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JP2007533321A - ウイルスに対する細胞性の許容性因子、および該因子の使用 - Google Patents

ウイルスに対する細胞性の許容性因子、および該因子の使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ウイルス増殖、特にブタ繁殖および呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスに関して許容性である宿主細胞の生成に関連する方法および組成物を提供する。

Description

発明の分野
本発明は、アスファウイルス科（Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ）およびアルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスに関して、ウイルス増殖を許容する宿主細胞の生成に関する方法および組成物を提供する。
発明の背景
アスファウイルス科
アスファウイルス科は、そのゲノムが、ほぼ長さ１５００００〜１９００００ヌクレオチドの直鎖二本鎖ＤＮＡの単一分子からなる、正二十面体（ｉｃｏｓｏｈｅｄｒａｌ）のエンベロープを持ったウイルス科である。この科の名称は、アフリカ・ブタ熱および関連ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）に由来する。アフリカ・ブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）は、アスフィウイルス属の基準種であり、そしてこの科の単独のメンバーである。最近、ブタＣＤ１６３ポリペプチドが、アフリカ・ブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）の細胞性受容体であると推測されてきている（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｏｒｔｅｓら、２００３）。
アルテリウイルス科
アルテリウイルス科のウイルスには、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）が含まれる。最大の経済的重要性を有するアルテリウイルス属は、ブタ繁殖および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）である。
ＰＲＲＳＶ
ブタ繁殖および呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は、経済的に最も重要なブタ疾患の１つである。該症候群は、１９８０年代後期、北米および西欧にほぼ同時に現れ、そしてそれ以来、欧州、アジアおよびアメリカの主要なブタ産生国に蔓延して、風土病になっている。ＰＲＲＳの病原体は、ＰＲＲＳウイルスまたはＰＲＲＳＶと称されているウイルスである。欧州および北米ＰＲＲＳのどちらに関しても、該疾患は、若い雌ブタおよび成熟した雌ブタにおける繁殖の失敗（後期流産、死産およびミイラ状胎児（ｍｕｍｍｉｅｓ））、保育されているブタの高死亡率、およびすべての年齢のブタにおける呼吸器疾患によって特徴付けられる。この疾患は、最近の概説の主題であった（ＭｅｎｇｅｌｉｎｇおよびＬａｇｅｒ、２０００；Ｍｕｒｔａｕｇｈら、２００２；Ｎｏｄｅｌｉｊｋ、２００２；Ｐｌａｇｅｍａｎｎ、２００３）。
ブタにおいて、ＰＲＲＳＶ感染は、単球／マクロファージ細胞系譜の細胞サブセットに限定される。完全に分化したブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）細胞が、ウイルス複製の主なターゲット細胞である（Ｄｕａｎら、１９９７ａ；Ｄｕａｎら、１９９７ｂ）。ＰＡＭ細胞の不死化は技術的に困難であり、そして成功した場合でも、ＰＲＲＳウイルス増殖に許容性でない細胞株を生じた（Ｗｅｉｎｇａｒｔｌら、２００２）。ＰＲＲＳビリオンは、マクロファージに特異的に結合され、そしてエンドサイトーシスによって、クラスリンにコーティングされたピット中に内在化される。細胞内小胞からの放出には、酸性ｐＨが必要である（Ｎａｕｗｙｎｃｋら、１９９９）。ビリオンの最初の結合は、ウイルス・マトリックス・タンパク質とヘパリン硫酸グリコサミノグリカンの相互作用によって仲介される（Ｄｅｌｐｕｔｔｅら、２００２）。２１０または２２０ｋＤａの膜糖タンパク質に対するモノクローナル抗体と、ＰＡＭ細胞をインキュベーションすると、ＰＲＲＳウイルスの感染が遮断されるため、内在化は、このポリペプチドによって促進されうる（Ｄｕａｎら、１９９８；Ｗｉｓｓｉｎｋら、２００３）。２１０ｋＤａ糖タンパク質は、最近、シアロアドヘシンと同定され、このタンパク質はシアル酸結合性免疫グロブリン様レクチンのｓｉｇｌｅｃファミリーのメンバーである（Ｐｅｎｓａｅｒｔら、２００３）。非許容性ＰＫ−１５（ブタ腎臓）細胞株にブタ・シアロアドヘシンをトランスフェクションすると、ＰＲＲＳＶ粒子を内在化する能力が与えられたが、ビリオンが細胞小胞に進入したものの、ヌクレオカプシド分解および小胞膜融合を経ないため、見かけ上、脱コート段階で遮断されたままであった。ウイルス遺伝子は発現されず、そしてトランスフェクションされたＰＫ−１５細胞は、ＰＲＲＳウイルスに許容性にならなかった（Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｊｄｅｎら、２００３）。我々が知る限りでは、シアロアドヘシンのトランスフェクションは、ＰＲＲＳＶ非許容性細胞株いずれかをＰＲＲＳＶ許容性表現型に変換するのに十分であるとは示されていない。
単球／マクロファージ細胞系譜の初代ブタ細胞は別として、細胞培養において、ＰＲＲＳＶの増殖に関して許容性であることが知られる他の細胞種は、不死化サル腎臓細胞株ＭＡ−１０４（Ｃｈｌａｄｅｋら、１９９８）、並びにＭＡＲＣ−１４５（Ｋｉｍら、１９９３）およびＣＬ−２６２１などの派生物のみである。この１つの特定の細胞株が許容性であるが、他の哺乳動物細胞株が許容性でないのはなぜかは未知である。ＰＲＲＳウイルスは、いくつかの異なる細胞種に特異的に結合するが、感染を開始しない（Ｋｒｅｕｔｚ、１９９８；Ｔｈｅｒｒｉｅｎら、２０００）。ＭＡＲＣ−１４５細胞において、エンドサイトーシスによるウイルスの内在化、およびそれに続く、低ｐＨ小胞における脱コートは、ＰＡＭ細胞における類似の事象を模倣しているように見える（ＫｒｅｕｔｚおよびＡｃｋｅｒｍａｎｎ、１９９６）。しかし、ブタ・シアロアドヘシンに結合するいくつかのモノクローナル抗体は、ＭＡＲＣ−１４５細胞表面上の相同タンパク質を検出できず（Ｄｕａｎら、１９９８；Ｗｉｓｓｉｎｋら、２００３）、ＭＡＲＣ−１４５細胞が、同じタンパク質ファミリーの異なるメンバーまたはまったく異なる受容体を用いる可能性が示唆される。
現在のＰＲＲＳＶワクチンは、サル細胞株上で増殖されており、これは潜在的に危険な行為である。ワクチン産生にサル細胞株を使用すると、異種移植目的が意図されるブタ系統に、重大な霊長類ウイルスが導入される可能性がある。ブタは、ヒトの異種移植臓器の供給源として、ますます検討が進められているため、ブタ集団に霊長類細胞株を導入することは、最終的には、異種移植臓器のレシピエントとなるヒトにリスクをもたらしうる。したがって、ブタ・ワクチン調製物にサル細胞株を使用するのを回避することが賢明であろう。したがって、ＰＲＲＳＶ複製を支持しうる非サル細胞または細胞株を同定するかまたは生成することが望ましいであろう。この目的に向けて、特定のサル細胞株、並びにＰＡＭ細胞において見られるような、ＰＲＲＳＶ複製に関する許容性を与えるのに関与しうる遺伝子産物（単数または複数）を同定することが必須である。こうした遺伝子産物がひとたび同定されたら、必須遺伝子をトランスフェクションすることによって非許容性細胞を許容性にして、それによってより豊富なワクチン産生株を提供することも可能である。
ある実験室が、ＭＡＲＣ−１４５細胞由来のテトラスパニン・タンパク質ＣＤ１５１を非許容性ＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションすると、ＰＲＲＳウイルスに対する許容性が与えられることを報告した（ＫａｐｉｌおよびＳｈａｎｍｕｋｈａｐｐａ、２００３；ＳｈａｎｍｕｋｈａｐｐａおよびＫａｐｉｌ、２００１）。この観察は、いまだに、この実験室と無関係の実験室によっては確認されていない。我々は、本明細書において、非許容性細胞にトランスフェクションした際、ＰＲＲＳウイルスに対する許容性を与える、非関連ポリペプチドを記載する。
引用参考文献
Figure 2007533321
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Figure 2007533321
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発明の概要
本発明は、アルテリウイルス科およびアスファウイルス科からなる群より選択されるウイルスによる、１以上の細胞の感染を促進する方法であって、前記細胞内でＣＤ１６３ポリペプチドの発現増加を導く工程を含む、前記方法を含む。好ましい態様において、ＣＤ１６３は膜結合型である。１つの態様において、ウイルスは、アルテリウイルス科からなる群より選択される。好ましい態様において、ウイルスはＰＲＲＳＶである。別の態様において、前記ウイルスは、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）である。さらに別の態様において、前記ウイルスは、アフリカ・ブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）である。
ＣＤ１６３ポリペプチドをコードする外因性核酸を導入するなどの方法によって、ＣＤ１６３ポリペプチドの発現増加を達成することも可能であり、こうした方法には、限定されるわけではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、およびＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのキャリアーとの融合が含まれる。化学的処理により、内因性ＣＤ１６３の発現を誘導することによって、発現増加を達成することもまた、可能である。
該方法は、以前にはＰＲＲＳＶ非許容性であった細胞をＰＲＲＳ許容性にしうる。該方法はまた、以前にはＣＤ１６３ポリペプチドを発現しなかった１以上の細胞を、ＣＤ１６３ポリペプチドを発現するように誘導された細胞にすることも含みうる。
好ましい態様において、細胞は動物細胞である。これらは脊椎動物細胞または無脊椎動物細胞であることも可能である。細胞は哺乳動物細胞であることも可能である。細胞または細胞株は、昆虫細胞株であることも可能である。細胞はＢＨＫ２１細胞であることも可能である。細胞はブタ腎臓細胞由来であることも可能である。細胞または細胞株は、ネコ腎臓細胞由来であることも可能である。細胞または細胞株は、限定されるわけではないが、ＢＨＫ−２１、ＮＬＳＴ−１、ＮＬＦＫ−１、ＶｅｒｏまたはＲＬ細胞であることも可能である。ＰＲＲＳＶは、欧州または北米遺伝子型であることも可能である。
上述のように、限定されるわけではないが：トランスフェクション、エレクトロポレーション、およびＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのキャリアーとの融合を含む方法によって、ＣＤ１６３ポリペプチドの発現増加を達成することも可能である。いかなるＣＤ１６３ポリペプチドも意図される。膜貫通領域を含有するものが好ましい。典型的なＣＤ１６３ポリペプチドは、以下に列挙するポリヌクレオチドからなる群より選択される。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、２０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号２と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号２と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号１に示す配列を持つポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号１４に示すポリペプチドと少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号１４と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号１４と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号１４を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号１３に示す配列を持つポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、２以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号２４と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号２４を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号２３に示す配列を持つポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号２７に示すポリペプチドと少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、２０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号２７と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号２７と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号２７を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号２６に示す配列を持つポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号３２に示すポリペプチドと少なくとも９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３２と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３２と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号３２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号３１に示す配列を持つポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号３４に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３４と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３４と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号３４を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号３３に示す配列を持つポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号３６に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３６と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３６と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号３６を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号３５に示す配列を持つポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４２に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４２と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４２と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４１に示す配列を持つポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４４に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４４と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４４と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４４を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４３に示す配列を持つポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４６に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４６と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４６と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４６を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４５に示す配列を持つポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４８に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４８と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４８と異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４８を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４７に示す配列を持つポリヌクレオチドを含む。
上述の感染を促進する方法は、ウイルスの培養物を産生する工程をさらに含むことも可能である。
本発明は、上述の方法によって単離された培養物をさらに含む。
上述の方法のいずれも、ＰＲＲＳまたは他のウイルスワクチンを産生する工程をさらに含むことも可能である。ワクチンは、死菌ワクチンまたは生弱毒化ワクチンであることも可能である。
本発明はまた、１以上の細胞が、アルテリウイルス科およびアスファウイルス科からなる群より選択されるウイルスに感染する能力が、前記細胞内でＣＤ１６３ポリペプチドの発現増加を導くことによって修飾されている、細胞または細胞株も含む。
好ましい態様において、ＣＤ１６３ポリペプチドは、膜貫通領域を含む。１つの態様において、ウイルスは、アルテリウイルス科からなる群より選択される。好ましい態様において、ウイルスはＰＲＲＳＶである。別の態様において、前記ウイルスはウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）である。さらに別の態様において、前記ウイルスは、アフリカ・ブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）である。
本発明の細胞または細胞株は、以前にはＰＲＲＳＶ非許容性であることも可能であり、そして前記細胞または細胞株内でＣＤ１６３ポリペプチドの発現増加を導くことによって、ＰＲＲＳＶ許容性にされている。
本発明の細胞または細胞株には、ＣＤ１６３ポリペプチドを発現しなかったものであり、そしてＣＤ１６３ポリペプチドを発現するように誘導された、細胞または細胞株が含まれる。
好ましい態様において、細胞は動物細胞である。これらは脊椎動物細胞または無脊椎動物細胞であることも可能である。細胞は哺乳動物細胞であることも可能である。細胞または細胞株は、昆虫細胞または細胞株であることも可能である。細胞はＢＨＫ２１細胞であることも可能である。細胞はブタ腎臓細胞由来であることも可能である。細胞または細胞株は、ネコ腎臓細胞由来であることも可能である。細胞は、限定されるわけではないが、ＢＨＫ−２１、ＮＬＳＴ−１、ＮＬＦＫ−１、ＶｅｒｏまたはＲＬ細胞であることも可能である。ＰＲＲＳＶは、北米または欧州遺伝子型であることも可能である。
本発明は、試験細胞または細胞株が、アルテリウイルス科およびアスファウイルス科からなる群より選択されるウイルスによる感染を可能にする傾向を測定するための方法であって：
ａ）試験細胞または細胞株由来の核酸を含有する試料を提供し；
ｂ）前記試料において、ＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体の量を測定する；
ことを含み、
前記ウイルスの増殖を支持しないことが知られる対照細胞または細胞株由来の対照試料に比較して、ＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量が増加していると、試験細胞または細胞株が前記ウイルスの複製を支持する傾向を持つことの指標となる、
前記方法を含む。
１つの態様において、ウイルスは、アルテリウイルス科からなる群より選択される。好ましい態様において、ウイルスはＰＲＲＳＶである。別の態様において、前記ウイルスはウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）である。さらに別の態様において、前記ウイルスは、アフリカ・ブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）である。
ＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量をハイブリダイゼーションによって測定することも可能である。
ＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量をＰＣＲによって測定することも可能である。
本発明はまた、試験細胞または細胞株がアルテリウイルス科およびアスファウイルス科からなる群より選択されるウイルスによる感染を可能にする傾向を測定するための方法であって：
（ａ）試験細胞または細胞株由来のポリペプチドを含有する試料を提供し；
（ｂ）前記試料において、ＣＤ１６３ポリペプチドの量を測定する；
ことを含み、
前記ウイルスの増殖を支持しないことが知られる対照細胞または細胞株由来の対照試料に比較して、ＣＤ１６３ポリペプチドの量が増加していると、試験細胞または細胞株が前記ウイルスの複製を支持する傾向を持つことの指標となる、
前記方法も含む。
１つの態様において、ウイルスは、アルテリウイルス科からなる群より選択される。好ましい態様において、ウイルスはＰＲＲＳＶである。別の態様において、前記ウイルスはウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）である。さらに別の態様において、前記ウイルスは、アフリカ・ブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）である。
１つの態様において、ＣＤ１６３ポリペプチドに特異的な抗体がＣＤ１６３ポリペプチドに結合する条件下で、ＣＤ１６３ポリペプチドを該抗体と接触させることによって、測定を達成する。
本発明は、ブタが、アルテリウイルス科およびアスファウイルス科からなる群より選択されるウイルスに感染する傾向を測定するための方法であって：
ａ）試験しようとするブタ由来の核酸を含有する試料を提供し；
ｂ）前記試料において、ＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体の量を測定する；
ことを含み、
前記ウイルス感染に抵抗性であることが知られるブタ由来の対照試料に比較して、ＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量が増加していると、試験しようとするブタが前記ウイルスに感染する傾向を持つことの指標となる、
前記方法を含む。
１つの態様において、ウイルスは、アルテリウイルス科からなる群より選択される。好ましい態様において、ウイルスはＰＲＲＳＶである。別の態様において、前記ウイルスはウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）である。さらに別の態様において、前記ウイルスは、アフリカ・ブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）である。
１つの態様において、ハイブリダイゼーションによって測定を達成する。別の態様において、ＰＣＲによって測定を達成する。
本発明はまた、ブタがアルテリウイルス科およびアスファウイルス科からなる群より選択されるウイルスに感染する傾向を測定するための方法であって：
（ａ）試験しようとするブタ由来のポリペプチドを含有する試料を提供し；
（ｂ）前記試料において、ＣＤ１６３ポリペプチドの量を測定する；
ことを含み、
前記ウイルス感染に抵抗性であることが知られるブタ由来の対照試料に比較して、ＣＤ１６３ポリペプチドの量が増加していると、試験しようとするブタが前記ウイルスに感染する傾向を持つことの指標となる、
前記方法もまた含む。
１つの態様において、ウイルスは、アルテリウイルス科からなる群より選択される。好ましい態様において、ウイルスはＰＲＲＳＶである。別の態様において、前記ウイルスはウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）である。さらに別の態様において、前記ウイルスは、アフリカ・ブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）である。
１つの態様において、ＣＤ１６３ポリペプチドに特異的な抗体がＣＤ１６３ポリペプチドに結合する条件下で、ＣＤ１６３ポリペプチドを該抗体と接触させることによって、測定を達成する。
本発明にはまた、以下に記載するポリペプチドからなる群より選択される、単離ポリペプチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた、配列番号２と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、２０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号２と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号２と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号２を含む。
したがって、本発明にはまた、配列番号１４に示すポリペプチドと少なくとも９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号１４と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号１４と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号１４を含む。
したがって、本発明にはまた、２以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号２４と異なる、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号２４を含む。
したがって、本発明にはまた、配列番号２７に示すポリペプチドと少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、２０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号２７と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号２７と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号２７を含むポリペプチドである。
したがって、本発明にはまた、配列番号３２に示すポリペプチドと少なくとも９８％、９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３２と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３２と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号３２を含むポリペプチドである。
したがって、本発明にはまた、配列番号３４に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３４と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３４と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号３４を含むポリペプチドである。
したがって、本発明にはまた、配列番号３６に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３６と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３６と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号３６を含むポリペプチドである。
本発明はまた、配列番号３８に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含む。
１つのこうしたポリペプチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３８と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号３８と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号４０を含むポリペプチドである。
したがって、本発明にはまた、配列番号４０に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４０と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４０と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号４０を含むポリペプチドである。
したがって、本発明にはまた、配列番号４２に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４２と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４２と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号４２を含むポリペプチドである。
したがって、本発明にはまた、配列番号４４に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４４と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４４と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号４４を含むポリペプチドである。
したがって、本発明にはまた、配列番号４６に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４６と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４６と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、配列番号４６を含むポリペプチドである。
したがって、本発明にはまた、配列番号４８に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、単離ポリペプチドも含まれる。
１つのこうしたポリペプチドは、１５以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４８と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリペプチドは、１０以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号４８と異なるポリペプチドである。
１つのこうしたポリヌクレオチドは、配列番号４８を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明にはまた、単離ＣＤ１６３ポリヌクレオチドであって、以下に列挙するポリヌクレオチドからなる群より選択される、前記ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号１または５に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号２に示すポリペプチドと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号１２または１３に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号１４に示すポリペプチドと少なくとも９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号２２または２３に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号２４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号２５または２６に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号２７に示すポリペプチドと少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号３０または３１に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号３２に示すポリペプチドと少なくとも９８％または９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号３３に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号３４に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号３５に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号３６に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号３７に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号３８に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号３９に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４０に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号４１に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４２に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号４３に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４４に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号４５に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４６に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号４７に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４８に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた、膜貫通領域が欠失しているＣＤ１６３ポリペプチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた、膜貫通領域が欠失しているＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれる。
前述のものに加えて、本発明には、さらなる側面として、上に具体的に言及した変型よりも、いずれかの点で範囲が狭い、本発明のすべての態様が含まれる。
配列リストの簡単な説明
配列番号１――ブタｓｕｓＣＤ１６３ｖ１をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号２――ブタｓｕｓＣＤ１６３ｖ１の予測されるアミノ酸配列
配列番号３――ｃＤＮＡ配列、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＪ３１１７１６
配列番号４――Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＪ３１１７１６由来の予測されるアミノ酸配列
配列番号５――隣接（非コード）配列を含有するｓｕｓＣＤ１６３ｖ１のｃＤＮＡ配列
配列番号６〜１１――プライマー配列
配列番号１２――隣接（非コード）配列を含有するブタｓｕｓＣＤ１６３ｖ２をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１３――ブタｓｕｓＣＤ１６３ｖ２をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１４――ブタｓｕｓＣＤ１６３ｖ２の予測されるアミノ酸配列
配列番号１５〜１６――プライマー配列
配列番号１７――隣接（非コード）配列を含有するヒトＣＤ１６３ｖ２をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１８――ヒトＣＤ１６３ｖ２をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１９――ヒトＣＤ１６３ｖ２の予測されるアミノ酸配列
配列番号２０〜２１――プライマー配列
配列番号２２――隣接（非コード）配列を含有するネズミＣＤ１６３ｖ２をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号２３――ネズミＣＤ１６３ｖ２をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号２４――ネズミＣＤ１６３ｖ２の予測されるアミノ酸配列
配列番号２５――隣接（非コード）配列を含有するネズミＣＤ１６３ｖ３をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号２６――ネズミＣＤ１６３ｖ３をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号２７――ネズミＣＤ１６３ｖ３の予測されるアミノ酸配列
配列番号２８〜２９――プライマー配列
配列番号３０――隣接（非コード）配列を含有するＭＡＲＣ−１４５ ＣＤ１６３ｖ３をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号３１――ＭＡＲＣ−１４５ ＣＤ１６３ｖ３をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号３２――ＭＡＲＣ−１４５ ＣＤ１６３ｖ３の予測されるアミノ酸配列
配列番号３３――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ２転写物をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号３４――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ２の予測されるアミノ酸配列
配列番号３５――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ３転写物をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号３６――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ３の予測されるアミノ酸配列
配列番号３７――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ４転写物をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号３８――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ４の予測されるアミノ酸配列
配列番号３９――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ５転写物をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号４０――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ５の予測されるアミノ酸配列
配列番号４１――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ６転写物をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号４２――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ６の予測されるアミノ酸配列
配列番号４３――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ７転写物をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号４４――Ｖｅｒｏ細胞ＣＤ１６３ｖ７の予測されるアミノ酸配列
配列番号４５――イヌＣＤ１６３ｖ２転写物をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号４６――イヌＣＤ１６３ｖ２の予測されるアミノ酸配列
配列番号４７――イヌＣＤ１６３ｖ３転写物をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号４８――イヌＣＤ１６３ｖ３の予測されるアミノ酸配列
発明の詳細な説明
一般的な定義
細胞および細胞株は、「ウイルス許容性」または「ウイルス非許容性」のいずれかであることも可能である。例えば、ウイルス許容性である細胞または細胞株は、ウイルス感染、それに続く複製およびウイルス産生を可能にしうる。ウイルス非許容性である細胞または細胞株は、ウイルス感染、それに続く複製およびウイルス産生を可能にしえない。既に幾分許容性である細胞株は、本発明の方法によって、より許容性にされることも可能である。
アルテリウイルス科は、ニドウイルス（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目に属する、エンベロープを持ったプラス鎖ＲＮＡウイルスの科を指す。この科には、マウスの乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、およびＰＲＲＳＶが含まれる。
アスファウイルス科は、正二十面体のエンベロープを持つウイルスであり、そのゲノムは、長さ約１５００００〜１９００００ヌクレオチドの直鎖二本鎖の単一分子からなる。この科の名称は、アフリカ・ブタ熱および関連ウイルスに由来する。アフリカ・ブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）は、アスフィウイルス属の基準種であり、そしてこの科の単独のメンバーである。
用語「ＰＲＲＳＶ」またはＰＲＲＳウイルスは、欧州および北米ＰＲＲＳウイルス遺伝子型の両方を指す。各遺伝子型内で、単離体は、典型的には８５％以上のヌクレオチド同一性を共有する。しかし、遺伝子型間で、配列同一性のレベルは、約６０％でしかない。
ＰＲＲＳウイルスは、アルテリウイルス科のメンバーである。アルテリウイルスのゲノムは、長さ１２〜１６ｋｂの間のプラス極性の一本鎖ＲＮＡであり、５’端でキャップされ、そして３’端でポリアデニル化されている。ゲノムの３分の２以上が、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）１ａおよび１ｂに充てられ、これらはウイルスの非構造機能をコードする。ＯＲＦ１ｂは、ＯＲＦ１ａの伸長であり、そしてリボソーム・フレームシフトの結果である。ＯＲＦ １ａおよび１ｂは、ゲノムＲＮＡから直接翻訳される。これらの巨大ポリペプチド産物は、ウイルスプロテアーゼによって切断されて、１２または１３の別個のより小さいペプチドを生じる。ウイルス構造タンパク質をコードする残りのＯＲＦは、一連の３’共末端（ｃｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から発現される。ｓｇＲＮＡは、マイナス鎖ＲＮＡの不連続転写によって産生されて、共通の５’リーダー配列が各転写物に融合される。主な構造タンパク質は、ヌクレオカプシド（Ｎ、ＯＲＦ７によってコードされる）、マトリックス・タンパク質（Ｍ、ＯＲＦ６によってコードされる）、および主要エンベロープ糖タンパク質（ＧＰ５、ＯＲＦ５によってコードされる）である。残りのタンパク質、ＧＰ４（ＯＲＦ４）、ＧＰ３（ＯＲＦ３）、ＧＰ２（ＯＲＦ２ａ）、およびＥ（ＯＲＦ２ｂ）は、ビリオンのマイナーな構造構成要素であり、その機能はいまだに解明されていない。ＰＲＲＳＶの分子生物学は、最近の概説論文の主題であった（Ｄｅａら、２０００；Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ、２０００；ＳｎｉｊｄｅｒおよびＭｅｕｌｅｎｂｅｒｇ、２００１）。
本明細書において、用語「ＣＤ１６３ポリペプチド」は、哺乳動物ＣＤ１６３遺伝子にコードされるタンパク質を意味し、保存的または非保存的変化を含有するアレル変異体が含まれる。ブタＣＤ１６３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列が報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＪ３１１７１６）。ネズミＣＤ１６３ポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ２７４８８３）、並びにＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＨ５１２８１およびＣＡＡ８０５４３に例示される多数のヒト変異体もまた、報告されている。我々は、本明細書において、ブタ、ヒト、ネズミ、イヌ、およびアフリカミドリザル（ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）ＣＤ１６３ポリペプチドをコードし、そして配列番号１、５、１２、１３、１７、１８、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４５および４７に示す配列を含む、ポリヌクレオチドを報告する。「ＣＤ１６３ポリペプチド」は、膜貫通糖タンパク質のスカベンジャー受容体システイン・リッチ（ＳＲＣＲ）ファミリーのメンバーであり、そしてもっぱら単球およびマクロファージ上で発現されると考えられる。ＣＤ１６３の１つの同定されている役割は、エンドサイトーシスによって、ヘモグロビン：ハプトグロビン複合体を消費することによって、溶血後の酸化的組織損傷を阻害することである。それに続くインターロイキン１０の放出およびヘム・オキシゲナーゼ−１の合成は、抗炎症効果および細胞保護効果を生じる（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓら、２００４；Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら、２００２）。ヒトＣＤ１６３遺伝子は、染色体１２上の３５ｋｂに渡り、そして１７のエクソンおよび１６のイントロンからなる。膜結合型、細胞質型および分泌型を含む、ＣＤ１６３ポリペプチドのいくつかのアイソフォームが、選択的スプライシングによって生成されることが知られる（Ｒｉｔｔｅｒら、１９９９）。膜貫通ドメインを含むアイソフォームが特に好ましい。
膜貫通ドメインは、より大きい配列のポリペプチドセグメントであって、膜の両側で暴露されることによって特徴付けられる。細胞質ドメインおよび細胞外ドメインは、脂質二重層の疎水性環境を横断する、少なくとも１つの膜貫通セグメントによって分けられる。膜貫通セグメントは、通常、アルファらせん型であり、非極性側鎖を持つアミノ酸残基で構成される。約２０〜３０の疎水性残基を含有するセグメントは、アルファらせんとして膜を貫通するのに十分に長く、そしてこれらはしばしば、ヒドロパシープロットによって同定可能である。配列番号２および配列番号１４の予測される膜貫通ドメインは、本明細書において、太字で示される。他のＣＤ１６３配列が類似の配列特徴を含有するかどうかは、配列の検査またはヒドロパシープロットによって容易に決定される。配列番号３７〜４０は、膜貫通ドメインを含有しない変異体ＣＤ１６３タンパク質およびそのコード核酸の代表である。
本明細書において、以降、「ポリヌクレオチド」は、一般的に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これらは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであることも可能である。「ポリヌクレオチド」には、限定なしに、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、並びに、一本鎖、あるいはより典型的には、二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であることも可能な、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子である。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡ両方を含む、三重鎖領域を指す。用語「ポリヌクレオチド」はまた、１以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された主鎖を持つＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンなどの普通でない塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡに多様な修飾を行うことも可能であり；したがって、「ポリヌクレオチド」は、天然に典型的に見られるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された型、並びにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的な型を含む。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドとも称される、比較的短いポリヌクレオチドも含む。
本明細書において、以降、「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって、互いに連結されるアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質いずれかを指す。「ポリペプチド」は、一般的にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般的にタンパク質と称されるより長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子にコードされる２０のアミノ酸以外のアミノ酸を含有することも可能である。「ポリペプチド」には、天然プロセス、例えば翻訳後プロセシングによるか、または当該技術分野に周知の化学的修飾技術によるかいずれかで修飾されているアミノ酸配列が含まれる。こうした修飾は、基本的な教科書、そしてより詳細なモノグラフ、並びに膨大な研究文献によく記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めて、ポリペプチドのどこに存在することも可能である。同種の修飾が、既定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じ度合いで、または異なる度合いで存在することも可能であることが認識されるであろう。また、既定のポリペプチドが多くの種類の修飾を含有することも可能である。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝していることも可能であるし、そして分枝を伴い、または伴わずに、環状であることも可能である。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生じることも可能であるし、または合成法によって作成されることも可能である。修飾または修飾型には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡが仲介するタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ―Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， 第２版， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ニューヨーク， １９９３；Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， １−１２ページ， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ中， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク， １９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒら， “Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ” ， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：６２６−６４６およびＲａｔｔａｎら， “Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ”， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８４２を参照されたい）。
本明細書において、以降、「単離された」は、人の手によって天然状態から改変されたことを意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在する場合、その元来の環境から変化しているかまたは除去されているか、あるいはその両方である。例えば、生存動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、天然状態で共存する物質から分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、該用語を本明細書で使用する際、「単離されて」いる。「単離された」は、本明細書において、そして当該技術分野に理解されるように、「単離」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドいずれを指すのであっても、該ポリペプチドまたは核酸が通常見られる元来の細胞環境から分離されたことを意味するように解釈される。したがって、本明細書において、一例として、本発明のポリヌクレオチドで構築したトランスジェニック動物または組換え細胞株は、「単離」核酸を利用する。本発明の単離されたポリヌクレオチドの定義から具体的に排除されるのは、ポリヌクレオチドが元来得られた天然宿主細胞由来の完全な単離染色体である。
以下の開示において、我々はしばしば、ポリペプチドのアミノ酸配列に適用されるような、用語「同一性」または類似性を使用するであろう。ポリペプチドに関するアミノ酸配列「同一性」パーセントは、本明細書において、両方の配列を並列させ、そして必要であればギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさずに、ターゲット配列中の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。配列同一性パーセントは慣用法によって決定される。例えば、ＢＬＡＳＴＰ２．２．６［Ｔａｔｕｓｏｖａ ＴＡおよびＴＬ Ｍａｄｄｅｎ， “ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ− ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． １７４：２４７−２５０］。
簡潔には、１０のギャップ・オープニング・ペナルティ、０．１のギャップ伸長ペナルティ、並びにＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９． １９９２）の「ｂｌｏｓｕｍ６２」スコアリングマトリックスを用いて、上述のように、２つのアミノ酸配列を並列させて、並列スコアを最適化する。
次いで、同一性パーセントを以下のように計算する：
Figure 2007533321
本発明のポリペプチドに関する配列「類似性」（しばしば「相同性」と称される）パーセントは、本明細書において、配列を並列させ、そして必要であればギャップを導入して最大の配列同一性パーセント（上述のようなもの）を達成した後、そしてまたいかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なして、ターゲット配列中の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。
Figure 2007533321
物理的特性、並びに二次および三次タンパク質構造への寄与にしたがって、アミノ酸を分類することも可能である。保存的置換は、当該技術分野において、１つのアミノ酸に対して、類似の特性を有する別のアミノ酸を置換するものと認識される。
典型的な保存的置換を、以下の表１、２、および３に示す。
表１
保存的置換Ｉ
Figure 2007533321
あるいは、保存的アミノ酸は、すぐ下の表２に示すように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第２版；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨーク（１９７５）， ｐｐ．７１−７７］に記載されるように分類可能である。
表２
保存的置換ＩＩ
Figure 2007533321
さらに別の代替物として、典型的な保存的置換をすぐ下の表３に示す。
表３
保存的置換ＩＩＩ
Figure 2007533321
本発明のウイルスおよび宿主細胞の産生に向けられる方法
本発明は、細胞における、アルテリウイルス科およびアスファウイルス科のメンバーであるウイルスの産生を修飾する方法であって、前記細胞にＣＤ１６３ポリペプチドを発現させる工程を含む、前記方法である。これは、ウイルス非許容性細胞をウイルス許容性細胞にすることを含むことも可能であるし、また細胞をウイルスにより許容性にすることを含むことも可能である。
１つの態様において、アルテリウイルス科またはアスファウイルス科のメンバーであるウイルスは、マウスのＬＤＶ、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、ブタのＰＲＲＳＶおよびブタのＡＳＦＶからなる群より選択される。
好ましい態様において、ウイルスはＰＲＲＳＶである。
本発明はさらに、アルテリウイルス科またはアスファウイルス科のメンバーであるウイルスの培養物を調製する方法であって：細胞株を提供し；前記細胞株にＣＤ１６３ポリペプチドを発現させ；前記細胞株をウイルスに感染させ；そして前記細胞株にウイルス子孫を産生させる工程を含む、前記方法を提供する。
１つの態様において、アルテリウイルス科のメンバーであるウイルスは、マウスのＬＤＶ、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、ブタのＰＲＲＳＶおよびブタのＡＳＦＶからなる群より選択される。
好ましい態様において、ウイルスはＰＲＲＳＶである。
上述の方法はすべて、ＣＤ１６３ポリペプチドを発現する細胞および細胞株を利用する。外因性核酸を細胞に導入することを含む方法によって、ＣＤ１６３を促進するかまたは増加させることも可能である。こうした細胞は、コードされるＣＤ１６３ポリペプチドの発現を可能にする方式で、ポリヌクレオチドまたはベクターを含むことも可能である。
ＣＤ１６３をコードするポリヌクレオチドを、単離タンパク質コード領域を含む環状プラスミドの一部として、または直鎖ＤＮＡとして、またはウイルスベクター中で、宿主細胞に導入することも可能である。外因性核酸を宿主細胞に導入するため、当該技術分野に周知であり、そして日常的に実施される方法には、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、核インジェクション、またはリポソーム、ミセル、ゴースト細胞、およびプロトプラストなどのキャリアーとの融合が含まれる。本発明の宿主細胞系には、無脊椎動物および脊椎動物細胞系が含まれる。宿主には、限定されるわけではないが、以下の細胞：昆虫細胞、ブタ腎臓（ＰＫ）細胞、ネコ腎臓（ＦＫ）細胞、ブタ精巣（ＳＴ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＭＡ−１０４、ＭＡＲＣ−１４５、ＶＥＲＯ、およびＣＯＳ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ヒト２９３細胞、およびネズミ３Ｔ３線維芽細胞が含まれることも可能である。昆虫宿主細胞培養系をＣＤ１６３ポリペプチドの発現に用いることもまた可能である。別の態様において、ショウジョウバエ発現系を用いてＣＤ１６３ポリペプチドを発現させる。
ＣＤ１６３ポリペプチドの発現に適した発現ベクターの選択は、もちろん、使用しようとする特定の宿主細胞に応じ、そして一般の当業者の技術の範囲内である。適切な発現ベクターの例には、ｐＳｐｏｒｔおよびｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、並びにｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が含まれる。哺乳動物宿主細胞で使用する発現ベクターには、ウイルスゲノム由来の転写調節配列および翻訳調節配列が含まれることも可能である。本発明で使用可能な、一般的に用いられるプロモーター配列および修飾因子配列には、限定されるわけではないが、ヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のものが含まれる。哺乳動物発現ベクターを構築する方法は、例えばＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２８０（１９８３））；Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：９３５（１９８６））；Ｃｏｓｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４））；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６；およびＷＯ ９１／１８９８２に開示される。
ＣＤ１６３配列は、多様な種由来の細胞に存在することが知られるため、内因性遺伝子を修飾して、ＣＤ１６３ポリペプチドの発現を許可するかまたは増加させることも可能である。細胞がより高いレベルでＣＤ１６３ポリペプチドを発現するように、天然存在ＣＤ１６３プロモーターの全体または一部を異種プロモーターの全体または一部で置き換えることによって、細胞を（例えば相同組換えによって）修飾して、増加した発現を提供することも可能である。内因性ＣＤ１６３コード配列に機能可能であるように連結される方式で、異種プロモーターを挿入する［例えばＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９４／１２６５０号、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９２／２０８０８号、およびＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９１／０９９５５号を参照されたい］。異種プロモーターＤＮＡに加えて、増幅可能マーカーＤＮＡ（例えばａｄａ、ｄｈｆｒ、並びにカルバミルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼをコードする多機能ｃａｄ遺伝子）および／またはイントロンＤＮＡを、異種プロモーターＤＮＡと共に挿入可能であることもまた、意図される。ＣＤ１６３コード配列に連結した場合、標準的選択法によってマーカーＤＮＡを増幅すると、細胞において、ＣＤ１６３コード配列が同時に増幅される。
化学的処理によってＣＤ１６３発現を誘導することもまた可能である。ホルボールエステル、特にホルボールミリスチルアセテート（ＰＭＡ）は、偏在性膜受容体、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の１以上のアイソザイムを活性化し、そしてＣＤ１６３発現を増加させる、特に好ましい手段である。細胞内カルシウム可動化の他の手段もまた意図される。
ワクチン産生
上述の方法を用いて、ワクチン産生または診断のため、アルテリウイルス科またはアスファウイルス科のメンバーであるいかなるウイルスを産生することも可能である。
１つの態様において、アルテリウイルス科のメンバーであるウイルスは、マウスのＬＤＶ、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、およびブタのＰＲＲＳＶからなる群より選択される。
好ましい態様において、ウイルスはＰＲＲＳＶである。
ワクチン産生
上述の方法を用いて、ワクチン産生または診断のため、ウイルスを産生することも可能である。
死菌（不活化）または生ワクチンを産生することも可能である。したがって、生ワクチンを作製するため、ウイルス単離体、あるいはその弱毒化または突然変異変異体を細胞培養中で増殖させる。当該技術分野に周知の方法にしたがって、ウイルスを採取する。次いで、ウイルスを濃縮し、凍結し、そして−７０℃で保存するか、または凍結乾燥して、そして４℃で保存することも可能である。ワクチン接種前に、ウイルスを適切な投薬量で（ｍｌあたり約１０３〜１０８組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ））、生理食塩水などの薬学的に許容しうるキャリアーと、そして場合によってアジュバントと混合する。
産生されるワクチンはまた、本発明の方法によって増殖させたウイルスを含む、不活化または死菌ワクチンを含むことも可能である。不活化ワクチンは、当該技術分野に周知の方法によって作製される。例えば、ウイルスをひとたび高い力価に増殖させたら、当該技術分野に周知の方法によってウイルス抗原量を得ることも可能であることが、当業者には容易に明らかであろう。例えば、希釈、濃縮、または抽出によってウイルス抗原量を得ることも可能である。これらの方法はすべて、ワクチンを産生するのに適したウイルス抗原量を得るのに使用されてきている。次いで、ホルマリン、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）、エチレンイミン二元化合物（ＢＥＩ）での処理、または当業者に知られる他の方法によって、ウイルスを不活化する。次いで、不活化ウイルスを、生理食塩水などの薬学的に許容しうるキャリアーと、そして場合によってアジュバントと混合する。アジュバントの例には、限定されるわけではないが、水酸化アルミニウム、水中油および油中水エマルジョン、ＡＭＰＨＩＧＥＮ、ＱｉｌＡなどのサポニン、並びにインターロイキン、インターフェロン、および他のサイトカインを含むポリペプチド・アジュバントが含まれる。
最終ホルムアルデヒド濃度が０．０５％になるように、３７％ホルムアルデヒドとウイルス懸濁物を混合することによって、ホルマリンによる不活化を行う。室温でおよそ２４時間持続して攪拌することによって、ウイルス−ホルムアルデヒド混合物を混合する。適切な細胞株上での増殖に関してアッセイすることによって、残りの生ウイルスに関して、不活化ウイルス混合物を試験する。
本発明のウイルス懸濁物を０．１Ｍ ＢＥＩ（０．１７５Ｎ ＮａＯＨ中の２−ブロモ−エチルアミン）と、最終ＢＥＩ濃度が１ｍＭになるように混合することによって、ＢＥＩによる不活化を行う。ウイルス−ＢＥＩ混合物を室温でおよそ４８時間持続して混合して、その後、１．０Ｍチオ硫酸ナトリウムを０．１ｍＭの最終濃度になるように添加する。混合をさらに２時間続ける。適切な細胞株上の増殖に関してアッセイすることによって、残りの生ウイルスに関して、不活化ウイルス混合物を試験する。
ＣＤ１６３を発現するように導かれたウイルス許容性細胞を用いて、生ウイルスを定量化することも可能である。当業者に周知の２つの一般的な方法は、プラークアッセイおよび限界希釈アッセイである。
本発明のＣＤ１６３発現細胞株を用いて、診断キット用のウイルス抗原を産生する目的で、ウイルスを増殖させることも可能である。例えば、ブタ血清において、ウイルスに対する抗体を検出し、そして定量化するため、感染細胞由来の溶解物（場合によってウイルス粒子の精製または選択されるウイルスタンパク質の抽出を伴う）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングすることも可能である。
ポリクローナル抗体、単一特異性抗体またはモノクローナル抗体を生成するため、場合によってウイルスタンパク質を分離した後、ＣＤ１６３発現細胞上で増殖させた生または不活化ウイルスを用いて、動物を免疫することも可能である。これらを次に、ブタ血清および他の生物学的試料において、ウイルスを検出し、そして定量化するための診断アッセイの基礎として用いることも可能である。
本発明のアッセイ
本発明は、動物がアルテリウイルス科またはアスファウイルス科のメンバーであるウイルスに感染する傾向、あるいは細胞株がアルテリウイルス科またはアスファウイルス科のメンバーであるウイルスの複製を支持する傾向を決定するための方法を提供する。いずれかの供給源から試料を得て、そしてＣＤ１６３の発現に関してアッセイする。ＣＤ１６３遺伝子発現のレベルを、ウイルスの複製を支持しないことが知られている対照のレベルと比較することも可能である。
動物の場合、試料は、試料核酸分子またはタンパク質を含むいかなる試料であることも可能であり、そして限定されるわけではないが、肺胞マクロファージ、培養細胞、生検、または他の組織調製物を含む、ＣＤ１６３を発現するいかなる身体組織から得ることも可能である。産生されるメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質のレベルのいずれかまたは両方で、発現レベルを評価することも可能である。好ましい態様において、アルテリウイルス科またはアスファウイルス科のウイルスのメンバーは、マウスのＬＤＶ、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、ブタのＰＲＲＳＶ、およびブタのＡＳＦＶからなる群より選択される。
核酸に基づくアッセイ
ＣＤ１６３レベルを決定する方法は、上述のように、核酸に基づくことも可能である。ＣＤ１６３に由来する核酸は、溶液中または固体支持体上にあることも可能である。いくつかの態様において、これらをマイクロアレイ中の単独のアレイ要素として、または他のアレイ要素分子と組み合わせたアレイ要素として、使用することも可能である。核酸に基づく方法は、一般的に、試料からのＤＮＡまたはＲＮＡの単離、およびそれに続く、当該技術分野に知られるＣＤ１６３コード配列いずれか、または配列番号１、３、５、１２、１３、１７、１８、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７と具体的に開示する配列に由来する、特異的プライマーを用いたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅を必要とする。ＤＮＡまたはＲＮＡを、当業者に周知のいくつかの方法いずれにしたがって、試料から単離することも可能である。例えば、核酸精製法が、Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， パートＩ． Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ニューヨーク州ニューヨークに記載される。１つの好ましい態様において、ＴＲＩＺＯＬ総ＲＮＡ単離試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いて総ＲＮＡを単離し、そしてオリゴｄ（Ｔ）カラムクロマトグラフィーまたはガラスビーズを用いて、ｍＲＮＡを単離する。試料核酸分子を増幅する場合、試料核酸分子を増幅し、そして低存在量転写物を含めて、元来の試料の相対存在量を維持することが望ましい。ＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｉｎ ｖｉｖｏで増幅することも可能である（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ、米国特許第５，５１４，５４５号を参照されたい）。
増幅法および標識法が、試料中の核酸分子の真の分布を変化させないことを確実にするため、試料内に対照を含むこともまた、好適である。この目的のため、相補アレイ化核酸分子へのハイブリダイゼーションに際して検出可能であることがあらかじめ決定された、ある量の対照核酸分子が試料に混入され（ｓｐｉｋｅｄ）、そして核酸分子の組成物には、対照アレイ化核酸分子と特異的にハイブリダイズする参照核酸分子が含まれる。ハイブリダイゼーションおよびプロセシング後、得られるハイブリダイゼーションシグナルは、試料に添加された対照アレイ化核酸分子の量を正確に反映しなければならない。
ハイブリダイゼーション前に、試料核酸分子を断片化することが望ましい可能性もある。断片化は、二次構造、および試料中の他の試料核酸分子または非相補的核酸分子への交差ハイブリダイゼーションを最小限にすることによって、ハイブリダイゼーションを改善する。断片化は、機械的手段または化学的手段によって実行可能である。
標識
試料核酸分子またはプローブを１以上の標識部分で標識して、ハイブリダイズしたアレイ化／試料核酸分子複合体の検出を可能にすることも可能である。標識部分は、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、生体電子工学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、視覚的手段または化学的手段によって検出することも可能な組成物を含むことも可能である。標識部分には、（３２）Ｐ、（３３）Ｐまたは（３５）Ｓなどの放射性同位体、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、蛍光マーカーおよび色素などの分光マーカー、磁気標識、連結された酵素、質量分析タグ、スピン標識、電子伝達供与体および受容体等が含まれる。好ましい蛍光マーカーには、Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が含まれる。
ハイブリダイゼーション
配列番号１、３、５、１２、１３、１７、１８、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７または当該技術分野の他のＣＤ１６３コード配列、並びにその断片の核酸分子配列を、多様な目的のため、多様なハイブリダイゼーション技術で用いることも可能である。いかなる哺乳動物ＣＤ１６３配列からハイブリダイゼーションプローブを設計する、または得ることも可能であるが、配列番号１、３、５、１２、１３、１７、１８、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７に開示する配列を利用することも可能である。こうしたプローブを、非常に特異的な領域から、または保存されたモチーフから作成し、そしてＣＤ１６３メッセージ、アレル変異体、または関連配列を定量化するプロトコルで用いることも可能である。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡであることも可能であり、そして当該技術分野に知られる哺乳動物ＣＤ１６３配列いずれかから、または配列番号１、３、５、１２、１３、１７、１８、２２、２３、２５、２６、３０として本明細書に開示する配列から、または哺乳動物遺伝子のプロモーター、エンハンサー、およびイントロンを含むゲノム配列からも得られうる。標識ヌクレオチドの存在下、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、またはＰＣＲ増幅を用いて、ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを産生することも可能である。核酸配列を含有するベクターを用いて、ＲＮＡポリメラーゼおよび標識核酸分子を添加することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡプローブを産生することも可能である。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈによって提供されるものなどの商業的に入手可能なキットを用いて、これらの方法を行うことも可能である。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、プローブのＧ＋Ｃ含量、塩濃度、および温度によって、決定される。特に、塩濃度を減少させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって、ストリンジェンシーを増加させることも可能である。膜に基づく、いくつかのハイブリダイゼーションに用いる溶液においては、ホルムアミドなどの有機溶媒を添加すると、反応がより低い温度で起こることが可能になる。１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む５ｘＳＳＣなどの緩衝液を、６０℃で用いて、低ストリンジェンシーでハイブリダイゼーションを行って、いくつかのミスマッチを含有するヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にすることも可能である。続いて、０．１％ＳＤＳを含む０．２ｘＳＳＣなどの緩衝液を、４５℃（中程度のストリンジェンシー）または６８℃（高ストリンジェンシー）いずれかで用いて、より高いストリンジェンシーで洗浄を行う。高ストリンジェンシーでは、核酸配列がほぼ完全に相補的である場合のみ、ハイブリダイゼーション複合体が安定であり続けるであろう。膜に基づく、いくつかのハイブリダイゼーションにおいて、好ましくは３５％または最も好ましくは５０％のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に添加し、ハイブリダイゼーションを行う温度を下げることも可能であるし、そしてサルコシルまたはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの他の界面活性剤およびサケ精子ＤＮＡなどのブロッキング剤の使用によって、バックグラウンドシグナルを減少させることも可能である。ハイブリダイゼーションのための構成要素および条件の選択は、当業者に周知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌ（上記）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州プレーンビューに概説されている。
典型的な高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである：５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃でのハイブリダイゼーション、そして０．１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中、６０℃３０分間２回の洗浄。Ａｕｓｕｂｅｌら（監修）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９４）， ｐｐ．６．０．３〜６．４．１０に記載されるように、温度および緩衝剤、または塩濃度の変動を通じて、同等のストリンジェンシーの条件を達成可能であることが、当該技術分野において理解される。ハイブリダイゼーション条件の修飾を、経験的に決定することも可能であるし、またはプローブの長さおよびグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対形成の割合に基づいて、正確に計算することも可能である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（監修）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）， ｐｐ．９．４７〜９．５１に記載されるように、ハイブリダイゼーション条件を計算することも可能である。
試料に既知の量で添加した特異性対照試料核酸分子に対して、特異性対照核酸分子のハイブリダイゼーションを比較することによって、ハイブリダイゼーション特異性を評価することも可能である。特異性対照アレイ化核酸分子は、対応するアレイ化核酸分子と比較して、１以上の配列ミスマッチを有することも可能である。この方式で、相補的アレイ化核酸分子のみが試料核酸分子にハイブリダイズするのか、またはミスマッチハイブリッド二重鎖が形成されるのかを決定することも可能である。
絶対的または示差的ハイブリダイゼーション形式で、ハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。絶対的ハイブリダイゼーション形式では、１つの試料由来の核酸分子を、マイクロアレイ形式で分子にハイブリダイズさせ、そしてハイブリダイゼーション複合体形成後に検出されるシグナルが、試料中の核酸分子レベルに相関する。示差的ハイブリダイゼーション形式では、２つの生物学的試料中の遺伝子セットの示差的発現を分析する。示差的ハイブリダイゼーションでは、両方の生物学的試料から核酸分子を調製し、そして異なる標識部分で標識する。２つの標識核酸分子の混合物を、マイクロアレイに添加する。次いで、２つの異なる標識からの発光を個々に検出可能である条件下で、マイクロアレイを調べる。両方の生物学的試料由来の実質的に同等の数の核酸分子にハイブリダイズする、マイクロアレイ中の分子は、区別可能な組み合わされた蛍光を生じる（Ｓｈａｌｏｎら；ＰＣＴ公報ＷＯ９５／３５５０５）。好ましい態様において、標識は、Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光体などの、区別可能な発光スペクトルを持つ蛍光マーカーである。
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄し、ハイブリダイズしていない核酸分子を取り除き、そしてハイブリダイズ可能なアレイ要素および核酸分子間の複合体形成を検出する。複合体形成を検出する方法は当業者に周知である。好ましい態様において、核酸分子を蛍光標識で標識し、そして複合体形成を示す蛍光のレベルおよびパターンの測定を、蛍光顕微鏡、好ましくは共焦点蛍光顕微鏡によって達成する。
示差的ハイブリダイゼーション実験において、２以上の異なる生物学的試料由来の核酸分子を、異なる発光波長を持つ２以上の異なる蛍光標識で標識する。特定の波長を検出する異なる光電子増倍管セットを用いて、蛍光シグナルを別個に検出する。２以上の試料中の核酸分子の相対的存在量／発現レベルを得る。
典型的には、同様の試験条件下で、１より多いマイクロアレイを用いる場合、マイクロアレイ蛍光強度を標準化して、ハイブリダイゼーション強度の変動を考慮に入れることも可能である。好ましい態様において、各マイクロアレイ上に含有される内部標準化対照由来の強度を用いて、個々のアレイ化試料核酸分子複合体ハイブリダイゼーション強度を標準化する。
ポリペプチドに基づくアッセイ
本発明は、ＣＤ１６３ポリペプチドを検出し、そして定量化するための方法および試薬を提供する。これらの方法には、電気泳動、質量分析、クロマトグラフィー法などの分析的生化学的方法、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロッティングなどの多様な免疫学的方法、アフィニティー捕捉質量分析、生物学的活性、および以下に記載し、そして本開示を再検討した際に当業者には明らかである他のアッセイが含まれる。
イムノアッセイ
本発明はまた、１以上の抗ＣＤ１６３抗体試薬を使用して、ＣＤ１６３ポリペプチドを検出する方法（すなわちイムノアッセイ）も提供する。本明細書において、イムノアッセイは、ＣＤ１６３ポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合する抗体（本明細書に広く定義されるとおりであり、そして具体的には断片、キメラおよび他の結合剤が含まれる）を利用するアッセイである。
本発明の実施に適した、いくつかのよく確立された免疫学的結合アッセイ形式が知られる（例えば米国特許第４，３６６，２４１号；第４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；および第４，８３７，１６８号を参照されたい）。例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｓａｉ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ニューヨーク（１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７版， Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ監修（１９９１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記［例えば第１４章］、並びにＡｕｓｕｂｅｌら、上記［例えば第１１章］を参照されたい。典型的には、免疫学的結合アッセイ（またはイムノアッセイ）は、分析物に特異的に結合し、そしてしばしば分析物を固相に固定する、「捕捉剤」を利用する。１つの態様において、捕捉剤は、ＣＤ１６３ポリペプチドまたは下位配列に特異的に結合する部分、例えば抗ＣＤ１６３抗体である。
通常、アッセイしようとするＣＤ１６３遺伝子産物を直接検出するか、または検出可能標識を用いて、間接的に検出する。アッセイで用いる特定の標識または検出可能基は、アッセイに用いる単数または複数の抗体の特異的結合に有意に干渉しない限り、通常、本発明の決定的な側面ではない。標識は、捕捉剤（例えば抗ＣＤ１６３抗体）に共有的に付着していることも可能であるし、またはＣＤ１６３ポリペプチドに特異的に結合する別の抗体などの第三の部分に付着していることも可能である。
本発明は、ＣＤ１６３ポリペプチドを検出する競合的および非競合的イムノアッセイの方法および試薬を提供する。非競合的イムノアッセイは、捕捉された分析物（この場合、ＣＤ１６３）の量を直接測定するアッセイである。１つのこうしたアッセイは、ＣＤ１６３ポリペプチド上の２つの干渉しないエピトープに反応性であるモノクローナル抗体を利用する、モノクローナル抗体に基づく２部位イムノアッセイである。背景情報に関しては、例えばＭａｄｄｏｘら， １９８３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １５８：１２１１を参照されたい。１つの「サンドイッチ」アッセイにおいて、捕捉剤（例えば抗ＣＤ１６３抗体）を固体支持体に直接結合させて、固定する。次いで、これらの固定された抗体が、試験試料中に存在するいかなるＣＤ１６３ポリペプチドも捕捉する。次いで、こうして固定されたＣＤ１６３ポリペプチドを、すなわち標識を所持する第二の抗ＣＤ１６３抗体に結合させることによって、標識することも可能である。あるいは、第二のＣＤ１６３抗体は標識を欠いているが、第二の抗体が得られた種の抗体に特異的な、標識された第三の抗体に結合されることも可能である。あるいは、第二の抗体をビオチンなどの検出可能部分で修飾し、これに酵素標識ストレプトアビジンなどの、第三の標識分子が特異的に結合することも可能である。
競合的アッセイにおいて、試料中に存在するＣＤ１６３ポリペプチドによって、捕捉剤（例えばＣＤ１６３抗体）から置換された（または競合により離れた（ｃｏｍｐｅｔｅｄ ａｗａｙ））、添加された（外因性）ＣＤ１６３ポリペプチドの量を測定することによって、試料に存在するＣＤ１６３ポリペプチドの量を間接的に測定する。ハプテン阻害アッセイは、競合アッセイの別の例である。このアッセイにおいて、ＣＤ１６３ポリペプチドを固体支持体上に固定する。既知の量のＣＤ１６３抗体を試料に添加し、そして次いで、試料を固定ＣＤ１６３ポリペプチドと接触させる。この場合、固定ＣＤ１６３ポリペプチドに結合した抗ＣＤ１６３抗体の量は、試料に存在するＣＤ１６３ポリペプチドの量に反比例する。抗体の固定された割合または溶液中に残存する抗体の割合いずれかを検出することによって、固定された抗体の量を検出することも可能である。この側面において、抗体が標識されている場合、検出は直接であることも可能であるし、または上述のように抗体に特異的に結合する分子に標識が結合している場合、間接的であることも可能である。
抗体に基づく他のアッセイ形式
本発明はまた、イムノブロット（ウェスタンブロット）形式を用いることによって、試料中のＣＤ１６３ポリペプチドの存在を検出し、そして定量化するための試薬および方法も提供する。別のイムノアッセイは、いわゆる「ラテラルフロークロマトグラフィー」である。ラテラルフロークロマトグラフィーの非競合型では、試料は、例えばキャピラリー作用によって、支持体を横切って移動し、そして可動標識抗体と出会い、該抗体が分析物に結合してコンジュゲートを形成する。次いで、コンジュゲートが支持体を横切り、そして固体された第二の抗体と出会い、この抗体が分析物と結合する。したがって、標識抗体を検出することによって、固定された分析物が検出される。ラテラルフロークロマトグラフィーの競合型では、分析物の標識型が、キャリアーを横切って移動し、そして固定された抗体との結合に関して、非標識分析物と競合する。試料中により多量の分析物があれば、標識分析物による結合はより少なくなり、そしてしたがって、シグナルはより弱くなる。例えばＭａｙら、米国特許第５，６２２，８７１号およびＲｏｓｅｎｓｔｅｉｎ、米国特許第５，５９１，６４５号を参照されたい。
アッセイに応じて、抗原、ターゲット抗体、または抗カテプシンＳ抗体を含む、多様な構成要素を、固体表面または支持体（例えば担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、膜、またはろ紙）に結合させることも可能である。多様な固体表面に生体分子を固定する多くの方法が当該技術分野に知られる。例えば、固体表面は、膜（例えばニトロセルロース）、マイクロタイターディシュ（例えばＰＶＣ、ポリプロピレン、またはポリスチレン）、試験管（ガラスまたはプラスチック）、ディップスティック（例えばガラス、ＰＶＣ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス等）、微量遠心分離試験管、またはガラスもしくはプラスチックビーズであることも可能である。所望の構成要素を共有結合させることも可能であるし、または非特異的結合を介して、非共有的に付着させることも可能である。
天然および合成両方の、非常に多様な有機ポリマーおよび無機ポリマーを、固体表面の材料として使用することも可能である。実例となるポリマーには、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シリコーン類、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース等が含まれる。使用可能な他の物質には、紙、ガラス、セラミックス、金属、メタロイド、半導体物質、セメント等が含まれる。さらに、タンパク質（例えばゼラチン）、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドなどの、ゲルを形成する物質も使用可能である。いくつかの水性相を形成するポリマー、例えばデキストラン、ポリアルキレングリコールまたは界面活性剤、例えばリン脂質、長鎖（１２〜１４の炭素原子）アルキルアンモニウム塩等もまた適切である。固体表面が多孔である場合、系の性質に応じて、多様な孔サイズを使用することも可能である。
質量分析
分子の質量（ｍａｓｓ）は、しばしば、分子の同定因子として使用することも可能である。したがって、質量分析法を用いて、タンパク質分析物を同定することも可能である。質量分析装置は、イオン化分析物が飛行管を通過して、そしてイオン検出装置に検出されるのに必要な時間を測定することによって、質量を測定可能である。タンパク質のための質量分析の１つの方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（「ＭＡＬＤＩ」）である。ＭＡＬＤＩにおいて、レーザーの波長のエネルギーを吸収するエネルギー吸収マトリックス物質と分析物を混合し、そしてプローブ表面に置く。マトリックスをレーザーで打つと、分析物がプローブ表面から脱離し、イオン化され、そしてイオン検出装置に検出される。例えばＨｉｌｌｅｎｋａｍｐら、米国特許第５，１１８，９３７号を参照されたい。
タンパク質のための質量分析の他の方法が、ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐ、米国特許第５，７１９，０６０号に記載される。１つのこうした方法は、アフィニティー捕捉のための増進表面（「ＳＥＡＣ」）と称され、この方法において、分析物に特異的にまたは非特異的に結合する固相アフィニティー試薬、例えば抗体または金属イオンを用いて、分析物を試料中の他の物質から分離する。次いで、捕捉された分析物を、例えばレーザーエネルギーによって固相から脱離し、イオン化し、そして検出装置によって検出する。
本発明の核酸
この例は、いくつかの新規ＣＤ１６３ポリヌクレオチドの我々の発見を開示する。本発明には、これらの新規ＣＤ１６３ポリヌクレオチドが含まれる。本発明は、新規ＣＤ１６３ポリペプチドをコードする、いくつかの単離新規ポリヌクレオチド（例えば、センス鎖および相補的アンチセンス鎖両方の、一本鎖および二本鎖両方のＤＮＡ配列およびＲＮＡ転写物、そのスプライス変異体を含む）を提供する。我々は本明細書において、ブタ、ネズミ、ヒト、イヌ、およびアフリカミドリザルＣＤ１６３ポリペプチドをコードし、そして配列番号１、５、１２、１３、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７に示す配列を含む、単離新規ポリヌクレオチドを報告する。
配列番号１、５、１２、１３、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７を開示することによって、これらの配列を得る多数の方法が当業者に提供されることを認識すべきである。例えば、配列番号１、５、１２、１３、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７に開示する配列からプローブを生成し、そしてブタ、ネズミ、ヒト、イヌ、およびアフリカミドリザルｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングして、そしてそれによって配列番号１、３、５、１２、１３、１７、１８、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７の全体、またはそのゲノム同等物を得ることも可能であろう。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（監修）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）。また例えば、配列番号５、１２、１３、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７に開示する配列が与えられたならば、ＰＣＲ増幅に適したプライマーを生成して、これらの配列に代表される配列全体を得ることが可能であることを、当業者は直ちに認識するであろう（例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈ．Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ監修， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク， １９８９；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍ．Ａ． Ｉｎｎｉｓ， Ｄａｖｉｄ Ｈ． Ｇｅｌｆａｎｄ， Ｊｏｈｎ Ｊ． Ｓｎｉｎｓｋｙ， およびＴｈｏｍａｓ Ｊ． Ｗｈｉｔｅ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク， １９９０を参照されたい）。
本発明のＤＮＡポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、および全体としてまたは一部が化学的に合成されているＤＮＡを含み、そしてまたそのアレル変異体を含むことも意図される。アレル変異体は、野生型遺伝子配列の修飾型であり、修飾は、染色体分離中の組換えから、または遺伝子突然変異を生じさせる条件への曝露から生じる。アレル変異体は、野生型遺伝子同様、天然存在配列である（ｉｎ ｖｉｖｏ操作から生じる非天然存在変異体とは対照的である）。
新規ＣＤ１６３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を配列番号５、１２、１３、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７に示す。当業者は、本発明のＤＮＡが二本鎖分子を含み、例えば、ＤＮＡのワトソン−クリック塩基対形成規則にしたがって、配列番号５、１２、１３、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７の配列から推定可能な配列を有する相補分子（「非コード鎖」または「相補体」）と共に、配列番号５、１２、１３、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７に示す配列を有する分子を含むことを容易に認識するであろう。本発明にやはり意図されるのは、当該技術分野に周知であるような普遍的遺伝暗号の縮重のため、配列番号１、３、５、１２、１３、１７、１８、２２、２３、２５、２６、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７のポリヌクレオチドと配列が異なる、配列番号２、１４、２４、２７および３２、３４、３６、３８、４０，４２、４４、４６、４８のブタ、ネズミおよびアフリカミドリザルＣＤ１６３ポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドである。したがって、本発明は、発現に際して、配列番号２、１４、２４、２７および３２のポリペプチドをコードする、他のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を意図する。ブタＣＤ１６３ポリペプチドをコードするアミノ酸残基配列が同定されたら、そして各特定のアミノ酸残基をコードするすべての３つ組コドンを知っていれば、こうしたコードＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列をすべて記載することが可能である。したがって、特定のアミノ酸に関して、単純にコドン中の変化によって特徴付けられる、本明細書に具体的に開示するもの以外のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子が、本発明の範囲内である。
アミノ酸およびそれを表す略語、記号およびコドンの表を、以下の表４に示す。
表４
Figure 2007533321
当該技術分野に周知であるように、コドンは、ｍＲＮＡおよびその対応するｃＤＮＡ分子において、ヌクレオチドの３つ組配列を構成する。コドンは、ｍＲＮＡ分子に存在する場合、塩基ウラシル（Ｕ）によって特徴付けられるが、ＤＮＡに存在する場合、塩基チミジン（Ｔ）によって特徴付けられる。ポリヌクレオチド内の同一アミノ酸残基のコドンにおける単純な変化は、コードされるポリペプチドの配列または構造を変化させないであろう。句が、特定の３ヌクレオチド配列が特定のアミノ酸いずれかを「コードする」ことを述べる場合、一般の当業者は、上の表が問題の特定のヌクレオチドを同定する手段を提供するのを認識するであろうことが明らかである。例として、特定の３ヌクレオチド配列が、スレオニンをコードする場合、上の表は、ありうる３つ組配列がＡＣＡ、ＡＣＧ、ＡＣＣおよびＡＣＵ（ＤＮＡの場合ＡＣＴ）であることを開示する。
したがって、本発明にはまた：
（ａ）配列番号１および５に示すｓｕｓＣＤ１６３ｖ１ポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号２に示すポリペプチドと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号１２または１３に示すｓｕｓＣＤ１６３ｖ２ポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号１４に示すポリペプチドと少なくとも９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号２２または２３に示すネズミＣＤ６３ｖ２ポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号２４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号２５または２６に示すネズミＣＤ１６３ｖ３ポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号２７に示すポリペプチドと少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号３０または３１に示すアフリカミドリザルＣＤ１６３ｖ２ポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号３２に示すポリペプチドと少なくとも９８％または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号３３に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号３４に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号３５に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号３６に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号３７に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号３８に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号３９に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４０に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号４１に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４２に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号４３に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４４に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号４５に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４６に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた：
（ａ）配列番号４７に示すポリヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４８に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの相補体であるポリヌクレオチド
を含む、単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明が提供するポリヌクレオチド配列情報は、当該技術分野に周知であり、そして日常的に実施される技術によって、コードされるポリペプチドを大規模に発現することを可能にする。本発明のポリヌクレオチドはまた、サザン・ハイブリダイゼーションおよび／またはノーザン・ハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む周知の技術によって、ヒト・アレル変異体および種相同体などの、関連するブタＣＤ１６３ｖ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの同定および単離も可能にする。
本明細書に開示するＣＤ１６３配列いずれかを知ることで、サザン・ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を通じて、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッサー等のＣＤ１６３制御配列をコードするゲノムＤＮＡ配列の同定もまた可能になる。
「本発明のアッセイ」と題する上のセクションに示すように、本発明のポリヌクレオチドはまた、細胞がＣＤ１６３を発現する能力を検出するか、またはＣＤ１６３発現レベルを測定するハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、上述のようなウイルス感染に対する動物の感受性を決定するのに有用な診断法の基礎となることも可能である。
ＣＤ１６３ポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチドの本明細書における開示は、一般の当業者が、全長ポリヌクレオチド断片を入手するのを容易に可能にする。したがって、本発明は、本明細書に開示するＣＤ１６３をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１５から全長の配列（この間の１つ１つの整数値を含む）の連続ヌクレオチドを含む、ＣＤ１６３コードポリヌクレオチドのユニークな断片を提供する。本発明のポリヌクレオチド（断片を含む）は、ＣＤ１６３をコードする特定のポリヌクレオチド配列にユニークな配列を含むため、したがって、非常にストリンジェントな条件下、または中程度にストリンジェントな条件下で、多様なＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにのみ（すなわち「特異的に」）ハイブリダイズするであろう。本発明のポリヌクレオチドにユニークな配列は、他の既知のポリヌクレオチドへの配列比較を通じて認識可能であり、そして当該技術分野で日常的に利用される並列プログラム、例えば公共の配列データベースで入手可能なものの使用を通じて同定可能である。こうした配列はまた、ポリヌクレオチドがハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片の数を決定するサザン・ハイブリダイゼーション分析からも認識可能である。本発明のポリヌクレオチドは、放射能標識、蛍光標識、および酵素標識を含めて、その検出を可能にする方式で標識されることも可能である。
１以上のユニークな断片ポリヌクレオチド（または上に論じるような他のＣＤ１６３ポリヌクレオチド）は、ＣＤ１６３をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するのに用いられるか、またはＣＤ１６３をコードするポリヌクレオチド配列における変動を検出するのに用いられる、キットに含まれることも可能である。本発明によりやはり利用可能になるのは、ＣＤ１６３をコードするポリヌクレオチドを認識し、そして該ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、アンチセンスポリヌクレオチドである。全長および断片のアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。本発明の断片アンチセンス分子には、（ｉ）本明細書に開示するＣＤ１６３変異体を特異的に認識し、そしてこれにハイブリダイズするもの（ＣＤ１６３をコードするＤＮＡと他の既知の分子をコードするＤＮＡの配列比較によって決定されるようなもの）が含まれる。新規ＣＤ１６３がコードするポリヌクレオチドにユニークな配列の同定は、公的に利用可能な配列データベースいずれかの使用を通じて、そして／または商業的に入手可能な配列比較プログラムの使用を通じて、推定可能である。全ゲノムにおける選択された配列のユニークさは、ハイブリダイゼーション分析によってさらに検証可能である。所望の配列を同定した後、制限消化を通じて単離するか、または当該技術分野に周知の多様なポリメラーゼ連鎖反応技術いずれかを用いて増幅することも可能である。アンチセンスポリヌクレオチドは、ＣＤ１６３ ｍＲＮＡを発現する細胞によるＣＤ１６３の発現を制御するのに特に適している。
ＣＤ１６３発現調節配列またはＣＤ１６３ ＲＮＡに特異的に結合可能なアンチセンス核酸（好ましくは１０〜２０塩基対オリゴヌクレオチド）を（例えばウイルスベクター、またはリポソームなどのコロイド性分散系によって）細胞に導入する。アンチセンス核酸は、細胞において、ＣＤ１６３ターゲットヌクレオチド配列に結合し、そしてターゲット配列の転写または翻訳を妨げる。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート・アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明による療法的使用に明確に意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、５’端で、ポリ−Ｌ−リジン、トランスフェリン、ポリリジン、またはコレステロール部分によってさらに修飾することも可能である。転写レベルまたは翻訳レベルいずれかでのブタＣＤ１６３発現の抑制は、異常なブタＣＤ１６３発現に特徴付けられる疾患の細胞モデルまたは動物モデルを生成するために、あるいは療法様式として、有用である。
上により詳細に記載されるとおり、本発明の核酸には、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが含まれる。こうしたベクターは、例えば宿主細胞において、ポリヌクレオチドを増幅し、有用な量を生じるのに有用である。他の態様において、ベクターは発現ベクターであり、該ベクター中で、本発明のポリヌクレオチドが、発現調節配列を含むポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されている。こうしたベクターは、本発明のポリペプチドの組換え体産生に有用である。
やはり上述のように、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターで（安定にまたは一過性に）形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。上述のように、こうした宿主細胞は、ウイルスの産生およびワクチンの産生に有用である。
本発明はまた、本発明の新規ポリヌクレオチドにコードされる単離ＣＤ１６３ポリペプチドも提供する。
本発明のポリペプチド
この例は、いくつかの新規ＣＤ１６３ポリペプチドの我々の発見を開示する。本発明には、配列番号２、１４、１９、２４、２７、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８に示すこれらの新規ＣＤ１６３ポリペプチドが含まれる。
したがって、本発明には、配列番号２に示す配列を持つｓｕｓ１６３ｖ１ポリペプチドを含む単離ポリヌクレオチドが含まれる。
本発明にはまた、配列番号２に示すポリペプチドと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドも含まれる。
したがって、本発明にはまた、配列番号１４に示す配列を持つｓｕｓＣＤ１６３ｖ２ポリペプチドを含む単離ポリヌクレオチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号１４に示すｓｕｓＣＤ１６３ｖ２ポリペプチドと少なくとも９９％の同一性およびまたは類似性を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号２４に示す配列を有するネズミＣＤ１６３ｖ２ポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号２７に示す配列を有するネズミＣＤ１６３ｖ３ポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号２７に示すポリペプチドと少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号３２に示す配列を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号３２に示すポリペプチドと少なくとも９８％または９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号３４に示す配列を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号３４に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号３６に示す配列を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号３６に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号３８に示す配列を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号３９に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号４０に示す配列を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号４０に示すポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号４２に示す配列を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号４２に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号４４に示す配列を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号４４に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号４６に示す配列を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号４６に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号４８に示す配列を有するポリペプチドも含まれる。
本発明にはまた、配列番号４８に示すポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性および／または類似性を有するポリペプチドも含まれる。
本発明のポリペプチドは、天然細胞供給源から単離されることも可能であるし、または化学的に合成されることも可能であるが、好ましくは、本発明の宿主細胞を伴う組換え法によって産生される。哺乳動物宿主細胞を使用すると、本発明の組換え発現産物に最適な生物学的活性を与えるために必要である可能性があるような、こうした翻訳後修飾（例えばグリコシル化、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、脂質化、およびリン酸化）が提供されると予期される。新規ＣＤ１６３ポリペプチドのグリコシル化型および非グリコシル化型が含まれる。
上述のような真核宿主および原核宿主における過剰発現は、ＣＤ１６３ポリペプチドの単離を容易にする。したがって、本発明には、配列番号２、１４、１９、２４、２７、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８に示すような単離ＣＤ１６３ポリペプチド、並びに変異体、および保存的アミノ酸置換が含まれ、標識化ポリペプチドおよびタグ化ポリペプチドが含まれる。
本発明には、「標識された」新規ＣＤ１６３ポリペプチドが含まれる。用語「標識された」は、本明細書において、酵素（例えば西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、蛍光標識（例えばフルオレセイン、ルシフェラーゼ）、および放射標識（例えば１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、および３５Ｓ）を含む適切な検出可能基いずれかを、標識しようとする化合物にコンジュゲート化するか、または共有結合することを指す。タンパク質、ペプチド、および抗体を含む、多様な化合物を標識する技術が周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２ｂ， １０３（１９７４）；Ｓｙｖａｎｅｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４， ３７６２（１９７３）；ＢｏｌｔｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３， ５２９（１９７３）を参照されたい。用語、標識された、はまた、以下に論じるように、アミノ酸タグに共有結合したポリペプチドも含むことも可能である。
さらに、本発明の新規ＣＤ１６３ポリペプチドを、間接的に標識することも可能である。これは、部分をポリペプチドに共有的に付加し、そしてそれに続いて、付加された部分への特異的結合を示す標識または標識化合物に、付加された部分をカップリングすることを伴う。間接的な標識の可能性には、ペプチドをビオチン化し、それに続いて、上記標識基の１つにカップリングしたアビジンに結合させることが含まれる。別の例は、ポリヒスチジン・タグを含むＣＤ１６３ポリペプチドと、ヒスチジン・タグに特異的な放射標識抗体をインキュベーションすることであろう。抗体がタグにかなりの親和性を有するため、ポリペプチドに対する放射能抗体の結合が、正味の効果である。
本発明はまた、新規ＣＤ１６３タンパク質の変異体（または類似体（ａｎａｌｏｇ））も含む。１つの例において、１以上のアミノ酸残基が新規ＣＤ１６３アミノ酸配列に付加されている、挿入変異体を提供する。挿入は、タンパク質のいずれかの末端または両方の末端に位置することも可能であるし、あるいは新規ＣＤ１６３タンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置することも可能である。いずれかの末端または両方の末端にさらなる残基を有する挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質が含まれることも可能である。挿入変異体には、ＣＤ１６３酸配列、またはその生物学的活性断片に、１以上のアミノ酸残基が付加されている、新規ＣＤ１６３ポリペプチドが含まれる。
したがって、挿入変異体はまた、新規ＣＤ１６３ポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端が別のポリペプチドに融合している融合タンパク質を含むことも可能である。多様なタグ・ポリペプチドおよびその対応する抗体が当該技術分野に周知である。例には、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグ・ポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ、並びに該タグに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６（１９８５）］；並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が含まれる。他のタグ・ポリペプチドには、Ｆｌａｇ−ペプチド［Ｈｏｐｐら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：１９２−１９４（１９９２）］；アルファ−チューブリン・エピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３９３−６３９７（１９９０）］が含まれる。さらに、ＣＤ１６３ポリペプチドを、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素タンパク質でタグ化することも可能である。
別の側面において、本発明は、新規ＣＤ１６３ポリペプチド中の１以上のアミノ酸残基が除去されている欠失変異体を提供する。欠失は、新規ＣＤ１６３ポリペプチドの一方の末端または両方の末端で、あるいは新規ＣＤ１６３アミノ酸配列内の１以上の残基の除去を伴って、達成されることも可能である。したがって、欠失変異体には、新規ＣＤ１６３ポリペプチドのすべての断片が含まれる。
ＣＤ１６３ポリペプチドは、膜貫通領域または膜アンカー領域を含有する。こうした膜貫通ドメインは、異種タンパク質に関連して発現される際、該異種タンパク質を膜にターゲティングするのを補助するのに有用であることを認識すべきである。いくつかの膜貫通ドメインを欠失させて、タンパク質の精製または可溶性を増進することが好適でありうることもまた、認識すべきである。ＣＤ１６３の膜貫通欠失変異体およびこれらをコードするポリヌクレオチドは、抗ウイルス療法剤として潜在的な価値がある。こうした変異体が、配列番号３７〜４０として、本明細書に具体的に開示される。
本発明にはまた、前述のポリペプチドの変異体、すなわち保存的アミノ酸置換によって参照配列と異なるポリペプチドも含まれる。
典型的な保存的置換を、「定義」と題する上記セクションの表１、２、および３に示す。
新規ＣＤ１６３ポリペプチドを部分的にまたは完全に単離することが好ましい状況において、当業者に周知の標準法を用いて、精製を達成することも可能である。こうした方法には、限定されるわけではないが、電気泳動による分離後の電気溶出、多様な種類のクロマトグラフィー（免疫アフィニティー、分子ふるい、および／またはイオン交換）、および／または高圧液体クロマトグラフィーが含まれる。いくつかの場合、完全に精製するため、これらの方法の１より多くを用いることが好ましい可能性もある。
多様な技術を用いて、新規ＣＤ１６３ポリペプチドの精製を達成することも可能である。ポリペプチドが、そのカルボキシル末端またはアミノ末端いずれかに、ヘキサヒスチジン（ＣＤ１６３／ヘキサＨｉｓ）、またはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．、コネチカット州ニューヘブン）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）などの他の小ペプチドなどのタグを含有するように合成されている場合、カラムマトリックスがタグに高い親和性を有するか、またはポリペプチドに直接、高い親和性を有する（すなわち、ＣＤ１６３を特異的に認識するモノクローナル抗体）アフィニティーカラムに、溶液を通過させることによって、該ポリペプチドを１工程プロセスで本質的に精製可能である。例えば、ポリヒスチジンは、高い親和性および特異性でニッケルに結合し、したがってニッケルのアフィニティーカラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ＴＭニッケルカラムなど）をＣＤ１６３／ポリＨｉｓの精製に用いることも可能である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， セクション１０．１１．８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク［１９９３］を参照されたい）。
精製を容易にする標識またはタグなしに、新規ＣＤ１６３ポリペプチドを調製する場合であっても、本発明の新規ＣＤ１６３を免疫アフィニティークロマトグラフィーで精製することも可能である。これを達成するためには、当該技術分野に周知の手段によって、ＣＤ１６３ポリペプチドに特異的な抗体を調製しなければならない。
本発明の新規ＣＤ１６３ポリペプチドまたはエピトープを所持する断片、類似体または細胞を、動物、好ましくは非ヒトに、日常的プロトコルを用いて投与することによって、本発明の新規ＣＤ１６３ポリペプチドに対して生成された抗体を得ることも可能である。モノクローナル抗体を調製するには、連続細胞株培養によって産生される抗体を提供する、当該技術分野に知られる技術いずれを使用することも可能である。例には、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら， ７７−９６ページ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ中， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．（１９８５）のものなどの多様な技術が含まれる。
付着するタグなしに新規ＣＤ１６３ポリペプチドを調製する場合、そして抗体がまったく入手可能でない場合、他の周知の精製法が使用可能である。こうした方法には、限定なしに、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶出と組み合わせた未変性ゲル電気泳動、および分取用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」装置／技術、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれる。いくつかの場合、２以上のこれらの技術を組み合わせて、純度増加を達成することも可能である。
本発明のポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾を所持するポリペプチドを含むことが意図されることを理解しなければならない。例えば、修飾は、共有結合性の性質であることも可能であるし、そして例えば、ポリマー、脂質、他の有機部分、および無機部分との化学結合が含まれる。
抗体
本発明にやはり含まれるのは、新規ＣＤ１６３またはその断片に特異的な抗体（例えばモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体）である。
用語「特異的」は、本発明の抗体を記載するのに使用する場合、本発明の抗体の可変領域が、もっぱらＣＤ１６３ポリペプチドを認識し、そしてこれに結合する（すなわち、新規ＣＤ１６３および他の既知のポリペプチド間に局所配列同一性、相同性、または類似性が存在しうるにもかかわらず、結合親和性が測定可能に異なるため、ＣＤ１６３ポリペプチドをこうしたポリペプチドから区別可能である）ことを示す。特異的抗体がまた、抗体の可変領域外の配列、そして特に分子の定常領域との相互作用を通じて、他のタンパク質（例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ、またはＥＬＩＳＡ技術における他方の抗体）とも相互作用可能であることが理解されるであろう。本発明の抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイが当該技術分野において周知であり、そして日常的に実施される。こうしたアッセイの包括的議論に関しては、Ｈａｒｌｏｗら（監修）， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）， 第６章を参照されたい。本発明のＣＤ１６３ポリペプチドの断片を認識し、そしてこれに結合する抗体もまた意図されるが、該抗体が、何よりもまず、新規ＣＤ１６３ポリペプチドに特異的であることが条件である。当該技術分野において周知であり、そして日常的に実施される方法いずれかを用いて、本発明の抗体を産生することも可能である。当該技術分野に知られる方法いずれかによって、非ヒト抗体をヒト化することも可能である。１つの方法では、非ヒトＣＤＲをヒト抗体またはコンセンサス抗体フレームワーク配列に挿入する。次いで、抗体フレームワークにさらなる変化を導入して、親和性または免疫原性を調節することも可能である。
本発明の抗体は、ＣＤ１６３を検出するかまたは定量化する診断目的に有用であると共に、ＣＤ１６３を精製するのにも有用である。本明細書に記載する目的いずれかのための、本発明の抗体を含むキットもまた、含まれる。一般的に、本発明のキットにはまた、抗体が免疫特異的である対照抗原も含まれる。
本発明は、限定されるわけではないが、以下の実施例によってさらに例示される。
（実施例１）
ブタＣＤ１６３を一過性トランスフェクションすると、非許容性細胞株に、ＰＲＲＳウイルス感染に対する許容性が与えられる
ブタ肺胞マクロファージ細胞由来の総ｍＲＮＡを用いて、プラスミドｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、ＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩ部位の間にｃＤＮＡをクローニングして、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーメンバーを単離し、そしてＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓）細胞株に一過性にトランスフェクションすると、ＰＲＲＳ許容性表現型が与えられる。５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２大気中、３７℃で細胞を増殖させた。１０．０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２．０μｇのプラスミドを用いて、細胞培養物に一過性にトランスフェクションした。２つ組単層に、陰性対照プラスミドｐＰＡＭＢをトランスフェクションした。このプラスミドは、挿入物を欠くｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６．１である。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを用いてトランスフェクション効率を監視した。トランスフェクションおよそ２４時間後、単層を、ＰＲＲＳウイルスの北米（単離体Ｐ１２９）または欧州（単離体９６Ｖ１９８）遺伝子型のいずれかに感染させた。ＰＲＲＳ複製を検出するため、８０％アセトンを用いて、感染およそ２４時間後に単層を固定し、そしてＦＩＴＣコンジュゲート化モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）でおよそ１時間インキュベーションした。このモノクローナル抗体は、オープンリーディングフレーム７から発現されるＰＲＲＳウイルス・ヌクレオカプシドに特異的である。１０ｘ対物レンズのＮｉｋｏｎ ＴＥ３００倒立蛍光顕微鏡を用いて、ＦＩＴＣ陽性細胞を含有する単層および陰性対照単層を写真撮影した。
トランスフェクション細胞は、ＰＲＲＳＶの北米（単離体Ｐ１２９）および欧州（単離体９６Ｖ１９８）遺伝子型の両方に許容性になることが確認された。トランスフェクションＢＨＫ細胞の多くでウイルス遺伝子の発現が検出可能であり、そして上清中に子孫ウイルスが容易に検出可能であった。挿入物を持たないベクターまたは不適切なプラスミドを用いた対照トランスフェクションは、許容性を与えなかった。
Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒバージョン１．０配列反応キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、機能するプラスミド中の挿入物を配列決定すると、公表されたブタＣＤ１６３遺伝子ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＪ３１１７１６）に非常に相同な遺伝子が明らかになった。我々が同定したｃＤＮＡは、ＡＪ３１１７１６に比較して、さらなる５’および３’非翻訳領域、並びに３点：（１）５’端近傍の７３８ｂｐの内部欠失、（２）ＡＴＧコドン上流の５’端の１５ｂｐ伸長、および（３）１０アミノ酸変化を生じると予測される１６のヌクレオチド変化で異なるオープンリーディングフレームを含有した。配列間のヌクレオチド配列同一性は９９．４％であった。新規に発見したブタＣＤ１６３配列と、先に報告された配列ＡＪ３１１７１６の並列を図１および２に示す。新規ブタＣＤ１６３変異体を「ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１」と名づけた。
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（実施例２）
プラスミドｐＣＭＶｓｕｓＣＤ１６３ｖ１の構築
プラスミドｐＣＭＶｓｕｓＣＤ１６３ｖ１の構築を以下のように行った。初代ブタ・マクロファージｃＤＮＡライブラリーにおいて、ＰＲＲＳＶ許容性を与えると同定された機能クローンが、プライマー５’ＤＳ−ＣＤ１６３（配列番号６）（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＧＧＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＧＡＡＧＡ−３’）および３’ＣＤ１６３（配列番号７）（５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＴＣＴＴ−３’）を用いた、５’および３’非翻訳領域を含むＣＤ１６３挿入物のＰＣＲ増幅のテンプレートとして働いた。プライマー５’ＤＳ−ＣＤ１６３は、ＣＤ１６３挿入物の５’端にＳａｃＩＩ制限部位を組み込み、一方、プライマー３’ＣＤ１６３は、挿入物の３’端にＸｈｏＩ制限部位を組み込む（下線）。製造者の指示にしたがって、プラチナＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１７０８−０１３）を用いて、１９０ｎｇのプラスミドテンプレートを含有する反応物を増幅した。反応物を９４℃に２分間加熱し、次いで９４℃２０秒間、５５℃３０秒間、および６８℃３．５分間を３５周期行い、その後、７２℃で７分間、最終伸長させた。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２８１０４）を用いて、生じたＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２８７０４）を用いて、生じた断片をゲル精製した。次いで、ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、その後、上述のようにゲル精製することによって消化ＰＣＲ断片を受け入れるように調製した、プラスミドｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２１２２２０）に、ＣＤ１６３ＰＣＲ断片を連結した。連結物質を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αに形質転換し、そして５０μｇ／ｍｌのカナマイシン中で増殖させることによって組換え体を選択し、そして制限分析によって同定した。生じたプラスミド「ｐＣＭＶｓｕｓＣＤ１６３ｖ１」は、真核ＣＭＶプロモーターの転写調節下にある実施例１記載の内部欠失ブタＣＤ１６３挿入物、並びに真核および原核プロモーター両方の調節下にあるネオマイシン／カナマイシン抵抗性遺伝子を含有する。
（実施例３）
ｐＲＳＶ−Ｓｃｒｉｐｔ発現ベクターおよびｐＲＳＶｓｕｓＣＤ１６３ｖ１の構築
ＲＳＶプロモーターをＰＣＲ増幅するテンプレートとして、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ＲＳＶプロモーター配列は、ｐＲｃ／ＲＳＶのヌクレオチド２０９〜６０４に含有された。順方向プライマーＰＣＩＲＳＶＬＴＲ（配列番号８）（５’−ＡＣＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＴＣＧＡＴＧＴＡＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡＴＡＣＧＣＧＴ−３’）および逆方向プライマーＶＳＲＲＴＬＳＡＣ（配列番号９）（５’ＴＴＣＣＴＴＡＣＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’）を合成した。さらなるクローニングのため、制限エンドヌクレアーゼＰｃｉＩおよびＳａｃＩ認識部位（下線）をそれぞれ５’および３’プライマーに組み込んだ。製造者の指示にしたがって、ＨｏｔＭａｓｔｅｒ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、ＰＣＲを行った。該反応物は、０．９ｎｇのｐＲｃ／ＲＳＶプラスミドテンプレートおよび上述のような各０．３μＭのプライマーを含有した。反応物を９４℃に２分間加熱し、次いで９４℃２０秒間、５２℃１０秒間、および６５℃１分間を３０周期行った。生じたＰＣＲ断片を制限酵素ＰｃｉＩおよびＳａｃＩで消化し、ゲル精製し、そしてＣＭＶプロモーター配列を除去するために同様に消化されている、プラスミドｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。最終構築物は、ＲＳＶプロモーターをマルチクローニングサイトのすぐ上流に配置し、そして「ｐＲＳＶ−Ｓｃｒｉｐｔ」と称する。
ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１挿入物を以下のようにＲＳＶプロモーターの後ろにクローニングした。制限消化（ＫｐｎＩおよびＳａｃＩＩ）によって、プラスミドｐＣＭＶｓｕｓＣＤ１６３ｖ１からｓｕｓＣＤ１６３ｖ１配列を切除し、そしてゲル精製した。やはり同じ酵素で消化しておいたｐＲＳＶ−Ｓｃｒｉｐｔにこの断片を連結し、そしてゲル精製した。連結混合物をＤＨ５α大腸菌に形質転換し、そして５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを用いて、形質転換体を選択した。正しい挿入物を含有するクローンを「ｐＲＳＶｓｕｓＣＤ１６３ｖ１」と名づけた。
（実施例４）
ブタＣＤ１６３ ｃＤＮＡのより長い変異体のクローニングおよび性質決定
ブタＣＤ１６３ｖ１配列に基づいて、全長ブタＣＤ１６３遺伝子を増幅するため、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、順方向プライマー５’ＣＤ１６３ＮｏｔＩｌｏｎｇ（配列番号１０）（５’ＣＧＧＴＣＣＧＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧ−３’）および逆方向プライマー３’ＣＤ１６３ＫｐｎＩ（配列番号１１）（５’ＣＧＧＴＴＧＧＴＡＣＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＣＣ−３’）を設計した。好適なクローニングを可能にするため、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩの制限エンドヌクレアーゼ部位（下線）を、それぞれ５’および３’プライマーに含んだ。健康なブタの肺洗浄液から採取した初代肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）から、総細胞ＲＮＡを調製した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、ＲＮＡ調製を行った。長いテンプレート用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ一工程ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を調製し、そしてＲＴ−ＰＣＲパラメータを以下のように設定した：５０℃３０分間、９４℃２分間、（９４℃３０秒間、５５℃３０秒間および６８℃４分間）を３５周期、７２℃１０分間。０．８％ ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧアガロースゲル上でＰＣＲ産物を分析した。多様なサイズのＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲルから切り出し、そしてＧｅｎｅＣｌｅａｎキット（ＱＢｉｏｇｅｎｅ）を用いてＤＮＡを抽出した。これらのＲＴ−ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。挿入物の存在に関して、制限酵素消化によってクローンを分析した。Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ バージョン１．０配列反応キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、挿入物を含有するコロニーを配列決定し、配列の信頼性を確認した。Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ＥｄｉｔＳｅｑおよびＳｅｑＭａｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、配列を編集し、そしてアセンブリさせた。巨大挿入物を持つ１つのプラスミドを「ｐＣＲｓｕｓＣＤ１６３ｖ２」（我々が配列番号１２に示したブタＣＤ１６３変異体２を含有するｐＣＲ２．１）と名づけた。配列番号１２内に含有されるコード配列を以下に再現し、そして配列番号１３に示す。配列分析によって、このブタＣＤ１６３が、我々が配列番号１４に示した１１１５アミノ酸のアミノ酸配列をコードすることが示された。ＧｅｎＢａｎｋのブタＣＤ１６３配列（寄託番号ＡＪ３１１７１６）と比較すると、我々のＣＤ１６３ｖ２配列は、アミノ酸レベルで９８．９％同一である。ＣＤ１６３ｖ２はまた、最も先端の５’端にさらに５アミノ酸残基を有し、オープンリーディングフレームを、インフレームの上流ＡＴＧ開始コドンにまで拡張している（実施例１に記載するブタＣＤ１６３ｖ１配列同様）。ブタＣＤ１６３は、アミノ酸レベルで、ヒトＣＤ１６３（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｚ２２９６８）と８４．３％同一であり、そしてマウスＣＤ１６３（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ２７４８８３）と７３．７％同一である。配列番号１４の予測されるシグナル配列および膜貫通領域を、それぞれ下線および太字によって示す。他のＣＤ１６３配列が類似の配列特徴を含有するかどうかは、配列を検査することによって容易に決定される。
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ｐＣＲｓｕｓＣＤ１６３ｖ２中のｓｕｓＣＤ１６３ｖ２を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてゲル精製して、ｐＣＲ２．１ベクターから遊離させた。レシピエント・ベクターｐＣＭＶ−ｓｃｒｉｐｔもまた、同じ制限酵素対で切断し、そしてｓｕｓＣＤ１６３ｖ２のｐＣＭＶ−ｓｃｒｉｐｔへの定方向クローニングを可能にした。ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２をｐＣＭＶ−ｓｃｒｉｐｔと連結した後、連結混合物を用いて、ＳＴＢＬ ２大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。制限酵素消化分析によって、１つの形質転換体が、ＣＤ１６３遺伝子を含有することが見出され、そしてこれをｐＣＭＶ−ｓｃｒｉｐｔ ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２クローン＃３と名づけた。
（実施例５）
直接連結およびトランスフェクション法による、ＲＳＶプロモーターに基づく発現系の調製
ＲＳＶプロモーターからＣＤ１６３を発現する安定細胞株を生成する際に使用するのに適した、マイクログラム量の直鎖ＤＮＡを生成する、クローニングに基づかない方法を開発した（図４）。該方法は、一方はｐＲＳＶ−ｓｃｒｉｐｔ由来のネオマイシン遺伝子およびＲＳＶプロモーターカセットを含有し、そして他方はｐＣＭＶｓｕｓＣＤ１６３ｖ２由来のｓｕｓＣＤ１６３ｖ２コード配列を含有する、２片のＤＮＡの単離および連結を伴う。ベクタープラスミドｐＲＳＶ−Ｓｃｒｉｐｔを、ネオマイシン遺伝子上流のＤｒａＩＩＩで直鎖化し、そして大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で平滑化した。次いで、このプラスミドを、ＲＳＶプロモーターのすぐ下流のＮｏｔＩで消化した。ｐＣＭＶｓｕｓＣＤ１６３ｖ２クローンを、ＣＤ１６３挿入物下流のベクター配列中、ＤｒｄＩで消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で平滑化した。ＣＤ１６３コード配列を、ＣＤ１６３コード配列のすぐ上流に位置するＮｏｔＩで、ベクターから遊離させた。各プラスミド消化に関して、アガロースゲルから適切な断片を精製した。大規模連結反応を以下のように行った。およそ２０μｇの各ＤＮＡ断片を、１５単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼと、６００μｌ体積中でインキュベーションした。反応物を室温で２０分間インキュベーションし、この時点で、アリコットを取り除き、そしてドライアイス上で反応物を凍結させた。アリコットのアガロースゲル分析によって、かなりの量の非連結ＤＮＡが残っていることが明らかになり、したがって、さらに１５単位のリガーゼを添加し、そして室温でさらに１０分間インキュベーションした。連結後、アガロースゲル電気泳動によって、適切な要素すべてを含有するＤＮＡの直鎖片を精製した。付着性ＮｏｔＩ末端を介した２つのＤＮＡ断片の連結によって、ＲＳＶプロモーター下流にＣＤ１６３遺伝子の５’配列が配置され、哺乳動物細胞においてＣＤ１６３の発現を導くことが可能になった。いったん単離し、精製ＤＮＡを用いて、多様な哺乳動物細胞株をトランスフェクションした。
（実施例６）
ヒトＣＤ１６３ ｃＤＮＡのクローニングおよび性質決定
既知のヒトＣＤ１６３ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＣ０５１２８１）に基づいて、ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔプログラムを用い、順方向プライマーＨｕ５’Ｎｏｔ（配列番号１５）（５’ＣＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＡＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＣＴＣＡＧＡＡＴＧＧ−３’）および逆方向プライマーＨｕ３’Ｋｐｎ（配列番号１６）（５’−ＴＧＣＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＴＣＴＴＡ−３’）を設計した。５’および３’プライマーに、それぞれ、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩの制限部位（下線）を取り込んで、発現ベクターへのクローニングを容易にした。配列ＣＡＣＣを５’プライマーの５’端に付加して、ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５／Ｈｉｓ／ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４９００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、図６を参照されたい）への定方向クローニングを可能にした。Ｕ９３７細胞株をホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（１００ｎｇ／ｍｌ）で３日間刺激した後、該細胞株から抽出したＲＮＡから、ヒトＣＤ１６３ ｃＤＮＡを増幅した。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、総細胞ＲＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲ反応および配列決定法は、実施例４に記載したものと同じであった。０．８％ ＳｅａＫｅｍアガロースゲル上でＰＣＲ産物を分離し、そしてＧｅｎｅＣｌｅａｎキットを用いて、ゲルから抽出した。製造者の指示にしたがって、ＰＣＲ産物を、ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５／Ｈｉｓ／ＴＯＰＯベクターに、定方向でクローニングした。巨大挿入物を持つ２つのクローンを配列決定した。配列決定および配列分析法を、実施例４に記載した。正しい挿入物を持つクローンを「ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２」と名づけ、そして我々は挿入物の配列を配列番号１７に示した。
ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２中のＣＤ１６３オープンリーディングフレームは、長さ１１２１残基であり（これを配列番号１８に示し、該配列は、以下に開示する配列番号１９をコードする）、そしてＧｅｎｂａｎｋ Ｚ２２９６８（同じ長さのヒトＣＤ１６３ ｃＤＮＡ）に１００％同一である。我々のヒトＣＤ１６３ｖ２配列はまた、Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＣ０５１２８１およびＺ２２９６９（ヒトＣＤ１６３のスプライス変異体）中の４２の非相同残基が、我々の配列では７つのカルボキシ末端残基で置換されていることを除いて、２つのＧｅｎｂａｎｋ配列にも１００％同一である。この相違は、ＢＣ０５１２８１およびＺ２２９６９には８３ヌクレオチドのエクソンが存在し、そして該エクソンの３’端でフレームシフトが生じるためである（Ｌａｗ， Ｓ．Ｋ．， Ｍｉｃｋｌｅｍ， Ｋ．Ｊ．， Ｓｈａｗ， Ｊ．Ｍ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ．Ｐ．， Ｄｏｎｇ， Ｙ．， Ｗｉｌｌｉｓ， Ａ．Ｃ．およびＭａｓｏｎ， Ｄ．Ｙ．（１９９３）Ａ ｎｅｗ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３（９）， ２３２０−２３２５）。
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（実施例７）
ネズミＣＤ１６３のクローニングおよび性質決定
ＧｅｎＢｎｋのネズミＣＤ１６３配列（ＡＦ２７４８８３）に基づいて、ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔプログラムを用い、順方向プライマー、Ｍｕｓ−ｎｅｗ５’（配列番号２０）（５’−ＣＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡ−３’）および逆方向プライマー、Ｍｕｓ−ｎｅｗ３’（配列番号２１）（５’−ＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＡＣＡＡＧＣＡＡＡＣＣＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＡＴＴＣＣＣＴＣ−３’）を設計した。５’プライマーおよび３’プライマーそれぞれに、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、他の発現ベクターへのさらなるクローニングを可能にした。チオグリコレート培地を腹腔に注入して、２日後、マウス腹腔マクロファージを採取した。ＲＮｅａｓｙキットを用いて、腹腔マクロファージから総細胞ＲＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲパラメータは、アニーリング温度を６０℃に上昇させ、そして伸長温度を７２℃に上昇させたことを除いて、実施例４に記載するものと同じであった。０．８％ ＳｅａＫｅｍアガロースゲル上でＰＣＲ産物を精製し、そして製造者の指示にしたがって、ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５／Ｈｉｓ／ＴＯＰＯベクターに、定方向でクローニングした。さらなる分析のため、巨大挿入物を含むいくつかのクローンを同定した。Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ２７４８８３と同じ長さ（１１２１アミノ酸の配列番号２４）のタンパク質をコードし、そして２アミノ酸のみが異なる（９９．８％同一性）ネズミＣＤ１６３を持つ挿入物（配列番号２２）を含有するプラスミドを、「ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ−ｍｕｒＣＤ１６３ｖ２」と名づけた。
長さ１１５９アミノ酸（配列番号２７）のタンパク質をコードする、ネズミＣＤ１６３コード配列（配列番号２６）を含有する挿入物（配列番号２５）を含有する、別のプラスミド「ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ−ｍｕｒＣＤ１６３ｖ３」が生成された。該挿入物は、最初の１１０７残基中では３アミノ酸のみがＡＦ２７４８８３と異なった（９９．７％同一性）が、残基１１０８以降、配列は完全に異なった。これはｃＤＮＡに８２ヌクレオチドが挿入され、そして同時に挿入下流の読み枠にはシフトが生じるためである。その結果、ネズミＣＤ１６３ｖ３は、カルボキシ末端に、ネズミＣＤ１６３ｖ２の１４のカルボキシ末端残基と相同でない、５２アミノ酸を含有する。「全長」ネズミＣＤ１６３のこれらの２つの代替型は、ヒトＣＤ１６３に関して記載されてきているように、同じ遺伝子のスプライス変異体である可能性が最も高い（Ｌａｗ， Ｓ．Ｋ．， Ｍｉｃｋｌｅｍ， Ｋ．Ｊ．， Ｓｈａｗ， Ｊ．Ｍ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ．Ｐ．， Ｄｏｎｇ， Ｙ．， Ｗｉｌｌｉｓ， Ａ．Ｃ．およびＭａｓｏｎ， Ｄ．Ｙ．（１９９３）Ａ ｎｅｗ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３（９）， ２３２０−２３２５）。
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（実施例８）
ＭＡＲＣ−１４５ ＣＤ１６３のクローニングおよび性質決定
順方向プライマー、５’サルＣＤ１６３（配列番号２８）（５’−ＣＡＣＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＣＴＣＡＧＡＡＴＧＧ−３’、ヒトＣＤ１６３に基づく）および逆方向プライマー、ＨｕＣＤ１６３−３’Ｋｐｎ（配列番号２９）（５’−ＴＧＣＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＴＣＴＴＡ−３’）を用いて、ＭＡＲＣ−１４５アフリカミドリザル腎臓細胞からＣＤ１６３ ｃＤＮＡを増幅した。ＲＮｅａｓｙキットを用いて、ＭＡＲＣ−１４５細胞から総細胞ＲＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲパラメータは実施例４に記載するものと同じであった。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがって、ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５／Ｈｉｓ／ＴＯＰＯベクターに定方向でクローニングした。巨大挿入物を含有するいくつかのクローンを分析した。クローン＃２５を「ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ−ＭＡＲＣ−ＣＤ１６３ｖ２」と名づけた。ＭＡＲＣ−１４５細胞由来のこの新規ＣＤ１６３ ｃＤＮＡは、長さ１１１６アミノ酸である。ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の配列と比較すると、ＭＡＲＣ−１４５ ＣＤ１６３アミノ酸配列は、ヒトＣＤ１６３（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｚ２２９６８）と９６．３％同一であり、ブタＣＤ１６３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＪ３１１７１６）と８４．７％同一であり、そしてマウスＣＤ１６３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ２７４８８３）と７３．９％同一である。
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（実施例９）
Ｖｅｒｏ細胞由来のサルＣＤ１６３のクローニングおよび性質決定
順方向プライマー、５’サルＣＤ１６３（配列番号２８）（５’−ＣＡＣＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＣＴＣＡＧＡＡＴＧＧ−３’、ヒトＣＤ１６３に基づく）および逆方向プライマー、ＨｕＣＤ１６３−３’Ｋｐｎ（配列番号２９）（５’−ＴＧＣＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＴＣＴＴＡ−３’）を用いて、Ｖｅｒｏ細胞からＣＤ１６３ ｃＤＮＡを増幅した。ＲＮｅａｓｙキットを用いて、総細胞ＲＮＡをＶｅｒｏ細胞から調製した。ＲＴ−ＰＣＲパラメータは、実施例４に記載したものと同じであった。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがって、ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５／Ｈｉｓ／ＴＯＰＯベクターに定方向でクローニングした。巨大挿入物を含有する８つのクローンを配列決定し、そして６つの別個のスプライシングパターンを見出した。これらのパターンを図１７に図式的に示す。
６つのスプライシング変異体は、Ｅ６、Ｅ１０５、およびＥ８３と称される３つのエクソンの存在または非存在が異なる。Ｅ６またはＥ１０５を省いても、読み枠は変化しないが、Ｅ８３を省くと変化する。ｖ２および／またはｖ３に似たパターンが、ブタ、ネズミ、ヒト、およびＭＡＲＣ−１４５サル細胞でもまた見られた。パターンｖ４およびｖ５は、疎水性膜貫通領域をコードする１０５ヌクレオチドエクソンを欠く。これらのｃＤＮＡは、一過性トランスフェクションアッセイにおいて、ＢＨＫ細胞をＰＲＲＳＶ感染に許容性にすることができず、これはおそらく、該ＣＤ１６３が膜結合であり続けるのでなく分泌されるためであろう。膜貫通領域を欠くＣＤ１６３分子は、細胞性の許容性因子として機能しないようであるが、直接ウイルス中和（中和抗体と同様）において、または宿主動物における、ウイルス感染を遮断する抗ＣＤ１６３抗体を誘導するための免疫原としてのいずれかで、有用性を有しうる。
最長のスプライス変異体ｖ７は、３つのエクソン、Ｅ６、Ｅ１０５、およびＥ８３のすべてを含有する。Ｖｅｒｏ細胞由来のこの新規ＣＤ１６３ ｃＤＮＡは、長さ１１５３アミノ酸のポリペプチドをコードする。Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中の配列に比較した際、Ｖｅｒｏ ＣＤ１６３ｖ７アミノ酸配列は、ヒトＣＤ１６３（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｚ２２９６８）に９５．４％同一であり、ブタＣＤ１６３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＪ３１１７１６）に８３．７％同一であり、そしてマウスＣＤ１６３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ２７４８８３）に７２．１％同一である。Ｖｅｒｏ細胞中の６つのスプライス変異体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を以下に提供する（配列番号３３〜４４）。
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（実施例１０）
ＤＨ８２細胞由来のイヌＣＤ１６３のクローニングおよび性質決定
順方向プライマー、５’サルＣＤ１６３（配列番号２８）（５’−ＣＡＣＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＣＴＣＡＧＡＡＴＧＧ−３’、ヒトＣＤ１６３に基づく）および逆方向プライマー、ＨｕＣＤ１６３−３’Ｋｐｎ（配列番号２９）（５’−ＧＣＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＴＣＴＴＡ−３’）を用いて、ＤＨ８２細胞からＣＤ１６３ ｃＤＮＡを増幅した。ＲＮｅａｓｙキットを用いて、ＤＨ８２細胞から総細胞ＲＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲパラメータは実施例４に記載するものと同じであった。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがって、ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５／Ｈｉｓ／ＴＯＰＯベクターに定方向でクローニングした。巨大挿入物を含有するいくつかのクローンを分析した。巨大挿入物を持ついくつかのクローンを分析し、そしてこれらは、他の種に見られるｖ２またはｖ３スプライシングパターンのいずれかに分類された。ｖ２変異体は、ｖ３変異体に比較して、８１ヌクレオチドエクソン（Ｅ８１）を欠き、この結果、読み枠シフトおよび別のカルボキシ末端アミノ酸配列が生じる。ＤＨ８２細胞由来のイヌＣＤ１６３ｖ２ ｃＤＮＡは、１１１５アミノ酸のペプチドをコードする。Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中の配列と比較すると、該ｃＤＮＡは、ヒトＣＤ１６３（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｚ２２９６８）と８３．９％同一であり、ブタＣＤ１６３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＪ３１１７１６）と８５．１％同一であり、そしてマウスＣＤ１６３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ２７４８８３）と７４．３％同一であった。ＤＨ８２細胞に見られる２つのスプライス変異体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を以下に提供する（配列番号４５〜４８）。
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（実施例１１）
ｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１の一過性トランスフェクション後、多数の細胞株が北米ＰＲＲＳＶ感染に対して許容性になる
ブタ腎臓（ＰＫ０３２４９５）、Ｎｏｒｄｅｎ Ｌａｂｓブタ精巣（ＮＬＳＴ−１）、Ｎｏｒｄｅｎ Ｌａｂｓイヌ腎臓（ＮＬＤＫ−１）をＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．から得て、そして３７℃および５％ＣＯ２で、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）からなる増殖培地中で増殖させた。細胞株、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ２１）、Ｎｏｒｄｅｎ Ｌａｂｓネコ腎臓（ＮＬＦＫ−１）、およびウサギ肺（ＲＬ）をＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．から得て、そして３７℃および５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）からなる増殖培地中で増殖させた。Ｖｅｒｏ細胞をＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．から得て、そして３７℃および５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１ｍｌあたり２０マイクログラムのゲンタマイシンを補った最小必須培地アルファ（ＭＥＭ、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．配合物）からなる増殖培地中で増殖させた。およそ１ｘ１０６細胞を含有する細胞培養ウェル（３５ｍｍ）に、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、ＦＢＳもまた抗生物質も含まないＤＭＥＭ中、ウェルあたり２マイクログラムのプラスミドｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１をトランスフェクションした。細胞株ＲＬに、ウェルあたり１．０マイクログラムのプラスミドｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１をトランスフェクションした。ｐＰＡＭＢ（基本的で、そして空のｐＳｐｏｒｔプラスミドベクター）と称される、挿入物を含まないＰＡＭ細胞ｃＤＮＡライブラリーのメンバーを、陰性対照プラスミドとして用いた。トランスフェクション２４時間後、ウェルを吸引し、そしてＤＭＥＭ／５％ ＦＢＳで２回洗浄し、その後、北米ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させた。ウイルスを０．５ｍｌの増殖培地に最短２時間吸着させ、その後、さらに培地を添加して最終体積２．０ｍｌにし、そして一晩インキュベーションした。次いで、ウイルスを取り除き、増殖培地で２回、ウェルを洗浄し、そして新鮮な増殖培地を添加した（ウェルあたり２．０ｍｌ）。接種材料由来の感染性ウイルスのバックグラウンドレベルを決定するため、０時間の培養液試料を直ちに採取した。最短で感染４８時間後に、生存ウイルスをアッセイするため、培養液を取り除くことによって、許容性に関して培養物をスクリーニングし、そして蛍光抗体アッセイ（ＦＡ）によって、単層中の許容性細胞を検出した。単層を８０％アセトンで固定し、そしてＰＲＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質に特異的であるＦＩＴＣコンジュゲート化モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）で染色することによって、ＦＡを完了させた。培養液の希釈物をＭＡＲＣ−１４５細胞上に接種することによって、生存ウイルスを力価決定した。表５は、ＦＡによるウイルス感染の結果、および試験した各細胞株の子孫ウイルスの存在を示す。
いくつかの細胞株から子孫ウイルスを検出できなかったのは、細胞培養液のウイルス力価が、アッセイの検出限界以下の低さであった結果である可能性もある。ＰＲＲＳＶ感染に対するＶｅｒｏ細胞の許容性は、ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１の発現によって増大した。バックグラウンドウイルスの０時間の測定に比較して、ｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１をトランスフェクションしたＶｅｒｏ細胞では、ウイルス力価に、ほぼ２ ｌｏｇの増加があり、一方、陰性対照プラスミドｐＰＡＭＢをトランスフェクションした細胞では、１ ｌｏｇ未満の力価増加しかなかった。ＮＬＤＫ−１を除くすべての細胞株は、ｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１のトランスフェクション後、北米ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９感染に対する許容性に関して、ＦＡによると陽性であった。
表５
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＋＋＋＝非常に陽性
＋＋＝中程度に陽性
＋＝わずかに陽性
−＝検出不能
ＮＴ＝未試験
（実施例１２）
ｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１の一過性トランスフェクション後、ＢＨＫ２１細胞は、欧州ＰＲＲＳＶ感染に対して許容性になる
細胞株、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ２１）をＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．から得て、そして３７℃および５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）からなる増殖培地中で増殖させた。およそ１ｘ１０６細胞を含有する細胞培養ウェル（３５ｍｍ）に、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、ＦＢＳもまた抗生物質も含まないＤＭＥＭ中、ウェルあたり２マイクログラムのプラスミドｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１をトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、ウェルを吸引し、そしてＤＭＥＭ／５％ ＦＢＳで２回洗浄し、その後、欧州ＰＲＲＳＶ単離体９６Ｖ１９８に感染させた。ウイルスを最短２時間吸着させた。次いで、ウイルスを取り除き、増殖培地で２回、ウェルを洗浄し、そして新鮮な増殖培地を添加した（ウェルあたり２．０ｍｌ）。接種材料由来の感染性ウイルスのバックグラウンドレベルを決定するため、０時間の培養液試料を直ちに採取した。最短で感染４８時間後に、生存ウイルスをアッセイするため、培養液を取り除くことによって、許容性に関して培養物をスクリーニングし、そして蛍光抗体アッセイ（ＦＡ）によって、単層中の許容性細胞を検出した。単層を８０％アセトンで固定し、そしてＰＲＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質に特異的であるＦＩＴＣコンジュゲート化モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）で染色することによって、ＦＡを完了させた。培養液の希釈物をＭＡＲＣ−１４５細胞上に接種することによって、生存ウイルスを力価決定した。ｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１のＢＫＨ２１への一過性トランスフェクションの結果、細胞は欧州ＰＲＲＳＶ単離体９６Ｖ１９８感染に対して許容性になり、そして子孫ウイルスを生じた。
（実施例１３）
多数の動物種由来のＣＤ１６３遺伝子が、ＢＨＫ２１細胞をＰＲＲＳウイルス感染に対して許容性にする
１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および抗生物質を補ったＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）中で増殖させたＢＨＫ２１細胞を、一過性トランスフェクション実験で用いた。トランスフェクション前に、血清もまた他の添加物も含まないＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を１回洗浄した。製造者によって提供されたプロトコルにしたがって、すべてのトランスフェクション実験にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。トランスフェクション混合物は、３５ｍｍウェルあたり、１０マイクロリットルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００および２〜３マイクログラムのＤＮＡからなった。一晩インキュベーションした後、トランスフェクション培地を取り除き、そして細胞をＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させた。感染を２４〜４８時間進行させ、その時点で細胞を８０％アセトンで固定し、そしてＦＩＴＣコンジュゲート化モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、サウスダコタ州ブルッキングス）で染色した。蛍光顕微鏡下で、ヌクレオカプシドタンパク質の染色を視覚化した。
表６．多様なＣＤ１６３遺伝子をＢＨＫ２１細胞に一過性トランスフェクションすると、細胞がＰＲＲＳウイルス感染に対して許容性になる
Figure 2007533321
＋＋＋＝非常に陽性
＋＋＝中程度に陽性
＋＝わずかに陽性
（実施例１４）
ｐＣＭＶ−ｓｕｓ１６３ｖ１を用いたＰＲＲＳＶ許容性ＢＨＫ２１安定細胞株の生成
１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および抗生物質を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＢＨＫ−２１細胞を増殖させた。トランスフェクションのため、６ウェルプレート中、およそ９０％の集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）で細胞を植え付け、そして５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベーションした。製造者の指示にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１ ＤＮＡを細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション１日後、細胞をトリプシン処理して、そして一連の希釈で、９６ウェルプレート中、再度植え付けた。安定トランスフェクタントに関して選択するため、この時点から先は、培地に１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８硫酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０１３１−０２７）を補った。３〜５日ごとに培地を交換した。単細胞に由来するコロニーを含むウェルが集密に到達するまでプレートを培養し、この時点でプレートをトリプシン処理し、そして２つ組９６ウェルプレートに植え付けた。２つ組９６ウェルプレートの一方をＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させて、そしてＦＩＴＣコンジュゲート化モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７で染色することによって、感染に対して許容性であるクローンを同定した。次いで、陽性クローンを第二の２つ組プレートから増殖させた。均一であることを確実にするため、陽性培養物を限界希釈によって、単細胞クローニングした。各クローニングの際、確たる増殖および高いＰＲＲＳＶ許容性を示すサブクローンを増殖のために選択した。ＢＨＫ／ＣＭＶ／ｖ１ ＃３、ＢＨＫ／ＣＭＶ／ｖ１ ＃５、およびＢＨＫ／ＣＭＶ／ｖ１ ＃１２（図６）と称される３つのクローンを選択した。これらの細胞株は、第２０継代まで許容性の表現型を維持した。
（実施例１５）
ｐＲＳＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１を用いたＰＲＲＳＶ許容性ＢＨＫ２１安定細胞株の生成
実施例１４に記載するように、ＢＨＫ−２１細胞を培養した。実施例１４に記載するように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、ｐＲＳＶｓｕｓＣＤ１６３ｖ１をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした。本質的に実施例１４に記載するように、トランスフェクション細胞のクローニングおよび許容性クローンに関するスクリーニングを行った。最初のクローニングから、３つの単細胞クローンを許容性と同定し、そして続いて、さらに２回、再クローニングして、均一であることを確実にし、そしてより高い許容性のサブクローンを単離することを試みた（図７を参照されたい）。生じた細胞株をＢＨＫ／ＲＳＶ／ｖ１、＃２、＃３、および＃４と名づけた。これらのクローンはすべて、試験した最高の継代（クローン＃２では第１１継代、クローン＃３では第７継代、およびクローン＃４では第５継代）まで許容性表現型を維持した。
（実施例１６）
ｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１を用いたＰＲＲＳＶ許容性ネコ腎臓安定細胞株の生成
親Ｎｏｒｄｅｎ Ｌａｂｓネコ腎臓（ＮＬＦＫ）細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および抗生物質を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎカタログ番号１１９６５−０９２）中で増殖させた。各々およそ２ｘ１０６細胞を含有するいくつかの３５ｍｍウェルに、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、ＯｐｔｉＭＥＭ中、ウェルあたり４マイクログラムのｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１をトランスフェクションした。一晩インキュベーションした後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＴ１０４）を用いて、細胞を支持体から取り除き、培地中で希釈して、そして３つの密度で３つの９６ウェルプレートに植え付けた（ウェルあたりおよそ２ｘ１０２、２ｘ１０３、および２ｘ１０４細胞）。安定形質転換体の選択を開始する前に、細胞を３７℃で一晩定着させた。翌朝、５００マイクログラム／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８硫酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０１３１−０２７）を含有する１００マイクロリットル／ウェルの新鮮培地で培地を交換して、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞に関して選択した。ジェネティシン強度を維持するため、２または３日ごとに培地を交換した。選択１９日後、最初の細胞密度が最低（およそ２００細胞／ウェル）だった９６ウェルプレートは、７０の空のウェル、およびＧ４１８耐性細胞の１以上のコロニーを含む２６のウェルを生じた（ポワソン分布を用いると、耐性細胞の計算上の数／ウェルは０．３である）。これらの２６ウェルを２つ組ウェルに分け、そして一晩定着させた。１組のウェルをＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させ、２４時間インキュベーションし、次いで、８０％アセトンで固定し、そしてＰＲＲＳＶヌクレオカプシドに特異的なＦＩＴＣコンジュゲート化モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）で染色した。２６のクローンのうち、８つがＰＲＲＳＶに感染した細胞をいくつか含有した。「ＮＬＦＫ−ＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１−Ｇ４」と称される、これらのうちの１つは、他のものより明らかにより許容性であり、ほぼ１００％の細胞がウイルス抗原に関して陽性に染色された。
細胞継代数５までに、ＮＬＦＫ−ＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１−Ｇ４細胞株には、表現型不均一性のいくつかの証拠があった。したがって、ＮＬＦＫ−ＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１−Ｇ４第４継代の凍結ストックから始めて、Ｇ４１８含有培地中で限界希釈することによって、細胞を単細胞クローニングした。１２のこうしたクローン（「Ａ」〜「Ｌ」）を、研究のため増殖させた。これらのうち、クローンＮＬＦＫ−ＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１−Ｇ４ＦおよびＮＬＦＫ−ＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１−Ｇ４Ｌは、ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させた際、別個のプラーク（ＣＰＥの局在領域）を形成する能力に関して、注目に値した（図８を参照されたい）。
（実施例１７）
ｐＲＳＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１を用いたＰＲＲＳＶ許容性ネコ腎臓安定細胞株の生成
Ｎｏｒｄｅｎ Ｌａｂｓネコ腎臓（ＮＬＦＫ）細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を補った最小必須培地アルファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２５７１−０７１）中で増殖させた。ＮＬＦＫ細胞をおよそ９０％の集密度で６ウェルプレート中に植え付け、そして一晩付着させた。次いで、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、プラスミドｐＲＳＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１を細胞にトランスフェクションした。２４時間後、実施例１４に記載するように、細胞をクローニングした。実施例１４に記載するように、ＰＲＲＳＶ許容性細胞クローンに関するスクリーニングを行った。スクリーニングから４つのクローンを選択し、そしてさらに２回、限界希釈することによって、単細胞クローニングした。ＦＫ／ＲＳＶ／ｖ１ ＃１、ＦＫ／ＲＳＶ／ｖ１ ＃２、ＦＫ／ＲＳＶ／ｖ１ ＃３、およびＦＫ／ＲＳＶ／ｖ１ ＃４と称される４つのクローンを選択した。これらの細胞株は、少なくとも８継代を通じて、ＰＲＲＳＶ許容性表現型を維持した（図９を参照されたい）。
（実施例１８）
ｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１を用いたＰＲＲＳＶ許容性ブタ腎臓安定細胞株の生成
親ブタ腎臓（ＰＫ０３２４９５）細胞をＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．から得て、そして３７℃および５％ＣＯ２で、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）からなる増殖培地中で増殖させた。各々およそ１ｘ１０６細胞を含有する細胞培養ウェル（３５ｍｍ）に、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、ＦＢＳもまた抗生物質も含まないＤＭＥＭ中、ウェルあたり２マイクログラムのプラスミドｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１をトランスフェクションした。一晩インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＴ１０４）を用いて、細胞を支持体から取り除き、そして１ｍｌあたり１．０ミリグラムのジェネティシン（Ｇ４１８硫酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０１３１−０２７）を含有する増殖培地中で希釈し、そして多様な密度で９６ウェルプレートに植え付けて、ジェネティシン選択後の単細胞クローンの回収を確実にした。ジェネティシン選択の間中、およそ３〜５日ごとに培地を交換した。選択後、単細胞クローンを含有するウェルを、２つ組９６ウェルプレートに拡大して、そして１００％集密が達成されるまでインキュベーションした。最低４８時間、ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させることによって、１組のウェルをＰＲＲＳＶ許容性に関してスクリーニングした。１１のクローンがＰＲＲＳＶに関して許容性であることが見出された。「ＰＫ−ＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１−Ａ１０」と称されるこれらの１つは、多数の継代後、明らかに許容性表現型を維持した（図１０を参照されたい）。
（実施例１９）
ｐＣＭＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２を用いたＰＲＲＳＶ許容性ＢＨＫ２１安定細胞株の生成
親ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ２１）細胞をＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．から得て、そして３７℃および５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）からなる増殖培地中で増殖させた。各々およそ１ｘ１０６細胞を含有する細胞培養ウェル（３５ｍｍ）に、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、ＦＢＳもまた抗生物質も含まないＤＭＥＭ中、ウェルあたり２マイクログラムのｐＣＭＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２をトランスフェクションした。一晩インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＴ１０４）を用いて、細胞を支持体から取り除き、そして１ｍｌあたり１．０ミリグラムのジェネティシン（Ｇ４１８硫酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０１３１−０２７）を含有する増殖培地中で希釈し、そして多様な密度で９６ウェルプレートに植え付けて、ジェネティシン選択後の単細胞クローンの回収を確実にした。ジェネティシン選択の間中、およそ３〜５日ごとに培地を交換した。選択後、単細胞クローンを含有するウェルを、２つ組９６ウェルプレートに拡大して、そして１００％集密が達成されるまでインキュベーションした。ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させ、そして最低４８時間インキュベーションすることによって、１組のウェルを許容性に関してスクリーニングした。３つのクローンがＰＲＲＳＶに関して許容性であることが見出され、そして「ＢＨＫ−ＣＭＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２−Ａ９」と称されるこれらの１つをさらなる研究のために選択した（図１１を参照されたい）。
（実施例２０）
ｐＲＳＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２を用いたＰＲＲＳＶ許容性ＢＨＫ−２１安定細胞株の生成
実施例１４に記載するように、ＢＨＫ−２１細胞を培養した。製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、実施例５に記載するような連結ｐＲＳＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２ ＤＮＡ構築物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした。ＰＲＲＳＶ許容性細胞株の続くクローニングおよび選択を、実施例１４に記載するように行った。スクリーニングした３３６単細胞クローンのうち、１２９が陽性であった。これらの細胞クローンのいくつかを７回まで継代し、そしてこれらはＰＲＲＳＶ許容性表現型を維持した（図１２を参照されたい）。これらの細胞株をＢＨＫ／ＲＳＶ／ｖ２と名づけ、その後に数字のクローン番号が続く。
（実施例２１）
ｐＣＭＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２を用いたＰＲＲＳＶ許容性ブタ腎臓安定細胞株の生成
親ブタ腎臓（ＰＫ０３２４９５）細胞をＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．から得て、そして３７℃および５％ＣＯ２で、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）からなる増殖培地中で増殖させた。各々およそ１ｘ１０６細胞を含有する細胞培養ウェル（３５ｍｍ）に、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、ＦＢＳもまた抗生物質も含まないＤＭＥＭ中、ウェルあたり２マイクログラムのｐＣＭＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２をトランスフェクションした。一晩インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＴ１０４）を用いて、細胞を支持体から取り除き、そして１ｍｌあたり１．０ミリグラムのジェネティシン（Ｇ４１８硫酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０１３１−０２７）を含有する増殖培地中で希釈し、そして多様な密度で９６ウェルプレートに植え付けて、ジェネティシン選択後の単細胞クローンの回収を確実にした。ジェネティシン選択の間中、およそ３〜５日ごとに培地を交換した。選択後、単細胞クローンを含有するウェルを、２つ組９６ウェルプレートに拡大して、そして１００％集密が達成されるまでインキュベーションした。ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させ、そして最低４８時間インキュベーションすることによって、ウェルの１組を許容性に関してスクリーニングした。「ＰＫ−ＣＭＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２−Ｄ１」と称される１つのクローンが、ＰＲＲＳＶ許容性表現型を示した。
（実施例２２）
ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２を用いたＰＲＲＳＶ許容性ＢＨＫ２１安定細胞株の生成
親ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ２１）細胞をＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．から得て、そして３７℃および５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）からなる増殖培地中で増殖させた。各々およそ１ｘ１０６細胞を含有する細胞培養ウェル（３５ｍｍ）に、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、ＦＢＳもまた抗生物質も含まないＤＭＥＭ中、ウェルあたり２マイクログラムのｐｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２をトランスフェクションした。一晩インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＴ１０４）を用いて、細胞を支持体から取り除き、そして１ｍｌあたり１．０ミリグラムのジェネティシン（Ｇ４１８硫酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０１３１−０２７）を含有する増殖培地中で希釈し、そして多様な密度で９６ウェルプレートに植え付けて、ジェネティシン選択後の単細胞クローンの回収を確実にした。ジェネティシン選択の間中、およそ３〜５日ごとに培地を交換した。選択後、単細胞クローンを含有するウェルを、２つ組９６ウェルプレートに拡大して、そして１００％集密が達成されるまでインキュベーションした。ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させ、最低４８時間インキュベーションすることによって、１組のウェルを許容性に関してスクリーニングした。７つの候補クローンがＰＲＲＳＶ許容性であることが見出された。７つの候補クローンの各々に、表現型不均一性の証拠がいくつかあり、これはおそらく、これらがクローン性でないためであった。したがって、Ｇ４１８含有培地中で限界希釈することによって、候補クローンを単細胞クローニングした。明らかにＰＲＲＳ許容性である単細胞クローンを１つ得て、そしてＢＨＫ−ｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２−Ｈ９と名づけた。
（実施例２３）
ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２を用いたＰＲＲＳＶ許容性ネコ腎臓安定細胞株の生成
親Ｎｏｒｄｅｎ Ｌａｂｓネコ腎臓（ＮＦＬＫ）細胞を３７℃および５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）からなる増殖培地中で増殖させた。各々およそ１ｘ１０６細胞を含有する細胞培養ウェル（３５ｍｍ）に、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、ＦＢＳもまた抗生物質も含まないＤＭＥＭ中、ウェルあたり２マイクログラムのｐｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２をトランスフェクションした。一晩インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＴ１０４）を用いて、細胞を支持体から取り除き、１ｍｌあたり５００マイクログラムのジェネティシン（Ｇ４１８硫酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０１３１−０２７）を含有する増殖培地中で希釈し、そして多様な密度で９６ウェルプレートに植え付けて、ジェネティシン選択後の単細胞クローンの回収を確実にした。ジェネティシン選択の間中、およそ３〜５日ごとに培地を交換した。選択後、単細胞クローンを含有するウェルを、２つ組９６ウェルプレートに拡大して、そして１００％集密が達成されるまでインキュベーションした。最低４８時間、ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させることによって、１組のウェルをＰＲＲＳＶ許容性に関してスクリーニングした。５つのクローンが許容性であることが見出された。「ＦＫ−ｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２−Ａ６」と称されるこれらの１つは、明らかに許容性表現型を示した（図１３を参照されたい）。
ＣＤ１６３発現に関して、ＮＦＬＫ親細胞および１つのサブクローンのＦＫ−ｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２−Ａ６を調べた。細胞を８０％アセトン中で固定し、そしてヤギ抗ヒトＣＤ１６３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、１：２００）と１時間反応させ、その後、ＰＢＳで洗浄した。視覚化のため、ＦＩＴＣコンジュゲート化ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｃ、１：１００）を用いた。図２１Ａに示すように、ＮＬＦＫ親細胞において、特異的蛍光は検出されなかった。ＦＫ．Ａ６．Ａ２サブクローンの大部分は、ＣＤ１６３の存在を示す、優れた蛍光染色を示した（図２１Ｂ）。
（実施例２４）
ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２を用いたＰＲＲＳＶ許容性ブタ腎臓安定細胞株の生成
親ブタ腎臓（ＰＫ０３２４９５）細胞をＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．から得て、そして３７℃および５％ＣＯ２で、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）からなる増殖培地中で増殖させた。各々およそ１ｘ１０６細胞を含有する細胞培養ウェル（３５ｍｍ）に、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、ＦＢＳもまた抗生物質も含まないＤＭＥＭ中、ウェルあたり２マイクログラムのｐｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２をトランスフェクションした。一晩インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＴ１０４）を用いて、細胞を支持体から取り除き、そして１ｍｌあたり１．０ミリグラムのジェネティシン（Ｇ４１８硫酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０１３１−０２７）を含有する増殖培地中で希釈し、そして多様な密度で９６ウェルプレートに植え付けて、ジェネティシン選択後の単細胞クローンの回収を確実にした。ジェネティシン選択の間中、およそ３〜５日ごとに培地を交換した。選択後、単細胞クローンを含有するウェルを、２つ組９６ウェルプレートに拡大して、そして１００％集密が達成されるまでインキュベーションした。最低４８時間、ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させることによって、１組のウェルをＰＲＲＳＶ許容性に関してスクリーニングした。２つのクローンが許容性であることが見出された。「ＰＫ−ｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２−Ｂ１１」と称されるこれらの１つは、明らかにＰＲＲＳＶ許容性表現型を示した。
（実施例２５）
連結されたｐＲＳＶ−Ｓｃｒｉｐｔ ＭＡＲＣ ＣＤ１６３ｖ２を用いたＰＲＲＳＶ許容性ネコ腎臓安定細胞株の生成
ＲＳＶプロモーターからＣＤ１６３を発現する安定細胞株を生成する際に使用するのに適した、マイクログラム量の直鎖ＤＮＡを生成する、クローニングに基づかない方法を開発した（図４）。類似のプロセスを適合させて、ＭＡＲＣ−１４５細胞由来のサルＣＤ１６３ｖ２をＲＳＶプロモーターの後ろに配置した。該方法は、一方はｐＲＳＶ−ｓｃｒｉｐｔ由来のネオマイシン遺伝子およびＲＳＶプロモーターカセットを含有し、そして他方はｐＣＤＮＡ３．１Ｄ ＭＡＲＣ ＣＤ１６３ｖ２由来のＭＡＲＣ ＣＤ１６３ｖ２コード配列を含有する、２片のＤＮＡの単離および連結を伴う。ベクタープラスミドｐＲＳＶ−Ｓｃｒｉｐｔを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで直鎖化した。プラスミドをまず、ＫｐｎＩで消化し、そして大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で平滑化した。次いで、このプラスミドを、ＲＳＶプロモーターのすぐ下流のＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ ＭＡＲＣ ＣＤ１６３ｖ２クローンを、ベクター配列中、ＣＤ１６３挿入物下流のＥｃｏＲＶおよびＣＤ１６３上流のＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＣＤ１６３コード配列をベクターから遊離させた。各プラスミド消化のため、アガロースゲルから適切な断片を精製した。大規模連結反応を以下のように行った。およそ２０μｇの各ＤＮＡ断片を、６００μｌの体積中、１５単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼとインキュベーションした。反応物を室温で１時間インキュベーションした。連結後、適切な要素をすべて含有するＤＮＡの直鎖片を、アガロースゲル電気泳動によって精製した。制限酵素消化分析を行って、各連結断片の信頼性を確認した。付着性ＨｉｎｄＩＩＩ末端を介した２つのＤＮＡ断片の連結によって、ＲＳＶプロモーター下流にＭＡＲＣ ＣＤ１６３遺伝子の５’配列が配置され、哺乳動物細胞においてＣＤ１６３発現を導くことが可能になった。いったん単離し、精製ＤＮＡを用いて、選択した哺乳動物細胞株をトランスフェクションした。
Ｎｏｒｄｅｎ Ｌａｂｓネコ腎臓（ＮＬＦＫ）細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で、５％ウシ胎児血清および抗生物質を補ったＤＭＥＭ中で増殖させた。ＮＬＦＫ細胞をおよそ９０％の集密度で６ウェルプレート中に植え付け、そして一晩付着させた。次いで、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、プラスミドｐＲＳＶ−ＭＡＲＣ ＣＤ１６３ｖ２で細胞をトランスフェクションした。２４時間後、実施例１２に記載するように、細胞をクローニングした。実施例１２に記載するように、ＰＲＲＳＶ許容性細胞クローンに関するスクリーニングを行った。１つのクローンがＰＲＲＳＶ感染に関して陽性であり、そしてこれをＮＬＦＫ−ＭＡＲＣ ＣＤ１６３Ｄ４と名づけた。このＤ４クローンは、９回継代する間、ＰＲＲＳＶ許容性表現型を維持した。
（実施例２６）
ＣＭＶプロモーターからｓｕｓＣＤ１６３ｖ１を安定して発現する組換えＢＨＫ−２１細胞およびＮＬＦＫ細胞におけるＰＲＲＳＶ単離体ＮＶＳＬ ９４−３の増殖速度論
ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１を安定して発現するように操作されたＰＲＲＳＶ感染ＢＨＫ−２１細胞またはＮＬＦＫ細胞によって産生される子孫ウイルスの量を定量化した。ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１を発現する４つの細胞株、ＢＨＫ／ＣＭＶ／ｓｕｓｖ１ ＃３、ＢＨＫ／ＣＭＶ／ｓｕｓｖ１ ＃５、ＢＨＫ／ＣＭＶ／ｓｕｓｖ１ ＃１２、およびＦＫ／ＣＭＶ／ｓｕｓｖ１ Ｇ４を、集密以下で６ウェルプレートに植え付け、そして一晩インキュベーションした後、ＰＲＲＳＶのＮＶＳＬ ９４−３単離体に感染させた。比較のため、ＭＡＲＣ−１４５細胞を実験に含んだ。およそ０．１のｍ．ｏ．ｉ．で細胞をウイルスに感染させた。ウイルスを６０〜９０分間吸着させ、そして取り除いた。細胞をＰＢＳで３回洗浄して、残りのウイルスを取り除いた。感染直後から開始して１２時間間隔で培養から１ミリリットルのアリコットを採取し、そしてこれを９６時間まで続けた。多様な時点で新鮮な培地を細胞に添加して十分な培養体積を維持し、細胞単層が乾燥するのを防いだ。すべての試料を収集するまで、培養上清を−８０℃で保存した。ＭＡＲＣ−１４５細胞上のプラークアッセイによって、培養上清に存在するＰＲＲＳＶの量を決定した。図１４は、試験したＣＤ１６３発現組換え細胞株がすべて、子孫ＰＲＲＳＶを産生可能であったことを示す。
（実施例２７）
抗ＣＤ１６３抗体を用いたＰＲＲＳＶ感染の遮断：一過性トランスフェクション細胞
実施例８に記載するプラスミドｐＣＤＮＡ３．１Ｄ−ＭＡＲＣ−ＣＤ１６３ｖ２で、実施例１４に記載するようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、２４ウェルプレートに植え付けたＢＨＫ−２１細胞を一過性トランスフェクションした。一晩インキュベーションして、ＣＤ１６３の発現を可能にした後、ヒトＣＤ１６３に特異的なヤギ・ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ１６０７）の滴定量（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を、ＰＢＳ中で、１００μｌ体積の細胞に添加した。対照として、同等量の正常ヤギＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＢ−１０８−Ｃ）を用いた。３７℃で１時間インキュベーションした後、ＧＦＰを発現する、ＰＲＲＳＶの組換えＰ１２９株、およそ１ｘ１０７ｐｆｕに単層を感染させた。抗ＣＤ１６３抗体およびＰＲＲＳＶと共に、細胞単層を３７℃で１時間インキュベーションし、この時点で、ウイルス接種材料／抗体混合物を吸引し、細胞単層をＰＢＳで１回洗浄し、そして１ｍｌの増殖培地をウェルに添加した。細胞を３７℃で２４時間インキュベーションして、ＰＲＲＳＶが導くＧＦＰ発現を可能にした。分析のため、細胞をトリプシン処理し、５００μｌのＰＢＳに再懸濁し、そしてフローサイトメトリーによって分析して、ＧＦＰ発現を介して、ＰＲＲＳＶ感染細胞を数えた（ｉｎｎｕｍｅｒａｔｅ）。フローサイトメトリーのため、非感染ＢＨＫ−２１細胞を用いて、蛍光検出のベースラインを設定し、そして続く試料各々からおよそ１００，０００細胞を分析した。図１５に示すこの分析の結果は、ＣＤ１６３特異的抗体が、正常ヤギＩｇＧとインキュベーションした細胞に比較した際、感染細胞数を有意に減少させうることを示す。
（実施例２８）
抗ＣＤ１６３抗体によるＰＲＲＳＶ感染の遮断：安定トランスフェクション細胞
実施例２３に記載した、ヒトＣＤ１６３を安定して発現するＮＬＦＫ細胞（ＦＫ−ｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２−Ａ６）を２４ウェルプレートに植え付けた。細胞を一晩付着させた後、ヒトＣＤ１６３に特異的なヤギ・ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ１６０７）の滴定量を、ＰＢＳ中で、１００μｌ体積の細胞に添加した。対照として、同等量の正常ヤギＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＢ−１０８−Ｃ）を用いた。３７℃で１時間インキュベーションした後、ＧＦＰを発現する、ＰＲＲＳＶの組換えＰ１２９株、およそ１ｘ１０７ｐｆｕに単層を感染させた。抗ＣＤ１６３抗体およびＰＲＲＳＶと共に、細胞単層を３７℃で１時間インキュベーションし、この時点で、ウイルス接種材料／抗体混合物を吸引し、細胞単層をＰＢＳで１回洗浄し、そして１ｍｌの増殖培地をウェルに添加した。細胞を３７℃で２４時間インキュベーションして、ＰＲＲＳＶが導くＧＦＰ発現を可能にした。分析のため、細胞をトリプシン処理し、５００μｌのＰＢＳに再懸濁し、そしてフローサイトメトリーによって分析して、ＧＦＰ発現を介して、ＰＲＲＳＶ感染細胞を数えた。試料各々からおよそ１００，０００細胞を分析した。図１６に示すこの分析の結果は、ＣＤ１６３特異的抗体が、正常ヤギＩｇＧとインキュベーションした細胞に比較した際、感染細胞数を有意に減少させうることを示す。
（実施例２９）
ｐＲＳＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２を用いたＰＲＲＳＶ許容性ブタ腎臓安定細胞株の生成
ブタ腎臓細胞（ＰＫ０３２４９５）を実施例２１に記載するように培養した。トランスフェクションのため、細胞を８０％集密度で２４ウェルプレートに蒔き、そして一晩回復させた。製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、実施例５に記載する連結ｐＲＳＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２ ＤＮＡのトランスフェクションを行った。続いて、ＰＲＲＳＶ許容性細胞のクローニングおよび選択を、本質的に実施例１４に記載するように行った。限界希釈による最初のクローニングでは、単細胞由来クローンを生じるのに失敗したため、ＰＲＲＳＶ許容性細胞を含む５つのウェルを限界希釈によって再クローニングして、クローン細胞株を得た。さらなる研究のため、１０のクローンを選択して、そしてこれらのクローンの１つ、ＰＫ−ＲＳＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２ ＃９は、感染初期にＰＲＲＳＶの増殖巣を援助する能力を示した（図１８を参照されたい）。
（実施例３０）
ｐＲＳＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２を用いたＰＲＲＳＶ許容性ネコ腎臓安定細胞株の生成
ＮＬＦＫネコ腎臓細胞を実施例１７に記載するように培養した。トランスフェクションのため、最大密度のおよそ８０％で細胞を２４ウェルプレートに蒔いた。一晩インキュベーションした後、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて、連結に由来するＲＳＶ／ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２（実施例５を参照されたい）を単層にトランスフェクションした。トランスフェクション細胞のクローニングおよびＰＲＲＳＶ許容性細胞クローンの選択を本質的に実施例１４に記載するように行った。ＰＲＲＳＶ許容性に関して試験した６７の細胞株のうち、２０が陽性であることが見出された。観察された染色の例を図１９に示す。
（実施例３１）
ＰＫ−ＲＳＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２細胞におけるＰＲＲＳＶ単離体Ｐ２０１の継代
ＰＲＲＳＶ臨床単離体の増幅を以下のように行った。２％ＦＢＳを補ったＯｐｔｉＭＥＭ培地を用いて、末梢肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）細胞を、６ウェルプレート中、１０ｃｍ２あたり５．４Ｅ６細胞で植え付けた。６時間後、培地を吸引し、そしてＰＲＲＳＶ感染ブタから採取した血清の２ｍｌアリコットを細胞に添加した。９０分間吸着させた後、血清接種材料を取り除き、そしてＯｐｔｉＭＥＭと交換した。感染およそ４０後、上清を採取し、そして１０分間遠心分離して清澄化した。上清を直接用い、６時間吸着を用いて、ＰＫ−ＲＳＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２クローン＃９細胞を感染させた。接種材料を除去した後、細胞にＤ−ＭＥＭを再供給した。感染細胞および細胞不含上清継代を交互に用いて、ＰＫ−ＲＳＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２ ＃９細胞株上で、Ｐ２０１ウイルスを連続継代した。ウイルスが十分に蔓延するためには、集密以下に維持した細胞フラスコを用いて、感染前日に細胞を５０〜７０％集密度で植え付けなければならないことが観察された。感染進行を追跡するため、同一に感染させた細胞の多数のウェル中で、各継代を複製し、そしてそれぞれの日に、ウェルの１つをアセトン固定し、そしてＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７で染色した。感染細胞の割合が５０％を超えず、そして前日までに増殖巣発達の有意な進行が見られない場合、同等のウェル中の細胞をトリプシン処理し、そして多数の新鮮なウェルに継代した。これらの感染細胞継代は、典型的には１：４分割であり、そしてときどき、未感染培養由来の同等数の細胞の添加を含んだ。あるいは、ＳＤＯＷ１７染色によって、感染細胞増殖巣が総細胞の５０％を超える割合を占めるのに十分に蔓延したことが明らかになった場合、細胞不含上清を採取し、そして新鮮に植え付けた細胞の多数のウェルを感染させるのに用いた（図２０）。１１回継代した後、ウイルスは十分な力価に増殖可能であり、ウイルスの細胞不含上清の連続継代が可能になるため、介在する細胞継代は不要であった。
（実施例３２）
多様な欧州および北米ＰＲＲＳＶ単離体に対する許容性に関する、多様なＣＤ１６３細胞株のスクリーニング
低継代欧州および北米ＰＲＲＳＶ単離体に対する許容性に関して、多様なＣＤ１６３トランスジェニック細胞株を評価した（表７を参照されたい）。先の実施例に記載するように、トランスジェニックＣＤ１６３細胞株には、ＮＬＦＫ−ＭＡＲＣ ＣＤ１６３Ｄ４、ＰＫ−ＲＳＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２クローン＃９およびＰＫ−ＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１−Ａ１０が含まれた。細胞株ＭＡＲＣ−１４５、親ネコ腎臓、親ブタ腎臓細胞株（対照として働く）と共に、各ＣＤ１６３細胞株を、９６ウェル組織培養プレート上に植え付けた。単層から増殖培地を取り除き、そして各ＰＲＲＳＶ単離体をウェルあたり０．１ｍｌ接種した。感染３日後、８０％アセトンでプレートを固定し、そしてヌクレオカプシドに特異的な、ＦＩＴＣコンジュゲート化モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で染色した。蛍光抗体（ＦＡ）アッセイの結果を表７に示す。
表７
Figure 2007533321
ａＥＵ９８Ｖ２２６が欧州単離体であることを除いて、すべてのＰＲＲＳＶ単離体は北米単離体である。
（実施例３３）
ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）でＣＤ１６３を誘導すると、ヒトＵ９３７細胞がＰＲＲＳＶ感染に対して許容性になる
ＡＴＣＣから得たヒトＵ９３７細胞（ＣＲＬ−１５９３．２）を、ＡＴＣＣの指定にしたがった血清および添加物を含有するＲＰＭＩ培地中で増殖させた。これらの細胞は、ＰＭＡ処理によって活性化されると、ＣＤ１６３を発現することが知られる（Ｇｒｏｎｌｕｎｄら、２０００）。６ウェルプレートのウェル中、２つ組で、Ｕ９３７細胞を植え付けた。一方の組のウェルを１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで処理し、そして他方の組を未処理で放置した。ＰＭＡ刺激の３日後、各組の１つのウェルをＰＲＲＳＶのＰ１２９単離体に感染させた。各組の他方のウェルを固定し、そしてヤギ抗ヒトＣＤ１６３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）およびＦＩＴＣコンジュゲート化ロバ抗ヤギＩｇＧ（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、間接的免疫蛍光抗体アッセイにおいて、ＣＤ１６３の発現に関して染色した。
未処理Ｕ９３７細胞は、最初の植え付けから３日後、高密度になるまで増殖を続けた。ＰＭＡ処理Ｕ９３７細胞は増殖を停止し、巨大になり始め、そして培養ウェルの表面に付着した。わずかな割合の未処理Ｕ９３７がＣＤ１６３染色に関して陽性であり、一方、ほぼすべてのＰＭＡ処理Ｕ９３７がＣＤ１６３染色に関して陽性であった。未処理Ｕ９３７では、ＰＲＲＳＶ感染細胞は観察されなかった。しかし、数百のＰＭＡ処理Ｕ９３７細胞がＰＲＲＳＶに感染した。これによって、ＣＤ１６３発現の化学誘導後、非許容性細胞が、ＰＲＲＳＶ感染に関して許容性になりうることが立証される。
本発明のさらなる特徴および変動が、詳細な説明を含めて、本出願全体から、当業者には明らかであろうし、そしてこうした特徴すべてが、本発明の側面と意図される。同様に、本明細書に記載する本発明の特徴を再度組み合わせて、特徴のその組み合わせが本発明の側面または態様として具体的に上述されているかどうかに関わらず、本発明の側面としても意図される、さらなる態様にすることも可能である。また、本発明に決定的であると本明細書に記載される限定のみを限定と見なすべきであり；決定的と本明細書に記載されていない限定を伴わない、本発明の変動は、本発明の側面と意図される。
本発明は、前述の説明および実施例に具体的に記載されるものと別の方式で実施することも可能であることは明らかであろう。
本発明の多くの修飾および変動が、上記解説を考慮して可能であり、そしてしたがって、本発明の範囲内である。
本明細書に引用するすべての刊行物のすべての開示は、本明細書の開示に矛盾しない度合いで、本明細書に援用される。
図１ ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１とＡＪ３１１７１６の模式的比較 図２ ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１（配列番号２）とＡＪ３１１７１６（配列番号４）のアミノ酸配列並列 図２ ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１（配列番号２）とＡＪ３１１７１６（配列番号４）のアミノ酸配列並列 図３ ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１とＡＪ３１１７１６のヌクレオチド配列並列 図３ ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１とＡＪ３１１７１６のヌクレオチド配列並列 図３ ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１とＡＪ３１１７１６のヌクレオチド配列並列 図４ ＤＮＡ断片の生成およびＲＳＶプロモーターの直後にＣＤ１６３を配置する連結。プラスミドを、ＤｒａＩＩＩまたはＤｒｄＩのいずれかで消化した後、クレノウ酵素で平滑化反応を行った。清浄化した後、プラスミドをＮｏｔＩで消化した。ゲル精製によってＤＮＡ断片を生じ、付着性ＮｏｔＩ末端を利用して、該断片を続いて連結した。ＲＳＶ（ｐＲＳＶ）およびＳＶ４０（ｐＳＶ４０）由来のプロモーターを矢印で示す。 図５ ｐＣＤＮＡ３．１定方向Ｖ５／Ｈｉｓ／ＴＯＰＯクローニングベクターのマップ 図６ ３つのＢＨＫ／ＣＭＶ／ｖ１細胞株、＃３、＃５、および＃１２、並びに非許容性ＢＨＫ細胞株を、ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させて、そしてＳＤＯＷ１７−ＦＩＴＣで染色した。パネルＡは、非許容性ＢＨＫ２１細胞クローンを示す。パネルＢは、ＢＨＫ／ＣＭＶ／ｖ１クローン＃３を示す。パネルＣは、ＢＨＫ／ＣＭＶ／ｖ１クローン＃５を示す。パネルＤは、ＢＨＫ／ＣＭＶ／ｖ１クローン＃１２を示す。 図７ ３つのＢＨＫ／ＲＳＶ／ｖ１細胞株、＃２、＃３、および＃４を、ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させて、そしてＳＤＯＷ１７−ＦＩＴＣで染色した。パネルＡは、ＢＨＫ／ＲＳＶ／ｖ１クローン＃２を示す。パネルＢは、ＢＨＫ／ＲＳＶ／ｖ１クローン＃３を示す。パネルＣは、ＢＨＫ／ＲＳＶ／ｖ１クローン＃４を示す。 図８ ＰＲＲＳＶプラークを示す、ブタＣＤ１６３ｖ１を安定して発現しているネコ腎臓細胞株。どちらも第４継代である細胞株ＮＬＦＫ−ＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１−Ｇ４ＦおよびＮＬＦＫ−ＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１−Ｇ４Ｌを北米ＰＲＲＳＶのＰ１２９単離体に感染させ、そして６日間インキュベーションした。８０％アセトンで単層を固定し、そしてモノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７−ＦＩＴＣで染色した。位相差顕微鏡（右）は、ウイルスＣＰＥの局在領域（プラーク）を示し、一方、ＦＡ検出（左）は、ウイルス・ヌクレオカプシド抗原の共局在を示す。 図９ ４つのＦＫ／ＲＳＶ／ｖ１細胞株、＃１、＃２、＃３、および＃４を、ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させて、そしてモノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７−ＦＩＴＣで染色した。パネルＡは、ＦＫ／ＲＳＶｖ１＃１細胞クローンを示す。パネルＢは、ＦＫ／ＲＳＶ／ｖ１クローン＃２を示す。パネルＣは、ＦＫ／ＲＳＶ／ｖ１クローン＃３を示す。パネルＤは、ＦＫ／ＲＳＶ／ｖ１ ＃４を示す。 図１０ ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させた、第１９継代のＰＫ−ＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１−Ａ１０細胞。左：単層を８０％アセトンで固定し、そしてＰＲＲＳＶヌクレオカプシドに特異的なＦＩＴＣコンジュゲート化モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）で染色した。右：明視野照明下での同じウェル、細胞分布を示す。 図１１ ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させた、第１７継代のＢＨＫ−ＣＭＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２−Ａ９。単層を８０％アセトンで固定し、そしてＰＲＲＳＶヌクレオカプシドに特異的なＦＩＴＣコンジュゲート化モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）で染色した。 図１２ ＢＨＫ／ＲＳＶ／ｖ２細胞株の３つの代表的な例。細胞をＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させ、そして続いてＳＤＯＷ１７−ＦＩＴＣで染色した。パネルＡは、細胞株ＢＨＫ／ＲＳＶ／ｖ２ ＃１を示し、パネルＢは、細胞株ＢＨＫ／ＲＳＶ／ｖ２ ＃３４を示し、そしてパネルＣは、細胞株ＢＨＫ／ＲＳＶ／ｖ２ ＃４７を示す。 図１３ ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させた、第１５継代のＦＫ−ｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２−Ａ６。次いで、単層を８０％アセトンで固定し、そしてＰＲＲＳＶヌクレオカプシドに特異的なＦＩＴＣコンジュゲート化モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）で染色した。 図１４ ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１を安定して発現している４つの組換え細胞株、およびＭＡＲＣ−１４５細胞によって産生される子孫ＰＲＲＳＶの量を、ＰＲＲＳＶのＮＶＳＬ９４−３単離体を用いた増殖曲線実験で決定した。１２時間間隔で採取した試料を、ＭＡＲＣ−１４５細胞単層上で力価決定した。 図１５ ＣＤ１６３特異的抗体の存在下のＰＲＲＳＶ感染のフローサイトメトリー分析。一過性トランスフェクション由来のＭＡＲＣ−１４５ ＣＤ１６３を発現しているＢＨＫ−２１細胞を、ＣＤ１６３特異的抗体または正常ヤギＩｇＧ（ＮＧＳ）のいずれかとインキュベーションし、そしてＧＦＰ発現ＰＲＲＳＶに感染させた。各データ点は、３つ組ウェルの結果に相当する。 図１６ ＣＤ１６３特異的抗体の存在下のＰＲＲＳＶ感染のフローサイトメトリー分析。ヒトＣＤ１６３を安定して発現しているＮＬＦＫ細胞を、ＣＤ１６３特異的抗体または正常ヤギＩｇＧ（ＮＧＳ）のいずれかとインキュベーションし、そしてＧＦＰ発現ＰＲＲＳＶに感染させた。感染２４時間後、ＧＦＰを発現している感染細胞の割合を決定した。各データ点は、細胞の単一ウェルの結果に相当する。 図１７ Ｖｅｒｏ細胞から回収されたＣＤ１６３ ｍＲＮＡの６つの選択的スプライシング変異体の模式図。６つの変異体は、Ｅ６、Ｅ１０５、およびＥ８３と称する３つのエクソンの存在または非存在が異なる。エクソンＥ６およびＥ１０５は、３の倍数の長さを有し、そしてしたがって、存在しなくても、読み枠に変化を生じない。対照的に、Ｅ８３が存在しないと、読み枠がシフトし、そしてタンパク質のカルボキシ末端に別のアミノ酸配列が生じる（図中、斜線パターンで示す）。疎水性膜貫通（ＴＭ）領域は、Ｅ１０５内にコードされる。 図１８ ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させたＰＫ−ＲＳＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２ ＃９細胞。ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ２０１に感染したＰＡＭ由来の未希釈上清を用いて、ＰＫ−ＲＳＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２ ＃９細胞を感染させた。インキュベーション２日後、細胞を固定し、そして実施例１１に記載するように、モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７で染色した。 図１９ ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ１２９に感染させたＦＫ−ＲＳＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２ ＃５１細胞。ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ２０１に感染したＰＡＭ由来の未希釈上清を用いて、ＦＫ−ＲＳＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２ ＃５１細胞を感染させた。感染２日後、細胞をアセトン固定し、そして実施例１１に記載するように、モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７で染色した。 図２０ ＰＲＲＳＶ単離体Ｐ２０１でのＰＫ−ＲＳＶＳｃｒｉｐｔ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ２クローン＃９細胞の感染。パネルＡは、感染２４時間後の第１継代のＰＲＲＳＶ Ｐ２０１に感染させた細胞単層を示す。パネルＢは、第１０継代の細胞不含上清ＰＲＲＳＶ Ｐ２０１に感染させて２日後の細胞単層を示す。 図２１ ＮＬＦＫ親細胞およびＦＫ−ｃＤＮＡ３．１Ｄ−ｈｕｍＣＤ１６３ｖ２−Ａ６の１つのサブクローンを、ＣＤ１６３発現に関して調べた。８０％アセトン中で細胞を固定し、そしてヤギ抗ヒトＣＤ１６３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、１：２００）と１時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。視覚化のため、ＦＩＴＣコンジュゲート化ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｃ、１：１００）を用いた。図２１Ａに示すように、ＮＬＦＫ親細胞では特異的蛍光は検出されなかった。ＦＫ．Ａ６．Ａ２サブクローンの大部分は、優れた蛍光染色を示し、ＣＤ１６３の存在を示した（図２１Ｂ）。

Claims (15)

  1. ＰＲＲＳＶによる脊椎動物細胞の感染を促進する方法であって
    （ａ）前記脊椎動物細胞によるＣＤ１６３ポリペプチドの発現増加を導く
    工程を含む、前記方法。
  2. 前記細胞をＰＲＲＳＶに感染させる工程をさらに含む、請求項１の方法。
  3. ＰＲＲＳＶの培養物を産生する工程をさらに含む、請求項１の方法。
  4. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１の方法。
  5. 前記ＣＤ１６３ポリペプチドが膜貫通ドメインを含む、請求項１の方法。
  6. 前記発現増加が外因性核酸の導入によって達成される、請求項１の方法。
  7. 前記発現増加が化学的処理によって達成される、請求項１の方法。
  8. 前記細胞がＰＲＲＳＶ非許容性であり、そして工程（ａ）によってＰＲＲＳＶ許容性にされる、請求項１の方法。
  9. ＰＲＲＳＶが欧州遺伝子型のものである、請求項２の方法。
  10. ＰＲＲＳＶが北米遺伝子型のものである、請求項２の方法。
  11. ＰＲＲＳＶワクチンを産生する工程をさらに含む、請求項２〜１０のいずれか１項の方法。
  12. ワクチンが死菌ワクチンである、請求項１１の方法。
  13. ワクチンが生弱毒化ワクチンである、請求項１１の方法。
  14. 試験細胞株がＰＲＲＳＶによる感染を可能にする傾向を測定するための方法であって：
    ａ）試験細胞株由来の核酸を含有する試料を提供し；
    ｂ）前記試料において、ＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体の量を測定する；
    ことを含み、
    前記ＰＲＲＳＶの増殖を支持しないことが知られる対照細胞株由来の対照試料に比較して、ＣＤ１６３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量が増加していると、試験細胞株が前記ＰＲＲＳＶの複製を支持する傾向を持つことの指標となる、
    前記方法。
  15. 試験細胞株がＰＲＲＳＶによる感染を可能にする傾向を測定するための方法であって：
    ａ）試験細胞株由来のポリペプチドを含有する試料を提供し；
    ｂ）前記試料において、ＣＤ１６３ポリペプチドの量を測定する；
    ことを含み、
    前記ＰＲＲＳＶの増殖を支持しないことが知られる対照細胞株由来の対照試料に比較して、ＣＤ１６３ポリペプチドの量が増加していると、試験細胞株が前記ＰＲＲＳＶの複製を支持する傾向を持つことの指標となる、
    前記方法。
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