JP2014516944A - Ｉｐ１０抗体の用量漸増計画 - Google Patents

Abstract

ある実施態様において、本発明は、（ａ）所定用量の抗ＩＰ１０抗体を対象に投与し、；（ｂ）対象の試料中の抗ＩＰ１０抗体のレベルを検出し；次いで（ｃ）工程（ｂ）からの抗ＩＰ１０抗体のレベルが閾値曝露レベル以下である場合、対象のＩＰ１０関連疾患が治療されるように対象における抗ＩＰ１０抗体の用量を増加させることを特徴とする、対象におけるＩＰ１０関連疾患の治療方法を提供する。

Description

インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ１０）（ＣＸＣＬ１０とも知られる）は、ＩＦＮガンマに応答して、様々な細胞（内皮細胞、単球、線維芽細胞およびケラチノサイトが挙げられる）で分泌される１０ｋＤａのケモカインである。ＩＰ１０は、ヒトの遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答時に真皮マクロファージおよび内皮細胞にも存在する。ＩＰ１０は、元々、ＩＦＮガンマによって誘発されるものとして同定されたが、例えば、樹状細胞においては、ＩＦＮアルファによっても誘発されうるものである。ＩＰ１０の発現はまた、ＩＦＮガンマ、ウイルスおよびリポ多糖類などの刺激によって、アストロサイトおよびミクログリアのような中枢神経系の細胞でも生じうる。

ＩＰ１０の受容体は、７回膜貫通型受容体であるＣＸＣＲ３として同定された。ＣＸＣＲ３は、活性化されたＴリンパ球上で発現されるが、他のＴリンパ球、あるいはＢリンパ球、単球または顆粒球上では発現されない。ＣＸＣＲ３の発現は、ＴＧＦ−ベータ１による刺激によってＮＫ細胞で上方調節される。ＣＸＣＲ３に対する２つの他のリガンド、ＭＩＧおよびＩＴＡＣが同定されている。ＩＰ１０のＣＸＣＲ３に対する結合は、活性化されたＴ細胞において、カルシウム動員および走化性を介在する。走化性および細胞内カルシウム動員はまた、活性化されたＮＫ細胞上でＩＰ１０がＣＸＣＲ３に結合することによって誘導される。胸腺内においては、ＩＰ１０は、ＴＣＲαβ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＴＣＲγσ^＋Ｔ細胞およびＮＫ型細胞に対する走化性因子である。

ＩＰ１０またはその受容体ＣＳＣＲ３は、多発性硬化症、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、肝炎、脊髄損傷、全身性エリテマトーデス、移植拒絶反応、シェーグレン症候群を含む様々な異なる炎症および自己免疫疾患中で同定されてきた。よって、ＩＰ１０関連疾患（例えば、炎症および自己免疫疾患）の治療剤（例えば、抗ＩＰ１０抗体）ならびに治療方法についての必要性が存在している。

ある実施態様において、本発明は、治療を必要な対象におけるＩＰ１０関連疾患の治療方法を提供する。このような方法は、（ａ）所定用量の抗ＩＰ１０抗体を対象に投与し；（ｂ）前記対象の試料中の抗ＩＰ１０抗体のレベルを検出し；次いで（ｃ）工程（ｂ）からの抗ＩＰ１０抗体のレベルが、閾値曝露レベル以下である場合、対象のＩＰ１０関連疾患が治療されるように、対象における抗ＩＰ１０抗体の用量を増加させることを特徴とする。適宜、前記方法に用いられる抗ＩＰ１０抗体は、ヒトＩＰ１０に特異的に結合し、ヒトＭＩＧまたはヒトＩＴＡＣと交差反応しないものであってもよい。好ましくは、前記抗ＩＰ１０抗体は、ＭＤＸ−１１００（完全なヒトモノクローナル抗体）である。典型的な抗ＩＰ１０抗体には、（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。別の典型的な抗ＩＰ１０抗体には、（ａ）配列番号：３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号：４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号：９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号：１０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３が含まれる。

ある態様において、上記に記載の方法の工程（ｂ）は、抗体抗原複合体の形成に適する条件下において、抗ＩＰ１０抗体に結合する抗体と接触させ、前記抗体抗原複合体の形成を検出することを特徴とする方法により抗ＩＰ１０抗体のレベルを検出することによって行われる。好ましくは、抗ＩＰ１０抗体に結合する抗体は、抗イディオタイプ抗体である。例えば、抗イディオタイプ抗体は、ＭＤＸ−１１００の１つまたはそれ以上のＣＤＲに結合する。典型的な抗イディオタイプ抗体としては、以下に限定されないが、実施例に記載の１０Ｃ８、６Ｃ９、２Ｆ５および２３Ｈ１０が挙げられる。具体的な例において、前記検出方法には、捕捉抗体および検出可能抗体（「検出抗体」としても示される）として、それぞれ２種類の抗イディオタイプ抗体（すなわち、１０Ｃ８および２３Ｈ１０）を使用する。必要に応じて、検出は、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、間接競合免疫アッセイ、直接競合免疫アッセイ、非競合免疫アッセイ、サンドウィッチ免疫アッセイおよび凝集アッセイからなる群から選択される方法によって行われる。

ある態様において、上記に記載の方法のＩＰ１０関連疾患は、炎症または自己免疫疾患である。炎症または自己免疫疾患の例としては、以下に限定されないが、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、炎症性皮膚障害（例えば、乾癬、扁平苔癬）、自己免疫性甲状腺疾患（例えば、グレーブス疾患、橋本甲状腺炎）、シェーグレン症候群、肺の炎症（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺サルコイドーシス、リンパ性肺胞炎）、移植拒絶反応、脊髄損傷、脳傷害（例えば、脳卒中）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）、歯肉炎、遺伝子治療誘発性炎症、血管形成の疾患、炎症性腎臓疾患（例えば、ＩｇＡ腎障害、膜性増殖性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎）およびアテローム性動脈硬化症が挙げられる。ＩＰ１０関連疾患の具体的な例は、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病）である。

ある実施態様において、本発明は、抗ＩＰ１０抗体に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）またはその抗原結合部分を提供する。好ましくは、抗ＩＰ１０抗体は、ＭＤＸ−１１００である。典型的な抗ＩＰ１０抗体には、（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。別の典型的な抗ＩＰ１０抗体には、（ａ）配列番号：３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号：４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号：９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号：１０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３が含まれる。典型的な抗イディオタイプ抗体としては、以下に限定されないが、実施例に記載されるような、１０Ｃ８、６Ｃ９、２Ｆ５および２３Ｈ１０が挙げられる。

ある実施態様において、本発明は、抗ＩＰ１０抗体（例えば、ＭＤＸ−１１００）に特異的に結合するモノクローナル抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）またはその抗原結合部分を産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。

ある実施態様において、本発明は、（１）抗ＩＰ１０抗体（例えば、ＭＤＸ−１１００）に特異的に結合するモノクローナル抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）またはその抗原結合部分、および（２）医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

ある実施態様において、本発明は、試料中の治療用抗ＩＰ抗体（例えば、ＭＤＸ−１１００）の検出方法を提供する。このような方法は、前記試料を、抗体抗原複合体の形成に適する条件下において、抗ＩＰ１０抗体に対する抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）またはその抗原結合部分と接触させ、続いて前記複合体の形成を検出することを特徴とする。例えば、前記抗イディオタイプ抗体は、ＭＤＸ−１１００の１つまたはそれ以上のＣＤＲに結合する。典型的な抗イディオタイプ抗体としては、以下に限定されないが、実施例に記載されるように、１０Ｃ８、６Ｃ９、２Ｆ５および２３Ｈ１０が挙げられる。具体的な例において、前記検出方法は、捕捉抗体および検出可能抗体（「検出抗体」とも称される）として、それぞれ２種類の抗イディオタイプ抗体（すなわち、１０Ｃ８および２３Ｈ１０）を使用する。必要に応じて、検出は、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、間接競合免疫アッセイ、直接競合免疫アッセイ、非競合免疫アッセイ、サンドウィッチ免疫アッセイおよび凝集アッセイからなる群から選択される方法によって行われる。

ある実施態様において、本発明は、（１）抗ＩＰ１０抗体（例えば、ＭＤＸ−１１００）に特異的に結合するモノクローナル抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）またはその抗原結合部分、および（２）抗体抗原複合体の形成を容易にするために必要な試薬を含むキットを提供する。

ある実施態様において、本発明は、（ａ）抗ＩＰ１０抗体を対象に投与し；（ｂ）前記対象の試料中の抗ＩＰ１０抗体のレベルを免疫アッセイにより検出し；次いで（ｂ）抗ＩＰ１０抗体のレベルが、閾値曝露レベル以下である場合、対象における抗ＩＰ１０抗体の用量を増加させ；抗ＩＰ１０抗体のレベルが、閾値曝露レベルまたはそれ以上である場合、対象における抗ＩＰ１０抗体の用量を増加させないことを特徴とする、治療を必要とする対象におけるＩＰ１０関連疾患の治療方法を提供する。

図１は、実験５７日目におけるＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}によって分類した臨床反応、臨床的寛解および粘膜治癒率の曝露−応答（Ｅ−Ｒ）関係を示す。 図２は、実験５７日目における臨床応答率とＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}とのロジスティック回帰分析を示す。 図３は、実験５７日目における臨床的寛解率とＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}とのロジスティック回帰分析を示す。 図４は、実験５７日目における粘膜治癒率とＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}とのロジスティック回帰分析を示す。 図５は、可能性のある標的曝露としての異なるＣ_{ｍｉｎｓｓ}に対する負のｌｏｇ１０で変換したｐ値を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、２種類の抗イディオタイプクローン１０Ｃ８および６Ｃ９の結合活性の分析を示す。 図７は、２種類の抗イディオタイプクローン２Ｆ５および２３Ｈ１０の結合活性の分析を示す。 図８は、１０Ｃ８のサブクローンの結合活性の分析を示す。 図９は、Ｃ９、２Ｆ５および２３Ｈ１０のサブクローンの結合活性の分析を示す。 図１０は、ＩＰ１０に対するクローン１０Ｃ８競合の結合活性の分析を示す。 図１１は、ＩＰ１０に対するクローン２Ｆ５および２３Ｈ１０競合の結合活性の分析を示す。 図１２Ａは、６Ａ５ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：３）、ＣＤＲ２（配列番号：４）およびＣＤＲ３（配列番号：５）領域を図示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列誘導を示す。図１２Ｂは、６Ａ５ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：６）およびアミノ酸配列（配列番号：７）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：８）、ＣＤＲ２（配列番号：９）およびＣＤＲ３（配列番号：１０）領域を図示し、ＶおよびＪ生殖系列誘導体を示す。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ＩＰ１０に特異的に結合し、ＩＰ１０の機能的特性を阻害する、単離されたモノクローナル抗体、特に、ヒトモノクローナル抗体（本明細書では「ＩＰ１０抗体」または「抗ＩＰ１０抗体」ともいう。）に関する。ある実施態様において、本発明は、ＩＰ１０抗体に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。ある実施態様において、本発明は、このような抗イディオタイプ抗体を用いる生物学的試料中のＩＰ１０抗体の検出方法を提供する。さらなる実施態様において、本発明は、（ａ）抗ＩＰ１０抗体を対象に投与し；（ｂ）前記対象の試料中の抗ＩＰ１０抗体のレベルを検出し；次いで（ｃ）工程（ｂ）からの抗ＩＰ１０抗体のレベルが、対象におけるＩＰ１０関連疾患が治療されるようなレベル以下である場合、対象に対する抗ＩＰ１０抗体の用量を増加させることを特徴とする、新規かつ有効なＩＰ１０関連疾患（例えば、炎症または自己免疫疾患）の治療方法を提供する。さらなる実施態様において、本発明は、（ａ）抗ＩＰ１０抗体を対象に投与し；（ｂ）前記対象の試料中の抗ＩＰ１０抗体のレベルを免疫アッセイによって検出し；次いで（ｂ）抗ＩＰ１０抗体のレベルが閾値曝露レベル以下である場合、対象における抗ＩＰ１０抗体の用量を増加させ；抗ＩＰ１０抗体のレベルが閾値曝露レベルまたはそれ以上である場合、対象における抗ＩＰ１０抗体の用量を増加させないことを特徴とする、治療を必要とする対象におけるＩＰ１０関連疾患の治療方法を提供する。

本発明がより容易に理解されうるために、特定の用語は、最初に定義されている。さらなる定義は、詳細な説明で説明される。

用語「インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０」、「ＩＰ１０」および「ＣＸＣＬ１０」は、相互に同一の意味で用いられ、ヒトＩＰ１０の変異型、アイソフォームおよびホモログが含まれる。よって、本発明のヒトＩＰ１０抗体は、ある場合において、ヒト以外の種に由来するＩＰ１０と交差反応しうる。他の場合において、前記抗体は、ヒトＩＰ１０に完全に特異的であってもよく、種または他のタイプの交差反応性を示し得ない。ヒトＩＰ１０の全アミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００１５５６である。アカゲザルＩＰ１０の全アミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＡＫ９５９５５である。マウスＩＰ１０の全アミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿０６７２４９である。

用語「ＣＸＣＲ３」は、ＩＰ１０の受容体（ＣＸＣＬ１０）を意味する。ヒトＣＸＣＲ３の全アミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００１４９５である。

用語「ＭＩＧ」は、ＩＰ１０とは異なり、ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカインとしても知られるＣＸＣＲ３のリガンドを意味する。ヒトＭＩＧの全アミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００２４０７である。

用語「ＩＴＡＣ」は、ＩＰ１０とは異なり、インターフェロン誘導Ｔ細胞アルファ走化性因子としても知られるＣＸＣＲ３のリガンドを意味する。ヒトＩＴＡＣの全アミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００５４００である。

本明細書で用いられる用語「抗体」には、抗体全体およびその抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）または単一鎖が含まれる。「抗体」は、ジスルフィド結合で相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、Ｖ_Ｈと略記する）および重鎖定常領域からなる。前記重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、Ｖ_Ｌと略記する）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ_Ｌからなる。前記Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに分けられ、この領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存されている領域に組み入れられている。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、下記の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、その免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の最初の補体（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子との結合を介在しうる。

抗体の用語「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）は、本明細書で用いられるように、抗原（例えば、ＩＰ１０またはＩＰ１０抗体）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによっても発揮することができることが示されている。抗体の用語「抗原結合部分」に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、Ｃ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一腕のＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989)）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメント、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈの２つのドメインは、別々の遺伝子によってコードされているが、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が対をなして一価分子を形成して単一タンパク質鎖とすることができる合成リンカーによって組み換え法を用いて連結することができる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al., Science, 242:423-426 (1988);およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)を参照のこと）。このような単一鎖抗体はまた、抗体の用語「抗原結合部分」の範囲内に含まれるものとされる。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、前記フラグメントは、そのままの抗体と同様にして有用性についてスクリーニングされる。

「単離された抗体」は、本明細書で用いられるように、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含んでいない抗体を意味するものとされる（例えば、ＩＰ１０に特異的に結合する単離された抗体は、ＩＰ１０以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含んでいない）。しかしながら、ＩＰ１０に特異的に結合する単離された抗体は、他の種に由来するＩＰ１０分子などの他の抗原に対する交差反応を有していてもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含み得ない。

本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一の分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。

本明細書で用いられる用語「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列から生じる可変領域を有する抗体を含むものとされる。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、前記定常領域はまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から生じるものである。本発明のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基が含まれてもよい（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された変異）。しかしながら、本明細書で用いられる用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳類の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移植された抗体を含むものではない。

用語「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を意味する。ある実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞と融合された、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）から得たＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。

本明細書で用いられる用語「組み換えヒト抗体」には、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についての導入遺伝子または導入染色体を有する動物（例えば、マウス）または（下記にさらに記載される）これらから作成したハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞（例えば、トランスフェクト−マ（transfectoma））から単離された抗体、（ｃ）組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングに関連する他の方法によって調製され、発現され、作出され、または単離された抗体などの組み換え方法によって調製され、発現され、作出され、または単離される全てのヒト抗体が含まれる。このような組み換えヒト抗体は、そのフレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有するものである。しかしながら、ある実態態様において、このような組み換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発にかけられ（あるいは、ヒトＩｇ配列についての動物トランスジェニックが用いられる場合、インビボ体細胞変異誘発）、それにより、組み換え抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌに由来し、関連する一方で、インビボにおけるヒト抗体生殖系列レパートリー内で天然に存在し得ない配列でありうる。

抗ＩＰ抗体に結合する抗体
ある態様において、本発明は、抗ＩＰ１０抗体に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体（例えば、ＭＤＸ−１１００）を提供する。好ましくは、このような抗体は、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体である。抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位に一般に結合するユニークな決定因子を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが作成される抗体で動物を免疫化することによって調製することができる。免疫化された動物は、これらのイディオタイプ決定因子に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することによって免疫化抗体のイディオタイプ決定因子を認識し、応答する。例えば、米国特許第４，６９９，８８０号を参照のこと。抗ＩＰ１０抗体に結合するモノクローナル抗体の産生のための典型的な技術は、以下に提供される。

モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から取得されうる（すなわち、前記集団を含む各抗体は、少量で存在しうる可能性のある天然に存在する変異体を除いて同一である）。よって、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物にはないような抗体の特性を示す。例えば、このモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作出されうるか、あるいは、組み換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作出されうる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスター）は、上記に記載されるように免疫化されて、免疫化に用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生し、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化されうる。次いで、リンパ球は、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press (1986)）。

それにより調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合されていない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つまたはそれ以上の物質を含有する適切な培地中で撒種され、増殖される。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠乏する場合、ハイブリドーマの培地には、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）が含まれ、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞によって抗体の安定で高いレベルの産生をサポートし、ＨＡＴ培地などの培地に感受性を有するものである。これらの中で、典型的な骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫細胞株（例えば、米国，カリフォルニア州，サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびに米国，バージニア州，マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なＳＰ−２、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ．Ｕ．１またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来する細胞株）である。ヒト骨髄腫およびマウスヒトヘテロ骨髄腫細胞もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)）。

ハイブリドーマ細胞が増殖する培地は、目的の抗体に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈殿法またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡ）によって決定される。このようなクローンはまた、捕捉試薬および／または検出可能抗体として用いられる場合、アッセイにおいてバックグラウンドノイズの少ないものについてスクリーニングされる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析によって決定することができる。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、前記クローンは、限界希釈法によってサブクローン化され、標準的な方法によって増殖されてもよい（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press (1986)）。このための適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物内の腹水腫瘍としてインビボで増殖されてもよい。サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）アガロースクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、培地、腹水または血清から適切に分離される。

ハイブリドーマ技術を用いる１つの具体的な精製技術としては、例えば、アジュバント（例えば、モノホスホリル脂質Ａ／トレハロースジコリノミコレート）中の目的の抗体を用いて、あるいはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはリムルスヘモシアニンを有する目的の抗体の抱合体として、足蹠または脾臓中に注射することによって、ＣＡＦ１マウスまたはＢａｌｂ／ｃなどのマウスを免疫化することが含まれる。注射は、必要に応じて何度でも行われる。マウスは屠殺され、免疫化されたマウスから取り出した膝窩リンパ節または脾臓（特に高い力価を有するもの）は、ＳＰ２／０またはＰ３Ｘ６３Ａｇ．Ｕ．１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州，マナサスのＡＴＣＣ））などのマウス骨髄腫細胞株と融合される。得られたハイブリドーマは、異なる抗原に結合する他の抗体ではなく、目的の抗体について結合親和性を有する抗体についてスクリーニングされる。このスクリーニングは、固定化した目的の抗体に結合する抗体の分泌に対して、または約９５％以上の阻害能（目的の抗体のタンパク質抗原への結合の阻害）を有するＩｇＧの産生に対して、従来のＥＬＩＳＡによって行いうる。このスクリーニングは、目的の抗体に対してわずかな、またはより高い反応性ならびに選択性を有する抗体の集団を明確にする。ＥＬＩＳＡに特に好ましい特性を有する抗体を同定するためにさらなる選択が行われてもよい。好ましい抗イディオタイプ抗体を選択するために用いられる判断基準としては、それが比較的高い親和性（Ｋｄ＜約１０^−８Ｍ）をもって目的の抗体に結合すること、ならびにその目的抗体への結合が分析膜貫通型タンパク質への結合と相互排他的であるべきことが挙げられる。最も少ないバックグラウンドノイズで最も鮮明なアッセイをも提供すべきである。

陽性クローンは、（そのオフ率に反映されるような）目的の抗体に対する抗イディオタイプ抗体の親和性およびその結合相互排他性を測定するために、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）装置を用いて表面プラズモン共鳴法で再度スクリーニングされてもよい。ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）は、バイオセンサー表面上に固定化され、ハイブリドーマ培養上澄み液から抗イディオタイプ抗体を捕捉するために用いられてもよい。目的の抗体は、０．２ｎＭ単独でおよび０．９ｎＭのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の存在中で、固定化された抗イディオタイプ抗体およびその比較される相対物質蓄積物の表面上に注入されうる。選択されるハイブリドーマ細胞は、限界希釈法によってクローン化されて、所望のクローンが得られる。続いて、抗イディオタイプ抗体は、これらのクローンから精製され、単離されうる。例えば、抗イディオタイプ抗体を調製するための例について米国公開番号第２００２／０１４２３５６号および第２００８／０１７６２５７号、ならびにDurrant et al., Int. J. Cancer, 1:92(3):414-420 (2001)およびBhattacharya-Chatterjee, Curr. Opin. Mol. Ther., 3(1):63-69 (2001)を参照のこと。

ある実施態様において、モノクローナル抗体はまた、組み換えて産生されうる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として供する。単離されると、前記ＤＮＡは、発現ベクターに組み込まれ、次いで免疫グロブリンタンパク質を他に産生することのないＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトさせて、組み換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成が得られてもよい。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現についての総説として、Skerra et al., Curr. Opin. Immunol., 5:256-262 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)が挙げられる。

さらなる実施態様において、抗体または抗体フラグメントは、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)に記載の技術を用いて作成した抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、それぞれ、ファージライブラリーを用いたマウスおよびヒト抗体の単離を記載する。その後の文献には、鎖シャッフリング法（chain shuffling）（Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)）、ならびに非常に大きいファージライブラリーを構築するための方策としてのコンビトリアル感染およびインビボ組み換え（Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)）による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生が記載される。よって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の代わりに実施することができる。

前記ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコーディング配列を置き換えることによって（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、あるいは免疫グロブリンコーディング配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列の全部または一部を共有結合で結合することによって改変されてもよい。

本明細書で詳細に記載されているか、または記載されていない本発明を実施するために有用な方法の多くは、分子生物学、生化学、免疫学および薬学の当業者にとって周知である。目的の抗体が同定されると、抗ＩＰ１０抗体に結合する抗体の作成は、当該技術分野の当業者の技術範囲内であろう。

検出アッセイの方法
ある実施態様において、本発明の抗ＩＰ１０抗体（例えば、ＭＤＸ−１１００）に対する抗体またはその抗原結合部分は、対象における治療用抗ＩＰ１０抗体（例えば、ＭＤＸ−１１００）ならびにそのフラグメントおよび誘導体の検出方法に用いることができる。好ましくは、このような抗体は、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体である。例えば、試験対象からの体液（例えば、血液、血清または血漿）または組織試料は、抗体抗原複合体の形成に適する条件下において、本発明の抗ＭＤＸ−１１００モノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触される。次いで、このような複合体の存在または量は、本明細書に記載され、あるいは当該技術分野で公知である方法によって決定することができ（例えば、O'Connor et al., Cancer Res., 48:1361-1366 (1988)を参照のこと）、試験試料中で検出される複合体の存在または量は、公知の抗原の量を含有する一連の標準試料または対照試料中で検出される複合体の存在または量と比較される。よって、本発明は、生物学的試料（例えば、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、粘液または）中のＭＤＸ−１１００（またはそのフラグメントおよび／または誘導体）などの抗ＩＰ１０抗体の検出方法に関する。

記載される検出アッセイのいずれにおいても、前記方法は、免疫アッセイ、例えば、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、間接競合免疫アッセイ、直接競合免疫アッセイ、非競合免疫アッセイ、サンドウィッチ免疫アッセイ、凝集アッセイまたは本明細書に記載され、当該技術分野で知られている他の免疫アッセイ（例えば、Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc. (1987)を参照のこと）を用いることができる。免疫アッセイは、不均一系または均一系で測定されてもよい。不均一系による免疫アッセイは、結合分析物を結合していない分析物から、または結合標識物を結合していない標識物から固相分離を取り入れることによって区別する。固相は、以下に限定されないが、チューブ、プレート、ビーズおよびストリップ（strip）を含む当該技術分野で周知の様々な形態をとりうる。ある特定の形態は、マイクロタイタープレートである。前記固相物質は、様々なガラス、ポリマー、プラスティック、紙または膜からなりうる。ポリスチレンなどのプラスティックが特に好ましい。不均一系による免疫アッセイは、競合または非競合であってもよい（すなわち、サンドウィッチ系）（例えば、米国特許第７，１９５，８８２号を参照）。

具体的な実施態様において、本発明は、下記の工程を特徴とする、対象からの生物学的試料中のＭＤＸ−１１００の検出方法を提供する（下記を参照）。

アッセイの第１の工程において、生物学的試料は、ＭＤＸ−１１００に対する抗イディオタイプ抗体などの固定化された捕捉抗体と接触され、インキュベートされる。これらの抗イディオタイプ抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体であり、いずれの種に由来してもよいが、好ましくは、げっ歯類、より好ましくは、マウス（例えば、実施例に記載されるような１０Ｃ８、６Ｃ９、２Ｆ５および２３Ｈ１０）。固定化は、水不溶性マトリックスまたは表面への吸着（米国特許第３，７２０，７６０号）または非共有結合もしくは共有結合（例えば、例えば、硝酸および米国特許第３，６４５，８５２号またはRotmans et al., J. Immunol. Methods, 57:87-98 (1983)）に記載されるような還元剤を含有する担体の活性化前もしくは活性化なしでグルタルアルデヒドまたはカルボジイミド架橋結合を用いる）によるようなアッセイ法の前、あるいはその後（例えば、免疫沈殿法による）に捕捉抗体を不溶化することによって従来技術を用いて行われる。

固定化に用いられる固相は、本質的に水不溶性であり、免疫アッセイに有用である不活性な担体または担体のいずれかであってもよく、例えば、表面、粒子、多孔性マトリックスなどの形態中の担体が含まれる。担体として一般的に用いられる例としては、小さなシート、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ゲル、ポリ塩化ビニル、プラスティックビーズ、ならびにポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンから製造されたアッセイプレートまたは試験管（９６ウェルのマイクロタイタープレートを含む）、ならびに濾紙、アガロース、交差結合デキストランおよび他の多糖類などの粒子状物質が挙げられる。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性水不溶性アトリックスおよび米国特許第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，２２９，５３７号；および第４，３３０，４４０号に記載の反応性物質は、捕捉剤の固定化に適切に用いられる。具体的な実施態様において、固定化された捕捉抗体は、マイクロタイタープレート上にコーティングされ、特に、用いられる固相は、一度に数種類の試料を分析するために用いることができるマルチウェルマイクロタイタープレートである。最も好ましくは、ＮＵＮＣ（登録商標）ＭａｘｉＳｏｒｂまたはＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）として販売されるものなどのＭＩＣＲＯＴＥＳＴ（登録商標）またはＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートである。前記固相は、上記に定義される捕捉抗体でコーティングされ、必要に応じて非共有または共有の相互作用または物理的結合によって連結されうる。結合技術としては、米国特許第４，３７６，１１０号および当該文献に列挙される参考文献に記載のものが挙げられる。共有結合である場合、プレートまたは他の固相は、室温で１時間などの当該技術分野で周知の条件下で捕捉抗体とともに架橋剤と共にインキュベートされる。捕捉剤を固相物質に結合させるために一般に用いられる架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル類、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（サクシニミジルプロピオネート）などのジサクシニミジルエステル類を含む）およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミド類が挙げられる。誘導体化剤（例えば、メチル−３−（（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ）プロピオイミデート）は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生じる。

続いて、コーティングされたプレートは、典型的に、遊離のリガンドのプレートのウェル上における過剰な部位への望ましくない結合を妨げるために、結合部位に非特異的に結合し、飽和させるブロッキング試薬で処理される。このための適当なブロッキング試薬の例としては、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、カゼインおよび無脂肪乳が挙げられる。ブロッキング処理は、典型的に、約１〜４時間、好ましくは、約１．５〜３時間周囲温度の条件下で行う。

試料および固定化した捕捉抗体のインキュベーションのための条件は、アッセイの感受性を最大にし、解離を最小にし、ならびに試料中に存在する目的の抗体が固定化した捕捉抗体に結合することを確実にするように選択される。好ましくは、前記インキュベーションは、ほぼ一定温度、約０℃〜約４０℃の範囲、好ましくは、およそ室温で行われる。インキュベーション時間は、一般に、約１０時間以下である。好ましくは、インキュベーション時間は、目的の抗体の捕捉抗体への結合を最大にするために、約０．５〜３時間、より好ましくは、約１．５〜３時間またはおよそ室温で行われる。インキュベーション期間は、プロテアーゼ阻害剤が生物学的液体中のプロテアーゼを目的の抗体の分解から防ぐために加えられる場合、より長くなってもよい。

任意の本明細書に記載のアッセイ方法の第２の工程において、生物学的試料は、捕捉されなかった目的の抗体（例えば、ＭＤＸ−１１００）を除去するために、固定化した捕捉抗体から（好ましくは、洗浄により）分離される。前記洗浄は３回またはそれ以上行われうる。洗浄の温度は、一般に、アッセイ期間中に一定温度で維持しながら、冷蔵庫中の温度から適度な温度、典型的に、約０〜４０℃、より好ましくは、約４〜３０℃である。架橋剤または他の適切な薬剤はまた、捕捉された目的の抗体が後の段階である程度解離される可能性がある場合に、現在結合している目的の抗体を捕捉試薬に共有結合させるために、この段階で加えられてもよい。

第３の工程において、目的の抗体（例えば、ＭＤＸ−１１００）が結合した固定化された捕捉抗体は、検出可能な抗体と、好ましくは、約２０〜４０℃、より好ましくは、約３６〜３８℃の温度で接触される。検出可能な抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得るが、好ましくは、モノクローナル抗体であり、より好ましくは、げっ歯類、さらにより好ましくはマウスのものである。具体的な実施例において、本明細書に記載のアッセイの検出可能な抗体は、実施例に記載されるようなＭＤＸ−１１００、１０Ｃ８、６Ｃ９、２Ｆ５および２３Ｈ１０に対する抗イディオタイプ抗体である。適宜、検出可能な抗体は、直接検出することができ、例えば、ビオチン化される。ビオチン化標識のための検出方法は、好ましくは、アビジンまたはストレプトアビジン−ＨＲＰであり、検出方法の読み取りは、好ましくは、蛍光または比色分析である。

同一の抗イディオタイプ抗体は、アッセイにおけるコーティング（捕捉）および検出に用いることができるか、あるいは、異なる抗体は、コーティング（捕捉）および検出に用いることができる。これらは、好ましくは、バックグラウンドノイズが最小となるように選択される。

アッセイ方法の第４の工程において、捕捉抗体に現在結合している試料から遊離した目的の抗体（例えば、ＭＤＸ−１１００）のレベルは、検出可能抗体のための検出方法を用いて測定される。生物学的試料が臨床患者に由来するものである場合、前記測定工程には、好ましくは、上記の３つの工程の結果として生じる反応を、標準曲線と比較して、公知の量と比較した目的の抗体のレベルを決定することが含まれる。

検出可能抗体（本明細書では、「第１の抗体」ともいう）は、過剰量の第１の抗体を洗浄して除去した後、第１の抗体の動物種のＩｇＧに対する第２の標識抗体を加えることによって、直接標識されるか、または間接的に検出される。後者の間接アッセイの場合、第１の抗体に対する標識抗血清は、生体内で標識抗体を産生させるために試料に加えられる。第１または第２の抗体のいずれかに用いられる標識物質は、遊離した目的抗体の抗イディオタイプ抗体への結合を妨げることのなく検出可能な官能性を有する。適切な標識物質の例は、蛍光色素、化学発光標識および放射性標識などの直接検出されうる部分、ならびに検出されるように反応され、誘導体化されるべき酵素などの部分を含む免疫アッセイにおける使用に知られている多くの標識物質である。このような標識物質の例としては、放射性同位体^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈおよび^１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば、希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、蛍ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（例えば、米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ＨＲＰ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼリゾチーム、糖オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘテロ環オキシダーゼ、例えば、ＨＰＲなどの標識前駆物質を酸化するために過酸化水素を用いる酵素と連結させたウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ、ビオチン（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＭＵＧを伴うストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼによる検出可能）、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカルなどが挙げられる。具体的な実施態様において、標識物質は、ビオチンであり、検出手段は、アビジンまたはストレプトアビジン−ＨＲＰである。

従来の方法は、タンパク質またはポリペプチドにこれらの標識物質に共有結合で結合させるために利用できる。例えば、カップリング剤（ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス−イミデート、ビス−ジアゾ化ベンジジンなど）は、上記に記載の蛍光、化学発光および酵素標識で抗体にタグを付けるために用いられうる。例えば、米国特許第３，９４０，４７５号（蛍光）および第３，６４５，０９０号（酵素）；Hunter et al., Nature, 144:945 (1962)； David et al., Biochemistry, 13:1014-1021 (1974)； Pain et al., J.Immunol. Methods, 40:219-230 (1981)；およびNygren, J. Histochem. Cytochem., 30:407-412 (1982)を参照のこと。典型的な標識物質は、検出のためにストレプトアビジン−ＨＲＰを用いるビオチンである。このような標識物質（酵素を含む）の抗体への抱合は、免疫アッセイ技術における分野のための標準的な操作手順である。例えば、O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, Langone, J.J. and Van Vunakis, H., eds. Vol.73, pp.147-166, Academic Press, New York, N.Y.(1981)を参照のこと。

最後の標識抗体を加えた後、結合した抗体の量は、過剰量の結合していない標識抗体を洗浄により除去し、次いで標識物質に適当な検出方法を用いて結合した標識物質の量を測定し、測定した量を生物学的試料中の目的の抗体の量との相互関係を比較することによって決定される。例えば、酵素の場合、発色させ、測定した量は、存在する目的の抗体の量の直接的な測定である。具体的には、ＨＲＰが標識物質である場合、色は、基質ＯＰＤを４９０ｎｍの吸光度で用いて検出される。別の例において、第１の標識されていない抗体に対する酵素標識された第２の抗体が固定化された相から洗浄された後、色または化学発光は、固定化された捕捉試薬を酵素の基質とインキュベートすることによって発色され、測定される。続いて、目的の抗体の濃度は、標準的な目的の抗体によって平行して作成された色または化学発光との比較によって算出される。

キット
ある実施態様において、本発明は、目的の抗ＩＰ１０抗体（例えば、ＭＤＸ−１１００）に対する１つまたはそれ以上の抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）またはその抗原結合部分ならびに抗体抗原複合体の形成および／または検出を容易にするために必要な試薬を含む、上記に記載のアッセイで用いることができるキットを提供する。好ましくは、このようなキットの抗体は、抗イディオタイプ抗体である。例えば、本発明のキットは、（ａ）ＭＤＸ−１１００に対する少なくとも１つの抗イディオタイプ抗体（本明細書では、「捕捉抗体」と称される）を含む捕捉剤；（ｂ）ＭＤＸ−１１００における異なるエピトープに結合する少なくとも１つの検出可能（標識され、または標識されていない）抗イディオタイプ抗体；および（ｃ）これらの試薬を用いてアッセイ方法を実施する方法についての説明書の基本的な構成要素を含むパッケージされた組み合わせである。

適宜、キットには、別個の構成要素として提供され、または捕捉抗体がすでに固定化されている捕捉抗体のための固相担体がさらに含まれていてもよい。よって、キット中の捕捉抗体は、固相担体上に固定化されていてもよく、あるいは、それらは、キットに含まれるか、またはキットとは別に提供される担体上に固定化されうる。例えば、捕捉抗体は、マイクロタイタープレート上にコーティングされる。検出可能な抗体は、直接検出される標識された抗体、または異なる種中で生じる標識されていない抗体に対する標識された抗体によって検出される標識されていない抗体でありうる。キットには、通常、標識物質が酵素である場合、酵素に必要とされる基質および共因子が含まれ、標識物質がフルオロフォアである場合、検出可能な発色団を供する色素前駆体が含まれ、ならびに、標識物質がビオチンである場合、アビジンなどのアビジン、ストレプトアビジン、またはＭＵＧを伴うＨＲＰもしくはβ−ガラクトシダーゼに抱合されたストレプトアビジンが含まれる。

具体的な実施例において、捕捉抗体は、実施例に記載されるような１０Ｃ８、６Ｃ９、２Ｆ５および２３Ｈ１０から選択される抗イディオタイプ抗体である。また、具体的な実施例において、検出可能な抗体は、１０Ｃ８、６Ｃ９、２Ｆ５および２３Ｈ１０から選択される抗イディオタイプであり、捕捉抗体および検出可能な抗体は、ＭＤＸ−１１００上の異なるエピトープに結合する。

前記キットには、陽性コントロールとして、抗イディオタイプ抗体に結合する目的の抗体（例えば、精製されたＭＤＸ−１１００）またはそのフラグメントがさらに含まれていてもよい。前記キットには、陰性コントロールとして、抗イディオタイプ抗体と反応しない抗体がさらに含まれていてもよい。このキットには、安定化剤、洗浄およびインキュベーション緩衝液などの他のさらなる物質が含まれていてもよい。キットの構成物は、アッセイの感受性を実質的に最大にする試薬の溶液中の濃度を提供するために適切に変化される様々な試薬の相対量を用いて、所定の比率で提供される。特に、試薬は、通常、凍結乾燥されている乾燥粉末（賦形剤を含む）として提供されてもよく、溶解され、試験される試料と合わせるのに適当な濃度の試薬溶液を提供する。

治療方法
ある実施態様において、本発明は、（ａ）所定用量の抗ＩＰ１０抗体を対象に投与し；（ｂ）前記対象の試料中の抗ＩＰ１０抗体のレベルを検出し；次いで（ｃ）工程（ｂ）からの抗ＩＰ１０抗体のレベルが閾値曝露レベル以下である場合、対象のＩＰ１０関連疾患が治療されるように、対象における抗ＩＰ１０抗体の用量を増加させ（例えば、治療上の有効な用量まで）；次いで、抗体（ｂ）からの抗ＩＰ１０抗体のレベルが閾値曝露レベルまたはそれ以上である場合、対象における抗ＩＰ１０抗体の用量を増加さかないことを特徴とする、新規かつ有効なＩＰ１０関連疾患（例えば、炎症または自己免疫疾患）の治療方法を提供する。特に、試料中の抗ＩＰ１０抗体のレベルは、上記に記載されるアッセイのいずれかによって検出することができる。

用語「治療する」には、ＩＰ１０関連疾患の症状の発症、合併症または生化学的な兆候を予防し、もしくは遅延させ、前記症状を軽減させ、または前記疾患のさらなる発症（例えば、炎症または自己免疫疾患）を妨げ、もしくは阻害するための抗ＩＰ１０抗体の投与が含まれる。治療は、疾患の兆候後の症状の予防上（疾患の発症を予防し、または遅延させるため、あるいは臨床的症状またはその亜臨床的症状の兆候を予防するため）または治療上の抑制または軽減でありうる。

本明細書で用いられる用語「用量」または「投与量」は、対象に投与される抗ＩＰ１０抗体の量を意味する。

本明細書で用いられる用語「治療上有効な用量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および持続時間の増加、または疾患による欠損または障害の予防を生じる抗ＩＰ１０抗体の用量を意味する。当該技術分野における通常の技術により、対象の大きさ、対象の症状の重症度および選択された投与の特定の組成物または経路などの因子に基づいて、このような量を決定することができる。

本明細書で用いられる用語「閾値曝露レベル」は、誘導期および／または維持期中に抗ＩＰ１０抗体を対象に投与した後、疾患の寛解の臨床的に意義のある誘導および／または維持を可能にする最小の曝露レベルを意味する。閾値曝露レベルは、実施例に記載される曝露応答分析などによって容易に決定することができる。例えば、閾値曝露レベルは、４０〜１５０μｇ／ｍＬ（例えば、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０μｇ／ｍＬ）の範囲のトラフ濃度でありうる。

本発明は、少なくとも一部は、下記に記載されるような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療する際に、ヒト抗ＩＰ１０抗体（すなわち、ＭＤＸ−１１００）の臨床試験中に行われた観察に基づくものである。前記試験は、ＭＤＸ−１１００で治療した患者におけるＭＤＸ−１１００の薬物動態的（ＰＫ）パラメータの変動を示す。一方、前記試験は、この試験中でＭＤＸ−１１００の極めて低い免疫原性を示す。さらに、前記試験は、トラフ薬物レベルが有効性に直接関連したことによる強い薬物曝露／応答関連性を示す。

多くの炎症または自己免疫疾患（例えば、ＩＢＤ）については、治療として、従来、（１）急性疾患を抑えるために比較的高い薬物用量を用いる誘導期；および（２）疾患の再発を予防するために比較的低い用量を用いる維持期（または治療期）（例えば、米国公開第第２００６／０００９３８５号）が含まれる。上記に記載される臨床試験の結果は、誘導期に得られたが、これらの観察（例えば、ＰＫパラメータの変動、非常に低い免疫原性および強い曝露／応答関連性）は、分子および／またはその作用メカニズムの特性に対する内因性のものでありうる。よって、出願人は、維持期においても同様に観察されることを予想する。

本発明のある態様は、患者に対する薬物の過剰投与を最小にし、同時に、（例えば、維持期において）有効性を最適にするものである。具体的な例において、本発明は、（１）抗ＩＰ１０抗体の維持用量（例えば、所定用量）で患者に投与し；（２）対象が応答を維持できない場合（「応答性を失う」または「再発する」ともいう）、診断アッセイは、対象における抗ＩＰ１０抗体の曝露レベル（例えば、血液濃度）を測定するために用いられ；（３）抗ＩＰ１０抗体の曝露レベルが閾値曝露レベル以下である場合、薬物応答が対象中で維持されるように、対象における用量を増加させることを特徴とする、ＩＰ１０関連疾患の治療方法を提供する。このことは、慢性的な療法中に、臨床的な評価および客観的な薬物濃度測定によって測定されるように、患者が個別の用量（例えば、必要な時にのみ多くの薬物を受けるなど）を摂取することを可能にする。

１．抗ＩＰ１０抗体
ある態様において、本発明は、特定の機能的な特徴または特性によって特徴付けられる抗ＩＰ１０抗体の使用に関する。例えば、抗体は、ヒトＩＰ１０に特異的に結合する。また、抗体は、アカゲザルなどの１種類またはそれ以上の非ヒト霊長類からのＩＰ１０と交差反応しうる。好ましくは、抗体は、マウスＩＰ１０と交差反応しない。さらに、ＭＩＧおよびＩＴＡＣがＣＸＣＲ３受容体のリガンドでもある場合、本発明の抗体は、好ましくは、ヒトＭＩＧまたはヒトＩＴＡＣと交差反応しないものである。また、本発明の抗体は、ＩＰ１０の１つまたはそれ以上の機能的な活性を阻害することができる。例えば、ある実施態様において、抗体は、ＩＰ１０のＣＸＣＲ３への結合を阻害する。別の態様において、抗体は、ＩＰ１０で誘導されるカルシウム流入を阻害する。なお別の実施態様において、抗体は、ＩＰ１０で誘導される細胞遊走（走化性）を阻害する。抗ＩＰ１０抗体の他の機能的な特徴または特性は、出典明示によりその内容が本明細書に取り込まれる米国公開第２００５／０１９１２９３号に記載される。

典型的な抗ＩＰ１０抗体は、出典明示によりその内容が本明細書に取り込まれる米国公開第２００５／０１９１２９３号に記載されるモノクローナル抗体１Ｄ４、１Ｅ１、２Ｇ１、３Ｃ４、６Ａ５、６Ａ８、６Ｂ１０、７Ｃ１０、８Ｆ６、１０Ａ１２および１３Ｃ４である。

好ましい態様において、抗ＩＰ１０抗体には、（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。

別の好ましい実施態様において、抗ＩＰ１０抗体には、（ａ）配列番号：３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号：４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号：９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（f）配列番号：１０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３が含まれる。

本明細書で定義されるように、本発明の抗ＩＰ１０抗体には、重鎖および軽鎖可変領域が本明細書に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列が含まれるものであって、前記抗体は、本発明の抗ＩＰ１０抗体の望ましい機能的な特性を保持するものである。例えば、抗ＩＰ１０抗体には、（ａ）配列番号：２からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸を含む重鎖可変領域；（ｂ）配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる抗体が挙げられる。別の例において、抗ＩＰ１０抗体として、（ａ）配列番号：３に少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号：４に少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：５に少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：８に少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号：９に少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号：１０に少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３；を含む抗体が含まれる。この相同な抗体のいずれかは、ＩＰ１０に特異的に結合し、下記の機能的な特性のうちの少なくとも１つを示す：（ｉ）前記抗体は、ＩＰ１０のＣＸＣＲ３への結合を阻害し；（ｉｉ）前記抗体は、ＩＰ１０で誘導されるカルシウム流入を阻害し；（ｉｉｉ）前記抗体は、ＩＰ１０で誘導される細胞遊走を阻害し；（ｉｖ）前記抗体は、アカゲザルＩＰ１０と交差反応し；（ｖ）前記抗体は、マウスＩＰ１０と交差反応せず；（ｖｉ）前記抗体は、ヒトＭＩＧと交差反応せず；（ｖｉｉ）前記抗体は、ヒトＩＴＡＣと交差反応しない。相同な抗ＩＰ１０抗体はまた、出典明示によりその内容が本明細書に取り込まれる米国公開第２００５／０１９１２９３号に記載される。

本明細書で定義されるように、本発明の抗ＩＰ１０抗体としては、細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素などの治療上の部分に抱合された抗ＩＰ１０抗体またはそのフラグメントが挙げられる。このような抱合体は、本明細書では「免疫抱合体」という。１つまたはそれ以上の細胞毒素を含む免疫抱合体は、本明細書では「免疫毒素」という。細胞毒素または細胞毒性剤には、細胞に有害である（例えば、死滅させる）薬剤が含まれる。例として、タキソール（登録商標）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンおよびその類似体またはホモログが挙げられる。治療剤としては、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（thioepa）、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシンと呼ばれていた）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシンと呼ばれていた）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。本発明の抗体に抱合することができる治療上の細胞毒素の他の好ましい例としては、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびオーリスタチン、およびその誘導体が挙げられる。カリケアマイシン抗体抱合体の一例として、市販品として入手可能である（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）；Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）。抗ＩＰ１０抗体の免疫抱合体はまた、出典明示によりその内容が取り込まれる米国公開第２００５／０１９１２９３号に記載される。

本明細書で定義されるように、本発明の抗ＩＰ１０抗体としては、抗ＩＰ１０抗体またはそのフラグメントを含む二特異性分子がさらに挙げられる。抗ＩＰ１０抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも２種類の異なる結合部位または標的分子に結合する二特異性分子を作成するために、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）から誘導体化され、または連結することができる。抗ＩＰ１０抗体またはそのフラグメントは、実際に、２つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異性分子を作成するために１つ以上の他の機能性分子から誘導体化され、または連結されていてもよく；このような多特異性分子もまた、本明細書で用いられる用語「二特異性分子」に包含されるものとされる。二特異性分子を作り出すために、抗ＩＰ１０抗体は、二特異性分子を生じるように、（例えば、化学カップリング、遺伝学的融合、非共有結合または他の手段によって）別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物（binding mimetic）などの１つまたはそれ以上の他の結合分子に機能的に連結することができる。二特異性抗ＩＰ１０抗体はまた、出典明示によりその内容が本明細書に取り込まれる米国公開第２００５／０１９１２９３号に記載される。

２．ＩＰ１０関連疾患の治療方法
ある態様において、本発明は、対象におけるＩＰ１０関連疾患を治療するための抗ＩＰ１０抗体（免疫抱合体および二特異性分子）の使用に関する。本明細書で用いられる用語「対象」には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれるものとされる。非ヒト動物としては、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類などの哺乳類および非哺乳類が挙げられる。前記方法は、異常なＩＰ１０発現に関連する疾患にかかっているヒト患者を治療するために特に適当である。ＩＰ１０に対する抗体が別の薬剤と共に投与される場合、この２つの薬剤は、順番に、または同時に投与することができる。

用語「ＩＰ１０関連疾患または障害」または「ＩＰ１０介在性疾患または障害」は、ＩＰ１０が障害の兆候を引き起こす主な原因となっている局所および／または全身の生理障害を意味する。典型的なＩＰ１０関連疾患としては、以下に限定されないが、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、炎症性皮膚障害（例えば、乾癬、扁平苔癬）、自己免疫性甲状腺疾患（例えば、グレーブス疾患、橋本甲状腺炎）、シェーグレン症候群、肺の炎症（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺サルコイドーシス、リンパ性肺胞炎）、移植拒絶反応、脊髄損傷、脳傷害（例えば、脳卒中）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）、歯肉炎、遺伝子治療誘発性炎症、血管形成の疾患、炎症性腎臓疾患（例えば、ＩｇＡ腎障害、膜性増殖性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎）およびアテローム性動脈硬化症を含む、炎症または自己免疫疾患が挙げられる。ＩＰ１０関連障害はまた、出典明示によりその内容が本明細書に取り込まれる米国公開第２００５／０１９１２９３号に記載される。

３．医薬組成物および投与経路
ある態様において、本発明は、医薬的に許容される担体と共に製剤化される抗ＩＰ１０モノクローナル抗体またはその抗原結合部分のうちの１つまたは組み合わせを含有する組成物（例えば、医薬組成物）に関する。このような組成物として、本発明の（例えば、２種類またはそれ以上の異なる）抗体、または免疫抱合体もしくは二特異性分子のうちの１つまたは組み合わせが含まれていてもよい。例えば、医薬組成物には、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的な活性を有する抗体（または免疫抱合体もしくは二特異性分子）の組み合わせが含まれうる。適宜、本発明は、抗ＩＰ１０抗体を他の薬剤と組み合わせて含む医薬組成物を使用することによる併用療法を提供する。例えば、併用療法としては、少なくとも１つの他の抗炎症剤または免疫抑制剤と組み合わせた抗ＩＰ１０抗体を挙げることができる。併用療法に用いることができる治療剤の例は、出典明示によりその内容が取り込まれる米国公開第２００５／０１９１２９３号に詳細に記載される。

本明細書で用いられるように、「医薬的に許容される担体」としては、生理学的に適合性を有するいずれか全ての溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、前記担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または点滴による）に適する。投与経路に応じて、活性な化合物（すなわち、抗体、免疫抱合体または二特異性分子）は、酸の作用および前記化合物を不活性化しうる他の自然条件から前記化合物を保護するための物質でコーティングされていてもよい。前記医薬化合物には、１つまたはそれ以上の医薬的に許容される塩が含まれうる。医薬組成物の他の成分は、出典明示によりその内容が取り込まれる米国公開第２００５／０１９１２９３号に詳細に記載される。

投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療上の応答）を生じるように調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、数回分割投薬量が長期間にわたり投与されてもよく、あるいはこの投薬量は、治療状況の危急により示されるように比例的に減少され、もしくは増加されてもよい。投与の利便性および投薬の均一性のために非経口組成物を投薬単位形態中に製剤化するのに特に有利である。本明細書で用いられる投薬単位形態は、治療される対象の単位用量として適する物理的に分離した単位を意味し；各単位は、必要な医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じるように算出された抗ＩＰ１０抗体の所定の量を含有する。投薬単位形態の特定は、（ａ）抗ＩＰ１０抗体の独特の特徴および達成される特定の治療効果、および（ｂ）各対象における治療感度に対する抗ＩＰ１０抗体などを配合する技術分野における固有の限界によって決定され、直接左右される。

抗ＩＰ１０抗体の投与に関して、前記用量は、宿主の体重の約１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、用量は、体重の１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇでありうる。典型的な治療計画は、１日に１回、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１月に１回、３月に１回または３〜６月に１回の投与を伴う。一例において、抗ＩＰ１０抗体の投薬計画としては、下記の投薬スケジュールのうちの１つを用いて投与される抗体の静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる：（ｉ）４週間ごとに６回の投薬、次いで３月ごと；（ｉｉ）３週間ごと；（ｉｉｉ）１回の３ｍｇ／ｋｇ体重、続いて３週間ごとに１回の１ｍｇ／ｋｇ体重。

具体的な実施態様において、抗ＩＰ１０抗体の投与は、誘導期中の静脈内吸入によるものであり、維持期中の皮下注射によるものである。投与頻度は、１日に１回から１月に１回まで変動しうる。対象が維持期中に応答を維持できない場合（「応答を失う」または「再発」ともいう）、診断アッセイは、抗ＩＰ１０抗体の対象の曝露レベル（例えば、血中レベル）を測定するために用いられ；（３）抗ＩＰ１０抗体の曝露レベルが閾値曝露レベル以下である場合、対象における用量を増加させる。適宜、前記用量は、投与頻度を増加させることによって、対象において増加させることができる（例えば、１週間に１回から１週間に２回の頻度に増加させる）。

ある実施態様において、異なる結合特異性を有する２つまたはそれ以上のモノクローナル抗体は、同時に投与され、この場合、投与される各抗体の用量は、示される範囲内に含まれる。抗ＩＰ抗体は、通常、複数回で投与される。投与間の間隔は、例えば、１週間ごと、１月ごと、３月または１年ごとでありうる。間隔はまた、患者におけるＩＰ１０抗体の血中レベルを測定することによって示されるように、不規則であってもよい。ある態様において、用量は、約１〜６００μｇ／ｍｌ、ある方法では、約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するように調整される。

あるいは、抗ＩＰ１０抗体は、持続放出性製剤として投与することができ、この場合、頻度の低い投与が必要となる。用量および頻度は、患者内における抗体の半減期によって変動しうる。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、続いて、ヒト化抗体、キメラ化抗体および非ヒト抗体と続く。用量および投与頻度は、治療が予防上であるか、または治療上であるかに応じて変動しうる。予防上に用いる場合、比較的低い用量が、長期間にわたり比較的少ない頻度の間隔で投与される。ある患者は、人生の残りについて治療を受け続ける。治療上に用いる場合、病気の進行が減少し、または終結するまで、好ましくは、患者が病気の症状の部分的または完全な軽減を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量が必要とされることもある。その後、患者は、予防的な計画で投与することができる。

医薬組成物中の抗ＩＰ１０抗体の実際の用量レベルは、患者に対して毒性であることなく、一定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るために変動されうる。選択される用量レベルは、用いられる抗ＩＰ１０抗体またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与期間、用いられる抗ＩＰ１０抗体の排出速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、年齢、性別、体重、条件、治療される患者の総体的な健康および既往歴を含む様々な薬物動態的因子ならびに医薬分野で周知の因子などに依存する。

本発明は、限定するものと解釈されるべきではない下記の実施例によってさらに例示される。本願を通して引用される全ての図面および全ての参考文献、特許文献および公開された特許出願の内容は、出典明示により本明細書に取り込まれるものである。

（実施例１）
潰瘍性大腸炎患者におけるＭＤＸ−１１００の曝露量−応答分析、および潰瘍性大腸炎患者の治療のためのＭＤＸ−１１００に対する標的曝露量の同定
第ＩＩ相二重盲検プラセボ対照ランダム化多施設反復投与臨床実験において、ＭＤＸ−１１００を、プラセボと比較した、中等度から重度の活動性潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者における臨床応答の誘発について実験した。臨床データの曝露量−応答（Ｅ−Ｒ）分析を行って、ＵＣ患者の治療において安全かつ有効となるであろうＭＤＸ−１１００に対する標的曝露量を同定した。

方法
１．Ｅ−Ｒ分析における患者集団
７カ国の４０の地区の全部で１０９人のＵＣ患者を、１週間おきに全部で４用量（用量は、実験１、１５、２９、および４３日目に投与された）、静脈内注入によって、１０ｍｇ／ｋｇのプラセボ（Ｎ＝５４）またはＭＤＸ−１１００（Ｎ＝５５）を投与するようにランダム化した。

研究は、日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議によって規定された医薬品の臨床試験の実施の基準に従って、欧州連合指令２００１／２０／ＥＣおよび米国連邦規制基準第２１章、第５０部（２１ＣＦＲ５０）の根本にある倫理原則に従って、ヘルシンキ宣言に端を発する倫理原則に従って行った。研究のプロトコル、修正、および被験者のインフォームドコンセントは、現場での研究の開始の前に、治験審査委員会（ＩＲＢ）／独立倫理委員会（ＩＥＣ）によって適切な認可を受けた。研究の開始に先立って、研究者は、各被験者に、ＩＲＢ／ＩＥＣの文書による認可／文書によるインフォームドコンセントフォームの好意的意見およびあらゆる他の関連する情報を提供した。研究における被験者の適格性を確認するために行われるあらゆるスクリーニング手順についてのインフォームドコンセントを含む、自由に提供された文書によるインフォームドコンセントを、各被験者から、またはインフォームドコンセントが被験者から得ることができなかった状況では被験者の法律的に認められる代表者から、研究への参加の前に得た。

全患者は、内視鏡検査で中等度から重度の活動性疾患を伴う６〜１０のＭａｙｏスコア（≧２のＭａｙｏ内視鏡サブスコア）として定義される活動性ＵＣを有していた。全ての患者は、５−アミノサリチレート（５−ＡＳＡ）、コルチコステロイド、アザチオプリン（ＡＺＡ）、および／または６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）を継続して投薬されていた。

これらの１０９人の患者は包括解析（ＩＴＴ）集団として定義され、有効性の測定を評価するための一次集団であった。１０９人の患者のうち、２人の患者（共にプラセボ群に割り当てられた）は、ランダム化されたが治療は受けなかった。したがって、残りの１０７人の患者が、安全性についての母集団として定義され、少なくとも１回の完全なまたは部分的な用量のプラセボ（Ｎ＝５２）またはＭＤＸ−１１００（Ｎ＝５５）を投与された全患者を含んでいた。患者の内訳および人口統計を、表１および２にまとめる。
表１
患者の内訳（ＩＴＴ集団）

表２
患者の統計（ＩＴＴ集団）

２．ＵＣ患者におけるＭＤＸ−１１００の薬物動態学的分析
ＭＤＸ−１１００の薬物動態学的評価のための血清試料を、実験１、１５、２９、および４３日目、ならびに実験５７日目の各投薬の６０分前までに各患者から採取した。ＭＤＸ−１１００の血清濃度を、バリデーションされたＥＬＩＳＡアッセイ法を用いてアッセイした。実験５７日目のＭＤＸ−１１００の血清トラフ濃度を、ＭＤＸ−１１００治療を受けた各患者の定常状態トラフ濃度（Ｃ_{ｍｉｎｓｓ}）として導き出した。

３．有効性および安全性の測定のＥ−Ｒ分析ならびにＭＤＸ−１１００に対する標的曝露量の同定
Ｅ−Ｒ分析において判定された曝露量の測定は、実験５７日目でのＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}であった。Ｅ−Ｒ分析において判定された有効性の測定は、（１）実験５７日目に、患者の少なくとも３０％で総Ｍａｙｏスコアがベースラインから少なくとも３点減少していること（スクリーニング）に加え、直腸出血についてのサブスコアが少なくとも１点減少しているかまたは直腸出血についての絶対サブスコアが０もしくは１減少しているものとして定義された、臨床応答（臨床応答率は、各治療群における、臨床応答を有していた患者の割合として定義された）；（２）実験５７日目に、総Ｍａｙｏスコアが≦２点であり、１点を超える個別のサブスコアがなく、かつ患者の便に血液が見られないものとして定義された、臨床的寛解（臨床的寛解率は、各治療群における、臨床的寛解にあった患者の割合として定義された）；および（３）実験５７日目に、患者における内視鏡検査サブスコアが０または１であるとして定義された、粘膜治癒（粘膜治癒率は、各治療群における、粘膜の治癒を有していた患者の割合として定義された）であった。Ｅ−Ｒ分析において判定された安全性の測定は、死亡、重篤有害事象（ＳＡＥ）、治療に関連するＳＡＥ、ＳＡＥに起因する中断、有害事象（ＡＥ）、治療に関連するＡＥ、およびＡＥに起因する中断であった。

Ｅ−Ｒ分析のために、実験５７日目にＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}値を有していた全ＩＴＴ患者を、それらの患者のＣ_{ｍｉｎｓｓ}値、すなわち（１）低（２６．４〜７８．６μｇ／ｍＬ）；（２）中（７９．２〜１０５μｇ／ｍＬ）；および高（１０８〜２３５μｇ／ｍＬ）に基づく三分位数に階層化した。臨床応答率、臨床的寛解率、および粘膜治癒率を、Ｃ_{ｍｉｎｓｓ}の三分位数のそれぞれについて計算し、フィッシャーの正確検定法を用いて９５％ＣＩを提供した。ロジスティック回帰を用いて、Ｃ_{ｍｉｎｓｓ}と有効性の測定のそれぞれとの間の曝露量−応答関係を別々に実験した。その９５％ＣＩとともに、曝露量の倍加に伴うオッズ比を計算した。Ｐ値もまた報告した。安全性の測定を、プラセボを投与された全患者、ＤＸ−１１００を投与された全患者、およびＤＸ−１１００を投与されＣ_{ｍｉｎｓｓ}が最高の三分位数（≧１０８μｇ／ｍＬ）であった全患者について表にした。

４．ＵＣ患者の治療のためのＭＤＸ−１１００に対する標的曝露量の同定
ＭＤＸ−１１００への最適な標的曝露量を、全体的な有効性に関して、曝露量が標的曝露量未満である患者と曝露量が標的曝露量を超える患者との間の最大の分離をもたらすように選択した。ＭＤＸ−１１００に対する標的曝露量は、以下のアルゴリズムに基づいて決定した。すなわち、いかなる所与の曝露量ｃについても、フィッシャーの正確検定を行って、曝露量がｃ未満である患者と曝露量がｃを超える患者との間で、臨床応答率、臨床的寛解率、および粘膜治癒率について差があるかどうかを決定した。最小対応ｐ値を有する曝露量を、標的曝露量として選択した。

結果
１．ＵＣ患者におけるＭＤＸ−１１００の薬物動態学
ＥＬＩＳＡによる全ての報告されたヒト血清中のＭＤＸ−１１００濃度は、事前に確立された許容基準を満たし、分析の時点で用いられている適用可能なＳＯＰに従って実行された、適切な検量線および品質管理試料を用いる分析ランにおいて調製した。アッセイ成績の概要を表３に示す。
表３
ヒト血清中のＭＤＸ−１１００についてのアッセイおよび能力の概要

^ａ分析ＱＣからの最大値

４回の投薬後、ＭＤＸ−１１００のトラフ濃度（Ｃｍｉｎ）は、１５日目の４２．２μｇ／ｍＬから５７日目の９１．３μｇ／ｍＬまで増大した（表４）。実験５７日目のＣ_ｍｉｎが、ヒトにおけるＭＤＸ−１１００の半減期がおよそ８日であったこと、およびＱ２ｗｅｅｋの投与計画に基づいて、Ｃ_{ｍｉｎｓｓ}であると考えられた。ＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}の変動係数（ＣＶ％）は、実験５７日目に４４．２％であり、他の生物学的療法に類似していた（例えば、Fasanmade AA, et al., Int J Clin Pharmacol Ther. 2010, 48(5):297-308; Nestorov I, Semin Arthritis Rheum. 2005 Apr;34(5 Suppl1):12-8. Reviewを参照されたい）。
表４
ＭＤＸ−１１００のＣ_ｍｉｎ(μｇ/ｍＬ)の統計の概要

^ａ注入用量の投与前の前投与量で収集したトラフ濃度

２．臨床応答率、臨床的寛解率、粘膜治癒率対ＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}の曝露量−応答関係
Ｅ−Ｒ分析により、より高いＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}が、臨床応答率、臨床的寛解率、および粘膜治癒率の顕著な増加に関連することが実証された（図１）。ＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}が最高の三分位数サブグループ（Ｃ_{ｍｉｎｓｓ}：１０８〜２３５μｇ／ｍＬ）にあった患者は、プラセボ治療を受けた患者またはＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}が２つのより低い三分位数にあった患者と比較して、最も高い臨床応答率、臨床的寛解率、および粘膜治癒率を達成した。臨床応答率、臨床的寛解率、および粘膜治癒率は、最高の三分位数サブグループにあるＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}を達成した患者対プラセボ治療を受けた患者で、それぞれ、８７．５％対３７％、４３．８％対１８．５％、および６８．８％対３５．２％であった。また、Ｃ_{ｍｉｎｓｓ}が最高の三分位数サブグループにあった患者におけるＭａｙｏスコアは、プラセボで治療した患者またはＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}が２つのより低い三分位数にあった患者と比較して顕著に向上し、ベースラインからのＭａｙｏスコアの減少の平均は、２．８と比較して、４．７であった。

臨床応答率、臨床的寛解率、および粘膜治癒率のロジスティック回帰分析により、ＵＣ患者をＭＤＸ−１１００で治療すると、患者が、ＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}の増加を達成すれば、臨床応答率、臨床的寛解率、および粘膜治癒率の増加を達成することが実証された。臨床応答率、臨床的寛解率、および粘膜治癒率のオッズ比は、それぞれ３．７７（Ｐ＝０．０１７）、２．８５（Ｐ＝０．０７１）、および３．０８（Ｐ＝０．０３）であった。言い換えると、患者によって達成されるＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}が２倍増加すると、患者が臨床応答、臨床的寛解、および粘膜治癒を達成するオッズは、それぞれ、３．７７、２．８５、および３．０８倍増加する（図２〜４）。

３．曝露量−安全性関係
ＭＤＸ−１１００で治療し、最高の三分位数サブグループにあるＣ_{ｍｉｎｓｓ}を達成した患者の安全性プロファイルは、ＭＤＸ−１１００の安全性についての母集団全体に匹敵するものであった（表５）。ＭＤＸ−１１００の安全性についての母集団全体においては５５人の患者のうち２２人（４０％）であったのに対し、ＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}が最高の三分位数サブグループにあった１６人の患者のうち６人（３７．５％）が、少なくとも１つのＡＥを経験した。ＭＤＸ−１１００の安全性についての母集団全体においては５５人のうち１１人（２０．０％）であったのに対し、前記１６人の患者のうち２人（１２．５％）のみが経験したＡＥは、実験療法に関連すると考えられた。ＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}が最高の三分位数サブグループにあり、少なくとも１つのＡＥを経験していた患者の数もまた、プラセボ群のそれに匹敵するものであった（それぞれ、６／１６［３７．５％］対１７／５２［３２．７％］）。

ＭＤＸ−１１００の安全性についての母集団全体においては４人の患者（７．３％）であったのに対し、ＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}が最高の三分位数サブグループにあった１６人の患者では、ＳＡＥは報告されなかった。ＡＥに起因して中断された、ＭＤＸ−１１００の安全性についての母集団全体における２人の患者は、Ｃ_{ｍｉｎｓｓ}の最高の三分位数サブグループにはなかった。さらに、ＭＤＸ−１１００の安全性についての母集団全体における、感染が報告された患者（５５人の患者のうち７人、１２．７％）のいずれも、Ｃ_{ｍｉｎｓｓ}の最高の三分位数サブグループにはなかった。

要するに、本研究における限られた数の患者に基づくと、ＭＤＸ−１１００のＣ_{ｍｉｎｓｓ}の増加に関連するＡＥの増加はなかった。
表５
有害事象の概要^ａ（Ｃ_{ｍｉｎｓｓ}サブグループ）

^ａＡＥは、前治療がないものを含む治療の間もしくは治療の最終投薬の７０日以内に現れる、または前治療の状態と比較して悪化した、症候の兆候、およびタイミングに関わらず、治療に関連するあらゆるＡＥとして定義される。
^ｂＳＡＥは、治験薬の７０日後までに研究者によって重篤であると考えられる、全てのグレード３（重度）以上の事象（または重症度の分からない事象）を含む。グレードレベルは、ＵＳＡ ＮＣＩ ＡＥの解明ガイドラインに基づく。
^ｃもしかすると、おそらく、または確実に、治験薬に関連している（関連が不明なものは、関連していると推定された）

４．ＵＣ患者の治療のためのＭＤＸ−１１００に対する標的曝露量
３つの有効性の測定（臨床応答率、臨床的寛解率、および粘膜の治癒率）の全てを用いて、ＭＤＸ−１１００に対する標的曝露量を同定した。図５の結果に基づくと、約１００μｇ／ｍＬのＣ_{ｍｉｎｓｓ}で、−ｌｏｇ１０変換されたｐ値は最大に達し、これは、最小対応ｐ値、すなわち、曝露量がこの標的曝露量を超える患者と曝露量がこの標的曝露量未満の患者との間で最大に有効性が異なることを示した。曝露量−安全性の分析は、ＭＤＸ−１１００が安全であり、本研究において最高の三分位数（１０８〜２３５μｇ／ｍＬ）にあるＣ_{ｍｉｎｓｓ}を有するＵＣ患者において良好な耐容性を示すことを示唆した。したがって、１００μｇ／ｍＬのＣ_{ｍｉｎｓｓ}値は、ＭＤＸ−１１００でのＵＣ患者の治療にとって安全かつ有効なＭＤＸ−１１００に対する標的曝露量と同定した。

５．免疫原性の分析
本研究において、ＭＤＸ−１１００の免疫原性の判定を、バリデーションされた電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイで、１、２９、５７、および８５日目（治験薬の最終投薬の４２日後）に、安全性についての母集団の試料を用いて行った。ＭＤＸ−１１００に対するヒト抗ヒト抗体は、このＥＣＬアッセイで、いずれの患者においても検出されなかった。

（実施例２）
マウス抗ＭＤＸ−１１００イディオタイプ抗体の作成
材料および方法
１．免疫原
本明細書において６Ａ５とも呼ばれるＭＤＸ−１１００は、ヒト抗ＩＰ１０抗体である（例えば、米国公開第２００５／０１９１２９３号を参照されたい）。ＭＤＸ−１１００（１０ｍｇ／ｍｌ）を、Ｆａｂの調製に用いた。ＭＤＸ−１１００のＦａｂ断片（２．９２ｍｇ／ｍｌ）を、抗体作成における免疫原として用いた。

２．マウスおよび免疫化手順
以下のマウスを用いて、少数のハイブリドーマ、例えば１０Ｃ８、６Ｃ９、２Ｆ５、および２３Ｈ１０を生成した。以下の表６は、ハイブリドーマおよびそれらの産生に用いられた相当するマウスをまとめている。
表６
ハイブリドーマおよびそれらの作成に用いられた対応するマウスのリスト

約２５〜３０μｇのＭＤＸ−１１００のＦａｂを用いて、ｉｐ注射、ｓｃ注射、および足底注射を介してマウスを免疫化した。このような免疫化は、５日の別の日に行った。その後、脾臓およびリンパ節を採取した。

３．ハイブリドーマの作成
Ｓｐ２／０骨髄腫細胞株は、融合するために用いた。細胞を１ヶ月間にわたり培養で維持し、１週間に２回継代した。Ｐ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−６３ＦＬ）細胞の上清を、ハイブリドーマのための馴化培地として用いた。簡潔に述べると、細胞を成長させ、２００ｍＬまで増殖させた。静置培養物を約７日間にわたり成長させた。枯渇上清を遠心沈殿させ、０．２μｍの無菌フィルターを介して濾過した。この細胞株を１ヶ月間にわたり継代し、次いで、新たなバイアルを融解した。

１０％ＦＢＳ（ＨＹＣＬＯＮＥ（登録商標）、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３；ロット番号ＡＳＬ３１０２４）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ番号１２３８２−０２４）を用いて、骨髄腫融合パートナーおよびＰ３８８Ｄ１細胞を培養した。追加の培地補充物をハイブリドーマ成長培地に添加し、これは、５％Ｏｒｉｇｅｎ−ハイブリドーマクローニング因子（ＩＧＥＮ（登録商標）、カタログ番号２１０００１）、１５％Ｐ３８８Ｄ１馴化培地、β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１０１９０９１）、Ｈｅｐｅｓ（ＣＥＬＬＧＲＯ（登録商標）番号２５０６００３７）、およびＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、Ｈ０２６２；１．０×１０^−４Ｍのヒポキサンチン、４．０×１０^−７Ｍのアミノプテリン、１．６×１０^−５Ｍのチミジン）またはＨＴ（Ｓｉｇｍａ、Ｈ０１３７；１．０×１０^−４Ｍのヒポキサンチン、１．６×１０^−５Ｍのチミジン）を含んでいた。

融合のための３匹のマウスの脾臓およびリンパ節から得られた生存細胞を、以下の表７に列挙した。電極融合を脾細胞に行った。得られたハイブリドーマを、２００μｌ／ウェルで播種された９６ウェルＣＯＳＴＡＲ（登録商標）組織培養物処理済プレート内に全てプレーティングした。
表７
マウスの脾臓およびリンパ節から生じた融合物のリスト

結果
１．融合体のスクリーニング、サブクローニング、および増殖
融合体を、ＭＤＸ１１００ ６Ａ５（６Ａ５全体、６Ａ５−ビオチン、または６Ａ５ Ｆａｂ）に直接的に結合する抗体についてまずスクリーニングし、次いで、他の抗ＩＰ１０ヒト抗体（例えば１Ｄ４および１０Ａ１２）およびプールされたヒトＩｇＧに対する特異的結合を追跡した。

図６Ａは、ハイブリドーマの上清をＥＬＩＳＡによってＭＤＸ１１００ ６Ａ５特異的抗体についてスクリーニングすると、クローン１０Ｃ８および６Ｃ９が陽性であったことを示す。図６Ｂは、クローン１０Ｃ８および６Ｃ９が６Ａ５に特異的に結合することを示す。図７は、クローン２Ｆ５および２３Ｈ１０が６Ａ５に特異的に結合することを示す。

さらに、１０Ｃ８、６Ｃ９、２Ｆ５、および２３Ｈ１０のサブクローンを同様に分析し、６Ａ５に特異的に結合することが見出された（図８〜９）。

２．抗体の選択
抗体の選択は、６Ａ５に特異的なＭＤＸ１１００ ６Ａ５対、無関係な抗体である１Ｄ４および１０Ａ１２ならびにプールされたヒトＩｇＧへの直接的な結合、さらに６Ａ５−ＩＰ１０相互作用との抗イディオタイプ抗体の競合に基づくものであった。ＥＬＩＳＡでの競合結合アッセイにおいて、１μｇ／ｍｌ、５０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧガンマをプレート上に被覆した。予め混合された６Ａ５およびＩＰ１０（抗原：抗体比＝５：１）、または６Ａ５全体のみを添加した。１μｇ／ｍｌ、５０μｌの希釈された抗イディオタイプ抗体を同様に添加した。次いで、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ−ＨＲＰを、検出のために添加した。

図１０は、クローン１０Ｃ８が競合結合アッセイにおいてＩＰ１０と競合することを示す。図１１は、クローン２Ｆ５および２３Ｈ１０が競合結合アッセイにおいてＩＰ１０と競合しないことを示す。

（実施例３）
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）電気化学発光免疫アッセイによるヒト血清におけるＭＤＸ−１１００の定量的決定
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）電気化学発光免疫アッセイは、ヒト血清におけるＭＤＸ−１１００の定量のために開発された。ＭＳＤ法が採用する技術は、２％ヒト血清中のＭＤＸ−１１００を捕捉するために、ビオチン化された抗ＭＤＸ−１１００マウスモノクローナル抗体（クローン１０Ｃ８）が、ストレプトアビジンで被覆された９６ウェルプレート上に被覆されているものであった。捕捉されたＭＤＸ−１１００を、次いで、ｓｕｌｆｏ−ｔａｇで標識された抗ＭＤＸ−１１００マウスモノクローナル抗体（クローン２３Ｈ１０）を用いて検出した。２％ヒト血清において作成された標準曲線は、５ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬ（１００％ヒト血清において２５０〜１５，０００ｎｇ／ｍＬ）の範囲であり、２５０ｎｇ／ｍＬがアンカーポイントである４パラメータロジスティック回帰モデルに適合した。ＱＣでのアッセイ内精度は７．２％以内であり、アッセイ間精度は１０．９％以内であった。参照標準でのアッセイ内精度は６．７％以内であり、アッセイ間精度は６．４％以内であった。ＱＣの正確性は、理論値の±１５．６％以内であった。参照標準の正確性は、理論値の±５．４％以内であった。５００ｎｇ／ｍＬの定量下限（ＬＬＯＱ）では、１０の潰瘍性大腸炎患者の血清試料のうち１０についての理論値からの予測濃度の偏差は、±６．７％以内であった。アッセイ成績は、それぞれ最大１００ｎｇ／ｍＬおよび５０００ｎｇ／ｍＬのプレインキュベートされたＩＰ１０およびヘパラン硫酸によって影響されなかったが、３５〜４０％の干渉が、ＨＱＣ、ＭＱＣ、およびＬＱＣにおいて１０００ｎｇ／／ｍＬのＩＰ−１０および５００００ｎｇ／ｍＬのヘパリン硫酸で観察された。ＭＤＸ−１１００およびイソＡｓｐ−ＭＤＸ−１１００の回収率は差を示さなかった。

材料および方法
Ａ．溶液および試薬の調製
１．アッセイバッファー（ＤＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）
５０ｍＬの１０％ＢＳＡ溶液および２．５ｍＬの１０％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液を５００ｍＬのＤＰＢＳに移す。２〜８℃で保管する。調製の３ヶ月以内に使用する。

２．ブロッキングバッファー（ＤＰＢＳ中５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）：
２５０ｍＬの１０％ＢＳＡ溶液および２．５ｍＬの１０％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液を２５０ｍＬのＤＰＢＳに添加する。２〜８℃で保管する。調製の３ヶ月以内に使用する。

３．ＰＢＳ洗浄バッファー（０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含有する、ＰＢＳ乾燥粉末パケット、ｐＨ７．４±０．２）
１つのＰＢＳパケットの内容物を１リットルのｄＨ_２Ｏ中に溶解し、溶液を室温で保管した。調製の１ヶ月以内に使用する。

４．アッセイバッファー／２％ヒト血清
６０μＬのヒト血清を２９４０μＬのアッセイバッファーに添加する。この溶液は、使用する日に調製する。

５．ビオチン化されたマウス抗イディオタイプＩＰ１０ ６Ａ５ ＭＡｂ １０Ｃ８
−７０℃でアリコートに保管した。使用する前に、各アリコートを室温で融解した。アッセイバッファー中で最終的に１μｇ／ｍＬを調製し、アッセイのためのプレートの被覆に用いた。この試薬の新たなロットのそれぞれは、以前のロットに対して滴定されなくてはならず、以前のロットで観察された結果に等しい結果をもたらす希釈度でアッセイにおいて用いられなくてはならない。

６．Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇで標識されたマウス抗イディオタイプＩＰ１０ ６Ａ５ ＭＡｂ ２３Ｈ１０
試薬をアリコートに分け、−７０℃で保管した。アッセイバッファー中のＳｕｌｆｏ−Ｔａｇで標識されたマウス抗イディオタイプＩＰ１０ ６Ａ５ ＭＡｂ ２３Ｈ１０の最終濃度２５ｎｇ／ｍＬの溶液を、アッセイのために調製した。この試薬の新たなロットのそれぞれは、以前のロットに対して滴定しなくてはならず、以前のロットで観察された結果に等しい結果をもたらす希釈度でアッセイにおいて用いなくてはならない。

７．ＭＳＤ読み取りバッファーＴ（２倍）
試薬を室温で保管した。最終的な２倍溶液を、使用前に５ｍＬのｄＩＨ２Ｏ中に５ｍＬのＭＳＤ読み取りバッファーＴ（４倍）を希釈することによって調製した。

Ｂ．標準の調製
１．ＭＤＸ−１１００希釈標準溶液の調製
２０μＬの０．９９ｍｇ／ｍＬのストック溶液を１７８μＬのヒト血清に添加して、１００μｇ／ｍＬを含有する溶液を得た。アッセイバッファー中でのさらなる５０倍希釈を行い、２％ヒト血清中２０００ｎｇ／ｍＬの溶液（希釈標準溶液１）を得、２０００ｎｇ／ｍＬの溶液を２％ヒト血清中にさらに２０倍希釈して、１００ｎｇ／ｍＬ（希釈標準溶液２）を得た。この希釈標準溶液は、調製した日に使用した。過剰量の溶液は廃棄した。

２． ２％ヒト血清における校正標準曲線の作成
標準曲線を、以下に記載するように、アッセイバッファー／２％ヒト血清において作成した。
注：容量は１プレートについての十分量である。比例的な容量を必要に応じて調製した。
表８
検量線の作成

* 記載されるＭＤＸ−１１００濃度は、１００％ ヒト血清中のものである。

３．品質管理試料の調製
（１）１００％ヒト血清中のＭＤＸ−１１００ ＱＣ試料の調製
２０μＬの０．９９ｍｇ／ｍＬのＭＤＸ−１１００ストック溶液を９７０μＬのヒト血清で希釈して、２００００ｎｇ／ｍＬを含有する溶液を得た。１５０００、１００００、６０００、１０００、および５００ｎｇ／ｍＬ（ＵＬＯＱ、高、中、低、およびＬＬＯＱ）のＱＣ試料を得るための、ヒト血清での２００００ｎｇ／ｍＬの溶液の適切な希釈液を調製した。ＱＣ試料を、２５μＬのアリコート中で、−７０℃で保管した。
表９
品質管理サンプルの調製

* 記載されるＭＤＸ−１１００の濃度は、１００％ ヒト血清中である。

（２）２％ヒト血清中のＱＣ試料（高、中、低、ＬＬＯＱ、および希釈液）の調製
アッセイの範囲内で、アッセイの最小必要希釈度まで、ＱＣ試料を調製するために、各ＱＣ試料の１：５０希釈液を、上記で調製された１０μＬの１００％ヒト血清ＱＣ試料を４９０μＬのアッセイバッファーに添加することによって調製して、２％ヒト血清中に１５０００、１００００、６０００、１０００、および５００ｎｇ／ｍＬを含有するＱＣ試料を提供した。これらの希釈液は、分析日に調製した。

４．アッセイ手順
特定しない限り、全ての工程は、２００ｒｐｍの速度の振とう機上で、２２℃で行った。プレートは、別段の記載がない限り、覆ってインキュベートした。
１）９６ウェルのストレプトアビジンで被覆されたＭＳＤプレートを、ブロッキングバッファー（ＤＰＢＳ中５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で少なくとも３０分にわたり２２℃で振とう機上でブロックした。
２）５０μＬのビオチン化された１０Ｃ８（アッセイバッファー中１μｇ／ｍＬ）をプレートに添加した。プレートをプレート密封剤で覆い、２２℃で６０±３０分間にわたり振とう機上でインキュベートした。
３）プレートを、３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
４）アッセイバッファー／２％ヒト血清バッファー中５０μＬの標準、ＱＣ、および試料をプレートに添加した。プレートを、２２℃で１２０±３０分間にわたり振とう機上でインキュベートした。
５）プレートを、３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
６）５０μＬのｓｕｌｆｏ−ｔａｇ ２３Ｈ１０（アッセイバッファー中２５ｎｇ／ｍＬ）をプレートに添加した。プレートを、６０±３０分間にわたり振とう機上でインキュベートした。
７）プレートを、３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
８）１５０μＬのＭＳＤ読み取りバッファーＴ（ｄＩＨ２Ｏ中で２倍）を添加した。プレートを、１０分間以内にＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００で読み取った。

結果
１．標準曲線範囲
２％ヒト血清中のＭＤＸ−１１００の２５０〜１５０００ｎｇ／ｍＬの範囲の１１点の校正標準曲線を、各分析ランにおいて２回ずつアッセイした。２５０ｎｇ／ｍＬの標準はアンカーポイントであり、許容基準に従うものではない（データは示さず）。

２．正確性および精度
方法の正確性を、その理論値からの予測濃度の偏差を計算することによって判定した。ＳＡＳにおける一元配置ＡＮＯＶＡを用いて得られた、３つの分析参照標準およびＱＣに基づく正確性および精度の情報を、表１０および１１に列挙する。ＱＣでのアッセイ内精度は７．２％以内であり、アッセイ間精度は１０．９％以内であった。参照標準でのアッセイ内精度は６．７％以内であり、アッセイ間精度は６．４％以内であった。ＱＣの正確性は、理論値の±１５．６％以内であった。参照標準の正確性は、理論値の±５．４％以内であった。
表１０
ＭＤＸ−１１００についてのＱＣ正確度および精度

１００％ヒト血清中の濃度ｎｇ／ｍＬ

２．選択性およびマトリックス干渉
方法における選択性およびマトリックス干渉を、１０の個別の潰瘍性大腸炎患者の血清を用いて評価した。スパイクされていないものおよびスパイクされたものの両方の各マトリックスロットを、５００ｎｇ／ｍＬ（ＬＬＯＱ）で、アッセイにおいてランした。スパイクされていないマトリックスロットは全て、定量レベルを下回って定量されたが、１０のスパイクされたマトリックスロットの逆算された濃度は全て、ＬＬＱＣの６．７％以内であった。表１２は、このアッセイにおいてマトリックス干渉が観察されないことを示す。

３．ヒト血清中の希釈度の直線性
ＭＤＸ−１１００の希釈度の直線性を、２．５ｍｇ／ｍＬのＱＣ試料をアッセイバッファーでまず５０倍希釈し、次いで、アッセイバッファー／２％ヒト血清中で１０倍連続希釈することによって判定した。これらの個別の希釈度を、標準曲線およびＱＣ試料で分析した。表１３にまとめた結果は、個別に希釈された試験試料の予測濃度が公称値の±１０％以内であったことを示した。データは、研究試料が、アッセイの正確性および精度に悪影響を及ぼすことなく、アッセイバッファー／２％ヒト血清中で少なくとも５０，０００倍希釈され得たことを実証した。
表１３
ＭＤＸ−１１００の希釈の直線性

４．特異性
ＩＰ１０およびヘパラン硫酸を、次の濃度、すなわち（ａ）０、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌのＩＰ１０；および（ｂ）０、５００、５０００、５００００ｎｇ／ｍｌのヘパラン硫酸で組み合わせ、低ＱＣ、中ＱＣ、および高ＱＣの定量との考えられる推定を試験するために用いた。

潜在的な干渉試薬の組み合わせのそれぞれを、マトリックスブランク、ＨＱＣ、ＭＱＣ、およびＬＱＣにおいて試験した。試料を１時間にわたり室温でインキュベートした。表１４にまとめた結果は、５００００ｎｇ／ｍＬのヘパラン硫酸＋１０００ｎｇ／ｍＬのＩＰ１０でスパイクすると、ＱＣの全ては、スパイクされていないものと比較して２５％以上の差を示し；一方、５０００ｎｇ／ｍＬのヘパラン硫酸＋１００ｎｇ／ｍＬのＩＰ１０、および５００ｎｇ／ｍＬのヘパラン硫酸＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＰ１０でスパイクすると、ＱＣの全ては、スパイクされていないＱＣと比較して１４．５％以下の差を示すことを示し、ここで、差のパーセントは、スパイクされたものとスパイクされていないものとの間のものである。

５．イソＡｓｐ−ＭＤＸ−１１００の回収率
異性化はＭＤＸ−１１００において年間６％の割合で生じるため、アッセイの回収率を、１００００、５０００、２５００ｎｇ／ｍＬのレベルの融解したばかりのＭＤＸ−１１００と精製されたイソＡｓｐ−ＭＤＸ−１１００とを比較することによって評価した。表１５にまとめた結果は、３つのレベルで、２つの形態の薬剤の回収率の差が観察されないことを示した。

結論として、ヒト血清中のＭＤＸ−１１００の定量のための特異的な、精度の高い、かつ正確なＭＳＤ免疫アッセイが、希釈されていないヒト血清中で２５０ｎｇ／ｍＬ〜１５，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の標準曲線濃度にわたって開発された。
表１５
ＭＤＸ−１１００およびイソＡｓｐ−ＭＤＸ−１１００のスパイク回収の比較

（実施例４）
正常なヒト血清中のＭＤＸ−１１００の定量的決定のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
方法の説明
この酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ヒト血清中のＭＤＸ−１１００を検出するために設計されている。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎで被覆されたプレートを、アッセイバッファー中１．５μｇ／ｍＬの濃度のビオチン化された抗ＭＤＸ−１１００マウスモノクローナル抗体（クローン１０Ｃ８）で被覆する。校正物質、対照および試料を、アッセイバッファー中でアッセイＭＲＤ（１：１０００）まで希釈し、プレート上でインキュベートして、ＭＤＸ−１１００を捕捉する。次いで、捕捉されたＭＤＸ−１１００を、アッセイバッファー中で０．２５μｇ／ｍＬの濃度のＨＲＰで標識された抗ＭＤＸ−１１００マウスモノクローナル抗体（クローン２３Ｈ１０）を用いて検出する。ＴＭＢをＨＲＰ基質として添加する。停止溶液を添加した後にプレートをＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダーで読み取り、測定された光学密度（ＯＤ）は、プレート上のＭＤＸ−１１００の濃度に直接比例する。

分析物の濃度は、重み係数１／応答２を伴う５パラメータロジスティック回帰モデルを用いて適合している標準曲線からの内挿によって決定する。最小必要試料容量は１０．０μＬである。ＭＲＤは１：１０００である。校正範囲は１．２５〜３２０μｇ／ｍＬであり、定量範囲は２．５μｇ／ｍＬ〜３２０μｇ／ｍＬである。試料は約−８０℃で保存する。

直線性および校正標準
１０の校正標準を、１．２５〜３２０μｇ／ｍＬの範囲にわたって、このバリデーション実験に利用した。標準曲線は、重み係数１／応答２を伴う５パラメータロジスティック方程式と適合するものであった。適合の良好性は、許容可能なランから得られた１３の標準曲線の平均から０．９９７２であると計算された。

精度および正確性
精度および正確性を、定量下限（ＬＬＯＱ）から定量上限ＵＬＯＱ）までの範囲の濃度で品質管理（ＱＣ）を分析することによって判定した。以下のＱＣレベルを分析した：ＬＬＯＱ（ＱＣ４＝２．５０μｇ／ｍＬ）、バックアップＬＬＯＱ（ＱＣ５；５．００μｇ／ｍＬ）、低ＱＣ（ＱＣ１；７．５０μｇ／ｍＬ）、中ＱＣ（ＱＣ２；１２０μｇ／ｍＬ）、高ＱＣ（ＱＣ３；２００μｇ／ｍＬ）、バックアップＵＬＯＱ（ＱＣ６；２４０μｇ／ｍＬ）、およびＵＬＯＱ（ＱＣ７；３２０μｇ／ｍＬ）。精度は、各プールの変動係数パーセント（ＰＣＶ）として表した。正確性は、理論値からの差のパーセント（ＰＤＴ）として表した。これらの式を以下に示す（式を参照されたい）。全ての精度および正確性の値は、データの許容性を判定する前に、四捨五入して最も近い整数とした。
変動係数パーセント（ＰＣＶ）：
ＰＣＶ＝（標準偏差／平均）×１００
理論値からの差のパーセント（ＰＤＴ）：
ＰＤＴ＝［１００×（（計算された濃度の平均−理論的濃度）／理論的濃度）］
差のパーセント：
差のパーセント＝１００×［｜値１−値２｜／（（値１＋値２）／２）］

正常なヒト血清におけるアッセイ内の精度および正確性
各ＱＣレベル（ＱＣ１〜７）のレプリケート（１２ウェル）６セットを個別のランにおいて分析して、各ＱＣのアッセイ内の精度および正確性を決定した。精度の許容基準を満たすために、ＱＣ１〜３および５〜７のアッセイ内試料は≦２０％の全体的なＰＣＶ値を有すると予想され、ＱＣ４は≦２５％の全体的なＰＣＶ値を有すると予想された。正確性の許容基準を満たすために、ＱＣ１〜３およびＱＣ５〜７のアッセイ内試料は±２０％以内の全体的なＰＤＴ値を有すると予想され、ＱＣ４は±２５％以内の全体的なＰＤＴ値を有すると予想された。

アッセイ内の精度および正確性の分析は、ラン１ＪＨＸ２（ＱＣ１〜３）、２ＪＨＸ２（ＱＣ４〜６）、および６ＪＨＸ２（ＱＣ７）において行った。全ＱＣレベルでのアッセイ内試料でのＰＣＶ値が許容可能であり、ＱＣ４（ＬＬＯＱ）での３％からＱＣ５（バックアップＬＬＯＱ）での１４％までの範囲であった。全ＱＣレベルについてのアッセイ内の精度および正確性の試料でのＰＤＴ値もまた許容基準内にあり、−８％（ＱＣ７；ＵＬＯＱ）〜１３％（ＱＣ１およびＱＣ２）までの範囲であった。これらのデータを表１６に示す。

正常なヒト血清におけるアッセイ間の精度および正確性
各ＱＣレベル（ＱＣ１〜７）の２つのレプリケートをそれぞれ含有する７つの許容可能なラン（１〜６ＪＨＸ２および８ＪＨＸ２）からのデータを用いて、アッセイ間の精度および正確性を決定した。精度基準を満たすために、ＱＣ１〜３およびＱＣ５〜７のアッセイ間試料は≦２０％の全体的なＰＣＶ値を有すると予測され、ＱＣ４は≦２５％の全体的なＰＣＶ値を有すると予想された。全ＱＣレベルでのＰＣＶ値が許容可能であり、９％（ＱＣ２およびＱＣ３）〜１４％（ＱＣ５）までの範囲であった。正確性の許容基準を満たすために、ＱＣ１〜３およびＱＣ５〜７のアッセイ間試料は±２０％以内のＰＤＴ値を有すると予想され、ＱＣ４は±２５％以内のＰＤＴ値を有すると予想された。全ＱＣレベルについてのＰＤＴ値が許容可能であり、−３％（ＱＣ１およびＱＣ７）〜２％（ＱＣ２およびＱＣ３）までの範囲であった。アッセイ間の精度および正確性についてのこれらのデータを表１７に示す。バリデーション校正物質およびＱＣを用いる全てのバリデーションランから得られたＱＣ１〜７についてのデータの完全なリストを表１８に提供する。

アッセイ感度
アッセイ感度を、ＱＣ４（ＬＬＯＱ）の正確性および精度を判定することによって評価した。ＱＣ４が２５％未満のＰＣＶ値および±２５％以内のＰＤＴ値を有するであろうことが予想された。ＱＣ４の２つのレプリケートを、ラン１ＪＨＸ２〜８ＪＨＸ２においてプレーティングし、これらのランの１つ（７ＪＨＸ２）は、中ＱＣ（ＱＣ２；１２０μｇ／ｍＬ）の許容不可能なＱＣ定量に起因して拒絶された。７つの許容可能なランにおいて、ＱＣ４は、許容可能限界内に十分に収まる１３％の平均ＰＣＶ値および０％の平均ＰＤＴ値を有していた（表１７）。これらのデータは、ＩＣＤ４２６のアッセイ感度がＬＬＯＱで許容可能であることを示す。

希釈度の直線性およびフック効果
標準曲線の上限を元々超える試料を希釈する能力を、曲線の上にあるＱＣプール（ＱＣ８）から調製された一連の希釈液を評価することによって判定した。ＱＣ８は、ＭＤＸ−１１００ストック（１０，２００μｇ／ｍＬ）を、プールされた正常なヒト血清中に１：２０で希釈して、５１０μｇ／ｍＬの濃度を達成することによって調製した。この濃度は、ＰＰＤ’ｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＳＯＰ Ｎｏ．：ＬＰ−ＰＡＬ−１０１３）のガイドラインに従ってＱＣ８で少なくとも９５％の血清を維持するために達成され得た、最も高い濃度であったことに留意されたい。５１０μｇ／ｍＬ、４０８μｇ／ｍｌ（Ｄｉｌ １．２５）、１３６μｇ／ｍＬ（Ｄｉｌ ３．７５）、４５．３μｇ／ｍＬ（Ｄｉｌ １１．２５）、１５．１μｇ／ｍＬ（Ｄｉｌ ３３．７５）、５．０４μｇ／ｍＬ（Ｄｉｌ １０１．２５）、および１．６８μｇ／ｍＬ（Ｄｉｌ ３０３．７５）を含む、定量範囲を上回る、定量範囲の間の、および定量範囲を下回る最終濃度を有するＱＣ８の希釈液を調製した。各希釈レベルの２つのレプリケートをラン８ＪＨＸ２において分析した（ｎ＝２、４ウェル）。

Ｄｉｌ ３．７５〜Ｄｉｌ １０１．２５（定量範囲内）の範囲の希釈係数を有する試料は−１６％〜−２％の範囲のＰＤＴ値を有し、ＰＤＴが±２０％以内であるという許容基準を満たした。定量範囲を超える（Ｄｉｌ １およびＤｉｌ １．２５）または下回る（Ｄｉｌ ３０３．７５）希釈された分析物濃度を有する試料は、それぞれ、＞ＵＬＯＱまたは＜ＬＬＯＱの応答を有していた。したがって、希釈度の直線性は、このアッセイに許容可能であると考えられる。

プロゾーン効果またはフック効果は、ＱＣ８試料（５１０μｇ／ｍＬ）およびＱＣ８ Ｄｉｌ １．２５試料（４０８μｇ／ｍＬ）の応答を、ＣＡＬ１０（３２０μｇ／ｍＬ；ＵＬＯＱ）の応答に対して比較することによって調べた。各希釈液の両レプリケートは、ＣＡＬ１０で記録された値よりも大きなＯ．Ｄ．値を有していたが、ＵＬＯＱを超える検量線を外挿することによっては定量されなかった。したがって、３２０μｇ／ｍＬのＵＬＯＱを超え５１０μｇ／ｍＬを含むＭＤＸ−１１００濃度では、フック効果はなかった。

選択性（マトリックス効果）
選択性は、分析方法の、生体マトリックスにおける他の成分の存在下で目的の分析物を区別および定量する能力である。選択性を、正常なヒト血清、ならびに２つの疾患状態、すなわち潰瘍性大腸炎およびクローン病において試験した。正常集団および疾患状態集団のそれぞれで、選択性を、少なくとも１０人の個別のドナー（５人の男性および５人の女性）から得た血清を低ＱＣ（ＱＣ１、７．５μｇ／ｍＬ）およびブランクレベルで分析することによって判定した。スパイクされたおよびスパイクされていない試料それぞれの１つのレプリケートを分析した（ｎ＝１、２ウェル）。各ドナー集団（正常、潰瘍性大腸炎、およびクローン病）で、低スパイクの８０％が基準を満たし（理論値で、理論値の２０％以内の定量）、スパイクされていないマトリックスのロットはＬＬＯＱを下回って定量することが予想された。

選択性を、ラン３ＪＨＸ２において、正常なヒト血清で試験した。ブランクの正常な血清の選択性試料（ＳＰ１〜１０）の全ては、ＬＬＯＱを下回ってスクリーニングした。低ＱＣレベル（７．５μｇ／ｍＬ）でスパイクされると、強化された正常なヒト血清試料（ＳＰＦ１〜１０）の１０個全ては、±２０％以内のＰＤＴ値で定量し、０％〜２０％の範囲であった。これらのデータを表１９Ａにまとめる。

選択性を、ラン４ＪＨＸ２において、１０人の潰瘍性大腸炎個体から得られた血清で試験した。ブランクの潰瘍性大腸炎血清試料（ＳＰ１１〜２０）の全ては、ＬＬＯＱを下回って定量した。低ＱＣレベル（７．５μｇ／ｍＬ）でスパイクされると、強化された潰瘍性大腸炎個体（ＳＰＦ１１〜２０）の１０人全ては、±２０％以内のＰＤＴ値で定量し、−２％〜１８％の範囲であった。これらのデータを表１９Ｂにまとめる。

選択性を、ラン１２ＪＨＸ２において、１０人のクローン病個体から得られた血清で試験した。ブランクのクローン病血清試料（ＳＰ２１〜３０）の全ては、ＬＬＯＱを下回って定量した。低ＱＣレベル（７．５μｇ／ｍＬ）でスパイクされると、強化されたクローン病個体（ＳＰＦ２１〜３０）の１０人全ては、±２０％以内のＰＤＴ値で定量し、−１５％〜６％の範囲であった。これらのデータを表１９Ｃにまとめる。

全体として、正常および疾患状態から得られた選択性試料の１００％が、ブランクレベルおよび低ＱＣレベルで許容基準を満たした。これらの選択性のデータの全てを表１９にまとめる。

干渉（溶血）
研究試料の定量に対する溶血の影響を、溶血した血清中で調製されたブランク試料およびスパイクされた（低および高ＱＣ）試料を分析することによって評価した。低レベルの溶血（販売者によって特定されるところによると、およそ７０ｍｇ／ｄＬのヘモグロビン濃度）を示す１０人の個別のドナー、および高レベルの溶血（販売者によって特定されるところによると、およそ５５０ｍｇ／ｄＬのヘモグロビン濃度）を示す１０人の個別のドナーを、正常なヒト血清において作成された、作成したばかりの検量線を用いて評価した。ブランク試料、低ＱＣ試料、および高ＱＣ試料の単一のレプリケート（ｎ＝１、２ウェル）を、各溶血した試料から調製し、分析した。スパイクされた溶血試料のそれぞれについての溶血データは、＜２０％のＰＣＶ値を有すると予想され、平均値の正確性は、そのプールの理論値の±２０％以内であると予想された。ブランク試料は、２０％未満のＰＣＶを有すると予想され、ＬＬＯＱ未満で定量する。各レベルの溶血試料の少なくとも８０％が許容基準を満たす必要があった。

低レベルの溶血を示す試料における干渉
低レベルの溶血を示す１０の個別の試料を、ラン１０ＪＨＸ２において分析した。ブランクレベルで分析された１０の個別の試料（ＨＳ１〜１０）の１つは３３％のレプリケートＰＣＶ値を有し、許容基準を満たさなかったが、この試料についての二重反復測定の両方は、ＣＡＬ１（アンカー）およびＬＬＯＱを下回って定量した。残りの９のブランク個体はＬＬＯＱを下回って定量し、ＰＣＶ値は１３％以下であった。低ＱＣレベルでスパイクされた個別の試料（ＨＥＭＱＣ１〜１０）の１０個全ては、０％〜６％の範囲の許容可能なＰＣＶ値および−１８％〜−１％の範囲の許容可能なＰＤＴ値を有していた。高ＱＣレベルでスパイクされた１０の個体（ＨＥＭＱＣ１１〜２０）の１つは、許容可能なＰＤＴで定量できなかった（ＨＥＭＱＣ１２；ＰＤＴ＝−２３％）。高ＱＣレベルでスパイクされた残りの９の個体は、０％〜５％の範囲の許容可能なＰＣＶ値および−７％〜１６％の範囲の許容可能なＰＤＴ値を有していた。全体として、低レベルの溶血を示す試料の許容基準は、ブランク（９０％許容可能）、低（１００％許容可能）、および高（９０％許容可能）ＱＣレベルで満たされた。これらのデータを表２０Ａにまとめる。

高レベルの溶血を示す試料における干渉
高レベルの溶血を示す１０の個別の試料を、ラン１１ＪＨＸ２において分析した。ブランクレベルで分析された１０の個別の試料（ＨＳ１０１〜１１０）の１つは２４％のレプリケートＰＣＶ値を有し、許容基準を満たさなかったが、この試料についての二重反復測定の両方は、ＣＡＬ１（アンカー）およびＬＬＯＱを下回って定量した。残りの９のブランク個体はＬＬＯＱを下回って定量し、ＰＣＶ値は１６％以下であった。低ＱＣレベルでスパイクされた個別の試料（ＨＥＭＱＣ１０１〜１１０）の１０個全ては、１％〜６％の範囲の許容可能なＰＣＶ値および−１５％〜８％の範囲の許容可能なＰＤＴ値を有していた。高ＱＣレベルでスパイクされた個体（ＨＥＭＱＣ１１１〜１２０）の１０個全ては、０％〜６％の範囲の許容可能なＰＣＶ値および−７％〜１２％の範囲の許容可能なＰＤＴ値を有していた。全体として、高レベルの溶血を示す試料の許容基準は、ブランク（９０％許容可能）、低（１００％許容可能）、および高（９０％許容可能）ＱＣレベルで満たされた。これらのデータを表２０Ｂにまとめる。

マトリックスにおける分析物の安定性
２〜８℃での融解されたマトリックスの安定性
融解されたマトリックスにおけるＭＤＸ−１１００の安定性を２〜８℃で評価して、一定期間にわたり融解状態で試料を保持することが正常なヒト血清における分析物の安定性に悪影響を及ぼすかどうかを決定した。低ＱＣおよび高ＱＣの６つのレプリケート（ｎ＝６、１２ウェル）を融解し、冷蔵庫内におよそ２４時間置き、その後５ＪＨＸ２において分析した。安定性試料のデータが許容可能であると考えられるために、反復測定のＰＣＶは２０％を超えないと予想され、各レベルについての平均値の正確性は理論的濃度の２０％以内であると予想された。低安定性および高安定性のＱＣの全体的なＰＣＶは、それぞれ４％および５％であった。低および高ＱＣの理論値からの差のパーセントは、それぞれ−１１％および１０％であった。これらのデータは、ＭＤＸ−１１００が２〜８℃でおよそ２４時間にわたり安定であることを示す。

室温での安定性
室温（ベンチトップ）での安定性を決定するために、低ＱＣおよび高ＱＣの６つのレプリケート（ｎ＝６、１２ウェル）を融解し、室温でおよそ２４時間置き、その後６ＪＨＸ２において分析した。許容基準を満たすために、安定な試料は、≦２０％のＰＣＶを有し、理論濃度の２０％以内で定量するはずであった。低安定性および高安定性のＱＣの全体的なＰＣＶは、それぞれ９％および８％であった。低および高ＱＣの理論値からの差のパーセントは、それぞれ−１２％および６％であった。これらのデータは、ＭＤＸ−１１００が融解されたマトリックスにおいて室温でおよそ２４時間にわたり安定であることを示す。

凍結融解の安定性
凍結融解の安定性を、低および高ＱＣを５回サイクルした後に判定した。各サイクルは、試料を凍結状態（第１のサイクルでは少なくとも２４時間、および全てのその後のサイクルでは少なくとも１２時間にわたる）に維持し、次いで、試料を周囲室温で少なくとも３０分間、しかし２時間未満にわたり維持することからなるものであった。サイクルされた低ＱＣおよび高ＱＣの６つのレプリケート（ｎ＝６、１２ウェル）を、９ＪＨＸ２において分析した。許容基準を満たすために、凍結融解試料は、≦２０％のＰＣＶを有すること、および理論的濃度の２０％以内で定量することが予想された。低安定性および高安定性のＱＣの全体的なＰＣＶは、それぞれ４％および８％であった。低および高ＱＣの理論値からの差のパーセントは、それぞれ−１３％および−８％であり、したがって、５回の凍結融解サイクルでの安定性が確立される。

−２０℃および−８０℃での短期間の安定性
凍結された校正標準の使用をバリデーションするために、凍結されたヒト血清中でのＭＤＸ−１１００の安定性を、バリデーションの間に使用される最も古い校正標準またはＱＣプールの古さに及ぶ期間にわたり実証した（１５日間）。これを試験するために、−２０℃および−８０℃で１５日間にわたり凍結されたＬＱＣおよびＨＱＣを、作成したばかりの検量線および許容ＱＣと比較した。各温度でのＬＱＣ試料およびＨＱＣ試料の６つのレプリケート（ｎ＝６、１２ウェル）を、１４ＪＨＸ２においてアッセイした。許容基準を満たすために、両温度で保管された短期間安定性試料は、≦２０％でなくてはならないＰＣＶ値を有さなくてはならず、ＰＤＴ値は±２０％以内でなくてはならない。−８０℃での低および高の短期間安定性試料の全体的なＰＣＶは、それぞれ１６％および５％であり、ＰＤＴ値はそれぞれ０％および１３％であった。−２０℃の短期間安定性試料では、全体的なＰＣＶ値はそれぞれ７％および４％であり、ＰＤＴ値はそれぞれ−６％および４％であった。これらのデータは、ＭＤＸ−１１００が、−８０℃または−２０℃でおよそ１５日間にわたり保管された場合に、正常なヒト血清中で安定であることを示す。

ＩＣＤ４２６とＩＣＤ２７４とのクロスバリデーション
方法の変更を評価し、方法ＩＣＤ４２６を用いて得られた結果が方法ＩＣＤ２７４を用いて得られた結果と一致するかどうかを決定するために、高い、中程度の、および低い実験濃度の代表であったＢＭＳ研究ＩＭ１２９−００４（ＰＰＤ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｄｅ：ＮＤＴ）において分析された試料をプールして（プール当たり≧３の個別の試料）、１５の試験試料プールを生成した。各プールされた試料の１つのレプリケート（ｎ＝１、２ウェル）、ならびに方法ＩＣＤ２７４において列挙されている各許容ＱＣ（ＱＣ１：３μｇ／ｍＬ；ＱＣ２：７．５μｇ／ｍＬ；ＱＣ３：２５μｇ／ｍＬ）の２つのレプリケート（ｎ＝２、４ウェル）を、方法ＩＣＤ４２６およびＩＣＤ２７４を用いて分析した。方法がクロスバリデーションされたと考えられるために、プールされた試料についての結果の２／３、およびＱＣレベルの３／４が、≦２０％の差のパーセント（ＤＩＦＦ％）（ＩＣＤ４２６を用いて得られた値対、ＩＣＤ２７４を用いて得られた値）を有すると予想された。別個のプロジェクトコードであるＪＨＸ４は、以前にバリデーションされた方法（ＩＣＤ２７４）を用いて得られたデータをＡｓｓｉｓｔにインポートするために生成された。

クロスバリデーションのランは、ラン１３ＪＨＸ２および１ＪＨＸ４において最初に行った。１５の試料プールのうち、１３（８７％）は許容基準を満たし、％ＤＩＦＦ値は３％〜１８％の範囲であった。２つの残りのプールは、２９％および３８％のＤＩＦＦ値％を有していた。全体として、プールされた試料の８７％が、クロスバリデーションの許容基準を満たした。

ＱＣ１〜３をまた、１３ＪＨＸ２および１ＪＨＸ４において分析した。ＱＣ２およびＱＣ３は、それぞれ１３％および７％のＤＩＦＦ％を有し、許容基準を満たした。ＱＣ１は許容基準を満たすことができず、％ＤＩＦＦ値は３５％であった。ＱＣ１のための方法の間の第２の比較を、ラン１４ＪＨＸ２および２ＪＨＸ４においてＱＣ１の４つのレプリケート（ｎ＝４、８ウェル）をプレーティングすることによって行った。１つの異常値が１４ＪＨＸ２において同定され、比較のために除去された。ＱＣ１のこの第２の比較でのＤＩＦＦ％は１８％であった。総合すると、プールされた試料とＱＣとの比較のための全ての許容基準は、方法ＩＣＤ４２６とＩＣＤ２７４とをクロスバリデーションするために満たされた。

ＳＯＰ偏差
バリデーションの間にＳＯＰ偏差は認められなかった。

均等物
当業者は、通常の実験を用いるだけで、本明細書において記載された本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができよう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものである。

Claims (25)

1. （ａ）所定用量の抗ＩＰ１０抗体を対象に投与し；
   （ｂ）前記対象の試料中の抗ＩＰ１０抗体のレベルを検出し；次いで
   （ｃ）工程（ｂ）からの抗ＩＰ１０抗体のレベルが、閾値曝露レベル以下である場合、対象におけるＩＰ１０関連疾患が治療されるように、対象における抗ＩＰ１０抗体の用量を増加させること：
   を特徴とする、治療を必要とする対象におけるＩＰ１０関連疾患の治療方法。
2. 前記抗ＩＰ１０抗体が、ヒトＩＰ１０に特異的に結合し、ヒトＭＩＧまたはヒトＩＴＡＣと交差反応しないものである、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗ＩＰ１０抗体が、ＭＤＸ−１１００である、請求項２に記載の方法。
4. 前記抗ＩＰ１０抗体が、
   （ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
   （ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
   を含むものである、請求項１に記載の方法。
5. 前記抗ＩＰ１０抗体が、
   （ａ）配列番号：３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
   （ｂ）配列番号：４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
   （ｃ）配列番号：５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
   （ｄ）配列番号：８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
   （ｅ）配列番号：９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
   （ｆ）配列番号：１０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
   を含むものである、請求項４に記載の方法。
6. 工程（ｂ）における抗ＩＰ１０抗体のレベルが、前記試料を、抗体抗原複合体の形成に適する条件下において、抗ＩＰ１０抗体に結合する抗体と接触させ、次いで、前記抗体抗原複合体の形成を検出することを特徴とする方法によって検出されるものである、請求項１に記載の方法。
7. 前記抗ＩＰ１０抗体に結合する抗体が、抗イディオタイプ抗体である、請求項６に記載の方法。
8. 前記抗イディオタイプ抗体が、ＭＤＸ−１１００の１つまたはそれ以上のＣＤＲに結合するものである、請求項６に記載の方法。
9. 前記抗イディオタイプ抗体が、１０Ｃ８、６Ｃ９、２Ｆ５および２３Ｈ１０から選択されるものである、請求項８に記載の方法。
10. 前記抗イディオタイプ抗体が、１０Ｃ８である、請求項９に記載の方法。
11. 前記抗イディオタイプ抗体が、２３Ｈ１０である、請求項９に記載の方法。
12. 前記検出が、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、間接競合免疫アッセイ、直接競合免疫アッセイ、非競合免疫アッセイ、サンドウィッチ免疫アッセイおよび凝集アッセイからなる群から選択される方法によって行われるものである、請求項６に記載の方法。
13. 前記ＩＰ１０関連疾患が、炎症または自己免疫疾患である、請求項１に記載の方法。
14. 前記炎症または自己免疫疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、炎症性皮膚障害（例えば、乾癬、扁平苔癬）、自己免疫性甲状腺疾患（例えば、グレーブス疾患、橋本甲状腺炎）、シェーグレン症候群、肺の炎症（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺サルコイドーシス、リンパ性肺胞炎）、移植拒絶反応、脊髄損傷、脳傷害（例えば、脳卒中）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）、歯肉炎、遺伝子治療誘発性炎症、血管形成の疾患、炎症性腎臓疾患（例えば、ＩｇＡ腎障害、膜性増殖性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎）およびアテローム性動脈硬化症から選択されるものである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記炎症または自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記炎症性腸疾患が、クローン病である、請求項１５に記載の方法。
18. 抗ＩＰ１０抗体に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
19. 前記抗体が、抗イディオタイプ抗体である、請求項１８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
20. 前記抗ＩＰ１０抗体が、ＭＤＸ−１１００である、請求項１８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
21. 前記抗体が、ＭＤＸ−１１００の１つまたはそれ以上のＣＤＲに結合するものである、請求項２０に記載の抗体またはその抗原結合部分。
22. 前記抗体が、１０Ｃ８、６Ｃ９、２Ｆ５および２３Ｈ１０から選択されるものである、請求項２１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
23. 請求項１８に記載のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
24. （１）抗ＩＰ１０抗体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分；および（２）抗体抗原複合体の形成を容易にするために必要な試薬を含む、キット。
25. （ａ）抗ＩＰ１０抗体を対象に投与し；
    （ｂ）前記対象の試料中の抗ＩＰ１０抗体のレベルを免疫アッセイによって検出し；次いで
    （ｂ）抗ＩＰ１０抗体のレベルが、閾値曝露レベル以下である場合、対象における抗ＩＰ１０抗体の用量を増加させ；抗ＩＰ１０抗体のレベルが、閾値曝露レベルまたはそれ以上である場合、対象における抗ＩＰ１０抗体の用量を増加させないこと
    を特徴とする、治療を必要とする対象におけるＩＰ１０関連疾患の治療方法。

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