 200 10/300 GLカラムに負荷し、上に記載されるようにＰＢＳに溶出した。単量体のピークを採取した。ｒＨＡ濃度を、１ｍｇ／ｍｌについて０．５１の吸光係数を用いるＡ２８０測定により決定した。精製したｒＨＡをvivaspin 500遠心濃縮器を卓上遠心機で１３，０００ｒｐｍで使用して約２００ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
ｈＣＧ−ＰＤＰＨのｒＨＡとの反応
精製したｒＨＡを、ｒＨＡが５倍のモル過剰量になるようにｈＣＧ−ＰＤＰＨ溶液に添加し（１２．８ｍｇのｒＨＡ／ｍｇのｈＣＧ）、穏やかに混合し、そして、２５℃の水槽に３時間静置した。
１：１：１複合体の精製
反応混合物を２本の５００μｌのアリコットに分割した。第１のアリコットをSuperdex 200 10/300 GLカラムに負荷し、そして、上記のようにＰＢＳに溶出した。複合体のピークを採取した。これを反応混合物の第２のアリコットについて繰り返した。複合体のピークをプールし、複合体濃度を、１ｍｇ／ｍｌについて０．４９６の吸光係数を用いるＡ２８０測定により決定した。
複合体溶液を、vivaspin500遠心濃縮器を使用して、１０倍、７００μｌの体積にまで再濃縮した。この濃縮された複合体溶液を、前のようにSuperdex 200 10/300 GLカラムを使用して１００μｌのアリコットに精製した。
精製した複合体溶液を０．２μｍのフィルターに通して濾過し、５０μｌのアリコットにして５００μｌの滅菌エッペンドルフチューブにピペットで注入し、そして、凍結した。
試料を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８ａ及び８ｂ）により、及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図８ｃ）により分析した。
複合体１の安定性を９６時間、４つの異なる条件、すなわち、５℃（ｐＨ７．４）、３７℃（ｐＨ７．４）、３７℃（ｐＨ６．４）、及び３７℃（ｐＨ５．４）で分析した。試料をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。
非複合体化ｈＣＧが約４０％／日の初期速度で放出されることが安定性分析の結果であった。
Ｂ：複合体３の作製
複合体３は、ＳＰＤＰの製造業者によって説明されるように、ＳＰＤＰリンカーをｈＣＧ上の（Ｎ末端又はリシン側鎖の）遊離アミンへ複合体化し、ｒＨＡの遊離システインへのジスルフィド結合形成を介してｒＨＡへｈＣＧ−ＳＰＤＰをさらに結合させることにより作製されたｈＣＧ−ＳＰＤＨ−アルブミン複合体（１：１：１）である。
ｈＣＧの調製
２０本の注射筒内のOvitrelleをまとめ（１０ｍｌ、５ｍｇのｈＣＧ）、６本のVivaspin 500遠心濃縮器を卓上遠心機で１３，０００ｒｐｍで使用して約２ｍｌに濃縮した。ｐＨ５．９のクエン酸緩衝液で平衡化した２本のPD-10脱塩カラムを使用して濃縮溶液の緩衝液を交換した。溶液の半分を各カラムに負荷し、クエン酸緩衝液を使用して総量で２．５ｍｌになるように洗浄した。ｈＣＧを５００μｌのクエン酸緩衝液のアリコットに溶出した。ピーク画分をＡ２８０測定により特定し、プールした。ｈＣＧの濃度を、０．４５９の吸光係数を用いるＡ２８０測定により決定し、クエン酸緩衝液を用いて１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。
ｈＣＧのＳＰＤＰとの反応
ＤＭＳＯ中にＳＰＤＰの２．５ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。この溶液を、ＳＰＤＰが１０倍のモル過剰量になるようにｈＣＧ溶液に添加し（５０μｌのＳＰＤＰ溶液／ｍｇのｈＣＧ）、穏やかに混合し、そして、２５℃の水槽に１時間静置した。反応しなかった架橋剤を除去するために、反応混合物の半分をｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で平衡化した２本のＰＤ１０カラムのそれぞれに負荷し、ＰＢＳを使用して総量で２．５ｍｌになるように洗浄した。ｈＣＧ−ＳＰＤＰ複合体を５００μｌのＰＢＳのアリコットに溶出した。タンパク質含有ピーク画分をＡ２８０測定により特定し、プールした。
ｒＨＡの調製
Superdex 200 26/600 Hiloadカラムを使用してｒＨＡを精製した。ｒＨＡ（３ｍｌ）をそのカラムに負荷し、上記のようにＰＢＳに溶出した。単量体のピークを採取した。ｒＨＡ濃度を、前のようにＡ２８０測定により決定した。
ｈＣＧ−ＳＰＤＰのｒＨＡとの反応
精製したｒＨＡを、ｒＨＡが５倍のモル過剰量になるようにｈＣＧ−ＳＰＤＰ溶液に添加し（１２．８ｍｇのｒＨＡ／ｍｇのｈＣＧ）、穏やかに混合し、そして、２５℃の水槽に一晩静置した。反応混合物（３ｍｌ）をSuperdex 200 26/600 Hiloadカラムに負荷し、そして、上記のようにＰＢＳに溶出した。複合体のピークを採取した。溶液を滅菌濾過し、そして、弱く結合した架橋剤の加水分解のために３７℃の恒温器に４８時間放置した。
１：１：１複合体の最終精製
加水分解後、vivaspin500遠心濃縮器を使用して溶液を約３ｍｌの体積にまで濃縮した。濃縮された溶液をSuperdex 200 26/600 Hiloadカラムに負荷し、そして、ＰＢＳに溶出した。複合体のピークを採取した。複合体濃度を、１ｍｇ／ｍｌについて０．４９６の吸光係数を用いるＡ２８０測定により決定した。精製した複合体溶液を前のように約１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、０．２ミクロンフィルターに通して濾過し、５０μｌのアリコットにして５００μｌの滅菌エッペンドルフチューブにピペットで注入し、そして、凍結した。
試料を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図９ａ及び９ｂ）により、及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図９ｃ）により分析した。
複合体３の安定性を９６時間３７℃（ｐＨ７．４）で分析した。試料をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。
複合体３が適度に安定的であり、非複合体化ｈＣＧが約２％／日の初期速度で放出されることが安定性分析の結果であった。
Ｃ：複合体４の作製
複合体４は、ｈＣＧ中のカルボン酸基がＰＤＰＨと反応するＰＤＰＨリンカーのＥＤＣ活性化ｈＣＧへの複合体化により作製されたｈＣＧ−ＰＤＰＨ−アルブミン複合体（１：１：１）である。ｈＣＧ−ＰＤＰＨは、ＰＤＰＨ及びＥＤＣの製造業者によって説明されるように、ｒＨＡの遊離システインへのジスルフィド結合形成を介してｒＨＡへさらに結合される。
ｈＣＧの調製
２０本の注射筒内のOvitrelleをまとめ（１０ｍｌ、５ｍｇのｈＣＧ）、６本のVivaspin 500遠心濃縮器を卓上遠心機で１３，０００ｒｐｍで使用して約１．５ｍｌに濃縮した。ｐＨ５．３のＭＥＳ緩衝液で平衡化した３本のPD-10脱塩カラムを使用して濃縮ｈＣＧ溶液の緩衝液を交換した。約５００μｌの溶液を各カラムに負荷し、ＭＥＳ緩衝液を使用して総量で３ｍｌになるように洗浄した。ｈＣＧを１．０ｍｌのＭＥＳ緩衝液に溶出した。ｈＣＧの濃度を、０．４５９の吸光係数を用いるＡ２８０測定により決定した。
ｈＣＧのＥＤＣ及びＰＤＰＨとの反応
ＤＭＳＯ中にＰＤＰＨの５０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。この溶液を、ＰＤＰＨが反応混合物中で５ｍＭになるようにｈＣＧ溶液に添加し（１．１５ｍｇ／ｍｌのＰＤＰＨ）、そして、穏やかに混合した。ＭＥＳ緩衝液中にＥＤＣの５０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、直ちにｈＣＧ／ＰＤＰＨ溶液に添加して反応混合物中に２．５ｍＭのＥＤＣ（０．４８ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ）が生じた。反応混合物を穏やかに混合し、そして、２５℃の水槽に３０分間静置した。反応しなかった架橋剤を除去するために、反応混合物の半分をｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で平衡化した２本のＰＤ−１０カラムのそれぞれに負荷し、ＰＢＳを使用して総量で２．５ｍｌになるように洗浄した。ｈＣＧ−ＰＤＰＨを５００μｌのＰＢＳのアリコットに溶出した。タンパク質含有ピーク画分をＡ２８０測定により特定し、プールした。
ｒＨＡの調製
Superdex 200 26/600 Hiloadカラムを使用してｒＨＡを精製した。ｒＨＡ（３ｍｌ）をそのカラムに負荷し、ＰＢＳに溶出した。単量体のピークを採取した。ｒＨＡ濃度を、前のようにＡ２８０測定により決定した。
ｈＣＧ−ＰＤＰＨのｒＨＡとの反応
精製したｒＨＡを、ｒＨＡが５倍のモル過剰量になるようにｈＣＧ−ＰＤＰＨ溶液に添加し（１２．８ｍｇのｒＨＡ／ｍｇのｈＣＧ）、穏やかに混合し、そして、２５℃の水槽に３時間静置した。３時間後に反応混合物の半分をSuperdex 200 26/600 Hiloadカラムに負荷した。２つ目の半分を２時間後、第１サイクルの完了時に負荷した。その複合体溶液を、vivaspin500遠心濃縮器を使用して約３ｍｌまで濃縮した。溶液を滅菌濾過し、そして、弱く結合した架橋剤の加水分解のために３７℃の恒温器に３６時間放置した。
１：１複合体の最終精製
加水分解した複合体溶液（３ｍｌ）をSuperdex 200 26/600 Hiloadカラムに負荷し、そして、上記のようにＰＢＳに溶出した。複合体のピークを採取した。複合体濃度を、１ｍｇ／ｍｌについて０．４９６の吸光係数を用いるＡ２８０測定により決定した。精製した複合体溶液を前のように約１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、０．２μｍのフィルターに通して濾過し、５０μｌのアリコットにして５００μｌの滅菌エッペンドルフチューブにピペットで注入し、そして、凍結した。
試料を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０ａ及び１０ｂ）により、及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図１０ｃ）により分析した。
複合体４の安定性を９６時間３７℃（ｐＨ７．４）で分析した。試料をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。
複合体３が適度に安定的であり、非複合体化ｈＣＧが約２％／日の初期速度で放出されることが安定性分析の結果であった。
Ｄ：複合体３Ｖ１の作製
複合体３Ｖ１はｒｈＣＧ−ＳＰＤＰ−ｒＨＡ（Ｋ５７３Ｐ）である。
上記のように複合体３を作製するために使用された方法を用い、ＳＰＤＰ架橋剤を使用してｈＣＧとｒＨＡ変異体（Ｋ５７３Ｐ）の複合体を調製した。試料を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１１ａ及び１１ｂ）により、及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図１１ｃ）により分析した。
複合体３Ｖ１の安定性を９６時間３７℃（ｐＨ７．４）で分析した。試料をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。
複合体３Ｖ１が適度に安定的であり、非複合体化ｈＣＧが約２％／日の初期速度で放出されることが安定性分析の結果であった。
Ｅ：複合体４Ｖ１の作製
複合体４Ｖ１はｒｈＣＧ−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ（Ｋ５７３Ｐ）である。
上記のように複合体４を作製するために使用された方法を用い、ＥＤＣ架橋剤及びＰＤＰＨ架橋剤を使用してｈＣＧとｒＨＡ変異体（Ｋ５７３Ｐ）の複合体を調製した。試料を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１２ａ及び１２ｂ）により、及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図１２ｃ）により分析した。
複合体４Ｖ１が適度に安定的であり、非複合体化ｈＣＧが約２％／日の初期速度で放出されることが安定性分析の結果であった。
ｈＣＧ−アルブミン融合体及びｈＬＨ−アルブミン融合体の作製
発現プラスミドの構築
ゴナドトロピン共通αサブユニット、ｈＣＧβサブユニット及びｈＬＨβサブユニットをコードする遺伝子並びにこれらの３つの遺伝子のヒト血清アルブミンの遺伝子との３’末端か５’末端での融合体を、ポリメレース連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる合成オリゴヌクレオチドの組み立てにより構築した。関連の遺伝子の天然のヒトシグナル配列をコードする配列が含まれ、ヒト血清アルブミンについては、天然プロペプチドをコードする遺伝子が含まれた。それらの遺伝子のコドンの使用頻度は哺乳類細胞における高発現のために最適化された。その関連の遺伝子は、次のものである。
それらの遺伝子配列はGeneArt AG社により合成され、下の表に示されるようにｐＥＥ１２．４ベクター及びｐＥＥ６．４ベクターにそれぞれサブクローニングされた。
Ｎ末端のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＣ末端のＥｃｏＲＩ制限部位を使用した。手短に言うと、Gene Art社により作製された５μｇの凍結乾燥シャトルベクターを５０μｌのエンドトキシンフリー滅菌水に再懸濁した。作製された１００ｎｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液のうちの１０μｌを２．５μｌずつのＥｃｏＲｌ及びＨｉｎｄＩＩＩ高忠実度制限酵素、５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液及び３０μｌのエンドトキシンフリー滅菌水と氷上で混合した。次に試料を３７℃で２時間保温した。８．３μｌの６×ＤＮＡ負荷緩衝液を添加し、そして、試料を臭化エチジウムで染色した１％（重量／体積）のアガロースゲルに１２０Ｖで４０〜６０分間電気泳動した。１０μｌのLonza SimplyLoad Tandem DNAラダーを基準ラダーとして使用した。BioSpectrum Imaging System (UVP社）を使用してそのアガロースゲルを画像撮影した。
製造業者の使用説明書に従ってQIAquickゲル抽出キットを使用して適切な断片をゲルから抽出した。１：６及び１：１２の挿入ＤＮＡに対するベクター骨格の比率、１μｌのT4 quickライゲース、２０μｌの２×T4 quickライゲーション緩衝液を用い、必要なときはエンドトキシンフリー滅菌水を使用して反応体積を２０μｌに調節し、試料を室温で１５分間保温してライゲーションを行った。ライゲーション反応のうちの１０μｌのアリコットを使用し、製造業者の使用説明書に従い、ヒートショック法を用いてOne Shot Top 10 化学コンピテント大腸菌（Escherichia coli）細胞を形質転換した。細胞をアンピシリン含有（５０μｇ／ｍｌ）ルリア・ベルターニ寒天プレートに広げ、そして、細菌のコロニーが目に見えるまで３７℃で一晩培養した。組換え体をスクリーニングするため、細菌の単一性コロニーを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１５ｍｌのルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地につまみ取り、そして、振盪して３７℃で６時間培養した。QIAGEN miniprepシステムを使用してベクターＤＮＡをこれらの培養物のうちの１０ｍｌから単離し、３０μｌのＥＢ緩衝液に溶出した。
陽性組換え体をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩでの消化により特定した。作製したベクターのアリコットを、ベクター特異的フォワードプライマー（ＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＴＡＡＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＣ）及びリバースプライマー（ＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡ）を使用する第三者団体による遺伝子配列解析のために送付した。下の表は各遺伝子について使用したＧＳベクターを示している。
ＤＮＡの増幅
ＤＮＡの増幅のため、コロニーのスクリーニングの間に作製された５ｍｌの培養物を使用して、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１．５Ｌのルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地に接種し、そして、２２０ｒｐｍで振盪して３７℃で一晩培養した。QIAGEN Plasmid Plus Gigaprep システムを使用してベクターＤＮＡを単離した。全ての例で、Nanodrop 1000 分光光度計（Thermo-Scientific社）を使用してＤＮＡ濃度を測定し、エンドトキシンフリー滅菌水を使用して濃度を１ｍｇ／ｍｌに調節した。図１３は遺伝子サイズの確認を示している。
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞の日常の培養
６ｍＭのグルタミンを添加したＣＤ‐ＣＨＯ培地でＣＨＯＫ１ＳＶ細胞を培養した。細胞を振盪培養器内で３６．５℃、１０％のＣＯ２、８５％の湿度、１４０ｒｐｍの条件で培養した。細胞を３〜４日ごとに日常的に継代培養し、２×１０5細胞／ｍｌの割合で蒔き、そして、形質移入に利用可能な充分な細胞を得るために培養した。２０継代までに細胞を廃棄した。
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞の一過性形質移入
少なくとも２週間培養したＣＨＯＫ１ＳＶ細胞を用いて一過性形質移入を行った。細胞を形質移入の２４時間前に継代した。細胞生存率は形質移入時に９９％超であった。全ての形質移入は、プレートベースの電気穿孔法のためのシステムであるGene Pulse MXCeII（Bio-Rad社）を使用する電気穿孔法により実行した。各形質移入につき、生存細胞を温めてあった培地に２．８６×１０7細胞／ｍｌの割合で再懸濁した。８０μｇのＤＮＡ（４０μｇ／単一遺伝子ベクター）を各ウェルに分注し、そして、７００μｌの細胞懸濁液を添加した。細胞を３００Ｖ、１３００ｐＦで電気穿孔した。形質移入された細胞をエーレンマイヤーフラスコ内の温めてあった培地に移し、セルを温めてあった培地で２回すすぎ、その培地もフラスコに移した。形質移入された細胞の培養物を振盪培養器内で３６．５℃、１０％のＣＯ２、８５％の湿度、１４０ｒｐｍの条件で６日間培養した。回収時に細胞の生存率を、Cedex HiRes自動細胞計測機（Roche社）を使用して測定した。
アルブミン結合生成物の精製
全ての精製について、培養物上清を回収し、２０００ｒｐｍの１０分間の遠心分離により清澄化した。清澄化した上清を、３０ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用する接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて約１００〜１５０ｍｌにまで、約１０倍に濃縮した。濃縮された上清を、10/50 Tricornカラム（GE Healthcare社、28-4064-14）に充填した５ｍｌのCaptureSelect HSA樹脂（BAC社、191.2970.05）を２ｍｌ／分の流速で使用して精製した。そのカラムを５０ｍＭリン酸ナトリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム（ＰＢＳ緩衝液）（ｐＨ７．４）で平衡化し、細胞培養上清を負荷した後にそのＰＢＳ緩衝液で洗浄した。溶出は、２０ｍＭトリス、２Ｍ塩化マグネシウム（ｐＨ７．４）を用いて開始された。溶出が終わるたびに、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ２．０）で置き換えてカラムを掃除した。
野生型ｈＣＧ及びＬＨの精製
清澄化した上清を、１０ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用する接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて約１００〜１５０ｍｌにまで、約１０倍に濃縮した。濃縮された上清を、HiTrap Capto Qカラム（５ｍｌ、GE Healthcare社、11-0013-03）を５ｍｌ／分の流速で使用して精製した。そのカラムを２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）で平衡化し、細胞培養上清を負荷した後に２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）で洗浄した。２０ｍＭトリス、１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）までの溶出濃度勾配を２０カラム体積に渡って適用して溶出を開始した。溶出が終わるたびに、０．５ＭのＮａＯＨで置き換えてカラムを掃除した。
ＳＤＳ ＰＡＧＥによる生成物１〜１０の分析
NuPage 4× LDS試料緩衝液（Invitrogen社、NP0007）及びNuPage 10×試料還元剤（Invitrogen社、NP0009）と混合し、７０℃で１０分間保温して還元試料を分析用に調製した。非還元試料については、還元剤と加熱を省略した。試料を、変性条件下のNuPage MES SDS泳動緩衝液を使用し、1.5 mm NuPage 4〜12%ビス‐トリスNovexプレキャストゲル（Invitrogen社、NP0315）で電気泳動した。SeeBlue Plus 2染色済み分子量標準物質（Invitrogen社、LC5925）と１ｍｇ／ｍｌの濃度の対照抗体又はｈＣＧタンパク質の１０μｌのアリコットがゲルに含まれた。１０μｌの１ｍｇ／ｍｌの濃度の各試料をゲルに負荷した。電気泳動後、InstantBlue（TripleRed社、ISBO1L）を使用してゲルを室温で３０分間染色した。染色したゲルの画像をBioSpectrum Imaging System（UVP社）で分析した（図１７を参照のこと）。
ウエスタンブロット法による生成物１〜１０の分析
適切な対照（ヒト血清アルブミン（Abcam社、ab7473）又はｈＣＧ（Ovitrelle、Serono社））を含む、ＳＤＳ ＰＡＧＥについて説明されたように調製されたゲルを、NuPAGE 転写緩衝液（Invitrogen社）中でX-Cell II Blotモジュール（Invitrogen社）を２５Ｖ、１００〜１２５ｍＡで１．５時間にわたって使用してニトロセルロース膜（０．２μｍの孔径）に転写した。Western Breeze発色性ウエスタンブロット免疫検出キット（Invitrogen社）を製造業者の使用説明書に従って使用してウエスタンブロットを実行した。簡単に説明すると、膜を室温で３０分間ブロッキングし、２０ｍｌの水で２回洗浄した。膜を一次抗体溶液と室温で１時間保温した。その膜を２０ｍｌの洗浄溶液で４回洗浄し、二次抗体溶液と室温で３０分間保温した。その膜をもう一度２０ｍｌの洗浄溶液で４回洗浄し、続いて２０ｍｌの水で２回洗浄し、５ｍｌの発色性基質の中でバンドが現像されるまでインキュベートし、次に２０ｍｌの水で膜を２回すすぎ、乾燥した。乾燥した膜の画像をBioSpectrum Imaging System（UVP社）で分析した。
抗ＨＳＡウエスタンブロット
このウエスタンブロットは、一次抗体としてヤギ抗ヒト血清アルブミン抗体（Abcam社、ab19180）を使用した。その抗体は１：２０００に希釈して（０．５μｇ／ｍｌの終濃度）で使用された。ヤギWestern Breeze発色性ウエスタンブロット免疫検出キット（Invitrogen社、WB7107）を使用した。図１４を参照のこと。
抗ｈＣＧα鎖ウエスタンブロット
このウエスタンブロットは、一次抗体としてポリクローナルヤギ抗ｈＣＧα鎖（Abcam社、ab20712）を使用した。その抗体は１：１００００に希釈して（０．６μｇ／ｍｌの終濃度）で使用された。ヤギWestern Breeze発色性ウエスタンブロット免疫検出キット（Invitrogen社、WB7107）を使用した。図１５を参照のこと。
抗ｈＣＧβ鎖ウエスタンブロット
このウエスタンブロットは、一次抗体としてモノクローナルマウス抗ｈＣＧβ鎖抗体（Abcam社、ab9582）を使用した。その抗体は１：３３３．３３に希釈して（０．６μｇ／ｍｌの終濃度）使用された。マウスWestern Breeze発色性ウエスタンブロット免疫検出キット（Invitrogen社、WB7103）を使用した。図１６を参照のこと。
ウエスタンブロット分析は生成物の個々の基礎的要素の特定と確認に成功した。
ＳＥＣによる分析
控えの試料を、Zorbax GF-250 4 pm 4.6 mm ID x 25 cmカラム（Agilent社）又はZorbax GF-250 4 pm 9.2 mm ID x 25 cmカラム（Agilent社）を使用するAgilent 1200シリーズＨＰＬＣシステムでのＳＥ−ＨＰＬＣにより分析した。注入前に、１ｍｇ／ｍｌの濃度の試料のアリコットを０．２μｍのフィルターに通して濾過した。２０μｌ又は１００μｌのアリコットをそれぞれ注入し、１ｍｌ／分の流速で５〜１５分間流した。Chemstationソフトウェアを使用して可溶性凝集体のレベルを分析した。
ｈＣＧ−Ｆｃ融合体及びＬＨ−Ｆｃ融合体の作製
発現プラスミドの構築
ゴナドトロピン共通αサブユニット及びリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のヒトＩｇＧ１のＦｃとの融合体、ｈＣＧβサブユニット及びリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のヒトＩｇＧ１のＦｃとの融合体、並びにｈＬＨβサブユニット及びリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のヒトＩｇＧ１のＦｃとの融合体をコードする遺伝子を、ポリメレース連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる合成オリゴヌクレオチドの組み立てにより構築した。関連の遺伝子の天然のヒトシグナル配列をコードする配列が含まれた。それらの遺伝子のコドンの使用頻度は哺乳類細胞における高発現のために最適化された。その関連の遺伝子は、次のものである。
それらの遺伝子配列はGeneArt AG社により合成され、下の表に示されるようにｐＥＥ１２．４ベクター及びｐＥＥ６．４ベクターにそれぞれサブクローニングされた。全ての作業は実施例６に記載されているように実施された。
図１３は遺伝子サイズの確認を示している。
ＤＮＡの増幅、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞の培養及び形質移入は実施例６に記載されるように実施された。
精製
Ｆｃ融合体生成物を精製するためにプロテインＡ精製を用いた。清澄化した上清を、充填済み5 ml HiTrap MabSelect SuREカラム（GE Healthcare社、11-0034-94）をAKTA purifier（１０ｍｌ／分）を使用して精製した。そのカラムを５０ｍＭリン酸ナトリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．３）で平衡化し、５０ｍＭリン酸ナトリウム及び１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．３）で洗浄し、１０ｍＭギ酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出した。溶出画分を直ちにｐＨ７．３に調節した。
ＳＤＳ ＰＡＧＥによる生成物１１及び１２の分析
精製した材料を実施例６に記載されるように還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した（図１８を参照のこと）。
ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分析
精製した材料を実施例６に記載されるようにサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに分析して、純度と同一性を確認した。
ｈＣＧ変異体及びＬＨ変異体のインビトロ活性の測定
ＬＨ／ｈＣＧ受容体を発現するＭＬＴＣ−１株（マウスライディッヒ腫瘍細胞株ＭＬＴＣ−１（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−２０６５））を適切な細胞密度で蒔き、そして、培養第１日にＬＨ／ｈＣＧ変異体をその細胞株に曝露した。この曝露に応答して、ステロイド産生経路が細胞において活性化され、プロゲステロン及びテストステロンが産生及び分泌された。
細胞をＲＰＭＩ培地に培養し、試験のために８００００細胞／ｍｌ又は８０００細胞／ウェルの濃度で蒔いた。
細胞培養
第０日：ＭＬＴＣ細胞の播種
第１日、０時間：
実験構成に応じた曝露
第１日、４時間：
プロゲステロン及び／又はテストステロンの定量のための使用済み培地の回収
二つ組のウェルの使用済み培地をまとめ、−２０℃で保存する。
第２日、２４時間：
プロゲステロン及び／又はテストステロンの定量のための使用済み培地の回収
二つ組のウェルの使用済み培地をまとめ、−２０℃で保存する。
使用済み培地におけるステロイドの定量
ステロイドホルモンのレベルを、Meso Scale Discovery社のMulti-Spot Assay Systemを使用して測定した。
使用済み培地をMULTI-SPOT９６ウェルヒトプロゲステロンプレート又はテストステロンプレートに添加する。
１． ウェル当たり２５μＬの検出試薬（希釈したSULFO-TAGプロゲステロンを含有するDiluent 22の溶液）を添加する。
２． ウェル当たり２５μＬの校正試料又は試料を添加し、振盪しながら室温で１時間保温する。
３． Read Bufferの添加後直ちにプレートを測定することができるようにSECTOR（登録商標）計測器を準備する。
４． プレートをＰＢＳで３回洗浄する。
５． ウェル当たり１５０μＬの１倍濃度のRead Buffer Tを添加する。気泡ができないようにする。電動マルチピペッターを中程度の速度設定で使用することを推奨する。
６． SECTOR計測器でプレートを測定する。
全ての緩衝液及び標準物質は供給会社により提供される。
全ての化合物について、Graphpad Software社のPrismソフトウェアを使用し、ＥＣ５０を計算する。一定の傾き並びに／又は最大値及び最小値を使用して、又は使用せずに、非線形回帰を用いてグラフをあてはめる。
実施例５の化合物並びに実施例６及び実施例７の生成物に対して前記の方法を適用した。結果が図１９ａ〜ｄに示されている。
ＬＨ／ｈＣＧ変異体のインビボ効力
本研究の目的は、ＬＨアッセイにおけるｈＣＧ／ＬＨ試験物質のＨＣＧ刺激活性に関してその物質の効力を決定することであった。未熟な雄ラットの貯精嚢の成長促進に対する効果を評価した。様々な投与計画、例えば毎日の投薬、１日おきの投薬、又は第１日、第２日、第３日若しくは第４日での投薬が用いられた。実施例５で作製されたＬＨ化合物並びに実施例６及び実施例７で作製された生成物を基準物質であるOvitrelleと比較した。結果は、４日にわたるOvitrelle及び様々なレベルのＬＨ化合物の投薬後の貯精嚢の重量として表された。
基準物質と試験物質の両方を毎日ＰＢＳアルブミン緩衝液（０．１％アルブミン）中に再構成し、そして、投与前に濃度を調節した。投与は、０．２ｍｌ／ラットの割合で頸部への皮下投与であった。
到着時に２１〜２３日齢の雄SPF Wistarラットを使用した。用量投与の第１日に１０ｇ以下の体重範囲内にあるラットが研究に使用された。第５日、最後の投薬から２４時間で、過剰なＣＯ２／Ｏ２麻酔によりラットを安楽死させた。
貯精嚢を取り出し、トリミングして、そして、水分を吸い取って乾燥させた。貯精嚢の重量を決定し、記録した。
前記の方法を実施例５の化合物並びに実施例６及び実施例７の生成物に適用した。結果が図２０ａ〜ｊに示されている。
ラット血清中のｈＣＧ含量の測定
ＬＨ含有生成物に曝露されたラットから採取された血清をドイツ、インゲルハイム、55218、Konrad-Adenauer-Str. 17にあるBioscientia GmbH, Institut fur Medizinische Diagnostik GmbHに、ADVIA Centaur Total hCG (ThCG)アッセイを用いる分析のために送付した。
ADVIA Centaur Total hCG (ThCG)アッセイは直接化学発光技術を使用する２部位サンドイッチ免疫アッセイであり、その免疫アッセイは一定量の２つの抗体を使用する。Lite Reagent中の第１抗体は、親和性精製され、アクリジニウムエステルで標識されているポリクローナルヤギ抗ｈＣＧ抗体である。Solid Phase中の第２抗体は精製モノクローナルマウス抗ｈＣＧ抗体であり、その抗体は常磁性粒子に共有結合している。これらの２つの抗体は遊離βサブユニット及び完全なｈＣＧのβサブユニットの両方に存在する異なるエピトープに特異的である。
前記のシステムは次の操作を機械的に実行する。
・５０μＬの試料をキュベットに分注する。
・１００μＬの Lite Reagent と４５０μＬの Solid Phaseを分注し、３７℃で７．５分間保温する。
・液体を分離し、吸引し、そして、キュベットを試薬水３で洗浄する。
・Acid ReagentとBase Reagentを３００μＬずつ分注して化学発光反応を開始する。
・システム操作説明書又はオンライン・ヘルプ・システムに記載されるように、選択された選択肢に応じて結果を報告する。
血清試料中に存在するｈＣＧの量とシステムによって検出される相対的発光単位（ＲＬＵ）の量の間には直接的な関係が存在する。
各ｈＣＧ含有生成物の希釈曲線を得られたデータの校正のために使用した。
ラット血清中のＬＨ様免疫反応性の量の測定
ＬＨ含有生成物に曝露されたラットから採取された血清をドイツ、インゲルハイム、55218、Konrad-Adenauer-Str. 17にあるBioscientia GmbH, Institut fur Medizinische Diagnostik GmbHに、Cobas（登録商標）黄体形成ホルモンECLIA (Elecsys)アッセイを用いる分析のために送付した。
Elecsys ＬＨアッセイはヒトＬＨを特異的に対象とする２つのモノクローナル抗体を用いる。使用される２つの特異的な抗体は特定の立体構造を認識し、エピトープを検出するビオチン化抗体は両方のサブユニットから構築されており、一方、ルテニウム複合物標識を有する抗体がβサブユニットに由来するエピトープを検出する。結果として、Elecsys ＬＨアッセイはＦＳＨ、ＴＳＨ、ｈＣＧ、ｈＧＨ、及びｈＰＬとの無視できるほどの交差反応性を示す。
試験原理
・第１保温：２０μＬの試料、ビオチン化モノクローナルＬＨ特異的抗体、及びルテニウム複合物で標識されたモノクローナルＬＨ特異的抗体がサンドイッチ複合体を形成する。
・第２保温：ストレプトアビジン被覆微粒子の添加後、その複合体がビオチンとストレプトアビジンの相互作用を介して固相に結合する。
・反応混合物を測定用セルに吸引し、そこで微粒子が磁力により電極の表面に捕捉される。次に、ProCell/ProCell Mを使用して結合しなかった物質を取り除く。次に電極への電圧の印加により化学発光が誘導され、その発光が光電子増幅管により測定される。
・２点校正により機器特異的に作製される校正曲線、及び試薬バーコードにより提供されるマスターカーブにより結果が決定される。
各ＬＨ含有生成物の希釈曲線を得られたデータの校正のために使用した。
下垂体を切除した雄WistarラットにおけるＰＫデータ
下垂体を切除した雄WistarラットにおいてＬＨ化合物の薬物動態プロファイルを測定した。
様々な投与量のＬＨ化合物を０時間の時点で皮下投与した。様々な時点でラットから血液を採取した。各ラットからの最初の４つの血液試料は１９ゲージの使い捨ての針を使用して、舌下出血により採取された。５番目で最後の血液試料は麻酔をして採取した。
血清は次の指示に従って調製された。
凝固促進剤を有するＳＳＴチューブ（Sarstedt社参照番号41.1500.005）に血液試料を採取した。その試料を５回転倒混合し、次にその試料を外界温度で３０分間凝固させた。凝固後直ちにその試料を２０℃、２５００Ｇで１０分間遠心分離した。血清を２本の保存用バイアルに、それぞれのバイアルに５０μｌずつ分割した。そのバイアルのうちの１本に３００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡを添加する。
遠心分離後６０分以内に血清試料を−１５℃以下で凍結した。
ｈＣＧ含有化合物について実施例１０に記載されるように、及びＬＨ含有化合物について実施例１１に記載されるようにＬＨ化合物の血清ラベルを測定した。前記の方法を実施例５の化合物並びに実施例６及び実施例７の生成物に適用した。結果は図２１ａ〜ｄ及び図２２ａ〜ｈに示されている。
正常な成体雄ラットにおけるＰＫデータ
正常なSprague Dawley雄ラットにおいてＬＨ化合物の薬物動態プロファイルを測定した。
様々な投与量のＬＨ化合物を０時間の時点で皮下投与した。様々な時点でラットから血液を採取した。各ラットからの最初の４つの血液試料は１９ゲージの使い捨ての針を使用して、舌下出血により採取された。５番目で最後の血液試料は麻酔をして採取した。
血清は次の指示に従って調製された。
凝固促進剤を有するＳＳＴチューブ（Sarstedt社参照番号41.1500.005）に血液試料を採取した。その試料を５回転倒混合し、次にその試料を外界温度で３０分間凝固させた。凝固後直ちにその試料を２０℃、２５００Ｇで１０分間遠心分離した。血清を２本の保存用バイアルに、それぞれのバイアルに１００μｌずつ分割した。そのバイアルのうちの１本に２５０μｌのＰＢＳ／ＢＳＡを添加した。
遠心分離後６０分以内に血清試料を−１５℃以下で凍結した。
ｈＣＧ含有化合物について実施例１０に記載されるように、及びＬＨ含有化合物について実施例１１に記載されるようにＬＨ化合物の血清レベルを測定した。前記の方法を実施例５の化合物及び実施例６の生成物に適用した。結果は図２３ａ〜ｄに示されている。
卵胞期後期にＦＳＨの代わりに投与されたｈＣＧと毎日の低用量のｒ−ｈＣＧ又はｒ−ＬＨの注射として実施された黄体期補助の、黄体期プロゲステロン投与を追加した標準的なＧｎＲＨアンタゴニスト法と比べた比較。
背景
着床の機会と妊娠の成立を最適化する現行の黄体期補助の方法はあまり確定されていないということが次第に明らかになりつつある。また、現行の黄体期補助の実施計画が、最適な結果を保証するほど充分なプロゲステロン濃度を全ての患者においてもたらすようには見えない。さらに、ほとんど一般的に使用される黄体期補助生成物の投与方法は、患者コンプライアンスと患者の承諾を低下させる多数の副次的影響を有する。
本試験の目的は、卵胞期後期にＦＳＨによる刺激の代わりに低用量のｈＣＧ（すなわち、１５０〜２００ＩＵ／日）の卵胞期投与を組合せ、一方、ＧｎＲＨアゴニスト注射を排卵誘発のために使用することにより黄体期プロゲステロン投与が必要とされない新しい刺激法の開発が可能であるかどうか決定することである。排卵誘発のためのＧｎＲＨアゴニストの使用は下垂体でのゴナドトロピンの産出を低下させ、黄体機能が不充分になることが知られている。しかしながら、同時に卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）のリスクは無視できるほどのレベル近くまで低下する。妊娠の成立を支持する、並びにＯＨＳＳのリスクを低レベルで保持する適切な黄体期を確保するために、本試験は、採卵日から毎日ｒ−ｈＣＧ（１２５ＩＵ／日）又はｒ−ＬＨ（すなわち、３００ＩＵ／日）のどちらかの注射を投与して黄体機能を刺激し、ＧｎＲＨアゴニストによる排卵誘発との関連で外来性のプロゲステロンを投与することなくプロゲステロンの内在性産生を増加させる。
材料と方法
ランダム化臨床試験において医療機関あたり総勢で９０人の女性を含む、２つの医療機関のそれぞれで１つの試験、合わせて２つの試験を行うことが計画される。
試験対象選択基準
１． ２５歳と４０歳の間の女性
２． ＦＳＨとＬＨのベースラインが１２ＩＵ／ｌ未満
３． 月経周期の長さが２５日から３４日の間
４． 肥満度（ＢＭＩ）が１８と３０の間
５． 両方の卵巣が存在し、子宮に異常を有しない
試験対象除外基準
１． 卵巣が１つだけ存在する
２． 子宮に異常を有する
３． 多嚢胞性卵巣症候群を有する
４． 医師により、代謝病を含む、糖尿病、てんかん、レバー病、腎臓病、心臓病と判断されている
５． 投与に用いられる薬品に存在するあらゆる物質に対するアレルギーを有する
６． 以前に本試験に参加している
ホルモン治療
処置群Ｉ：第２周日より組換えＦＳＨ（ｒ−ｈＦＳＨ；Gonal-F、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を最初の４日間に一定の用量で投与する。その用量は、年齢、ＢＭＩ、基礎ＦＳＨ値、胞状卵胞の数、及び卵巣の体積に応じて、１５０ＩＵ／日か２２５ＩＵ／日である。４日後に、卵巣の応答に応じて用量を調節することができる。
少なくとも４つの卵胞が１２ｍｍの直径に達したときに、毎日のＦＳＨの用量（その量とは無関係に最初は特定の用量を使用した）を毎日の２００ＩＵのｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）に換える。希釈については下の指示を参照のこと。成熟前のＬＨの上昇を防ぐため、固定ＧｎＲＨアンタゴニスト法が用いられ、刺激第５日の午前中にその方法が始まる。この日に、０．２５ｍｇ／日のＧｎＲＨアンタゴニスト（Cetrotide、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を毎日皮下投与し、排卵誘発日を含むその日までこれを続ける。３つ以上の卵胞が１７ｍｍの直径に達したときに０．５ｍｇの皮下投与用ブセレリン（Suprefact；Sanofi-Aventis社、デンマーク、ホルスホルム）などのＧｎＲＨアゴニストの１回のボーラス投与により全ての患者において排卵を誘導し、３４時間後に採卵（ＯＰＵ）が続く。ＯＰＵとの関連で、ブセレリン注射後約３５時間で、黄体期補助及び内在性プロゲステロン産生の促進のために１２５ＩＵのｒ−ｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）（希釈については下の指示を参照のこと）の毎日の投与を開始する。ｒ−ｈＣＧの投与を妊娠検査が行われるまで続ける。外来性のプロゲステロンを投与しない。
処置群ＩＩ：第２周日より組換えＦＳＨ（ｒ−ｈＦＳＨ；Gonal-F、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を２２５ＩＵという一定の用量で毎日投与する。やはり第２周日より１５０ＩＵという一定の用量のｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を毎日投与する。希釈については下の指示を参照のこと。成熟前のＬＨの上昇を防ぐため、固定ＧｎＲＨアンタゴニスト法が用いられ、刺激第５日の午前中にその方法が始まる。この日に、０．２５ｍｇ／日のＧｎＲＨアンタゴニスト（Cetrotide、Merck--Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を毎日皮下投与し、排卵誘発日を含むその日までこれを続ける。
少なくとも４つの卵胞が１２〜１３ｍｍの直径に達したときに毎日のＦＳＨの投薬を中断し、ｈＣＧの投薬を排卵誘発まで毎日１５０ＩＵの用量で続ける。
３つ以上の卵胞が１７ｍｍの直径に達したときに０．５ｍｇの皮下投与用ブセレリン（Suprefact；Sanofi-Aventis社、デンマーク、ホルスホルム）というＧｎＲＨアンタゴニストの１回のボーラス投与により全ての患者において排卵を誘導し、３４時間後に採卵（ＯＰＵ）が続く。ＯＰＵとの関連で、ブセレリン注射後約３５時間で、黄体期補助及び内在性プロゲステロン産生の促進のために１２５ＩＵのｒ−ｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）（希釈については下の指示を参照のこと）の毎日の投与を開始する。ｒ−ｈＣＧの投与を妊娠検査が行われるまで続ける。外来性のプロゲステロンを投与しない。
処置群ＩＩＩ：第２周日より組換えＦＳＨ（ｒ−ｈＦＳＨ；Gonal-F、Merck--Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を最初の４日間に一定の用量で投与する。その用量は、年齢、ＢＭＩ、基礎ＦＳＨ値、胞状卵胞の数、及び卵巣の体積に応じて、１５０ＩＵ／日か２２５ＩＵ／日である。４日後に、卵巣の応答に応じて用量を調節することができる。成熟前のＬＨの上昇を防ぐため、固定ＧｎＲＨアンタゴニスト法が用いられ、刺激第５日の午前中にその方法が始まる。この日に、０．２５ｍｇ／日のＧｎＲＨアンタゴニスト（Cetrotide、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を毎日皮下投与し、排卵誘発日を含むその日までこれを続ける。３つ以上の卵胞が１７ｍｍの直径に達したときに０．５ｍｇの皮下投与用ブセレリン（Suprefact；Sanofi-Aventis社、デンマーク、ホルスホルム）の１回のボーラス投与により全ての患者において排卵を誘導し、３４時間後に採卵（ＯＰＵ）が続く。ＯＰＵとの関連で、ブセレリン注射後約３５時間で、黄体期補助及び内在性プロゲステロン産生の促進のために３００ＩＵのｒ−ＬＨ（ｒ−ＬＨ、Luveris、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）の毎日の投与を開始する。ｒ−ＬＨの投与を妊娠検査が行われるまで続ける。外来性のプロゲステロンを投与しない。
対照群：第２周日より組換えＦＳＨ（ｒ−ｈＦＳＨ；Gonal-F、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を最初の４日間に一定の用量で投与する。その用量は、年齢、ＢＭＩ、基礎ＦＳＨ値、胞状卵胞の数、及び卵巣の体積に応じて、１５０ＩＵ／日か２２５ＩＵ／日である。４日後に、卵巣の応答に応じて用量を調節することができる。成熟前のＬＨの上昇を防ぐため、固定ＧｎＲＨアンタゴニスト法が用いられ、刺激第５日の午前中にその方法が始まる。この日に、０．２５ｍｇ／日のＧｎＲＨアンタゴニスト（Cetrotide、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を毎日皮下投与し、排卵誘発日を含むその日までこれを続ける。３つ以上の卵胞が１７ｍｍの直径に達したときに２５０μｇのｒ−ｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）の１回のボーラス投与により全ての患者において排卵を誘導し、３４〜３５時間後に採卵（ＯＰＵ）が続く。黄体期補助のため、毎日、９０ｍｇ／日の微粒子化プロゲステロン（Crinone；Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）の膣内投与、及び、４ｍｇ／日のエストラジオール（Estrofem；Novo Nordisk社、デンマーク、コペンハーゲン）の経口投与をＯＰＵ後の日に開始し、妊娠検査の日まで続ける。
全ての群について：臨床検査手法は参加医療機関の通常の手法に従い、ランダム化に無関係である。採取後２日目に２つの胚の混合物を移植する。受精率、卵割速度を含む全ての臨床検査パラメータをモニターする。生化学的妊娠は、胚移植（ＥＴ）後１２日目での血漿中β−ｈＣＧ濃度が１０ＩＵ／ｌ以上であることにより定義される。臨床的妊娠は、陽性のｈＣＧ試験から３週間後に心臓の鼓動を有する子宮内の胎嚢として定義される。
ランダム化
参加患者は刺激第１日に４群のうちの１つに無作為に選択される。
血液試料及びホルモン測定
血液試料を（１）排卵誘発日に、（２）ＯＰＵの日に、（３）ＯＰＵから７日の日に、及び（４）ＯＰＵから１４日目に採取する。後のＬＨ、プロゲステロン及びｈＣＧの分析のために血清アリコット（２つの同じアンプルに試料を分割する）を−２０℃で凍結保存する。それらのホルモンを、それぞれの参加臨床機関の組織内の測定法を用いて測定する。
結果判定法
黄体期中期のプロゲステロンレベルが一次的な結果である。二次的な結果判定法には進行中の妊娠の割合、早期妊娠損失の割合、及びＯＨＳＳの割合が含まれる。
刺激用のｒ−ｈＣＧの希釈
１本のアンプルのｒ−ｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）は、約６，５００ＩＵに相当する２５０μｇのｒ−ｈＣＧを含有する。注射針付きの２ｍｌの無菌注射筒を使用し、ゴム栓に突き刺して、１０ｍｌの無菌生理食塩水を含む瓶から１ｍｌの液体をくみ出すものとする。その後、その瓶の中の残りの９ｍｌの生理食塩水にアンプルの内容物を注入するものとする。この時点でｈＣＧの濃度はその瓶の中で６５０ＩＵ／ｍｌになる。２００ＩＵのｈＣＧで患者に刺激を与えるために、瓶から０．３ｍｌ（又は、正確には１９５ＩＵ）を１ｍｌの無菌注射筒により再度くみ取り、注射するものとする。
総計で１２５ＩＵのｈＣＧを取り出すために瓶から０．１９ｍｌを１ｍｌの無菌注射筒により再度くみ取り、注射するものとする。
総計で１５０ＩＵのｈＣＧを取り出すために瓶から０．２３ｍｌを１ｍｌの無菌注射筒により再度くみ取り、注射するものとする。
刺激用のｒ−ｈＣＧは、毎日新しいものを調製するものとする。
参加者及び臨床活性
２つの不妊治療院が本試験に参加する。一方の不妊治療院は、総勢で９０人の患者（３０人の患者からなる群が３つ）を含む、処置群Ｉ及び処置群ＩＩ及び対照群を含んでなる試験を引き受ける。他方の不妊治療院は、総勢で９０人の患者（３０人の患者からなる群が３つ）を含む、処置群Ｉ、処置群ＩＩＩ及び対照群を含んでなる試験を引き受ける。
卵胞期後期にＦＳＨの代わりに投与されたｈＣＧと毎日の低用量のｒ−ｈＣＧ又はｒ−ＬＨの注射として実施された黄体期補助を、黄体期プロゲステロン投与を追加した標準的なＧｎＲＨアンタゴニスト法と比較した。そうして、本特許出願に記載されるようなＳ−ｈＣＧの効果を例示するために野生型ｈＣＧが小用量で毎日投与された。
背景
着床の機会と妊娠の成立を最適化する現行の黄体期補助の方法はあまり確定されていないということが次第に明らかになっている。また、現行の黄体期補助の実施計画が最適な結果を保証するほど充分なプロゲステロン濃度を全ての患者においてもたらすようには見えない。さらに、ほとんど一般的に使用される黄体期補助生成物の投与方法は、患者コンプライアンスと患者の承諾を低下させる多数の副次的影響を有する。
本試験の目的は、卵胞期後期にＦＳＨによる刺激の代わりに低用量のｈＣＧ（すなわち、１５０〜２００ＩＵ／日）の卵胞期投与を組合せ、一方、ＧｎＲＨアゴニスト注射を排卵誘発のために使用することにより黄体期プロゲステロン投与が必要とされない新しい刺激法の開発が可能であるか決定することであった。排卵誘発のためのＧｎＲＨアゴニストの使用は下垂体でのゴナドトロピンの産出を低下させ、黄体機能が不充分になることが知られている。しかしながら、同時に卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）のリスクは無視できるほどのレベル近くまで低下する。妊娠の成立を支持する、並びにＯＨＳＳのリスクを低レベルで保持する適切な黄体期を確保するために、採卵日から毎日ｒ−ｈＣＧ（１２５ＩＵ／日）又はｒ−ＬＨ（すなわち、３００ＩＵ／日）のどちらかの注射を本試験の患者に投与して黄体機能を刺激し、ＧｎＲＨアゴニストによる排卵誘発との関連で外来性のプロゲステロンを投与することなくプロゲステロンの内在性産生を増加させた。
材料と方法
この有望なランダム化試験に総勢で３２人の女性が含まれた。その試験は下で詳細が述べられる。
試験対象選択基準
１． ２５歳と４０歳の間の女性
２． ＦＳＨとＬＨのベースラインが１２ＩＵ／ｌ未満
３． 月経周期の長さが２５日から３４日の間
４． 肥満度（ＢＭＩ）が１８と３０の間
５． 両方の卵巣が存在し、子宮に異常を有しない
試験対象除外基準
１． 卵巣が１つだけ存在する
２． 子宮に異常を有する
３． 多嚢胞性卵巣症候群を有する
４． 医師により、代謝病を含む、糖尿病、てんかん、肝臓病、腎臓病、心臓病と判断されている
５． 投与に用いられる薬品に存在するあらゆる物質に対するアレルギーを有する
６． 以前に本試験に参加している
ホルモン治療
処置群Ｉ：第２周日より組換えＦＳＨ（ｒ−ｈＦＳＨ；Gonal-F、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を最初の４日間に一定の用量で投与した。その用量は、年齢、ＢＭＩ、基礎ＦＳＨ値、胞状卵胞の数、及び卵巣の体積に応じて、１５０ＩＵ／日か２２５ＩＵ／日であった。４日後に、卵巣の応答に応じて用量を調節した。
少なくとも４つの卵胞が１２ｍｍの直径に達したときに毎日のＦＳＨの用量（その量とは無関係に最初は特定の用量を使用した）を毎日の２００ＩＵのｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）に換えた。希釈については下の指示を参照のこと。成熟前のＬＨの上昇を防ぐため、固定ＧｎＲＨアンタゴニスト法が用いられ、刺激第５日の午前中にその方法が始まった。この日に、０．２５ｍｇのＧｎＲＨアンタゴニスト（Cetrotide、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を毎日皮下投与し、排卵誘発日を含むその日までこれを続けた。３つ以上の卵胞が１７ｍｍの直径に達したときに０．５ｍｇの皮下投与用ブセレリン（Suprefact；Sanofi-Aventis,デンマーク、ホルスホルム）などのＧｎＲＨアゴニストの１回のボーラス投与により全ての患者において排卵を誘導し、３４時間後に採卵（ＯＰＵ）が続いた。ＯＰＵとの関連で、ブセレリン注射後約３５時間で、黄体期補助及び内在性プロゲステロン産生の促進のために１２５ＩＵのｒ−ｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）（希釈については下の指示を参照のこと）の毎日の投与を開始した。ｒ−ｈＣＧの投与を妊娠検査が行われるまで続けた。外来性のプロゲステロンを投与しなかった。
処置群ＩＩ：第２周日より組換えＦＳＨ（ｒ−ｈＦＳＨ；Gonal-F, Merck--Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を２２５ＩＵという一定の用量で毎日投与した。やはり第２周日より１５０ＩＵという一定の用量のｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を毎日投与した。希釈については下の指示を参照のこと。成熟前のＬＨの上昇を防ぐため、固定ＧｎＲＨアンタゴニスト法が用いられ、刺激第５日の午前中にその方法が始まった。この日に、０．２５ｍｇのＧｎＲＨアンタゴニスト（Cetrotide、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を毎日皮下投与し、排卵誘発日を含むその日までこれを続けた。
少なくとも４つの卵胞が１２〜１３ｍｍの直径に達したときに毎日のＦＳＨの投薬を中断し、ｈＣＧの投薬を排卵誘発まで毎日１５０ＩＵの用量で続けた。
３つ以上の卵胞が１７ｍｍの直径に達したときに０．５ｍｇの皮下投与用ブセレリン（Suprefact；Sanofi-Aventis社、デンマーク、ホルスホルム）というＧｎＲＨアンタゴニストの１回のボーラス投与により全ての患者において排卵を誘導し、３４時間後に採卵（ＯＰＵ）が続いた。ＯＰＵとの関連で、ブセレリン注射後約３５時間で、黄体期補助及び内在性プロゲステロン産生の促進のために１２５ＩＵのｒ−ｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）（希釈については下の指示を参照のこと）の毎日の投与を開始した。ｒ−ｈＣＧの投与を妊娠検査が行われるまで続けた。外来性のプロゲステロンを投与しなかった。
処置群ＩＩＩ：第２周日より組換えＦＳＨ（ｒ−ｈＦＳＨ；Gonal-F, Merck--Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を最初の４日間に一定の用量で投与した。その用量は、年齢、ＢＭＩ、基礎ＦＳＨ値、胞状卵胞の数、及び卵巣の体積に応じて、１５０ＩＵ／日か２２５ＩＵ／日であった。４日後に、卵巣の応答に応じて用量を調節した。成熟前のＬＨの上昇を防ぐため、固定ＧｎＲＨアンタゴニスト法が用いられ、刺激第５日の午前中にその方法が始まった。この日に、０．２５ｍｇのＧｎＲＨアンタゴニスト（Cetrotide、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を毎日皮下投与し、排卵誘発日を含むその日までこれを続けた。３つ以上の卵胞が１７ｍｍの直径に達したときに０．５ｍｇの皮下投与用ブセレリン（Suprefact；Sanofi-Aventis社、デンマーク、ホルスホルム）の１回のボーラス投与により全ての患者において排卵を誘導し、３４時間後に採卵（ＯＰＵ）が続いた。ＯＰＵとの関連で、ブセレリン注射後約３５時間で、黄体期補助及び内在性プロゲステロン産生の促進のために３００ＩＵのｒ−ＬＨ（ｒ−ＬＨ、Luveris、Merck--Serono社、デンマーク、ヘレルプ）の毎日の投与を開始した。ｒ−ＬＨの投与を妊娠検査が行われるまで続けた。外来性のプロゲステロンを投与しなかった。
対照群（処置群４）：第２周日より組換えＦＳＨ（ｒ−ｈＦＳＨ；Gonal-F、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を最初の４日間に一定の用量で投与した。その用量は、年齢、ＢＭＩ、基礎ＦＳＨ値、胞状卵胞の数、及び卵巣の体積に応じて、１５０ＩＵ／日か２２５ＩＵ／日であった。４日後に、卵巣の応答に応じて用量を調節した。成熟前のＬＨの上昇を防ぐため、固定ＧｎＲＨアンタゴニスト法が用いられ、刺激第５日の午前中にその方法が始まった。この日に、０．２５ｍｇのＧｎＲＨアンタゴニスト（Cetrotide、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）を毎日皮下投与し、排卵誘発日を含むその日までこれを続けた。３つ以上の卵胞が１７ｍｍの直径に達したときに２５０μｇのｒ−ｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）の１回のボーラス投与により全ての患者において排卵を誘導し、３４〜３５時間後に採卵（ＯＰＵ）が続いた。黄体期補助のため、毎日、９０ｍｇ／日の微粒子化プロゲステロン（Crinone；Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）の膣内投与、及び、４ｍｇ／日のエストラジオール（Estrofem；Novo Nordisk社、デンマーク、コペンハーゲン）の経口投与をＯＰＵ後の日に開始し、妊娠検査の日まで続けた。
全ての群について：臨床検査手法は参加医療機関の通常の手法に従い、ランダム化に無関係であった。採取後２日目に２つの胚の混合物を移植した。受精率、卵割速度を含む全ての臨床検査パラメータをモニターした。生化学的妊娠は、胚移植（ＥＴ）後１２日目での血漿中β−ｈＣＧ濃度が１０ＩＵ／ｌ以上であることにより定義された。臨床的妊娠は、陽性のｈＣＧ試験から３週間後に心臓の鼓動を有する子宮内の胎嚢として定義された。
ランダム化
参加患者は刺激第１日に４群のうちの１つに無作為に選択された。
血液試料及びホルモン測定
血液試料を（１）排卵誘発日に、（２）ＯＰＵの日に、（３）ＯＰＵから７日の日に、及び（４）ＯＰＵから１４日目に採取した。後のＬＨ、プロゲステロン及びｈＣＧの分析のために血清アリコット（２つの同じアンプルに試料を分割した）を−２０℃で凍結保存した。それらのホルモンを、それぞれの参加臨床機関の組織内の測定法を用いて測定した。
結果判定法
黄体期中期のプロゲステロンレベルが一次的な結果であった。
刺激用のｒ−ｈＣＧの希釈
１本のアンプルのｒ−ｈＣＧ（ｒ−ｈＣＧ、Ovitrelle、Merck-Serono社、デンマーク、ヘレルプ）は、約６，５００ＩＵに相当する２５０μｇのｒ−ｈＣＧを含有する。注射針付きの２ｍｌの無菌注射筒を使用し、ゴム栓に突き刺して、１０ｍｌの無菌生理食塩水を含む瓶から１ｍｌの液体をくみ出した。その後、その瓶の中の残りの９ｍｌの生理食塩水にアンプルの内容物を注入した。この時点でｈＣＧの濃度はその瓶の中で６５０ＩＵ／ｍｌになった。２００ＩＵのｈＣＧで患者に刺激を与えるために、瓶から０．３ｍｌ（又は、正確には１９５ＩＵ）を１ｍｌの無菌注射筒により再度くみ取り、注射した。
総計で１２５ＩＵのｈＣＧを取り出すために瓶から０．１９ｍｌを１ｍｌの無菌注射筒により再度くみ取り、注射した。
総計で１５０ＩＵのｈＣＧを取り出すために瓶から０．２３ｍｌを１ｍｌの無菌注射筒により再度くみ取り、注射した。
刺激用のｒ−ｈＣＧは、毎日新しいものを調製した。
結果
提案された卵胞期と黄体期におけるｒｈＣＧの投与連隊、及び提案された黄体期におけるｒｈＬＨによるプロゲステロン産生促進のための投与計画は、黄体期中期でのプロゲステロン産生に顕著なプラスの効果を示すことがデータにより明らかに示されている。
薬理学的方法
長期作用性ＬＨ化合物、例えばヒトアルブミン結合ｈＣＧ（ＳＵＳ−ｈＣＧ）の生物作用能の決定法
ＳＵＳ−ｈＣＧの生物作用能は２つの確立されたインビボアッセイのうちの１つを用いて決定される。薬局方及び規制当局は、貯精嚢の重量増加を測定してＬＨ含有ゴナドトロピン生成物のＬＨ生物活性を決定するVan Hellバイオアッセイ(Van Hell et al., Acta Endocrin. 47: 409 (1964) )を要求する。外来性ＬＨ処置に反応した卵巣におけるアスコルビン酸の減少を測定する卵巣アスコルビン酸欠乏試験が擬似妊娠ラットの役に立った (Parlow AF: Bioassay of pituitary luteinizing hormone by depletion of ovarian ascorbic acid. In Human Pituitary Gonadotropins Edited by: Albert A. Springfield; CC Thomas; 1961:300--320）。この後者のアッセイは、最初に述べた薬局方に記述されるアッセイと比較してほぼ一桁感度が高い、より高い感度をＬＨ生物活性の検出に対して示す。
また、ＳＵＳ−ｈＣＧのインビトロ生物活性は、Ascoli, Endocrinology 108: 88 (1981)に開示されるＭＡ１０ライディッヒ細胞バイオアッセイなどの標準的な細胞アッセイ、又は、ＬＨにより誘導されるマウスライディッヒ細胞によるインビトロでのテストステロンの増加がＲＩＡアッセイなどの標準的な免疫学的技術により測定されるマウスライディッヒ細胞アッセイ（Van Damme et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 1974:77;655）を用いて決定される。
全てのアッセイについて、ＳＵＳ−ｈＣＧの生物活性は組換えｈＣＧ及びヒト尿由来ｈＣＧに対して、及び国立生物標準・管理研究所（The National Institute of Biological Standards and Controls）（NIBSC、英国、ハートフォードシャー）の適切な標準品を使用することにより比較される。
所与の組成物中のｈＣＧタンパク質の量はＥＬＩＳＡ測定法又はＲＩＡ測定法などの標準的な免疫学的技術を用いて決定され、ウエスタンブロッティング及びブラッドフォード法やローリー法を用いる総タンパク質含量の測定により特徴解析される。
ＦＳＨと組み合わせた長期作用性改変ＬＨ（Ｓ−ＬＨ）、例えばアシル化基、ＰＥＧ又はヒトアルブミンに結合しているｈＬＨの生物作用能の決定法
Ｓ−ＬＨの生物作用能は２つの確立されたインビボアッセイのうちの１つを用いて決定される。薬局方及び規制当局は、貯精嚢の重量増加を測定してＬＨ含有ゴナドトロピン生成物のＬＨ生物活性を決定するVan Hellバイオアッセイ（Van Hell 30 et al., Acta Endocrin. 47: 409 (1964)）を要求する。外来性ＬＨ処置に反応した卵巣におけるアスコルビン酸の減少を測定する卵巣アスコルビン酸欠乏試験が擬似妊娠ラットの役に立った (Parlow 32 AF: Bioassay of pituitary luteinizing hormone by depletion of ovarian ascorbic acid. In Human Pituitary Gonadotropins Edited by: Albert A. Springfield; CC Thomas; 1961:300--320）。この後者のアッセイは、最初に述べた薬局方に記述されるアッセイと比較してほぼ一桁感度が高い、より高い感度をＬＨ生物活性の検出に対して示す。
また、Ｓ−ＬＨのインビトロ生物活性は、Ascoli, Endocrinology 108: 88 (1981)に開示されるＭＡ１０ライディッヒ細胞バイオアッセイなどの標準的な細胞アッセイ、又は、ＬＨにより誘導されるマウスライディッヒ細胞によるインビトロでのテストステロンの増加がＲＩＡアッセイなどの標準的な免疫学的技術により測定されるマウスライディッヒ細胞アッセイ（Van Damme et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 1974:77;655）を用いて決定される。
全てのアッセイについて、Ｓ−ＬＨの生物活性は組換えｈＣＧ、組換えＬＨ及びヒト尿由来ｈＣＧに対して、及び国立生物標準・管理研究所（The National Institute of Biological Standards and Controls）（NIBSC、英国、ハートフォードシャー）の適切な標準品を使用することにより比較される。
所与の組成物におけるＬＨタンパク質の量はＥＬＩＳＡ測定法又はＲＩＡ測定法などの標準的な免疫学的技術を用いて決定され、ウエスタンブロッティング及びブラッドフォード法やローリー法を用いる総タンパク質含量の測定により特徴解析される。
複数の卵胞発生及び胚発生をインビボで持続させる、ＦＳＨと組み合わせたＳ−ＬＨの作用が、天然のＬＨホルモン及びｈＣＧホルモンと比べてYding Andersen C et al., Requirements for human chorinonic gonadotropin and recombinant human luteinizing hormone for follicular development and maturation. J. Assist. Reprod. Gen., 1999, 16, 536-541に記載されるように、マウスにおいて実施される。一定の用量のＦＳＨ及び様々な量のＬＨ／ｈＣＧ活性を組み合わせてマウスを刺激して複数の卵胞の発生を誘導する。そのマウスの排卵を誘導し、そして、雄と交尾させる。その後、そのマウスを殺処理し、卵管を回収し、その卵管に水を流して存在する胚盤胞の数を決定する。胚盤胞の数が半定量的にＬＨ成分の効力を表す。
ＦＳＨと組み合わせた長期作用性改変ＬＨ、例えばアシル化基、ＰＥＧ又はヒトアルブミンに結合しているｈＬＨの生物作用能の決定法
長期作用性ＬＨの生物作用能は２つの確立されたインビボアッセイのうちの１つを用いて決定され得る。薬局方及び規制当局は、貯精嚢の重量増加を測定してＬＨ含有ゴナドトロピン生成物のＬＨ生物活性を決定するVan Hellバイオアッセイ（Van Hell et al., Acta Endocrin. 47: 409 (1964)）を要求する。外来性ＬＨ処置に反応した卵巣におけるアスコルビン酸の減少を測定する卵巣アスコルビン酸欠乏試験が擬似妊娠ラットの役に立った (Parlow AF: Bioassay of pituitary luteinizing hormone by depletion of ovarian ascorbic acid. In Human Pituitary Gonadotropins Edited by: Albert A. Springfield; CC Thomas; 1961:300-320）。この後者のアッセイは、最初に述べた薬局方に記述されるアッセイと比較してほぼ一桁感度が高い、より高い感度をＬＨ生物活性の検出に対して示す。
また、長期作用性ＬＨのインビトロ生物活性は、Ascoli, Endocrinology 108: 88 (1981)に開示されるＭＡ１０ライディッヒ細胞バイオアッセイなどの標準的な細胞アッセイ、又は、ＬＨにより誘導されるマウスライディッヒ細胞によるインビトロでのテストステロンの増加がＲＩＡアッセイなどの標準的な免疫学的技術により測定されるマウスライディッヒ細胞アッセイ（Van Damme et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 1974:77;655）を用いて決定される。
全てのアッセイについて、長期作用性ＬＨの生物活性は組換えｈＣＧ、組換えＬＨ及びヒト尿由来ｈＣＧに対して、及び国立生物標準・管理研究所（The National Institute of Biological Standards and Controls）（NIBSC、英国、ハートフォードシャー）の適切な標準品を使用することにより比較される。所与の組成物におけるＬＨタンパク質の量はＥＬＩＳＡ測定法又はＲＩＡ測定法などの標準的な免疫学的技術を用いて決定され、ウエスタンブロッティング及びブラッドフォード法やローリー法を用いる総タンパク質含量の測定により特徴解析される。
正常な雄ラット及び下垂体を切除した雄ラットにおけるＰＫ／ＰＤ複合試験のデータ
様々な投与量のＬＨ化合物を０時間の時点で皮下投与する。様々な時点でラットから血液を採取するが、最大で４週間まで少なくとも毎日採取する。各ラットからの最初の血液試料は１９ゲージの使い捨ての針を使用して、舌下出血により採取される。最後の血液試料は麻酔をして採取する。
基準物質と試験物質の両方を毎日ＰＢＳアルブミン緩衝液（０．１％アルブミン）中に再構成し、そして、投与前に濃度を調節する。投与は、０．２ｍｌ／ラットの割合で頸部への皮下投与であった。
下垂体を切除したラットでの試験について、９５〜１１０ｇの雄WistarラットをTaconic-M&B社より購入し、経耳的手法を用いて下垂体を切除する。正常なラットでの試験について、約２５０ｇの体重の雄Sprague Dawleyラットを使用する。
血清は次の指示に従って調製される。
凝固促進剤を有するＳＳＴチューブ（Sarstedt社参照番号41.1500.005）に血液試料を採取する。その試料を５回転倒混合し、次にその試料を外界温度で３０分間凝固させる。凝固後直ちにその試料を２０℃、２５００Ｇで１０分間遠心分離する。血清を２本の保存用バイアルに、それぞれのバイアルに５０μｌずつ分割する。そのバイアルのうちの１本に３００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡを添加する。
遠心分離後６０分以内に血清試料を−１５℃以下で凍結する。
ＬＨ化合物の血清レベルを実施例Ｘ及びＺに記載されるように測定する。テストステロンの血清レベルを実施例Ｙに記載されるように測定する。
最終日に過剰なＣＯ２／Ｏ２麻酔によりラットを安楽死させる。貯精嚢を取り出し、トリミングして、そして、水分を吸い取って乾燥させる。貯精嚢の重量を決定し、記録する。

Claims (128)

  1. 哺乳類新生児型Ｆｃ受容体、トランスフェリン及びｎが８〜２２であるＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ−に結合する分子並びに高分子から選択される医薬的に許容可能な分子に結合した哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体を含んでなる長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物。
  2. 前記の医薬的に許容可能な分子が哺乳類新生児型Ｆｃ受容体に結合する分子から選択される、請求項１に記載のＬＨ化合物。
  3. 前記の医薬的に許容可能な分子がアルブミン、哺乳類抗体のＦｃ断片及び哺乳類抗体のＦｃ断片の変異体から選択される、請求項１又は２に記載のＬＨ化合物。
  4. 前記の医薬的に許容可能な分子がヒトアルブミン、組換えヒトアルブミン、哺乳類ＦｃＲｎへの結合が増強した改変ヒトアルブミン、哺乳類ＦｃＲｎへの結合が増強した改変組換えアルブミンなどのアルブミンから選択される、請求項１〜３の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  5. 前記の医薬的に許容可能な分子が哺乳類抗体の組換えＦｃ断片などの哺乳類抗体のＦｃ断片から選択される、請求項１〜３の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  6. 前記の医薬的に許容可能な分子が哺乳類抗体のＦｃ断片の変異体から選択される、請求項１〜３の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  7. 前記アルブミンが組換えヒトアルブミン（配列番号２０）及びＫ５７３Ｐヒトアルブミン（配列番号２１）から選択される、請求項１〜６の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  8. 前記Ｆｃ断片が配列番号２２から選択される、請求項１〜６の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  9. 前記Ｆｃ断片の前記変異体が配列番号２２に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択され、配列番号２２を放棄する、請求項１〜６の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  10. 前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体が組換え哺乳類ＣＧ又はその類似体から選択される、請求項１〜９の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  11. 前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体が組換え哺乳類ＬＨ又はその類似体から選択される、請求項１〜９の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  12. 前記組換え哺乳類ＣＧ又はその類似体が霊長類のＣＧ、例えばヒトＣＧ、類人猿（abe）ＣＧ又はサルＣＧの配列、及びウマ科動物のＣＧ、例えばウマＣＧの配列から選択される、請求項１０に記載のＬＨ化合物。
  13. 前記組換え哺乳類ＬＨ又はその類似体が霊長類のＬＨ、例えばヒトＬＨ、類人猿（abe）ＬＨ又はサルＬＨの配列、ウシＬＨの配列、ブタＬＨの配列、ウマ科動物のＬＨ、例えばウマＬＨの配列、ヒツジＬＨの配列、イヌＬＨの配列、ネコＬＨの配列、及びヤギＬＨの配列から選択される、請求項１１に記載のＬＨ化合物。
  14. 前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体が、絨毛性ゴナドトロピン又は黄体形成ホルモンの対応する哺乳類配列に対してそれぞれ少なくとも８０％の同一性、例えば、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性を有する類似体から選択される、請求項１〜１３の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  15. 前記の医薬的に許容可能な分子がＰＥＧ、例えば、分子量が少なくとも５ｋＤａ、例えば、１０ｋＤａから１５０ｋＤａまで、通常１０〜４０ｋＤａであるＰＥＧから選択される、請求項１〜１４の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  16. 前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体が前記の医薬的に許容可能な分子に結合しており、そして、リンカーが化学リンカー、随意で二官能性リンカーから選択される、請求項１〜１５の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  17. 前記化学リンカーが糖部分、ジスルフィド架橋、親水性リンカー、加水分解性リンカー、ジカルボン酸、カルボン酸ヒドラジド、マレイミドヒドラジド、ＰＤＰＨ、ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＧＭＢＳ、アルキルリンカー、及びＰＥＧリンカーから選択される、請求項１６に記載のＬＨ化合物。
  18. 前記化学リンカーがコハク酸、グルタル酸、アジピン酸、Ｎ−［マレイミドカプロン酸］ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、Ｎ-−［マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＭＰＨ又はＢＭＰＨ）、４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−-１−カルボキシルヒドラジド、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨ）、４−（４−Ｎ−-マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、ＮＨＳ−３−マレイミドプロピオン酸スクシンイミドエステル（ＭＰＳ−ＥＤＡ）、スルフヒドリル反応性タンパク質に複合体化した（３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、２個から５個までの炭素原子を有するカルボン酸ヒドラジド、ｍが２から２０までの整数であり、あらゆる非立体障害基（non-sterically hindering group）、例えば、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ1〜Ｃ6アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ2、又はフェニルで随意に置換されている−ＮＨ−（ＣＨ２）m−Ｃ（Ｏ）−から選択される、請求項１７に記載のＬＨ化合物。
  19. 前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体が前記の医薬的に許容可能な分子に直接化学的に結合している、請求項１６に記載のＬＨ化合物。
  20. 前記の医薬的に許容可能な分子が前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は前記哺乳類ＬＨ若しくはその類似体のα鎖に結合している、請求項１６〜１９の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  21. 前記の医薬的に許容可能な分子が前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は前記哺乳類ＬＨ若しくはその類似体のβ鎖に結合している、請求項１６〜１９の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  22. 前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体が、哺乳類新生児型Ｆｃ受容体に、随意でペプチドリンカーを介して、結合する分子、例えば、アルブミン、哺乳類抗体のＦｃ断片、又は哺乳類抗体のＦｃ断片の変異体から選択される前記の医薬的に許容可能な分子に融合している、前記の請求項１〜１５の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  23. 前記ペプチドリンカーが少なくとも１アミノ酸、例えば１アミノ酸から２００アミノ酸まで、通常１〜５０アミノ酸を有し、前記アミノ酸が２０種の天然アミノ酸から選択される、請求項２２に記載のＬＨ化合物。
  24. 前記ペプチドリンカーが、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリシンから選択されるアミノ酸より構成されるリンカー、大部分が立体障害を持たないアミノ酸、例えばグリシン及びアラニンから構成されるリンカー、ｎが１から５０までの整数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である配列−（Ｇ）ｎ−、（ＧＧＳ）ｎ又は（ＧＧＧＧＳ）ｎを含んでなるリンカーから選択される、請求項２３に記載のＬＨ化合物。
  25. 前記ペプチドリンカーがＧＧＧ、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号５９）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号６０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５７）及びＥＦＡＧＡＡＡＶ（配列番号５６）から選択される、請求項２４に記載のＬＨ化合物。
  26. 前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体が前記の医薬的に許容可能な分子に直接融合している、請求項２２に記載のＬＨ化合物。
  27. 前記の医薬的に許容可能な分子が前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体のＮ末端又は前記哺乳類ＬＨ若しくはその類似体のＮ末端に融合している、請求項２２〜２６の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  28. 前記の医薬的に許容可能な分子が前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体のα鎖のＮ末端又は前記哺乳類ＬＨ若しくはその類似体のα鎖のＮ末端に融合している、請求項２７に記載のＬＨ化合物。
  29. 前記の医薬的に許容可能な分子が前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体のβ鎖のＮ末端又は前記哺乳類ＬＨ若しくはその類似体のβ鎖のＮ末端に融合している、請求項２７に記載のＬＨ化合物。
  30. 前記の医薬的に許容可能な分子が前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体のＣ末端又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体のＣ末端に融合している、請求項２２〜２６の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  31. 前記の医薬的に許容可能な分子が前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体のα鎖のＣ末端又は前記哺乳類ＬＨ若しくはその類似体のα鎖のＣ末端に融合している、請求項３０に記載のＬＨ化合物。
  32. 前記の医薬的に許容可能な分子が前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体のβ鎖のＣ末端又は前記哺乳類ＬＨ若しくはその類似体のβ鎖のＣ末端に融合している、請求項３０に記載のＬＨ化合物。
  33. 前記哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は前記哺乳類ＬＨ若しくはその類似体がグリコシル化される、請求項１〜３２の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  34. 哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体が１つの哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は１つの哺乳類ＬＨ若しくはその類似体から選択される、請求項１〜３３の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  35. 哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は哺乳類ＬＨ若しくはその類似体が２つの哺乳類ＣＧ若しくはその類似体又は２つの哺乳類ＬＨ若しくはその類似体から選択される、請求項１〜３４の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  36. 前記の医薬的に許容可能な分子が１つの医薬的に許容可能な分子から選択される、請求項１〜３５の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  37. 前記の医薬的に許容可能な分子が２つの医薬的に許容可能な分子から選択される、請求項１〜３６の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  38. 複合体１（ｈＣＧ−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ複合体）、複合体３（ｈＣＧ−ＳＰＤＰ−ｒＨＡ複合体）、複合体４（ＥＤＣ活性化ｈＣＧ−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ複合体） 複合体３Ｖ１（ｈＣＧ−ＳＰＤＰ−ｒＨＡ−Ｋ５７３Ｐ複合体）、複合体４Ｖ１（ＥＤＣ活性化ｈＣＧ−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−Ｋ５７３Ｐ複合体） 配列番号９及び配列番号２６からなる生成物２、配列番号１及び配列番号２８からなる生成物３、配列番号９及び配列番号２７からなる生成物４、配列番号１及び配列番号２９からなる生成物５、配列番号４及び配列番号２６からなる生成物７、配列番号１及び配列番号３０からなる生成物８、配列番号４及び配列番号２７からなる生成物９、配列番号１及び配列番号３１からなる生成物１０、配列番号３２及び配列番号３３からなる生成物１１、配列番号３２及び配列番号３４からなる生成物１２、配列番号３２及び配列番号６１からなる生成物１３、配列番号３２及び配列番号６２からなる生成物１４から選択される、請求項１に記載のＬＨ化合物。
  39. 請求項１〜３８の何れか一項に記載のＬＨ化合物を含んでなる医薬組成物。
  40. 注射、例えば皮下注射用の請求項３９に記載の医薬組成物。
  41. 哺乳類対象の生殖能力の促進、例えば生殖補助技術処置において使用される、請求項１〜４０の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  42. 雌哺乳類動物における生殖補助医療のための方法において使用され、卵胞発生を補助するのに充分な投薬量の一倍、二倍、三倍、又は四倍の投薬量で卵胞期の間に好ましくは一回のボーラス注射として投与される、前記の請求項１〜４０の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  43. 前記投薬量が黄体機能を補充するのにも充分である、請求項４２に記載のＬＨ化合物。
  44. 雌哺乳類動物における生殖補助医療のための方法において使用され、少なくとも排卵後２週間まで、一倍、二倍、三倍、又は四倍の投薬量で黄体期の間に好ましくは一回のボーラス注射として投与される、前記の請求項１〜４０の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  45. 雌哺乳類動物における生殖補助医療のための方法において使用され、少なくとも排卵後２週間まで、一倍、二倍、三倍、又は四倍の投薬量で妊娠期の間に好ましくは一回のボーラス注射として投与される、前記の請求項１〜４０の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  46. 雌哺乳類動物における不育症の治療のための方法において使用され、受胎後１２週間まで、一倍、二倍、三倍、又は四倍以上の投薬量で初期の妊娠期間の間に好ましくは一回のボーラス注射として投与される、前記の請求項１〜４０の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  47. プロゲステロンの産生を増強し、そして、妊娠が成功する機会を最適化するための方法において使用され、一倍、二倍、三倍、又は四倍以上の投薬量で妊娠の最初の１２週間の間に好ましくは一回のボーラス注射として投与される、前記の請求項１〜４０の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  48. 前記ＬＨ化合物が排卵後に初めて投与される、請求項４４〜４７の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  49. 雌哺乳類動物における生殖補助医療のための方法において使用され、排卵誘発との関連で一倍又は二倍の投薬量で好ましくは一回のボーラス注射として投与される、前記の請求項１〜４０の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  50. ＧｎＲＨアゴニストが排卵誘発のために使用される、請求項４２〜４９の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  51. ｈＣＧが排卵誘発のために使用される、請求項４２〜４９の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  52. 低ゴナドトロピン性で性機能低下性の雄哺乳類対象の生殖能力又は不稔性の治療の促進において使用される、前記の請求項１〜４０の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  53. 停留精巣を有する若い、又は青年期の雄哺乳類対象の生殖能力又は不稔性の治療の促進において使用される、前記の請求項１〜４０の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  54. 哺乳類新生児型Ｆｃ受容体、トランスフェリン及びｎが８〜２２であるＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ−に結合する分子並びに高分子から選択される医薬的に許容可能な分子に結合した哺乳類ＬＨ又はその類似体を含んでなる長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ＬＨ）化合物であって、ＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する分子と同時、断続的又は別々に併用して哺乳類雌対象の無排卵治療において卵胞発生、例えば少卵胞形成（paucifolliculogenesis）若しくは単一卵胞形成（unifolliculogenesis）を誘導する、又は哺乳類雌対象の月経周期の卵胞期においてＣＯＳを誘導する、前記ＬＨ化合物。
  55. 前記ＦＳＨが外部に由来する、又は前記哺乳類雌対象において内在的に産生される、請求項５４に記載のＬＨ化合物。
  56. 前記の医薬的に許容可能な分子が、哺乳類新生児型Ｆｃ受容体に結合する分子、例えばアルブミン、例えばヒトアルブミン、組換えヒトアルブミン、哺乳類ＦｃＲｎへの結合が増強した改変ヒトアルブミン、哺乳類ＦｃＲｎへの結合が増強した改変組換えアルブミン、哺乳類抗体のＦｃ断片、例えば哺乳類抗体の組換えＦｃ断片、及び哺乳類抗体のＦｃ断片の変異体から選択される、請求項５４に記載のＬＨ化合物。
  57. 前記哺乳類雌対象において２時間から４８時間までの前記哺乳類ＬＨ若しくはその類似体、又は前記改変ＬＨのインビボ血漿内半減期をもたらす、請求項５４〜５６の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  58. 前記ＬＨ化合物及び前記ＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する前記分子が同時使用のために医薬組成物中に提供される、請求項５４〜５７の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  59. 前記ＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する前記分子が哺乳類ＦＳＨ、例えばヒトＦＳＨ、とりわけ組換えＦＳＨ、例えばｒｈＦＳＨから選択される、請求項５４〜５８の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  60. 前記ＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する前記分子が、２０：１から１：２０までのＬＨに対するＦＳＨ又はＦＳＨ活性を有する前記分子のＩＵ比で投与される、請求項５４〜５９の何れか一項に記載のＬＨ化合物。
  61. 女性のヒトにおける生殖補助医療のための方法であって、
    ａ．月経周期の第１〜第３周日にＦＳＨを投与することにより刺激を開始すること、
    ｂ．前記の刺激を開始して第４〜第７日から排卵誘発までＧｎＲＨアンタゴニストを投与すること、
    ｃ．前記の刺激を開始して第１〜第９日からの期間において、排卵誘発まで卵胞発生を刺激するのに充分である少なくとも１投薬量のＬＨアゴニストを投与することにより、前記女性にＬＨアゴニストを供給すること、
    ｄ．少なくとも１つの卵胞が１２〜１４ｍｍの直径を有するときにＦＳＨの投与を中断すること、
    ｅ．少なくとも１つの卵胞が１５ｍｍの直径を有するときに少なくとも１投薬量のＧｎＲＨアゴニストを用いて排卵を誘導すること、
    を含んでなる前記方法。
  62. 前記ＬＨアゴニストが、ｈＣＧの半減期の少なくとも１．５倍の血清半減期を有する長期作用性ｈＣＧである、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記長期作用性ｈＣＧが排卵誘導期の間に１日おきに、例えば２日おきに、例えば３日おきに、例えば４日おきに、例えば５日おきに、例えば６日おきに、例えば７日おきに、例えば８日おきに、例えば９日おきに投与される、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記長期作用性ｈＣＧが続いて起こる黄体期の間に１日おきに、例えば２日おきに、例えば３日おきに、例えば４日おきに、例えば５日おきに、例えば６日おきに、例えば７日おきに、例えば８日おきに、例えば９日おきに投与される、請求項６２〜６３の何れか一項に記載の方法。
  65. 前記長期作用性ｈＣＧが続いて起きる妊娠期の間に１日おきに、例えば２日おきに、例えば３日おきに、例えば４日おきに、例えば５日おきに、例えば６日おきに、例えば７日おきに、例えば８日おきに、例えば９日おきに投与される、請求項６２〜６４の何れか一項に記載の方法。
  66. 前記長期作用性ｈＣＧが続いて起きる排卵誘導期及び／又は続いて起きる黄体期及び／又は続いて起きる妊娠期の間に１３日おきに、例えば２０日おきに、例えば毎月又は更に少ない頻度で投与される、請求項６２〜６５の何れか一項に記載の方法。
  67. 前記長期作用性ｈＣＧが、卵胞発生を補助するのに充分であり、そして、好ましくは黄体機能を補充するのにも充分である投薬量で卵胞期の間に一回のボーラス注射として投与される、請求項６２に記載の方法。
  68. 前記長期作用性ｈＣＧが、卵胞発生を補助するのに充分であり、そして、好ましくは妊娠機能を補助するのにも充分な投薬量で卵胞期の間に一回のボーラス注射として投与される、請求項６２〜６６の何れか一項に記載の方法。
  69. 少なくとも１つの卵胞が少なくとも１２ｍｍの直径を有するときに前記長期作用性ｈＣＧが一回のボーラス注射として投与される、請求項６２〜６８の何れか一項に記載の方法。
  70. 前記長期作用性ｈＣＧがＦＳＨ投与の間に一回のボーラス注射として投与される、請求項６２に記載の方法。
  71. 卵胞期における前記ＬＨアゴニスト投薬量が、卵胞期の間に１〜１２ＩＵ／リットルの血清濃度のｈＣＧにより生じる生物学的応答に類似の前記応答を引き起こすのに充分である、前記の請求項６１〜７０の何れか一項に記載の方法。
  72. 卵胞期におけるｈＣＧが、２５〜４００ＩＵ／日、例えば５０〜３００ＩＵ／日の投薬量で、より好ましくは１５０〜２５０ＩＵ／日など、１００〜３００ＩＵ／日の、例えば１７５〜２２５ＩＵ／日の投薬量で投与される組換えｈＣＧ又は尿由来ｈＣＧである、前記の請求項６１〜７１の何れか一項に記載の方法。
  73. 前記ｈＣＧが卵胞期の第５日から排卵誘発まで毎日投与される、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記ｈＣＧが卵胞期の第２日からさらに投与される、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記ＬＨアゴニストがＬＨ及び長期作用性ＬＨよりなる群から選択され、好ましくは長期作用性ＬＨから選択される、請求項６１に記載の方法。
  76. 前記ＦＳＨが、卵胞期の間に５〜２５ＩＵ／リットル、好ましくは１０〜１５ＩＵ／リットルのＦＳＨの血清レベルを生じさせる投薬量で投与される、前記の請求項６１〜７５の何れか一項に記載の方法。
  77. 前記ＦＳＨが、５０〜６００ＩＵのＦＳＨ／日、好ましくは１００〜３００ＩＵのＦＳＨ／日、例えば１５０〜２２５ＩＵ／日の一日量で投与される組換えＦＳＨ又は尿由来ＦＳＨである、前記の請求項６１〜７６の何れか一項に記載の方法。
  78. 前記ＦＳＨが、好ましくは月経周期の第１〜第３日に４０〜２４０ｐｇ／雌哺乳類の一回のボーラス注射として投与される長期作用性ＦＳＨ、例えばコリフォリトロピンである、前記の請求項６１〜７７の何れか一項に記載の方法。
  79. 前記ＧｎＲＨアンタゴニストがセトロレリクス、ガニレリクス、アバレリクス及びデガレリクスよりなる群から選択される、前記の請求項６１〜７８の何れか一項に記載の方法。
  80. 前記ＧｎＲＨアゴニストがロイオプロリド（leuoprolide）、ブセレリン、ナファレリン、ヒストレリン、ゴセレリン、デスロレリン、及びトリプトレリンよりなる群から選択される、前記の請求項６１〜７９の何れか一項に記載の方法。
  81. 続いて黄体機能が、採卵後の第７日に少なくとも２０ｎｍｏｌ／Ｌの血清中プロゲステロン濃度を生じさせるのに充分な１投薬量以上のＬＨアゴニストを投与することにより補充される、前記の請求項６１〜８０の何れか一項に記載の方法。
  82. 前記の１投薬量以上が、採卵後少なくとも１０日まで、採卵後好ましくは少なくとも１４日まで、より好ましくは少なくとも２１日まで、より好ましくは少なくとも２８日まで少なくとも２０ｎｍｏｌ／Ｌの血清中プロゲステロンレベルを維持するのに充分である、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記ＬＨアゴニストが組換えＬＨ又は尿由来ＬＨである、請求項８１に記載の方法。
  84. 前記の投与されたＬＨが、黄体期の間に２〜１２ＩＵのＬＨ／リットルの血清濃度、より好ましくは４〜１２ＩＵ／Ｌ、例えば６〜１２ＩＵ／Ｌの血清濃度により生じる生物学的応答に類似の前記応答を引き起こすのに充分である、請求項８１〜８３の何れか一項に記載の方法。
  85. 前記ＬＨが１００〜６００ＩＵのＬＨ／日、好ましくは２００〜４００ＩＵのＬＨ／日など、１５０〜４５０ＩＵのＬＨ／日の、例えば２５０〜３５０ＩＵ／日の一日量で投与される、請求項８１〜８４の何れか一項に記載の方法。
  86. 前記ＬＨアゴニストが、化学部分に結合した黄体形成ホルモンを含んでなり、ＬＨの半減期の少なくとも６倍の血清半減期を有する長期作用性ＬＨである、請求項８１に記載の方法。
  87. 前記ＬＨアゴニストが組換えｈＣＧ又は尿由来ｈＣＧである、請求項８１に記載の方法。
  88. 前記ＬＨアゴニストが、化学部分に結合したヒト絨毛性ゴナドトロピンを含んでなり、ｈＣＧの半減期の少なくとも１．５倍の血清半減期を有する長期作用性ｈＣＧである、請求項８１に記載の方法。
  89. 前記の投与されたｈＣＧが、黄体期の間に５〜１５ＩＵのＬＨ／リットルの血清濃度、より好ましくは５〜１２ＩＵ／日など、４〜１２ＩＵ／Ｌの、例えば５〜８ＩＵ／日の血清濃度により生じる生物学的応答に類似の前記応答を引き起こすのに充分である、請求項８７又は８８に記載の方法。
  90. ｈＣＧが（複数の）一日量の組換えｈＣＧ又は尿由来ｈＣＧとして投与される、請求項８７に記載の方法。
  91. 前記のｈＣＧの一日量が２５〜４００ＩＵのｈＣＧ／日、好ましくは５０〜２００ＩＵのｈＣＧ／日、例えば、１００〜１５０ＩＵ／日又は１２０〜１７０ＩＵ／日など、７５〜２００ＩＵ／日である、請求項９０に記載の方法。
  92. 少なくとも１つの卵胞が少なくとも１６ｍｍ、より好ましくは１７ｍｍの直径を有するときに、より好ましくは少なくとも２つ又は３つの卵胞が１７ｍｍの直径を有するときに排卵が誘発される、請求項６１〜９１の何れか一項に記載の方法。
  93. 前記生殖補助技術により調節卵巣刺激又は調節卵巣過刺激が引き起こされる、前記の請求項６１〜９２の何れか一項に記載の方法。
  94. 前記生殖補助技術がインビトロ受精、卵細胞質内精子注入、体外成熟、及び子宮内授精と併用される、前記の請求項６１〜９３の何れか一項に記載の方法。
  95. 生殖補助医療を受けている雌に黄体機能を補充する方法であって、黄体期の間に、少なくとも排卵後２週間までＬＨアゴニストを投与することを含んでなる前記方法。
  96. 前記ＬＨアゴニストが排卵後少なくとも３週間、排卵後例えば４週間、例えば５週間、例えば６週間、例えば７週間、例えば８週間、例えば９週間、例えば１０週間まで投与される、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記ＬＨアゴニストが少なくとも２０ｎｍｏｌ／Ｌのプロゲステロンの血清レベルを生じさせるのに充分である、請求項９５〜９６の何れか一項に記載の方法。
  98. 前記ＬＨアゴニストがＬＨ、ＬＨの配列変異体、及び長期作用性ＬＨよりなる群から選択される、請求項９５〜９７の何れか一項に記載の方法。
  99. 前記ＬＨアゴニストが組換えＬＨ又は尿由来ＬＨである、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記の投与されたＬＨが、黄体期の間に４〜１２ＩＵのＬＨ／リットルの血清濃度、より好ましくは４〜１２ＩＵ／Ｌ、例えば８〜１２ＩＵ／Ｌの血清濃度により生じる生物学的応答に類似の前記応答を引き起こすのに充分である、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記ＬＨが１００〜６００ＩＵのＬＨ／日、好ましくは２００〜４００ＩＵのＬＨ／日など、１５０〜４５０ＩＵのＬＨ／日、例えば２５０〜３５０ＩＵ／日の一日量で投与される、請求項９９に記載の方法。
  102. 前記ＬＨアゴニストが、化学部分に結合した黄体形成ホルモンを含んでなり、ＬＨの半減期の少なくとも６倍の血清半減期を有する長期作用性ＬＨである、請求項９８に記載の方法。
  103. 前記長期作用性ＬＨが黄体期の間に１日おきに、例えば２日おきに、例えば３日おきに、例えば４日おきに、例えば５日おきに、例えば６日おきに、例えば７日おきに、例えば８日おきに、例えば９日おきに投与される、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記長期作用性ＬＨが妊娠期の間に１日おきに、例えば２日おきに、例えば３日おきに、例えば４日おきに、例えば５日おきに、例えば６日おきに、例えば７日おきに、例えば８日おきに、例えば９日おきに投与される、請求項９８に記載の方法。
  105. 前記長期作用性ＬＨが黄体期及び妊娠期の間に１３日おきに、例えば２０日おきに、例えば毎月又は更に少ない頻度で投与される、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  106. 前記ＬＨアゴニストがｈＣＧ、ｈＣＧの配列変異体及び長期作用性ｈＣＧよりなる群から選択される、請求項９５〜９７の何れか一項に記載の方法。
  107. 前記ＬＨアゴニストが、化学部分に結合したヒト絨毛性ゴナドトロピンを含んでなり、ｈＣＧの半減期の少なくとも１．５倍の血清半減期を有する長期作用性ｈＣＧである、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記の投与されたｈＣＧが、黄体期の間に２〜１２ＩＵのＬＨ／リットルの血清濃度、より好ましくは４〜１２ＩＵ／Ｌの血清濃度により生じる生物学的応答に類似の前記応答を引き起こすのに充分である、請求項１０６に記載の方法。
  109. ｈＣＧが（複数の）一日量の組換えｈＣＧ又は尿由来ｈＣＧとして投与される、請求項１０６〜１０８の何れか一項に記載の方法。
  110. 前記の一日量のｈＣＧが２５〜４００ＩＵのｈＣＧ／日、好ましくは５０〜２００ＩＵのｈＣＧ／日、例えば、１００〜１５０ＩＵ／日又は１２０〜１７０ＩＵ／日など、７５〜２００ＩＵ／日である、請求項１０９に記載の方法。
  111. ｈＣＧが、ｈＣＧの半減期の少なくとも１．５倍の血清半減期を有する長期作用性ｈＣＧである、請求項１０６〜１０８の何れか一項に記載の方法。
  112. 前記長期作用性ｈＣＧが黄体期の間に１日おきに、例えば２日おきに、例えば３日おきに、例えば４日おきに、例えば５日おきに、例えば６日おきに、例えば７日おきに、例えば８日おきに、例えば９日おきに投与される、請求項１０６〜１１１の何れか一項に記載の方法。
  113. 前記長期作用性ｈＣＧが妊娠期の間に１日おきに、例えば２日おきに、例えば３日おきに、例えば４日おきに、例えば５日おきに、例えば６日おきに、例えば７日おきに、例えば８日おきに、例えば９日おきに投与される、請求項１０６〜１１１の何れか一項に記載の方法。
  114. 前記長期作用性ｈＣＧが黄体期及び妊娠期の間に１３日おきに、例えば２０日おきに、例えば毎月又は更に少ない頻度で投与される、請求項１１２〜１１３の何れか一項に記載の方法。
  115. 前記長期作用性ｈＣＧが、黄体機能を補充するのに充分な前記投薬量で卵胞期の間に一回のボーラス注射として投与される、請求項１０６〜１１２の何れか一項に記載の方法。
  116. 卵胞期における前記ｈＣＧ投薬量が、卵胞期の間に１〜１２ＩＵ／リットルの血清濃度のｈＣＧにより生じる生物学的応答に類似の前記応答を引き起こすのに充分である、請求項１１５に記載の方法。
  117. 請求項６１〜９４の何れか一項に記載の方法により生殖補助技術が導入されている、請求項９５〜１１６の何れか一項に記載の方法。
  118. 排卵が、ｈＣＧ、長期作用性ｈＣＧ、ＧｎＲｈアゴニスト又はアゴニストとｈＣＧの組合せからなる誘発剤注射により誘発されている、請求項９５〜１１６の何れか一項に記載の方法。
  119. 女性のヒトにおいて卵胞形成を誘導し、続いて起きる胚の着床を補助するための方法であって、
    ａ．月経周期の第１〜第３周日にＦＳＨを投与することにより刺激を開始すること、
    ｂ．前記の刺激を開始して第４〜第７日から排卵までＧｎＲＨアンタゴニストを投与すること、
    ｃ．第１〜第９日からの期間において、排卵まで卵胞発生を刺激するのに充分である少なくとも１投薬量のｈＣＧを投与することにより、ＬＨアゴニストを投与すること、
    ｄ．少なくとも１つの卵胞が１２〜１４ｍｍの平均直径を有するときにＦＳＨの投与を中断すること、及び
    ｅ．排卵後７〜１０日に少なくとも２０ｎｍｏｌ／Ｌの血清中プロゲステロン濃度を生じさせるのに充分な１投薬量以上のＬＨアゴニストを投与することにより黄体機能を補充すること、
    を含んでなる前記方法。
  120. 前記方法により単一卵胞形成（monofolliculogenesis）又は少卵胞形成（paucifolliculogenesis）が引き起こされる、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記方法が、少なくとも１つの卵胞が少なくとも１５ｍｍ、より好ましくは少なくとも１６ｍｍの直径を有するときに、例えば少なくとも３つの卵胞が１７ｍｍの直径を有するときにｈＣＧ又はＧｎＲＨアゴニストからなる誘発剤注射を投与することによる排卵誘発を含む調節卵巣刺激方法である、請求項１１９に記載の方法。
  122. 請求項９１〜１１０の何れか一項に記載の方法により黄体機能がさらに補充される、請求項１２０又は１２１に記載の方法。
  123. 女性のヒトにおける生殖補助医療のための方法であって、
    ａ．月経周期の第１〜第３周日にＦＳＨを投与することにより刺激を開始すること、
    ｂ．前記の刺激を開始して第４〜第７日から排卵誘発までＧｎＲＨアンタゴニストを投与すること、
    ｃ．前記の刺激を開始して第１〜第９日からの期間において、排卵誘発まで卵胞発生を刺激するのに充分である少なくとも１投薬量のＬＨアゴニストを投与することにより、前記女性にＬＨアゴニストを供給すること、
    ｄ．少なくとも１つの卵胞が１２〜１４ｍｍの直径を有するときにＦＳＨの投与を中断すること、
    ｅ．少なくとも１つの卵胞が少なくとも１５ｍｍの直径を有するときに２０００ＩＵという少なくとも１投薬量又はそれより少ないｈＣＧを使用して排卵を誘発すること、
    を含んでなる前記方法。
  124. 排卵誘発がＧｎＲＨアゴニストの投与をさらに含む、請求項１２３に記載の方法。
  125. 請求項７２〜８５の何れか一項において明示されている特徴のうちの１つ以上を含んでなる、請求項１２３又は１２４に記載の方法。
  126. 請求項６１〜９４に記載の方法のうちのいずれかにおいて使用されるＦＳＨ、ＬＨアゴニスト、ＧｎＲＨアンタゴニスト、及びＧｎＲＨアゴニスト。
  127. 請求項９５〜１１８の何れか一項に記載の黄体機能の補充において使用されるＬＨアゴニスト。
  128. 請求項１２１に記載の方法において使用されるＦＳＨ、ＬＨアゴニスト、ＧｎＲＨアンタゴニスト、及びＬＨアゴニスト。
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