JP2007155585A - 生化学反応カートリッジ、カバー部材および反応チャンバー付プロ−ブ担体 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、反応チャンバー部分とハンドリング機構を機能分離することにより、チャンバー部の設計の自由度を向上させた構造を有する生化学反応カートリッジを提供することにある。
【解決手段】少なくとも検体を生化学処理するための溶液が内蔵されたカートリッジと、プローブ担体が載置された反応チャンバーとを嵌合させた生化学反応カートリッジであって、カートリッジが溶液を注入する第１の注入口と、チャンバーから排出される溶液を受ける第１の排出口と、プローブ担体が載置された反応チャンバーを載置する載置部とを有し、反応チャンバーは、プローブ担体に載置することにより、溶液とプローブ担体に担持されたプローブとを反応させる反応空間を構成し、第１の注入口および第１の排出口とが接続されていることを特徴とする生化学反応カートリッジである。
【選択図】図３

Description

本発明は、核酸プローブなど標的物質検出に使用される生化学反応カートリッジに関する。より詳しくは、基板上の既知の位置に核酸プローブを配置したプローブ担体と標的物質とのハイブリダイゼーション反応とその反応検出を容易に行うための生化学反応カートリッジに関する。

また本発明は、当該生化学反応カートリッジと共に用いる反応チャンバー付プローブ担体、それに用いるカバー部材に関する。

核酸の塩基配列の決定、検体試料中の目的とする特定の塩基配列をもつ核酸の検出、各種細菌の同定を行なうことが求められている。迅速・正確に行い得る技術のひとつとして、ハイブリダイゼーション反応により標的核酸と特異的に結合する、プローブと呼ばれる物質を固相支持体上に多数並べたプローブ媒体（プローブアレイ）の使用が提案されている。

プローブアレイは所望の遺伝子配列を基に設計された複数のプローブにより、感染症起炎菌の病原菌の識別や癌など病状の診断やＳＮＰ識別による体質判定に応用されてきている。一方、プローブアレイを用いた検査は、従来は、高度の熟練が要求されていた。プローブアレイを診断のような臨床分野、法医科学、その他の分野に応用展開するためには、試料の前処理工程（ゲノムの抽出・増幅）とその後のハイブリダイゼーションから検出までを、熟練性を不要にすることが望まれている。

熟練性を不要にするためには、試料の前処理工程（ゲノムの抽出・増幅）、その後のハイブリダイゼーションから検出の手順を自動化し、標準化し、単純化して、熟練度の低い作業者でも行うことができるようにすることが必要である。同時に、プローブアレイの小型化とハイブリダイゼーション反応を行う反応チャンバーの小型化も望まれている。

特許文献１に、ウォーターバスを温度制御に使用し、チャンバーに液体入出の連通孔を付与したハイブリダイゼーション・チャンバー装置およびそれを使用した核酸ハイブリダイゼーション方法が開示されている。特許文献１では、チャンバーの中にＤＮＡ断片を結合させたメンブレンを多孔質フィルターでサンドウィッチした担体が使われている。

特許文献２に、ウェハ上にオリゴヌクレオチド・プローブを多数配置したチップ・プレートをハイブリダイゼーションに使用するため、多数の隔壁ウェルからなるマイクロプレートが開示されている。

特許文献３には、液体入出口・流路で連通した反応チャンバーを含むパッケージに、プローブアレイを取り付けたバイオアレイチップ反応装置およびその製造方法が開示されている。パッケージには、反応チャンバーでのハイブリダイゼーション後、検出部に搬送・検出のための位置決めマーカーが設けられている。

特許文献４および５には、プローブアレイと可撓層で反応空間を形成し、反応空間を連通孔で連通したハイブリダイゼーション・チャンバーが開示されている。

更に、特許文献６には、スライドガラス型のバイオチップを収納する弾性材料で形成されたカートリッジが開示されている。バイオチップ用カートリッジは、スライドガラスを挿入してハイブリダイゼーション、前処理、洗浄処理ができ、それらの処理後にスライドガラス型のバイオチップを取外し、汎用の読取装置検出にかけることが可能な構造をしている。
米国特許第５１９９７５５号明細書 米国特許第５５４５５３１号明細書 特表平１０−５０５４１０号公報 特表２００３−５１７１５６号公報 特表２００３−５２０９７２号公報 特開２００４−２２６０６８号公報

特許文献１に開示されているように、ハイブリダイゼーション・チャンバーの基本的な構成は、「封止構造をした反応チャンバーとそれに連結する連通孔・流路および温度制御部」である。

特許文献１で開示されているチャンバーは、容量が大きく反応溶液もチャンバー容量に合わせて多く必要となるという問題があり、特許文献２以降ではチャンバーの小型化と取り扱いの容易性が追求されている。取り扱いを容易にするために、処理装置が自動化された加熱機構、流体制御機構、検出機構などの処理機構を組合せてシステム化した様々な提案がなされている。

特に、特許文献３では、バイオチップアレイ上に連通孔・流路を含む反応チャンバーを構成し、一体パッケージとし、検出機構を含む検査システム装置と組み合わせたシステムが開示されている。バイオチップをパッケージ化することで、操作性は非常に便利になった。一方、検査システム装置でのハンドリングに必要なパッケージ位置マーキング、すべり防止のパッケージ・ラインの付与、液漏れ防止の隔壁付与などにより、パッケージの小型化・低コスト化・形状変更が困難になっている。

また、特許文献６のように、現行のスライドガラス型のバイオチップをそのまま使用し、反応チャンバーを構成するように専用のカートリッジに挿入して、一連の反応処理を行えるようにしたカートリッジも開示されている。

従来の検出装置がそのまま使用できる利便性があり、実験室レベルでは優れているが、バイオチップの小型化やシステム装置としての自動化には向いているとは言い難い。

本発明の目的は、上記の課題を解決するものであり、ハイブリダイゼーション処理を行う反応チャンバー部分と検査システム装置に必要とされるハンドリング機構を機能分離することにより、チャンバー部の設計の自由度を向上させた構造を有する生化学反応カートリッジを提供することにある。

本発明の一態様によれば、少なくとも検体を生化学処理するための溶液が内蔵された、あるいは溶液を供給するカートリッジと、検体中の標的物質を検出するプローブが担持されたプローブ担体が載置され、生化学処理された検体中の標的物質の検出反応を行なうための反応チャンバーとを嵌合させた生化学反応カートリッジであって、
前記カートリッジは、前記反応チャンバーに前記溶液を注入する第１の注入口と、前記チャンバーから排出される前記溶液を受ける第１の排出口と、前記プローブ担体が載置された前記反応チャンバーを載置する載置部とを有し、
注入口と排出口を有する前記反応チャンバーは、前記プローブ担体に載置することにより、前記溶液と前記プローブ担体に担持されたプローブとを反応させる反応空間を構成し、
前記第１の注入口および前記第１の排出口とが接続されていることを特徴とする生化学反応カートリッジが提供される。

また本発明の他の一態様によれば、（ｉ）少なくとも検体を生化学処理するための溶液が内蔵された、あるいは溶液を供給するカートリッジと、
（ｉｉ）検体中の標的物質を検出するプローブが配置されている領域を有しているプローブ担体と、該プローブ担体と共に該領域を内包する反応チャンバーを構成するカバー部材とによって構成されている反応チャンバー付プローブ担体と、
を嵌合させた生化学反応カートリッジであって、
前記カートリッジは、前記反応チャンバーに前記溶液を注入する第１の注入口と、前記チャンバーから排出される前記溶液を受ける第１の排出口と、前記反応チャンバー付プローブ担体を載置する載置部とを有し、
前記カバー部材は、該反応チャンバーと外部との液体の授受を行う少なくとも２つの連通孔を備え、
前記第１の注入口および前記第１の排出口との各々は、前記カバー部材の２つの連通孔の開口部の各々と接続されている、ことを特徴とする生化学反応カートリッジが提供される。

また本発明の他の態様によれば、検体中の標的物質を検出するプローブが配置されている領域を有しているプローブ担体と共に用いられるカバー部材であって、
前記プローブ担体の嵌合スペースと、該嵌合スペースに前記プローブ担体を嵌合することによって前記領域を内包する反応チャンバーを構成する空間と、を具備し、
更に、前記嵌合スペースへの前記プロ−ブ担体の嵌合によって形成される反応チャンバーへの液体の授受のための連通孔を具備していることを特徴とするカバー部材が提供される。

更にまた本発明の他の態様によれば、反応チャンバー付プローブ担体であって、
（ｉ）検体中の標的物質を検出するプローブが配置されている領域を有しているプローブ担体と、
（ｉｉ）上記カバー部材と、
を含み、前記プローブ担体が、前記カバー部材の嵌合スペースに嵌合し、前記プローブ担体と前記カバー部材とで反応チャンバーが構成されていることを特徴とする反応チャンバー付プロ−ブ担体が提供される。

このような目的を達成するための手段を以下説明する。

少なくともひとつのプローブ担体アレイを含む基板に反応チャンバーが構成できるような所定のサイズを標準化（規格化）する。規格化されたサイズの該プローブ担体アレイ上に反応チャンバーを形成するために、反応空間と流路とポートを有するカバー部材を作製するが、少なくともポート位置は規格化されている。該プローブ担体アレイと該カバー部材を接着することにより、ハイブリダイゼーション処理を行う反応チャンバー部分が構成される。

上記の反応チャンバー部分のままでハンドリングしてもよいが、検出システム装置に対応するように、該反応チャンバー部分を設置できる機構を有すると同時に、ハンドリング機構を備えた専用のカートリッジに設置して使用することもできる。カートリッジには反応チャンバーを固定するための機構、検出システム装置内での搬送用の機構、検出部での位置マーキング機構などが備えられる。

基板上に少なくともひとつのプローブアレイを形成したプローブ担体であり、該プローブアレイに対向して反応チャンバーを構成するカバー部材からなり、該基板の大きさおよび該カバー部材の大きさと液体連通孔の位置が規格化され、該プローブアレイを着脱交換可能に嵌合する構成にしたことにより、反応チャンバーの規格内での設計変更であれば、検査システム装置の搬送ガイド・位置ガイドの設計を変更せずに対応することが可能になる。

また、反応チャンバーを含むプローブ担体のみを交換することにより、カートリッジについては再利用が可能であり、繰り返し使用できるので、省資源・低コスト化が可能である。

まず、本発明に係る生化学反応カートリッジは、反応チャンバー付プローブ担体と共に用いられる。反応チャンバーは、図３及び図４において図番３４で示す空間であり、該反応チャンバーは、カバー部材３２の嵌合スペース３５にプローブ担体１３を嵌合させることによって形成され、プローブ担体上のプローブが配置されている領域（プローブアレイ１２）を内包している。カバー部材３２は、該チャンバー３４への液体の注入及び排出のための連通孔３３を有している。

そして、本発明に係る生化学反応カートリッジは、少なくとも生化学処理するための溶液が内蔵された、あるいは該溶液を供給するカートリッジと、上記反応チャンバー付プローブ担体とを嵌合させることにより構成されている。

反応チャンバー付プローブ担体は、カートリッジに嵌合される。嵌合された状態においては、カートリッジに設けられた、反応チャンバー３４に溶液を注入する注入口と、反応チャンバーに形成され、反応チャンバーに外部から溶液が注入される注入口（連通孔）とが接続されている。また、反応チャンバーに設けられた、反応チャンバーから溶液を排出する排出口と、該排出口から排出された溶液を受け、チャンバーの外部へ溶液を排出する、該カートリッジに設けられた、排出口とが接続されている。

カートリッジは、検査システム装置に必要とされるハンドリング機構や動作同期するためのマーキング部などの位置が決まっている。

反応チャンバー付プローブ担体の外形は、カートリッジに嵌合させるために一定の形状・機構が必要がある。更に、カートリッジと嵌合させた時に、反応チャンバーに形成された外部から溶液を反応チャンバーに供給する供給口と、反応チャンバーから溶液を外部に排出する排出口との位置が一定になるようにカートリッジの勘合位置合わせ機構が必要である。

一方、反応チャンバー内の溶液とプローブ担体との反応を行わせるための反応空間の広さおよびプローブ担体の大きさは、カートリッジに嵌合可能な外形寸法の内であれば特に規制されるものではない。

プローブを担持する基材は、プローブを担持し、基材に担持されたプローブを用いて検知物質（標的物質）を検出する。プローブを担持する基材は、検知物質（標的物質）を検出するのに支障のないものであれば特に限定されるものではないが、例えば無機材料または高分子材料などがあげられる。

無機材料を使用する場合は、検知物質（標的物質）を検出するため、塩基性基を導入するので、基材表面を例えばアミノ基を有するシランカップリング剤で処理したものが好ましい。

シランカップリング剤で処理する場合、特には石英、石英ガラス、ガラス、シリコン（単結晶あるいはポリシリコン）、シリカ、アルミナ、タルク、クレー、アルミニウム、水酸化アルミニウム、鉄、マイカ等のシランカップリング剤で効率的に処理できるような基板が好ましいが、表面OH基があるので、反応効率は低くなるが酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄などの酸化物などを使用することもできる。

標的物質の検出や材料としての汎用性を考慮すると、アルカリ成分を含まない、無アルカリガラスや石英基板材料が特に好ましい。

シリコンは、後述の小片に切断する際に、スクライブ＆ブレーキング法を用いることを考慮すると単結晶シリコンであることが好ましい。ポリシリコンの場合には、ダイシング法の適用が好ましい。

アミノ基を有するシランカップリング剤としては、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリアルコキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルメチルジアルコキシシラン、γ−アミノプロピルトリアルコキシシラン、γ−アミノプロピルメチルジアルコキシシランなどがあげられる。アルコキシシリル基としては、加水分解が速やかに行えるメトキシシリル基もしくはエトキシシリル基が好ましい。

高分子材料としては、アミノ基などの塩基性基を有する高分子材料、あるいは、塩基性基を容易に導入できる高分子材料が好ましい。例えば、末端にアミノ基を持つポリアミドなどを利用する方法、保護したアミノ基とビニル基を持つ物質を共重合させ、保護基を外した材料等がある。ポリカーボネート系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリアクリルアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂などを基材として表面にアミノ基を導入した高分子材料も使用できる。この場合には、シランカップリング剤による処理は必要ない。

なお、上述のシランカップリング剤とは、樹脂などの有機化合物と反応しうる有機官能基と、ガラスなどの無機化合物とシロキサン結合を介して結合しうる部分を併せ持つ化合物のことを言う。

また、プローブを担持する基材の形状は制約されるものではないが、ＤＮＡチップを例として挙げるならば検出方法および装置などの汎用性から基板形状であることが好ましい。更に、材料の表面の平滑性が高い材料であることが好ましく、市販されている標準的な検出装置を用いる上では、具体的には１インチ×３インチ、厚さ０．７〜１．５ｍｍ程度の基板形状をしていることが好ましい。

プローブが担持された基板を所定のサイズに切断してＤＮＡチップを作製する場合、基板の形状、サイズは特に制約されない。

プローブを担持する基板の表面をシランカップリング剤で処理する際には、基板表面を予め洗浄しておくことが好ましい。洗浄方法としては、水による洗浄，薬液による洗浄，プラズマによる洗浄，ＵＶオゾンによる洗浄など多くの方法が知られているが、簡易的に尚且つ均一に洗浄する方法としては、薬液による洗浄方法が適当である。

基板に用いる基材の種類によっても好適な洗浄方法は異なるが、例えば基材としてガラスを用いる場合は、所定濃度の水酸化ナトリウム水溶液を用いて基材表面を十分に洗浄し、基材上に付着した汚れを除去する方法が挙げられる。

ガラスを、プローブを担持する基板として用いる場合、６０℃程度に加温した１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用意し、水溶液中で基材表面をワイピングするもしくは水溶液をシャワーリングしながらブラッシングすることにより基材上に付着した汚れを確実に除去する。汚れを除去した後、余分な水酸化ナトリウム分を十分に水で洗い流す。最後にＮ₂などの不活性ガスでブローするなどの方法で水分除去を行う。

シランカップリング剤のコーティングの方法は、浸漬法（ディッピング法）、スピンコート法、スプレーコート法などの方法が利用できる。特に簡便且つ均一に処理できる浸漬法が好ましい。

浸漬法は、例えば、濃度が０．１〜２．０ｗｔ％の水に溶解させたシランカップリング剤水溶液に、洗浄した基材を浸漬し、反応終了後余分なシランカップリング剤を含む溶液を洗い流すことでシランカップリング剤を基材表面にコーティングすることができる。

シランカップリング剤を基材表面にコーティング後、１００〜１２０℃くらいの温度で乾燥させることが好ましい。

プローブとしては、タンパク質（複合タンパク質を含む）、核酸、糖鎖（複合糖質を含む）、脂質（複合脂質を含む）等の生体高分子などが含まれる。具体的には、酵素、ホルモン、フェロモン、抗体、抗原、ハプテン、ペプチド、合成ペプチド、ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ＰＮＡ、合成ＰＮＡ、ガングリオシド、レクチンなどがあげられる。

媒体中に含まれるプローブの量は、例えば核酸プローブの場合、プローブ安定性を考慮すると、媒体中に、好ましくは鎖長２ｍｅｒ〜５００ｍｅｒ、より好ましくは２ｍｅｒ〜８０ｍｅｒの核酸プローブの濃度が、０．０５〜５００μＭとなるように調整することが好ましく、０．５〜５０μＭの濃度となるように調整することがより好ましい。

プローブにチオール基を導入する際、例えば、自動合成するＤＮＡをプローブとする場合にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事ができる。なお、効率良くチオール基の導入することができれば、特にチオールモディファイアに限定されるものではない。

基板へのプローブの付与は、プローブを水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、インクジェット法、ピン法あるいはピン＆リング法などにより表面に塩基性基を有する基板にスポットする。

スポッティング方法に関し、上述した方法の中でも特にインクジェット法は高密度で尚且つ正確なスポッティングができることから好適なスポッティング方法である。インクジェット法とは、ごく細いノズルの中にプローブを含む溶媒を入れ、ノズルの先端近くを瞬間的に加圧ないし加熱し、ノズルの先端から正確に極微量のプローブを含む溶媒を飛び出させ、基材面に付着させるというものである。

プローブ媒体に含まれる成分はプローブ媒体としてインクジェットヘッドから吐出させた時にプローブに対して実質的に影響を与えないものであって、且つインクジェットヘッドを用いて基材上に正常に吐出可能である媒体組成を満たすものであれば、特に限定されるものではない。例えば、インクジェットヘッドが媒体に熱エネルギーを付与して吐出させる機構を備えるバブルジェットヘッドである場合、グリセリン、チオジグリコール、イソプロピルアルコール、アセチレンアルコールを含む液体はプローブ媒体に含まれる成分として好ましいものである。更に具体的に述べるのであれば、グリセリン５〜１０ｗｔ％、チオジグリコール５〜１０ｗｔ％、アセチレンアルコール０．５〜１ｗｔ％を含む液体がプローブ媒体として好適に用いられる。

また、インクジェットヘッドが圧電素子を用いて媒体を吐出させるピエゾジェットヘッドである場合、エチレングリコール、イソプロピルアルコールを含む液体はプローブ媒体に含まれる成分として好ましいものである。更に具体的には、エチレングリコール５〜１０ｗｔ％、イソプロピルアルコール０．５〜２ｗｔ％を含む液体がプローブ媒体として好適に用いられる。

このようにして得られたプローブ媒体は、インクジェットヘッドより吐出させ基材上に付着させた時、スポットの形状が円形で、また吐出された範囲が広がることがない。高密度にプローブ媒体をスポッティングした場合にも、隣接するスポットとの連結を有効に抑えることができる。なお、本発明のプローブ媒体の特性は上記のものに限定されるものではない。

また、予めプローブと塩基性基を有するシランカップリング剤を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、インクジェット法もしくはピン法などの方法により、基板表面に接触させ、基板表面への塩基性基の導入と、プローブの固定担持を同時に行っても良い。

さらにスポットのプローブの乾燥を低減するために、プローブが溶解あるいは分散してなる水性液中に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、プローブが溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し得るもので、かつ粘性の大きくない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、チオジグリコール、ジメチルスルホキシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、パオゲン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、プルラン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。

高沸点の物質としては、エチレングリコールまたはジエチレングリコールを用いることがさらに好ましい。高沸点の物質の濃度は、プローブの水性液中、０．１〜１０容量％の範囲にあることが好ましい。また、プローブを付与した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２０〜５０℃の温度範囲の環境にいてもよい。

スポッティング後、過剰のプローブを洗浄して除去することが好ましい。プローブの種類にもよるが、チオール基を導入した１本鎖ＤＮＡプローブを用いた場合１分以内でプローブは固定担持されるが、１０分以上放置した後に除去することが好ましい。

このようにして得られたプローブ担持基板は、標的物質を検出するためのプローブ担持担体として好適である。

プローブ担持担体を用い、標的物質の検出等を行う場合、プローブを固相表面に担持した後、基材上のプローブ非結合部分が検体（サンプル）中に含まれる標的物質等と結合しないようにブロッキングを行って検出精度（Ｓ／Ｎ比）の向上を図ることができる。

ブロッキングは例えば、基材を１〜２％ウシ血清アルブミン水溶液中に、２時間程度浸すことにより行なわれる。この場合、基材上のプローブ担持部位以外への標識物質の吸着を防ぐ効果からすると、ウシ血清アルブミン水溶液が好適である。

なお、ブロッキングの工程は必要に応じて行えば良く、例えばサンプルのプローブ担持基材への供給を各々のスポットに対して限定的に行い、スポット以外の部位へのサンプルの付着が実質的にない場合には行わなくても良い。スポット以外の部位へのサンプルが付着される場合は、基材となる材料や、シランカップリング剤の種類によって異なる。また、基材がガラス，石英などである場合において、塩基性基を有するシランカップリング剤のような物質とチオール基を有するプローブを含むプローブ媒体をスポッティングする場合にも、ブロッキング操作は必要ない。

この様にして作製するプローブ担持基材はその用途に応じて、例えば同じプローブを含む複数のスポットを有するように構成しても良く、また異種のプローブを各々含む複数のスポットを有する様に構成してもよい。プローブの種類，数量，配置は必要に応じて適宜変更することが可能である。そしてこの様な方法によってプローブが高密度に配置されたプローブ担持基材は、その後標的物質の検出や、標的物質塩基配列の特定等に用いられる。

例えば、サンプル中に含まれている可能性のある、塩基配列が既知の標的物質である一本鎖核酸の検出に用いる場合は、標的物質の一本鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸をプローブとして用いる。標的物質として、プローブを含む複数のスポットが固相上に配置されているプローブ担持基材を用意し、プローブ担持基材の各々のスポットに、検知物質を含むサンプルを付与して該標的物質の一本鎖核酸とプローブとがハイブリダイズするような条件下に置いた後、各々のスポットにおけるハイブリッドの有無を、例えば蛍光、電波、磁力による検出等の既知の方法で検出する。それによって、サンプル中における標的物質の有無の検出を行うことができる。

また、サンプル中に含まれている標的物質の一本鎖核酸における塩基配列の特定に用いる場合は、標的物質の一本鎖核酸における塩基配列の複数の候補を設定し、塩基配列群に対して各々相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸をプローブとして基材上にスポッティングする。次いで、各々のスポットにサンプルを供給して標的物質の一本鎖核酸とプローブとがハイブリダイズするような条件下に置いた後、各々のスポットにおけるハイブリッドの有無を蛍光検出等の既知の方法で検出する。これにより、標的物質である一本鎖核酸の塩基配列の特定を行うことができる。また本発明に係わるプローブ担持基材の他の用途としては、例えばＤＮＡ結合蛋白質が認識する特異的な塩基配列のスクリーニングやＤＮＡに結合する性質を有する化学物質のスクリーニングへの適用が考えられる。

ハイブリダイゼーションは標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散した水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に付与することによって実施することが好ましい。

ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、そして２〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。

界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。

ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に少ないことである。そのため、固相担体に担持するＤＮＡ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハイブリダーゼーションの最適条件を設定する必要がある。

遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。１塩基ミスマッチ（１塩基変異）の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を２種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。

プローブを担持した基板を切断（ダイシング）してプローブ担体を形成する方法は、
１．ダイヤモンド・カッターを用いて基板表面を罫書いて、基板の表面にスクライブ・ラインを形成し、衝撃ブレーキングによりスクライブ・ラインで破断し、小チップ化する、
２．ダイシング装置を使って切断する、
３．ダイシング装置を用いて切り代を残して切断し、その後、破断する、
４．レーザー切断法による切断する、
５．高分子材料の場合には、切削カッターによる切断方法が適用できる、
また、射出成型法の場合には、その形状・サイズに対応した金型を使用することによって可能である。

１〜４の方法は、半導体のダイシングでよく使われている方法で、シリコン基板、石英基板および石英ガラスのような材料のダイシングに適している。

一方、ダイシング装置を用いる場合、ダイシング中のブレードを冷却するためにブレードに冷却水を供給する必要がある。更に、ダイシング中に生成される基板の切削粒子によりプローブ担体の剥離や特性変化がないことが必要である。

スクライブ＆ブレーキング法はウェット・プロセスを含まないドライ・プロセスなので、プローブ担体の切断加工には適している。

反応チャンバーは、ハイブリダイゼーション反応に影響しない材料で、反応空間の加工性があれば、特に制限はないが、一般には射出成型に適した高分子材料、例えば、ポリカーボネート樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリアクリル系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリエチレン系樹脂などのプラスティックが用いられる。

プローブ担体と反応チャンバーとの接着には、基板材料・カバー材料・ハイブリダイゼーション処理に影響を与えない接着剤であれば、特に制限はない。基板材料およびカバー材料が両方ともプラスティックである場合には、超音波溶着やレーザー溶着も使用することができる。

以下、本発明の好ましい一実施例を添付図面に基づき更に詳細に説明する。これらは説明目的で記載され、本発明を限定するものではない。

＜実施例＞
プローブ担体の作製
◎基板の洗浄
プローブ担持担体の基材として、図１に示す７２ｍｍ角（厚さ０．７ｍｍ）の合成石英ガラス基板１１もしくは図２に示す３インチφ（厚さ０．７ｍｍ）のシリコンウェハ２１を用いた。基板の洗浄は、純水ブラシ洗浄→純水リンス→アルカリ性洗剤超音波洗浄→純水リンス→純水超音波洗浄→純水リンス→窒素ブロー乾燥の順に行い、清浄面を有する基板を用意した。

◎表面処理
アミノシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ−９０３；信越化学工業（株）社製）を０．１ｗｔ％になるように溶解し、３０分間撹拌してメトキシ基を加水分解させた。この水溶液をスピンコーターにて基材に塗布した後、取り出し、オーブン中１２０℃で１時間ベーク処理を行った。

次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（Ｄｏｊｉｎ社製；以後、ＥＭＣＳと略す）を２．７ｍｇ秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。前記のベーク処理したアミノ基導入基板に該ＥＭＣＳ溶液をスピンコーターにて塗布し、表面にマレイミド基を導入した。

◎プローブ担持
メルカプト（ＳＨ）基を導入した合成一本鎖ＤＮＡプローブ断片をグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥ１００；川研ファインケミカル（株）社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液に、０．６ＯＤになるよう溶解させた。該プローブ含有溶液をインクジェット法により、図１および図２に示す通り、前記基板にスポッティングしてプローブ担持アレイ１２（２２）を形成した後、基板を３０分間、恒温恒湿チャンバー内に静置して、基板表面のマレイミド基とＤＮＡプローブ末端のメルカプト基とを反応させた。次いで、１Ｍ−ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）で洗浄し、純水で軽く洗浄した後、窒素ブロー乾燥してプローブ担持担体を得た。

◎プローブ担体の切断・小チップ化
プローブ担持した合成石英ガラス基板１１を接着シートに貼り付け、ダイヤモンド・カッターにてスクライブ・ライン１４を罫書き、破断して、プローブ担持アレイ１２を含む小チップ（例えば、１８ｍｍ角）１３を得た。

プローブ担持したシリコン基板２１を接着シートに貼り付け、ダイシング装置によりライン２４に沿って切断して、プローブ担持アレイ２２を含む小チップ（例えば、１８ｍｍ角）２３を得た。

反応チャンバーの作製
●カバー部材は、プローブ担体を載置する手段と反応空間に溶液を蓄え、プローブと溶液とを反応させる反応空間と溶液を注入・排出する開孔を持っているので、反応チャンバーと称させていただきます。●⇒プローブ担体とカバー部材を組合せて（接合して）反応チャンバーの反応空間を形成するので、一律に反応チャンバーとしてしまうと紛らわしいと思います。区別していただきたいと思います。

図３は、プローブ担体とカバー部材を示すとともに、それらを接合して形成されてなる反応チャンバー付プローブ担体を示す模式図で、図３（ａ）は、カバー部材を俯瞰した模式的平面図である。カバー部材３２は、外から溶液を反応チャンバー３４に注入あるいは、反応チャンバー３４から溶液を排出する流路となる連通孔３３が形成されている。

図３（ｂ）は、カバー部材３２を載置するプローブ担体１３（２３）を俯瞰した模式的平面図である。プローブ担体１３（２３）を構成する基材上にプローブアレイ１２が形成されている。プローブアレイ１２の拡大図に示すように、基材上にプローブ３１がマトリックス状に担持されている。

図３（ｃ）は、プローブ担体１３上に形成されたプローブアレイ１２がカバー部材と接合されて反応チャンバー３４に対向するように載置した状態を示す模式的平面図である。

図４（a）は、図３のＡ−Ａ'の断面を示す模式的断面である。カバー部材３２はプローブ担体の嵌合スペース３５を有し、該嵌合スペース３５にプローブ担体を嵌合することにより、反応チャンバー３４が形成される。

図４（ｂ）は、図３のＢ−Ｂ'の断面を示す模式的断面である。反応チャンバー３４は、連通孔３３を介して反応チャンバー３４の外部と連通している。

カバー部材３２に設けた１対の連通孔３３により、検体となる溶液を反応チャンバー３４に注入し、反応チャンバー３４から排出される。カバー部材３２は、アクリル樹脂基板を削り出し加工する、あるいは、金型を作製し、射出成型機により、大量に生産することも可能である。

カバー部材３２表面の連通孔３３の開口部の位置は図示しないが規格化されている必要がある。一方、検体の量あるいは検出する検体の種類等の状況にあわせて連通孔３３から検体を反応チャンバー３４に注入および排出が可能な範囲で反応チャンバー３４およびプローブ担体１３の大きさを変えることができる。

この結果、同一のカートリッジを用いて異なる寸法のプローブ担体、および／あるいは、異なる体積の反応空間を持った反応チャンバー３２を、同一形状のカートリッジを用いて検査することができる。

プローブ担体と反応チャンバーとの接着
カバー部材３２の反応チャンバー３４となる空間以外の部分（図４（ａ）のＣ部）に紫外線硬化型樹脂を塗布し、プローブ担体１３もしくは２３をプローブ担体の嵌合スペース３５に嵌合し、貼り合せた後、所定量の紫外線を照射して、硬化・接着して、反応チャンバー付プローブ担体３６が得られる。

反応チャンバー付プローブ担体のカートリッジへの取付け
カートリッジの構成は検査システム装置の構成にも依存するが、プローブ担体の大きさが変っても、反応チャンバー付プローブ担体の外形寸法が規格に則ったものであって、カバー部材の連通孔の開口部が決められた位置に形成されているのでカートリッジを変えることなく反応や検査を行うことができる。

カートリッジに反応チャンバーを載置した例を図５に示す。

図５（Ａ）は、反応チャンバー付プローブ担体をカートリッジに１つ設置するタイプである。図５（Ｂ）は反応チャンバー付きプローブ担体をカートリッジに４つ設置するタイプである。それぞれ反応チャンバー付プローブ担体の固定機構および開口４２があり、カートリッジにプローブ担体を設置した状態で、検査システム装置内での加熱処理が可能である。またカートリッジの開口部が、検出のためのウィンドウ（窓）としても機能する。更に、カートリッジ図面には示していないが、カートリッジ状態での検査システム装置内の移動や検出のためのガイドをカートリッジに設けることも可能である。もちろん、カートリッジ導入した後に検査システム装置内で、プローブ担体３６が分離して処理されるように装置構成してもよい。

本発明の角形基板を用いたプローブ担体を示し、規格化された大きさに切断した小チップも示した図である。 本発明の丸形ウェハ基板を用いたプローブ担体を示し、規格化された大きさに切断した小チップも示した図である。 本発明のプローブ担体と反応チャンバーを示し、それらを接着して、反応チャンバー付与プローブ担体を構成した図である。 反応チャンバーの断面形状を示す図である。 反応チャンバー付与プローブ担体を嵌合するカートリッジを示す図である。

符号の説明

１１ 角型基板
１２ プローブアレイ
１３ 規格化された大きさのプローブ担体
１４ 切断ライン、
２１ 丸型ウェハ
２３ 規格化された大きさのプローブ担体、２４ 切断ライン、
３１ 基板に付与したプローブ
３２ カバー部材
３３ ポート孔
３４ 反応チャンバー
３５ プローブ担体の嵌合スペース
３６ 反応チャンバー付与プローブ担体
４１ 反応チャンバー付与プローブ担体１つを嵌合するカートリッジ
４２ ウィンドウ（窓）
４３ 反応チャンバー付与プローブ担体４つを嵌合するカートリッジ

Claims (10)

1. 少なくとも検体を生化学処理するための溶液が内蔵された、あるいは溶液を供給するカートリッジと、検体中の標的物質を検出するプローブが担持されたプローブ担体が載置され、生化学処理された検体中の標的物質の検出反応を行なうための反応チャンバーとを嵌合させた生化学反応カートリッジであって、
   前記カートリッジは、前記反応チャンバーに前記溶液を注入する第１の注入口と、前記チャンバーから排出される前記溶液を受ける第１の排出口と、前記プローブ担体が載置された前記反応チャンバーを載置する載置部とを有し、
   注入口と排出口を有する前記反応チャンバーは、前記プローブ担体に載置することにより、前記溶液と前記プローブ担体に担持されたプローブとを反応させる反応空間を構成し、
   前記第１の注入口および前記第１の排出口とが接続されていることを特徴とする生化学反応カートリッジ。
2. 前記反応チャンバーが前記カートリッジの前記反応チャンバーを載置する載置部に嵌合されていることを特徴とする請求項１に記載の生化学反応カートリッジ。
3. 前記プローブ担体を構成する基板の材料が、石英、石英ガラス、無アルカリガラス、単結晶シリコンまたは高分子材料である請求項１記載の生化学反応カートリッジ。
4. 前記プローブ担体のプローブが基板に共有結合していることを特徴とする請求項１記載の生化学反応カートリッジ。
5. 前記反応チャンバーがプラスティックであり、射出成型法により製造されることを特徴とする請求項１記載の生化学反応カートリッジ。
6. 前記プローブ担体が、前記基板をスクライブおよびブレーキング切断法、ダイシング切断法もしくはレーザー切断法により小片化されていることを特徴とする請求項４記載の生化学反応カートリッジ。
7. 前記プローブ担体と反応チャンバーとが、超音波溶着法、レーザー溶着法もしくは接着剤により接着されていることを特徴とする請求項１記載の生化学反応カートリッジ。
8. （ｉ）少なくとも検体を生化学処理するための溶液が内蔵された、あるいは溶液を供給するカートリッジと、
   （ｉｉ）検体中の標的物質を検出するプローブが配置されている領域を有しているプローブ担体と、該プローブ担体と共に該領域を内包する反応チャンバーを構成するカバー部材とによって構成されている反応チャンバー付プローブ担体とを嵌合させた生化学反応カートリッジであって、
   前記カートリッジは、前記反応チャンバーに前記溶液を注入する第１の注入口と、前記チャンバーから排出される前記溶液を受ける第１の排出口と、前記反応チャンバー付プローブ担体を載置する載置部とを有し、
   前記カバー部材は、該反応チャンバーと外部との液体の授受を行う少なくとも２つの連通孔を備え、
   前記第１の注入口および前記第１の排出口との各々は、前記カバー部材の２つの連通孔の開口部の各々と接続されていることを特徴とする生化学反応カートリッジ。
9. 検体中の標的物質を検出するプローブが配置されている領域を有しているプローブ担体と共に用いられるカバー部材であって、
   前記プローブ担体の嵌合スペースと、該嵌合スペースに前記プローブ担体を嵌合することによって前記領域を内包する反応チャンバーを構成する空間と、を具備し、
   更に、前記嵌合スペースへの前記プロ−ブ担体の嵌合によって形成される反応チャンバーへの液体の授受のための連通孔を具備していることを特徴とするカバー部材。
10. 反応チャンバー付プローブ担体であって、
    （ｉ）検体中の標的物質を検出するプローブが配置されている領域を有しているプローブ担体と、
    （ｉｉ）請求項９に記載のカバー部材とを含み、
    前記プローブ担体が、前記カバー部材の嵌合スペースに嵌合し、前記プローブ担体と前記カバー部材とで反応チャンバーが構成されていることを特徴とする反応チャンバー付プロ−ブ担体。

Images