JP2010539131A - アミリンとそのアナログの安定的製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、アミリンペプチド及びアニオン界面活性剤を含む、非経口投与のための可溶性製薬組成物、及び高血糖症の治療方法に関する。

Description

本発明は非経口投与のための可溶性製薬組成物であって、アミリンペプチドとアニオン界面活性剤を含む組成物に関する。また、高血糖症の治療方法を記載する。

発明の背景

真正糖尿病はグルコースを利用する能力が部分的にまたは完全に失われる代謝異常である。
真正糖尿病の治療において、多種類のインスリン製剤がある。通常、インスリン製剤は皮下注射によって投与される。
糖尿病の治療に対する関心の他のペプチドは、アミリンである。糖尿病に関するアミリンの作用は、以下の通りである：低体重につながる食糧摂取量の減少、より遅い胃内容排出、食後のグルコースプロフィールを滑らかにすること、及び過剰な糖尿病性グルカゴン放出の減少(A.Young,Amylin:Physiology and Pharmacology,Academic Press(2005))。概して、アミリンは、直接的に標的器官に作用するよりもむしろ、同定されたＣＮＳ受容体を経て作用する。

ヒトアミリンは、３７アミノ酸長ペプチドであり、薬としての使用が問題となる生理−化学的性質を有する。特に、それはエクスビボでフィブリル化する傾向があり、沈殿により効果がなくなる。市場には、現在、シムリン（登録商標）と呼ばれる位置２５、２８及び２９の３アミノ酸がプロリンに各々置換されているヒトアミリン（プラムリンチド）のアナログを含む医薬品がある。これは、フィブリル化傾向をかなり改良する。しかしながら、プラムリンチドであっても中性ｐＨの溶液中に保つことは難しく、そのため酸性溶液で提供される（すなわちシムリン（登録商標））。薬剤が酸性ｐＨで投与される場合、それによって患者の局所刺激が生じるリスクがある。
生理的ｐＨの安定溶液中にアミリンペプチドを含む製薬組成物を提供することは有用である。

（発明の開示）
本発明は非経口投与のための可溶性製薬組成物であって、アミリンペプチド及びアニオン界面活性剤を含む組成物に関する。
また、本発明は非経口投与のための可溶性製薬組成物であって、アミリンペプチド及び、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ＤＭＰＧ）であるアニオン界面活性剤を含む組成物に関する。

生理的ｐＨで安定している製薬組成物を得ることは、本発明の目的である。本発明の一態様において、製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨは、約ｐＨ４．０から約ｐＨ９．０である。
更に、本発明は、本発明に係る製薬組成物を投与することによる高血糖症の治療方法及び医薬として使用される定義のとおりの製薬組成物に関する。

（定義）
本願明細書で使用する「アミリンペプチド」なる用語は、アミリン、アミリンアナログ、アミリン誘導体またはアミリンアゴニストを意味する。
本願明細書で使用する「アミリン」は、すい臓のβ細胞からインスリンと共に分泌されるアミリンと称される３７アミノ酸のヒトペプチドホルモンを指す。ヒトアミリンは、以下のアミノ酸配列を有する：Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（配列番号１）。従って、構造式は、２つのＣｙｓ残基の間のジスルフィド架橋、及びＣ末端アミノ酸にペプチド結合を介して結合されるアミド基を有するＬｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ− Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（配列番号１）である。当該用語は、単離可能な形態で、他の哺乳類の種に存在するアミリンの変異体を更に含む。天然に存在するアミリン化合物に関して、該用語は単離された形態、精製された形態、又はさもなければ天然に見られない他の形態を含む。

アミリンの「アゴニスト」は、インビトロまたはインビボでアミリンの一つ以上の効果（または活性）を模倣するする化合物を指す。アミリンの効果は、直接的または間接的に相互作用する能力又はアミリンにより活性化されるか又は不活性化される一つ以上の受容体と結合する能力を含む（例えばＷＯ２００４／０３７１６８の実施例２及び３に記載されている受容体結合アッセイ及びヒラメ筋アッセイ）。好ましくは、アミリンアゴニストはカルシトニンではなく、それは本願明細書において使われる場合、ヒトペプチドホルモンカルシトニン及びラット、サーモン１０とウナギ（アミノスベリン酸ウナギカルシトニンを含む）のそれのような種間変異体を指す。
好適なアミリンアゴニストは、また、配列番号１に対する少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％のアミノ酸配列同一性を有し、且つアミリン活性を有する化合物であってもよい。
本発明の使用において意図される例示的なアミリンアゴニストアナログは、米国特許第５６８６４１１号、６１１４３０４号及び６４１０５１１号（Amylin Pharmaceuticals Inc)に記載されているものを含み、それらの全部について本願明細書に引用により援用される。

アミリンの「アナログ（ａｎａｌｏｇ）」または「アナログ（ａｎａｌｏｇｕｅ）」または「アゴニストアナログ」は、アミリンに構造が類似しており（例えば、一つ以上の天然又は非天然アミノ酸又はペプチド疑似体を置換することによって、アミリンの一次アミノ酸配列から誘導される）、インビトロ又はインビボでアミリンの効果を模倣する化合物を指す。
本発明において有用なさまざまなアミリンアナログの命名法は、配列が基づくペプチド及び任意の基礎ペプチドアミリン配列（例えばヒトアミリン）される修飾の両方を示すために用いることができる。番号が続くアミノ酸又は上付きの番号の後のアミノ酸は、名づけられたアミノ酸が基礎のアミノ酸配列の番号／上付き番号のアミノ酸の位置において通常存在するアミノ酸を変えたことを示す。例えば、「Ａｒｇ１８ Ｐｒｏ２５ Ｐｒｏ２８−ｈ−アミリン」及び「^１８Ａｒｇ^{２５，２８}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン」は、「ｈ−アミリン」または「ヒト−アミリン」の配列に基づいて、以下の置換を有しているペプチドに関連する：残基１８のＨｉｓが置換されたＡｒｇ、残基２５のＡｌａが置換されたＰｒｏ及び残基２８のＳｅｒが置換されたＰｒｏ。「ｄｅｓ−Ｌｙｓ１−ｈ−アミリン」及び「ｄｅｓ−^１Ｌｙｓ−ｈ−アミリン」なる用語は、ヒトアミリンの配列に基づくペプチドであって、第１又はＮ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを指す。本発明による有用なアミリンアナログは、また、ＥＰ２８９２８７に記載されているようなアミリンの断片を含み、その内容は引用によって本願明細書に組み込まれる。
更にアミリンアナログは、配列番号１の少なくとも１つ以上のアミノ酸位置に挿入、欠失および／または置換を有するアミリンを含む。アミノ酸挿入、欠失または置換の数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、１０あってもよい。挿入または置換は、他の天然又は非天然アミノ酸、合成アミノ酸、ペプチド疑似体、または他の化学物質によってされてもよい。

非限定的な例示的化合物は、ｄｅｓ−Ｌｙｓ１−ｈ−アミリン、Ｐｒｏ２８−ｈ−アミリン、Ｐｒｏ２５ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９−ｈ−アミリン、Ａｒｇ１８ Ｐｒｏ２５ Ｐｒｏ２８−ｈ−アミリン、Ｐｒｏ２５ Ｖａｌ２６ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９−ｈ−アミリン及びＡｒｇ１８ Ｐｒｏ２５ Ｐｒｏ２８−ｄｅｓ−Ｌｙｓ１−ｈ−アミリンであり、それら全ては処理された試験動物においてインビボでアミリン活性を示す（例えば、高血糖症が続く著しい高乳酸血症が誘発される）。アミリンに特徴的な活性を有することに加えて、ヒトアミリンと比較した場合、特定の本発明の好適な化合物はより望ましい溶解及び安定特性を備えていることが更に見いだされている。

アミリンの「誘導体」は、化学的に改変されたアミリンを指し、例えばアミリン主鎖の一つ以上の位置に側鎖を導入することによって、又はアミリンのアミノ酸残基の基の酸化または還元によって、またはフリーのカルボキシ基をエステル基またはアミド基に変換することによって改変される。他の誘導体は、フリーのアミノ基または水酸基をアシル化することによって得られる。アミリン誘導体の例は、国際特許出願ＷＯ２００７／１０４７８９（ノボノルディスク エー／エス）及び系属中の欧州特許出願番号第０７１１６０６７．５号に記載されている。アミリン誘導体の更なる例はＮ−メチル化アミリンであって、例えばＹａｎ等(PNAS,vol.103,no.7,p.2046-2051,2006)に記載アミリンが位置２４と２６においてＮ−メチル化されたアミリンペプチドである。

（本発明の説明）
一態様において、本発明は、アミリンペプチドと界面活性剤とを含む非経口投与のための可溶性製薬組成物に関する。
生理的ｐＨで安定している製薬組成物を得ることは、本発明の目的である。本発明の一態様において、前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨは、約ｐＨ４．０から約ｐＨ９．０である。本発明の更なる態様において、前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨは、約ｐＨ５．０から約ｐＨ８．５である。本発明の更なる態様において、前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨは、約ｐＨ６．０から約ｐＨ８．５である。本発明の更なる態様において、前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨは、約ｐＨ６．５から約ｐＨ８．５である。本発明の更なる態様において、前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨは、約ｐＨ６．５から約ｐＨ８．０である。本発明の更なる態様において、前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨは、約ｐＨ７．０から約ｐＨ８．０である。本発明の更なる態様において、前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨは、約ｐＨ７．４である。

本発明の他の態様では、製薬組成物は溶液である。本発明の他の態様では、製薬組成物は固体である。本発明の他の態様では、製薬組成物は、水溶液（例えばバッファーまたは注射用蒸留水）によって再構成されることになっている。本発明の他の態様では、製薬組成物は、注射または注入による投与に適している。本発明の更なる態様において、製薬組成物は、皮下投与のための投与に適している。本発明の他の態様では、製薬組成物は、筋肉内投与に適している。本発明の他の態様では、製薬組成物は、静脈内投与に適している。

本発明のある態様において、アミリンペプチドは、アミリン、アミリンアナログ、アミリン誘導体またはアミリンアゴニストである。
本発明のアミリンペプチドは、アミリン受容体、又はアミリン自体が生物反応（例えば摂食量の減少）を引き出すために相互作用する他の受容体に、結合できるか、さもなければ直接的または間接的に相互作用できてもよい。本発明の化合物は、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭを超える親和性により、より好ましくは「アッセイ」のセクションにおいてアミリン受容体アッセイにより測定されたように、０．１０ｎＭを超える親和性によりアミリン受容体に結合できる。

更に、アミリンアナログは、挿入、欠失および／または置換を有するアミリンを配列番号１の少なくとも１つ以上のアミノ酸位に含む。アミノ酸挿入、欠失または置換の数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、１０であってもよい。
挿入または置換は、他の天然又は非天然アミノ酸、合成アミノ酸、ペプチド疑似体、または他の化学物質によってされてもよい。
本発明の一態様において、前記アミリンペプチドは、ヒトアミリンである。本発明の一態様において、前記アミリンペプチドは、Ｐｒｏ２５ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９−ｈ−アミリン（プラムリンチド）である。本発明の更なる態様において、前記アミリンペプチドは、位置２４と２６においてメチル化されたヒトアミリンである。

本発明の一態様において、前記アミリンペプチドの濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌまで、または約０．１ｍｇ／ｍｌから約４ｍｇ／ｍｌまで、又は約０．４ｍｇ／ｍｌから約１．２ｍｇ／ｍｌまでの範囲である。
本発明の一態様において、界面活性剤は、アニオン界面活性剤である。
本発明の一態様において、製薬組成物は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）より高い濃度のアニオン界面活性剤を含む。
アニオン界面活性剤は、ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸メチルエステル、ジギトニン、ジギトキシゲニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−酸化物、ドキュセートナトリウム、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸水和物、グリコデオキシコール酸一水和物、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、グリコリトコール酸３−硫酸ジナトリウム塩、グリコリトコール酸エチルエステル、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ラウロイルサルコシン、リチウム・ドデシルスルフェイト、ルゴール、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、１−オクタンスルホネート、ナトリウム１−ブタンスルホネート、ナトリウム１−デカンスルホネート、ナトリウム１−ドデカンスルホネート、ナトリウム１−ヘプタンスルホネート、ナトリウム１−ヘプタンスルホネート、ナトリウム１−ノナンスルホネート、ナトリウム１−プロパンスルホネート一水和物、ナトリウム２−ブロモエタンスルホネート、コール酸ナトリウム水和物、雄牛またはヒツジ胆汁、コール酸ナトリウム水和物、胆汁酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ナトリウムヘキサンスルホネート、オクチル硫酸ナトリウム、ナトリウムペンタスルホネート、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩一水和物、タウロリトコール酸３硫酸ジナトリウム塩、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、トリズマ（登録商標）ドデシル硫酸、ＤＳＳ（ドキュセートナトリウム、ＣＡＳ登録番号［５７７−１１−７］）、ドキュセートカルシウム、ＣＡＳ登録番号［１２８−４９−４］）、ドキュセートカリウム（ＣＡＳ登録番号［７４９１−０９−０］）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム）、ドデシルホスホコリン（ＦＯＳ−コリン−１２）、デシルホスホコリン（ＦＯＳ−コリン−１０）、ノニルホスホコリン（ＦＯＳ−コリン−９）、ジパルミトイル・ホスファチジン酸、カプリル酸ナトリウムおよび／またはウルソデオキシコール酸からなる群から選択される。

本発明の一態様において、アニオン界面活性剤はグリセロホスホグリセロール誘導体である。本発明の一態様において、前記グリセロホスホグリセロール誘導体は、ジミリストイル誘導体、例えば１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ＤＭＰＧ）である。本発明の一態様において、ジミリストイル誘導体は、０．１ｍＭと１０ｍＭとの間、好ましくは０．５ｍＭと５ｍＭとの間、好ましくは０．５ｍＭと３ｍＭとの間の濃度において加えられる。本発明の一態様において、ジミリストイル誘導体は、０．１ｍＭと０．５ｍＭとの間の濃度において加えられる。本発明の一態様において、前記グリセロホスホグリセロール誘導体は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ＤＭＰＧ）、例えばＣＡＳ番号６７２３２−８０−８である。

本発明の一態様において、前記界面活性剤の濃度は、約５ｍｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌまでである。本発明の更なる態様において、前記界面活性剤の濃度は、約１０ｍｇ／Ｌから約３０ｇ／Ｌである。本発明の更なる態様において、前記界面活性剤の濃度は、約２０ｍｇ／Ｌから約３０００ｍｇ／Ｌである。本発明の更なる態様において、前記界面活性剤の濃度は、約３０ｍｇ／Ｌから約５００ｍｇ／Ｌである。本発明の更なる態様において、前記界面活性剤の濃度は、約５０ｍｇ／Ｌから約２００ｍｇ／Ｌである。
本発明の一態様において、界面活性剤は、０．１ｍＭと１０ｍＭとの間、好ましくは０．５ｍＭと５ｍＭとの間、好ましくは０．５ｍＭと３ｍＭとの間の濃度において、好ましくは加えられる。
一態様において、本発明の可溶性製薬組成物は、更なる界面活性剤を含む。更なる態様において、更なる界面活性剤が、アニオン界面活性剤、非イオン性活性剤、双性イオンの界面活性剤、カチオン界面活性剤、ポロキサマー、及びアルキルポリグルコシドからなる群から選択される。更に他の態様において、更なる界面活性剤がポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３８、ポリソルベート２０（トゥイーン２０）、ポリソルベート８０、Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５、ｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシナート、テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド及びｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシドからなる群から選択される。

本発明の製薬組成物は、物理的と化学的に安定しており、所望のｐＨで可溶性である。「所与のｐＨで可溶性」により意味されるのは、本発明の組成物に含まれるアミリンペプチド組成物が、組成物のｐＨで完全に溶解されることである。ここで、本発明の組成物に含まれるアミリンペプチドが溶解しているか否かを測定する方法は当該分野で知られている。
一態様において、製薬組成物は３０，０００ｇで２０分間の遠心にかけることができ、それにより上澄みのアミリンペプチド濃度はＲＰ−ＨＰＬＣによって測定することができる。この濃度が組成物を作るために本来使用されるアミリンペプチド濃度に実験誤差の範囲内で等しい場合、それによりアミリンペプチドは本発明の組成物に完全に可溶性である。
別の態様においては、本発明の組成物におけるアミリンペプチドの溶解性は、簡単に見た目で組成物が含まれる容器を調べることによって測定することができる。溶液が見た目には透明であり、微粒子物質が容器の側面／底に懸濁も沈殿もしていない場合、アミリンペプチドは可溶性である。
別の態様においては、本発明の組成物におけるアミリンペプチドの物理的安定性は、タンパク質製剤の物理的安定性の評価のためのＴｈＴフィブリル化アッセイによって測定することができる。

本発明の一態様において、本発明による製薬組成物は、薬学的に「物理的に安定」な組成物である。本願明細書において使用される場合「物理的に安定」なる用語は、アミリンペプチドがフィブリル形成しないか、又は凝集の他の形態、沈殿又は表面（例えば、製薬組成物を含んでいる容器）への吸着により失われないことを意味する。物理安定性は、セクション「アッセイ」において、ＴｈＴフィブリル化アッセイに記載したように測定することができる。
当然ながら、本発明の組成物におけるアミリンペプチドの溶解性が組成物及びそのｐＨによって影響を受けるだけではなく、溶解性の測定の前に組成物が保存される温度及び時間によっても影響を受けうることは、当業者によってよく理解される。

本発明の一態様において、前記製薬組成物は防腐剤を含む。ある態様において、前記防腐剤は、フェノール、ｍ−クレゾールまたはそれら混合物からなる群から選択される。
本発明の更なる態様において、前記製薬組成物は、バッファーを含む。一態様において、前記バッファーは、ホスフェート、ＴＲＩＳ、ＢＩＣＩＮＥ、及びＨＥＰＥＳのようなグッドバッファー、グリシン、グリシルグリシン、シトレートまたはそれらの混合物からなる群から選択される。更なる態様において、前記バッファーは、ＴＲＩＳ、ＢＩＣＩＮＥ、及びＨＥＰＥＳのようなグッドバッファー、グリシン、グリシルグリシンまたはそれらの混合物から成る群から選択される。

本発明の更なる態様において、前記製薬組成物は等張剤を含む。一態様において、前記等張性剤は塩ではない。更なる態様において、前記等張性剤は、トレハロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール及びそれら混合物からなる群から選択される。

本発明の更なる態様において、前記製薬組成物は安定剤を含む。一態様において、前記安定剤は、Ｌ−ヒスチジン、イミダゾール及びＬ−アルギニンからなる群から選択される。一態様において、前記安定剤は、ポリエチレングリコールである。
別の態様において、本発明は、アミリンペプチド及び界面活性剤を含む製薬組成物の有効量の非経口投与による、高血糖症の治療方法に関する。
別の態様において、本発明は、アミリンペプチド及び界面活性剤を含む製薬組成物の有効量の非経口投与を含む、過食症及び過食の治療方法に関する。
別の態様において、本発明は、アミリンペプチド及び界面活性剤を含む製薬組成物の有効量の非経口投与を含む、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、高血圧、エックス症候群、異脂肪血症、認知傷害、アテローム硬化症、心筋梗塞、虚血性心疾患及び他の心血管疾患、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良及び胃潰瘍の治療または予防方法に関する。
別の態様において、本発明は、アミリンペプチド及び界面活性剤を含む製薬組成物の有効量の非経口投与を含む、２型糖尿病の疾患の進行を遅延又は予防する方法に関する。

別の態様において、本発明は、アミリンペプチド及び界面活性剤を含む製薬組成物の有効量の非経口投与を含む、摂食量減少、β細胞アポトーシス減少、β細胞機能及びβ細胞量の増大、および／またはβ細胞のグルコース感受性回復のための方法に関する。
更なる態様において、本発明は、薬学的に適切な量のインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１誘導体をそれを必要とする患者に投与することを更に含む、上記の病状の何れかを治療する方法に関する。
別の態様において、本発明の組成物と組合わせて使用されるインスリンとして指すものは、ヒトインスリンである。
別の態様において、本発明の組成物と組合わせて使用されるインスリンとして指すものは、ヒトインスリンアナログである。
別の態様において、本発明の組成物と組合わせて使用されるインスリンとして指すものは、ヒトインスリンアナログの誘導体である。
別の態様においては、インスリンアナログ及び誘導体は、ＥＰ３７５４３７、ＥＰ０７９２２９０、ＥＰ０２１４８２６、ＥＰ１６６０５３１、ＥＰ１８４６４４６、ＥＰ１８４６４４７、ＷＯ２００７／０９６４３１、ＷＯ２００７／１２８８１７、ＷＯ２００７／１２８８１５及びＥＰ０７０５２７５（ノボノルディスク エー／エス）、ＵＳ５５０４１８８およびＥＰ３８３４７２（イーライ・リリー）およびＥＰ０３６８１８７（Ａｖｅｎｔｉｓ）において開示されるもの中から選択される。

一態様において、インスリン誘導体は商品名Ａｐｉｄｒａ（登録商標）で販売されているインスリングルリシン（ＬｙｓＢ３ ＧｌｕＢ２９ヒトインスリン）および、ＵＳ６２１６３３(Sanofi Aventis)において開示されている他のインスリン誘導体を含んでもよい。
一態様において、インスリン誘導体およびインスリンアナログは、商品名ランタス（登録商標）により酸性の製剤として現在販売されている持続性インスリンアナログであるインスリングラルジン（ｇｌａｒｇｉｎｅ）（ＧｌｙＡ２１ ＡｒｇＢ３１ ＡｒｇＢ３２ヒトインスリン）を含んでもよい。一態様において、インスリンアナログは、商品名Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）の下で販売されるインスリンｌｙｓｐｒｏ（ＬｙｓＢ２８ ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン）又は商品名Ｎｏｖｏｒａｐｉｄ（登録商標）またはＮｏｖｏｌｏｇ（登録商標）の下で販売されるインスリンアスパート（ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン）である。

別の態様において、本発明の組成物と組合わせて使用されるインスリンは、例えばＢ２９位置のような一以上の位置でアシル化されたインスリン分子又はｄｅｓＢ３０ヒトインスリンを指す。
別の態様においては、本発明の組成物と組合わせて使用されるインスリンは、ＧｌｙＡ２１ ＡｒｇＢ３１ ＡｒｇＢ３２ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン）、ＮεＢ２９−トリデカノイルヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルヒトインスリン、ＤｅｓＢ３０ ＡｒｇＢ３１ ＡｒｇＢ３２ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル・ヒトインスリン及びＬｙｓＢ２９（Ｎε−ヘクサデカノイル−γ−Ｇｌｕ）ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンからなる群から選択される。
本発明の他の態様において、インスリンアナログは、例えばＧｌｙＡ２１ ＡｓｐＢ２８ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンまたはＧｌｙＡ２１ ＧｌｕＢ２８ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンのようなＷＯ２００４／０８０４８０において開示されるそれらの酸性安定するインスリンアナログから選択される。
本発明の他の態様において、前記ヒトインスリンアナログは、ヒトインスリンｄｅｓＢ３０（別名ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン）である。

別の態様において、本発明の組成物と組合わせて使用されるＧＬＰ−１誘導体は、ＧＬＰ−１（１−３７）、エキセンディン−４（１−３９）、そのインスリン分泌促進断片、そのインスリン分泌促進アナログとそれのインスリン分泌促進誘導体に関する。ＧＬＰ−１（１−３７）のインスリン分泌促進断片は、全ての配列がＧＬＰ−１（１−３７）の配列に見いだすことができ、少なくとも一つの末端アミノ酸が欠失したインスリン分泌促進ペプチドである。ＧＬＰ−１（１−３７）のインスリン分泌促進断片の例は、ＧＬＰ−１（１−３７）の位置１−６のアミノ酸残基が欠失したＧＬＰ−１（７−３７）であり、ＧＬＰ−１（１−３７）の位置１−６と３７のアミノ酸残基が欠失したＧＬＰ−１（７−３６）である。エキセンディン−４（１−３９）のインスリン分泌促進断片の例は、エキセンディン−４（１−３８）及びエキセンディン−４（１−３１）である。化合物のインスリン分泌促進特性は、公知技術のインビボ及びインビトロアッセイによって測定することができる。例えば、化合物を動物に投与して、時間とともにインスリン濃度を監視することができる。ＧＬＰ−１（１−３７）及びエキセンディン−４（１−３９）のインスリン分泌促進アナログは、アミノ酸残基の一つ以上が他のアミノ酸残基と置換されており、および／または、一以上のアミノ酸残基が欠失しており、および／または、一以上アミノ酸残基が付加されているそれぞれの分子であるが、但し前記アナログはインスリン分泌促進であるか、インスリン分泌促進化合物のプロドラッグである。ＧＬＰ−１（１−３７）のインスリン分泌促進アナログの例は、例えば位置１から６のアミノ酸残基が欠失しているおり且つ位置８のアラニンがメチオニンと交換されたＭｅｔ８−ＧＬＰ−１（７−３７）であり、位置１から６のアミノ酸残基が欠失しているおり且つ位置３４のバリンがアルギニン交換されたＡｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）である。エキセンディン−４（１−３９）のインスリン分泌促進アナログの例は、位置２と３のアミノ酸残基がそれぞれセリンとアスパラギン酸と交換されたＳｅｒ２Ａｓｐ３−エキセンディン−４（１−３９）である（この特別なアナログはエキセンディン−３として知られている）。ＧＬＰ−１（１−３７）、エキセンディン−４（１−３９）及びそのアナログのインスリン分泌促進誘導体は、当業者がこれらのペプチドの誘導体であると考えるもの、すなわち親ペプチド分子に存在しない少なくとも一つの置換基を有するものであって、但し前記誘導体がインスリン分泌促進であるか、又はインスリン分泌促進化合物のプロドラックである。置換基の例は、アミド、糖、アルキル基及び親油性置換基である。ＧＬＰ−１（１−３７）、エキセンディン−４（１−３９）とそれのアナログのインスリン分泌促進誘導体の例は、ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ２６（Ｎ^ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ^α−ヘキサデカノイル）））−ＧＬＰ−１（７−３７）及びＴｙｒ３１−エキセンディン−４（１−３１）−アミドである。ＧＬＰ−１（１−３７）、エキセンディン−４（１−３９）、そのインスリン分泌促進断片、そのインスリン分泌促進アナログ及びそのインスリン分泌促進誘導体の更なる例は、ＷＯ９８／０８８７１（ノボノルディスク エー／エス）、ＷＯ９９／４３７０６（ノボノルディスク エー／エス）、ＵＳ５４２４２８６（ｅｎｇ）、ＷＯ００／０９６６６（米国政府）、ＷＯ２００６／０９７５３７（ノボノルディスク エー／エス）及び欧州特許出願第０８１０１００８．４号（ノボノルディスク エー／エス）に記載されている。

本発明による製薬組成物が例えばペン型注射器または注射器を介して注射によって投与される場合、好ましくは食事前に通常は１日につき３回投与される。より大きな注射体積は患者にとって不快であるので、各投与は約５００μＬ未満または約２００μＬ未満を含むことが好ましい。本発明による製薬組成物がポンプによって投与される場合、通常は連続的に、又は１日につき少なくとも１０回かそれ以上の投与により不連続的に投与される。
本発明の一態様において、治療方法は、３０μＬ／日から約６００μＬ／日の、約６０μＬ／日から約３６０μＬ／日の製薬組成物の有効量の投与を含む。本発明の別の態様において、方法は、皮下注射による投与のための製薬組成物を含む。本発明の他の態様では、方法は、ポンプによる投与のための製薬組成物を含む。本発明の他の態様において、方法は、前記製薬組成物の不連続量を送達するポンプによる投与を含む。本発明の他の態様において、方法は、前記製薬組成物の前記不連続な投与がパルス間の周期より短い周期のパルス投与によりなされる、前記製薬組成物の不連続量を送達するポンプによる投与を含む。

別の態様において、本発明は、非経口投与のためのアミリンペプチドと界面活性剤とを含む製薬組成物の製造のためのアミリンペプチド及びの界面活性剤の使用に関する。本発明の一態様において、使用は、皮下注射によって投与するための製薬組成物を含む。本発明の他の態様において、使用は、ポンプによる投与のための製薬組成物を含む。本発明の他の一実施態様において、使用は、前記製薬組成物の不連続量を送達するポンプによる投与を含む。本発明の他の態様において、使用は、前記製薬組成物の前記不連続な投与がパルス間の周期より短い周期のパルス投与によりなされる、前記製薬組成物の不連続量を送達するポンプによる投与を含む。

別の態様において、本発明は非経口投与による高血糖症の治療のための製薬組成物の製造のためのアミリンペプチド及び界面活性剤の使用であって、組成物がアミリンペプチド及び界面活性剤を含む使用に関する。
別の態様において、本発明は、高血糖症の治療に使用するための、本発明による製薬組成物に関する。別の態様において、本発明は、アミリンペプチドの使用及び過食症または過食の治療のための製薬組成物の製造のための界面活性剤に関する。

（本発明の更なる態様）
１． アミリンペプチド及びアニオン界面活性剤を含む、非経口投与のための可溶性製薬組成物。
２． アニオン界面活性剤がグリセロホスホグリセロール誘導体またはアニオンリン脂質である、態様１に記載の製薬組成物。
３． アニオン界面活性剤がジミリストイル誘導体である、態様１又は２に記載の製薬組成物。
４． アニオン界面活性剤が１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ＤＭＰＧ）である、態様１−３の何れかに記載の製薬組成物。
５． 前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ４．０から約ｐＨ９．０である、態様１−４の何れか一つに記載の製薬組成物。
６． 前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液が約ｐＨ４．５から約ｐＨ８．５である、態様１−５の何れか一つに記載の製薬組成物。
７． 前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ５．０から約ｐＨ８．５である、態様１−６の何れか一つに記載の製薬組成物。
８． 前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ６．０から約ｐＨ８．５である、態様１−７の何れか一つに記載の製薬組成物。
９． 前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ６．５から約ｐＨ８．５である、態様１−８の何れか一つに記載の製薬組成物。
１０． 前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ６．８から約ｐＨ８．０である、態様１−９の何れか一つに記載の製薬組成物。
１１． 前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ７．０から約ｐＨ７．８である、態様１−１０の何れか一つに記載の製薬組成物。
１２． 前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ７．２から約ｐＨ７．６である、態様１−１１の何れか一つに記載の製薬組成物。
１３． 組成物が溶液である、態様１−１２の何れか一つに記載の製薬組成物。
１４． 組成物が固体である、態様１−１２の何れか一つに記載の製薬組成物。
１５． バッファーまたは注射用蒸留水のような水溶液によって再構成されることになっている、態様１４に記載の製薬組成物。
１６． 注射または注入による投与に適している、態様１−１５の何れか一つに記載の製薬組成物。
１７． 前記アミリンペプチドがアミリン、アミリンアナログまたはアミリンアゴニストである、 態様１−１６の何れか一つに記載の製薬組成物。
１８． 前記アミリンペプチドがヒトアミリンである、態様１−１７の何れか一つに記載の製薬組成物。
１９． 前記アミリンペプチドがＰｒｏ２５ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９ ^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリンである、態様１−１７の何れか一つに記載の製薬組成物。
２０． 前記アミリン・ペプチドが位置２４と２６においてメチル化されたヒトアミリンである、態様１−１７の何れか一つに記載の製薬組成物。
２１． 前記アニオン界面活性剤がＤＭＰＧであり、前記アミリンペプチドがＰｒｏ２５ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９ ^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリンである、態様１−１７又は１９の何れか一つに記載の製薬組成物。
２２． 前記アニオン界面活性剤がＤＭＰＧであり、前記アミリンペプチドが位置２４と２６においてメチル化されたヒトアミリンである、態様１−１７又は２０の何れか一つに記載の製薬組成物。
２３． 前記アニオン界面活性剤がＤＭＰＧであり、前記アミリンペプチドがヒトアミリンである、態様１−１８の何れか一つに記載の製薬組成物。
２４． 前記アミリンペプチドの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１ｍｇ／ｍｌから約４ｍｇ／ｍｌ、または約０．４ｍｇ／ｍｌからの約１．２ｍｇ／ｍｌの範囲にある、態様１−２３の何れか一つに記載の製薬組成物。
２５．アニオン界面活性剤の濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌから約４．０ｍｇ／ｍｌ、または約１．０ｍｇ／ｍｌから約４．０ｍｇ／ｍｌ、または約１．３ｍｇ／ｍｌから約３．４ｍｇ／ｍｌの範囲にある、態様１−２４の何れか一つに記載の製薬組成物。
２６． アニオン界面活性剤の濃度が約２．１である、態様１−２５の何れか一つに記載の製薬組成物。
２７． アニオン界面活性剤の濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌから約３．４ｍｇ／ｍｌまで範囲にある、態様１−２５の何れか一つに記載の製薬組成物。
２８． 前記アミリンペプチドの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲にあり、前記アニオン界面活性剤の濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌから約４．０ｍｇ／ｍｌの範囲にある、態様１−２７の何れか一に記載の製薬組成物。
２９． 前記アミリンペプチドの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの範囲にあり、前記アニオン界面活性剤の濃度が約１．０ｍｇ／ｍｌから約４．０ｍｇ／ｍｌの範囲にある、態様１−２７の何れか一に記載の製薬組成物。
３０． 前記アミリンペプチドの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲にあり、前記アニオン界面活性剤の濃度が約１．３ｍｇ／ｍｌから約３．４ｍｇ／ｍｌの範囲にある、態様１−２７の何れか一に記載の製薬組成物。
３１． 前記アミリンペプチドの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲にあり、前記アニオン界面活性剤の濃度が約２．１ｍｇ／ｍｌにある、態様１−２７の何れか一に記載の製薬組成物。
３２． Ｐｒｏ２５ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９ ^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリンの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲にあり、ＤＭＰＧの濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌから約４．０ｍｇ／ｍｌの範囲にある、態様２１に記載の製薬組成物。
３３． Ｐｒｏ２５ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９ ^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリンの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌまで範囲にあり、ＤＭＰＧの濃度が約１．０ｍｇ／ｍｌから約４．０ｍｇ／ｍｌまで範囲にある、態様２１に記載の製薬組成物
３４． Ｐｒｏ２５ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９ ^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリンの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌまで範囲にあり、ＤＭＰＧの濃度が約１．３ｍｇ／ｍｌから約３．４ｍｇ／ｍｌまで範囲にある、態様２１に記載の製薬組成物
３５． Ｐｒｏ２５ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９ ^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリンの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌまで範囲にあり、ＤＭＰＧの濃度が約２．１である、態様２１に記載の製薬組成物。
３６． Ｐｒｏ２５ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９ ^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリンの濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌから約４ｍｇ／ｍｌまで範囲にあり、ＤＭＰＧの濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌから約３．４ｍｇ／ｍｌまで範囲にある、態様２１に記載の製薬組成物。
３７． 前記製薬組成物が防腐剤を含む、態様１−３６の何れか一つに記載の製薬組成物。
３８． 前記防腐剤がそれについてフェノール、ｍ−クレゾールまたはその混合物からなる群から選択される、態様１−３７の何れか一つに記載の製薬組成物。
３９． 前記製薬組成物がバッファーを含む、態様１−３８の何れか一つに記載の製薬組成物。
４０． 前記バッファーは、ホスフェート、ＴＲＩＳ、ＢＩＣＩＮＥ、及びＨＥＰＥＳのようなグッドバッファー、グリシン、グリシルグリシン、シトレートまたはそれらの混合物からなる群から選択される、態様３９に記載の製薬組成物。
４１． 前記バッファーがＴＲＩＳ、ＢＩＣＩＮＥ及びＨＥＰＥＳ、グリシン、グリシルグリシンまたはその混合物から選択される、態様４０に記載の製薬組成物。
４２． 前記製薬組成物が等張性剤を含む、態様１−４１の何れか一つに記載の製薬組成物。
４３． 前記等張性剤が塩でない、態様４２に記載の製薬組成物。
４４． 前記等張性剤がトレハロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、プロピレングリコールまたはそれらの混合物からなる群から選択される、態様４２に記載の製薬組成物。
４５． 前記製薬組成物が安定剤を含む、態様１−４４の何れか一つに記載の製薬組成物。
４６． 前記安定剤がＬ−ヒスチジン、イミダゾール及びＬ−アルギニンからなる群から選択される、態様４５に記載の製薬組成物。
４７． 前記安定剤がポリエチレングリコールである、態様４５に記載の製薬組成物。
４８． 更なる界面活性剤を含む、態様１−４７の何れか一つに記載の製薬組成物。
４９． 前記更なる界面活性剤が、アニオン界面活性剤、非イオン性活性剤、双性イオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、ポロキサマー及びアルキル−ポリグルコシドから成る群から選択される、態様４８に記載の製薬組成物。
５０． 前記更なる界面活性剤がポロキサマーである、態様４９又は５０に記載の製薬組成物。
５１． 前記更なる界面活性剤がポロキサマー１８８である、態様４９又は５０に記載の製薬組成物。
５２． 前記更なる界面活性剤がポロキサマー４０７、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１及びポロキサマー３３８からなる群から選択される、態様４９に記載の製薬組成物。
５３． 前記更なる界面活性剤がポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）である、態様４９に記載の製薬組成物。
５４． 前記更なる界面活性剤がポリソルベート８０である、態様４９に記載の製薬組成物。
５５． 前記更なる界面活性剤がＳｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５である、態様４９に記載の製薬組成物。
５６． 前記更なる界面活性剤がｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシナートである、態様４９に記載の製薬組成物。
５７． 前記更なる界面活性剤がテトラデシル−β−Ｄ−マルトシデまたはｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシデである、態様４９に記載の製薬組成物。
５８． 前記更なる界面活性剤の濃度が約５ｍｇ／ｌから約５０ｇ／ｌである、態様４８−５７の何れか一つに記載の製薬組成物。
５９． 前記更なる界面活性剤の濃度が約５０ｍｇ／ｌから約２００ｍｇ／ｌである、態様４８−５８の何れか一つに記載の製薬組成物。
６０． 態様１−５９の何れかに記載の製薬組成物の有効量の非経口投与を含む、高血糖症の治療方法。
６１． 製薬組成物の前記有効量が、約３０μＬ／日から約６００μＬ／日、約６０μＬ／日から約３６０μＬ／日である、態様６０に記載の方法。
６２． 投与が皮下注射によってである、態様６０−６１の何れか一つに記載の方法。
６３． 投与がポンプによってである、態様６０−６２の何られ一つに記載の方法。
６４． 投与が前記製薬組成物の不連続量を分配するポンプによってである、態様６０−６３の何れか一つに記載の方法。
６５． 前記製薬組成物の前記不連続投与がパルス間の周期より短い時間の周期のパルス投与によってである、態様６４に記載の方法。
６６． 医薬として使用するための態様１−５９の何れか一つに記載の製薬組成物。
６７． 皮下注射用医薬として使用するための態様６６に記載の製薬組成物。
６８． ポンプによる投与用医薬として使用するための態様６６に記載の製薬組成物。
６９． 前記製薬組成物の不連続量を分配するポンプによる投与のための医薬として使用するための態様６６または６８に記載の製薬組成物。
７０． パルス間の時間の周期より短い時間の周期のパルス投与による前記医薬の不連続投与のための医薬としての使用するのための態様６６に記載の製薬組成物。
７１． 高血糖症の治療における医薬として使用するための態様６６に記載の製薬組成物。
７２． 過食症または過食の治療における医薬として使用するための態様６６に記載の製薬組成物。

（アッセイ）
ルシフェラーゼアッセイ（Ｉ）
１． アミリンアッセイ概略
アミリンによるアミリン受容体（カルシトニン受容体の共発現及びペプチドＲＡＭＰｓを修飾する受容体活性）の活性化がｃＡＭＰの細胞内濃度の増加につながることは、以前発行されている(Poyner DR等2002,Pharmacological Reviews54(2)233-246)。結果的に、転写は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の多重コピーを含むプロモーターで活性化される。したがって、アミリン受容体も発現するＢＨＫ細胞に導入されたＣＲＥルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いてアミリン活性を測定可能である。
２． アミリン３（ａ）／ＣＲＥ−ｌｕｃ細胞株の構築
ＢＨＫ５７０細胞株はヒトカルシトニン受容体（ＣＴａ）とＣＲＥ応答ルシフェラーゼレポーター遺伝子によって安定にトランスフェクトされた。細胞株は、標準方法を用いてＲＡＭＰ−３によって更にトランスフェクトした。これは、カルシトニン受容体をアミリン３（ａ）受容体に変える。メトトレキサート、ネオマイシン及びハイグロマイシンは、それぞれルシフェラーゼ、カルシトニン受容体及びＲＡＭＰ−３のための選択マーカーである。
３． アミリンルシフェラーゼアッセイ
活性アッセイを行うために、ＢＨＫアミリン３（ａ）／／ＣＲＥ−ｌｕｃ細胞は、約２０，０００の細胞／ウェルの密度で、白い９６ウェル培養プレートにまかれた。細胞は、１００μｌの増殖培地（１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１ｍＭのＮａ−ピルベート、２５０ｎＭのメトトレキサート、５００μｇ／ｍｌのネオマイシン、及び４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを有するＤＭＥＭ）中であった。オーバーナイトで３７℃及び５％のＣＯ_２のインキュベーション後、増殖培地は、５０μｌ／ウェル分析培地（ＤＭＥＭ（フェノールレッドなし）、Ｇｌｕｍａｍａｘ^ＴＭ、１０％のＦＢＳ及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）と交換された。更に、５０μｌ／ウェルのアッセイバッファー溶液中の標準又は試料のを加えた。３７℃及び５％のＣＯ_２における４時間のインキュベーション後、標準または試料を有するアッセイ培地は取り除かれて、１００μｌ／ウェルのＰＢＳと交換された。更に、１００μｌ／ウェルのＬｕｃＬｉｔｅ^ＴＭを加えた。プレートはシールされて、３０分間の室温でインキュベートした。最後に、発光は、ＳＰＣ（単光子計数）方法によりＴｏｐＣｏｕｎｔｅｒ（パッカード）で測定された。

（アッセイ（ＩＩ） タンパク質製剤の物理的安定性の評価のためのＴｈＴフィブリル化アッセイの一般的説明）
ペプチドの低い物理的安定性はアミロイド繊維形成につながる可能性があり、それは規則正しい糸状の高分子構造として試料中に観察され、最終的にゲル形成に結果としてなる。これは伝統的に試料の外観検査により測定された。しかしながら、このような測定は非常に主観的であり、観察者次第である。従って、小分子インジケータープローブの適用は、はるかに有利である。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）はこのようなプローブであり、フィブリルと結合した場合、異なった蛍光シグネチャーを有する[Naiki等(1989)Anal.Biochem.177,244-249;LeVine(1999)Methods.Enzymol.309,274-284]。

フィブリル形成の経時変化は、次の式によりＳ字曲線によって記載することができる[Nielsen等．(2001)Biochemistry40,6036-6046]：
式１

式中、Ｆは時間ｔのＴｈＴ蛍光である。定数ｔ_０は５０％の最大蛍光に到達するために必要な時間である。フィブリル形成を記載する２つの重要なパラメータは、ｔ_０−２τにより計算される遅延時間と見かけの速度定数ｋ_ａｐｐ＝１／τである。

ペプチドの部分的に折り畳まれた中間体の形成は、フィブリル化のための一般的な始まりの機構として示唆される。それら中間体の少数がテンプレートを形成する核となり、その上に更に中間体が集まり、フィブリル化が進む。遅延時間は核の臨界量が構築される間隔に相当し、見かけの速度定数がフィブリル自体が形成される速度である

（試料調整）
試料は、各アッセイの前に新しく調製された。各試料組成は、各実施例に記載する。試料のｐＨは、濃縮ＮａＯＨとＨＣｌＯ_４またはＨＣｌの適切な量を使用して所望の値に調整した。チオフラビンＴは、Ｈ_２Ｏのストック液から最終濃度１μＭまで試料に加えられた。
２００μｌの試料アリコートは、９６ウェルのマイクロタイタープレート（パッカードＯｐｔｉＰｌａｔｅ^ＴＭ−９６、白ポリスチレン）にに配置された。通常、各試料の４又は８の複製（１テスト条件状態に相当する）は、ウェルの１カラムに配置された。
プレートは、Ｓｃｏｔｃｈ Ｐａｄ（Ｑｉａｇｅｎ）によってシールした。

（インキュベーション及び蛍光測定）
所与温度でのインキュベート、振盪及びＴｈＴ蛍光放出の測定は、Fluoroskan Ascent FL蛍光プレートリーダー又はVarioskanプレートリーダー(Thermo Labsystems)で行われた。温度は３７℃に調整した。全ての示されたデータにおいて、軌道振盪は１ｍｍの振幅を有する９６０ｒｐｍ／分に調整した。蛍光測定は、４４４ｎｍのフィルターを介した励起を使用して、４８５ｎｍのフィルターを介した放出の測定により実施された。
各ランは、１０分間、アッセイ温度でプレートを暖めることによって開始した。プレートは、所望の一定期間２０分ごとに測定された。各測定の間に、記載のとおりプレートは振盪され、加熱された。

（データ処理）
測定ポイントは更なる処理のためにマイクロソフトＥｘｃｅｌ形式で保存され、曲線描画及びフィッテイングはGraphPadPrismを使用して行われた。フィブリルの非存在下においてＴｈＴからのバックグラウンド放出は無視できるものだった。データポイントは通常４又は８試料の平均であり、標準偏差エラーバーと共に示される。同じ実験（すなわち同じプレート上の試料）において得られたデータだけを同じグラフに示し、実験間のフィブリル化の相対的測定を確実にする。
データセットは、式（１）に合わせることができる。しかしながら、この場合に完全なＳ字曲線が測定時間の間に必ずしも得られなかったので、フィブリル化の程度は試料の平均を表にしたＴｈＴ蛍光として示され、さまざまな時点で標準偏差によって示される。

（初期及び最後の濃度測定）
各試験製剤のペプチド濃度は、ＴｈＴフィブリル化アッセイ適用前（「初期」）及びＴｈＴフィブリル化完了後（「ＴｈＴアッセイ後」）に測定された。濃度はプラムリンチド標準をリファレンスとして使用して逆相ＨＰＬＣ方法によって測定された。完了後の測定前に、各複製から１５０μｌが収集されて、エッペンドルフチューブへ移された。これらは、４０分間、３００００Ｇで遠心分離された。上澄みは、ＨＰＬＣシステムに適用する前に、０．２２μｍのフィルターによってろ過された。

ＴｈＴフィブリル化アッセイを使用して評価した、市販のシムリン（登録商標）製剤に類似したプラムリンチド製剤の物理的安定性。図は、時間の関数としてＴｈＴ蛍光を示す。 ＴｈＴフィブリル化アッセイを使用して評価した、異なるプラムリンチド製剤の物理的安定性。図は、時間の関数としてＴｈＴ蛍光を示す。 図３は異なるプラムリンチド製剤のプラムリンチドの初期濃度、及び濃度はＴｈＴアッセイの完了後の溶液に残った濃度を示す。

実施例１
市販のシムリン（登録商標）製剤に類似したプラムリンチド製剤の物理的安定性は、図１に示すようにＴｈＴフィブリル化アッセイを使用して評価された。製剤Ａは１５０μＭのプラムリンチド、４．５ｍＭの酢酸ナトリウム、２５．５ｍＭの酢酸、２３６ｍＭのマンニトール、２０ｍＭのｍ−クレゾールから成り、ｐＨ４．０に調整した。適用された条件下で、ＴｈＴ蛍光シグナルが現れなかった時、製剤はフィブリル化に対し不活性だった。

実施例２
生理学的ｐＨでプラムリンチドを調製することは、物理的に不安定な製剤に結果としてなった。これは、図２に図示したように、ＴｈＴフィブリル化アッセイを使用して示された。４製剤の特定の時点のＴｈＴ蛍光を下に示す：

製剤Ｂは、１００μＭのプラムリンチド、１７４ｍＭのグリセロール、３０ｍＭのフェノール、８ｍＭのグリシルグリシンｐＨ７．４から成る。この製剤は、ほぼ即座にフィブリル化を始めた。１．０ｍＭのＤＭＰＧの製剤Ｂへの添加により安定性が改良され、約５時間の遅延時間後にフィブリル化が開始した。製剤Ｂにおいて３．０ｍＭまでＤＭＰＧ濃度を増加させることによりフィブリル化に対し不活性な製剤に結果としてなり、ＴｈＴ蛍光シグナルが測定時間の間に現れなかった。５．０ｍＭまでＤＭＰＧを添加された製剤Ｂは約２２時間の遅延時間後、わずかなＴｈＴ蛍光を呈した。それはＤＭＰＧ無しの製剤Ｂよりかなり長かった。

実施例３
初期濃度及びＴｈＴフィブリル化アッセイ完了後のペプチド濃度を、上の「初期及び最後の濃度測定」で述べた通りに測定した。これは、実施例１に記載した製剤Ａ及び実施例２に記載したＤＭＰＧの有無の４つの製剤Ｂのためにされた。結果を、図３にグラフで示し、更に下に表で示す：

製剤Ａのプラムリンチドの９３％以上は、このアッセイの間、作用する苛酷なストレス条件にもかかわらず、ＴｈＴアッセイ完了後に回復した。それゆえに、ＴｈＴ蛍光の遅延は、吸着または沈殿または他の手段によってペプチドの減失よりむしろ安定プラムリンチド製剤と一致した。
ＤＭＰＧ無しの製剤Ｂにおいて、全プラムリンチドは、ＴｈＴアッセイの間に失われた。製剤ＢにＤＭＰＧを１ｍＭに加えることは、ＴｈＴフィブリル化アッセイ後に初期プラムリンチドの約４０％の回復に結果としてなった。製剤Ｂにおいて３．０ｍＭまでＤＭＰＧ濃度を増加させることはアッセイ後にプラムリンチドの約１００％の回復に結果としてなり、これはＴｈＴ蛍光の遅延が他の手段（例えば吸着または沈殿）によるペプチド減失のためでなかったことを示している。ＤＭＰＧを５．０ｍＭまで添加した製剤Ｂにおいて、約１００％のプラムリンチドは、非常に小さいＴｈＴシグナルにもかかわらず、アッセイの後で回復した。

Claims (12)

1. アミリンペプチド及びアニオン界面活性剤を含む、非経口投与のための可溶性製薬組成物。
2. アニオン界面活性剤がアニオンリン脂質である、請求項１に記載の製薬組成物。
3. アニオン界面活性剤が１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ＤＭＰＧ）である、請求項１又は２に記載の製薬組成物。
4. 前記製薬組成物または前記製薬組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ４．０から約ｐＨ９．０である、請求項１から３の何れか一項に記載の製薬組成物。
5. 組成物が溶液である、請求項１から４の何れか一項に記載の製薬組成物。
6. 前記アミリンペプチドがヒトアミリン、Ｐｒｏ２５ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９−ｈ−アミリン又は位置２４と２６においてメチル化されたヒトアミリンである、請求項１から５の何れか一項に記載の製薬組成物。
7. 前記アミリンペプチドの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．１ｍｇ／ｍＬから約４ｍｇ／ｍＬ、または約０．４ｍｇ／ｍＬから約１．２ｍｇ／ｍＬの範囲である、請求項１から６の何れか一項に記載の製薬組成物。
8. アニオン界面活性剤の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬ、または約１．０ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬ、または約１．３ｍｇ／ｍＬから約３．４ｍｇ／ｍＬの範囲にある、請求項１から７の何れか一項に記載の製薬組成物。
9. 前記アニオン界面活性剤がＤＭＰＧであり、前記アミリンペプチドがＰｒｏ２５ Ｐｒｏ２８ Ｐｒｏ２９−ｈ−アミリンである、請求項１から８の何れか一項に記載の製薬組成物。
10. 請求項１から９の何れか一項に定義の製薬組成物の有効量の非経口投与を含む、高血糖症の治療方法。
11. 医薬として使用するための、請求項１から９の何れか一項に記載の製薬組成物。
12. 高血糖症の治療において医薬として使用するための、請求項１０に記載の製薬組成物。

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