JP2008122297A - 蛍光検出装置および蛍光検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】簡単な構成で、任意の種類の蛍光標識剤で標識された複数の被測定スポットを効率的に蛍光検出する構成を提供する。
【解決手段】蛍光検出装置は、蛍光標識された試料を含む被測定スポット（１４）を搭載する基板（１３）と、前記被測定スポットに励起光を照射する励起光照射用光ファイバ（１１）と、前記被測定スポットからの蛍光を検出する蛍光検出用光ファイバと（２１）、前記基板上の被測定スポットを前記励起光照射用光ファイバ側から前記蛍光検出用光ファイバ側へ相対移動（Ｖ）させる移動メカニズムとを備える。
【選択図】図５

Description

本発明は、励起光によって蛍光を発生する被測定物、例えば、蛍光罪を標識された微小試料、ＤＮＡマイクロアレイチップ、プロテインチップなどからの微弱蛍光を検出する蛍光検出装置と蛍光検出方法に関する。

蛍光標識された微小試料からの蛍光検出では、励起光を試料に照射し、発生する蛍光強度を検出するが、用いる蛍光剤の種類によって、検出方法も異なる。

励起光の消失と同時に蛍光も消失してしまう、遅延蛍光の少ない標識剤を使用する場合は、励起光の照射と同時に蛍光を検出する。この場合、励起光と蛍光のわずかな波長の違いを利用して、蛍光のみを光学フィルタで分離検出する方法や、励起光が蛍光検出領域に入らない構成を採用して、空間的に分離検出する方法などが知られている。

一方、励起光を遮断しても蛍光がしばらく発生（遅延蛍光）している蛍光剤を利用した場合は、励起光を遮断した後に蛍光標識剤から発生する遅延蛍光のみを検出する、いわゆる時間分解蛍光検出法が知られている。時間分析蛍光検出法で用いられる標識剤としては、ユーロビューム（Ｅｕ）、テルビュム（Ｔｂ）など希土類元素を配合したものがある。たとえば、ユーロビュームを配合したＤＴＢＴＡ−Ｅｕ3+は、蛍光スペクトルの極大値が波長４５０ｎｍ以上にあり、図１（ａ）に示すように、励起光パルス照射後、１ミリ秒〜数ミリ秒の間蛍光が発生し続ける。

前者の方法と後者の方法の違いは、励起光の照射と同時に蛍光を検出するか、励起光の照射後、時間差をつけて蛍光を検出するかの違いである。

たとえば、図１（ｂ）のように、励起パルス照射の後に１ミリ秒程度の遅延発光が続く標識剤を用いるとする。励起パルス照射中から蛍光を検出すると、点線で示すバックグラウンド蛍光も検出されてしまい、検出精度が劣化する。バックグラウンド蛍光は、標識剤以外の部分からの光であり、蛍光波長と同じ波長を有する蛍光成分である。

そこで、バックグラウンド蛍光が完全に消える時間Ｔｄを、検出遅延時間Ｔｄとして設定し、たとえば、Ｔｄ＝０．１２ｍｓｅｃあたりから蛍光を検出すれば、純粋に標識剤だけからの蛍光を検出することができる。この場合、次のレーザパルス照射の少し手前に至るまでの時間Ｔｇｗを、蛍光検出時間とする。その結果、Ｓ／Ｎ比の良い高感度計測が実現できる。

蛍光検出結果に基づいて試料を分析する場合、与えられた試料は、遅延蛍光がほとんどない標識剤で標識されている場合もあれば、遅延蛍光を発する標識剤が付されている場合もある。その都度、用いられている標識剤の種類に応じて異なる蛍光検出装置にかけるのは煩雑である。

時間分解蛍光検出のみを行う検出装置として、回転円板を用いたもの（たとえば、特許文献１参照）や、フロータイプのもの（たとえば、特許文献２参照）が知られている。

図２に、特許文献１の円板型の時間分解蛍光検出装置の構成例を示す。回転円板１１２上に、試料スポット１１１が放射状に配置されたバイオチップ１１０が搭載されている。各試料スポット１１１には、遅延蛍光のでる標識剤が付けられている。この装置は、ＣＷレーザ１２０と、互いに独立して配置される励起光照射光学系１３０および蛍光検出光学系１４０を有する。図２（ａ）に示すように、時間ｔ１において、ＣＷレーザ１２０で励起されたビームは、励起光照射光学系１３０により、試料スポット１１１ａに照射される。円板１１２は、矢印Ｒの方向に回転し、図２（ｂ）に示すように、時間ｔ２において、試料スポット１１１ａからの遅延蛍光が、蛍光検出光学系１４０で検出される。

この構成では、レーザによる照射位置と、蛍光検出位置の間隔が広いため、円板１１２の回転数を非常に速くしないと遅延蛍光検出が実現できない。また、遅延蛍光がでない標識剤を用いたサンプルには適用できない。

図３は、特許文献２のフロー型の時間分解蛍光検出装置の構成例を示す。液状のサンプル１５５は、流露に沿って移動する。サンプル１５５は、上流側でレーザ１５２により励起され、下流側で遅延蛍光が測定器１５１により測定される。この装置も、遅延蛍光のでない標識剤には適用できない。

一方、図４に示すように、遅延蛍光のでる標識剤にも、蛍光遅延のでない標識剤にも適用可能な蛍光画像読み取り装置が提案されている（たとえば、特許文献３参照）。

図４（ａ）に示すように、時間分解検出モードでは、光学ヘッド１８０に入射したレーザ光２００が、凸レンズ１８６を介して画像担体２２２上の励起点２３５に導かれるように、角度調整機構１８３によってミラー１８１の角度が調整され、遅延蛍光性の蛍光画像を読み取る。励起点２３５と距離Ｌ４だけ隔たった検出点２３６で、蛍光色素から放出される蛍光２２５が、凸レンズ１８７によって集光され、穴あきミラー１８５で反射されて下流側の光学系（不図示）へ導かれる。

一方、図４（ｂ）に示すように、同時検出モードでは、遅延蛍光のでない蛍光体層に形成された画像を読み取る。この場合は、ミラー１８１は光路から退避し、入射光２００はミラー１８２によって反射され、穴あきミラー１８５の穴１８４を通過し、凸レンズ１８７によって、励起点２３５で蛍光体を励起する。励起と同時に蛍光が放出される。放出された蛍光２２５は、凸レンズ１８７によって平行な光とされ、穴あきミラー１８５で反射されて下流側の光学系（不図示）に導かれる。
特開２０００−３２１２０６号公報 特開２００２−７１５６５号公報 特開２００２−７２３９３号公報

しかし、特許文献３の構成では、ミラー１８１を倒すか起こすかしかできないので、図１（ｂ）に示す検出遅延時間Ｔｄを、ゼロから連続的に変化させて計測の最適条件を探すことはできない。

また、レーザ、対物レンズ（凸レンズ）、反射ミラー、可動ミラーなどを含む光学系を用いているので、装置が大型化、複雑化し、距離Ｌ４を２ｍｍ程度に設定するのは困難である。振動にも弱い。さらに、試料スポットからの蛍光は単色性が無く、コヒーレント光ではないので凸レンズ１８７、反射ミラー１８５で検出しようとすると、検出器への入射効率は非常に低くなり、測定困難となる可能性がある。

そこで、本発明は、簡単な構成で効率的な蛍光検出を可能にする蛍光検出装置を提供することを課題とする。

また、簡単な構成で、同時蛍光検出と時間分解蛍光検出の双方に対応することのできる蛍光検出手法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するために、本発明の実施形態では、励起光の照射と、蛍光検出の双方に光ファイバを採用する。蛍光標識された試料を含む被測定スポットを、励起光照射用の光ファイバと蛍光検出用の光ファイバに対して相対移動させることにより、簡単な構成で効率的な蛍光検出を可能にする。

また、励起光照射用の光ファイバと蛍光検出用の光ファイバの位置関係を調整することによって、あるいは、蛍光検出用の光ファイバの先端形状を所定形状に加工することによって、遅延蛍光のでる標識剤が付された試料（サンプル）に対しても、遅延蛍光のでない通常の標識剤が付された試料（サンプル）に対しても、蛍光検出できる構成とする。

具体的には、本発明の第１の側面では、蛍光検出装置は、
（ａ）蛍光標識された試料を含む被測定スポットを搭載する基板と、
（ｂ）前記被測定スポットに励起光を照射する励起光照射用光ファイバと、
（ｃ）前記被測定スポットからの蛍光を検出する蛍光検出用光ファイバと、
（ｄ）前記基板上の被測定スポットを前記励起光照射用光ファイバ側から前記蛍光検出用光ファイバ側へ相対移動させる移動メカニズムと
を備える。

一例として、励起光照射用光ファイバと、蛍光検出用光ファイバとは、被測定スポットを搭載する基板を挟んで、反対側に位置する構成としてもよいし、前記基板に対して同じ側に位置する構成としてもよい。

良好な構成例として、蛍光検出用光ファイバと被測定スポットとの間の距離は、５０μｍ〜１ｍｍの範囲で設定される。

蛍光検出用光ファイバの位置が励起光照射用光ファイバの位置に対して可変に設定される構成としてもよいし、蛍光検出用光ファイバの先端を所定の形状に加工したうえで、励起光照射用光ファイバと蛍光検出用光ファイバの位置関係を固定的に設定してもよい。

本発明の第２の側面では、蛍光検出方法は、
（ａ）蛍光標識剤で標識した試料を含む被測定スポットを、励起光照射用の光ファイバで励起するステップと、
（ｂ）前記励起によるバックグランド蛍光が消失する時間Ｔｄ後に、蛍光検出用の光ファイバを用いて前記蛍光標識剤からの蛍光を検出するステップと
を含む。

簡単な構成で、多数の被測定スポットを効率的に蛍光測定することができる。

また、遅延蛍光のでる標識剤で標識されている試料の測定にも、遅延蛍光のでない一般的な標識剤で標識されている試料測定にも、容易に対応できる。

図５は、本発明の第１実施形態の蛍光検出装置の基本構成を説明するための図である。蛍光検出装置は、蛍光標識された試料（サンプル）を含む被測定スポット１４を搭載する基板１３と、被測定スポット１４に励起光を照射する励起光照射用の光ファイバ（以下、単に「励起光ファイバ」と称する）１１と、励起光の照射により被測定スポット１４から放射される蛍光を検出する蛍光検出用の光ファイバ（以下、単に「蛍光検出ファイバ」と称する）２１を含み、被測定スポット１４が励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１に対して、相対的に移動する構成となっている。

図５の例では、被測定スポット１４を搭載する基板１３が矢印の方向に速度Ｖで移動する。基板１３は透過性の基板であり、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１は、基板１３を挟んで反対側に位置する。

被測定スポット１４に含まれる試料が、遅延蛍光を発生させる標識剤で標識されている場合、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１は、被測定スポット１４の相対移動方向に沿って、所定の距離Ｌｆだけ離れて設置される。距離Ｌｆは、被測定スポット１４が励起光ファイバ１１で励起された後、蛍光検出ファイバ２１の真下に移動してきたときにバックグランド蛍光が消失して標識剤からの遅延蛍光のみを発生しているように、決定される。

一方、遅延蛍光の少ない、あるいはほとんどない標識剤を用いたサンプルを測定する場合は、蛍光検出ファイバ２１が励起光ファイバ１１と対向するように、すなわちＬｆ＝０となるように、位置設定される。これにより、時間分解蛍光検出と同時検出の双方に容易に対応することができる。

光ファイバ間距離Ｌｆは、励起光ファイバ１１と蛍光検出用光ファイバ２１の中心間距離である。Ｄｅは励起光ファイバ１１の直径、Ｄｄは蛍光検出用ファイバ２１のコア径、Ｌｓは基板１３に配置される被測定スポット１４の直径、Ｓｓはスポット間隔、Ｓｅは蛍光検出ファイバ２１と被測定スポット１４との距離、Ｖは被測定スポット１４と励起光ファイバ１１および蛍光検出用ファイバ２１との相対的移動速度である。

図５のように、被測定スポット１４を搭載する基板１３を移動する場合は、Ｖは基板１３の移動速度となる。もちろん、基板１３を移動する代わりに、あるいは基板１３の移動と同時に、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１を一体にして移動させてもよい。

励起光ファイバ１１の直径Ｄｅと、蛍光検出ファイバ２１の直径Ｄｄは、１００ミクロンから１０００ミクロンの範囲で適切に選択される。光ファイバ間の距離Ｌｆは、ゼロから数十ｍｍまで任意に設定できるので、検出遅延時間Ｔｄ（図１（ｂ）参照）もゼロから任意の値まで連続的に可変設定できる。これは、遅延蛍光検出の際に、遅延検出開始時点の最適化を容易に行えることを意味する。

なお、光ファイバ間距離Ｌｆは、基板１３と光ファイバとの相対移動速度Ｖと検出遅延時間（すなわち励起光照射開始時間と蛍光検出開始時間との差）Ｔｄとにより、
Ｌｆ＝Ｖ＊Ｔｄ
と表される。

励起光ファイバ１１の先端は、レンズ作用を持たせるように加工が可能であり、励起光照射領域を、励起光波長の数十倍程度に絞り込むことができる。これにより、分解能を十分上げることができる。

蛍光検出ファイバ２１は、所定の領域からの光のみが入射されるように、そのコア径、端面形状を容易に設計、変更することができる。光ファイバを用いるので、被測定スポット１４との間の距離Ｓｅを十分小さくでき、被測定スポット１４からの蛍光のほとんどを蛍光検出ファイバ２１に入射させることができる。Ｓｅは５０μｍ〜１mmの範囲で任意に設定される。たとえば、Ｓｅを１００μm程度に設定すると、図５に示すように蛍光検出領域Ａが限定され、被測定スポット１４が蛍光検出領域Ａに入らないかぎり蛍光が検出されない。従って、当該被測定スポットの蛍光検出時に、次のスポット１４が励起光ファイバ１１によって励起されていたとしても、蛍光検出ファイバ２１の直下にある被測定スポット１４だけからの蛍光が検出される。

蛍光検出領域Ａには被測定スポット１４が１個入るようにする。この領域に同時に２個以上の被測定スポット１４が入らないように、蛍光検出用ファイバ２１のコア径、入射端面形状が設計されている。

励起光パワー、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１の配置、用いる光ファイバの本数等を最適に選択することで、検出感度は向上する。

図５の構成では、遅延蛍光特性のある標識剤のみならず、従来の遅延蛍光の小さい標識剤が用いられている場合でも、光ファイバ間距離Ｌｆを変えることによって、容易に被測定スポット１４からの蛍光を検出することができる。

すなわち、遅延蛍光の少ない（あるいはほとんどない）標識剤が被測定スポットに用いられている場合は、Ｌｆをゼロに近づけ、蛍光検出ファイバ２１を、励起光ファイバ１１と基板１３を挟んで、ほぼ同位置に配置するだけでよい。

レンズ系により光を空間伝播させる構成でなく、光を導波できる光ファイバを基本構成に取り入れることで、時間分解蛍光検出と、通常の（同時）蛍光検出が可能な簡便な装置が実現できる。

図６は、図５の基本構成を採用した蛍光検出装置１の概略構成図である。蛍光検出装置１は、励起光源として連続発振レーザ光源（ＣＷ）１０と、これに接続される励起光ファイバとしてＵＶ光ファイバ１１と、光検出器２０と、これに接続される蛍光検出ファイバ２１と、被測定スポット１４を搭載する基板１３を支持する円形の移動回転ステージ１２を含む。光検出器２０は、たとえば光電子増倍管（ＰＭＴ）である。光検出器２０で検出された結果（蛍光強度情報）は、伝送線４２を介してＰＣ４０に入力され、分析、処理される。蛍光強度信号の伝送は必ずしも有線である必要はなく、無線通信であってもよい。

蛍光検出装置１はまた、移動回転ステージ自体の移動を制御するステージコントローラ３０を含む。ステージコントローラ３０は、伝送線４２および接続インタフェース４１を介してＰＣ４０と接続されており、ＰＣ４０からステージコントローラ３０に、ステージコントロール信号および位置情報が入力される。

図６の例では、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１は、移動回転ステージ１２を挟んで、反対側に位置する。遅延蛍光のでる標識剤が用いられる被測定サンプルを測定する場合は、蛍光検出ファイバ２１は、励起光ファイバ１１から所定の距離Ｌｆだけオフセットして位置し、時間分解検出を可能にする。遅延蛍光の少ない（あるいはほとんどない）通常の標識剤が用いられたサンプルを測定する場合は、蛍光検出ファイバ２１は、励起光ファイバ１１に対応する位置へ移動される。また、継続する遅延蛍光時間に応じて（遅延蛍光標識剤の種類に応じて）、蛍光検出ファイバ２１のオフセット距離、すなわち光ファイバ間距離Ｌｆが適切に設定される。これとともに、またはこれに代えて、移動回転ステージ１２の回転速度が適切に調整される。

移動回転ステージ１２が回転して、基板１３上に搭載される被測定スポット１４を、励起光ファイバ１１および蛍光検出ファイバ２１に対して円周方向に相対移動させるとともに、移動回転ステージ１２それ自体が並行移動することによって、次のスポット列の蛍光検出を行う構成とする。もちろん、移動回転ステージ１２を並行移動させる代わりに、あるいはこれと同時に、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１を一体として、移動回転ステージ１２の中心に向かって移動させる構成としてもよい。

被測定スポット１４は、たとえば、移動回転ステージ１２の中心から３ｃｍから８ｃｍの領域に配置されている。図示の便宜上、単一の基板１３のみが移動回転ステージ上に配置されているが、複数の基板が半径方向に沿って放射状態に並べられていてもよい。被測定スポット１４のスポット径は、たとえば５０ミクロンである。

測定は、励起光ファイバ１１の照射位置にきた被測定スポット１４の位置情報と、当該被測定スポットからの検出蛍光強度とが対応付けられて測定される。この情報に基づき、ＰＣ４０で蛍光画像が再構成される。

この装置では、シャッターなどの機械的構成を用いて光をＯＮ／ＯＦＦするような切り換え制御ではなく、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１の位置関係を調整するだけで、容易に時間分解検出と、通常の同時検出とを切り換えることができる。

また、レーザ光源１０は連続発振（ＣＷ）レーザでよく、パルス化する必要がない。光検出器２０には検出時間制御の機構や機能は必要なく、連続的に蛍光を検出して電気信号として、ＰＣ４０に送り込めばよい。ただし、位置情報と蛍光強度を１対１に対応付けるための同期信号を、移動回転ステージ１２側か検出器２０側で発生させる必要がある。また、ＰＣ４０ではデジタル信号を扱うので、Ａ／Ｄ変換をＰＣ４０の接続インタフェース４１で行う。

図７は、移動回転ステージ１２の中心から半径５ｃｍのところに置かれた被測定スポット１４が、Ｌｆ＝２ｍｍの距離を移動するのに必要な時間ｔｆ（ｋ）［msec］および移動速度Ｖ（ｋ）［m/sec］と、移動回転ステージ１２の回転数ｋ（ｒｐｍ）との関係を示すグラフである。

検出遅延時間Ｔｄ＝０．１ｍｓｅｃとすると、ｔｆ（ｋ）［msec］も０．１ｍｓｅｃとなり、移動回転ステージ１２の回転数ｋは毎分４０００回転となる。その時の被測定スポット（サンプル）１４の相対移動速度V（ｋ）は、２０ｍ／ｓｅｃである。蛍光検出ファイバ２１のコア径を５０μmとするなら、検出される蛍光光パルスの時間幅は２．５μｓｅｃ程度になる。

なお、回転半径をａ［ｍ］（図７の例では、ａ＝０．０５）、回転周期をＴ（ｋ）［sec］とすると、
Ｔ（ｋ）＝６０／ｋ
Ｖ（ｋ）＝２πａ／Ｔ（ｋ）
となる。被測定スポット（サンプル）１４が距離Ｌｆを移動する時間ｔｆ（ｋ）［sec］は
ｔｆ（ｋ）＝Ｌｆ／Ｖ（ｋ）
である。ここで、光ファイバ間距離Ｌｆ［ｍ］は０．００２である。

図８は、被測定スポット１４の相対移動速度Ｖ（ｋ）を２０ｍ／ｓｅｃとして、光ファイバ間距離Ｌｆ［ｍ］と、移動時間ｔｆ［μsec］の関係を示すグラフである。光ファイバ間距離Lｆは、０から１０mm程度まで連続的に設定できるので、検出遅延時間Ｔｄに相当する被測定スポット１４の移動時間ｔｆは、０から５００μｓｅｃ程度あるいはそれ以上の範囲で変化させることができる。一方、蛍光検出時間Ｔgw（図１（ｂ）参照）は、蛍光検出ファイバ２１のコア径、先端部形状、被測定スポット１４の相対移動速度Ｖ（ｋ）によって決定される。

図９は、本発明の第２実施形態に係る蛍光検出装置の基本構成を示す図である。この構成は、基板１３が励起光に対して透過性を有しない場合などに有効である。

蛍光検出ファイバ２１の先端は、斜めに研磨されており、蛍光検出領域が、励起光の照射スポットをカバーする。これにより、被測定スポット１４へ励起光を照射した直後から蛍光を検出できる（検出遅延時間Ｔｄを実質的にゼロに設定できる）ので、遅延蛍光のでない通常の標識剤を用いたサンプルにも対応できる。また、Ｌｆを大きくすることで、所定の遅延時間Ｔｄを設定できるので、遅延蛍光の出る標識剤での最適化も可能である。図９のように、蛍光検出領域に励起光の照射スポットが入ってくる構成でも、励起光照射直後の遅延蛍光を検出するので、バックグランド蛍光を拾ってしまうが、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１の位置関係を変えることなく、通常の蛍光標識剤と遅延蛍光を有する標識剤の双方に対応できるというメリットがある。

図１０は、本発明の第３実施形態に係る蛍光検出装置の基本構成を示す図である。第３実施形態では、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１を、基板１３に対して同じ側に配置し、基板１３は透過性の基板として、基板１３を透過した光を凹面ミラー３１、３２によって、再度、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１に戻す構成である。透過光を励起光照射スポットや蛍光検出領域Ａに戻すことにより、励起光強度と、蛍光検出効率の双方を改善できる。

もっとも、用いるレーザ光源１０の強度によっては、凹面ミラー３１と３２のいずれか一方のみを使用する構成としてもよい。

この構成では、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１を可能な限り近づけても、Ｔｄ＝０ｍｓｅｃにはならない。たとえば励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１の双方に、半径１２５μmの光ファイバを用いると、Ｌｆ＝２５０μｍとなる。被測定スポット１４の相対移動速度Ｖ＝２０ｍ／ｓｅｃとすると、最小検出遅延時間Ｔｄ＝１２．５μｓｅｃとなり、ゼロにすることはできない。しかし、遅延蛍光が小さい（あるいはほとんどない）通常の標識剤でも、数十マイクロ秒程度の遅延蛍光特性はあるので、正確にＴｄがゼロにならなくても、光ファイバ径を小さくすることで、一般的な蛍光色素であるＣｙ3やＣｙ5を用いても蛍光測定が可能である。

なお、凹面ミラーを用いない場合は、Ｌｆをより短くできることは上述したとおりである。すなわち、図５に示すように、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１を、基板１３を挟んで反対側に配置する場合はＬｆ＝０に設定でき、図９に示すように、蛍光検出ファイバ２１の先端を斜め研磨した場合は、同じ側に配置してもより光ファイバ同士をより近接させることができる。したがって、遅延蛍光のほとんどない標識剤を用いたサンプルを測定する場合は、励起光ファイバ１１の半径をＲ１、蛍光検出ファイバの半径をＲ２としたときに、Ｌｆを
０≦Ｌｆ≦Ｒ１＋Ｒ２
の範囲に設定して同時検出することが可能である。

図１１は、本発明の第４実施形態の蛍光検出装置の基本構成図である。第４実施形態では、基板１３の両側に、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１の組を配置する。この場合、励起光源１０（図６参照）も２つ用いる。検出器２０も２つ用いてもよいが、基板１３の両側で生じる蛍光を途中で合波して、強度検出してもよい。

図１２は、本発明の第５実施形態の蛍光検出装置の基本構成図である。第５実施形態では、励起光ファイバ１１の両側に蛍光検出ファイバ２１ａ、２１ｂを配置する。この構成では、光ファイバ１１、２１ａ、２１ｂに対して基板１３を左右に相対移動させて蛍光検出する。たとえば、初期位置として、励起光ファイバ１１が、被測定スポット１４を搭載する基板１３の長手方向の中心線上に位置するように光ファイバセットを配置し、基板１３を２５ｍｍ程度の振幅で左右に振動させる。基板１３が図１２の右手側にオシレートするときには、中心線よりも左側の被測定スポットが右側の蛍光検出ファイバ２１ａで蛍光測定され、基板１３が図１２の左側へオシレートするときは、中心線よりも右側の被測定スポットが左側の蛍光検出ファイバ２１ｂで蛍光測定される。基板が相対的に右に移動するときは２１ａのファイバで蛍光が検出され、左に移動するときは２１ｂのファイバで蛍光が検出されるので、２次元配列された測定スポットからの蛍光をより短時間で測定できる。この構成では、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１ａ、２１ｂを、ひとまとめにしてヘッド状にするのが望ましい。

図１３は、図９の構成を図１２に適用したもので、励起光ファイバ１１の両側に配置される蛍光検出ファイバ２１ａ、２１ｂの端部を斜めに研磨したものである。遅延時間Ｔｄを変化させるには励起光ファイバ１１と検出ファイバ２１ａ、２１ｂとの間隔を変化させる必要があるが、この構成は図９と同様に、蛍光検出領域を励起光ファイバ１１の照射領域にまで拡げることができるので、調整遅延蛍光のでる標識剤を用いたサンプルに対する時間分解検出と、遅延蛍光の少ない標識剤を付したサンプルに対する検出の双方に同時に対応することができる。

図１４は、図１３の基本構成を採用した蛍光検出装置の概略構成図である。図１４では移動回転ステージに代えて、並行移動ステージ１６上に、被測定スポット１４を搭載した基板１３を配置する。ステージコントローラ３０の制御に基づいて、並行移動ステージ１６を２５ｍｍ程度の振幅で左右に振動させる。この振動方向を、ステージ移動方向Ｂとする。さらに、励起光ファイバ１１と蛍光検出ファイバ２１ａ、２１ｂの端部をまとめた光ファイバヘッド１９を、ステージ移動方向とは垂直な方向Ｃに、ゆっくりと移動させる。検出器２０において、検出蛍光強度を励起光ファイバ１１の位置と対応付けて測定する。ＰＣ４０は、検出データを画像化する。被測定スポット１４は、基板１３上にマトリックス状に配置される。

異なる種類の光ファイバヘッド１９をあらかじめ用意しておいて、用いられる蛍光標識剤の種類に応じて適宜交換する構成としてもよい。たとえば、図１２の構成で、励起光ファイバ１１と各蛍光検出ファイバ２１との間の距離ＬｆがＬｆ＝Ｖ＊Ｔｄ（Ｖは振動速度、Ｔｄは検出遅延時間）となるように設定したヘッドを、遅延検出（時間分解検出）用に用い、図１３の構成でＬｆをゼロに近づけた状態で光ファイバセットをひとまとめにしたヘッドを、同時検出用に用いることにしてもよい。

なお、図５のように、被測定スポット１４のスポット直径Ｌｓとスポット間隔Ｓｓの和（Ｌｓ＋Ｓｓ）が蛍光検出領域Ａの直径と同程度になるところが、最高のスポット密度になる。 Ｌｓ＋Ｓｓが蛍光検出領域Ａより大きい分には問題ない。

図１４に示す装置構成では、図６の構成と同様に、レーザ光源１０は連続発振（ＣＷ）レーザでよく、パルス化する必要がない。また、光検出器２０には検出時間制御の機構や機能は必要なく、連続的に蛍光を検出して電気信号として、ＰＣ４０に送り込めばよい。ただし、位置情報と蛍光強度を１対１に対応付けるための同期信号を、並行移動ステージ１６側か検出器２０側で発生させる必要がある。また、ＰＣ４０ではデジタル信号を扱うので、Ａ／Ｄ変換をＰＣ４０との接続インタフェース４１で行う。

図１５は、回転円板４２を用いた場合の被測定スポット１４の配置例を示す図である。被測定スポット１４は、同心円上にかつ放射状に配置するのが望ましい。被測定スポット１４は、たとえば石英でできた回転円板４２上に直接スポットしてもよいし、スライドガラス４３上にスポットしたものを、図６のような移動回転ステージ１２上に固定してもよい。スライドガラス４３を用いる場合は、最終的に移動回転ステージ１２上に置かれたときに、同心円かつ放射状になるようなスポット配置とする。

図１６は、図１４のように並行移動ステージ１６を用いた場合の被測定スポット１４の配置例を示す。ステージ上に複数のスライドガラス４３が並べられており、各スライドガラス４３上に、被測定スポット１４がマトリクス状態に並べられている。各スライドガラス４３で、被測定スポット１４は、異なるスポットサイズで、相対移動方向に沿って異なるスポット間隔で配置されていてもよい。被測定スポット１４がどのようなサイズ、間隔で配置されようと、励起光ファイバ１１および蛍光検出ファイバ２１（またはこれらをまとめた光ファイバヘッド１９）に対してステージ１６が左右に相対的移動（オシレート）する間、励起光ファイバ１１による照射から一定時間Ｔｄ後に、蛍光検出ファイバ２１で蛍光検出され得るからである。なお、この場合は、測定される被測定スポット列は、振動方向（測定方向）に沿ってアラインしている必要がある。

図１７は、光ファイバ端部の加工例を示す図である。励起光ファイバ１１の端部の形状は、励起光の集光と励起光照射領域の形成に影響し、蛍光検出ファイバ２１の端部の形状は、蛍光検出領域の形成に影響する。

図１７（ａ）では、光ファイバの先端を直接球面加工またはテーパ先球加工したものである。図１７（ｂ）では、光ファイバの先端に、マイクロレンズ、非球面レンズ、ロッドレンズなどを装着したものである。図１７（ｃ）は、ファイバ素線の端部表面を金属コートしたものである。この場合、光ファイバの最端部のみを金属コートなしに露出させておく構成、あるいは、光ファイバの最端部が金属コートの端部外周よりも引っ込んだ構成にしてもよい。さらにこれらの構成と、ファイバ端面を凹面、凸面などに加工する構成とを組み合わせてもよい。

以上述べたように、本発明の蛍光検出装置によれば、励起光ファイバと蛍光検出ファイバの位置関係を調整するだけで、時間分解検出と同時検出を使い分けることができ、遅延蛍光のでる標識剤を適用したサンプルにも、遅延蛍光の少ない標識剤を適用したサンプルにも対処可能である。

また、遅延蛍光検出を行う場合は、バックグラウンド蛍光の消失後に蛍光検出を開始する検出遅延時間Ｔｄを、連続的に変えて最適な値に設定することが可能である。

図５に示す第１実施形態の構成では、光ファイバと、蛍光標識された被測定スポットとの位置合わせや、光ファイバ間隔Ｌｆの設定が容易だというメリットがある。

励起光ファイバと、蛍光検出ファイバの位置合わせ時には、たとえばＨｅ−Ｎｅレーザ（波長６３３ｎｍの可視光）を使用し、実際の測定には、たとえばＨｅ−Ｃｄレーザ（波長３２５ｎｍ）のＣＷレーザ光を励起光ファイバに入射する構成としてもよい。

また、実施例では被測定スポットを搭載する基板１３と、励起光ファイバ１１および蛍光検出ファイバ２１とを相対移動させるために、回転運動する円形回転ステージ１２や左右にオシレートする並行移動ステージ１６、光ファイバヘッド１９を用いたが、基板上の被測定スポット１４が、励起光ファイバ１１側から蛍光検出ファイバ１２側へ相対的に移動できる構成であれば、コンベアベルト等の任意の相対移動メカニズムを採用することができる。

最後に、以上の説明に関して、以下の付記を開示する。
（付記１） 蛍光標識された試料を含む被測定スポットを搭載する基板と、
前記被測定スポットに励起光を照射する励起光照射用光ファイバと、
前記被測定スポットからの蛍光を検出する蛍光検出用光ファイバと、
前記基板上の被測定スポットを前記励起光照射用光ファイバ側から前記蛍光検出用光ファイバ側へ相対移動させる移動メカニズムと
を備えることを特徴とする蛍光検出装置。
（付記２） 前記励起光照射用光ファイバと、前記蛍光検出用光ファイバとは、前記基板を挟んで、反対側に位置することを特徴とする付記２に記載の蛍光検出装置。
（付記３） 前記励起光照射用光ファイバと、前記蛍光検出用光ファイバとは、前記基板に対して同じ側に位置することを特徴とする付記１に記載の蛍光検出装置。
（付記４） 前記蛍光検出用光ファイバと、前記被測定スポットとの間の距離は、５０μｍ〜１ｍｍの範囲で設定されることを特徴とする付記１に記載の蛍光検出装置。
（付記５） 前記蛍光検出用光ファイバの先端は、斜めに加工されていることを特徴とする付記１または３に記載の蛍光検出装置。
（付記６） 前記励起光照射用光ファイバから照射され、前記被測定スポットを透過した光を前記測定スポットに戻す光学素子と、前記被測定スポットからの蛍光を、前記蛍光検出用ファイバに集光させる光学素子の少なくとも一方をさらに有することを特徴とする付記１に記載の蛍光検出装置。
（付記７） 前記蛍光検出用光ファイバの位置は、前記励起光照射用光ファイバの位置に対して可変に設定されることを特徴とする付記１に記載の蛍光検出装置。
（付記８） 前記蛍光検出用光ファイバの先端は、蛍光検出領域が励起光の照射スポットをカバーする形状に加工されており、
前記励起光照射用光ファイバと蛍光検出用光ファイバの位置関係は、固定される
ことを特徴とする付記１に記載の蛍光検出装置。
（付記９） 前記蛍光検出用光ファイバは、前記励起光照射用光ファイバの両側に位置する一対の蛍光検出用光ファイバを含み、
前記被測定スポットを搭載する基板は、前記蛍光検出量光ファイバおよび前記一対の蛍光検出用光ファイバに対して、両方向に移動する
ことを特徴とする付記１に記載の蛍光検出装置。
（付記１０） 前記励起光照射用光ファイバと、前記一対の蛍光検出用光ファイバとを一体的に固定する光ファイバヘッド
をさらに有することを特徴とする付記９に記載の蛍光検出装置。
（付記１１） 前記励起光照射用光ファイバに対する前記蛍光検出用光ファイバの位置は、前記試料が遅延蛍光を生じさせる蛍光標識剤で標識されている場合は、前記励起光照射用光ファイバと蛍光検出用光ファイバとの間の距離をＬｆ、前記励起光の照射により前記被測定スポットから発生するバックグランド蛍光が消失する時間をＴｄ、前記被測定スポットの相対移動速度をＶとしたときに、
Ｌｆ＝Ｖ＊Ｔｄ
となるように設定されることを特徴とする付記１に記載の蛍光検出装置。
（付記１２） 前記励起光照射用光ファイバに対する前記蛍光検出用光ファイバの位置は、前記試料が遅延蛍光をほとんど生じさせない蛍光標識剤で標識されている場合は、前記励起光照射用光ファイバと蛍光検出用光ファイバとの間の距離をＬｆ、前記励起光照射用光ファイバの半径をＲ１、前記蛍光検出用の光ファイバの半径をＲ２としたときに、
０≦Ｌｆ≦Ｄ１＋Ｄ２
となるように設定されることを特徴とする付記１に記載の蛍光検出装置。
（付記１３） 前記移動メカニズムは、前記基板を搭載して回転する回転ステージである
ことを特徴とする付記１に記載の蛍光検出装置。
（付記１４） 前記移動メカニズムは、前記基板を搭載してオシレーション運動をする並行移動ステージであることを特徴とする付記１に記載の蛍光検出装置。
（付記１５） 前記励起光照射用光ファイバに接続される連続発振光源
をさらに含むことを特徴とする付記１〜１４のいずれかに記載の蛍光検出装置。
（付記１６） 前記蛍光検出用ファイバにより検出された蛍光情報を収集し処理する情報処理部、をさらに含むことを特徴とする付記１〜１５のいずれかに記載の蛍光検出装置。
（付記１７） 蛍光標識剤で標識した試料を含む被測定スポットを、励起光照射用光ファイバで励起するステップと、
前記励起によるバックグランド蛍光が消失する時間Ｔｄ後に、蛍光検出用光ファイバを用いて前記蛍光標識剤からの蛍光を検出するステップと
を含むことを特徴とする蛍光検出方法。
（付記１８） 前記蛍光検出用光ファイバの検出面と、前記被測定スポットとの間の距離を、５０μｍ〜１ｍｍの範囲で設定するステップ
をさらに含むことを特徴とする付記１７に記載の蛍光検出方法。

時間分解蛍光検出法を説明するための図である。 公知の円板型の時間分解蛍光検出装置の構成例である。 公知のフロー型の時間分解蛍光検出装置の構成例である。 時間分解蛍光検出と同時蛍光検出の双方に適用可能な公知の画像読み取り装置の構成例である。 本発明の第１実施形態の蛍光検出装置の基本構成を示す図である。 図５の構成を採用する蛍光検出装置の概略構成図である。 光ファイバ間距離Ｌｆを移動するサンプルの移動速度Ｖおよび移動時間ｔｆと、移動回転ステージの回転数との関係を示すグラフである。 光ファイバ間距離Ｌｆとサンプル移動時間ｔｆ［μsec］との関係を示すグラフである。 第２実施形態の蛍光検出装置の基本構成を示す図である。 第３実施形態の蛍光検出装置の基本構成を示す図である。 第４実施形態の蛍光検出装置の基本構成を示す図である。 第５実施形態の蛍光検出装置の基本構成を示す図である。 第５実施形態の変形例を示す図である。 図１３の構成を採用した蛍光検出装置の概略構成図である。 回転円板を用いた蛍光測定のための被測定スポットの配置例の図である。 並行移動ステージを用いた場合のスライドガラス基板上の被測定スポットの配置例を示す図である。 光ファイバ端部の加工例を示す図である。

符号の説明

１ 蛍光検出装置
１０ レーザ光源
１１ 励起光ファイバ（励起光照射用光ファイバ）
１２ 移動回転ステージ
１３ 被測定スポット搭載基板
１４ 被測定スポット
１６ 並行移動ステージ
１９ 光ファイバヘッド
２０ 光検出器
２１ 蛍光検出ファイバ（蛍光検出用光ファイバ）
３０ ステージコントローラ
４０ ＰＣ（データ収集処理装置）

Claims (10)

1. 蛍光標識された試料を含む被測定スポットを搭載する基板と、
   前記被測定スポットに励起光を照射する励起光照射用光ファイバと、
   前記被測定スポットからの蛍光を検出する蛍光検出用光ファイバと、
   前記基板上の被測定スポットを前記励起光照射用光ファイバ側から前記蛍光検出用光ファイバ側へ相対移動させる移動メカニズムと
   を備えることを特徴とする蛍光検出装置。
2. 前記励起光照射用光ファイバと、前記蛍光検出用光ファイバとは、前記基板を挟んで、反対側に位置することを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
3. 前記励起光照射用光ファイバと、前記蛍光検出用光ファイバとは、前記基板に対して同じ側に位置することを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
4. 前記蛍光検出用光ファイバと、前記被測定スポットとの間の距離は、５０μｍ〜１ｍｍの範囲で設定される
   ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
5. 前記蛍光検出用光ファイバの先端は、斜めに加工されていることを特徴とする請求項１または３に記載の蛍光検出装置。
6. 前記励起光照射用光ファイバから照射され、前記被測定スポットを透過した光を前記測定スポットに戻す光学素子と、前記被測定スポットからの蛍光を、前記蛍光検出用ファイバに集光させる光学素子の少なくとも一方
   をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
7. 前記蛍光検出用光ファイバの位置は、前記励起光照射用光ファイバの位置に対して可変に設定されることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
8. 前記蛍光検出用光ファイバの先端は、蛍光検出領域が励起光の照射スポットをカバーする形状に加工されており、
   前記励起光照射用光ファイバと蛍光検出用光ファイバの位置関係は、固定される
   ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
9. 前記蛍光検出用光ファイバは、前記励起光照射用光ファイバの両側に位置する一対の蛍光検出用光ファイバを含み、
   前記被測定スポットを搭載する基板は、前記励起蛍照射用光ファイバおよび前記一対の蛍光検出用光ファイバに対して、両方向に移動する
   ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
10. 蛍光標識剤で標識した試料を含む被測定スポットを、励起光照射用光ファイバで励起するステップと、
    前記励起によるバックグランド蛍光が消失する時間Ｔｄ後に、蛍光検出用光ファイバを用いて前記蛍光標識剤からの蛍光を検出するステップと
    を含むことを特徴とする蛍光検出方法。

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