JP2010539956A - 核酸増幅 - Google Patents
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Abstract
核酸分子内に位置する標的ヌクレオチド配列の選択的増幅のための方法であって、核酸分子(「鋳型」分子)を、(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および(ii)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含むステップと、特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップとを含む方法が本明細書において提供される。
Description
本発明は、特異的な核酸配列の選択的増幅のための方法に関する。増幅の選択性は、熱サイクルの酵素的増幅反応において対応する促進因子オリゴヌクレオチドと共に少なくとも1つの修飾オリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって達成される。選択性はまた、促進因子オリゴヌクレオチドが結合するアンプリコン内に位置する配列によって提供される。本発明はまた、特有のヌクレオチド配列結合部位として使用することができる3'一本鎖配列の付加など、増幅産物の操作および本発明の方法に従って生成される修飾産物の使用に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、核酸分子の規定されたセグメントの多数のコピーを迅速に合成するための技術である(たとえば、Mullisらの米国特許第4683195号、第4683202号、および第4800159号を参照されたい)。PCR技術は、非常に感度が高く、理論上、増幅のために一本の核酸分子のみを必要とする。PCRは、典型的には、鋳型分子、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、および核酸ポリメラーゼを、適切な塩、金属カチオン、遊離ヌクレオチド、およびpH緩衝系から成る反応媒体中に組み込む、酵素媒介性の反応である。PCRプロセスは、二本鎖核酸の変性、その後の核酸鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーアニーリングおよびポリメラーゼによるプライマー伸長の反復サイクルに基づくものである。PCRにおいて使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型分子の反対の鎖にアニールするように設計され、増幅されることとなる標的配列に隣接するように配置される。プライマーが、ポリメラーゼによってそれらの3'端から伸長されるので、伸長産物は、引き続いて、増幅のさらなるラウンドのための鋳型分子として作用することができる、元の標的配列のコピーを提供する。PCR増幅は、別個の核酸分子の指数関数的な増加をもたらし、所望の量の増幅核酸産物が得られ、この長さは、オリゴヌクレオチドプライマーの5'端によって規定される。
PCRは、原理的に単純で、特異的であるが、PCRは、使用者に対して問題となり得、技術の選択性および特異性を損ない得るいくつかのタイプの不要な人工産物を発生しやすい。たとえば、断片の非特異的増幅は、標的配列以外の(1つまたは複数の)配列に結合する一方または両方のプライマーに起因する可能性があり、これは、所望の産物ではない1つまたは複数の断片を産生し得る。プライマーの非特異的結合は、頻繁に起こり、これは、たとえば標的ヌクレオチド配列鋳型中に存在する、代わりのプライマー結合配列、外来混入分子上の、類似するプライマー結合配列の存在、および/または最適に及ばないプライマー配列設計によるものとすることができる。これらの非特異的核酸産物は、とりわけ、標的配列を含有する鋳型核酸がわずかなコピーでしか存在しない場合、問題となり得る。
いくつかの場合において、プライマーは、ただ部分的に相補的なだけの結合部位に結合する可能性があり、結合したDNAに対するミスマッチがプライマーの3'端に存在する場合でさえ、伸長する可能性がある(たとえば、Kwokら1990年、「Effects of primer template mismatches on the polymerase chain-reaction human-immunodeficiency-virus type-1 model studies.」Nucleic Acids Research 18(4): 999〜1005頁を参照されたい)。このために、不要な非特異的増幅は起こり得る。ミスプライミングに起因するDNAの鎖が複製される場合、このプライマーと完全にマッチするプライマー結合部位が生成される。したがって、これらのプライマーに完全に相補的な結合部位を両端に有する不要な産物は、標準的なPCRにおいて現れ得る。したがって、一旦、この不要な産物が産生されると、これは、高い効率で増幅されるであろう。言いかえれば、一旦、ミスプライミングが起こったら、それ以上の特異性は、標準的なPCRにおいて可能でなくなる。過度の非特異的増幅が起こる場合、様々なタイプのプローブを、必要な標的を特異的に検出するために使用することができるが、所望の産物の産生は、特異的なプローブを用いると、検出不可能なレベルまで阻止され、または低下し得る。この状況は、対象とする標的が、全核酸の非常に小さな部分のみを構成する場合において起こる可能性が最も高い。
非特異的増幅はまた、PCRサイクルの初期のラウンドにおいて起こる場合にも深刻である。典型的には、既存のPCR技術において、プライマーの配列による特異性は、PCRの初期のラウンドにおいて達成されるにすぎない。一旦、かなりの量の産物が生成されると、増幅は、プライマーが、標的配列に隣接する意図される部位から伸長しようと、ミスプライミングから生じる非特異的なアンプリコンから伸長しようと、等しい速度で進行する。すなわち、プライマーが、プライマーが部分的な相補性のみを有する不正確な部位に結合し、伸長が、不正確な部位から起こる場合でさえ、増幅された非特異的産物は、PCR技術によって組み込まれる、まさにそのオリゴヌクレオチドプライマー結合配列を有し、これらは、後のPCRサイクルにおいて、オリゴヌクレオチドプライマー結合のための標的配列を含有する核酸鋳型と等しい効率で競合する。アレル特異的PCRなどの適用において、プライマー設計における相当な注意および技術最適化における相当な努力が、ミスプライミングを最小限にするために典型的には必要とされる。
非特異的産物増幅の発生を制限するための試みにおいて、現在のPCR技術は、標的核酸に結合するプライマーの特異性を増加させることを目指した、改変された手順を使用することができる。これは、たとえば、プライマー結合プロセスを媒介する異なる補助因子の存在および濃度を変更することまたはPCR方法の熱サイクリングを改変することを含み得る。あるいは、PCRの2回の連続的なラウンドにおいて使用される2セットのプライマーを含むネステッドPCRを利用できる。第1のPCR増幅は、プライマーの第1のセットを使用して、標的を産生し、可能性として非特異的産物を産生するが、第2のPCRラウンドは、非特異的産物の生成を低下させるために、新しいプライマーを使用して第1のラウンドの標的産物内の二次標的を増幅する。
プライマー結合特異性を改善する既存のPCR技術の改変は、有用であるが、多くが、時間浪費になり得、厄介になり得る大規模な試行錯誤を必要とする。さらに、これらの技術を組み込んだ後でさえ、排除するのが本質的に困難である非特異的産物は、残存することが多い。結果的に、標的核酸配列の選択的増幅の改善を考慮に入れるPCRベースの方法論を改善することが継続して必要である。
これらの方法のように、本明細書に記載される新しい発明は、開始ヌクレオチド配列上のプライミング部位の間に位置する配列の選択性を含み、ネステッドプライマーおよびPCRの2回のラウンドを使用して通常得られるような、さらなる配列特異性を単一の反応内で提供することができる。
Kwokら1990年、「Effects of primer template mismatches on the polymerase chain-reaction human-immunodeficiency-virus type-1 model studies.」Nucleic Acids Research 18(4): 999〜1005頁
Cottrellら2004年、「A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers.」Nucleic Acids Research 32(1)
Sambrook, J.およびRussell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第3版、2001年
Dieffenbach, C. W.およびDveksler, G.S. (編) PCR Primer: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、2003年
本発明は、PCRの特異性が、それぞれ標的配列の同じ端に結合する2つの修飾オリゴヌクレオチドの使用によって増強することができるという、発明者の驚くべき発見に基づくものである。これらの修飾オリゴヌクレオチドのうちの1つ(本明細書において「促進因子オリゴヌクレオチド」と称される)は、プライマーとして作用せず、伸長を阻止する、3'末端のまたはその近くの修飾を有する。促進因子オリゴヌクレオチドは、アンプリコン配列再生成のための鋳型として作用し、いかなる増幅産物にも直接組み込まれない。他方の修飾オリゴヌクレオチド(本明細書において「開始因子プライマー」と称される)は、プライマーからのポリメラーゼ媒介性の3'伸長は可能であるが、反対の鎖のポリメラーゼによる複製は阻止されるように修飾される。特定の実施形態において、このプライマーは、開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドを使用する鎖伸長に続いて再生成され、それによって、開始因子プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域と十分な配列同一性を有していてもよい。そのような場合において、開始因子プライマーは、増幅されたヌクレオチド配列鋳型への結合の成功が、開始因子プライマー結合部位の再生成のための鋳型として作用する促進因子オリゴヌクレオチドに依存するので、「促進因子オリゴヌクレオチド依存的」である。開始因子プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域の間に不十分な配列同一性がある場合において、この方法は、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された、さらなる「促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー」を使用してもよく、このプライマーは、促進因子オリゴヌクレオチドを使用する鎖合成から促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位が生成され、それによって、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域と十分な配列同一性を有する。本発明によれば、促進因子オリゴヌクレオチドならびに開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーの組合せは、増幅されることとなる標的配列の一方の端または両端で使用することができる。
本発明の実施形態は、核酸分子を含有する生物学的試料内の特異的な標的ヌクレオチド配列の選択的増幅のための方法を提供する。そのような方法はまた、本明細書において、総称して、ハイブリダイゼーション依存的連鎖反応(HDCR)とも呼ばれる。
本発明の第1の態様によれば、核酸分子内に位置する標的ヌクレオチド配列の選択的増幅のための方法であって、核酸分子(「鋳型」分子)を、
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含むステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと
を含む方法が提供される。
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含むステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと
を含む方法が提供される。
この方法は、
(a)鋳型核酸分子を変性させるステップと、
(b)変性した鋳型核酸分子を少なくとも1つの開始因子プライマーと接触させ、それから第2の鎖合成を開始し、それによって、新しく合成された鎖に開始因子プライマーからの修飾を導入するステップと、
(c)そのように生成された二本鎖分子を変性させて、開始因子プライマーが結合する標的ヌクレオチド配列の反対の端に位置するプライマーからの逆方向の鎖合成を開始し、それによって、逆方向の鎖合成が、ステップ(b)において導入された修飾により、早期に終結するステップと、
(d)新しく合成された二本鎖分子を変性させて、ステップ(c)において生成された不完全な逆方向の鎖に促進因子オリゴヌクレオチドを結合し、それから鎖伸長を開始して、それによって逆方向の鎖を完成させるステップと、
(e)1回または複数回のさらなるサイクルでステップ(a)〜(d)を任意選択で反復するステップと
を含んでいてもよい。
(a)鋳型核酸分子を変性させるステップと、
(b)変性した鋳型核酸分子を少なくとも1つの開始因子プライマーと接触させ、それから第2の鎖合成を開始し、それによって、新しく合成された鎖に開始因子プライマーからの修飾を導入するステップと、
(c)そのように生成された二本鎖分子を変性させて、開始因子プライマーが結合する標的ヌクレオチド配列の反対の端に位置するプライマーからの逆方向の鎖合成を開始し、それによって、逆方向の鎖合成が、ステップ(b)において導入された修飾により、早期に終結するステップと、
(d)新しく合成された二本鎖分子を変性させて、ステップ(c)において生成された不完全な逆方向の鎖に促進因子オリゴヌクレオチドを結合し、それから鎖伸長を開始して、それによって逆方向の鎖を完成させるステップと、
(e)1回または複数回のさらなるサイクルでステップ(a)〜(d)を任意選択で反復するステップと
を含んでいてもよい。
一実施形態において、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域は、開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖伸長に続いて再生成され、それによって、開始因子プライマーが、鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、開始因子プライマーと十分な配列同一性を有する。
代替の実施形態において、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域は、開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成に続いて再生成されないように、開始因子プライマーと不十分な配列同一性を有する。
この代替の実施形態によれば、この方法は、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーをさらに使用してもよく、このプライマーは、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成から促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位が生成され、それによって、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域と十分な配列同一性を有する。
この方法は、所望の標的配列の増幅の特異性を改善し、同時に、所望されない非標的配列の増幅を実質的に低下させ、または排除するために使用することができる。
核酸分子は、たとえば組織、細胞、および/またはその抽出物を含む、任意の適した生物学的試料中に存在していてもよい。核酸分子は、本発明に従って増幅方法を実行する前に生物学的試料から精製することができる。
核酸分子は、DNAもしくはRNAであってもよく、またはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/もしくは天然ヌクレオチドの類似体の組合せを含んでいてもよい。
典型的には、促進因子オリゴヌクレオチドの3'伸長をブロックする少なくとも1つの修飾は、3'末端のもしくはその近くの1つもしくは複数の非伸長性部分もしくはヌクレオチド類似体、たとえば単一の3'末端非伸長性塩基もしくは塩基類似体、3'末端非伸長性塩基およびオリゴヌクレオチドの3'末端の近くの1つもしくは複数のヌクレオチドミスマッチの組合せの組み込みまたはオリゴヌクレオチドの3'末端の近くの脱塩基部位の組み込みを含む。非伸長性塩基は、たとえば2',3'ジデオキシヌクレオチド、3'C3、C18もしくは他の長さのスペーサー、3'リン酸化ヌクレオチド、「ペプチド核酸」塩基、「ロックド核酸」(LNA)塩基、ヌクレオチドアミン誘導体、ウラシルDNAグリコシラーゼを用いて処理されたウラシル、RNAもしくは2'O-メチルヌクレオチド、またはこれらの組合せから選択することができる。
開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーは、たとえば1つまたは複数のスペーサー、脱塩基部位、または2'-O-メチルヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドの包含によって修飾することができる。典型的には、開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーにおける修飾は、プライマーが3'伸長を開始する能力を保持する一方で、そのプライマー配列内に修飾を含有する伸長産物が複製される場合に、相補鎖が早期に切断され、後の増幅サイクルにおけるプライマー結合を阻止するように、プライマーの3'末端の十分近くに位置する。たとえば、特定の実施形態において、修飾は、プライマーの3'末端から約10塩基、9塩基、8塩基、7塩基、6塩基、5塩基、または4塩基のところに位置してもよい。
促進因子オリゴヌクレオチドの5'末端は、開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーの5'末端と一致し、またはそれに含まれてもよい。あるいは、促進因子オリゴヌクレオチドは、さらなる5'配列を含んでいてもよい。そのようなさらなる配列は、検出可能なタグまたは標識として使用することもでき、またはその付加を促進することもできる。
一実施形態において、両方のプライマー(順方向および逆方向プライマー)は、開始因子プライマーである。この場合において、2つの促進因子オリゴヌクレオチドを使用し、これらのうちの一方は、順方向開始因子プライマーと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合し、他方は、逆方向開始因子プライマーと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合する。
さらに、この方法は、2つの促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーを使用してもよく、これらのうちの一方は、一方の促進因子オリゴヌクレオチドと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合し、他方は、他方の促進因子オリゴヌクレオチドと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合する。
本発明の第2の態様によれば、熱サイクルの酵素的増幅反応の特異性を改善するための方法であって、反応が、核酸分子内に位置する、対象とする標的ヌクレオチド配列に隣接する少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、前記プライマーの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾されており、反応が、少なくとも1つの非プライミング促進因子オリゴヌクレオチドをさらに利用し、促進因子オリゴヌクレオチドが、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含み、促進因子オリゴヌクレオチドおよび修飾プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、修飾プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含む方法が提供される。
熱サイクルの酵素的増幅反応の特異性は、対象とする標的ヌクレオチド配列を含まない増幅産物の消失またはその量の低下によって典型的には決定される。
上記の態様および実施形態に従って実行される方法は、たとえばDNAメチル化分析において、かつ/または対象における疾患もしくは状態の診断もしくはそれに対する感受性の予測において使用することができ、この疾患または状態は、変異遺伝子配列によって特徴づけられ、またはそれと関連する。変異配列は、1つもしくは複数のヌクレオチドの付加、欠失、もしくは置換または1つもしくは複数のヌクレオチドに対するメチル化状態の変化などの修飾を含んでいてもよい。
したがって、本発明の第3の態様は、核酸分子内に位置し、変異配列を含む標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅するステップを含む、変異ヌクレオチド配列を検出するための方法であって、
核酸分子(「鋳型」分子)を、
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な3'配列をさらに含み、前記3'配列は、対応する非変異配列へではなく、変異配列を含む標的ヌクレオチド配列への促進因子オリゴヌクレオチドの優先的な結合を可能にするステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと、
増幅された産物のヌクレオチド配列を非変異標的配列に対応する配列と比較して、変異ヌクレオチド配列を検出するステップと
を含む方法を提供する。
核酸分子(「鋳型」分子)を、
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な3'配列をさらに含み、前記3'配列は、対応する非変異配列へではなく、変異配列を含む標的ヌクレオチド配列への促進因子オリゴヌクレオチドの優先的な結合を可能にするステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと、
増幅された産物のヌクレオチド配列を非変異標的配列に対応する配列と比較して、変異ヌクレオチド配列を検出するステップと
を含む方法を提供する。
一実施形態において、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域は、開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖伸長に続いて再生成され、それによって、開始因子プライマーが、鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、開始因子プライマーと十分な配列同一性を有する。
代替の実施形態において、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域は、開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成に続いて再生成されないように、開始因子プライマーの対応する領域と不十分な配列同一性を有する。
この代替の実施形態によれば、この方法は、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーをさらに使用してもよく、このプライマーは、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成から促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位が生成され、それによって、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域と十分な配列同一性を有する。
変異配列は、1つもしくは複数のヌクレオチドの付加、欠失、もしくは置換または標的配列内の1つもしくは複数のヌクレオチドに対するメチル化状態の変化などの修飾を含んでいてもよい。
添付図面を参照しつつ、本発明を、非限定的なほんの例として、本明細書において説明する。
本明細書および続く請求項の全体にわたって、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、用語「含む(comprise)」および「含む(comprises)」または「含む(comprising)」などの変化形は、明示される完全体もしくはステップまたは複数の完全体もしくはステップの群の包含を暗示するが、任意の他の完全体もしくはステップまたは複数の完全体もしくはステップの群の排除を暗示しないことが理解されるであろう。
冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、1つまたは複数の(つまり少なくとも1つの)、その冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書において使用される。一例として、「要素」は、1つの要素または複数の要素を意味する。
本発明の文脈において使用されるように、用語「増幅」は、熱サイクルの酵素的反応を介して標的ヌクレオチド配列の1つまたは複数のコピーを作製することを指し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸分子の増幅を含むが、これに限定されない。本明細書において使用されるように、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」(PCR)は、熱サイクリングプロセスにおいて実行される、オリゴヌクレオチドプライマーによって指示される酵素的増幅を介して核酸配列の特異的なセグメントの多数のコピーを産生するための技術を指す。異なるPCR技術の例は、逆転写PCR、ネステッドPCR、アレル特異的PCR、定量的PCR、長距離(Long Range)PCR、迅速増幅多型DNA分析、cDNA端の迅速増幅、ディファレンシャルディスプレイPCR、ライゲーション媒介性PCR、メチル化特異的PCR、ヘッドループPCR、およびヘビーメチルPCRを含むが、これらに限定されない。PCRは、DNAの指数関数的な増幅に加えて、DNAの直線的で、非指数関数的な増幅を指してもよく、当業者は、増幅のいずれの形態も本発明の目的に適切であることを認識するであろう。
本明細書において使用されるように、用語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「プライマー」は、DNA、cDNA、RNA、mRNA、cRNA、PNA、またはその任意の組合せを含む、任意の核酸ベースの分子を示す。したがって、核酸分子、オリゴヌクレオチド、またはプライマーは、天然に存在するヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、またはその組合せを含んでいてもよい。
本明細書において使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド塩基もしくはリボヌクレオチド塩基、天然ヌクレオチドの知られている類似体、またはその混合物の単鎖配列を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には、たとえば、適切な配列の直接的な化学合成またはクローニングおよび制限を含む、任意の適した方法によって調製できる、短い(たとえば長さが50未満のヌクレオチド)配列である。典型的には、本発明との関連で、オリゴヌクレオチドは、より大きな核酸分子内に位置する特異的な相補ヌクレオチド配列を認識し、結合するように設計される。オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ媒介性の伸長のためのプライマーとして作用することができてもよく、またはできなくてもよい。オリゴヌクレオチドにおけるすべての塩基が、オリゴヌクレオチドが結合するように設計される配列に相補的である必要はなく、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがその配列を認識し、それに結合することを可能にするのに十分な相補塩基をただ含有する必要がある。オリゴヌクレオチドはまた、さらなる塩基を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチド配列は、非修飾ヌクレオチド配列であってもよく、または本明細書において記載されるような多種多様の手段によって化学的に修飾されていてもよく、もしくはコンジュゲートされていてもよい。
本発明との関連で使用されるように、用語「相補鎖合成」は、鋳型として変性したアンプリコン配列を使用する、酵素的反応を介しての相補ヌクレオチド配列の生成を指す。
本明細書において使用されるように、用語「アンプリコン」は、標的配列に隣接する少なくとも1つのプライマーを組み込む、増幅されたヌクレオチド配列産物を指す。
本明細書において使用されるように、用語「プライマー」は、一本鎖鋳型核酸分子の特異的な領域に結合し、酵素的反応を介して核酸合成を開始して、プライマーの3'端から伸長し、鋳型分子の配列に相補的であるオリゴヌクレオチドを指す。慣習によって、プライマーは、典型的には、「順方向」および「逆方向」プライマーと呼ばれ、これらのうちの一方は、核酸鎖に相補的であり、他方は、その鎖の相補体に相補的である。
本明細書において使用されるように、用語「標的配列」は、増幅されることとなる特異的なヌクレオチド配列を指す。本発明の方法に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、標的配列の5'および3'の端に位置する核酸配列に対して少なくとも実質的な配列相補性を有する。
本明細書において使用されるように、用語「3'末端のまたはその近くの」は、典型的には末端ヌクレオチドを含む、3'末端のすぐ5'側のまたは核酸分子の3'末端の5'側に伸長するヌクレオチドの領域を指す。
本発明との関連で使用されるように、用語「ブロックされた3'伸長」は、促進因子オリゴヌクレオチドの3'伸長の実際的な期間の欠如を指し、増幅反応は、進行しないであろうまたは非実際的な速度で進行するであろう。
本明細書において使用されるように、促進因子オリゴヌクレオチドならびに開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーのための結合部位との関連の用語「実質的に同じまたは隣接する領域」は、オリゴヌクレオチド/プライマーは、鋳型分子の同じ一般的な領域に結合することができるが、鋳型の同じヌクレオチド配列に必ずしも結合しないことを意味する。たとえば、促進因子オリゴヌクレオチドは、開始因子プライマーが結合する配列に対して3'側(下流)であるが、なお実質的に、鋳型の同じ領域内となる、鋳型の配列に結合してもよい。この場合において、促進因子オリゴヌクレオチドの結合は、開始因子プライマーの結合配列に隣接する配列に起こる。用語「隣接する」は、配列が、すぐに隣接しているまたは「接している」ことを必要としないが、1つまたは複数の介在するまたはオーバーラップするヌクレオチドが「隣接する」配列の間にある状況を包含する。
本明細書において使用されるように、用語「試料」は、典型的にはDNAおよび/またはRNAを含む、核酸分子を含む任意の生物学的試料を指す。試料は、組織、細胞、もしくはその抽出物であってもよく、または核酸分子の精製試料であってもよい。用語「試料」の使用は、試料中に存在する核酸分子内の標的配列の存在を必ずしも暗示しない。
本発明の増幅方法はまた、本明細書において、総称して、ハイブリダイゼーション依存的連鎖反応(HDCR)と呼ばれ、任意の標的とされる核酸増幅に対して高度の特異性を提供し、これは、引き続いて、非特異的なアンプリコンを劇的に低下させ、または排除する。
本明細書において記載される方法論は、標準的な先行技術のPCRにおける場合と異なり、所望の標的の選択が増幅反応において多くのサイクルの間維持されることを可能にする。所望の標的の増幅の効率が不要な産物よりもわずかにのみよい場合でさえ、多数のサイクルにわたるこの差異を維持する累積効果は、所望の標的に対する高い選択性をもたらす。この選択性は、それらが完全に複製されるのを阻止する修飾を含有する特定のプライマー(「開始因子プライマー」および「促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー」と本明細書において呼ばれる)を使用することによって達成される。さらなる結合および伸長を可能にするようにプライマー結合部位を再生成することができない限り、有意な増幅は可能ではない。プライマー結合部位の再生成は、開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位の下流の、所望の標的における配列を認識するように設計される、本明細書において促進因子オリゴヌクレオチドと呼ばれるオリゴヌクレオチドを使用して達成される。ミスプライミングイベントの場合において、この領域が、促進因子オリゴヌクレオチドにおける対応する領域と十分にマッチして、プライマー結合部位の再生成を可能にすることはありそうにない。したがって、非特異的増幅を低下させ、または排除することができる。さらに、このシステムは、プライマー結合部位から下流の領域における突然変異などの、特定の配列変異を選択するために使用することができる。この場合において、促進因子オリゴヌクレオチドとのミスマッチがある場合でさえ、プライマー結合部位は再生成され得るが、これは、より低い効率で起こり、多数のサイクルにわたり選択を維持することができるので(反応に添加される標的の量に依存して)、所望の配列変異の強い選択が起こり得る。
多数のサイクルにわたる選択をまた可能にする先行技術の方法論もまた記載される。これらは、ブロッキングオリゴヌクレオチド(たとえば、Cottrellら2004年、「A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers.」Nucleic Acids Research 32(1)において記載されるように)およびヘッドループDNA増幅(US2005221312において記載される)の使用を含む。これらの方法において、特異性の改善は、特定の配列を用いる、産物の抑制によるものである。多くの異なる不要な潜在的な産物がある可能性がある場合において、多数のブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要な増幅を阻止するために使用される必要があるであろう。さらに、ヘッドループDNA増幅の場合において、不要な配列のうちの1つだけを選択することができる。対照的に、本明細書において記載される本発明の方法論は、所望の配列の正の選択を提供し、これらの産物の配列が知られていない場合でさえ、すべての不要な産物の抑制をもたらす。
PCRにおいて、増幅の特異性は、プライマーの結合の特異性に依存し、先行技術のPCR方法において、特異性は、標的配列に対する相補配列を有する、適切な順方向および逆方向プライマーの設計に起因する。しかしながら、プライマーの配列による特異性は、PCRの初期のラウンドにおいて達成されるにすぎない。一旦、かなりの量の産物が生成されると、増幅は、プライマーが、標的配列に隣接する正確な部位から伸長しようと、ミスプライミングから生じる非特異的なアンプリコンから伸長しようと、等しい速度で進行する。
対照的に、本発明の増幅方法において、選択性は、増幅のそれぞれのサイクルにおいて維持される。この高い特異性は、順方向および逆方向プライマーの一方または両方のプライミング領域の下流の、正確な標的配列の存在に依存して、増幅を成すことによって達成される。本発明の方法は、増幅の特異性を増加させるために、対応する促進因子オリゴヌクレオチドと共に、標的配列の一方の端(または両端)で少なくとも1つの修飾オリゴヌクレオチドプライマーを利用する。本明細書において記載される方法論の最も広い形態において、修飾プライマーは、本明細書において、逆方向の鎖合成が修飾によって妨げられるように修飾される開始因子プライマーと称される。促進因子オリゴヌクレオチドが、ミスプライミングの部位に対して下流(3'側)に位置するヌクレオチド配列を認識しないので、不要な増幅産物をもたらす先行技術のPCR方法のミスプライミングは、本発明の方法において回避される。
したがって、本発明の態様は、核酸分子内に位置する標的ヌクレオチド配列の選択的増幅のための方法であって、
核酸分子(「鋳型」分子)を、
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含むステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと
を含む方法を提供する。
核酸分子(「鋳型」分子)を、
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含むステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと
を含む方法を提供する。
本発明の実施形態によれば、選択性は、増幅のすべてのサイクルにおいて維持される。特異性は、プライマー結合だけではなく、プライマー結合部位の下流に「正確な」配列を有する必要性に起因する。そのため、驚くほど高度の選択性は、特に、増幅が、複数の修飾プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドを組み込む場合に、維持され、それによって、ミスプライミングに起因する不要な産物の生成は、大幅に低下し、または排除される。
促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域は、開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖伸長に続いて再生成され、それによって、開始因子プライマーが、鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、開始因子プライマーと十分な配列同一性を有していてもよい。あるいは、開始因子プライマー結合部位が、鋳型として促進因子オリゴヌクレオチドを使用する鎖合成に続いて、再生成されないように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域および開始因子プライマーの間に不十分な配列類似性があってもよい。この後者の場合において、この方法は、典型的に、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーをさらに使用し、これは、促進因子オリゴヌクレオチドを使用する鎖合成から促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位が生成され、それによって、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域と十分な配列同一性を有する。
本発明のさらなる態様は、熱サイクルの酵素的増幅反応の特異性を改善するための方法であって、反応が、核酸分子内に位置する、対象とする標的ヌクレオチド配列に隣接する少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、前記プライマーの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾されており、反応が、少なくとも1つの非プライミング促進因子オリゴヌクレオチドをさらに利用し、促進因子オリゴヌクレオチドが、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含み、促進因子オリゴヌクレオチドおよび修飾プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、修飾プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含む方法を提供する。
本発明の方法は、任意の所望の標的配列の増幅の特異性を改善し、同時に、所望されない非標的配列の増幅を実質的に低下させ、または排除するために使用することができる。当業者らは、この方法が、特定のアンプリコンの増幅の特異性および選択性が所望される、任意の熱サイクルの酵素的増幅反応において使用できることを認識するであろう。
ほんの一例として、本発明の方法は、メチル化ヌクレオチドの検出の特異性を改善するメチル化特異的PCR技術などにおいてDNAメチル化分析に適用される。本発明の方法はまた、たとえば疾患診断における点突然変異の検出にも適用される。いくつかの場合において、多くの異なる点突然変異は、PCRの多重化を必要とする特定の疾患(K-ras遺伝子における発癌性突然変異など)と関連する可能性がある。本発明の方法は、多重化に適用可能である。当業者らは、本発明の方法が、それらの適用にそのように限定されず、この方法が、高度の選択性および特異性を必要とする任意の熱サイクルの酵素的増幅において利用することができることを認識するであろう。そのような適用は、ウイルスおよび細菌を含む病原性生物の検出、ゲノムにおける多型および/または突然変異の検出、遺伝子指紋法、法人類学、分子系統分類学、系統学的調査、遺伝性疾患検出、ゲノム配列決定、対象とする形質をコントロールする遺伝子の同定、ならびにDNAメチル化の異なる状態の検出を含むが、これらに限定されない。
当業者らは、促進因子オリゴヌクレオチドの3'末端からの3'伸長をブロックする任意の適した手段を使用できることを容易に認識するであろう。適したブロッキング修飾は、3'末端もしくはその近くの1つもしくは複数の非伸長性部分もしくはヌクレオチド類似体、たとえば単一の3'末端非伸長性塩基もしくは塩基類似体、3'末端非伸長性塩基およびオリゴヌクレオチドの3'末端の近くの1つもしくは複数のヌクレオチドミスマッチの組合せの組み込みまたはオリゴヌクレオチドの3'末端の近くの脱塩基部位の組み込みを含むが、これらに限定されない。非伸長性塩基は、たとえば2',3'ジデオキシヌクレオチド、3'C3、C18、もしくは他の長さのスペーサー、3'リン酸化ヌクレオチド、「ペプチド核酸」塩基、「ロックド核酸」(LNA)塩基、ヌクレオチドアミン誘導体、ウラシルDNAグリコシラーゼを用いて処理されたウラシル、RNAもしくは2'O-メチルヌクレオチド、またはこれらの組合せから選択することができる。
同様に、多種多様の適した修飾は、逆方向の鎖合成を終結させるために促進因子オリゴヌクレオチドプライマーにおいて使用することができる。たとえば、これらの修飾は、1つまたは複数のミスマッチ、脱塩基部位、および/または2'-O-メチルヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドの包含を含んでいてもよいが、これらに限定されない。典型的には、開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーにおける修飾は、プライマーが、3'伸長を開始する能力を保持する一方で、そのプライマーが相補鎖合成の鋳型として作用する場合に、増幅される配列産物が切断され、これにより、後の増幅サイクルにおけるプライマー結合の欠如をもたらすように、プライマーの3'末端の十分近くに位置する。たとえば、特定の実施形態において、修飾は、プライマーの3'末端から約10塩基、9塩基、8塩基、7塩基、6塩基、5塩基、または4塩基のところに位置してもよい。
促進因子オリゴヌクレオチドは、開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位から下流の標的核酸配列に相補的な配列を含む。促進因子オリゴヌクレオチドはまた、開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーもまた認識し、結合する標的配列に相補的な配列を含んでいてもよい。促進因子オリゴヌクレオチドの5'端は、開始因子プライマーおよび/もしくは促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーの5'端と一致し、もしくはそれに含まれてもよく、または所望される場合、増幅される産物上のタグのための特有の配列結合部位を生成するために使用することができる、特有の配列の5'伸長部分を含有していてもよい。そのようなタグ結合部位を使用して、たとえば、特異的なアンプリコンの捕獲もしくは検出(たとえば突然変異検出)または増幅産物をクローニングすることができる。
ほんの一例として、かつ本発明の範囲を限定することなく、本発明の一実施形態に従って実行される増幅反応の典型的なステップは、図1Aにおいて示される。簡潔にするために、増幅反応に参加する標的ヌクレオチド配列の一方の端のみを図1Aにおいて表すことに注意されたい。この図は、本発明の一実施形態における開始因子プライマー(10)(本明細書において「順方向」PCRプライマー)および促進因子オリゴヌクレオチド(60)の役割を概略的に示す。図1Aにおいて示されない標的ヌクレオチド配列の端に、任意の適した逆方向プライマーを利用することができ、またはその代わりに、第2の開始因子プライマーおよび対応する第2の促進因子オリゴヌクレオチドを使用することもできる。
図1Aの概略図に戻ると、二本鎖鋳型配列を変性させるための最初のステップの後に、反応を冷却して、開始因子プライマー(10)を単鎖鋳型(20)上の相補配列に結合させる(ステップ1)。開始因子プライマー(10)は、プライマーの3'端にまたはその近くに修飾(15)を含む。順方向鎖合成は、開始因子プライマーの3'端から開始され(ステップ2)、それによって新しい核酸鎖(30)を生成する。第2の変性ステップに続いて、逆方向鎖合成(40)は、鋳型として開始因子プライマーを組み込む、新しく合成された鎖(30)を用いて、逆方向プライマー(示さず)によって開始される(ステップ3)。しかしながら、開始因子プライマー(10)によって提供されるように、新しい鋳型中に存在する修飾(15)の存在によって複製がブロックされるので、逆方向鎖(40)の合成は、早期に終結する(50)。後の変性ステップに続いて、促進因子オリゴヌクレオチド(60)は、開始因子プライマー(10)の3'端と比較した、促進因子オリゴヌクレオチド(60)の3'端の、より大きな配列結合能のおかげで、ステップ3において生成される不完全な逆方向鎖(40)に、開始因子プライマー(10)に対して優先的にハイブリダイズする(ステップ4)。促進因子オリゴヌクレオチド(60)は、オリゴヌクレオチドの3'端にまたはその近くに修飾(65)を含む。促進因子オリゴヌクレオチド(60)は、その後、逆方向鎖(70)の完成および開始因子プライマーの完全結合部位の再生成が達成されるように、逆方向鎖(40)上の伸長部分の鋳型として作用する(ステップ4)。このポイントで、大部分またはすべての完全長二本鎖材料を変性させることなく、鋳型(40)から促進因子オリゴヌクレオチド(60)を解離するであろう温度まで反応を加熱する任意選択のステップがある。反応は、その後、冷却されて、開始因子プライマー(10)の結合および順方向鎖(80)合成のさらなるラウンドを可能にする(ステップ5)。
代替の実施形態は、図1Bにおいて例示される。二本鎖鋳型配列を変性させるための最初のステップの後に、反応を冷却して、開始因子プライマー(10)を単鎖鋳型(20)上の相補配列に結合させる(ステップ1)。開始因子プライマー(10)は、プライマーの3'端にまたはその近くに修飾(15)を含む。順方向鎖合成は、開始因子プライマーの3'端から開始され(ステップ2)、それによって新しい核酸鎖(30)を生成する。第2の変性ステップに続いて、逆方向鎖合成(40)は、鋳型として開始因子プライマーを組み込む、新しく合成された鎖(30)を用いて、逆方向プライマー(示さず)によって開始される(ステップ3)。しかしながら、開始因子プライマー(10)によって提供されるように、新しい鋳型中に存在する修飾(15)の存在によって複製がブロックされるので、逆方向鎖(40)の合成は、早期に終結する(50)。後の変性ステップに続いて、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー(11)に実質的に類似する5'領域を有する促進因子オリゴヌクレオチド(61)は、開始因子プライマー(10)または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー(11)のいずれかと比較した、促進因子オリゴヌクレオチド(61)の3'端の、より大きな配列結合能のおかげで、ステップ3において生成される不完全な逆方向鎖(40)に、開始因子および促進因子オリゴヌクレオチドプライマーの両方に対して優先的にハイブリダイズする(ステップ4)。促進因子オリゴヌクレオチド(61)は、オリゴヌクレオチドの3'端にまたはその近くに修飾(65)を含む。促進因子オリゴヌクレオチド(61)は、その後、逆方向鎖(71)の完成および促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーの完全結合部位の再生成が達成されるように、逆方向鎖(40)上の伸長部分の鋳型として作用する(ステップ4)。このポイントで、任意の完全長二本鎖材料を変性させることなく、鋳型(40)から促進因子オリゴヌクレオチド(61)を解離するであろう温度まで反応を加熱する好ましいステップがある。反応は、その後、冷却されて、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー(11)の結合および順方向鎖(80)合成のさらなるラウンドを可能にする(ステップ5)。開始因子プライマーにおける修飾(15)および促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーにおける修飾(15)が、同じでもよく、または異なっていてもよいことは当業者らによって十分に理解されるであろう。
アンプリコン鋳型配列を使用する順方向鎖合成は、開始因子プライマーまたは促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが、促進因子オリゴヌクレオチドによる逆方向鎖の3'端の再生成に続いて、完全に合成された逆方向鎖にアニールすることを必要とする。
増幅サイクルのこの段階の間に、開始因子プライマーまたは促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドの間の配列結合における競合は、好ましくは最小限にされる。一実施形態において、開始因子プライマーまたは促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーの結合は、低濃度の促進因子オリゴヌクレオチドを使用すること、および/またはオリゴヌクレオチド配列において修飾を組み込むことによって、促進因子オリゴヌクレオチドの結合に対して促進することができる。たとえば、開始因子プライマーまたは促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーの結合は、シトシンの代わりの5メチルシトシンなどの、当業者らに知られている、プライマー配列における修飾の使用、INAもしくはPNAの使用、またはマイナーグルーブバインダーの5'末端での付加によって増強することができる。さらに、促進因子オリゴヌクレオチド配列結合の安定性は、グアニンの代わりに、イノシンまたはデアザグアニンなどの代替の塩基を使用することによって低下させることができる。
他の実施形態において、標的配列が、特異的に増幅されることになっている配列変化(たとえば突然変異)を有する場合、これは、この領域への促進因子オリゴヌクレオチドの配列特異的ハイブリダイゼーションに依存する増幅を成すことによって達成することができる。この原理は、たとえば突然変異の検出および重亜硫酸処理の後に差次的にメチル化されたDNAの選択的増幅に適用することができる。比較的小さな選択性のみが増幅の単一のステップにおいて達成される場合でさえ、この選択性が、増幅の全期間にわたって起こるので、選択性は、反応の経過にわたって著しく増強される。
さらなる実施形態において、本発明の方法の使用は、付加および/または伸長などの操作を増幅産物に組み込むことを可能にする。たとえば、促進因子オリゴヌクレオチド上の5'尾部が、開始因子プライマーまたは促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーを組み込むアンプリコン鋳型配列の3'端よりも長いように作製される場合、最終増幅産物は、3'一本鎖伸長部分を有するであろう。この配列伸長部分は、その後、たとえばプライマー/プローブを結合し、かつ/または異なる基質に増幅産物を付加するための、特有の配列結合部位として使用することができる。
典型的には、本発明に従って分析されることとなる核酸分子は、DNAを含む。しかしながら、適切な試薬、たとえばRNAの増幅または複製に適切なRNAポリメラーゼまたは逆転写酵素であることを条件として、当業者は、本発明の方法がまた、RNAなどの他の核酸分子に適用可能であることを容易に十分に理解するであろう。
他の増幅方法のように、本発明の方法において使用されるアニーリング時間、伸長時間、増幅サイクルの数、および温度などの条件は、特異的な配列に依存し、個々の最適化を必要とする。そのような最適化は、当業者らの技術および能力の範囲内にあり、単なる日常的な実験を必要とするにすぎない(たとえばSambrook, J.およびRussell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第3版、2001年ならびにDieffenbach, C. W.およびDveksler, G.S. (編) PCR Primer: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、2003年を参照されたい;これらの開示は、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる)。さらに、本発明の方法は、プライマー伸長産物としてのヌクレオチド配列の合成を触媒することができる任意の適した酵素を利用してもよい。多種多様のポリメラーゼは、入手可能であり、本発明に従う使用に適しており、そのようなポリメラーゼは、当業者に知られている。特定の実施形態において、ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼである。DNAポリメラーゼは、たとえば、大腸菌(E. coli)DNAポリメラーゼI、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow断片、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、T.リトラリス(T. litoralis)DNAポリメラーゼ、Taq、Tth、Pfu、Vent、deep vent、およびUlTmaポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼ、ならびにその変種および誘導体を含む群から選択することができる。
共通の配列が、増幅されることとなる核酸分子の端に付加される他の方法のように、本発明の増幅方法は、多重PCRに容易に適応させることができる。
本発明に従って実行される増幅反応の産物は、ゲル電気泳動、SYBR Greenなどの非特異的核酸結合色素を使用するリアルタイムモニタリング、配列特異的蛍光プローブ、またはアレイへのハイブリダイゼーションを含むが、これらに限定されない、当業者らによく知られている標準的な方法によって検出することができる。
当業者らは、標準的なPCR方法論におけるオリゴヌクレオチドプライマー設計と関連する限界を十分に理解するであろう。類似する限界はまた、PCR増幅産物の検出において使用できるオリゴヌクレオチドプローブの設計にも当てはまる。プローブは、典型的には、プローブが、一本鎖標的に結合することができるように、プライマーよりもよくハイブリダイズすることができるように設計されなければならない。したがって、プローブは、プライマーと比較して、それらが比較的高温で結合することを可能にするために、普通長くなければならない、または修飾を有していなければならない。より短いプローブを使用するために、PCRに対する改変は、PCR指数関数的増幅における一本鎖核酸分子の産生が、限られた数のサイクルについてのみ起こり、その後、直線的な増幅が続くことを可能にするように成さなければならない。これは、典型的には、プライマーのうちの一方の濃度を制限することによってまたは異なる結合温度のプライマーを使用し、PCRの間にアニーリング温度の上昇を利用することによって達成される。これらの限界は、3'一本鎖タグ-蛍光プローブを使用する指数関数的増幅を、伸長フェーズの後にこれらの領域に結合させるために使用することができることを可能にする本発明の一実施形態に従う増幅方法を使用して克服することができる。さらに、伸長フェーズ(たとえば72℃)の後に、選択された温度(たとえば40℃、50℃、および60℃)でのオリゴヌクレオチドプローブ結合を測定することができる。異なる融解プローブ/タグの組合せと異なる蛍光色素を組合せることによって、多数の反応の多重化は、達成することができる。あるいは、新しい検出技術は、タグ結合部位を使用して開発することができる。本発明の一実施形態によれば、3'伸長部分の存在は、たとえば、それらが、3'一本鎖タグの伸長によって複製される場合にのみ蛍光を発するであろうモレキュラービーコン様のプローブの開発を可能にする。当業者らは、適した促進因子オリゴヌクレオチド、開始因子プライマー、および促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーの特異的な配列が、標的核酸配列の配列およびこの方法が使用される特定の適用に依存して、最適化されることが必要とされることを十分に理解するであろう。適したオリゴヌクレオチドおよびプライマー配列の設計は、十分に、当業者の能力の範囲内にあり、単なる日常的な実験を必要とするにすぎない。
あらゆる先の刊行物(またはそれに由来する情報)または知られているあらゆる事柄への本明細書における言及は、先の刊行物(もしくはそれに由来する情報)または知られている事柄が、本明細書が関する試みの分野における共通の一般知識の一部を形成するといった承認または許可または示唆のあらゆる形態としてみなされず、またみなされるべきではない。
ここで、以下の特定の実施例を参照して本発明を説明するが、これらは、本発明の範囲を限定するとして決して解釈されるべきではない。
(実施例)
方法および材料
修飾オリゴヌクレオチドプライマー
プライマー伸長を終結させるプライマー修飾の例は、以下のとおりとする:2'-Oメチルヌクレオチド-小文字(たとえば、2'Oメチルウリジンについてはu)、イノシン-I、脱塩基部位-△、および/または+ddG-ターミナルトランスフェラーゼを使用してオリゴヌクレオチドの端に付加されたジデオキシグアノシン。脱塩基部位は、オリゴヌクレオチド合成の間のd-スペーサーの組み込みまたはデオキシウリジンのいずれかによって含めた。後者の場合において、ウラシルは、37℃で2時間、200μLのTEX緩衝液(10mM Tris HCl、0.1mM EDTA、0.01%Triton-X 100)において、4ユニットのウラシルDNAグリコシラーゼ(New England Biolabs)を用いて、5μM(つまり1nmole)でオリゴヌクレオチドを処理することによって、脱塩基部位に変換した。
方法および材料
修飾オリゴヌクレオチドプライマー
プライマー伸長を終結させるプライマー修飾の例は、以下のとおりとする:2'-Oメチルヌクレオチド-小文字(たとえば、2'Oメチルウリジンについてはu)、イノシン-I、脱塩基部位-△、および/または+ddG-ターミナルトランスフェラーゼを使用してオリゴヌクレオチドの端に付加されたジデオキシグアノシン。脱塩基部位は、オリゴヌクレオチド合成の間のd-スペーサーの組み込みまたはデオキシウリジンのいずれかによって含めた。後者の場合において、ウラシルは、37℃で2時間、200μLのTEX緩衝液(10mM Tris HCl、0.1mM EDTA、0.01%Triton-X 100)において、4ユニットのウラシルDNAグリコシラーゼ(New England Biolabs)を用いて、5μM(つまり1nmole)でオリゴヌクレオチドを処理することによって、脱塩基部位に変換した。
ヌクレオチド配列鋳型
ヌクレオチド標的配列鋳型は、標的領域に対応する合成単鎖核酸分子から調製した。標準的なPCR増幅は、二本鎖標的配列鋳型を増幅し、生成するために使用した。増幅産物は、その後、10,000分の1に希釈し、標的領域鋳型としてHDCR増幅に使用した。
ヌクレオチド標的配列鋳型は、標的領域に対応する合成単鎖核酸分子から調製した。標準的なPCR増幅は、二本鎖標的配列鋳型を増幅し、生成するために使用した。増幅産物は、その後、10,000分の1に希釈し、標的領域鋳型としてHDCR増幅に使用した。
増幅条件
HDCRの標準的な条件(25μl中)は、以下のとおりに行った:それぞれの実施例において明示されるオリゴヌクレオチド濃度およびサイクリング条件と共に1×Platinum Taq緩衝液[20mM Tris-HCl(pH8.4)および50mM KCl]、4mM MgCl2、0.2mMのそれぞれのdNTP、1/25,000希釈のSYBR Green、およびInvitrogenからの0.5U Platinum Taq DNAポリメラーゼ(ホットスタート)。
HDCRの標準的な条件(25μl中)は、以下のとおりに行った:それぞれの実施例において明示されるオリゴヌクレオチド濃度およびサイクリング条件と共に1×Platinum Taq緩衝液[20mM Tris-HCl(pH8.4)および50mM KCl]、4mM MgCl2、0.2mMのそれぞれのdNTP、1/25,000希釈のSYBR Green、およびInvitrogenからの0.5U Platinum Taq DNAポリメラーゼ(ホットスタート)。
(実施例1)
増幅の成功のための開始因子プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドに対する依存性
本実施例は、本発明の実施形態に従うHDCR増幅技術が、開始因子プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドの両方の存在に依存することを実証する。
増幅の成功のための開始因子プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドに対する依存性
本実施例は、本発明の実施形態に従うHDCR増幅技術が、開始因子プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドの両方の存在に依存することを実証する。
HDCRは、図2において示されるようなヒトAlu反復配列の領域を増幅するために使用した。開始因子プライマーまたは促進因子オリゴヌクレオチドのいずれかを抜いた影響を示す。反応はすべて、二連で行った。図2は、標的領域、開始因子プライマーInAluPr3、促進因子オリゴヌクレオチドInAluFol5、および逆方向プライマーAluRevの配列を示す。開始因子プライマーは、脱塩基部位を含有し、促進因子オリゴヌクレオチドの3'端は、それがプライミングするのを阻止するために、標的核酸配列内に2つの脱塩基部位ならびに2つのミスマッチ(T/TミスマッチおよびG/Tミスマッチ)を含有する。促進因子オリゴヌクレオチドはまた、促進因子オリゴヌクレオチドに対するミスプライミングによって引き起こされるバックグラウンドを低下させるためにさらなる脱塩基部位を含有する。
1μLの1:10,000希釈の核酸鋳型を含有する複製増幅を、Corbett Rotor-Gene 3000 Real-time PCR機において実行した。開始因子プライマーInAIuPr3および促進因子オリゴヌクレオチドInAluFol5は、200nMの濃度で使用し、逆方向プライマーAluRevは40nMの濃度で使用した。熱サイクリング条件は、以下のとおりとした:2分間95℃、その後、1秒間95℃、20秒間60℃、1秒間80℃、および20秒間60℃を40サイクル。SYBR Green蛍光は、最終の60℃のステップにおいて測定した。図3において示されるように、開始因子プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドの増幅産物は、約17サイクルの後に観察されるが、別個の開始因子プライマーの反応または促進因子オリゴヌクレオチドの反応は、40サイクルで検出閾値をまだ通過していない。
(実施例2)
HDCR方法論を用いる選択的増幅
本実施例は、単一の塩基対が異なる核酸鋳型から選択的増幅を達成することが可能であることを実証する。図4において示される配列の中央領域は、v-rafマウス肉腫ウイルス癌遺伝子相同体B1(BRAF)遺伝子の配列の一部に相当する。下線を引いた塩基は、正常配列(NORB)と比較した、共通の発癌性のTからAへの突然変異V600E(MUTB配列)の場所を示す。外側配列は、使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとマッチする。図5において示されるように、順方向開始因子プライマーBRF2は、その3'端から7塩基目に脱塩基部位を含有する。促進因子オリゴヌクレオチドBFol3の3'端は、標的DNAに対して6つのミスマッチを含有し、その伸長を阻止するためにジデオキシGTPによって終結させている。促進因子オリゴヌクレオチドは、突然変異配列と正確にマッチする、BRF2プライマーに隣接する19個の塩基領域を含有するが、正常BRAF配列に対して単一の塩基ミスマッチを含有する(ギャップに下線を引いている)。促進因子オリゴヌクレオチドはまた、促進因子オリゴヌクレオチド/伸長した逆方向鎖二重鎖の安定性を低下させるために、開始因子プライマーと等価な領域において、いくつかのグアニンの代わりにイノシンをも含有する(図5を参照されたい)。
HDCR方法論を用いる選択的増幅
本実施例は、単一の塩基対が異なる核酸鋳型から選択的増幅を達成することが可能であることを実証する。図4において示される配列の中央領域は、v-rafマウス肉腫ウイルス癌遺伝子相同体B1(BRAF)遺伝子の配列の一部に相当する。下線を引いた塩基は、正常配列(NORB)と比較した、共通の発癌性のTからAへの突然変異V600E(MUTB配列)の場所を示す。外側配列は、使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとマッチする。図5において示されるように、順方向開始因子プライマーBRF2は、その3'端から7塩基目に脱塩基部位を含有する。促進因子オリゴヌクレオチドBFol3の3'端は、標的DNAに対して6つのミスマッチを含有し、その伸長を阻止するためにジデオキシGTPによって終結させている。促進因子オリゴヌクレオチドは、突然変異配列と正確にマッチする、BRF2プライマーに隣接する19個の塩基領域を含有するが、正常BRAF配列に対して単一の塩基ミスマッチを含有する(ギャップに下線を引いている)。促進因子オリゴヌクレオチドはまた、促進因子オリゴヌクレオチド/伸長した逆方向鎖二重鎖の安定性を低下させるために、開始因子プライマーと等価な領域において、いくつかのグアニンの代わりにイノシンをも含有する(図5を参照されたい)。
複製HDCR増幅は、Bio-Rad I Cycler Real-time PCR機を使用して実行した。順方向開始因子プライマーBRF2は、200nMで、促進因子オリゴヌクレオチドBFol3は、20nMで、逆方向プライマーCommR3Gは、40nMで含まれ、MgCl2は、2mMの濃度で使用した。熱サイクリング条件は、以下のとおりとした:2分間95℃、その後、5秒間95℃、15秒間68℃または72℃、10秒間83℃、および15秒間68℃または72℃を60サイクル。SYBR Green蛍光は、それぞれのサイクルにおいて最終のステップにおいて測定した。
図6において観察されるように、アニーリング/伸長熱サイクリングステップを68℃で実行した場合、突然変異配列の増幅産物の量は、正常配列増幅産物と比べて、わずかに大きいだけであった。これに対して、アニーリング/伸長熱サイクリングステップを72℃で実行した場合、マッチした正常鋳型の増幅産物の量は、突然変異鋳型増幅産物と比較した場合、非常に低下した。正常(ミスマッチ)配列と比較した、突然変異配列への促進因子オリゴヌクレオチドの選択的なハイブリダイゼーションの有意な温度依存は、選択的な温度で見られる主な差異によって示すことができる(図6)。
(実施例3)
HDCR方法論を使用する選択的増幅および増幅効率の改善
本実施例は、重亜硫酸処理の後に差次的にメチル化されたDNAの選択的増幅にHDCR増幅を使用するための可能性および逆方向鎖の2ステップの合成の効率を改善するための、温度サイクリングにおける中間の加熱ステップの利点の両方を実証する。図7は、重亜硫酸処理の後の、hMLH1遺伝子の領域の重亜硫酸処理から産生した配列を模倣する中央領域(下線を引く)を用いて調製した異なる核酸配列鋳型を示す。両方の配列には、オリゴヌクレオチドプライマー結合のための同じ配列が隣接する。鋳型Mは、CpGジヌクレオチドのシトシンが重亜硫酸処理の後にCとして残存するメチル化DNAを模倣する。鋳型Uは、シトシンがすべて、ウラシル(続いて増幅の後にT)に変換される非メチル化DNAを模倣する。核酸鋳型は、PCRによって調製し、HDCR反応増幅への添加のために1:100に希釈した。開始因子プライマー、促進因子オリゴヌクレオチド、および逆方向プライマーCommR2Gの配列は、図8に示す。
HDCR方法論を使用する選択的増幅および増幅効率の改善
本実施例は、重亜硫酸処理の後に差次的にメチル化されたDNAの選択的増幅にHDCR増幅を使用するための可能性および逆方向鎖の2ステップの合成の効率を改善するための、温度サイクリングにおける中間の加熱ステップの利点の両方を実証する。図7は、重亜硫酸処理の後の、hMLH1遺伝子の領域の重亜硫酸処理から産生した配列を模倣する中央領域(下線を引く)を用いて調製した異なる核酸配列鋳型を示す。両方の配列には、オリゴヌクレオチドプライマー結合のための同じ配列が隣接する。鋳型Mは、CpGジヌクレオチドのシトシンが重亜硫酸処理の後にCとして残存するメチル化DNAを模倣する。鋳型Uは、シトシンがすべて、ウラシル(続いて増幅の後にT)に変換される非メチル化DNAを模倣する。核酸鋳型は、PCRによって調製し、HDCR反応増幅への添加のために1:100に希釈した。開始因子プライマー、促進因子オリゴヌクレオチド、および逆方向プライマーCommR2Gの配列は、図8に示す。
開始因子プライマーMLH2Oは、促進因子オリゴヌクレオチドの非存在下においてそれが指数関数的増幅をもたらすのを阻止するために4つの2'O-メチルヌクレオチド(小文字u)を有する。促進因子オリゴヌクレオチドMLHF1は、促進因子オリゴヌクレオチドに対するミスプライミングから生じるバックグラウンド増幅を阻止するのを助ける、内側のd-スペーサー(脱塩基部位)を有する。3'ミスマッチと組み合わせて、促進因子オリゴヌクレオチドの伸長に干渉することが予想される、3'端近くの2つのd-スペーサーもまたある。促進因子オリゴヌクレオチドの残りは、メチル化核酸配列に正確に対応するが、等価な非メチル化核酸配列と3つのミスマッチもまた有する(図8)。
複製HDCR増幅は、Corbett Rotor-Gene 3000 Real-time PCR機において実行した。HDCR反応混合物は、200nM FDオリゴヌクレオチドプライマーMLH20、20nM促進因子オリゴヌクレオチドMLHF1、および40nM逆方向オリゴヌクレオチドプライマーCommR2Gを含有した。熱サイクリング条件は、以下のとおりとした:2分間95℃、その後、5秒間95℃および40秒間65℃(図9A)または5秒間95℃、20秒間65℃、10秒間74℃、および20秒間65℃(図9B)を60サイクル。中間の加熱ステップを包含する反応および包含しない反応を比較した。両方の条件下で、M鋳型からの増幅は、U鋳型と比較して、非常に優先的であったが、反応速度論は、中間の加熱ステップを包含するとはるかに改善され、それによって、M鋳型からの増幅は、5〜10サイクル進行した(図9B)。追加の、10秒間の74℃のステップでさえ、予想されるメカニズムから予測されるのと同じくらい、HDCRの効率を増加させる。このステップは、ハイブリダイズし、伸長した標的DNAから促進因子オリゴヌクレオチドを取り外し、したがって、一旦、温度が十分に低下したら、開始因子プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする。
(実施例4)
共通の外側プライミング部位の組み込みのためのHDCR
本実施例は、有効な多重化システムを組み立てるために、どのようにHDCRを使用することができるのかを実証する。選択的な増幅は、別個の管において実行したが、同じ「外側」プライマーは両方の反応に使用した。本研究のために選んだ2つのCpGアイランドは、それらが、結腸直腸癌などの多くの癌において過剰メチル化されるようになるので、癌研究において興味深いが、血液を含む正常組織からのDNAにおいて非メチル化のままである。図10は、TMEFF2およびhMLH1のCpGアイランド内の標的配列領域(それぞれ、hg18 chr2:192,767,556〜192,767,775(鎖)およびhg18 chr3:37,010,130〜37,010,262)ならびに重亜硫酸処理メチル化DNAに由来する配列と比べた、プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドの配置を示す。
共通の外側プライミング部位の組み込みのためのHDCR
本実施例は、有効な多重化システムを組み立てるために、どのようにHDCRを使用することができるのかを実証する。選択的な増幅は、別個の管において実行したが、同じ「外側」プライマーは両方の反応に使用した。本研究のために選んだ2つのCpGアイランドは、それらが、結腸直腸癌などの多くの癌において過剰メチル化されるようになるので、癌研究において興味深いが、血液を含む正常組織からのDNAにおいて非メチル化のままである。図10は、TMEFF2およびhMLH1のCpGアイランド内の標的配列領域(それぞれ、hg18 chr2:192,767,556〜192,767,775(鎖)およびhg18 chr3:37,010,130〜37,010,262)ならびに重亜硫酸処理メチル化DNAに由来する配列と比べた、プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドの配置を示す。
鋳型DNA UおよびMは、それぞれ、正常血液DNAまたはCpGとの関連におけるシトシンを5-メチルシトシン(5mC)に変換することが知られているSsslメチラーゼを用いて処理した血液DNAのいずれかとした。5mCは、重亜硫酸による変換に対して抵抗性であるが、非メチル化Cは、Uに(後に、dTTPを含有する増幅においてTに)変換されると予想される。重亜硫酸処理の後に、非メチル化されている、試験する領域内のCはすべて、重亜硫酸によってUに、後に、PCRによってTに変換されると予想される。この重亜硫酸変換DNAは、「U」と呼ばれるが、実験を行う前に、この特定の血液DNA試料における、選んだ領域の正確なメチル化状態は知られていなかったことに注目すべきである。
重亜硫酸変換の後の、HDCRおよび「外側」依存的プライマーを使用する、hMLH1 CpGアイランド(hg18 chr3:37,010,130〜37,010,262内)の領域のメチル化バージョンおよびTMEFF2 CpGアイランド(hg18 chr2:192,767,556〜192,767,775内)の領域のメチル化バージョンの選択的増幅を示す。
この変異体のHDCRに対する鍵は、開始因子プライマーの使用である(図10)。これらのプライマーは、標的配列にハイブリダイズし、対象とする領域を横切って伸長することができるように設計している。しかしながら、それらは、それらが完全に複製されることを阻止するであろう修飾、本明細書でd-スペーサーを含有する。これは、開始因子プライマーにおける修飾の反対のまたはその周辺における、標的の早期終結をもたらし、したがって、典型的なポリメラーゼ連鎖反応は、可能ではない。この場合の促進因子オリゴヌクレオチドは、開始因子プライマーのものとマッチしないが、その代わりに、反応において存在する他の依存的プライマーの5'領域とマッチする5'尾部を有する。促進因子オリゴヌクレオチドは、開始因子プライマーのプライミング領域に対して3'側の領域を認識する3'ハイブリダイジング部分を有する。促進因子オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する早期終結標的分子は、促進因子オリゴヌクレオチドの5'尾部を複製することができる。これにより、「外側」促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーのためのプライマー結合部位が生成される。これらの依存的プライマーもまた、完全な複製を阻止する修飾(d-スペーサー)を含有するので、増幅は、すべてのサイクルの間に促進因子オリゴヌクレオチドを複製することによる、依存的プライマーのための結合部位の継続的な再生成に依存する。本明細書で提供される実施例において、開始因子プライマーは、それらの標的のMおよびU変異体の両方にプライミングすることができるように設計した。言いかえれば、プライミングは、重亜硫酸変換配列に特異的となるように設計しているが、MまたはU変異体へのいかなる特異性をももたらさないように設計している。これを行うために、メチル化における変化が存在するCpG配列は可能な限り回避する。CpGの場所が開始因子の結合部位内に位置するところでは、それがMおよびUの両方に結合することができるように、CおよびT(または標的とされる鎖に依存してGおよびA)の混合物を開始因子内に使用する。M配列変異体に対する唯一の特異性は、促進因子オリゴヌクレオチドのハイブリダイジング領域内にあり、これは、U配列ではなくM配列とマッチする。
TMEFF2標的についてHDCRにおいて使用したオリゴヌクレオチド配列(5'から3')およびそれらの濃度は、
250nM TMEFInL1 TTTTTAGAGTTTTTTTTTTATGGTAGTΔGTTTTT
250nM TMEFInR1 CCRAACAACRAACTACTAAΔCATCCC
40nM TMEFLdS170
TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTGTΔTTTCGCGTTTTCGGCAA ddG
40nM TMEFRdS133
CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTGTCAΔCCCGCGAACGACGGA ddG
500nM MCD6 TGG555GT5G55GT555T5TGΔTTTGCT
500nM MCD4 CA5A5GT5G5T5GGG55TGTGΔTCTTGT
100nM TPEFMC HEX-AAATTTTCGAGATTATGCGCGGGT TAMRA
とした。
250nM TMEFInL1 TTTTTAGAGTTTTTTTTTTATGGTAGTΔGTTTTT
250nM TMEFInR1 CCRAACAACRAACTACTAAΔCATCCC
40nM TMEFLdS170
TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTGTΔTTTCGCGTTTTCGGCAA ddG
40nM TMEFRdS133
CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTGTCAΔCCCGCGAACGACGGA ddG
500nM MCD6 TGG555GT5G55GT555T5TGΔTTTGCT
500nM MCD4 CA5A5GT5G5T5GGG55TGTGΔTCTTGT
100nM TPEFMC HEX-AAATTTTCGAGATTATGCGCGGGT TAMRA
とした。
hMLH1標的については、
250nM MLHInit2 AATGTTATTAAAGAGATGATTGAGAΔTTGGTA
250nM MLHInit1 CTATACATACCTCTACCCRAACAΔAAAAAC
40nM 131hMLHFoldS2
CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTGTAAAAΔCGTATCCGCGCCAGG-ddG
40nM RMLH170
TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTTTGΔTACGGAGGGAGTCGCC-ddG
500nM MCD6 TGG555GT5G55GT555T5TGΔTTTGCT
500nM MCD4 CA5A5GT5G5T5GGG55TGTGΔTCTTGT
100nM hMLH HEX-ACGCGACCCGTTAAATCGTAACCCT BHQ1
とし、
ここで、△=d-スペーサー、5=メチルシトシン、ddG=ターミナルトランスフェラーゼを使用して導入したジデオキシグアノシン、R=AおよびGの混合物、HEX=ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレスセイン、TAMRA=6-カルボキシテトラメチルローダミン、BHQ1=Black Hole Quencher1とする。下線を引いた塩基=付加したddGと共に伸長を低下させ、または排除するミスマッチ。
250nM MLHInit2 AATGTTATTAAAGAGATGATTGAGAΔTTGGTA
250nM MLHInit1 CTATACATACCTCTACCCRAACAΔAAAAAC
40nM 131hMLHFoldS2
CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTGTAAAAΔCGTATCCGCGCCAGG-ddG
40nM RMLH170
TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTTTGΔTACGGAGGGAGTCGCC-ddG
500nM MCD6 TGG555GT5G55GT555T5TGΔTTTGCT
500nM MCD4 CA5A5GT5G5T5GGG55TGTGΔTCTTGT
100nM hMLH HEX-ACGCGACCCGTTAAATCGTAACCCT BHQ1
とし、
ここで、△=d-スペーサー、5=メチルシトシン、ddG=ターミナルトランスフェラーゼを使用して導入したジデオキシグアノシン、R=AおよびGの混合物、HEX=ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレスセイン、TAMRA=6-カルボキシテトラメチルローダミン、BHQ1=Black Hole Quencher1とする。下線を引いた塩基=付加したddGと共に伸長を低下させ、または排除するミスマッチ。
HDCRは、1×Platinum Taq緩衝液[20mM Tris-HCl(pH8.4)および50mM KCl]、4mM MgCl2、0.2mM dATP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、0.4mM dUTP、1/25,000希釈のSYBR Green、10nMフルオレスセイン、ならびにInvitrogenからの0.4ユニットのPlatinum Taq DNAポリメラーゼ(ホットスタート)を含有する10マイクロリットル容量で二連で実行した。Ssslメチラーゼを使用してインビトロにおいてメチル化し、その後重亜硫酸処理した1ナノグラムのヒト血液DNA(M)を、重亜硫酸処理したが、Ssslメチラーゼ処理を行わなかった同じ血液DNA(U)と比較した。サイクリングは、RotorGene 3000(72本の管用ローター)を使用して実行し、プログラムは、5秒間90℃、2分間95℃、その後、5秒間90℃、15秒間95℃、2分間50℃、10秒間80℃、2分間60℃を10サイクル、その後、FAM/SYBRチャネルでの読み取りと共に15秒間60℃で1回のインキュベーション(自動キャリブレーションをこの温度で行う)、その後、JOEチャネルにおいて90℃での(HEX TaqManプローブの加水分解を検出するため)およびFAM/SYBRチャネルにおいて60℃での(二本鎖DNAの産生を検出するため)読み取りと共に90℃15秒間、50℃1分間、80℃10秒間、60℃1分間を60サイクルとした。90℃5秒間のステップは、次のステップの95℃まで上昇させる場合の、温度のいかなるオーバーシュートをも阻止するために含めた。初期の実験において、RotorGene 3000において10マイクロリットルなどの容量を使用する場合、非常に低い温度から95℃まで直接上昇させることは有害となり得ることが分かった。
2つの異なる標的、TMEFF2(パネルA)およびhMLH1(パネルB)についてのメチル化配列の増幅の成功について図11に示す。加水分解プローブの加水分解によるHEX蛍光の産生は、メチル化バージョンの増幅の成功を示す。これは、TMEFF2およびhMLH1標的の両方について起こる。SYBR Greenの存在は、任意の他の増幅されたDNAの検出を可能にする。非標的配列は、TMEFF2の場合においてはあまり十分に増幅されず、hMLH1の場合においては全く増幅されないことが分かる。d-スペーサーは、本実施例において、それぞれの促進因子オリゴヌクレオチドのハイブリダイジング領域内に含まれる。この1つの利点は、これが、促進因子オリゴヌクレオチドの融解温度を低下させ、したがって、修復された標的への結合についての、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーと競合するためのその能力を低下させることである。第2の可能性として考えられる利点は、d-スペーサーに対して3'側の促進因子オリゴヌクレオチドハイブリダイジング領域の領域に部分的にまたは完全にマッチする可能性を有する非標的分子からの伸長による、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域の複製を阻止することである。同じ依存的プライマーは、両方の場合において使用し、したがって、存在する標的のいずれかまたはすべてを増幅することができる1対の依存的プライマーと共に開始因子および促進因子オリゴヌクレオチドの使用を通して、特定の(1つまたは複数の)標的に対する特異性が達成される多重HDCRシステムを達成するための可能性を示した。
(実施例5)
HDCRのオリゴヌクレオチド依存性
hMLH1標的を使用する本実施例は、3つすべてのオリゴヌクレオチド(標的の一方の端のみを考慮する)がHDCRに必要とされることを示す。緩衝液およびサイクリング条件は、前の実施例においてhMLH1に使用したものと同じとしたが、この場合において、反応はすべて、1ナノグラムの重亜硫酸変換Ssslメチル化DNA(M)を含有した。複製反応のうちのいくつかは、HDCRの成功のためのそのオリゴヌクレオチドの必要性を確立するために特定のオリゴヌクレオチドを欠いた。HEX(加水分解プローブ)およびSYBR Greenの両方は、50サイクル分を含有する段階の間に60℃のステップで読み取った。結果を図12に示す。加水分解プローブおよびSYBR Greenを使用して得た曲線の間で差異はほとんどなく、hMLH1標的が特異的に増幅されたことを示唆した。試験したオリゴヌクレオチドの3つすべてが存在した場合、増幅は、サイクル20の直後に最初に検出された。開始因子のうちの1つであるMLHInit2を反応から抜いた場合、増幅は、反応のうちの1つについて、サイクル35の後に検出することができたにすぎなかった。他の複製反応において、増幅は検出されなかった。促進因子オリゴヌクレオチドRMLH170または外側依存的プライマーMCD6のいずれかを抜くと、非常に遅い増幅がもたらされた。これは、HDCRの成功が、3つすべてのオリゴヌクレオチドの包含に依存することを示す。標的の他端を対象とする、対応するオリゴヌクレオチドは、反応のすべてにおいて存在した。
HDCRのオリゴヌクレオチド依存性
hMLH1標的を使用する本実施例は、3つすべてのオリゴヌクレオチド(標的の一方の端のみを考慮する)がHDCRに必要とされることを示す。緩衝液およびサイクリング条件は、前の実施例においてhMLH1に使用したものと同じとしたが、この場合において、反応はすべて、1ナノグラムの重亜硫酸変換Ssslメチル化DNA(M)を含有した。複製反応のうちのいくつかは、HDCRの成功のためのそのオリゴヌクレオチドの必要性を確立するために特定のオリゴヌクレオチドを欠いた。HEX(加水分解プローブ)およびSYBR Greenの両方は、50サイクル分を含有する段階の間に60℃のステップで読み取った。結果を図12に示す。加水分解プローブおよびSYBR Greenを使用して得た曲線の間で差異はほとんどなく、hMLH1標的が特異的に増幅されたことを示唆した。試験したオリゴヌクレオチドの3つすべてが存在した場合、増幅は、サイクル20の直後に最初に検出された。開始因子のうちの1つであるMLHInit2を反応から抜いた場合、増幅は、反応のうちの1つについて、サイクル35の後に検出することができたにすぎなかった。他の複製反応において、増幅は検出されなかった。促進因子オリゴヌクレオチドRMLH170または外側依存的プライマーMCD6のいずれかを抜くと、非常に遅い増幅がもたらされた。これは、HDCRの成功が、3つすべてのオリゴヌクレオチドの包含に依存することを示す。標的の他端を対象とする、対応するオリゴヌクレオチドは、反応のすべてにおいて存在した。
Claims (30)
- 核酸分子内に位置する標的ヌクレオチド配列の選択的増幅のための方法であって、核酸分子(「鋳型」分子)を、
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含むステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと
を含む方法。 - (a)鋳型核酸分子を変性させるステップと、
(b)変性した鋳型核酸分子を少なくとも1つの開始因子プライマーと接触させ、それから第2の鎖合成を開始し、それによって、新しく合成された鎖に開始因子プライマーからの修飾を導入するステップと、
(c)そのように生成された二本鎖分子を変性させて、開始因子プライマーが結合する標的ヌクレオチド配列の反対の端に位置するプライマーからの逆方向の鎖合成を開始し、それによって、逆方向の鎖合成が、ステップ(b)において導入された修飾により、早期に終結するステップと、
(d)新しく合成された二本鎖分子を変性させて、ステップ(c)において生成された不完全な逆方向の鎖に促進因子オリゴヌクレオチドを結合し、それから鎖伸長を開始して、それによって逆方向の鎖を完成させるステップと、
(e)1回または複数回のさらなるサイクルでステップ(a)〜(d)を任意選択で反復するステップと
を含む、請求項1に記載の方法。 - 開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖伸長に続いて再生成され、それによって、開始因子プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が開始因子プライマーと十分な配列同一性を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成に続いて再生成されないように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が開始因子プライマーと不十分な配列同一性を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーをさらに使用し、前記プライマーが、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成から促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位が生成され、それによって、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域と十分な配列同一性を有する、請求項4に記載の方法。
- 所望の標的配列の増幅の特異性を改善し、同時に、所望されない非標的配列の増幅を実質的に低下させ、または排除するために使用される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 鋳型核酸分子が、組織、細胞、および/またはその抽出物から選択される生物学的試料中に存在する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドの3'伸長をブロックする少なくとも1つの修飾が、3'末端のまたはその近くの1つまたは複数の非伸長性部分またはヌクレオチド類似体の組み込みを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの修飾が、単一の3'末端非伸長性塩基もしくは塩基類似体、3'末端非伸長性塩基およびオリゴヌクレオチドの3'末端の近くの1つもしくは複数のヌクレオチドミスマッチの組合せおよび/またはオリゴヌクレオチドの3'末端の近くの脱塩基部位の組み込みを含む、請求項8に記載の方法。
- 非伸長性塩基が、2',3'ジデオキシヌクレオチド、3'C3、C18もしくは他の長さのスペーサー、3'リン酸化ヌクレオチド、「ペプチド核酸」塩基、「ロックド核酸」(LNA)塩基、ヌクレオチドアミン誘導体、ウラシルDNAグリコシラーゼを用いて処理されたウラシル、RNAもしくは2'O-メチルヌクレオチド、またはこれらの組合せから選択される、請求項9に記載の方法。
- 開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが、1つまたは複数のスペーサー、脱塩基部位、または2'-O-メチルヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドの包含によって修飾される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーにおける修飾が、プライマーが3'伸長を開始する能力を保持する一方で、そのプライマー配列内に修飾を含有する伸長産物が複製される場合に、相補鎖が早期に切断され、後の増幅サイクルにおけるプライマー結合を阻止するように、プライマーの3'末端の十分近くに位置する、請求項11に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドの5'末端が、開始因子プライマーの5'末端と一致する、または開始因子プライマーに含まれる、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドの5'末端が、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーの5'末端と一致する、または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーに含まれる、請求項5から12のいずれか一項に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの5'端に存在する配列に付加的な配列を含む、伸長された5'尾部を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドが、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーの5'端に存在する配列に付加的な配列を含む、伸長された5'尾部を含む、請求項5から12のいずれか一項に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドの5'尾部が、検出可能なタグまたは標識の付加を促進する、請求項15または16に記載の方法。
- 標的配列に隣接する両方のオリゴヌクレオチドプライマーが開始因子プライマーであり、2つの促進因子オリゴヌクレオチドを使用し、これらのうちの一方が、順方向開始因子プライマーと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合し、他方が、逆方向開始因子プライマーと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合する、請求項1に記載の方法。
- 開始因子プライマー結合部位が、少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖伸長に続いて再生成され、それによって、対応する開始因子プライマーが、鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が、対応する開始因子プライマーと十分な配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 開始因子プライマー結合部位が、少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成に続いて再生成されないように、少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が、対応する開始因子プライマーと不十分な配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーをさらに使用し、前記プライマーが、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成から促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位が生成され、それによって、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、対応する促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域と十分な配列同一性を有する、請求項20に記載の方法。
- 2つの促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーを使用し、これらのうちの一方が、一方の促進因子オリゴヌクレオチドと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合し、他方が、他方の促進因子オリゴヌクレオチドと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合する、請求項21に記載の方法。
- 熱サイクルの酵素的増幅反応の特異性を改善するための方法であって、反応が、核酸分子内に位置する、対象とする標的ヌクレオチド配列に隣接する少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、前記プライマーの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾されており、反応が、少なくとも1つの非プライミング促進因子オリゴヌクレオチドをさらに利用し、促進因子オリゴヌクレオチドが、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含み、促進因子オリゴヌクレオチドおよび修飾プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、修飾プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含む方法。
- 熱サイクルの酵素的増幅反応の特異性が、対象とする標的ヌクレオチド配列を含まない増幅産物の消失またはその量の低下によって決定される、請求項23に記載の方法。
- 核酸分子内に位置し、変異配列を含む標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅するステップを含む、変異ヌクレオチド配列を検出するための方法であって、
核酸分子(「鋳型」分子)を、
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な3'配列をさらに含み、前記3'配列は、対応する非変異配列へではなく、変異配列を含む標的ヌクレオチド配列への促進因子オリゴヌクレオチドの優先的な結合を可能にするステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと、
増幅された産物のヌクレオチド配列を非変異標的配列に対応する配列と比較して、変異ヌクレオチド配列を検出するステップと
を含む方法。 - 開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖伸長に続いて再生成され、それによって、開始因子プライマーが、鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が開始因子プライマーと十分な配列同一性を有する、請求項25に記載の方法。
- 開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成に続いて再生成されないように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が開始因子プライマーの対応する領域と不十分な配列同一性を有する、請求項25に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーをさらに使用し、前記プライマーが、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成から促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位が生成され、それによって、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域と十分な配列同一性を有する、請求項27に記載の方法。
- 変異配列が、1つもしくは複数のヌクレオチドの付加、欠失、もしくは置換または標的配列内の1つもしくは複数のヌクレオチドに対するメチル化状態の変化などの修飾を含む、請求項25から28のいずれか一項に記載の方法。
- DNAメチル化分析において、かつ/または被験者における疾患もしくは状態の診断もしくはそれに対する感受性の予測において利用され、疾患または状態が、遺伝子配列における変化によって特徴づけられ、またはそれと関連する、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
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