JP2014064477A - 酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法 - Google Patents

Abstract

【課題】高温下での生育能力や酢酸発酵能力を備えた、酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法を提供すること。
【解決手段】酢酸菌の酢酸耐性能、及び耐熱性かつ酢酸過酸化に関与する遺伝子を取得し、該遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させるよう改変することによって酢酸生産能が向上した酢酸菌を育種する。この酢酸生産能が向上した酢酸菌をエタノール含有培地で培養することにより、高酢酸濃度の食酢を効率良く製造することができる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法、より詳しくは、酢酸菌において発現する特定のタンパク質の機能を低下又は欠損させることにより、高温下での生育能力や酢酸生産能が低下せずに酢酸発酵を行うことができる能力（酢酸発酵能力）を発揮することのできる酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法酢酸菌の育種方法に関する。

酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属（Acetobacter）やグルコンアセトバクター属（Gluconacetobactor）に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。例えば、アセトバクター属酢酸菌の培養においては、発酵温度が３０℃より高くなると急激に生育能力及び酢酸発酵能力が低下する。このため、通常の発酵は２５℃〜３０℃で行われる。しかし、夏期には気温が３０℃以上になること、また、発酵によって熱が発生するため、酢酸発酵が進むにつれて発酵層が４０〜４５℃以上となってしまうことがある。したがって発酵槽を２５℃〜３０℃に保つための冷却設備が必要となるが、その費用負担は大きい。

また、酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになる。しかし、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて、酢酸菌の生育能力や酢酸発酵能力は次第に低下する。さらに、酢酸菌の培養過程において、ある一定の時間が過ぎると、酢酸菌は自らが作り出した酢酸を資化・利用して、再び生育を開始する。この現象を酢酸過酸化というが、この現象もまた、酢酸菌の酢酸生産能に大きく影響を及ぼす。

したがって、酢酸の安定生産を達成するために、高い酢酸生産能を有する酢酸菌、すなわち、高温においても高い生育能力をもち、酢酸過酸化が起こる時期がより遅い酢酸生産能が向上した酢酸菌を開発することが求められている。

高温で育成可能な酢酸菌を開発する試みとして、例えばアセトバクター属の酢酸菌を変異させて高温適応能力を付与した変異株（例えば、非特許文献１参照）が知られている。しかし、この変異株において、酢酸生産能の向上は得られていない。

また、酢酸生産能を向上するために高い耐酸性を持つ酢酸菌を開発する試みとして、例えばアセトバクター属の酢酸菌を変異させて酢酸感受性にした株を元に回復させることのできる酢酸菌由来のクラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）を増幅した形質転換株（例えば、特許文献１参照）、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入した例（例えば、特許文献２参照）、酢酸菌由来のアコニターゼ遺伝子を過剰発現させた例（例えば、特許文献３参照）、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子を修飾し該遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させた例（例えば、特許文献４参照）など多くが開示されている。しかし、いずれも十分な酢酸生産能を付与することには成功していないのが現状であり、また、高温下での酢酸菌育成能については一切考慮されていない。

高い酢酸発酵能力をもつ酢酸菌として、アセトバクター属の酢酸菌アセトバクター・パスツリアヌス（A.pasteurianus）ＳＫＵ１１０８（例えば、非特許文献２参照）、ＳＫＵ１１０８株を変異させたアセトバクター・パスツリアヌス ＴＨ−３（例えば、特許文献５参照）が、本発明者らによって開示されている。

特開平３−２１９８７８号公報 特開平２−２３６４号公報 特開２００３−２８９８６７号公報 特開２００８−２０６４１３号公報 特開２０１０−１１０２９８号公報

Nucleic Acids Res.、３７巻、５７６８〜５７８３頁、２００９年 Biosci. Biotechnol. Biochem.、６１巻、１３８〜１４５頁、１９９７年

本発明の課題は、高温下での生育能力や酢酸発酵能力を備えた、酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法を提供することにある。

本発明者らは、耐熱性酢酸菌であるアセトバクター・パスツリアヌスＳＫＵ１１０８株（寄託番号ＮＢＲＣ１０１６５５）を酢酸発酵条件下で高温適応育種を行い、変異株アセトバクター・パスツリアヌスＴＨ−３株（寄託番号Ｐ−６６４）を既に得ていたが、適応育種方法を変えることにより新たに変異株アセトバクター・パスツリアヌスＴI株を得ることに成功した。ＴＨ−３株とＴI株はともにＳＫＵ１１０８よりも高い酢酸生産能を有していたが、それぞれ異なった特徴を有していることを見出した。

そこで、ＴＨ−３株とＴI株の遺伝的背景を明らかにするために、本発明者らは、ＳＫＵ１１０８株、ＴＨ−３株、ＴI株のドラフトゲノム解析を行い、得られたＳＫＵ１１０８株のドラフトゲノム配列に対して、ＴＨ−３株あるいはＴI株のゲノム情報を個別にマッピングした。その結果、アミノ酸レベルで、ＴＨ−３株とＴI株とで共通して変異している箇所を初めて同定した。次いで、ＴＨ−３株とＴ−１株とで共通して変異している遺伝子の内、２カ所の遺伝子（ｍａｒＲ遺伝子及びｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子）をそれぞれ破壊し、得られた遺伝子破壊株２種（ｍａｒＲ遺伝子破壊株及びｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子破壊株）についてそれぞれ機能解析を行った。その結果、親株であるＳＫＵ１１０８株と比較して、ｍａｒＲ遺伝子破壊株では酢酸耐性能力が付与されており、ｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子破壊株では高温生育能力及び酢酸過酸化を遅らせる能力（酢酸過酸化遅延能力）が付与されていることがわかった。このように、ｍａｒＲ遺伝子破壊株とｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子破壊株のいずれもが、ＳＫＵ１１０８株に対し酢酸生産能が向上していることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質、及び／又は、配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させることを特徴とする酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法。
（２）酢酸菌が、アセトバクター属に属する酢酸菌であることを特徴とする上記（１）記載の酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法。

本発明によると、酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法を提供することができる。より具体的には、酢酸耐性能力や、高温生育能力かつ酢酸過酸化遅延能力が付与された酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法を提供することができる。この育種された酢酸生産能が向上した酢酸菌を用いると、高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率的に製造することができる。

ＳＫＵ１１０８株を３９℃で繰り返し培養してＴI株を得る際の、ＳＫＵ１１８株の生育（上段）及び酢酸生成（下段）の結果を示すである。 ３７℃条件下における、ＳＫＵ１１０８株、ＴＨ−３株、ＴI株、及びｍａｒＲ遺伝子破壊（ΔｍａｒＲ）株の、生育（上段左）、酢酸生成（上段右）、及び酢酸耐性能（下段）をそれぞれ比較した結果を示す図である。 ＳＫＵ１１０８株、ＴＨ−３株及びＴI株のゲノムの比較結果を示す図である。 ＳＫＵ１１０８株（Ｗｉｌｄ）、ＴＨ−３株、及びｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子破壊株（Δａａ ｐｅｒｍｅａｓｅ）の、３７℃及び３９℃における生育と酢酸生成（上段）、並びに耐熱性（下段）をそれぞれ比較した結果を示す図である。

本発明において育種の対象となる酢酸菌（親酢酸菌株）としては特に制限されず、例えば、アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属などの酢酸菌を挙げることができる。アセトバクター属に属する酢酸菌としては、例えば、アセトバクター・パスツリアヌス、アセトバクター・アセチ（A.aceti）、アセトバクター・アルトアセチゲネス（A.altoacetigenes）等を挙げることができ、より具体的には、アセトバクター・パスツリアヌスＳＫＵ１１８株、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３株、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株等を挙げることができる。また、グルコンアセトバクター属に属する酢酸菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・インターメディウス（G.intermedius）、グルコンアセトバクター・キシリヌス（G.xylinus）、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（G.europaeus）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（G.diazotrophicus）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（G.entanii）等を挙げることができ、より具体的には、グルコンアセトバクター・キシリヌスＩＦＯ３２８８株、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウスＤＳＭ６１６０株、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカスＡＴＣＣ４９０３７株、グルコンアセトバクター・インターメディウスＮＣＩ１０５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６７）株等を挙げることができる。

本発明において「酢酸生産能が向上した酢酸菌」とは、酢酸耐性能力、高温生育能力、酢酸過酸化遅延能力、酢酸発酵能力のうちの少なくとも１つの能力が親酢酸菌株より優れ、かつ、同じ培養条件で培養した場合、酢酸の生産量が親酢酸菌株より優れた酢酸菌をいう。

本発明の「酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法」には、酢酸生産能が向上した酢酸菌の生産方法も含まれる。

本発明における、配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質（ｍａｒＲ）、配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質（ｐｅｒｍｅａｓｅ）、及び配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させる方法としては、当該タンパク質をコードする遺伝子を標的として修飾し、タンパク質の機能を低下又は欠損させる方法の他、物理的処理や化学的変異剤を用いて当該タンパク質をコードする遺伝子部分に突然変異を誘導し、タンパク質の機能を低下又は欠損させる方法を挙げることができる。

上記タンパク質をコードする遺伝子を標的として修飾し、タンパク質の機能を低下又は欠損させる方法としては、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づき、遺伝子の部分配列を欠失させたＤＮＡや、遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子等を挿入したＤＮＡを作製し、かかるＤＮＡで親酢酸菌株を形質転換し、染色体上の正常な遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の前記遺伝子を破壊する方法を挙げることができる。酢酸菌の形質転換は、塩化カルシウム法（例えば、Agric. Biol. Chem.、４９巻、２０９１頁、１９８５年参照）やエレクトロポレーション法（Biosci. Biotechnol. Biochem.、５８巻、９７４頁、１９９４年参照）等によって行うことができる。

また、上記物理的処理や化学的変異剤を用いて当該タンパク質をコードする遺伝子部分に突然変異を誘導し、タンパク質の機能を低下又は欠損させる方法としては、親酢酸菌株に紫外線照射処理により、あるいは、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸等による変異剤処理により、突然変異を誘発させ、前記遺伝子に変異をおこした酢酸菌を分離する方法を挙げることができる。かかる前記遺伝子に変異をおこした酢酸菌は、前記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づき、プライマー対を作製してＰＣＲを行うことにより分離することができる。

１つの菌株において、前記タンパク質のうち２つ以上のタンパク質の機能を低下又は欠損させるには、まず、上記の突然変異や相同組換え等を利用して、１つのタンパク質の機能を低下又は欠損させた株を作製した後、この株に上記の突然変異や相同組換えなどを利用して、２つめのタンパク質の機能を低下又は欠損させた株を作製する方法を用いることができる。なお、相同組換えを２回行い選択する場合には、異なる２つの薬剤耐性遺伝子を利用すると、形質転換体を効率よく選択することができる。

本発明の育種方法により得られた酢酸生産能が向上した酢酸菌、例えばｍａｒＲ遺伝子破壊株やｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子破壊株を用いて食酢を製造するには、アルコールを含有する培地で酢酸生産能が向上した酢酸菌を培養し、培地中に酢酸を生成蓄積せしめること以外は、従来公知の酢酸の製造方法を採用することができる。また、アルコールを含有する培地としては酢酸発酵に使用する培地であればよく、エタノールなどのアルコール成分の他、炭素源、窒素源、無機物等を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものを用いることができる。培地は、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸を挙げることができる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いることができる。また、培養条件としては、静置培養法、振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下、２５〜３７℃、通常３０℃の培養温度、ｐＨ２．５〜７、好ましくはｐＨ４．５〜６．５の培地ｐＨ、１〜４日間の培養期間等を挙げることができる。

以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが,本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

[酢酸菌変異株Acetobacter pasteurianus ＴIの作製]
Acetobacter pasteurianus ＳＫＵ１１０８株を、５ｍＬのポテト培地を入れた試験管で３７℃、２００ｒｐｍで濁度が１５０Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔになるまで前培養した。この前培養液５ｍＬを１００ｍＬのＹＰＧＤ培地が入った５００ｍＬのフラスコに無菌的に接種し、４％エタノールを加えて３９℃、２００ｒｐｍで培養した。

菌の生育は、ｋｌｔｔ ｕｎｉｔを測定することにより確認した。この測定には、ｋｌｌｅｔｔ−ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ光電比色計（富士工業製）を用いた。酢酸生成能は、酸性度を測定することにより確認した。培地の酸性度は、発酵液に対してフェノールフタレインを指示薬として用いて、０．８Ｎ ＮａＯＨでアルカリ滴定を行い、得られた滴定量を０．１２倍にして酢酸濃度換算した値を酸度とし、％で表わした。

菌の生育及び酢酸発酵が認められ、目的のフェーズ（Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔにして６０〜１２０程度、酸性度が１〜１．８％）に達したら、その培養液の一部を種菌として５ｍＬ取り、新しい培地に接種して同じ条件で培養を行った。この過程を１１回繰り返すことにより、延べ１１５０時間培養を行った。

図１は、３９℃で繰り返し培養を行った際（最初の９回の培養）の生育能（図１上段）及び酢酸生成能力（図１下段）を調べたものである。（図１上段）は横軸が培養時間で、縦軸が濁度Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ、（図１下段）は横軸が培養時間、縦軸が酸性度（％）を示す。（図１上段）の左から順に繰り返し培養の１回目、２回目と順に９回培養した場合の生育を示し、それぞれに対応する酸性度を示すデータが（図１下段）となる。こうして、３９℃の条件下での培養でも生育及び酢酸発酵を行うことができるアセトバクター・パスツリアヌスＴI株を得ることができた。

[Ｔ−１株等の酢酸発酵試験]
実施例１で得られたＴI株、親株であるＳＫＵ１１０８、ＴI株と同じくＳＫＵ１１０８株を親株とするＴＨ−３株、及びｍａｒＲ遺伝子破壊（ΔｍａｒＲ）株の４種の酢酸菌の酢酸発酵能を比較した。具体的には、５Ｌのミニジャー（丸菱バイオエンジ製、ＭＤＩＡＣＳ−Ｓ５）を用いて、エタノール４％、グルコース０．５％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．５％、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ（ΔｍａｒＲの場合）、消泡剤０．０１％を含む２Ｌの培地にて、３７℃、５００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍの通気攪拌培養を行った。結果を図２（上段）にまとめた。

図２（上段左）は、ＳＫＵ１１０８株、ＴＨ−３株、ＴI株、及びΔｍａｒＲ株の生育能を比較した結果である。ＳＫＵ１１０８株は、２日以内に培地に添加されているエタノールを使い切るため生育が止まるが、５日目以降酢酸過酸化が起こり再び生育が起こっていることが示された。これに対し、ＴＨ−３株には酢酸過酸化が見られないことが示された。また、ＴI株やΔｍａｒＲ株はＳＫＵ１１０８株に比べて酢酸過酸化の遅延に優れているが、ＴＨ−３株には及ばないことが示された。

図２（上段右）は、ＳＫＵ１１０８株、ＴＨ−３株、ＴI株、及びΔｍａｒＲ株の３７℃での酢酸生成能を比較した結果である。ＳＫＵ１１０８株は、５日目以降酢酸過酸化が起こるため酢酸生成量が減少していることが示された。これに対し、ＴＨ−３株には酢酸過酸化が見られないため、酢酸生成能が落ちないことが示された。また、ＴI株やΔｍａｒＲ株はＳＫＵ１１０８株よりは酢酸生成能に優れているが、ＴＨ−３株には及ばないことが示された。

ＳＫＵ１１０８株、ＴＨ−３株、及びΔｍａｒＲ株のそれぞれ休止菌体を、１％酢酸＋１０ｍＭ乳酸、２％酢酸＋１０ｍＭ乳酸、３％酢酸＋１０ｍＭ乳酸、１％酢酸を含む１５０ｍＭ ＫＣｌの各溶液で３０分間処理した後、細胞を遠心で集め、１ｍＬの１５０ｍＭ ＫＣｌに懸濁し、さらに１０^−１、１０^−２、１０^−３、１０^−４倍に希釈して、原液とこれら４種の希釈液をそれぞれ７０μＬずつ、ＹＰＧＤ寒天培地にスポットし、３７℃で培養することにより、残存菌数を比較した。また、酢酸及び乳酸を含まない溶液で処理したものを対照とした。結果を図２（下段）にまとめた。

図２（下段）は、ＳＫＵ１１０８株、ＴＨ−３株、及びΔｍａｒＲ株の酢酸耐性能を比較した結果である。ΔｍａｒＲ株は、ＳＫＵ１１０８株に比べて酢酸耐性能力が付与されていたが、ＴＨ−３株には及ばないことが示された。

[ＴＨ−３株およびＴI株における遺伝子変異箇所の取得]
ＳＫＵ１１０８株とＴＨ−３株及びＴI株において、変異した遺伝子を特定するために、ドラフトゲノム解析を行った。具体的には、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した染色体ＤＮＡを、北海道システム・サイエンス社がＩｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＡＩＩ ｐｌａｔｆｏｒｍ）を用いてドラフト・シーケンス解析を行った。得られたＳＫＵ１１０８株のドラフトゲノム配列に対して、個別にＴＨ−３株あるいはＴI株のゲノム情報をマッピングすることで変異部位を解析した。

図３は、ＳＫＵ１１０８株とＴＨ−３株及びＴI株における、ゲノムの比較を示したものである。ＳＫＵ１１０８株と比較して、アミノ酸レベルの変異箇所を、ＴＨ−３株で１１カ所、ＴI株で６カ所それぞれ同定した。また、ＳＫＵ１１０８株と比較して、ＴＨ−３株とＴI株で共通して変異している箇所を３カ所同定した。ＴＨ−３株とＴI株で共通して変異していた３カ所の配列をそれぞれ、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３で示す。

[ｍａｒＲ破壊株の作製]
実施例３で取得した配列番号１の塩基配列に基づいて、プライマー１（配列表の配列番号４参照）及びプライマー２（配列表の配列番号５参照）を合成し、ＳＫＵ１１０８株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法により配列番号１の塩基配列がコードする遺伝子を増幅した。該増幅産物を制限酵素ＢｇｌII（東洋紡製）で切断した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ (東洋紡製)を用いて平滑末端化を行い、ｐＴＫｍ由来のＫｍ^ｒｃａｓｓｅｔｔｅを含むＥｃｏＲＶ−ｆｒａｇｍｅｎｔへ挿入し（Microbiology、１４９巻、４３１〜４４４頁、２００３年）、ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片１）を調製した。

染色体ＤＮＡはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ(キアゲン製)を用いて抽出した。また、ＰＣＲ反応はｍＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（パーキンエルマー製）を用い、変性９５℃で３０秒を１サイクル、その後、９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で１分を２５サイクル行い、すべてのサイクルが終了すると最後は３７℃に保つ方法で行なった。

次にＤＮＡ断片１を、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（プロメガ製）に導入した。このようにして調製したＤＮＡを、酢酸菌ＳＫＵ１１０８株にエレクトロポレーション法（Biosci. Biotechnol. Biochem.、５８巻、９７４頁、１９９４年参照）により導入することによって形質転換した。

形質転換酢酸菌株は、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＹＰＧＤ寒天培地で選択した（Bisci. Biotechnol. Biochem. ６９巻、１１２０〜１１２９頁、２００５年参照）。

実施例３で取得した配列番号１の塩基配列情報に基づいて、プライマー３（配列番号６参照）及びプライマー４（配列番号７参照）を合成した。選択培地上で生育したカナマイシン耐性の形質転換株の染色体ＤＮＡを、同上のキットを用いて抽出した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマー３及びプライマー４を用いてＰＣＲ法を行い、選択培地上で生育したカナマイシン耐性の形質転換株のｍａｒＲ遺伝子が破壊されていることを確認した。

ｍａｒＲ遺伝子破壊株の酢酸発酵試験等の結果は、上記図２に示されている。

[ｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子破壊株の作製]
実施例３で取得した配列番号２の塩基配列に基づいて、プライマー５（配列番号８参照）及びプライマー６（配列番号９参照）を合成し、ＳＫＵ１１０８株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、ヘラクレスＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン製）を用いたＰＣＲ法により、配列番号２の塩基配列がコードする遺伝子を増幅した。該増幅産物を制限酵素ＳｐｈＩ（東洋紡製）及び制限酵素ＳｍａＩ（東洋紡製）で切断し、ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片２）を調製した。

染色体ＤＮＡは同上のキットを用いて抽出した。また、ＰＣＲ反応は同上の機器を用い、変性９４℃で６０秒を１サイクル、その後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３分を２５サイクル行い、すべてのサイクルが終了すると最後は４℃に保つ方法で行なった。

実施例３で取得した配列番号２の塩基配列に基づいて、プライマー５とプライマー７（配列番号１０参照）を合成し、ＳＫＵ１１０８株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、ヘラクレスＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン製）を用いたＰＣＲ法により、配列番号２の塩基配列がコードする遺伝子の５’領域のみを増幅した。該増幅産物を制限酵素ＳｐｈＩ（東洋紡製）及び制限酵素ＸｂａＩ（東洋紡製）で切断し、ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片３）を調製した。

染色体ＤＮＡは同上のキットを用いて抽出した。また、ＰＣＲ反応は同上の機器を用い、同上の条件で行なった。

ＤＮＡ断片２及び３を、ｐＫ１９ｍｏｂＧＩＩ（Appl. Environ. Microbiol. ６５巻、２７８〜２８２貢、１９９９年参照）に導入した。調製したＤＮＡと大腸菌ＨＢ１０１／ｐＫＲ２０１３株を用いて、三系交雑法（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ７６巻、１６４８〜５２貢、１９７９年参照）を行い、酢酸菌ＳＫＵ１１０８株を形質転換した。

形質転換酢酸菌株はまず、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび４０μｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（シクロヘキシルアンモニウム塩）を添加したＹＰＧＤ寒天培地でβ−グルクロニダーゼ活性陽性かつカナマイシン耐性コロニーを選択した。次に、このコロニーを再び培養し、グルクロニドを含みカナマイシンを含まない寒天培地で、β−グルクロニダーゼ活性陰性のコロニーを選び、その中からカナマイシン感受性であったものを最終的に選択した。

このようにして選択されたβ−グルクロニダーゼ陰性かつカナマイシン感受性の形質転換株の染色体ＤＮＡを、同上のキットを用いて抽出した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマー５及びプライマー６を用いてＰＣＲ法を行い、選択培地上で生育した形質転換株のｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子が破壊されていることを確認した。

[ｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子破壊株の酢酸発酵試験]
実施例６で得られたｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子が破壊されたｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子破壊（Δａａ ｐｅｒｍｅａｓｅ）株について、親株であるＳＫＵ１１０８やＴＨ−３株と酢酸発酵能を比較した。具体的には、５Ｌのミニジャー（丸菱バイオエンジ製）を用いて、エタノール４％、グルコース０．５％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．５％を含む２Ｌの培地にて、３７℃もしくは３９℃、５００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍの通気攪拌培養を行った。結果を図４（上段）にまとめた。

図４（上段）は、ＳＫＵ１１８株、ＴＨ−３株、及びΔａａ ｐｅｒｍｅａｓｅ株の酢酸生成能を比較した結果である。図４（上段）は、横軸が培養時間で、縦軸が濁度Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔあるいは酸性度（％）を示している。３７℃条件下での酢酸生育能を比較すると、Δａａ ｐｅｒｍｅａｓｅ株はＳＫＵ１１０８株やＴＨ−３株、特にＳＫＵ１１０８株に比べ酢酸過酸化が遅れて起こっている。これより、３７℃条件下でΔａａ ｐｅｒｍｅａｓｅ株は、ＳＫＵ１１０８株に比べ優れた酢酸生産能を有していることを示した。また、酢酸生成量を比較すると、Δａａ ｐｅｒｍｅａｓｅ株はＳＫＵ１１０８株に比べ酢酸生成量が多いことが示された。

これに対し、３９℃条件下での酢酸生育能および酢酸生産量を比較すると、ＳＫＵ１１０８株が全く生育せず酢酸生産も行うことができないのに対し、ΔＡＴＰ１６９８株は、ＴＨ−３株にやや劣るものの、優れた生育能や酢酸生産能を有していることが示された。

ＳＫＵ１１０８株、ＴＨ−３株、及びΔａａ ｐｅｒｍｅａｓｅ株をそれぞれ、５ｍＬのポテト培地でＫｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ１５０まで培養し、滅菌水で１０^−１、１０^−２、１０^−３、１０^−４に希釈し、原液とこれら４種の希釈駅をそれぞれ７０μＬずつ、ＹＰＧＤＥ寒天培地にスポットし、３７℃、３９℃、４０℃のそれぞれの条件下で培養した。結果を図４（下段）にまとめた。

図４（下段）は、ＳＫＵ１１０８株、ＴＨ−３株、及びΔａａ ｐｅｒｍｅａｓｅ株の耐熱性能を比較した結果である。ＳＫＵ１１０８株は、３７℃では生育できるが、４０℃では生育できないことが示された。これに対してΔａａ ｐｅｒｍｅａｓｅ株は、４０℃でも生育しており、ＴＨ−３株同様、ＳＫＵ１１０８株よりも高い耐熱性を有していることが示された。

本発明によると、酢酸生産能が向上した酢酸菌が提供されるので、高濃度の酢酸を含有する食酢のより効率的な製造を行うことができ、食酢産業において有用である。

Claims (2)

1. 配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質、及び／又は、配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させることを特徴とする酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法。
2. 酢酸菌が、アセトバクター属に属する酢酸菌であることを特徴とする請求項１記載の酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法。