JP2003526344A

JP2003526344A - 加ピロリン酸分解活性化重合（ｐａｐ）：アリル−特異的増幅および核酸配列決定への適応

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Publication number: JP2003526344A
Application number: JP2001561783A
Authority: JP
Inventors: リュウ，チャン; サマー，スティーヴ・エス
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 2000-02-23
Filing date: 2001-02-22
Publication date: 2003-09-09
Anticipated expiration: 2021-02-22
Also published as: EP1259646B1; DE60139762D1; AU4162101A; JP4989004B2; EP1259646A2; WO2001062975A9; CA2395391C; US20030092051A1; ATE441726T1; WO2001062975A2; EP2112233A1; EP2112233B1; AU2001241621B2; WO2001062975A3; US6534269B2; CA2395391A1; US7105298B2; ES2330408T3; US20020127554A1

Abstract

(57)【要約】加ピロリン酸分解活性化重合（PAP）の新規方法が開発された。PAPでは、DNAポリメラーゼによる加ピロリン酸分解および重合は、3'末端に非伸長可能3'-デオキシヌクレオチドを有する活性化可能オリゴヌクレオチドP^*を使用することにより各々の増幅について連続的に結合される。PAPは、指数関数的増幅あるいは線形的増幅に適用できる。PAPは、まれなアリルには3'末端で正確にマッチするが野生型アリルには3'末端あるいはその近くでのミスマッチを有する活性化可能オリゴヌクレオチドP^*を使用することにより、1つあるいはそれ以上の野生型アリルを有する混合物中のまれなアリルの増幅に適用できる。PAPは、3'末端から16ヌクレオチド離れたところまでの3'特異的部分配列中のミスマッチにより阻害される。PAPは、野生型アリルの存在下で非常にまれな変異アリルの検出の特異性を大きく増加させることができる。特異性は、加ピロリン酸分解および重合から生じるが、それは顕著な非特異的増幅が、非常にまれな事象である、DNAポリメラーゼによるミスマッチ加ピロリン酸分解および間違った組み込みの組み合わせを必要とするからである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明は核酸の重合および増幅に関する。特に、核酸の増幅のための新規のお
よび一般的な方法に関し、そこでは加ピロリン酸分解および重合は連続的に結合
される。方法は、アリル特異的増幅に適応され、野生株アリル中で極度にまれな
アリルを検出するための特異性を大いに増加することができる。我々は、加ピロ
リン酸活性化重合（PAP）として方法に言及する。

【０００２】発明の背景を明らかにするため、あるいは実施に関するさらなる詳細を提供す
るために、ここで使用される刊行物およびその他の資料は参考文献により援用さ
れ、便宜上各々添付の参考文献のリストにまとめられる。

【０００３】 10⁶-10⁹の野生株アリルにおいて1つの変異を検出する方法は、微小残存病変（
緩解中のまれに残存する癌細胞、特にp53遺伝子あるいは以前に腫瘍内で同定さ
れたその他の抑制遺伝子における変異）および変異負荷（mutation load）の測
定（血液あるいは尿などの、正常な組織に存在する特異的な体細胞変異の頻度）
を含む多くの応用にとって都合が良いであろう。高い変異負荷を有する個人は、
ゲノムの完全さを維持するために必要な数百の遺伝子において、環境的な暴露あ
るいは内生的な欠損のいずれかに対する癌の危険度が増加しているかもしれない
。高い変異負荷を有することが見出されるそれらの個人にとって、変異パターン
を明らかにすることにより病因の糸口を得ることができる。

【０００４】特異的なアリルのPCR増幅（PASA）、PNAクランピングブロッカーPCR、アリル
特異的競合ブロッカーPCR、MAMA、およびRFLP/PCRを含む、細胞の10％未満に存
在する変異（すなわち、まれなアリル）を検出する複数の方法が開発された（1
）。これらの方法は、i）まれなアリルを選択的に増幅する、ii）豊富な野生型
アリルを破壊する、あるいはiii）野生型アリルからまれなアリルを空間的に分
離する。RFLP/PCRは、10^-8の最も高い特異性を有すると報告されたが（2）、し
かし我々の場合、特異性は10^-3から10^-4であった（3）。選択的にまれなアリル
を増幅する方法はPASAを含み、それは40分の1未満かあるいは等しい特異性を日
常的に有する（4）。

【０００５】 DNAポリメラーゼは、DNA増幅に重要であり、以下の反応のいくつかあるいは全
てを触媒する：i）デオキシヌクレオチド三リン酸の重合；ii）ピロリン酸（PPi
）の存在におけるDNAの二本鎖の加ピロリン酸分解；iii）3'-5'エキソヌクレア
ーゼ活性およびiv）5'-3'エキソヌクレアーゼ活性（5, 6）。TaqおよびTfl DNA
ポリメラーゼについて、重合および5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が報告された
（7-9）。T7 Sequenase^TM DNAポリメラーゼについて、加ピロリン酸分解により
サンガー配列決定反応において特異的ジデオキシヌクレオチド-終結セグメント
（terminated segment）の減少を導くことができる（10, 11）。

【０００６】ジデオキシターミネーションおよび変性ゲル電気泳動を使用するサンガー配列
決定（27）、化学的開裂および変性ゲル電気泳動を使用するマクサム-ギルバー
配列決定（28）、DNAポリメラーゼ反応中に放出されるピロリン酸（PPi）を検出
するピロ-配列決定（29）、およびオリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイ
ゼーションによる配列決定（SBH）（30-35）などの、多くのDNA配列決定方法お
よびそれらの変法がある。

【０００７】ここでは、我々は加ピロリン酸分解活性化重合（PAP）、つまりPASAの特異性
を劇的に亢進する潜在能力を有するアプローチ、を記載する。我々はまた、PAP
によるDNA配列決定の新規方法も記載する。

【０００８】発明の概略本発明は、核酸テンプレート鎖上にて所望する核酸鎖を合成する加ピロリン酸
分解活性化重合（PAP）方法である。この方法は、連続的に実行される以下のス
テップを含む。

【０００９】（a）テンプレート鎖に対する相補的な活性化可能オリゴヌクレオチドP^*のア
ニーリング。この活性化可能オリゴヌクレオチドは、その3'末端に非伸長可能（
non-extendable）3'-デオキシヌクレオチドを有する。それは、その3'末端ある
いはその近くにおいて、テンプレート鎖上で対応するヌクレオチドをミスマッチ
させるヌクレオチドを持たない。従って、末端3'-デオキシヌクレオチドは、オ
リゴヌクレオチドP^*がアニールされるとき、テンプレート鎖とハイブリダイズす
る。

【００１０】（b）ピロリン酸および加リン酸分解活性を有する酵素を用いたアニールされ
た活性化可能オリゴヌクレオチドP^*の加ピロリン酸分解。これは、ハイブリダイ
ズされた末端3'-デオキシヌクレオチドの除去によりオリゴヌクレオチドP^*を活
性化する。

【００１１】（c）4つのヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下において、
テンプレート鎖上での活性化オリゴヌクレオチドP^*の伸長による重合して、所望
する核酸鎖を合成。

【００１２】 PAP法は、以下の追加的なステップにより所望する核酸鎖を増幅するため利用
できる。（d）テンプレート鎖からのステップ（c）の所望する核酸鎖の分離。

【００１３】（e）所望する核酸鎖の増幅の所望するレベルが達せられるまでのステップ（a
）〜（d）の繰り返し。好ましい観点において、上記したようなPAP法はアリル特異的増幅に応用され
る。この応用において、核酸テンプレート鎖は1つのアリルのセンスあるいはア
ンチセンス鎖であり、2番目のアリルの対応（センスあるいはアンチセンス）核
酸鎖（アリル鎖（allelelic strand））との混合物中に存在する。活性化可能オ
リゴヌクレオチドP^*は、対立鎖（allelic strand）の対応ヌクレオチドとミスマ
ッチする少なくとも1つのヌクレオチドを、その3'末端あるいはその近くに有す
る。ミスマッチのため、PAP法のステップ（a）において、オリゴヌクレオチドP^* の末端3'-デオキシヌクレオチドはアリル鎖に対してハイブリダイズしない。ス
テップ（b）において、加ピロリン酸分解は対立鎖にアニールされた活性化可能
オリゴヌクレオチドP^*から非ハイブリダイズ末端3'-デオキシヌクレオチドを実
質的には除去しない。ステップ（c）において、オリゴヌクレオチドP^*は対立鎖
上において重合では実質的には伸長しない。結果として、テンプレート鎖上で合
成される所望される核酸鎖は、アリル鎖上で合成されるあらゆる核酸鎖にわたり
優先的に増幅される。

【００１４】 PAP法を使用して、RNAあるいはDNAのいずれかを増幅できる。DNAを増幅するた
めに使用するとき、活性化可能オリゴヌクレオチドP^*は2'-デオキシオリゴヌク
レオチドであり、末端デオキシヌクレオチドは2', 3'-ジデオキシヌクレオチド
であり、4つのオリゴヌクレオシド三リン酸は2'-デオキシヌクレオシド三リン酸
であり、および核酸ポリメラーゼはDNAポリメラーゼである。ステップ（c）で使
用するDNAポリメラーゼはまた、ステップ（b）で使用する加ピロリン酸分解活性
を有する酵素でもありうる。加ピロリン酸分解活性を有する好ましいDNAポリメ
ラーゼは、耐熱性Tfl、Taq、およびAmpliTaqFsおよびThermoSequenase^TMなどの
遺伝子操作したDNAポリメラーゼである。これらの遺伝子操作したDNAポリメラー
ゼは、それらの活性部位に変異F667Yを有し、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が除
去されている。AmpliTaqFsおよびThermoSequenase^TMなどの遺伝子操作したDNAポ
リメラーゼの使用により、PAPの効率が大きく亢進する。

【００１５】 PAP法による増幅は、線形的あるいは指数関数的となりうる。線形的増幅は、
活性化可能オリゴヌクレオチドP^*が使用される唯一の相補的オリゴヌクレオチド
であるときに得られる。指数関数的増幅は、所望する核酸鎖に対して相補的であ
る第2オリゴヌクレオチドが存在するときに得られる。活性化可能オリゴヌクレ
オチドP^*および第2オリゴヌクレオチドは、増幅のために標的となる領域に隣接
する。ステップ（a）において、第2オリゴヌクレオチドは、ステップ（d）の分
離された所望する核酸鎖産物にアニールする。ステップ（c）において、重合は
所望する核酸鎖上で第2オリゴヌクレオチドを伸長して、核酸テンプレート鎖の
コピーを合成する。ステップ（d）において、合成核酸テンプレート鎖は所望す
る核酸鎖から分離される。ステップ（a）から（d）は、所望するレベルの指数関
数的増幅が達成されるまで繰り返される。

【００１６】 PAP法では、もし活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖との
間のミスマッチがP^*の3'末端にあるP^*の3'特異的部分配列においてあるいはP^*の
3'末端の16ヌクレオチド内で起こる場合は、そのミスマッチは結果として増幅を
生じない。P^*の3'特異的部分配列におけるそのようなミスマッチによるこの増幅
の欠如により、1塩基置換分析を用いた40億の異なるおよび特異的なオリゴヌク
レオチドが提供される。

【００１７】好ましい観点において、PAP法は1つあるいはそれ以上の野生型アリルを含有す
る混合物におけるまれな変異アリルの指数関数的な増幅のために使用される。ア
リルの鎖は分離されて、一本鎖DNAを提供して、そして以下のステップが連続的
に実行される。

【００１８】（a）各々のアリルのセンスあるいはアンチセンスに対して、3'末端での非伸
長可能2',3'-デオキシヌクレオチドを有する相補的な活性化可能2'-デオキシオ
リゴヌクレオチドP^*のアニーリング。P^*は、変異鎖上で対応する2'-デオキシヌ
クレオチドとミスマッチする2'-デオキシヌクレオチドをその3'末端あるいはそ
の近くに有していないが、野生型鎖上で対応する2'-デオキシヌクレオチドとミ
スマッチする少なくとも1つの2'-オリゴヌクレオチドをその3'末端あるいはその
近くに有する。従って、末端2',3'-デオキシヌクレオチドは変異鎖に対してハイ
ブリダイズするが、オリゴヌクレオチドP^*がアニールされるとき野生型鎖に対し
てはハイブリダイズしない。同時に、各々のアリルのアンチパラレル鎖に相補的
な第2の2'-デオキシオリゴヌクレオチドは、アンチパラレル鎖に対してアニール
される。活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*および第2の2'-デオキシ
オリゴヌクレオチドは、増幅すべき遺伝子の領域に隣接する。

【００１９】（b）ピロリン酸および加リン酸分解活性を有する酵素を用いた、変異鎖に対
してアニールされる活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*の加ピロリン
酸分解。これは、ハイブリダイズした末端2',3'-デオキシヌクレオチドを除去す
ることにより変異鎖に対してアニールされる2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*
を活性化する。それは、変異鎖に対してアニールされる2'-デオキシオリゴヌク
レオチドP^*を実質的には活性化しない。なぜなら非ハイブリダイズ末端2',3'-デ
オキシヌクレオチドが加リン酸分解により実質的には除去されないためである。

【００２０】（c）4つのヌクレオシド三リン酸およびDNAポリメラーゼの存在下における、
変異鎖上での活性化オリゴヌクレオシドP^*の伸長による重合化、および同時期の
、変異および野生型アンチパラレル鎖の両方における第2の2'-デオキシオリゴヌ
クレオチドの伸長。

【００２１】（d）ステップ（c）の伸長産生物の分離。（e）変異アリルの指数関数的増幅の所望するレベルが達せられるまでのステ
ップ（a）〜（d）の繰り返し。

【００２２】活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*はアリルのアンチセンス鎖に対
してアニールされ、第2の2'-デオキシオリゴヌクレオチドはセンス鎖に対してア
ニールされ、あるいはその逆も同様である。

【００２３】 PAPのステップ（a）から（c）は、サーモサイクラー上での2つあるいはそれ以
上の温度ステージとして連続的に行われるか、あるいはそれらはサーモサイクラ
ー上での1つの温度ステージとして行われうる。

【００２４】ヌクレオシド三リン酸および2'-デオキシヌクレオシド三リン酸あるいはそれ
らの化学的修飾バージョンは、PAPによる複数-ヌクレオチド伸長のための基質と
して使用されうる、すなわち、1つのヌクレオチドが組み込まれるとき、伸長鎖
はさらに伸長されうる。さらなる伸長のターミネーターである2', 3'-ジデオキ
シヌクレオシド三リン酸あるいはそれらの化学的修飾バージョンは、1ヌクレオ
チド伸長のために使用されうる。2', 3'-ジデオキシヌクレオシド三リン酸は、
オリゴヌクレオチドP^*の3'末端ジデオキシヌクレオチドとの識別のために放射性
あるいは蛍光色素により標識されうる。ヌクレオシド三リン酸あるいは2'-デオ
キシヌクレオチド三リン酸および2', 3'-ジデオキシヌクレオシド三リン酸の混
合物もまた使用されうる。

【００２５】 PAPは、DNA配列決定の新規方法において使用できる。PAPにおいて、DNAポリメ
ラーゼによる加リン酸分解および重合は、3'ジデオキシ末端オリゴヌクレオチド
であるP^*により連続的に連結される。この原則はPAPの特異性、および次には3'
特異的部分配列の塩基対の特異性に基づいている。3'特異的部分配列のこの特性
は、未知の配列変化のスキャンニング、de novo DNA配列の決定、2つのDNA配列
の比較、および大きいスケールでの遺伝子発現プロファイリングのモニターに応
用することができる。P^*アレイはこれらの方法において可能である。すなわち、
P^*の各々は、別々のドットあるいは2次元固体支持体において固定化することが
でき、従って、全てのPAP反応を同時にプロセスできる。

【００２６】このように1つの観点において、PAP法は以下のステップを連続的に実行するこ
とにより、核酸配列における未知の配列変化のスキャンニング、あるいは核酸に
おいて先に決定した配列の再配列決定のために使用される。

【００２７】（a）ハイブリダイゼーション条件下における、核酸のテンプレート鎖とそれ
とハイブリダイズするテンプレート鎖に充分に相補的である、4つの活性化可能
オリゴヌクレオチドP^*の複数のセットとの混合。各々のセット内では、オリゴヌ
クレオチドP^*は異なる3'-末端非伸長可能ヌクレオチドを有する点で各々他のも
のと異なっており、そのため、3'末端非伸長可能ヌクレオチドは、もしテンプレ
ート鎖が3'末端非伸長可能ヌクレオチドに相補的であるなら、テンプレート鎖と
ハイブリダイズする。セットの数は、配列におけるヌクレオチドの数に一致する
。

【００２８】（b）ピロリン酸、およびテンプレート鎖とハイブリダイズする3'末端非伸長
可能ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドP^*のみを加ピロリン酸分解により
活性化するための加リン酸分解活性を有する酵素を用いた、結果として生じた二
本鎖の処理。

【００２９】（c）4つのヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下における、
テンプレート鎖上での活性化オリゴヌクレオチドP^*の伸長による重合化。（d）ステップ（c）において合成された核酸鎖のテンプレート鎖からの分離。

【００３０】（e）増幅の所望するレベルが達せられるまでのステップ（a）〜（d）の繰り
返し、および（f）増幅を産生したオリゴヌクレオチドP^*の重複の解析による、核酸配列の
順序に従った整理。

【００３１】第2の観点において、PAP法は以下のステップを連続的に行うことにより、核酸
の配列のde novoを決定するために使用される。（a）ハイブリダイゼーション条件下における、核酸のテンプレート鎖と複数
の活性化可能オリゴヌクレオチドP^*との混合。オリゴヌクレオチドP^*の全ては、
テンプレートとして同数nのヌクレオチドを有しており、集合的にnのヌクレオチ
ドを有する全ての可能な配列からなる。オリゴヌクレオチドP^*の全ては、3'末端
に非伸長可能ヌクレオチドを有する。充分に相補的なあらゆるオリゴヌクレオチ
ドP^*は、テンプレート鎖とハイブリダイズするであろう。3'末端非伸長可能ヌク
レオチドは、テンプレート鎖が3'末端に対応する位置で相補的である場合のみ、
テンプレート鎖とハイブリダイズするであろう。

【００３２】（b）ピロリン酸、およびテンプレート鎖とハイブリダイズする3'末端非伸長
可能ヌクレオチドを有するハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドP^*のみを、
それらのハイブリダイズされる3'末端非伸長可能ヌクレオチドの加ピロリン酸分
解によって活性化するための加リン酸分解活性を有する酵素を用いた、結果とし
て生じた二本鎖の処理。

【００３３】（c）4つのヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下における、
テンプレート鎖上での活性化オリゴヌクレオチドP^*の伸長による重合化。（d）ステップ（c）において合成された核酸鎖のテンプレート鎖からの分離。

【００３４】（e）増幅の所望するレベルが達せられるまでのステップ（a）〜（d）の繰り
返し、および（f）増幅を産生したオリゴヌクレオチドP^*の配列の決定、そしてこれらのオ
リゴヌクレオチドの重複の解析による、核酸配列の順序に従った整理。

【００３５】発明の詳細な説明本発明は以下の実施例から理解することができ、それらはPAPを使用すること
により、ヒトD₁ドーパミン受容体遺伝子内の多型部位における既知の変異を同定
できることを説明する。ジデオキシオリゴヌクレオチド配列、DNAポリメラーゼ
、PPi濃度、アリル特異的テンプレート、pH、およびdNTP濃度の効果を調べた。
実施例に報告される実験は、原理を証明するために行った。以下の実施例は、説
明の目的で提供されるのであり、いかなる様式においても発明を限定する意図は
ない。当該技術分野における既知の標準的な技術、あるいはそこに具体的に記載
される技術を利用した。

【００３６】

【実施例】

実施例1 PCRによるテンプレートの調製ヒトD₁ドーパミン受容体遺伝子の640-bp領域を、2つのプライマー（T = 5' GA
C CTG CAG CAA GGG AGT CAG AAG 3'（SEQ ID NO:1）およびU = 5' TCA TAC CGG
AAA GGG CTG GAG ATA 3'（SEQ ID NO:2））を用いたPCRにより増幅した（図1A）
。TU:UT二本鎖産生物はGenBank X55760におけるヌクレオチド33から672にわたり
、G+C含量は55.3％である。共通のAからGへの多型はヌクレオチド229に配置して
おり、G/G、A/AおよびG/Aの3つの遺伝型を生じる（12）。PCR混合物は50μlの容
量：50 mM KCl、10 mM Tris/HCl、pH 8.3、1.5 mM MgCl₂、各々200μMのdNTP（B
oehringer Mannheim）、各々0.1μMのプライマー、2％ DMSO、1 UのTaq DNAポリ
メラーゼ（Boehringer Mannheim）および250 ngのG/G同型接合体、A/A同型接合
体あるいはG/A異型接合体由来のゲノムDNAを含有する。サイクリング条件は：95
℃で15秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、および72℃で1分間の伸長で
、全35サイクル（Perkin Elmer GeneAmp PCR system 9600）を含んだ。PCR産生
物は、Centricon^R 100マイクロコンセントレーター（Amicon）上での3回の残留
（retention）によって、プライマーおよびその他の小分子を除いて約10,000倍
まで精製した。回収したPCR産生物の量は、260 nmでのUV吸光度により決定した
。

【００３７】 3'-ジデオキシヌクレオチドを加えることによるP^*の合成デオキシヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、Perseptive Biosystems 8909 S
ynthesizer（Framinsham）により合成して、City of Hope DNA/RNA Chemistry L
aboratoryで、オリゴピュアカートリッジ（oligopure cartridge）（Hamilton）
により精製した。3'末端ジデオキシヌクレオチドをターミナルトランスフェラー
ゼによって付加した。混合物は40μlの総量：200 mMカコジル酸カリウム、25 mM
Tris/HCl（25℃でpH 6.6）、2.5 mM CoCl₂、 0.25 mg/mlのBSA、4000 pMのオ
リゴヌクレオチド、2.5 mM 2'3'-ddNTP（3'-OH末端とddNTPとのモル比は1:25で
あった（Boehringer Mannheim））、125 Uのターミナルトランスフェラーゼ（Bo
ehringer Mannheim）を含有した。反応は37℃で1時間インキュベートして、そし
てEDTAを5 mM最終濃度で加えて停止した。ブタノールによる脱塩の後、ジデオキ
シオリゴヌクレオチドはTBE緩衝液（90 mM Tris/ホウ酸、1 mM EDTA、pH 8.3）
中で分離用（preparative）の7 M尿素/20％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より精製した（25）。回収したP^*の量は、260 nmでのUV吸収度により決定した。

【００３８】少量の非末端化（unterminated）オリゴヌクレオチドにより非特異的な加ピロ
リン酸分解が生じ得るため、各々のジデオキシオリゴヌクレオチドはT4ポリヌク
レオチドキナーゼにより5'末端を³²P-標識化して、7 M尿素/20％ポリアクリルア
ミドゲルを通して電気泳動した。P^*産生物のみ、ゲルを過剰暴露したときでさえ
も見ることができた（データは示されていない）。P^*の99.99％以上が3'末端に
ジデオキシオリゴヌクレオチドを含有することが推定された。

【００３９】加リン酸分解活性化重合 TU:UT二本鎖テンプレート内の469-bp領域を、オリゴヌクレオチドP^*およびU、
あるいは唯一P^*のみを用いたPAPにより増幅した（表1および図1A）。PU:UP二本
鎖産生物は、GenBank X55760におけるヌクレオチド204から672に対応しており、
G+G含量は55.6％である。言及しない場合は、PAP反応混合物はTfl DNAポリメラ
ーゼのために25μlの総量：75 mM KCl、20 mM Tris/HCl（pH 7.4）、1.5 mM MgC
l₂、各々40μlの4つのdNTP（dATP、dTTP、dGTPおよびdCTP）、0.2μM P^*、0.05
μMUオリゴヌクレオチド、300μM Na₄PPi（20 MMストック液はHClによりpH 8.0
に調節した）、1μCiの[α-³²P]-dCTP（3000 Ci/nmole、Amersham）、1 UのTfl
DNAポリメラーゼ（Promega）および2 ngのTU:UTを含有した。Taq DNAポリメラー
ゼのために、反応混合物は50 mM KCl、10 mM Tris/HCl（pH 7.4）、2.0 mM MgCl ₂ および1 UのTaq DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）以外は同様であった
。PCRおよびその他の対照の混合物は、加えたプライマー以外は同様であった。
サイクリング条件は：94℃で15秒間、55℃で1分間、および72℃まで1分間のラン
ピング（ramping）および72℃で2分間、全15サイクルを含んだ。

【００４０】

【表１】 ^a D₁G^*はD₁の3'末端へのGジデオキシヌクレオチドの追加により産生された、^*
= 3'末端のジデオキシヌクレオチド。^b Tは3'末端がTデオキシヌクレオチドであることを意味し、G^*は3'末端がGジデ
オキシヌクレオチドであることを意味する。太字大文字の“G”および“A”は、
各々GおよびAアリルに対応するGおよびAの塩基である。5'末端の最初の塩基は、
GenBank X55760におけるヌクレオチド208に一致する。^c 3'末端塩基はデオキシヌクレオチドあるいはジデオキシヌクレオチドであり
、テンプレートの相補的な鎖に対応する塩基とマッチ（Yes）あるいはミスマッ
チ（No）をつくる。^d アリル-特異的ヌクレオチドはGあるいはAであり、3'末端に対するその距離は
次のように割り当てる：0 = 3'末端、+1 = 3'末端から1塩基下流、-1 = 3'末端
から1塩基上流、-2 = 3'末端から2塩基上流、-3 = 3'末端から3塩基上流。^e オリゴヌクレオチドについてのT_mは、1 M NaClにおける4℃ X (G+C) + 2℃ X
(T+A)であると推定した（26）。^f Uおよび1つのP^*あるいは1つのP^*のみを用いた増幅。

【００４１】反応は、標準的な2％アガロースゲルを通して電気泳動した。ゲルは、CCDカメ
ラ（Bio-Rad Gel Doc 1000）によるUV写真撮影のためにエチジウムブロマイドで
染色して、オートラジオグラフィーのために乾燥してKodak X-OMAT^TM ARフィル
ムにかけた。

【００４２】制限消化 AciI（5'C↓CGC3'/3'GGC↑G5'）、EaeI（5'Py↓GGCCPu3'/3'PuCCGG↑Py5'）お
よびEco0109I（5'PuG↓GNCCPy3'/3'PyCCNG↑GPu5'）の3つの制限エンドヌクレア
ーゼの各々は、PU:UP二本鎖内に制限部位をもつ。G/GアリルはD₅G^*およびUを用
いてPAPにより増幅した；D₁およびUを用いたPCR増幅を対照として使用した。40
μlのPAP反応物および2μlのPCR反応物はCentricon^R 100マイクロコンセントレ
ーターを用いて精製および濃縮し、産生物は制限エンドヌクレアーゼ：1 X NE緩
衝液3中の2.5 UのAciI；あるいは1 X NE緩衝液1中の3 UのEaeI；あるいはBSAを
含むNE緩衝液4中の30 UのEco0109I（上の全ての酵素および緩衝液はNew England
Biolabs由来）により消化した。10μlの反応物は37℃で2時間インキュベートし
た。消化反応物は上記のように、標準的2％アガロースゲルを通して電気泳動し
た。

【００４３】結果 PAPの原理 TflおよびTaq DNAポリメラーゼは、加ピロリン酸分解活性を含有することを示
した（データは示していない）。Tfl DNAポリメラーゼを利用して、D₁ドーパミ
ン受容体遺伝子のヌクレオチド229にてGアリルを検出した（12）（図1A）。P^*は
3'末端にてddGあるいはddAのどちらかを用いて合成された（表1参照）。3'末端
ジデオキシヌクレオチドは重合による直接的な伸長を阻害するが、しかし、P^*が
Gアリルの相補鎖と特異的にハイブリダイズするときは、ピロリン酸（PPi）の存
在下で加ピロリン酸分解により除去することができる。分解されたオリゴヌクレ
オチドは、5'-3'方向における重合により伸長されうる（図1Bおよび1C）。

【００４４】 PASAに関連するPAPの特異性の亢進は、加ピロリン酸分解および重合を連続的
に連結することにより提供される。著しい非特異的な増幅には、ミスマッチ加ピ
ロリン酸分解およびDNAポリメラーゼによる間違った組み込み（misincorporatio
n）が必要であり、非常にまれな事象である（図2）。

【００４５】 D₅G^*およびD₃G^*を用いた特異的増幅 PAPは2つのオリゴヌクレオチド（P^*およびU）、Tfl DNAポリメラーゼおよびG/
GおよびA/AアリルのDNAテンプレートを用いて行われた。複数のP^*をテストした
（表1）。D₅G^*（アリル-特異的ヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドは3'
末端に共に存在（co-localize）される）およびD₃G^*（アリル-特異的ヌクレオチ
ドは3'末端からの2塩基である）は、PPiの存在下にてGアリルを特異的に増幅し
た（図3A）。PPiを加えない場合、 D₅G^*を用いた特異的産生物は観察されず、添
加されたPPiはPAPの必須成分であることが示された（図3B、レーン6および15）
。D₃G^*を用いたわずかな産生物がレーン4に、およびD₄G^*を用いたわずかな産生
物がレーン5に、観察された（図3B）（以下参照）。

【００４６】 pH、[PPi]および[dNTP]および酵素の効果上のパラメーターの各々を調べた。PAPは、pHが7.4および7.7の間、[PPi]が20
0μMおよび400μMの間、[dNTP]が25μMおよび50μMの間で最も効果的であった（
表2）。Taq DNAポリメラーゼは、Tflと置換しても同様の効果が得られる（表2）
。

【００４７】

【表２】 ^a Tfl DNAポリメラーゼを使用して、表示した因子以外は材料と方法における条
件下でG/Gアリルを増幅した。^b PAP効率は：-、特異的産生物なし；+、非常に弱い特異的産生物；+、弱い特
異的産生物；++、中程度の特異的産生物；+++、強い特異的産生物；++++、非常
に強い特異的産生物、として表示する。^c 表示した濃度は変化させたが、その他は200μMに維持した。

【００４８】特異的産生物の同一性特異的産生物の同一性を確認するため、制限エンドヌクレアーゼ消化を行った
（図4）。AciI、EaeIおよびEco0109の3つの制限エンドヌクレアーゼの各々は、P
U:UP二本鎖をともなう制限部位を有する。期待される制限断片が見出された。同
様な結果がD₃G^*およびUで観察された。

【００４９】 D₅G^*およびUを用いたPAPの特異的産生物により、アガロースゲル上の2つの特
異的バンド、すなわちPU:UPおよびUPが明らかになった；なぜなら、我々の増幅
条件下では、UはD₅G^*よりも効率的であったためである。これを確認するために
、G/Gアリルを先と同様にD₅G^*およびUとともにTfl DNAポリメラーゼを使用するP
APにより増幅した。産生物を変性して、変性アクリルアミドゲルを通して電気泳
動した。一本鎖型の1つの特異的バンドのみ観察され、特異的PAP産生物は二本鎖
および一本鎖セグメントを含有することが示された。同様な結果がD₃G^*およびU
で観察された。

【００５０】線形PAP PAPは、PPiの存在下にてG/GおよびA/Aアリル由来の1つのP^*のみを用いた線形
増幅のために行った。PAPの特異的産生物はD₃G^*およびD₅G^*で観察されたが、し
かしその他のP^*では観察されなかった（図5、レーン4および6）。P^*の効率は、
オリゴヌクレオチドサイズ、3'-末端ジデオキシヌクレオチドおよびアリル-特異
的ヌクレオチドの位置により影響された。

【００５１】図1A-1C。PAPの概略図。図1A。二本鎖DNAテンプレートTU:UTは、2つのオリゴ
ヌクレオチドP^*およびU、Tfl DNAポリメラーゼ、dNTP、ピロリン酸および[α-³² P]-dCTPを用いて増幅される。P^* = 加ピロリン酸分解活性化可能オリゴヌクレオ
チド。この実施例において、P^*はD₅G^*であり、TU:UTはドーパミンD₁受容体遺伝
子の640-bpセグメントである。図1B。D₅G^*は3'末端にGジデオキシヌクレオチド
を有し、それはGアリルの相補鎖に特異的であるが、3'末端のAアリルとはミスマ
ッチする（表1）。加ピロリン酸分解によりジデオキシGを除去した後、各々の増
幅のための重合を行った。図1C。G/G、A/AおよびG/A遺伝子型由来のPAPのオート
ラジオグラム。Gアリルが存在するとき、469塩基の放射性に標識化された特異的
産生物（二本鎖PU:UPおよび余剰アンチセンス鎖UP）を産生するが、なぜならTfl
ポリメラーゼによる低速の加ピロリン酸分解は、オリゴヌクレオチドUがオリゴ
ヌクレオチドP^*よりも非常に高い効率を有することを意味するからである。より
長時間の電気泳動は、UPからPU:UPを分離する。UTおよびUT:TUのその他の産生物
が示される。TU:UTは、非放射性標識化TU起源テンプレートと共に余剰放射性標
識UTをアニーリングすることで得られることは注目すべきである。PAPはまた、G
/G、A/AおよびG/A遺伝子型からD₃G^*およびUを用いても行い、同様な結果が観察
された。

【００５２】図2A-2B。D₅G^*を用いたPAPの特異性の亢進。PAPの特異性は、GおよびAアリル
のテンプレートプール（template pool）の指数関数的な増幅のためにPASAの特
異性と比較される。図2A。PASAの特異的な増幅は、プライマーがGアリルとマッ
チするときに、プライマー伸長の高い効率から得られる。非特異的増幅は、Aア
リル由来のミスマッチ伸長から生じる。これが起きるとき、それはさらなる増幅
のための効率的な基質となる。矢印の太さおよび位置は、各々のサイクルにおけ
る増幅効率を示す。図2B。Gアリル由来のPAPの特異的増幅は、高い効率で起こる
。非特異的増幅の2つの型はAアリルから生じる：（i）非特異的増幅は、A:Tホモ
-二本鎖PU:UP産生物を生じるミスマッチ加ピロリン酸分解によって低い効率で起
こりうるが、それは続く増幅にとって効率的なテンプレートではない；（ii）非
特異的増幅は、ミスマッチ加ピロリン酸分解および間違った組み込みの両方によ
って非常に低い効率で起こり、G:Tヘテロ-二本鎖PU:UP産生物を産生しうるが、
しかし一度それが起これば、それは続く増幅にとって効率的なテンプレートを提
供する。非特異的増幅の同様な傾向が、D₅G^*のみを用いたPAPによる線形増幅に
ついて示唆される。D₃G^*などのP^*のアリル-特異的ヌクレオチドは3'末端の近く
でありうるが、3'末端ではないことに注目すべきである。その場合には、PAPの
非特異的増幅には、ミスマッチ加ピロリン酸分解およびミスマッチ伸長の両方が
必要である。PAPの両方の変化がPASAよりも高い特異性を有するはずである一方
で、最も高い特異性は、3'末端ジデオキシヌクレオチドがアリル-特異的ヌクレ
オチドでもあるときに予想される。

【００５３】図3A-3B。D₅G^*およびD₃G^*を用いた特異的増幅。PAPは、指数関数的増幅のため
2つのオリゴヌクレオチドを用いて、追加的PPiの存在下（図3A）あるいは非存在
下（図3B）で行った。オリゴヌクレオチドは表1にリストされる。Uのみを用いた
伸長対照は、TU:UTおよびUTの位置を同定する。D₁を用いた伸長対照は、PUの位
置を同定する。D₁およびUのPCR対照は、PU:UPおよびPU:UTの位置を同定する。D₁ を用いた伸長反応物およびPCR反応物の20％のみを、その他のレーンと比較して
ロードした。

【００５４】図4。制限エンドヌクレアーゼ消化。PAPの特異性を示すために、図3で示した
実験由来の試料をAciI、EaeIおよびEco0109I制限エンドヌクレアーゼを用いて消
化した。各々の酵素は、PU:UP内に制限部位を持つ。PAPはD₅G^*およびUを用いてG
/Gアリルを増幅し、D₁およびUを用いたPCRの5％は対照として得た。AciIは、PU:
UPから236 bpおよび233 bpの断片を、TU:UTから407 bpおよび233 bpの断片を産
生する。EaeIは、PU:UPから289 bpおよび180 bpの断片を、TU:UTから460 bpおよ
び180 bpの断片を産生する。Eco0109Iは、PU:UPから348 bpおよび121 bpの断片
を、TU:UTから107 bp、412 bpおよび121 bpの断片を産生する。矢印はPU:UPから
期待される消化産生物を示す。

【００５５】図5。線形PAP。PAPは、追加的PPiの存在下で1つのP^*のみを用いて行った。D₁
を用いた反応物の20％を、その他のレーンと比較してロードした（レーン1およ
び10）。No = 追加的なオリゴヌクレオチドはない。

【００５６】考察パートI D₅G^*を用いたPAPの特異性の亢進実施例Iは、加ピロリン酸分解の後に重合することを使用してPASAの特異性を
増加させうる証拠を提供する。顕著な非特異的増幅には、2つのタイプの誤りが
連続的に連結することが必要である（図2）。3'末端でのミスマッチデオキシヌ
クレオチドを除去するミスマッチ加ピロリン酸分解の割合は、正確なdNMPに対す
る不正確なものの除去の割合で示され、T7 DNAポリメラーゼについては10^-5以下
であると報告された（6、13）。重合による置換的変異を生み出す間違った組み
込みの割合は、正確なdNMPに対する不正確なものの組み込みの割合で示され、T7
DNAポリメラーゼについては10^-5およびE. coli DNAポリメラーゼIについては10 ^-4 であると報告された（6、13、14）。同様な結果は、Taq DNAポリメラーゼおよ
びT7 DNAポリメラーゼおよびE. coli DNAポリメラーゼIの3'-5'エキソヌクレア
ーゼ-欠損変異体について報告された（6、13、15）。（i）D₅G^*を用いたPAPにお
ける非特異的増幅による特異性は、もしddNMPのミスマッチ加ピロリン酸分解の
割合がdNMPと同じである場合に、1サイクルあたり10^-5であると見積もられる。
（ii）非特異的増幅による特異性は、もしミスマッチ加ピロリン酸分解および間
違った組み込みが連続的に連結される場合に、3.3 X 10^-11であると見積もられ
る。

【００５７】 PAPの必須成分各々のP^*は、TflあるいはTaq DNAポリメラーゼを利用して、G/GおよびA/Aアリ
ルを増幅することによりテストした。特異的増幅には、PPiおよびアリル-特異的
テンプレートの存在が必要である。加えて、増幅効率は、オリゴヌクレオチドサ
イズ、3'末端ジデオキシヌクレオチド、P^*の3'末端に関連するアリル-特異的ヌ
クレオチドの位置に影響される。

【００５８】 D₁G^*およびD₂G^*が特異的シグナルを生成しなかった理由は明らかではないが、
それはP^*およびテンプレートの間の二本鎖の限界安定性（threshold stability
）に関連しうる。3'末端にAジデオキシヌクレオチドを含有するD₆A^*は、重合に
よるddNTPの様々な組み込み効率に関連しうる特異的シグナルを生成しなかった
。E. coli DNAポリメラーゼI、Taq DNAポリメラーゼおよびΔTaq DNAポリメラー
ゼのクレノー断片は、ddGTPをその他のddNTPよりも効率よく組み込む（16、17、
11）。ddNTPの組み込みの割合はもまた、テンプレート配列に依存して変化し、
いくつかの塩基では他のものと比較して10倍高くなりうる（16）。もう一つの可
能性は、D₆A^*はより低いT_mを有するサイズがより小さいことである。

【００５９】追加的なPPiを用いないPAPにおいて、非常にかすかな擬似シグナルがD₃G^*およ
びD₄G^*で生成された（図3B）。一つの可能性は、オリゴヌクレオチド二量体が“
エンド-”PPiがUT生成のために副重合（by-polymerization）から放出された後
の、より後のサイクルにて、P^*の非特異的過ピロリン酸分解を形成および誘引す
ることができる、というものである。3'末端減少D₃G^*およびD₄G^*は、擬似シグナ
ルとしてハイブリダイズおよび伸長されうる。オリゴヌクレオチド二量体は、D₃ G^*およびD₄G^*で観察された。D₃G^*でのもう一つの可能性は、特異的加ピロリン酸
分解は“エンド-”PPiが放出された後のより後のサイクルにて起こることができ
る、というものである。第三の可能性は、D₃G^*およびD₄G^*は3'末端でGジデオキ
シヌクレオチドにより完全には追加されなかった最小のD₃およびD₄によるコンタ
ミネーションであった、というものである。

【００６０】その他の技術との比較 in vitroでの酵素的核酸増幅のための多くの方法が開発され、これを適用して
、既知の配列変化を検出することができる。これらは、ポリメラーゼ連鎖反応（
PCR）（18、19）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（20、21）およびローリングサーク
ル（rolling circle）増幅（RCA）（22、23）を含む。PAPは多くの方法において
異なっている：i）加ピロリン酸分解および重合が各々の増幅のために連続的に
連結する、ii）PAPのための少なくとも1つのジデオキシオリゴヌクレオチドがあ
る。その他の化学的に修飾された3'末端での3'-水酸基を欠くヌクレオチドは、
同様な機能を供給することができ、iii）一つの形式は線形増幅のためであり、
その他は指数関数的増幅のためである、iv）PPiは増幅に必要である、v）顕著に
非特異的な増幅には、ミスマッチ加ピロリン酸分解および間違った組み込みの両
方が必要である、vi）PAPは既知の点変異を検出でき、特異性を大きく増加させ
て、野生型アリルから非常にまれな変異アリルを検出できる。

【００６１】力学的な基礎は、2つあるいはそれ以上の反応が特異性の増加を伴って増幅の
ために連続的に結合することである。PAPの鍵となる成分は、加ピロリン酸分解
活性化可能オリゴヌクレオチドである。これらの実験において阻害される3'末端
はジデオキシヌクレオチドであるが、加ピロリン酸分解を受けやすい非伸長可能
ヌクレオチドのいずれかは原則的に置換することができた。実際、ミスマッチに
対してオリゴヌクレオチド5'を開裂するいずれかの酵素は、加ピロリン酸分解活
性化と同様な機能を提供することができた。例えば、メチル化認識配列（G^mATC
など）を含む阻害されるオリゴヌクレオチドは、非メチル化認識配列を用いてそ
の標的に対してアニールされ、そしてその後制限エンドヌクレアーゼ（DpnIなど
）はメチル化部位をまさに開裂することで、伸長のためにオリゴヌクレオチドを
活性化できる。もしミスマッチが開裂部位に対して5'に配置される場合は、顕著
な非特異的増幅にはミスマッチ開裂および間違った組み込みを連続的に連結する
ことを必要とするが、それはまれな事象である。活性化可能オリゴヌクレオチド
はまた、“ミニ配列決定（minisequencing）”プライマー伸長と組み合わせるこ
とができる。これは、特異性が問題となりうる²⁴チップ技術の影響を特に受けや
すくなりうる、1塩基変化（single base change）の検出のためのさらなる特異
的アッセイを提供しうる。PAPが線形形式（図5）にて起こることができることの
説明は、このアプローチの実行可能性を支持する。

【００６２】ヌクレオシド三リン酸および2'-デオキシヌクレオチド三リン酸あるいはそれ
らの化学的修飾バージョンは、PAPによる複数-ヌクレオチド伸長のための基質と
して使用しうる、すなわち、1つのヌクレオチドが組み込まれるとき、伸長鎖は
さらに伸長することができる。さらなる伸長にとってのターミネーターである2'
, 3'-ジデオキシヌクレオシド三リン酸あるいはそれらの化学的修飾バージョン
は、1ヌクレオチド（single-nucleotide）伸長のために使用されうる。2', 3'-
ジデオキシヌクレオシド三リン酸は、オリゴヌクレオチドP^*の3'末端ジデオキシ
ヌクレオチドから識別するために、放射性あるいは蛍光色素で標識されうる。ヌ
クレオシド三リン酸あるいは2'-デオキシヌクレオチド三リン酸の混合物および2
', 3'-ジデオキシヌクレオシド三リン酸もまた、使用されうる。

【００６３】考察パートII PAPにおいて、特異的核酸配列はテンプレートとしてその配列を含有する核酸
を使用することにより産生される。もし核酸が2つの鎖を含有するなら、それを
テンプレートとして使用する前に、別々のステップとしてあるいは同時のどちら
かで、核酸の鎖を分離する必要がある。鎖の分離はまた、生理学的、化学的ある
いは酵素的な手段を含むその他の適した方法のいずれかにより達成することもで
きる。

【００６４】元の核酸あるいは核酸の混合物から1つ以上の特異的産生物を産生することを
所望するとき、適した数の異なるオリゴヌクレオチドが利用される。例えば、2
つの異なる特異的産生物を指数関数的に産生しなければならないとき、4つのオ
リゴヌクレオチドが利用される。2つのオリゴヌクレオチド（P^* >1）は特異的核
酸配列の1つに特異的であり、他の2つのオリゴヌクレオチド（P^* >1）は第2の特
異的核酸配列に特異的である。この様式において、各々の2つの異なる特異的配
列は、現在のプロセスにより指数関数的に産生されることができる。

【００６５】 DNAあるいはRNAは、一本鎖であってもあるいは二本鎖であってもよく、比較的
純粋な種であってもあるいは核酸の混合物の成分であってもよく、および直線で
あってもあるいは環状であってもよい。1つあるいは複数の核酸は、例えば、プ
ラスミド、クローンDNAあるいはRNA、あるいは細菌、酵母、ウイルス、および植
物あるいは動物などの高等生物を含むあらゆる源からの天然DNAあるいはRNAから
のあらゆる源から得られうる。DNAあるいはRNAは、Maniatisら（25）により記載
されるような様々な技術により、血液、絨毛膜絨毛などの組織物質あるいは羊膜
細胞から抽出されうる。

【００６６】 P^*オリゴヌクレオチドは、増幅すべき各々の特異的配列の異なる鎖に対して“
実質的に相補的”であるように選択される。従って、P^*オリゴヌクレオチド配列
は、テンプレートの正確な配列を反映する必要なはい。例えば、非相補的ヌクレ
オチドセグメントはP^*オリゴヌクレオチドの5'-末端に接着することができ、P^*
オリゴヌクレオチド配列の残りは鎖に相補的である。あるいは、非相補的塩基あ
るいはより長い配列は、もしP^*オリゴヌクレオチド配列が増幅すべき鎖の配列に
対する十分な相補性を有し、それによりハイブリダイズしてその他のP^*オリゴヌ
クレオチドの伸長産生物の合成のためのテンプレートを形成するなら、P^*オリゴ
ヌクレオチド内に散在させることができる。請求項にて使用されるように、“相
補的”という用語はここで議論されるように、“実質的に相補的”という意味で
あると理解されるべきである。

【００６７】あらゆる特異的核酸配列は、現在のプロセスにより産生することができる。配
列の両方の末端における十分な数の塩基が十分詳細に知られており、そのため2
つのオリゴヌクレオチドが配列に沿う相対的な位置で所望する配列の異なる鎖に
ハイブリダイズできることのみ必要である。配列の両末端での塩基についての知
識が大きければ大きいほど、それだけ標的核酸配列にとってのオリゴヌクレオチ
ドの特異性をより大きくすることができ、従って、プロセスの効率もそれだけ大
きくすることができる。下で使用するように、オリゴヌクレオチドという言葉は
、特に増幅すべきセグメントの末端配列に関する情報にいくつかあいまいなこと
がある場合、1つ以上のオリゴヌクレオチドのことを言うことがある。この集合
からの1つのオリゴヌクレオチドは、増幅すべき所望する配列の末端と100％相同
であるだろう。

【００６８】本発明は段階的様式にて行うことができ、そこでは、各々のステップの後に新
たな試薬を加えるか、あるいは同時に、すなわち最初のステップで全ての試薬を
加えるか、あるいは一部は段階的および一部は同時に試薬を加える、すなわち与
えられた数のステップの後に新鮮な試薬を加える。同時的な方法は、酵素的手段
が鎖の分離ステップのために使用されるときに利用されうる。同時的な手順にお
いて、反応混合物は鎖-分離酵素（例えば、ヘリカーゼ）、ATPなどの鎖-分離酵
素のための適したエネルギー源を含有しうる。さらなる物質は、必要なものとし
て加えられうる。

【００６９】核酸ポリメラーゼは、増幅を達成するために機能するであろういずれかの化合
物あるいは系でありうる。この目的のために適した酵素は、例えば、Tfl DNAポ
リメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、E. coli DNAポリメラーゼI、E. coli DNAポ
リメラーゼIのクレノウ断片、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、その
他の利用可能ななDNAポリメラーゼ、逆転写酵素、およびその他の遺伝子操作バ
ージョンを含む。DNAポリメラーゼが、もしddNTPを（dNTPに比べて）効率的にお
よび（4つのddNTP間で比較して）等しく組み込むなら、P^*活性化可能オリゴヌク
レオチドにとって高いおよび等しい加ピロリン酸分解活性を有するであろうとい
うことは、逆および順反応の間の関係に基づいて予測される。全てのDNAポリメ
ラーゼのうち、ThermoSequenase（2）などの遺伝子操作バージョンは、将来的に
最も良いものでありうる。一般的に、合成は各々のオリゴヌクレオチドの3'末端
で開始されて、テンプレート鎖に沿って5'方向に進行するであろう。しかし、5'
末端で合成を開始してその他の方向に進行する誘導用薬剤もまた、上記のように
PAP法において使用することができる。

【００７０】実施例2 PCRによるテンプレートの調製ヒトD₁ドーパミン受容体遺伝子の640-bp領域を、2つのプライマー（T = 5' GA
C CTG CAG CAA GGG AGT CAG AAG 3'（SEQ ID NO:1）およびU = 5' TCA TAC CGG
AAA GGG CTG GAG ATA 3'（SEQ ID NO:2））を用いてPCRにより増幅した。TU:UT
二本鎖産生物はGenBank X55760中のヌクレオチド33から672におよび、産生物のG
+C含量は55％である。共通のAからGの多型はヌクレオチド229に配置しており、G
/G、A/AおよびG/Aの3つの遺伝子型を生じる¹¹。PCR容量は50μl：50 mM KCl、10
mM Tris/HCl、pH 8.3、1.5 mM MgCl₂、各々200μMの4つのdNTP、各々0.1μMの
プライマー、2％ DMSO、1 UのTaq DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）お
よび250 ngのG/G同型接合体、A/A同型接合体あるいはG/A異型接合体由来のゲノ
ムDNA、である。サイクリング条件は：94℃で15秒間の変性、55℃で30秒間のア
ニーリング、および72℃で1分間の伸長で、 GeneAmp PCR system 9600（Perkin
Elmer Applied Biosystems）を用いた全35サイクルを含んだ。PCR産生物は、Cen
tricon^R 100マイクロコンセントレーター（Amicon）上での3回の残留（retentio
n）によって、プライマーおよびその他の小分子を除いて約10,000倍まで精製し
た。回収したPCR産生物の量は、260 nmでのUV吸収度により決定した。

【００７１】 3'-ジデオキシヌクレオチドを加えることによるP^*の合成デオキシヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、Perseptive Biosystems 8909 S
ynthesizer（Framinsham）により合成して、City of Hope DNA/RNA Chemistry L
aboratoryで、オリゴピュアーカートリッジ（oligopure cartridge）（Hamilton
）により精製した。3'末端ジデオキシヌクレオチドをターミナルトランスフェラ
ーゼによって付加した。混合物は30μlの総量：100 mMカコジル酸カリウム（pH
7.2）、2.0 mM CoCl₂、0.2 mMのDTT、2500 pMのオリゴヌクレオチド、2 mM 2',
3'-ddNTP（3'-OH末端とddNTPとのモル比は1:24であった）（Boehringer Mannhei
m）、100 Uのターミナルトランスフェラーゼ（GIBCO BRL）を含有した。反応は3
7℃で4時間インキュベートして、そしてEDTAを5 mM最終濃度で加えて停止した。
Centri-spin^TMカラム（Princeton Separations）を使用した脱塩の後、P^*はTBE
緩衝液（90 mM Tris/ホウ酸、1 mM EDTA、pH 8.3）中で分離用（preparative）
の7 M尿素/20％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した（25）。回収し
たP^*の量は、260 nmでのUV吸光度により決定した。

【００７２】少量の非末端化（unterminated）オリゴヌクレオチドにより加ピロリン酸分解
の非特異性が生じ得るため、各々のP^*はT4ポリヌクレオチドキナーゼにより5'末
端を³²P-標識化して、その後7 M尿素/20％ポリアクリルアミドゲルを通して電気
泳動した。ゲルを過剰暴露したときでさえも、P^*産生物のみを見ることができた
（データは示されていない）。P^*の99.99％以上が3'末端にジデオキシオリゴヌ
クレオチドを含有することが評価された。P^*の純度は、pH 8.3にてPCR産生物あ
るいはPAP産生物が存在しないことにより支持された。

【００７３】加リン酸分解活性化重合 TU:UT二本鎖テンプレート内の445から469 bpまでの領域を、オリゴヌクレオチ
ドP^*およびU、あるいはP^*のみを用いたPAPにより増幅した。PU:UP二本鎖産生物
は、GenBank X55760におけるヌクレオチド204-228から672に対応しており、その
G+G含量は56％である。PAP反応混合物は25μlの総量：50 mM KCl、10 mM Tris/H
Cl（pH 7.6）、1.5 mM MgCl₂、各々100μlの4つのdNTP（dATP、dTTP、dGTPおよ
びdCTP）、0.1μM P^*、0.1μMUオリゴヌクレオチド（TCATACCGGA AAGGGCTGGA GA
TA（SEQ ID NO:2）、300μM Na₄PPi、2％のDMSO、1μCiの[α-³²P] dCTP（3000
Ci/nmole、Amersham）、1 UのAmpliTaqFS DNAポリメラーゼ（PE Applied Biosys
tems）あるいはおのおの0.5 UのAmpliTaqFSおよびTaq DNAポリメラーゼ、および
10 ngのTU:UTを含有した。ThermoSequenase（Amersham Pharmacia）もまた、8 U
のThermoSequenaseあるいは4 UのThermoSequenaseに0.5 U Taqおよび2.5 mM MgC
l₂を加えること以外は同条件下でテストした。サイクリング条件は：94℃で10秒
間の変性、60℃（ThermoSequenaseでは55℃）で1分間のアニーリング、および72
℃で2分間の伸長、全15サイクルを含んだ。

【００７４】産生物は、標準的な2％アガロースゲルを通して電気泳動した。ゲルは、CCDカ
メラ（Bio-Rad Gel Doc 1000）およびMulti-Analyst^RソフトウェアによるUV写真
撮影のためにエチジウムブロマイドで染色して、オートラジオグラフィーのため
に乾燥してKodak X-OMAT^TM ARフィルムにかけた。PAP収量は、PCRバンドからバ
ックグランドを引いた総ピクセル数としてImageQuantソフトウェア（Molecular
Dynamics）を用いるPhosphorImagerを用いて定量されて、ランダムユニット（ra
ndom unit）として表示された。

【００７５】結果および考察 PAP効率の亢進実施例1において、3'末端にddGをともなうP^*のみを天然TflあるいはTaq DNAポ
リメラーゼを使用して増幅した。AmpliTaqFSおよびThermoSequenase DNAポリメ
ラーゼは、P^*の3'末端にていずれかの種類のジデオキシヌクレオチド（ddAMP、d
dTMP、ddGMPあるいはddCMP）に対するかなり低い識別をともなう非常に高いPAP
効率を達成することが見出された。例えば、P^*(212)18G⁰およびP^*(212)18A⁰は、
ドーパミンD₁受容体遺伝子の18-merであるが3'末端にddGMPおよびddAMPを有する
が（表3）、各々GおよびAアリルを特異的に増幅した。それらの収率は1.4であり
（図6Bにおけるレーン9と11を比較）、そしてP^*(212)18G⁰はP^*(212)18A⁰よりサ
イクルあたり4％より効率的であると見積もられる。もう一つのP^*(228)26A^-24 =
5' TAGGAACTTGGGGGGTGTCAGAGCCC^* 3'（SEQ ID NO:12）は、3'末端にddCMPを有
する26-merであり、3'末端でのddCMPがないプライマーと同程度の効率で増幅さ
れ、収量はTflあるいはTaq を使用することによるものと比較すると1,000倍増加
されると見積もられた。さらに、PAPはヒトゲノムDNAから直接的に由来するセグ
メントを増幅した。

【００７６】

【表３】 ^a P^*(204)26G⁰は3'末端でGジデオキシヌクレオチドを有するP^*である。⁰はアリ
ル-特異的塩基が3'末端にあることを意味する。5'末端の最初の塩基はGenBank X
55760における塩基204に一致する。その長さは26塩基である。^b 太字のGあるいはAはGあるいはAアリル特異的塩基であり、下線の塩基は設計
されたミスマッチである。^c 3'末端からアリル-特異的塩基までの距離：0 = 3'末端、-3 = 3'末端から3塩
基。^d オリゴヌクレオチドについてのT_mは、1 M NaClの条件の下で4℃ X (G+C) + 2
℃ X (T+A)であると推定された。各々のP^*の長さは18塩基である。^e PAP（%）のノイズ割合は、同じP^*による非特異的アリル産生物の特異的アリ
ル産生物に対する相対収量として、あるいは同じテンプレートを使用することに
よって示した変異させたP^*のその天然型に対する相対収量として定義する。特異
的シグナルは<10%ノイズ割合とし表示される。

【００７７】 AmpliTaqFSは天然Taqと比較して2つの変異をもっている。5'ヌクレアーゼドメ
インにある1つは5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を除去し、2番目の変異のF667Yは
活性部位にある（38）。ThermoSequenaseは活性部位に同じ変異F667Yを有するが
、5'-3'エクソヌクレアーゼドメインは欠く（39、40）。それらは組み込みに関
してdNTPおよびddNTPの間の識別はしない。ddNMPの加ピロリン酸分解は、逆反応
であり、これらの酵素により非常に高くおよび低く認識されるはずである。使用
するAmpliTaqFSあるいはThermoSequenase DNAポリメラーゼのいずれかを製剤化
して、反応においてPPiの加水分解をすることができ、そのためPAP効率を減少さ
せる耐熱性ピロホスファターゼ（製造者の教示）を含有するが、PAPは我々の条
件下でまだ増幅される。AmpliTaqFSおよびThermoSequenase DNAポリメラーゼは
、ピロホスファターゼが混入していないそれらの純粋な型のなかでよりよく働く
であろう。

【００７８】 P^*の3'特異的部分配列異なる長さおよびミスマッチを有する様々なP^*をAmpliTaqFSを使用して調べた
（表3）。PAP効率に対する長さおよびミスマッチの効果は、同じテンプレート由
来の異なる長さの2つのP^*間の相対収量（％）として表示し（図7）、それは0.0
％から201.5％の変化であり、各々長さで2から4少ない塩基を有していた。PAPの
特異性もまた、P^*の長さおよびミスマッチに影響される（表3）。ノイズ割合（
％）はマッチ産生物に対するミスマッチ産生物の相対収量として定義され、特異
的シグナルは<10％ノイズ割合で区切られる。もしP^*のアリル-特異的塩基が3'末
端にあった場合は、特異的アリルのみ増幅されて、特異性はP^*の長さには関係し
なかった（図7A）。もしアリル-特異的塩基がP^*の3'末端になかった場合は、特
異性はP^*の長さに関連した。18-mer P^*中の非3'末端ミスマッチは、3'末端から1
5塩基までであり、いずれも増幅を起こさなかったが（図7Bから7E）、26-mer P^* 中の2つのそのようなミスマッチでさえ非特異的な増幅を引き起こした（データ
は示されない）。

【００７９】 18-merはさらに、様々な位置でのアリル-特異的塩基におよぶ“積み重ねた（s
tacked）”P^*を使用して調べた（表4）。ノイズ割合（％）は0.0％から7.1％ま
で変化した。3'末端特異的部分配列の長さは>13塩基であった。

【００８０】

【表４】 ^e 2つのオリゴヌクレオチドを用いたPAP、あるいは1つのP^*を用いた線形的PAP
によるGおよびAテンプレートからの増幅。PAP（%）のノイズ割合は特異的アリル
産生物に対する非特異的アリル産生物の相対収量である。

【００８１】同様な結果は、異なる位置でGアリルをマッチおよびミスマッチするP^*を使用
することにより得られた（表5）。1つのミスマッチでのノイズ割合は0.8％から5
.6％まで様々であった。3'特異的部分配列の長さは>16塩基であった。2つのミス
マッチでのノイズ割合は0％であった（図9におけるレーン10〜15とレーン2を比
較）。

【００８２】

【表５】 ^a Gアリルとのマッチあるいはミスマッチ。^b ノイズ割合（%）は、Gアリル-特異的テンプレートを用いたミスマッチP^*およ
びP^*(212)18G⁰の間の相対収量である。

【００８３】線形的PAPは18 mer P^*のみを使用して調べられ、より高い特異性がより低ノイ
ズ割合で観察された（表4および5）。線形的PAPは異なる機構的な経路をとり、
そこでは全ての非特異的産生物が開始テンプレートから生成され、3'末端ミスマ
ッチP^*をともなうミスマッチ加ピロリン酸分解、あるいは非3'末端ミスマッチP^* をともなうミスマッチ加ピロリン酸分解およびミスマッチ伸長の両方を必要とす
る。

【００８４】 PASAは3'末端にddNMPを加えない17-merプライマーをを用いて行われた（表4お
よび5参照）。ミスマッチ17-merプライマーは、ミスマッチが3'末端まで6塩基ほ
どの近さのとき、30％のノイズ割合を伴って非特異的産生物を強力に増幅し、非
常により短い3'特異的部分配列を示した。同様な結果は以前にその他でも報告さ
れた（41）。

【００８５】要約すると、P^*（1-長）は2つの部分配列を有する：3'特異的部分配列（n = 3
'特異的部分配列の塩基数<1）は特異性を決定する、すなわち、この領域内でテ
ンプレートのその相補鎖に対するいずれのミスマッチも増幅を生じない；および
5'エンハンサー部分配列（m = 5'エンハンサー部分配列の塩基数>0）は増幅効率
を亢進する。PAP特異性は、3'特異的部分配列の塩基対の特異性、加ピロリン酸
分解特異性および重合特異性により共決定（co-determine）される。従って、3'
特異的部分配列の塩基対特異性は、PAP特異性の最低必要なものである。

【００８６】 P^*の3'特異的部分配列の長さは、配列の内容およびP^*のサイズ、3'末端ジデオ
キシヌクレオチドの型、テンプレート配列、DNAポリメラーゼ、鉄のようなその
他の成分、およびサイクリング条件により影響されうる。テンプレートが繰り返
し配列>1あるいは同種ポリマー走行>1を含有するとき、P^*は固定のための特異性
を失う。

【００８７】未知の配列変化のためのスキャンニング P^*の3'特異的部分配列の特性は、並列方法にて未知の配列変化のためのスキャ
ンニングあるいは先に決定された配列の再配列決定に適応させることができる。
先に決定された配列の相補鎖上の各々のヌクレオチドは、3'末端でddAMP、ddTMP
、ddGMPあるいはddCMPのいずれかは野生型配列および3つの可能な一塩基置換に
一致する以外は、同一の配列を有する、18-mer（図6）などの4つの下流P^*により
尋ねられる（query）。X塩基の相補鎖をスキャンニングするP^*の数は4およびXの
複数であり、指数関数的あるいは線形的PAPのどちらかに適している。4つの下流
P^*は、3'末端でのddAMP、ddTMP、ddGMPおよびddCMPが4つの蛍光色素などによる
識別のために異なって標識されるときに、単一ドット上で固定化させることさえ
可能である。従って、増幅シグナルは、ddNMPが加ピロリン酸分解によりP^*から
除去されるときに、各々の色素の強度の減少により示すことができる。線形的PA
Pの1つの利点は、識別のために異なる色素で標識して、4つのddNTPを一塩基伸長
のための基質として使用できることである。

【００８８】簡単には、もし野生型配列と一致する全てのP^*のみが特異的に増幅されると、
野生型配列は重複を解析することにより順序に従って整理できる。3'末端に一塩
基置換を有するP^*は、ヘミ-あるいはホモ-点変異の位置で増幅される。変異はま
た、いくつかの連続的なヌクレオチドの領域にわたる非PAPシグナルの“ギャッ
プ”もつくる。一塩基置換について、ギャップサイズ（塩基）+1 = 3'特異的部
分配列の長さ。

【００８９】さらに、我々は上流P^*の第2のセットを設計することによりセンス鎖をスキャ
ンすることもできる。未知の一塩基置換は、異型接合体中でさえP^*の2つのセッ
トの結合により決定することができる。未知の小さい欠失および挿入は、検出し
て位置づけることができる。欠失あるいは挿入の具体的な型を同定するために、
対応するP^*を加えることができる。変異位置の情報を提供することができるフィ
ンガープリントにとって、各々2つの連続するP^*を積み重ねた領域<アレイ上の3'
特異的部分配列、n倍までP^*数を減少させる、という簡単に積み重ねる方法があ
る。

【００９０】 de novo DNA配列の決定 PAPによるde novo DNA配列決定の概念は、P^*の可能な3'特異的部分配列の全て
を利用して、de novo配列中の3'特異的部分配列の存在を同定する。P^*の3'特異
的部分配列の完全なセットは4ⁿである。各々の3'特異的部分配列は、4^mの5'エン
ハンサー部分配列の完全なサブセットを有する。例えば、3'特異的部分配列とし
ての16-merのおよび5'エンハンサー部分配列としての2-merの完全なセットは、(
A、T、G、C)(A、T、G、C) N₁₆ = 4¹⁸として示すことができる。

【００９１】簡単には、手順は全ての特異的PAP増幅のリストを最初に決定して、次にワト
ソン-クリック対法則を使用することにより、所定の長さを有する3'特異的部分
配列を整えることによってこのリストから未知のDNA相補的配列を再構築する。

【００９２】組立プロセスは、所定のP^*の3'特異的部分配列が2回以上出会うところではど
こでも中断される。最大の配列決定長に影響する因子の1つは、3'特異的部分配
列の長さである。所定の長さを有する3'特異的部分配列の完全なセットによりあ
いまいでなく再構築されるうるランダム配列の長さは、完全なセットにおける3'
特異的部分配列の数の約四乗根であり、いかなる所定の3'特異的部分配列も2回
以上出会わないという>50％可能性を有する。65,538のうちの3'特異的部分配列
の8 merは、200塩基までの範囲において有用でありうる。100万以上のうちのデ
カヌクレオチド（10ヌクレオチド）は、キロ塩基de novo配列まで解析しうる。3
'特異的部分配列として16 merを含有する18 mer P^*は、完全セットがP^*の4¹⁸で
あり、最大77,332塩基を配列決定しうる。

【００９３】隣接する既知の配列があるとき、2つのオリゴヌクレオチドを用いたPAPのため
の反対のオリゴヌクレオチドを設計する。最大の配列決定長は主に対のオリゴヌ
クレオチドに限定されるが、P^*の3'特異的部分配列の長さには限定されず、条件
的（conditional）de novo DNA配列決定と呼ばれる。

【００９４】 PAPのためのその他の適応 2つのDNA配列を比較して、それらが同じあるいは異なるかどうかをみるフィン
ガープリント法について、3'特異的部分配列の不完全なセットを使用することに
よりP^*の数を減少させる簡単な方法がある。特定の順序でそれらを整理すること
により、染色体での位置ならびに配列を同定することができる。ヒトゲノムにお
ける3×10⁹ bp DNAを考慮すると、2つのオリゴヌクレオチドを用いたPAPは1つの
P^*のみを用いたPAPよりも好ましく、特異性を増加させる。

【００９５】 6×10⁴から10⁵までの転写が発現され、そして正確な配列の詳細が必要ではな
い、遺伝子発現プロファイリングをモニターするために、1つのP^*のみを用いたP
APを適応させることができ、遺伝子中の唯一のモチーフを同定するP^*のセットを
22-merまでの全長で設計することができる。各々2つのP^*の間では、3'末端で少
なくとも1つの配列差異あるいは非3'末端で>2の配列差異がある。

【００９６】ハイブリダイゼーションによる配列の比較オリゴヌクレオチドを使用することによるSBHにおいて、DNA配列は重複部分を
通して積極的にハイブリダイズするプローブのハイブリダイゼーションおよび組
立により決定される。固定化された試料上の一オリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーションは、至適なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件では非常に特異的
でありうることが長い間知られており（42）、従って完全なハイブリッドと単一
内在ミスマッチを含有するものとを識別することができる。アレイにおけるオリ
ゴヌクレオチドは長さ11-20ヌクレオチドであり、中央に7-9塩基の特異的領域を
有し、非特異的シグナルはミスマッチされたハイブリダイゼーションにより生成
される。標準的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下では、マッチおよ
びミスマッチの間の二本鎖の安定性もまた、末端のミスマッチおよび隣接する配
列により影響される（32、33、43）。

【００９７】 SHBはいくつかの方法において酵素を用いて修飾できる（26、44）。DNAポリメ
ラーゼによるプライマー伸長は、塩基が相補鎖にマッチする場合のみ一度に1つ
ずつ塩基を組み込む。リガーゼは同様な要求を有する：2つのオリゴヌクレオチ
ドは、それら両方ともが結合部位でテンプレートに相補的であれば、酵素的に結
合できる。

【００９８】図6A-6B。PAP効率の亢進。図6A。PAPは2つのオリゴヌクレオチドP^*およびUを
もちいて二本鎖TU:UTテンプレートから増幅される。4つのP^*の各々は3'末端にdd
A、ddT、ddGおよびddCを有する。3'末端塩基はGあるいはAアリルの相補鎖に特異
的であるか、あるいはマッチしないかのどちらかである。図6B。ヒトドーパミン
受容体遺伝子のG/G、A/AおよびG/A遺伝子型由来のPAPのオートラジオグラム。46
1塩基の放射性標識特異的産生物（二本鎖PU:UPおよび過剰アンチセンス鎖UP）が
産生される。その他の副産生物UTおよびUT:TUが示される。TU:UTは非放射性標識
TUオリジナルテンプレートをともなう過剰放射性標識UTのアニーリングに由来す
ることに注目せよ。

【００９９】図7A-7B。PAP効率に対するP^*長およびミスマッチの効果。PAPはP^*およびUオリ
ゴヌクレオチドを用いて増幅された（表3参照）。図7A-7の各々において、P^*は
試料3'末端を有するが、長さは様々である。図7A。レーン1-4では、P^*はGアリル
をマッチさせて増幅した。レーン5-8では、P^*は3'末端でミスマッチしたがAアリ
ルを増幅した。図7B。レーン9-12では、P^*はGアリルをマッチさせて増幅した。
レーン13-16では、P^*は3'末端から-12塩基でミスマッチしたがAアリルを増幅し
た。図7C。レーン17-20では、P^*はAアリルをマッチさせて増幅した。レーン21-2
4では、P^*は3'末端から-2塩基でミスマッチしたがGアリルを増幅した。図7D。レ
ーン25-28では、P^*は3'末端から-9塩基でミスマッチしたがAアリルを増幅した。
図7E。レーン29-32では、P^*は3'末端から-15塩基でミスマッチしたがAアリルを
増幅した。長さの効果は、先のレーン（L_n-1）に対する1つのレーン（L_n）にお
ける収量割合として表示する。長さの効果はレーン5-8では示さなかったが、そ
れはシグナルがバックグランドと同じかあるいは非常に近いためである。

【０１００】図8。様々に位置させたP^*を用いたPAPの特異性。PAPはP^*およびUオリゴヌクレ
オチドを用いて増幅された（表4参照）。P^*はレーン2-7ではGアリルをマッチさ
せて増幅したが、レーン9-15ではAアリルをミスマッチさせて増幅した。レーン1
および9は、D₁(212)17 merおよびUを用いたPCR対照であった。レーン8および16
は、Uのみを用いた伸長対照であった。

【０１０１】図9。様々にミスマッチさせたP^*を用いたPAPの特異性。PAPはP^*およびUオリゴ
ヌクレオチドを用いて増幅された（表5参照）。レーン2-7では、P^*はマッチある
いは1つのミスマッチをともなってGアリルを増幅した。レーン9-15では、P^*は1
つあるいは2つのミスマッチをともなってAアリルを増幅した。レーン1および9は
、D₁(212)17 merおよびUを用いたPCR対照であった。レーン8および16は、Uのみ
を用いた伸長対照であった。

【０１０２】実施例3 この実施例は、ゲノムDNAからの直接的なPAP増幅を説明する。この実施例で使
用したオリゴヌクレオチドは以下に列挙する。レーン番号は図10におけるレーン
のことである。

【０１０３】 0.1μM濃度における下流オリゴヌクレオチドは：

【０１０４】

【化１】 0.1μM濃度における対の上流オリゴヌクレオチドは：D₁(420)24U 5' ACGGCAGC
ACAGACCAGCGTGTTC 3'（SEQ ID NO:48）であり、それは各々の下流オリゴヌクレ
オチドと対になる。詳細は表3の脚注参照。

【０１０５】その他の成分は実施例2と同じであったが、以下のものは異なる：0.5 Uの各々
のAmpliTaqFSおよびTaq DNAポリメラーゼ、および100 ngの異型接合G/A対立性ゲ
ノムDNAは、30サイクルの使用による25μl反応液毎で使用した。

【０１０６】 PAP産生物のサイズは193 bpから218 bpの範囲である。1つの二本鎖および1つ
の一本鎖の産生物がゲル上で観察され、混入した耐熱性ピロホスファターゼによ
り加水分解されたPPiの消耗を示した。

【０１０７】参考文献のリスト

【０１０８】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】図1Aおよび1Bは、D₁ドーパミン受容体遺伝子のヌクレオチド229に
おけるGアリルを検出するためのPAPの使用を説明する概略図である。手順は以下
の実施例1に詳細に記載する。図1Cは、ヒトドーパミン受容体遺伝子のG/G、A/AおよびG/A遺伝子型由来のPAP
のオートラジオグラムである。

【図２】図2A-2Bは、PASAに関連するPAPの特異性の亢進を説明するダイアグ
ラムである。

【図３】図3Aおよび3Bは、以下の実施例1で得られた試料の電気泳動の結果
を示すオートラジオグラムである。

【図４】図4は、以下の実施例1で得られた試料の電気泳動の結果を示すオー
トラジオグラムである。

【図５】図5は、以下の実施例1で得られた試料の電気泳動の結果を示すオー
トラジオグラムである。

【図６】図6Aは、PAP効率の亢進を説明する概略図である。図6Bは、ヒトドーパミン受容体遺伝子のG/G、A/AおよびG/A遺伝子型由来のPAP
のオートラジオグラムである。

【図７】図7A-7Bは、以下の実施例2で得られた試料の電気泳動の結果を示す
オートラジオグラムである。

【図８】図8は、以下の実施例2で得られた試料の電気泳動の結果を示すオー
トラジオグラムである。

【図９】図9は、以下の実施例2で得られた試料の電気泳動の結果を示すオー
トラジオグラムである。

【図１０】図10は、以下の実施例3で得られた試料の電気泳動の結果を示す
オートラジオグラムである。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号６０／２３７，１８０ (32)優先日平成12年10月３日(2000．10．3) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者リュウ，チャンアメリカ合衆国カリフォルニア州91784，アップランド，ズィニア・ストリート 1310 (72)発明者サマー，スティーヴ・エスアメリカ合衆国カリフォルニア州91010，デュアーテ，スピンクス・キャニオン・ロード 201 Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA14 FB02 FB07 FB12 GC15 4B024 AA11 CA01 HA08 HA14 HA19 4B063 QA13 QQ41 QR08 QR13 QR42 QR50 QR55 QR62 QR66 QS03 QS25 QS34 QX02 【要約の続き】からである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸テンプレート上で所望する核酸鎖を合成する加ピロリン酸分
解活性化重合方法であって、以下のステップ、（a）オリゴヌクレオチドP^*がアニールされるときに、末端3'-デオキシヌクレ
オチドがテンプレート鎖とハイブリダイズするように、3'末端に非伸長可能3'-
デオキシヌクレオチドを有し、および3'末端あるいはその近くにテンプレート鎖
上の対応するヌクレオチドをミスマッチさせるヌクレオチドをもたない相補的活
性化可能オリゴヌクレオチドP^*を、テンプレート鎖に対してアニーリングするこ
と、（b）ピロホスファターゼ、および加リン酸分解活性を有しおよびハイブリダ
イズした末端3'-デオキシヌクレオチドの除去によりオリゴヌクレオチドP^*を活
性化する酵素を用いて、結果として生じた二本鎖を加ピロリン酸分解すること、
および（c）4つのヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下において、
テンプレート鎖上の活性化オリゴヌクレオチドP^*を伸長させることにより重合し
て、所望する核酸鎖を合成すること、を連続的に含む、前記方法。
【請求項２】請求項1の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、以下の
ステップ、（d）テンプレート鎖からステップ（c）の所望する核酸鎖を分離すること、お
よび（e）所望する核酸鎖の増幅の所望するレベルが達成されるまでステップ（a）
〜（d）を繰り返すこと、によって所望する核酸鎖を増幅することを含む、前記方法。
【請求項３】請求項2の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、ステッ
プ（a）において、ステップ（d）の分離された所望する核酸鎖産生物に対してア
ニールする第2のオリゴヌクレオチドの存在下で実行され、そしてここでステッ
プ（c）が、所望する核酸鎖上で第2のオリゴヌクレオチドを伸長することにより
重合して、核酸テンプレート鎖のコピーを合成することを含み、ステップ（d）
が、所望する核酸鎖から合成された核酸テンプレート鎖を分離することを含み、
そのため増幅が指数関数的である、前記方法。
【請求項４】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間の
ミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端3'-デオキシヌクレオ
チドから最初あるいは2番目のヌクレオチドで起こる、請求項3の加ピロリン酸分
解活性化重合方法。
【請求項５】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間の
ミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項3の加ピロリン酸
分解活性化重合方法。
【請求項６】ステップ（a）から（c）が、サーモサイクラー上で2つあるい
はそれ以上の温度ステージとして連続的に行われる、請求項2の加ピロリン酸分
解活性化重合方法。
【請求項７】請求項6の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、ステッ
プ（a）において、ステップ（d）の分離された所望する核酸鎖産生物に対してア
ニールする第2のオリゴヌクレオチドの存在下で実行され、そしてここでステッ
プ（c）が、所望する核酸鎖上で第2のオリゴヌクレオチドを伸長することにより
重合して、核酸テンプレート鎖のコピーを合成することを含み、ステップ（d）
が、所望する核酸鎖から合成された核酸テンプレート鎖を分離することを含み、
そのため増幅が指数関数的である、前記方法。
【請求項８】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間の
ミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端3'-デオキシヌクレオ
チドから最初あるいは2番目のヌクレオチドで起こる、請求項7の加ピロリン酸分
解活性化重合方法。
【請求項９】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間の
ミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項7の加ピロリン酸
分解活性化重合方法。
【請求項１０】ステップ（a）から（c）が、サーモサイクラー上で1つの温
度ステージとして行われる、請求項2の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項１１】請求項10の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、ステ
ップ（a）において、ステップ（d）の分離された所望する核酸鎖産生物に対して
アニールする第2のオリゴヌクレオチドの存在下で実行され、そしてここでステ
ップ（c）が、所望する核酸鎖上で第2のオリゴヌクレオチドを伸長することによ
り重合して、核酸テンプレート鎖のコピーを合成することを含み、ステップ（d
）が、所望する核酸鎖から合成された核酸テンプレート鎖を分離することを含み
、そのため増幅が指数関数的である、前記方法。
【請求項１２】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端3'-デオキシヌクレ
オチドから最初あるいは2番目のヌクレオチドで起こる、請求項11の加ピロリン
酸分解活性化重合方法。
【請求項１３】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項11の加ピロリ
ン酸分解活性化重合方法。
【請求項１４】 DNAポリメラーゼがまた、加ピロリン酸分解活性をもつ酵素
でもある、請求項10の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項１５】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端3'-デオキシヌクレ
オチドから最初あるいは2番目のヌクレオチドで起こる、請求項14の加ピロリン
酸分解活性化重合方法。
【請求項１６】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項14の加ピロリ
ン酸分解活性化重合方法。
【請求項１７】請求項14の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、ステ
ップ（a）において、ステップ（d）の分離された所望する核酸鎖産生物に対して
アニールする第2のオリゴヌクレオチドの存在下で実行され、そしてここでステ
ップ（c）が、所望する核酸鎖上で第2のオリゴヌクレオチドを伸長することによ
り重合して、核酸テンプレート鎖のコピーを合成することを含み、ステップ（d
）が、所望する核酸鎖から合成された核酸テンプレート鎖を分離することを含み
、そのため増幅が指数関数的である、前記方法。
【請求項１８】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端3'-デオキシヌクレ
オチドから最初あるいは2番目のヌクレオチドで起こる、請求項17の加ピロリン
酸分解活性化重合方法。
【請求項１９】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項17の加ピロリ
ン酸分解活性化重合方法。
【請求項２０】 DNAポリメラーゼが、耐熱性Tfl、Taq、あるいは遺伝学的に
操作されたDNAポリメラーゼである、請求項14の加ピロリン酸分解活性化重合方
法。
【請求項２１】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端3'-デオキシヌクレ
オチドから最初あるいは2番目のヌクレオチドで起こる、請求項20の加ピロリン
酸分解活性化重合方法。
【請求項２２】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項20の加ピロリ
ン酸分解活性化重合方法。
【請求項２３】請求項20の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、ステ
ップ（a）において、ステップ（d）の分離された所望する核酸鎖産生物に対して
アニールする第2のオリゴヌクレオチドの存在下で実行され、そしてここでステ
ップ（c）が、所望する核酸鎖上で第2のオリゴヌクレオチドを伸長することによ
り重合して、核酸テンプレート鎖のコピーを合成することを含み、ステップ（d
）が、所望する核酸鎖から合成された核酸テンプレート鎖を分離することを含み
、そのため増幅が指数関数的である、前記方法。
【請求項２４】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端3'-デオキシヌクレ
オチドから最初あるいは2番目のヌクレオチドで起こる、請求項23の加ピロリン
酸分解活性化重合方法。
【請求項２５】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項23の加ピロリ
ン酸分解活性化重合方法。
【請求項２６】アリル-特異的増幅に適応される請求項2の加ピロリン酸分解
活性化重合方法であって、核酸テンプレート鎖がテンプレート鎖とは異なる第2
のアリル核酸鎖との混合物中に存在し、そのため活性化可能オリゴヌクレオチド
P^*がアリル鎖の対応するヌクレオチドをミスマッチさせる少なくとも1つのヌク
レオチドを3'末端あるいはその近くに有し、そのためステップ（a）において、
オリゴヌクレオチドP^*の末端3'-デオキシヌクレオチドはアリル鎖とはハイブリ
ダイズしない；および従って、ステップ（b）において、ピロリン酸および加ピ
ロリン酸分解活性を有する酵素は活性化可能オリゴヌクレオチドP^*からハイブリ
ダイズされない末端3'-デオキシヌクレオチドを実質的には除去せず、ステップ
（c）において、オリゴヌクレオチドP^*はアリル鎖上での重合により実質的には
伸長されず、それによってテンプレート鎖上で合成される所望する核酸鎖はアリ
ル鎖上合成されるあらゆる核酸鎖にわたり好ましく増幅される、前記方法。
【請求項２７】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端3'-デオキシヌクレ
オチドから最初あるいは2番目のヌクレオチドで起こる、請求項26の加ピロリン
酸分解活性化重合方法。
【請求項２８】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項26の加ピロリ
ン酸分解活性化重合方法。
【請求項２９】請求項26の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、ステ
ップ（a）において、ステップ（d）の分離された所望する核酸鎖産生物に対して
アニールする第2のオリゴヌクレオチドの存在下で実行され、そしてここでステ
ップ（c）が、所望する核酸鎖上で第2のオリゴヌクレオチドを伸長することによ
り重合して、核酸テンプレート鎖のコピーを合成することを含み、ステップ（d
）が、所望する核酸鎖から合成された核酸テンプレート鎖を分離することを含み
、そのため増幅が指数関数的である、前記方法。
【請求項３０】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端3'-デオキシヌクレ
オチドから最初あるいは2番目のヌクレオチドで起こる、請求項29の加ピロリン
酸分解活性化重合方法。
【請求項３１】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項29の加ピロリ
ン酸分解活性化重合方法。
【請求項３２】所望する核酸鎖、テンプレート鎖、およびアリル鎖がDNA鎖
であり、活性化可能オリゴヌクレオチドP^*が2'-デオキシオリゴヌクレオチドで
あり、末端デオキシヌクレオチドが2', 3'-ジデオキシヌクレオチドであり、4つ
のヌクレオシド三リン酸が2'-デオキシヌクレオシド三リン酸であり、および核
酸ポリメラーゼがDNAポリメラーゼである、請求項26の加ピロリン酸分解活性化
重合方法。
【請求項３３】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端3'-デオキシヌクレ
オチドから最初あるいは2番目のヌクレオチドで起こる、請求項32の加ピロリン
酸分解活性化重合方法。
【請求項３４】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項32の加ピロリ
ン酸分解活性化重合方法。
【請求項３５】請求項32の加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、ステ
ップ（a）において、ステップ（d）の分離された所望する核酸鎖産生物に対して
アニールする第2のオリゴヌクレオチドの存在下で実行され、そしてここでステ
ップ（c）が、所望する核酸鎖上で第2のオリゴヌクレオチドを伸長することによ
り重合して、核酸テンプレート鎖のコピーを合成することを含み、ステップ（d
）が、所望する核酸鎖から合成された核酸テンプレート鎖を分離することを含み
、そのため増幅が指数関数的である、前記方法。
【請求項３６】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端3'-デオキシヌクレ
オチドから最初あるいは2番目のヌクレオチドで起こる、請求項35の加ピロリン
酸分解活性化重合方法。
【請求項３７】活性化可能オリゴヌクレオチドP^*およびテンプレート鎖の間
のミスマッチが、末端3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項35の加ピロリ
ン酸分解活性化重合方法。
【請求項３８】所望する核酸鎖、テンプレート鎖、およびアリル鎖がDNA鎖
であり、活性化可能オリゴヌクレオチドP^*および第2のオリゴヌクレオチドの両
方が2'-デオキシオリゴヌクレオチドであり、末端デオキシヌクレオチドが2', 3
'-ジデオキシヌクレオチドであり、4つのヌクレオシド三リン酸が2'-デオキシヌ
クレオシド三リン酸であり、および核酸ポリメラーゼがDNAポリメラーゼである
、請求項26の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項３９】活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*およびテンプ
レート鎖の間のミスマッチが、末端2',3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端2'
,3'-デオキシヌクレオチドから最初あるいは2番目の2'-デオキシヌクレオチドで
起こる、請求項38の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項４０】活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*およびテンプ
レート鎖の間のミスマッチが、末端2',3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求
項38の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項４１】ステップ（c）において使用する核酸ポリメラーゼが、遺伝
学的に修飾されたDNAポリメラーゼである、請求項1の方法。
【請求項４２】 PAP効率が亢進されるか、あるいはPAP効率がP^*の3'末端で、
ddAMP、ddTMP、ddGMP、ddCMPなどのいずれかの種のジデオキシヌクレオチドに対
してあまり区別しない、請求項41の方法。
【請求項４３】遺伝学的に修飾されたDNAポリメラーゼを使用することによ
り、PAP効率が亢進される、あるいはPAP効率がP^*の3'末端で、ddAMP、ddTMP、dd
GMP、ddCMPなどのいずれかの種のジデオキシヌクレオチドに対してあまり区別し
ない、請求項42の方法。
【請求項４４】遺伝学的に修飾されたDNAポリメラーゼが、AmpliTaqFSおよ
びThermoSequenase DNAポリメラーゼなどの、活性部位にて変異F667Yを含有する
、請求項41の方法。
【請求項４５】 ddAMP、ddTMP、ddGMP、およびddCMPなどの、P^*の3'末端での
ジデオキシヌクレオチドが、蛍光色素などの色素により標識されうる、請求項41
の方法。
【請求項４６】ヌクレオチド三リン酸が、ddATP、ddTTP、ddGTP、およびddC
TPなどの、DNAポリメラーゼの基質としてのジデオキシヌクレオチド三リン酸で
あり、ジデオキシヌクレオチド三リン酸が、蛍光色素などの色素により標識され
うる、請求項41の方法。
【請求項４７】 P^*がn>3の長さのヌクレオチドをともなう3'特異的部分配列
を有し、そしてそのテンプレート鎖に対する1つあるいはそれ以上のミスマッチ
が3'特異的部分配列内に位置するときに、P^*が実質的に増幅されず、一方で、3'
特異的部分配列内でその完全にマッチするテンプレート鎖を用いてP^*が実質的に
増幅される、請求項1の方法。
【請求項４８】 3'特異的部分配列におけるミスマッチが、P^*の3'末端の16ヌ
クレオチド内にある、請求項47の方法。
【請求項４９】各々のPAPが、1つのP^*あるいは2つのオリゴヌクレオチドを
用いて適応されうる、請求項47の方法。
【請求項５０】異なる3'特異的部分配列をともなうP^*のセットがPAPのため
に応用される、2つのDNA配列を比較するための、あるいは遺伝子発現プロファイ
リングをモニターするための、請求項1の方法。
【請求項５１】各々のP^*が3'特異的部分配列を有する、請求項50の方法。
【請求項５２】 P^*のセットが異なる3'特異的部分配列により不完全である、
請求項50の方法。
【請求項５３】あらかじめ知られたP^*を用いた特異的PAP増幅のリストが記
録されて、そして未知の相補的配列が3'特異的部分配列を整理することにより決
定される、請求項50の方法。
【請求項５４】各々のPAPが、1つのP^*あるいは2つのオリゴヌクレオチドを
用いて適応されうる、請求項53の方法。
【請求項５５】野生型アリルとの混合物中に存在する変異アリルの指数関数
的増幅のための加ピロリン酸分解活性化重合方法であって、一本鎖DNAを提供す
るためにアリルの鎖を分離して、次に以下のステップ、（a）各々のアリルのセンスあるいはアンチセンス鎖に対して、3'末端に非伸
長可能2',3'-デオキシヌクレオチドを持ち、および変異鎖上で対応する2'-デオ
キシヌクレオチドをミスマッチする3'末端あるいはその近くで2'-デオキシヌク
レオチドを持たないが、しかし野生型鎖上で対応する2'-デオキシヌクレオチド
をミスマッチする3'末端あるいはその近くで少なくとも1つの2'-デオキシヌクレ
オチドを持ち、そのためオリゴヌクレオチドP^*がアニールされるときに、末端2'
,3'-デオキシヌクレオチドは変異鎖とハイブリダイズするが、しかし野生株鎖と
はハイブリダイズしない、相補的な活性化可能2'-オリゴヌクレオチドP^*をアニ
ールすること、および同時に各々のアリルのアンチパラレル（anti-parallel）
鎖に対して、活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*および第2の2'-デオ
キシオリゴヌクレオチドが増幅すべき遺伝子の領域に隣接する、第2の相補的2'-
デオキシオリゴヌクレオチドをアニールすること；（b）ピロリン酸、およびハイブリダイズした末端2',3'-デオキシヌクレオチ
ドの除去により2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*を活性化する加リン酸分解活
性をもつ酵素を用いて、変異鎖に対してアニールされる活性化可能2'-デオキシ
オリゴヌクレオチドP^*を加ピロリン酸分解すること、および（c）4つのヌクレオシド三リン酸およびDNAポリメラーゼの存在下にて変異鎖
上での活性化オリゴヌクレオチドP^*の伸長により重合すること、および同時に変
異および野生型アンチパラレル鎖の両方の上にて第2の2'-デオキシオリゴヌクレ
オチドを伸長すること、（d）ステップ（c）の伸長産生物を分離すること；および（e）変異アリルの指数関数的増幅の所望するレベルが達成されるまでステッ
プ（a）〜（d）を繰り返すこと、を連続的に含む、前記方法。
【請求項５６】活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*および野生型
鎖の間のミスマッチが、末端2',3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端2',3'-デ
オキシヌクレオチドから最初あるいは2番目の2'-デオキシヌクレオチドで起こる
、請求項55の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項５７】活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*および野生型
鎖の間のミスマッチが、末端2',3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項56の
加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項５８】活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*がアリルのア
ンチセンス鎖に対してアニールされ、および第2の2'-デオキシオリゴヌクレオチ
ドがセンス鎖に対してアニールされる、請求項55の加ピロリン酸分解活性化重合
方法。
【請求項５９】活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*および野生型
鎖の間のミスマッチが、末端2',3'-デオキシヌクレオチドあるいは末端2',3'-デ
オキシヌクレオチドから最初あるいは2番目の2'-デオキシヌクレオチドで起こる
、請求項58の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項６０】活性化可能2'-デオキシオリゴヌクレオチドP^*および野生型
鎖の間のミスマッチが、末端2',3'-デオキシヌクレオチドで起こる、請求項58の
加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項６１】ステップ（a）から（c）がサーモサイクラー上で2つあるい
はそれ以上の温度ステージとして連続的に行われる、請求項55の加ピロリン酸分
解活性化重合方法。
【請求項６２】ステップ（a）から（c）がサーモサイクラー上で1つの温度
ステージとして連続的に行われる、請求項55の加ピロリン酸分解活性化重合方法
。
【請求項６３】 DNAポリメラーゼが耐熱性Tfl、Taq、あるいは遺伝子操作さ
れたDNAポリメラーゼである、請求項55の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項６４】（a）テンプレート核酸鎖に対して、3'末端に非伸長可能3'-
デオキシヌクレオチドを持ち、およびテンプレート鎖上で対応するヌクレオチド
とミスマッチするヌクレオチドを、3'末端あるいはその近くで持たず、そのため
オリゴヌクレオチドP^*がアニールされるときに、末端3'-デオキシヌクレオチド
がテンプレート鎖とハイブリダイズする、相補的な活性化可能2'-オリゴヌクレ
オチドP^*をアニールすること、（b）ピロリン酸、および加リン酸分解活性を有してハイブリダイズした末端3
'-デオキシヌクレオチドの除去によりオリゴヌクレオチドP^*を活性化する酵素を
用いて、結果として生じた二本鎖を加ピロリン酸分解すること、および（c）非伸長可能3'-デオキシヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼの
存在下にてテンプレート鎖上で活性化オリゴヌクレオチドP^*を伸長すること、を連続的に含む、加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項６５】非伸長可能3'-デオキシヌクレオシド三リン酸が放射性ある
いは蛍光標識で標識される、請求項64の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項６６】非伸長可能3'-デオキシヌクレオシド三リン酸が非伸長可能2
', 3'-ジデオキシヌクレオシド三リン酸である、請求項64の加ピロリン酸分解活
性化重合方法。
【請求項６７】ステップ（c）において、活性化オリゴヌクレオチドP^*が非
伸長可能2', 3'-ジデオキシヌクレオシド三リン酸および4つの2'-デオキシ-ヌク
レオシド三リン酸の混合物の存在下で伸長される、請求項66の加ピロリン酸分解
活性化重合方法。
【請求項６８】非伸長可能3'-デオキシヌクレオシド三リン酸が放射性ある
いは蛍光標識で標識される、請求項66の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項６９】非伸長可能3'-デオキシヌクレオシド三リン酸が放射性ある
いは蛍光標識で標識される、請求項67の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項７０】ステップ（c）において、活性化オリゴヌクレオチドP^*が非
伸長可能3'-デオキシヌクレオシド三リン酸および4つのヌクレオシド三リン酸の
混合物の存在下で伸長される、請求項64の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項７１】非伸長可能3'-デオキシヌクレオシド三リン酸が放射性ある
いは蛍光標識で標識される、請求項70の加ピロリン酸分解活性化重合方法。
【請求項７２】 2つの反応の連続的な結合を含むプロセスであって、第2の反
応は4つのヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下で核酸テンプ
レート上にてオリゴヌクレオチドを伸長することにより核酸を増幅することであ
り、第1の反応は、もしそれが除去されない場合にはオリゴヌクレオチドのテン
プレート上での伸長を防ぐであろう3'末端ブロックを除去することによりオリゴ
ヌクレオチドを活性化することである、前記プロセス。
【請求項７３】オリゴヌクレオチドが第1の反応の前および最中にテンプレ
ートと少なくもと部分的にハイブリダイズする、請求項72のプロセス。
【請求項７４】オリゴヌクレオチド上の3'末端ブロックがテンプレートの3'
化学的キャップあるいは3'ミスマッチである、請求項73のプロセス。
【請求項７５】 3'ブロックが3'塩基修復、脱リン酸化あるいは制限エンドヌ
クレアーゼ開裂により除去される、請求項74のプロセス。
【請求項７６】オリゴヌクレオチドがメチル化エンドヌクレアーゼ認識配列
を含有して、非メチル化制限エンドヌクレアーゼ配列を有する標的に対してアニ
ールされ、およびオリゴヌクレオチドがメチル化部位の制限エンドヌクレアーゼ
開裂により活性化される、請求項75のプロセス。
【請求項７７】メチル化エンドヌクレアーゼ認識配列がG^mATCである、請求
項76のプロセス。
【請求項７８】制限エンドヌクレアーゼがDpnIである、請求項77のプロセス
。
【請求項７９】加ピロリン酸分解活性化重合方法により核酸配列中の未知の
配列変化のためスキャンニング、あるいは核酸中の先に決定された配列の再配列
決定する方法であって、（a）ハイブリダイゼーション条件下で、核酸のテンプレート鎖と、テンプレ
ート鎖に対してそれとハイブリダイズするのに十分に相補的であり、そして各々
のセット内で異なる3'-末端非伸長可能ヌクレオチドを有する点で互いに異なり
、そのため、テンプレート鎖が3'末端非伸長可能ヌクレオチドに相補的な場合は
、3'末端非伸長可能ヌクレオチドがテンプレート鎖とハイブリダイズし、セット
の数が配列中のヌクレオチドの数に一致する、4つの活性化可能オリゴヌクレオ
チドP^*の複数セットを混合すること；（b）ピロリン酸、およびテンプレート鎖にハイブリダイズする3'末端非伸長
可能ヌクレオチドを有するそれらのオリゴヌクレオチドP^*のみを加ピロリン酸分
解により活性化する加リン酸分解活性をもつ酵素を用いて、結果として生じた二
本鎖を処理すること、（c）4つのヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下にてテンプ
レート鎖上での活性化オリゴヌクレオチドP^*の伸長により重合すること、（d）ステップ（c）において合成された核酸鎖をテンプレート鎖から分離する
こと、（e）増幅の所望するレベルが達成されるまでステップ（a）〜（d）を繰り返
すこと、および（f）増幅を産生したオリゴヌクレオチドP^*の重複を解析することにより順序
に従って核酸鎖を整理すること、を含む、前記方法。
【請求項８０】ヌクレオチド三リン酸が単一ヌクレオチド伸長のためのDNA
ポリメラーゼの基質としての、ddATP、ddTTP、ddGTPおよびddCTPなどの、ジデオ
キシヌクレオチドでありうる、請求項79の方法。
【請求項８１】ジデオキシヌクレオチド三リン酸が蛍光色素などの色素によ
り染色されていてもよく、およびPAPシグナルが各々の色素の強度の増加により
表される、請求項80の方法。
【請求項８２】 3'末端ヌクレオチドが参照配列あるいは3つの可能性のある
単一塩基置換の1つと一致する、下流あるいは上流のヌクレオチド位置と一致す
る1つのP^*がある、請求項79の方法。
【請求項８３】 3'末端で、ddAMP、ddTMP、ddGMPあるいはddCMPのいずれかが
参照配列および3つの可能性のある単一塩基置換に一致すること以外は同一な配
列を有する、下流あるいは上流のヌクレオチド位置に一致する4つのP^*がある、
請求項79の方法。
【請求項８４】 4つのP^*が単一スポット上で固定される、請求項83の方法。
【請求項８５】各々2つの連続的なP^*が積み重ね領域<3'特異的部分配列を用
いて積み重ねて整理されることでP^*の数を減少させ、それが変異位置の情報を提
供することができる、請求項83の方法。
【請求項８６】既知のP^*を用いた特異的PAP増幅のリストを記録して、そし
て次にDNA相補的配列をワトソン-クリック対法則を使用することにより再構築す
る、請求項83の方法。
【請求項８７】各々のPAPが1つのP^*あるいは2つのオリゴヌクレオチドを用
いて適用されうる、請求項83の方法。
【請求項８８】加ピロリン酸分解活性化重合により核酸の配列をde novoに
決定する方法であって、（a）ハイブリダイゼーション条件下で、核酸のテンプレート鎖と、全てがヌ
クレオチドの同数nを有しておよびnヌクレオチドを有する全ての可能性のある配
列から集合的に構成され、および全てが3'末端で非伸長可能ヌクレオチドを有し
、それにより十分に相補的なオリゴヌクレオチドP^*のいずれかがテンプレート鎖
とハイブリダイズするであろうし、およびテンプレート鎖が3'末端に一致する位
置で相補的である場合にのみ、3'末端非伸長可能ヌクレオチドがテンプレート鎖
とハイブリダイズするであろう、複数の活性化可能オリゴヌクレオチドP^*を混合
すること、（b）ピロリン酸、およびテンプレート鎖にハイブリダイズする3'末端非伸長
可能ヌクレオチドを有するそれらのハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドP^* のみを、それらのハイブリダイズされる3'末端非伸長可能ヌクレオチドの加ピロ
リン酸分解により活性化する加リン酸分解活性をもつ酵素を用いて、結果として
生じた二本鎖を処理すること、（c）4つのヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下にてテンプ
レート鎖上での活性化オリゴヌクレオチドP^*の伸長により重合すること、（d）ステップ（c）において合成された核酸鎖をテンプレート鎖から分離する
こと、（e）増幅の所望するレベルが達成されるまでステップ（a）〜（d）を繰り返
すこと、および（f）増幅を産生したオリゴヌクレオチドP^*の配列を決定し、次にこれらのオ
リゴヌクレオチドの重複を解析することにより順序に従って核酸鎖を整理するこ
と、を含む、前記方法。
【請求項８９】ヌクレオチド三リン酸が単一ヌクレオチド伸長のためのDNA
ポリメラーゼの基質としての、ddATP、ddTTP、ddGTPおよびddCTPなどの、ジデオ
キシヌクレオチドでありうる、請求項88の方法。
【請求項９０】ジデオキシヌクレオチド三リン酸が蛍光色素などの色素によ
り染色されていてもよく、およびPAPシグナルが各々の色素の強度の増加により
表される、請求項89の方法。
【請求項９１】 ddAMP、ddTMP、ddGMPおよびddCMPなどの、 P^*の3'末端での
ジデオキシヌクレオチドが蛍光色素などの色素により染色されていてもよく、お
よびPAPシグナルが各々の色素の強度の減少により表される、請求項88の方法。
【請求項９２】様々な3'特異的部分配列を有するP^*のセットがPAPに適用さ
れる、請求項88の方法。
【請求項９３】各々のP^*が3'特異的部分配列を有する、請求項92の方法。
【請求項９４】 P^*のセットが様々な3'特異的部分配列の完全なセットあるい
は様々な3'特異的部分配列の不完全なセットである、請求項92の方法。
【請求項９５】既知のP^*を用いた特異的PAP増幅のリストを記録して、そし
て次に未知のDNA相補的配列をワトソン-クリック対法則を使用することによって
3'特異的部分配列を整えることにより再構築する、請求項92の方法。
【請求項９６】各々のPAPが1つあるいは2つのP^*あるいは2つのオリゴヌクレ
オチドを用いて適用されうる、請求項92の方法。