JP2007153894A - 異常細胞成長の処置方法 - Google Patents

Abstract

【課題】癌に罹患した哺乳動物を治療する方法を提供する。
【解決手段】哺乳動物における異常細胞成長を処置するための、新規なc-Met/HGFR阻害剤である、(R)-3-[1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-5-(1-ピペリジン-4-イル-1H-ピラゾール-4-イル)-ピリジン-2-イルアミンの使用。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、哺乳動物における異常細胞成長を処置するためのc-Met/HGFRインヒビターの使用に関する。特に、本発明は、癌に罹患した哺乳動物を治療する方法を提供する。

発明の背景
本願は、2005年12月5日に出願の米国仮出願第60/742,766号及び2006年10月7日出願の米国仮出願第60/864,637号の利益を請求する。これらの内容は本明細書に参考としてその全体が組み込まれる。

式1：

で表される化合物 (R)-3-[1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-5-(1-ピペリジン-4-イル-1H-ピラゾール-4-イル)-ピリジン-2-イルアミンは、c-Met/HGFR（肝細胞成長因子受容体）キナーゼ及びALK（未分化リンパ腫キナーゼ）の強力な小分子インヒビターである。化合物1は、幅広い種類の腫瘍の成長及び転移性進行の調節に関連するc-Met/HGF及びALCL（未分化大細胞性リンパ腫）の病原性に関連するALKR、の阻害によって薬理学的に仲介される抗腫瘍活性を有する。化合物1は、いずれも本明細書に参考としてその全体が組み込まれている、国際出願第PCT/IB2005/002837号及び米国特許出願第11/212,331号に開示されている。更に、化合物1のラセミ体は、国際出願第PCT/IB2005/002695号及び米国特許出願第11/212,039号に開示されている。

ヒト癌は、世界中の開発国で総じて主な死亡原因の1つである様々な疾患群を含む（米国癌協会、癌の実態及び形態2005、アトランタ：米国癌協会；2005）。癌の進行は、遺伝子変異、染色体転座及び核型異常を含む、複数の遺伝的及び分子的事象の複雑なシリーズが原因となる（Hanahan D, Weinberg RA. 癌の顕著な特徴 Cell 2000; 100: 57-70）。癌の根底にある遺伝的原因は複雑かつ様々であるが、各癌の種類は、一般的な特徴を示すことが観察され、その進行を促進する可能性を獲得してきた。これらの獲得された可能性は、調節不全細胞成長、血管を救援する持続能力（すなわち、脈管形成）及び局部的に拡がり及び二次的臓器部位に転移する腫瘍細胞の能力を含む（Hanahan D, Weinberg RA. 癌の顕著な特徴 Cell 2000; 100: 57-70）。従って、1)癌進行中に変化する分子標的を阻害し、2)様々な腫瘍における癌の進行に共通する複数のプロセスを標的する新規の治療剤を同定する能力は、重要な、かつ未だ対処されていない必要性を提供する。

文献の広範な部分は、c-Met/HGFRが様々なヒト癌における最も頻繁に変異される又は異常に活性化されたRTKの1つである、ことを示している（Cristensen JG, Burrows J, Salgia R. ヒト癌の標的としてのc-Met及び治療的インターベンション用の阻害剤の特徴 Cancer Letters 2005; 225: 1-26）。C-Met/HGFRが変異又は遺伝子増幅によって遺伝的に改変されることが報告されている腫瘍の種類は、強力なかつ未だ対処されていない医療的必要性を有する癌兆候、例えば腎臓、転移性結腸直腸、神経膠腫、非小細胞肺、胃、及び頭部及び頚部の癌に限定されない（Cristensen JG, Burrows J, Salgia R. ヒト癌の標的としてのc-Met及び治療的インターベンション用の阻害剤の特徴 Cancer Letters 2005; 225: 1-26）。

HGFR変異は腎癌に関連している（例えば、L. Schmidt, K. Junker, N. Nakaigawa, T. Kinjerski, G. Weirich, M. Miller他, Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Oncogene 1999; 18: 2343-2350; L. Schmidt, F. M. duh, F. Chen, T. Kishida, G. Glenn, P. Choyke他、Germline and somatic mutations in the tyrosisne kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Nat. Genet. 1997: 16: 68-73; L. Schmidt, K. Junker, G. Weirich, G. Glenn, P. Choyke, I. Lubensky他, Two North American families with hereditary papillary renal carcinoma and identical novel mutations in the MET proto-oncogene, Cancer Res. 1998; 58: 1719-1722を参照）。HGFR変異は頭部及び頚部の癌に関連する（例えばM. F. DiRenzo, M. Olivero, T. Martone, A. Maffe, P. Maggiora, A. D. Stefani他, Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas, Oncogene 2000; 19: 1547-1555; D. M. Aebersold, O. Landt, S. Berthou, G. Gruber, K. T. Beer, R. H. Greiner, Y. Zimmer, Prevalence and clinical impact of Met Y1253D-activating point mutation in radiotherapytreated squamoous cell cancer of the oropharynx, Oncogene 2003; 22: 8519-8523参照）。HGFR変異は肺癌に関連する（例えばP. C. Ma, T. Kijima, G. Maulik, E. A. Fox, M. Sattler, J. D. Griffin他, c-MET mutational analysis in small cell lung cancer: novel juxtamembrane domain mutations regulating cytoskeletal functions, Cancer Res. 2003; 63: 6272-6281; P. C. Ma, S. Jagadeeswaran, E. A. Fox, J. G. Christensen, G. Maulik他, c- MET expression/activation, functions, and mutations in non-small cell lung cancer, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2004; 63: 1875参照）。

更に、HGFR変異は、小児肝細胞癌、ヒト胃癌、硬性胃癌、結腸直腸癌及び悪性黒色腫に限定されない他の兆候に関連する（例えば、W. S. Park, S. M. Dong, S. Y. Kim, E. Y. Na, M. S. Shin, J. H. Pi他, Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hhepatocyte growth factor receptor gene in childhood hepatocellular carcinomas, Cancer Res. 1999; 59: 307-310; J. H. Lee, S. U. Han, H. Cho, B. Jennings, B. Gerrard, M. Dean他, A novel germ line juxtamembrane Met mutation in human gastric cancer, Oncogene 2000; 19: 4947-4953; A Lorenzato, M. Olivero, S. Patane, E. Rosso, A. Oliaro, P. M. Comoglio, M. F. Di Renzo, Novel somatic mutations of the MET oncogene in human carcinoma metastases activating cell motility and invasion, Cancer Res. 2002; 62: 7025-7030; H. Kuniyasu, W. Yasui, Y. Kitadai, H. Yokozaki, H, Ito, E. Tahara, Frequent amplification of the c-met gene in scirrhous type stomach cancer, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992; 227-232; M. F. Di Renzo, M. Olivero, A. Giacomini, H. Porte, E. Chastre, L. Mirossay他, Overexpression and amplification of the met/HGF receptor gene during the progression of colorectal cancer, Clin. Cancer Res. 1995; 1: 147-154; T. Hara, A. Ooi, M. Kobayashi, M. Mai, K. Yanagihara, I. Nakanishi, Amplification of c-myc, K-sam, and c-met in gastric cancers: detection by fluorescence in situ hybridization, Lab. Invest. 1988; 78: 1143-1153参照）。

HGFR変異と、機能及び発癌可能性との関係も確立されている（例えば、M. Jeffers, L. Schmidt, N. Nakaigawa, C. P. Webb, G. Weirich, T. Kishida他, Activating mutations for the met tyrosine kinase receptor in human cancer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997; 94: 11445-11450; M. Jeffers, M. Fiscella, C. P. Webb, M. Anver, S. Koochekpour, G. F. Vande Woude, The mutationally activated Met receptor mediates motility and metastasis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95: 14417-14422参照）。

最後に、HGFR変異は、マウス癌に関連し、マウス癌で研究されてきた（例えば、H. Takayama, W. J. LaRochelle, R. Sharp, T. Otsuka, P. Kriebel, M. Anver他, Diverse tumorigenesis associated with aberrant development in mice overexpressing hepatocyte growth factor/scatter factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 94: 701-706; T.Otsuka, H, Takayama, R. Sharp, G. Celli, W. J. LaRochelle, D. P. Bottaro他, c-<et autocrine activation induces development of malignant melanoma and acquisition of the metastatic phenotype, Cancer Res. 1988; 58: 5157-5167; M. I. Gallego, B. Bierie, L. Hennighausen, Targeted expression of HGF/SF in mouse mammary epithelium leads to metastatic adenosquamous carcinomas through the activation of multiple signal transduction pathways, Oncogene 2003; 22: 8498-8508; C. R. Graveel, Y. Su., L. M. Wang, M. Fiscella, T. Lino, C. Birchmeier他, Tumorigenic effects of activating Met mutations in a knock-in mouse model, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2004; 44: 5102参照）。

NPM-ALK、すなわち未分化リンパ腫キナーゼ発癌性融合タンパク質変異体は、染色体転座がヒト未分化大細胞リンパ腫の病原性に関連していることから生じる（Pulford K, Morris SW, Turturro F. Anaplastic lymphoma kinase proteins in growth control and cancer. J. Cell Physiol 2004; 199: 330-58）。ALCLの病原性における、本質的に活性なALKキメラタンパク質の異常発現の役割は十分に明らかにされている（Weihua Wan他, Anaplastic lymphoma kinase activity is essential for the proliferation and survival of anaplastic large cell lymphoma cells. Blood first Edition Paper, prepublished online October 27, 2005; DOI 10.1182/blood-2005-08-3254）。

c-Met/HGFR（野生型c-Metを含む）の不適切な活性化も、複数の癌の発癌プロセス、例えば有糸分裂生起、生存、脈管形成、侵襲的成長及び特に転移プロセス、の調節不全に関連する（Christensen他，2005）。更に、c-Met及びHGF、その内の1つ、高親和性リガンドの発現は、多くの主なヒト癌における低予知又は転移性進行に関連することが証明された（Christensen他，2005）。NPM-ALKは、細胞増殖及びALCLリンパ腫細胞のアポトーシスの調節不全に関連する（Pulford他，2004）。

発明の概要
1つの実施態様では、本発明は、そのような治療を必要としている哺乳動物の異常細胞成長を処置する方法であって、式1：

の化合物又はその薬学的に許容される塩の治療上有効量を哺乳動物に投与するステップを含む、前記方法を提供する。

別の実施態様では、当該哺乳動物はヒトである。別の実施態様では、当該哺乳動物はイヌである。

別の実施態様では、異常細胞成長は、少なくとも1つの遺伝子組換えされたチロシンキナーゼによって仲介される。別の実施態様では、異常細胞成長は、肝細胞成長因子受容体（c-Met/HGFR）キナーゼ又は未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）によって仲介される。別の実施態様では、異常細胞成長は、肝細胞成長因子受容体（c-Met/HGFR）キナーゼによって仲介される。別の実施態様では、異常細胞成長は、未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）によって仲介される。

別の実施態様では、異常細胞成長は癌である。別の実施態様では、癌は、肺癌、骨肉種、膵癌、皮膚癌、頭部又は頚部の癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、結腸癌、乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経（CNS）腫瘍、中枢神経原発悪性リンパ腫、脊髄軸癌、脳幹膠腫、下垂体腺腫及びそれらの組合せからなる群より選ばれる。

更に別の実施態様では、癌は、非小細胞肺癌（NSCLC）、扁平上皮細胞癌、ホルモン性-難治性前立腺癌、乳頭状腎細胞癌、直腸結腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）及び胃癌からなる群より選ばれる。

更に別の実施態様では、化合物又はその薬学的に許容される塩は、式1の化合物及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として投与される。

更に別の実施態様では、本発明は式1：

の化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することによって細胞中のc-Met/HGFRキナーゼ活性を阻害する方法を提供する。

更に別の実施態様では、細胞は、ヒト肺癌A549、ヒト胃癌GTL-16、ヒト結腸癌HT-29、ヒト結腸癌Colo205、ヒト腎癌A498、ヒト腎癌786-O、ヒト乳癌MBA-MD-231、イヌ腎由来（MDCK）上皮細胞、P-糖タンパク質を発現させるために設計されたMDCK細胞（MDCK-MDR1）、mIMCD3マウス腎上皮、HUVEC（ヒト臍静脈内皮細胞）、腎癌Caki-1、並びにヒト野生型c-Met/HGFR、及びHGFR-V10921、HGFR-H1094R、HGFR-Y1230C及びHGFR-M1250Tを含む変異c-Met/HGFRを発現させるために設計されたNIH-3T3細胞、からなる群より選ばれる。

発明の詳細な説明
特に断らない限り、本発明の化合物に関する本明細書に記載の全ての文献は、その塩、溶媒和物、水和物及び複合体に関する文献、及びその溶媒和物、水和物及びその塩の複合体、例えば多型、立体異性体及びその同位体標識された変形に関する文献、を含む。

定義
特に断らない限り、本明細書で用いる用語「異常細胞成長」は、正常な調節機構と無関係な細胞成長を意味する（例えば接触阻害の喪失）。

特に断らなければ、本明細書で用いる用語「処置する」は、かかる用語が適用される疾患もしくは症状又はかかる疾患もしくは症状の1以上の兆候の進行を逆転させ、緩和し、抑制し、又はこれらを予防することを意味する。本明細書で用いる用語「処置」は、特に断らない限り、「処置する」が直ちに上で定義されるような処置行為を言う。

本明細書で用いる用語「薬学的に許容される塩」は、酸付加塩及び塩基性塩（二重塩を含む）を含む。

好適な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。具体例は、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシレート、重炭酸塩/炭酸塩、重硫酸塩/硫酸塩、ホウ酸塩、カムシル酸（camsylate）、クエン酸塩、エデシラート、エシレート、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩/塩化物、臭化水素塩/臭化物、ヨウ化水素塩/ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩、2-ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロチン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモン酸塩、リン酸塩/一水素リン酸塩/二水素リン酸塩、サッカラート、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩及びトリフルオロ酢酸塩を含む。

好適な塩基性塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。具体例は、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオールアミン、グリシン、リジン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン及び亜鉛の塩を含む。

好適な薬学的に許容される塩に関する考察に関しては、本明細書に文献としてその全体が組み込まれている、Stahl及びWermuthによる”Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use” (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002）を参照されたい。

本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、必要に応じて、化合物の溶液と所望の酸又は塩基とを混合することにより容易に調製できる。塩は、溶液から沈殿させ、濾過によって回収してもよく、又は溶媒の濃縮によって回収してもよい。塩のイオン化の程度は、完全なイオン化からほとんど非イオン化まで変化させてよい。

本発明の化合物は非溶媒和物及び溶媒和物の形態で存在すればよい。用語「溶媒和物」は、本明細書では、本発明の化合物及び1以上の薬学的に許容される溶媒分子、例えばエタノールを含む分子複合体を記載するために用いられる。用語「水和物」は、溶媒として水を使用する場合に用いられる。本発明に従う薬学的に許容される溶媒和物は、結晶溶媒が同位体置換されている水和物及び溶媒和物。たとえばD₂O、d₆-アセトン、d₆-DMSOを含む。

本発明はまた、1以上の原子が、本来一般的に見出される原子量又は質量数とは異なった原子量又は質量数を有する原子によって置換されることを除いて、化合物1と同一である放射性同位体標識化合物を含む。本発明の化合物に取り込まれ得る同位体の例は、水素、炭素、窒素、酸素、リン、イオウ、フッ素及び塩素の同位体、例えば、各々、²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F及び³⁶Clを含む。上記同位体及び/又は他の原子の他の同位体を含む、本発明の化合物及び当該化合物の薬学的に許容される塩は、本発明の範囲内にある。本発明のある同位体標識化合物、例えば放射性同位体例えば³H及び¹⁴Cが取り込まれる化合物は、薬物及び/又は基質組織分布アッセイで有用である。トリチウムすなわち³H及び炭素-14すなわち¹⁴C同位体は、特に調製及び検出の容易さから好ましい。更に、より重同位体、例えばジュウテリウムすなわち²Hによる置換は、より大きな代謝的安定性から生じるある治療的利点、例えばin vivoでの半減期の増加又は投薬量の減少の要件を与え、よって、ある環境では好ましい。本発明の同位体標識化合物1は一般的に、非標識化合物について記載された方法を実施することによって調製でき、非同位体標識試薬を容易に入手可能な同位体標識試薬に置き換える。

複合体、例えば包接化合物、薬物-ホスト包接複合体であって、上記の溶媒和物に対して、薬物及びホストが化学両論量又は非化学両論量で存在する複合体も、本発明の範囲内に含まれる。化学両論量又は非化学両論量で存在することができる、2以上の有機及び/又は無機成分を含む薬物の複合体も含まれる。得られた複合体は、イオン化、部分的にイオン化又は非イオン化することができる。かかる複合体の考察のために、本明細書に文献として全体が組み込まれている、HaleblianによるJ Pharm Sci. 64 (8), 1269-1288 (August 1975)を参照されたい。

経口投与
本発明の化合物は経口的に投与できる。経口投与は、化合物が胃腸管に入るように嚥下を含んでもよく、又は化合物が口から直接血流に入る舌下もしくは舌下腺投与も採用できる。

経口投与に好適な製剤は、固体製剤、例えば錠剤、粒子を含むカプセル剤、液剤、又は粉剤、トローチ剤（液体充填を具汲む）、噛み剤（chew）、マルチ-及びナノ-粒子、ゲル、固体液剤、リポゾーム、フィルム（粘膜接着を含む）、オブレ（ovule）、スプレイ及び液体製剤を含む。

液体製剤は、懸濁液、溶液、シロップ及びエリキシルを含む。かかる製剤は、軟又は硬カプセルとして用いることができ、典型的には薬学的に許容される担体、例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース又は好適な油、及び1以上の乳化剤及び/又は懸濁剤を含む。液体製剤は、固体、例えばサシェから再構成することによっても調製できる。

本発明の化合物は、迅速型溶解、迅速型崩壊投薬剤形、例えば本明細書に文献としてその全体が組み込まれているLiang及びChenによる Expert Opinion in Therapeutic Patents, 11 (6), 981-986 （2001）に記載の剤形、としても使用できる。

錠剤投薬剤形に関しては、投薬量によって、薬物は、投薬剤形の1重量%〜80重量%、より典型的には投薬剤形の5重量%〜60重量%を構成してもよい。薬物に加えて、錠剤は一般的に崩壊剤を含む。崩壊剤の例は、グリコール酸デンプンナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、微結晶性セルロース、低級アルキル-置換ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファーデンプン及びアルギン酸ナトリウムを含む。一般的に、崩壊剤は、投薬剤形の1重量%〜25重量%、好ましくは5重量%〜20重量%を含むことになる。

結合剤は一般的に、錠剤に粘着性を与えるために使用される。好適な結合剤は、微結晶性セルロース、ゼラチン、糖類、ポリエチレングリコール、天然及び合成ガム、ポリビニルピロリドン、アルファーデンプン、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。錠剤は、希釈剤、例えばラクトース（一水和物、噴霧乾燥一水和物、無水等）、マンニトール、キシリトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、微結晶性セルロース、デンプン及び第二リン酸カルシウム二水和物を含んでもよい。

錠剤は、場合により表面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びポリソルベート80、及び流動促進剤例えば二酸化ケイ素及びタルクを含んでもよい。存在する場合には、表面活性剤は、典型的には、錠剤の0.2重量%〜5重量%の量であり、流動促進剤は、典型的には錠剤の0.2重量%〜1重量%である。

錠剤は一般的に、滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリルフマル酸ナトリウム、及びステアリン酸マグネシウムとラウリル硫酸ナトリウムとの混合物も含む。滑剤は一般的に、錠剤の0.25重量%〜10重量%、好ましくは0.5重量%〜3重量%の量で存在する。

他の慣用的な成分は、抗酸化剤、着色料、香料、保存料及び風味マスキング剤を含む。

具体的な錠剤は、最高約80重量%薬物、約10重量%〜約90重量%結合剤、約0重量%〜約85重量%希釈剤、約2重量%〜約10重量%崩壊剤、及び約0.25重量%〜約10重量%滑剤を含む。

錠剤混合物は、直接又はローラーで圧縮して錠剤に形成できる。錠剤混合物又は混合物の一部分は、錠剤化の前に、選択的に、湿式-、乾式-又は融解-粒状化、融解凝固、又は押出すことができる。最終製剤は、1以上の層を含み、被覆し又は被覆しないこともでき；又はカプセル化することもできる。

錠剤の製剤化は、本明細書に文献としてその全体が組み込まれている、H. Lieberman及びL. Lachmanによる、”Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol. 1”, Marcel Dekker, N.Y., N.Y., 1980 (ISBN 0-8247-6918-X)に詳細が考察される。

経口投与用の固体製剤は、迅速及び/又は変更型放出であるように製剤化できる。変更型放出製剤は、遅延型-、徐放型-、パルス型-、制御型-、標的型-及びプログラムされた放出を含む。

好適な変更型放出製剤は、米国特許第6,106,864号明細書に記載されている。他の好適な放出技術の詳細、例えば高エネルギー分散剤及び浸透性かつ被覆された粒子、はVerma他, Pharmaceutical Technology On-line, 25(2), 1-14 (2001)に見出される。制御された放出を達成するためのチューイングガムの使用は、WO 00/35298に記載されている。これらの文献の開示は、本明細書に文献としてその全体が組み込まれている。

非経口投与
本発明の化合物は、血流、筋肉、又は内臓へ直接に投与することのもできる。非経口投与のための好適な手段は、静脈内、動脈内、腹腔内、鞘内、心室内、尿道口内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内及び皮下を含む。非経口投与用の好適な器具は、ニードル（微小ニードルを含む）インジェクター、ニードル無のインジェクター及び注入技術を含む。

非経口製剤は、典型的には、賦形剤、例えば塩、炭水化物及び緩衝剤（好ましくは、3〜9のpH）を含んでもよい水溶液である。しかし、用途によっては、殺菌非水溶液、又は好適なビヒクル例えば殺菌した発熱性物質のない水と組み合わせて用いられるべき乾燥形としてより好適に製剤化できる。

殺菌条件、例えば凍結乾燥による非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的医薬技術を用いて容易に達成できる。

非経口溶液の調製で用いられる本発明の化合物の溶解度は、好適な製剤技術の使用、例えば溶解度増加剤の採用によって増加させることができる。

非経口投与用製剤は、迅速型及び/又は変更型放出であるように製剤化できる。変更型放出製剤は、遅延型-、徐放型-、パルス型-、制御型-、標的型-及びプログラムされた放出を含む。従って、本発明の化合物は、活性化合物の変更型放出を提供する移植型デポー（depot）として投与するための、固体、半固体、又は揺変性液として製剤化できる。かかる製剤は、薬物被覆ステント及びPGLAミクロスフェアを含む。

局所投与
本発明の化合物は、皮膚又は粘膜に局所的、すなわち、皮膚的に又は経皮的に投与することもできる。この目的の典型的な製剤は、ゲル、ハイドロゲル、ローション、液剤、クリーム、軟膏、粉剤、包帯、泡剤、フィルム、皮膚パッチ、ウエハー、インプラント、スポンジ、ファイバー、帯具及びマイクロエマルジョンを含む。リポソームも使用できる。典型的な担体は、アルコール、水、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコールを含む。浸透性エンハンサーが組み込まれてもよい；例えばFinnin及びMorganによるJ Pharm Sci, 88 (10), 955-958（October 1999）を参照。局所投与の他の手段は、エレクトロポレーション、イオントフォレシス、フォノフォレシス、ソノフォレシス及びミクロニードル又はニードル無し（例えばPowderject（商標）、Bioject（商標）等）の注射による送達を含む。

局所投与用製剤は、迅速及び/又は変更型放出であるように製剤化できる。変更型放出製剤は、遅延型-、徐放型-、パルス型-、制御型-、標的型-及びプログラムされた放出を含む。

吸入/鼻吸入投与
本発明の化合物は、鼻吸入的に又は吸入によっても、典型的には乾燥粉末吸入器からの乾燥粉末（単独又は混合物として、例えば、ラクトースとの乾燥混合物、又は混合成分粒子として例えばリン脂質例えばフォスファチジルコリンとの混合）の形態で、あるいは加圧型容器、ポンプ、スプレイ、アトマイザー（好ましくは微霧を生成するために電気流体力学を用いる噴霧器）又はネブライザーからのアエロゾルスプレイとして、好適な発射剤、例えば1,1,1,2-テトラフルオロエタン又は1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパンを使用して又は使用しないで、投与できる。鼻吸入用途に関しては、粉末は、生物接着剤、例えばキトサン又はシクロでキストリンを含んでもよい。

加圧容器、ポンプ、スプレイ、アトマイザー又はネブライザーは、例えば、エタノール、エタノール水溶液、又は活性物を分散、溶解又はその放出を拡げるための好適な代わりの薬剤、溶媒としての発射剤及び任意の界面活性剤、例えばソルビタントリオレエート、オレイン酸もしくはオリゴ乳酸を含む、本発明の化合物の溶液又は懸濁液を含む。

乾燥粉剤又は懸濁剤での使用の前に、薬物を吸入によって送達するために好適なサイズ（典型的には5ミクロン未満）に微粉化する。これは、任意の好適な細分方法、例えばスパイラルジェットミリング、流動床ジェットミリング、ナノ粒子をつくるための超臨界流体、高圧均質化又はスプレイ乾燥、によって達成できる。

吸入器又は粉吹き器で使用するための、カプセル（例えばゲラチン又はHPMC製）、ブリスター及びカートリッジは、本発明の化合物の粉末混合物、好適な粉末基材、例えばラクトース又はデンプン及び遂行改変剤（performance modifier）例えばL-ロイシン、マンニトールもしくはステアリン酸マグネシウムを含むように製剤化できる。ラクトースは、無水でも又は一水和物の形態でもよい。好ましくは後者である。他の好適な賦形剤は、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロース及びトレハロースを含む。

微霧をつくるために電気流体力学を用いるアトマイザーでの使用のための好適な液剤は、/1作動当たり本発明の化合物の1μg〜20mgを含んでよく、作動体積は1μL〜100μLまで変化してよい。典型的な製剤は、本発明の化合物、プロピレングリコール、殺菌水、エタノール及び塩化ナトリウムを含む。プロピレングリコールの代わりに用いられる代わりの溶媒は、グリセロール及びポリエチレングリコールを含む。

好適な香料例えばメントール及びレボメントール、又は甘味料例えばサッカリン又はサッカリンナトリウムは、吸入/鼻吸入投与を意図する本発明の製剤に添加できる。

吸入/鼻吸入投与用製剤は、例えばグリコール酸/DL-乳酸共重合体（PGLA）を用いて、迅速及び/又は変更型放出であるように製剤できる。変更型放出製剤は、遅延型-、徐放型-、パルス型-、制御型-、標的型及びプログラムされた放出を含む。

乾燥粉末吸入器及びアエロゾルの場合には、投薬単位は、測定された量を送達するバルブの方法によって決定される。本発明に従う単位は、典型的には、本発明の化合物の所望量を含む測定された用量又は「一服（puff）」を投与するために調整される。日量全体は、単回投与で、又は通常、一日の分割量として投与できる。

直腸/膣内投与
本発明の化合物は、例えば座薬、ペッサリー又は浣腸剤の形態で、直腸的に又は膣内に投与できる。ココアバターは、典型的な座薬基材であるが、様々な代替物が好適に使用できる。

直腸/膣内投与用製剤は、迅速及び/又は変更型放出であるように製剤化できる。変更型放出製剤は、遅延型-、徐放型-、パルス型-、制御型-、標的型-及びプログラムされた放出を含む。

眼内投与
本発明の化合物は、眼又は耳に、典型的には、等張の、pH-調整された殺菌生理食塩水中の、微粉化懸濁液又は溶液の液滴の形態で、直接、投与することもできる。眼内及び耳内投与に好適な他の製剤は、軟膏、生分解性（例えば、吸収性ゲルスポンジ、コラーゲン）及び非-生分解性（例えば、シリコン）インプラント、ウエハー、レンズ及び粒子又は小胞系、例えばニオソームもしくはリポソームを含む。ポリマー、例えば架橋ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、セルロース性ポリマー、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース又はメチルセルロース、又はヘテロポリサッカライドポリマー、例えばゼラチンガムは、保存料例えば塩化ベンザルコニウムと共に取り込める。

眼内/耳内投与用製剤は、迅速及び/又は変更型放出であるように製剤化できる。変更型放出は、遅延型-、徐放型-、パルス型-、制御型-、標的型またはプログラムされた放出を含む。

他の方法
本発明の化合物は、上記の任意の投与形式で使用するための、その溶解性、溶解度速度、風味マスキング、生物学的利用能及び/安定性を改善するために、溶解性高分子例えばシクロデキストリン及びその好適な誘導体又はポリエチレングリコール-含有ポリマーと混合できる。

薬物-シクロデキストリン複合体は、例えば、ほとんどの投薬剤形及び投与経路に一般的に有用であることが判っている。包接及び非-包接複合体はいずれも使用できる。薬物との直接的複合化に代わるものとして、シクロデキストリンは、補助剤すなわち担体、希釈剤又は溶解剤として使用できる。これらの目的に一般的に使用されるほとんどは、アルファ-、ベータ-及びガンマ-シクロデキストリンであり、その例は、本明細書に文献としてその全体が組み込まれている、PCT公開番号WO 91/11172、WO 94/02518及びWO 98/55148に見出される。

投薬
投与される活性化合物の量は、治療される対象、障害又は症状の重度、投与の割合、化合物の性質及び薬を処方する医師の判断力に依拠することになる。しかしながら、効果的な投薬は、典型的には、単回又は分割投薬で、約0.001〜約100mg/kg体重/日、好ましくは約0.01〜約35mg/kg/日の範囲である。70kgのヒトでは、これは、約0.07〜約7000mg/日、好ましくは約0.7〜約2500mg/日の量である。場合によっては、上記の範囲の下限よりも低い投薬レベルがより適切であるが、場合によっては、何ら有害な副作用を起こすことなく、より高い投薬量が用いられ、典型的にはこのような高い投薬量は、一日の投薬用としていくつかに低い投薬量に分割される。

パーツのキット
例えば特定の疾患又は症状を治療する目的のためには、活性化合物の組合せを投与することが望ましいので、2以上の医薬組成物、そのうちの少なくとも1つは本発明に従う化合物を含む、は組成物の共投与に好適なキットの形態で一般的に混合できる、ことは本発明の範囲内である。従って、本発明のキットは、2以上の別個の医薬組成物、そのうちの少なくとも1つは、本発明の化合物である、及び当該組成物を別個に保持するための手段、例えば容器、分割ボトル又は分割ホイルパケットを含む。このようなキットの例は、錠剤、カプセル剤等の包装に使用される、よく知られたブリスターパックである。

本発明のキットは、異なった投薬剤形、例えば経口及び非経口を投与するために、異なった投薬間隔で別個の組成物を投与するために、又は互いに別個の組成物を投与するために特に好適である。コンプライアンスを促進するために、キットは典型的に、投薬の指示を含み、記憶補助を与える。

In vitro試験
材料及び方法
In vitro法
生物化学キナーゼ試験法
c-Met/HGFRキナーゼの阻害である、化合物1の生物化学的Ki値を、以下のようにしてATPターンオーバーに関連するNADH酸化を監視する一般的方法を用いて決定した。化合物及びキナーゼ試験試薬を試験ウェルに導入し、37℃で10分間インキュベートした。試験はc-Met/HGFR酵素の添加によって開始した。酵素阻害剤は、酵素の測定された活性を減少させる。連続-連結分光光度分析（continuous coupled spectrophotometric assay）において、340nmでの吸収の減少の測定によるNADHの消費率の分析によって、キナーゼによる時間依存性ADPの生成を測定した。キナーゼ酵素はADPを生成するので、ホスホエノールピリビン酸及びピルビン酸キナーゼとの反応によってATPに再変換される。ピリビン酸塩は次いで、NADHをNADに同時に変換する乳酸デヒドロゲナーゼとの反応によって乳酸塩に変換される。NADHは、340nmで測定可能な吸収を有するが、NADは有さない。そのため、試験の終点は、指定された時点で340nmで、分光光度計によって測定した。

細胞情報伝達生物化学的キナーゼ試験法（Upstate）
キナーゼは、試験に加える前に、10xの操作濃度に予め希釈した。すなわち、基質を溶解し、希釈した。そして、ヒストンH1（20mM MOPS pH 7.4での10x操作ストック）、PDKtide（20mM MOPS pH 7.4での10x操作ストック）及びATF2（典型的には、50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1MM EGTA, 0.03% Brij-35, 50% グリセロール, 1mM ベンザミジン, 0.2mM PMSF及び0.1% メルカプトエタノールでの20x操作ストックで保存した）を除いて、脱イオン水でのストックとした。次いで、対象である生物化学的酵素を、8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA 50μM EAIYAAPFAKKK、10mM 酢酸Mg及び³²P-ATPでインキュベートした選択した酵素の5〜10mUを含む25μlの最終反応体積中で試験した（必要に応じて、特異的活性は約500cpm/pmolの濃度）。MgATP混合物の添加によって反応を開始した。室温で40分間インキュベーションした後、5μlの3%リン酸水溶液の添加によって反応を停止した。次いで、10μlの反応液をP30濾紙にスポットし、乾燥及びシンチレーション計数の前に75mMリン酸で5分間で3回洗浄し、メタノールで1回洗浄した。

細胞株
In vitro試験で化合物1を評価するために使用した細胞株は、以下のとおりであった：ヒト肺癌A549、ヒト胃癌GTL-16、ヒト結腸癌HT-29、ヒト結腸癌Colo205、ヒト腎癌A498、ヒト腎癌786-O、ヒト乳癌MBA-MD-231、イヌ腎由来（MDCK）上皮細胞、P-糖タンパク質を発現させるために設計されたMDCK細胞（MDCK-MDR1）、mIMCD3マウス腎上皮、HUVEC（ヒト臍静脈内皮細胞）、ヒト野生型c-Met/HGFR並びにHGFR-V10921、HGFR-H1094R、HGFR-Y1230C及びHGFR-M1250Tを含む変異型c-Met/HGFRを発現させるために設計されたNIH-3T3細胞。他のチロシンキナーゼのホスホリルかしようの阻害を評価するために使用した細胞株は、以下のとおりであった：KARPAS 299、SU-DHL-1及びジャーカットヒトリンパ腫細胞、ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト微少血管内皮細胞（HMVEC）、ヒトVEGFR2、PDGERβ、TrkA及びTrkBを発現させるために設計されたブタ大動脈内皮細胞（PAE）；ヒトRon、Axl、Sky及びEGFR/Tie-2キメラ発現させるために設計されたNIH-3T3細胞；ヒトIRKを発現せるために設計されたHEK293細胞；ヒトRonを発現させるために設計されたチャイニーズハムスター卵巣（CHO-B）細胞、並びにBCR-Ablを発現させるために設計されたBAF3細胞。全ての設計細胞株はファイザー（Pfizer）で樹立し、GTL-16胃癌細胞はPaolo Comoglio博士 (University Torino Medical School, Candiolo, Italy)に贈り、HUVEC及びHMVEC（ヒト微少血管内皮細胞) はClonetics社（Walkersville, MD）から購入し、他の細胞株はATCC (Manassas, VA) から得た。特に断らなければ、細胞培養試薬はLife Technologies (Gaithersburg, MD) から入手した。細胞は、5〜10%のCO₂の加湿雰囲気で37℃で維持した。

抗体及び成長因子
抗体は、in vitorELISA及びイムノブロッティング試験における化合物1を評価するために使用し、以下のとおりであった：抗-全ヒトc-Met/HGFR及び抗-ホスホZap70はZymed/Invitrogen, Carlsbad, CAから入手し；抗-全Ron、抗-全FDFR1、抗-全PDGFRβ、抗-全Trk、抗-全Tie-2、及び抗-ホスホチロシン（PY-20）はSanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CAから入手し；抗-全Axl及び抗-全マウスc-Met/HGFRはR&D Systems Minneapolis, MNから入手し；抗-全IRKはBD Pharmingen, San Diego, CAから入手し；抗-VEGFR2はNovus Biologicals, Littleton, COから入手し；抗-ホスホ-c-Met/HGFR、抗-全及び-ホスホALK、抗-全c-ABL、抗-全及び-ホスホGab1、抗-全及び-ホスホAKT、抗-全及び-ホスホ-MAPK44/42、抗-ホスホRaf、Mek1/2、P90RSK及びSTAT5は、Cell Signaling Technologies, Boston, MAから入手した。

細胞試験で用いるほとんどの成長因子は、GibcoBRL/Invitrogen, Carlabad, CAから入手したBDGF及びRoche Applied Science, Indianapolis, INから入手したEGFを除いて、R&D Systems Minneapolis, MNから入手した。

細胞キナーゼリン酸化試験
リガンド-依存的又は構成的キナーゼリン酸化反応を阻害する化合物1の能力を直接決定するために用いる細胞試験（すなわちELISA又はイムノブロット）は、様々な血清不足細胞を用いて行った。

細胞調製
細胞は、生育培地（10%ウシ胎児血清-FBSで補充した培地）で96ウェルプレートに播き、試験プレートへの接着を促進するために37℃で終夜培養した。接着後に、生育培地を除き、細胞を無血清培地（0.04%BSAを含む）で培養した。化合物1の段階希釈を行い、好適な対照濃度又は化合物1の所定の濃度を各ウェルに加え、細胞を1時間37℃でインキュベートした。リガンド-依存的RTKリン酸化反応を試験する実験では、対応する成長因子（例えばHGF、MSP、Gas6、EGF、NGF、BDNF、インシュリン、VEGF又はPDGF BB）を8〜20分間、細胞に加えた。前記のHUVEC細胞におけるヒトAxlリン酸化反応を刺激するためにH₂O₂を用いた（Konishi, A., Aizawa, T. Mohan, A., Korshunov, V.A. and Berk, B.C., Hydrogen peroxide activates the Gas6-Axl pathway in vascular smooth muscle cells. The Journal of Biological Chemistry, 279: 28766-28770 (2004)）。構成的活性キナーゼ活性を有する細胞株に対する外因性リガンド（例えば、GTL-16細胞中のc-Met/HGFR、Karpas299細胞中のNPM-ALK、Ron-CHO-B細胞中のRon、及びBCR-Abl BaF3細胞中のBCR-Abl）の添加なしで、構成的キナーゼリン酸化反応を測定した。化合物1及び/又は好適なリガンドで所定の時間、細胞をインキュベーションした後、1mM Na₃VO₄のHBSSで1回、細胞を洗浄し、次いで溶解緩衝剤を用いて溶解した（Cell Signaling Technologies, Boston MA）。

ELISA試験
対象のプロティンキナーゼのリン酸化反応は、各タンパク質に特異的な捕獲抗体及びリン酸化チロシン残基に特異的な検出抗体を利用するサンドウィッチELISA法によって評価した。各ELISA試験では、好適なRTKリガンド及び/又は化合物1で処理した様々な細胞株から生成したタンパク質溶解物を、抗-c-Met/HGFR、-Ron、-Axl、-Sky、-IR、-Tie2、-KDR、-PDGFRβ、-Zap70等を含む対応する抗体で予め処理した96ウェルプレートに移した。抗体被覆プレートを終夜4℃でタンパク質溶解物の存在下でインキュベートし、1%ツィーン20のPBSで7回洗浄した。HRP-RY20（horseradish peroxidase-conjugated anti-total-phosphotyrosine, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）をブロッキング緩衝液（Pierce, Rockford, IL）で1：500に希釈し、30分間各プレートに加えた。次いで、プレートを再度洗浄し、TMBパーオキシダーゼ基質（Bio-Rad laboratories, Hercules CA）を加え、HRP-依存性比色反応を開始した。反応を0.09N H₂SO₄を加えて停止した。分光分析計を用いてプレートをCD-450nmで測定した。Excel系テンプレートでの4パラメータ分析法を用いる濃度-反応曲線当てはめによって、IC₅₀値を計算した。

イムノブロッティング
イムノブロッティング法によって、細胞キナーゼリン酸化反応を阻害する化合物1の能力も測定した。細胞を無血清培地中の化合物1の希釈で処理し、上記のタンパク質抽出物用に溶解した。BSA試験（Pierce, Rockford, IL）によるタンパク質濃度用に細胞溶解物を標準化し、対象のタンパク質を免疫沈降させるために特異的抗体を使用した。免疫沈降タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、抗-ホスホチロシン抗体によるイムノブロッティングを行い、各薬物濃度でのリン酸化タンパク質の相対的レベルを決定した。このイムノブロッティング法は、対象の分子の全タンパク質レベルを決定するためにも使用した。

細胞増殖試験及び生存試験
細胞増殖試験
生育培地（10%ウシ胎児血清-FBSで補充した培地）で、低濃度で96ウェルプレートに腫瘍細胞を播き、37℃で終夜培養した。次の日、生育培地を除き、細胞を無血清培地（0% FBS及び0.04% BSA）で培養した。化合物1の段階希釈を行い、細胞を37℃で24〜72時間インキュベートした。MTT試験（Promega, Madison, WI) を次いで行い。相対的細胞数を決定した。4パラメータ分析法を用いる濃度-反応曲線当てはめにより、IC₅₀値を計算した。

アポトーシス/細胞生存試験
96ウェルプレートに40,000細胞/ウェで、GTL-16細胞を播いた。PF-02341066の所定の濃度又はビヒクルを、無血清培地で当該ウェルに加えた。細胞を37℃、5%CO₂で48時間インキュベートした。アポトーシスを検出するために、ssDNAアポトーシスキット（Chemicon International）を使用した。

HGF-刺激HUVEC生存試験
HUVEC細胞（継代3）をEGM2培地（Walkersville, MD）でコンフルエンスになるまで生育した。細胞をEGM2培地で高密度（20,000〜30,000/ウェル）で96ウェルプレートに播き、細胞接着させるために5〜6時間インキュベートした。接着後、5%CO₂で37℃で終夜無血清培地（Cell Applications, San Diego, CA）で細胞を培養した。次の日、細胞を飢餓培地（Cell Applications, San Diego, CA）に5時間曝露した。化合物1を無血清培地で段階的に希釈し、好適な対照又は化合物1の所定の濃度を各ウェルに加えた。1時間後、ヒト組換えHGF（R&D Systems, Minneapolis, MN）を所定のウェルに加え、100ng/mLの最終濃度にした。次いで、48〜72時間後にMTT試験（Promega）を行い、相対的細胞数を決定した。4パラメータ分析法を用いる濃度-反応曲線当てはめにより、IC₅₀値を計算した。

HGF-依存性細胞移動及び侵襲試験
NCI-H441細胞移動及びマトリゲル（Matrigel）（商標）侵襲試験
商業的に入手可能な細胞転移及び侵襲系（BD Biosciences, San Jose, CA）を用いて、HGF-刺激NCI-H441ヒト非-小細胞肺癌細胞転移及びマトリゲル侵入に対する化合物1の効果を決定した。対数増殖期の細胞をトリプシン処理し、無血清培地（0.04%BSAを含む）で400,000細胞/mLの濃度に懸濁した。化合物1を無血清培地で段階的に希釈し、所定の濃度を懸濁細胞に加え、細胞を室温で30分間インキュベートした。所定の対照又は処理した懸濁細胞（0.5mL）を各転移又は侵襲チャンバー（すなわちプレート挿入物）に加えた。更に、化学反応物質として25ng/mL HGF（0.75mL）を各随伴プレートのより低いウェルに加え、随伴プレートの上部に挿入された転移又は侵襲チャンバープレート挿入物から細胞を剥がし、細胞を37℃で22時間インキュベートした。プレートのより低いウェルに転移又は侵襲した細胞を次いで固定し、37℃で15分間、核を染色した（1μg/mL DAP1の100%MeOH）。細胞をTBS溶液で2回洗浄した。各ウェルから5つの顕微鏡像をとり、Image-Pro Plusソフトウェア（Media Cybernetics, Silver Spring, MD）を用いて各条件下で、転移又は侵襲の細胞数を決定した。4パラメータ分析法を用いる濃度-反応曲線当てはめによりIC₅₀を計算した。

HUVECマトリゲル侵入試験
ACEA RT-CESシステム（ACEA biologicals, San Diego, CA)を使用し、in vitroでのHUVECマトリゲル侵入に対する化合物1の効果を決定した。ACEA電気検出96-ウェルプレートを50μlの0.001%フィブロネクチン及び100ng/mL HGFのPBS溶液で被覆し、37℃で1時間及び4℃で30分間インキュベートした。各プレートを4℃のPBSで洗浄した後、マトリゲル（BD Biosciences, San Jose, CA）を、飢餓培地（SM, Cell Applications, San Diego, CA）で1：40に希釈し、HGF(100ng/mL）及び/又は異なった濃度の化合物1で補充し、所定のウェルに加え（50μL）、37℃で2時間凝固させた。HUVEC細胞を無血清培地（Cell Applications, San Diego, CA）で5時間培養し、次いでSMで2時間培養した。次いで、細胞をSMで60,000細胞/mLに回収し、100ng/mL HGF及び/又は化合物1の好適量で、37℃で30分間処理した。所定の条件下で、HUVEC細胞懸濁液（100μL）を、被覆ACEAプレートの所定のウェルのマトリゲル層の上部に移した。次いで、37℃、95%空気：5%CO₂で、ACEAプレートをACEA Device Stationに接続し、48時間、ACEA Sensor Analyzerで、リアルタイムで監視した。ACEAプレートの底部の電気的センサーは、マトリゲルを侵襲したHUVEC細胞を検出した。侵襲ACEA RT-CES（商標）Integrated Softwareを用いて、HUVEC細胞の相対数（細胞指数）を決定した。4パラメータ分析法を用いる濃度-反応曲線当てはめによりIC₅₀を計算した。

MDCK細胞分散試験
10%FBSで補充した培地で96-ウェルプレートにMDCK細胞を低濃度で播き（25細胞/ウェル）、10〜15細胞の小コロニーが現れるまで生育させた。次いで、生育培地で希釈した化合物1の様々な濃度の存在下で、細胞をHGF（50ng/mL）で刺激した。終夜インキュベーション後に、コロニーを固定し、0.2%クリスタルバイオレットを含む10%緩衝ホルマリンで染色し、各濃度での拡散を視覚評価した。

HMVEC血管萌芽試験
0.24%メチルセルロースを含むEGM-2培地に5000HMVECを加え、U字型96-ウェルプレートに移し、終夜、スフェロイドを形成した。スフェロイドを回収し、トロンビン（2mLの5,000U/mL）で被覆した48-ウェルプレート中で、4〜8% FBS±化合物を含む2mg/mLフィブリノーゲン溶液に混合した。得られた3-Dフィブリンゲルを4〜8% FBSを含むEGM-2で被覆し、37℃、95%空気/5%CO₂でインキュベートした。倒立顕微鏡下で毎日、内皮管形成を観察した。顕微鏡に接続したデジタルカメラ（Olympus BX60）で7日目に、画像を撮影した。化合物1をいくつかの濃度で加え、血管萌芽を視覚評価した。

フローサイトメトリーによる細胞周期及びアポトーシス分析
ヒトリンパ腫細胞のNPM-ALK依存性細胞周期分布及びアポトーシスに対する化合物1の影響をフローサイトメトリー分析（FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA）により評価した。生育培地（RPMIおよび10%FBS）で、Karpas 299及びSU-DHL-1ヒトリンパ腫細胞を化合物1で24〜48時間処理した。細胞をPBSで2回洗浄し、固定し、BDCytofix/Cytoperm溶液で4℃で20分間浸出した。CycloTest Plus DNA Reagent Kit (BD Biosciences）を用いてリンパ腫細胞の細胞周期分布及びアポトーシスを評価した。このキットを用いて、細胞を1×BD Perm/ Wash Bufferで2回洗浄し、非イオン界面活性剤及びトリプシンを単離した核に加え、DNA量を視覚化するためにヨウ化プロピディウムを添加し、細胞をフローサイトメトリーで分析した。DNA量（各細胞周期におけるパーセント細胞数を決定するための倍数性分析）をCell Quest Proを用いて評価し、Modfit Lt Software (BD Biosciences) で分析した。アポトーシスピーク（A₀）を (Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del-Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. S., Lassota, P., and Traganos, F., Cytometry 13: 795-808 (1992)）に記載のG_O/G₁ピークよりも低いチャンネル数で起こるピークと定義した。アポトーシスは、アネキシンV-FITC染色（BD Biosciences，San Jose, CA）を用いるフローサイトメトリー分析によっても決定し、FACSCaliburを用いても分析した。

In vivo法
細胞株
他に記載がない限り、細胞培養試薬はLife Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD) から入手した。細胞は5〜10% CO₂の湿雰囲気で37℃で維持し、標準的細胞培養技術を用いて継代した。U87MG（ヒトグリア芽腫）、NCI-H441（ヒト非-小細胞肺腺癌）、PC-3（ヒト前立腺腺癌）細胞をAmerican Type Culture Collection (Bethesda, MD) から入手し、その推奨に従って培養した。

胸腺欠損マウスにおける皮下異種移植モデル
雌性又は雄性nu/nu、又はSCID/Beigeマウス（5〜8週令）をHarlan (Madison, WI）及びCharles River (Wilmington, MA) から入手した。HEPA-濾過済の換気孔を設けたラック上に置いたAlpha-Dri/bed-o-cob櫛型ベッドを備えた殺菌フィルター最上ケージ中で、清潔な部屋条件で、動物を維持した。動物は殺菌した齧歯用餌及び水を自由に摂取した。胸腺欠損マウスへの移植のための細胞を回収し、450×gで5〜10分間、遠心分離してペレット化した。細胞ペレットを1回洗浄し、殺菌リン酸緩衝生理食塩水又は無血清培地に再懸濁した。腫瘍細胞を30〜50% Mtrigel（BD Biosciences，San Jose, CA）で補充し、腫瘍獲得及び異種移植として選択した腫瘍細胞の成長を促進した。各実験の化合物の投与の前に、細胞（100μl中、2〜5×10⁶）をマウスの後側面部にSC移植し、所定の大きさに成長させた。電気キャリパーで測定することによって腫瘍の大きさを決定し、腫瘍体積を、長さ×（幅）²×0.4の産物として計算した。

Ex vivo標的調節(PK/PD）試験
In vivo薬理試験のための腫瘍及び血漿処理
構成的にリン酸化されたc-Met/HGFR又はALKを発現する腫瘍細胞をヌードマススの皮下に移植し、処置せずに300〜800mm³の大きさに成長させた。所定の用量レベルで、化合物1をマウスに単一経口用量（急性PK/PD試験用）又は複数経口用量（定常状態PK/PD試験用）投与した。化合物1の投与後規定の時間に、個々のマウスを慈悲深く安楽死させ、硫酸ヘパリンで処理したシリンジを用いて心臓の左心室から血液試料を単離し、腫瘍を切除した。LCMS分析を用いて血漿試料について化合物1の濃度を分析した。切除した腫瘍をドライアイス上で素早く凍らせ、液体窒素で冷却した低温計及び乳棒を用いて粉砕し、冷1×Cell Lysis Buffer（Cell Spring Technologies, Boston MT）で溶解した。腫瘍溶解物からタンパク質を抽出し、タンパク質濃度をBSA試験(Pierce，Rockford，IL）を用いて決定した。以下の捕獲ELISA法を用いて、各腫瘍試料中の対象の総タンパク質及び/又はリン酸化タンパク質のレベルを決定した。

キナーゼ標的の薬理的阻害の評価のためのELISA試験
各ELISA試験では、ビヒクル-又は化合物1-処置腫瘍から得られたタンパク質溶解物を抗-c-Met/HGFR（Zymed Lab/Invitrogen, Carlsbad, CA）又は抗-ALK捕獲抗体（Cell Spring Technologies, Boston MT）のいずれかで前処理した96ウェルプレートに移した。抗体被覆プレートを腫瘍溶解物の存在下で4℃で終夜インキュベートし、1%ツィーン20のPBSで7回洗浄した。HRP-RY20（horseradish peroxidase-conjugated anti-total-phosphotyrosine, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）をブロッキング緩衝液（Pierce, Rockford, IL）で1：500に希釈し、30分間各プレートに加えた。次いで、プレートを再度洗浄し、TMBパーオキシダーゼ基質（Bio-Rad laboratories, Hercules CA）を加え、HRP-依存性比色反応を開始した。反応を0.09N H₂SO₄を加えて停止した。分光分析計を用いて、各ビヒクル又は処置ウェルの吸光密度（CD）を450nmで測定した。OD読み取りに基づいて、化合物1-処置動物から切除した腫瘍のc-Met/HGFR又はALKの総リン酸化を、同時点でビヒクル-処置の動物から切除した腫瘍と比較した。この評価において、腫瘍における化合物1によるキナーゼ標的リン酸化の阻害を、次式：%阻害 = 100−[(平均OD処置/平均OD非処置）×100]を用いて、計算した。

イムノブロッティング
イムノブロッティング法をまた用いて、相対的キナーゼリン酸化状態及び対象のタンパク質に関して腫瘍試料中の総タンパク質レベルを決定した。腫瘍担持マウスを化合物1の異なった用量で処置し、腫瘍溶解物及びタンパク質試料を上記のようにして調製した。対象のタンパク質を免疫沈降させるために特異的抗体を使用した。免疫沈降タンパク質を、SDS-PAGE、及び抗-ホスホチロシン又は総抗体によるイムノブロッティングによって分離した。

イムノブロッティング試験に用いた抗体は以下のとおりであった：抗-全ヒトc-Met/HGFR は、Zymed/Invitrogen, Carlsbad, CAから入手し￥；抗-ホスホ-c-Met/HGFR、抗-全及び-ホスホALK、抗-全及び-ホスホGab1、抗-全及び-ホスホAKT、抗-全及び-ホスホ-MAPK44/42、STAT5は、Cell Signaling Technologies, Boston, MAから入手した。

In vivoでの導入試験のための浸透性ミニポンプ移植
Alzet 1003D及び1007D浸透性ミニポンプをDurect Corporation (Cupertino, CA) から購入した。ミニポンプは、化合物1の所定の濃度の溶液を用いて装填し、4〜5時間で平衡に達するまで、37℃で殺菌生理食塩水で処理した。ポンプは、右側部のマウスの担持腫瘍の左背面胸部に製造者の教示に従って、皮下に外科的に移植された。切開を外科クリップで閉じ、皮膚切開が完全に治癒される5〜7日後に除いた。ポンプ置換手術は、注入時間を必要とする所定の試験期間に、ポンプの能力を越える薬物体積で行った。

腫瘍組織学及び免疫組織化学（IHC）
免疫組織化学的エンドポイントを評価する腫瘍標本をとり、70%エタノールに移す前に、プロテアーゼ及びホスファターゼインヒビターを含む10%緩衝ホルマリンで24時間固定した。次いで腫瘍標本をパラフィンに埋め込み、4μM断片を切り出し、顕微鏡スライドのために焼いた。商業的に入手可能な覆いのないチャンバー（Biocare Medical, Cat番号DC2001）を用いる製造者の教示に従って、脱パラフィン処理及び抗原回復処理（EDTA-系）を行った。腫瘍OCT冷凍試料も回収し、CD-31染色のために切断した。免疫染色のために、スライドを第一抗体次いで第二抗体でインキュベートし、比色分析法（DAO Envision-HARP, DAB kit, DAO, Carpentaria, CA)又は蛍光分析法（Alexa 488又はAlexa 635, Molecular Probes/INvitrogen, Carlsbad CA）のいずれかを用いて視覚化した。全ての免疫染色した断片を、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。自動Ventana Discovery XT Staining Module (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) も使用し、製造者の教示に従って組織学的染色を行った。染色した断片をOlympus顕微鏡で分析し、断片染色の定量的分析を、ACISシステム（Automated Cellular Imaging, Clarient, Irvine, CA）を用いて行った。標準的な臨床法を用いて、住み込み病理学者によってスライドも分析した。

免疫組織化学試験に用いられる抗体は、Biosource International/Invitrogen, Carlsbad, CA製の抗-ホスホ-c-Met/HGFR；Dacocytomation, Carpenteria, CA製の抗-Ki67；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA製の抗-CD31を含んだ。

データ及び結果
C-Met/HGFR RTKに対する化合物1の酵素的有用性
化合物1は、平均Kiが4nMである、組換えヒトc-Met/HGFRキナーゼ活性の強力なATP-競争的インヒビターであることが証明された。

化合物1は、生物化学的酵素試験でc-Met/HGFRのキナーゼ活性を3nMのKiで阻害した。C-Met/HGFRに対するキナーゼ選択性を研究するために、＞120の組換えキナーゼ群に対する生物化学的キナーゼスクリーニング試験において、化合物1を更に評価した。これらの予備的生物化学的キナーゼ選択性選別において、c-Met/HGFRの選択性がc-Met/HGFRと比べて100倍未満のであると評価されるように、化合物1が活性を示したキナーゼの一部を特定した。信頼性のある細胞系キナーゼ選択性試験において、これらの強力なキナーゼヒット（hit）に対する化合物1の活性を更に評価した（表1）。c-Met/HGFRキナーゼの阻害を示す、化合物1の生物化学的Ki値は、ATPターンオーバーに関連するNADH酸化を監視することにより決定した。化合物及びキナーゼ試験試薬を試験ウェルに入れ、37℃で10分間インキュベートし、c-Met/HGFRを添加することにより反応を開始した。所定の時点で、340nmで、分光光度計によりNADHを測定した。

細胞系試験における化合物1のキナーゼ選択性
生物化学的試験でヒットする可能性のある選ばれたキナーゼ及び他の関連するRTK（例えばRON、SKY、IR）についての一群の細胞系キナーゼ活性試験で、化合物1の選択性を評価した。細胞系試験では、化合物1は、c-Met/HGFR（A549 IC₅₀ = 8.6nM) と比べて、VEGFR2及びPDGFRβ スプリット-RTKについては1000倍より高い選択性であり、IR及びLcKについては200倍より高い選択性であり、Axl、Tie2、TrkA及びTrkBについては約40〜60倍の選択性であった。50倍ウィンドウがin vivoでのc-Met/HGFRの選択性に十分であるかを試験するために、化合物1について、ヌードマウスのC6異種移植片のTie-2リン酸化を阻害する能力を評価した。この試験では、50mg/kg（24時間に渡るc-Met/HGFR阻害のIC₉₉を示す）又は100mg/kgの単回PO投薬後の任意の時点で、Tie-2リン酸化の顕著な阻害は観察されなかった。このことは、Tie-2、Axl又はTrkA及びTrkBの阻害が、24時間でのc-Met/HGFRの完全な阻害に関連する用量レベルよりも最高2倍高い用量では起こりそうにない、ことを示している。1)選ばれた癌での過剰発現及び変異、2)RON-ヌードマウスでの逆表現型の欠失に因り、化合物1は、潜在的に有用な癌研究の標的を示すRONキナーゼに20〜30倍選択的であった。上記のRTKに比べて、化合物1は、ヒト未分化巨大細胞リンパ腫（ヒトリンパ腫細胞株では、ALCL）の病因に関連する染色体転座から生じる、ALK RTK（Anaplastic Lymphoma Kinase）融合タンパク質の発癌性形態、ALK RTK（Anaplastic Lymphoma Kinase）のNPM-ALK発癌性融合タンパク質変異体に対して、ほとんど等しいIC₅₀値（24nM）を示した。

細胞におけるc-Met/HGFR RTK活性の薬理的阻害
酵素的活性が細胞のc-Met/HGFR阻害に変換されることを確認するために、化合物1の、腫瘍及び内皮細胞株の一群におけるc-Met/HGFRリン酸化を阻害する能力を評価した。化合物1は、ヒト腫瘍及び内皮細胞株の一群について平均11nMのIC₅₀値で、野生型c-Met/HGFRのHGF-刺激又は構成的総チロシン自己リン酸化を阻害した（表1）。化合物1は、mIMCD3マウス上皮細胞胃では、同様な値を示した（IC₅₀=5nM）（表1）。

細胞におけるc-Met/HGFR活性部位の変異に対する化合物1の有効性
c-Met/HGFR活性化変異は、いくつかのヒト癌で同定されており、実験的証拠及び他のPTK標的を用いる先行する臨床に基づいて、概念的臨床試験の証拠の強力な理論的説明を与える。細胞外又は膜近傍のドメインでのc-Met/HGFR変異は、活性部位に結合する化合物に影響を与えるとは予測できないが、キナーゼドメイン変異は活性を喪失させる可能性がある。この問題を解決するために、野生型c-Met/HGFR又は一連の代表的なc-Met/HGFR活性部位変異を発現するように設計された化合物1で処理されたNIH3T3細胞で、RTKリン酸化IC₅₀を評価した。これらの試験では、化合物1は、野生型受容体（12.6nM）に比べて、ATP結合サイト変異又はP-ループ変異（M1250T，15nM）に対して改善された又は同等の活性を示した（V10921，19nM及びH1094R，2.2nM）（表1）。化合物1はまた、内因的にc-Met膜近傍変異体R988C及びT10101をそれぞれ発現する、NCI-H69（IC₅₀：13nM）及びHOP92（IC₅₀：16nM）細胞でのc-Metリン酸化を阻害する匹敵する有効性を強く示した（表1）。対照的に、野生型受容体に比べて、活性化ループ変異（Y1230C，127nM、及びY1235D，92nM）について、有効性（10倍）の顕著なシフトが観察された（表1）。

細胞におけるc-Met/HGFR-又はNPM-ALK-依存性癌遺伝子の表現型に対する化合物1の効果
表現型試験
c-Met/HGFRは、細胞成長、転移の調節不全、及び様々な腫瘍細胞及び腫瘍内皮細胞の侵襲に関連し、一方、NPM-ALKは、ALCLリンパ腫細胞の細胞増殖及びアポトーシスの調節不全に関連する。一連の細胞系機能性試験では、化合物1は、ヒトGTL-16胃癌細胞成長を強く阻害し、GTL-16細胞アポトーシスを誘導し、HGF-刺激ヒトNCI-H441破意癌細胞転移及びマトリゲルマトリックスによる侵襲を阻害し、そしてHGF-刺激MDCK細胞死/分散を阻害した（表2）。化合物1は、染色体転座に因るNPM-ALK融合タンパク質を発現する、Karapas 299又はSU-DHL-1 ALCL細胞の増殖も阻害した。これらのNPM-ALK陽性リンパ腫細胞における化合物1による成長阻害は、G0/G1細胞周期捕獲及びアポトーシス誘導に関連した。可能性のある抗-血管形成活性を試験した結果、化合物1は、HGF-仲介HUVEC内皮細胞生存及びマトリゲル侵入、並びにフィブリンゲル中のHMVEC内皮細胞管形成を阻害した。これらのデータは、化合物1の、活性化c-Met/HGFR又はNPM-ALKをそれぞれ発現する細胞における、c-Met/HGFR-及びNPM-ALK-依存性機能を阻害する能力を証明するものである。加えて、これらのデータは、化合物1の抗腫瘍効果が腫瘍細胞成長又は生存及び抗-血管形成機構に与える直接的効果によって仲介され得る、ことを示唆している。

In vivo試験
データ及び結果
In vivoでのキナーゼ標的阻害及び腫瘍成長阻害
腫瘍モデル選択
c-Met/HGFR標的阻害と、腫瘍成長阻害と、化合物1のin vivoでの血漿曝露との関係を評価するために、c-Met/HGFR-依存性腫瘍異種移植モデルを利用した。マウス間葉細胞によって発現されるマウスHGFによる腫瘍異種移植によって発現されるヒトc-Met/HGFRの傍分泌活性化の喪失に因り、構成的c-Met/HGFR活性を示すヒト異種移植モデルは以下のように使用した：1)構成的に活性なc-Met/HGFRの高レベルを発現する、GTL-16ヒト胃癌又はCaki-1腎癌モデル、2) 自己分泌ループを含むHGF及びc-Met/HGFRを発現する、U87MGヒトグリア芽腫又はPC-3ヒト前立腺癌モデル、又は3) c-Met/HGFRの種-特異的傍分泌活性化を取り戻すための腫瘍間質性区画から生物活性ヒトHGF源を供給するための、ヒト腫瘍細胞（例えばNCI-H441 NSCLC）とヒトMRC5繊維芽細胞との共移植。

経口投与後の抗腫瘍効果に対するc-Met/HGFR阻害の関係
GTL-16腫瘍
樹立GTL-16腫瘍（250mm³）を担持する胸腺欠損マウスに、所定の用量の化合物1又はビヒクルのみを11日間、経口投与した。GTL-16でのc-Met/HGFRリン酸化の阻害を調べる試験（図2A）については、所定の時点での投与後の試験終了時に思いやりを持って安楽死させ、腫瘍を切断し、冷凍し、ビヒクル及び処置群でのリン酸化をELISAによって定量した。腫瘍中の化合物1によるキナーゼ標的リン酸化の阻害を次式：%阻害 = 100−[(平均OD処置/平均OD非処置）×100]に従って計算した。GTL-16腫瘍成長阻害を調べる試験（図2B）については、15匹のマウス群について、示された平均腫瘍体積±SEMと共に、所定の日にキャリパーで腫瘍体積を測定した。パーセント(%)値は、ビヒクル-処置マウスと比べた薬物-処置マウスを20日目に測定し、次式：100^*｛1-[(処置20日−処置10日）/（対照20日−対照10日）]｝に従って計算した腫瘍成長阻害の%を示す。^*は、処置群対対照群（P＜0.001）において平均腫瘍体積がほとんど有意でないことを示し、これは一方向バリアンス分析を用いて決定した（図2B参照）。

化合物1に対するc-Met/HGFR PD反応を評価するために、単回投薬-及び反復投薬-(定常状態）試験での化合物1の経口投与後のいくつかの時点で、GTL-16腫瘍を採取した。腫瘍のc-Met/HGFRリン酸化状態を、幅広い範囲の用量でのELISAによって定量した。腫瘍成長阻害との相関関係をひきだすための定常状態PD試験（11日）に焦点を当てた結果、化合物1は、図2Aび2Bから明らかな以下の点を証明した。

50mg/kg/日では：100%腫瘍成長阻害が、24時間持続したGTL-16腫瘍のc-Met/HGFRリン酸化の完全阻害と関連した（25mg/kg--リン酸化のほとんど完全な阻害及び腫瘍成長）。12.5mg/kg/日では：60%腫瘍成長阻害が、1〜8時間でのc-Met/HGFRリン酸化の80〜90%阻害と関連し、これは16〜24時間で50〜60%阻害に減少した。

6.25mg/kg/日では：腫瘍成長阻害に関して全く有意でない傾向は、1〜8時間でのc-Met/HGFRリン酸化の30〜50%阻害と関連し、これは16時間で完全に回復した。

U87MG腫瘍
樹立U87MG腫瘍（150mm³）を担持する胸腺欠損マウスに、9日間、化合物1を所定の用量で又はビヒクルのみを経口投与した。腫瘍成長阻害を調べる試験（図3A）について、10〜12匹のマウス群について、示された平均腫瘍体積±SEMと共に、腫瘍体積を所定の日にキャリパーで測定した。パーセント(%)値は、ビヒクル-処置マウスと比べた薬物-処置マウスを14日目に測定し、次式：100^*｛1-[(処置14日−処置6日）/（対照14日−対照6日）]｝に従って計算した腫瘍成長阻害の%を示す。^*は、処置群対対照群（P＜0.001）において平均腫瘍体積がほとんど有意でないことを示し、これは一方向バリアンス分析を用いて決定した（図3A参照）。C-Met/HGFRリン酸化の阻害を調べる試験（図3B）については、化合物1の投与後4時間の試験終了時に思いやりを持って安楽死させ、腫瘍を切断し、冷凍し、ビヒクル及び処置群でのリン酸化をELISAによって定量した。腫瘍中の化合物1によるキナーゼ標的リン酸化の阻害を次式：%阻害 = 100−[(平均OD処置/平均OD非処置）×100]に従って計算した。

最高100mg/kgの用量レベルでは、U87MG異種移植で、Tie-2リン酸化の薬理関連阻害は観察されなかった。これは、化合物1が同様な用量レベルでは所望の標的について選択的であることを示唆するものである。

ヒト異種移植モデルでの化合物1の抗腫瘍効果
GTL-16胃癌、U87MGグリア芽腫、NCI-H441 NSCLC及びPC-3前立腺癌を含む、c-Met/HGFRの調節不全が関連する癌兆候を代表する、様々なヒト腫瘍異種移植モデルで、化合物1の抗腫瘍効果を評価した（表4）。

GTL-16胃癌モデル
GTL-16胃癌モデルを用いて、化合物1は、大きな樹立腫瘍（＞600mm³）の顕著な退縮を引き起こす能力を証明した（図4）。この試験では、50及び75mg/kg/日の化合物1処置群は、43日間の投与スケジュールの間に、等しい平均腫瘍退縮を示し、50mg/kg/日は、最高に有効な用量レベルを与えるという更なる証拠を提供した。図4に示したように。50又は75mg/kg/日での平均腫瘍退縮は、化合物1の投与の43日後に60%であった。本試験では、43日間の化合物1の投与サイクル中に各腫瘍が各用量レベルで大量に減少した。14匹中9匹のマウスは、腫瘍量が＞30%減少し（部分的反応）、1動物は、完全な反応を示し、10日間の処置の停止後でさえ腫瘍の形跡が全くなかった。

胸腺欠損マウスにおける大きな樹立GTL-16腫瘍異種移植片の退縮（図4A）、及び化合物1の毎日の経口投与後のマウス体重（図4B）。樹立GTL-116腫瘍（620mm³）を担持する胸腺欠損マウスに、化合物1を所定の用量レベルで又はビヒクルのみを43日間経口投与した。抗腫瘍効果を試験するために（図4A）。6〜8匹のマウス群について、所定の日にキャリパーで、示された平均腫瘍体積±SEMと共に腫瘍体積を測定した（図4B）。化合物1処置及びビヒクル対照群の平均マウス体重を右側パネルに示す。

NCI-H441 NSCLCモデル/Caki-1/PC-3腫瘍異種移植
樹立NCI-H441（100mm3）（図5A）及びCaki-1（表3A、表3B）又はPC-3腫瘍異種移植片（図5B）を担持する胸腺欠損マウスに、それぞれ、38日間、40日間又は20日間、化合物1を所定の用量で又はビヒクルのみを経口投与した。平均腫瘍体積±SEMと共に、所定の日に腫瘍体積をキャリパーで測定した。^*は、処置群対対照群（P＜0.001）において平均腫瘍体積がほとんど有意でないことを示し、これは一方向バリアンス分析を用いて決定した（図5参照）。

NCI-H441 NSCLCモデルでは、化合物1投与の38日後に50mg/kg/日で、樹立腫瘍の43%平均退縮が観察された（図5）。この試験では、33日間の化合物1の投与サイクル中に各腫瘍が50mg/kg/日で大量に減少した。14匹中9匹のマウスは、腫瘍量が＞30%減少し（部分的反応）、3動物は、完全な反応を示し、腫瘍の形跡が全く認められなかった。化合物1の抗腫瘍効果は、50mg/kg/日で観察される樹立NCI-H441腫瘍の退縮、及び15mg/kg/日で観察される腫瘍成長の部分的退縮（57%腫瘍成長阻害）に用量依存的であった（図5）。NCI-H441モデルで観察される化合物1の抗腫瘍効果は、ビヒクル処置群と比べて化合物処置群由来の腫瘍でのc-Met/HGFRリン酸化阻害と一致した。Caki-1腎癌モデルでは、平均腫瘍体積の53%減少が、33日間の化合物1の投与サイクル中、50mg/kg/日で観察された（図5B）。Caki-1試験では、各腫瘍は、33日間の化合物1の投与サイクル中、少なくとも30%の体積が減少した（図3B、表4）。化合物1の抗腫瘍効果をPC-3前立腺癌異種移植モデルでも試験し、ほとんど完全な腫瘍成長阻害（84%成長阻害）がこのモデルで観察された。

c-Met/HGFR阻害と抗腫瘍効果との関係
c-Met/HGFR標的阻害と抗腫瘍効果との関係を証明するために、一連の用量-依存的抗腫瘍効果及び薬理試験を行った。化合物1によるc-Met/HGFR薬理的阻害を評価するために、化合物1の経口投与後のいくつかの時点でGTL-16胃癌を採取した。腫瘍のc-Met/HGFRリン酸化状態を用量範囲に渡ってELISAで定量した。これらの試験では、化合物1は、腫瘍成長阻害と、c-Met/HGFRの用量-及び時間-依存的阻害との強い相関関係を証明した。GTL-16モデルでの標的PDと有効性との関連を特定すると、以下の結論が明らかである：1)24時かのc-Met/HGFR活性の完全な阻害は、腫瘍成長の完全な阻害（50mg/kg，100% TGI）と一致する、2)スケジュールの一部分のみについてのc-Met/HGFR活性の強力な阻害は、次善の有効性（12.5mg/kg，60% TGI）に一致する、3)c-Met/HGFR活性の＞50%阻害（3.125，6.25mg/kg）を達成できない能力は、重要な腫瘍成長阻害（TGI）の喪失と一致する（図2A及び2B）。別のGTL-16試験は、50及び75mg/kg/日の化合物1の処理群が同等の平均腫瘍退縮を示したことを証明し、これは、50mg/kg/日が最高の有効容量レベルを示したという更なる証拠（図4及び表4）を提供するものである。これらの発見は、c-Met/HGFR阻害の期間が化合物1の抗腫瘍効果に直接関連する、ことを示唆している。

更に、腫瘍成長及びc-Met/HGFRリン酸化に対する化合物1の同様な用量-用量依存的効果を、全ての腫瘍モデル（GTL-16、U87MG及びNCI-H441）及び観察を更に支持する投薬スケジュールを用いて観察した。これらの試験のそれぞれでは、50mg/kg/日用量レベルは、完全な腫瘍成長阻害又は腫瘍退縮のいずれかをもたらした（表4）。加えて、完全な有効性を達成するために、c-Met/HGFR阻害の程度及び期間を最高にするという概念を更に支持する各モデルにおいて、用量-依存的関係が、c-Met/HGFRリン酸化阻害と抗腫瘍効果との間で観察された。包括的には、これらの試験は、投与スケジュールの期間でのc-Met/HGFRリン酸化のほとんど完全な阻害が、治療効果を最大にするために必要であり、c-Met/HGFR活性阻害の程度及び期間が抗腫瘍効果のレベルに直接関した、ことを示唆している。これらのデータは、化合物1、すなわちc-Met/HGFRの所望の薬理的標的の阻害と、抗腫瘍効果の程度との関連を支持する。

NPM-ALK-依存性リンパ腫モデルでの化合物1の抗腫瘍効果
Karpas 299 ALCLモデル
樹立Karpas 299腫瘍（220mm³）を担持するSCID-ベージュ色マウスに、所定の期間、化合物1の所定量又はビヒクルのみを経口投与した。腫瘍性腸阻害を調べる試験（図6A）に関して、所定の日に、8〜12匹のマウス群について、示された平均腫瘍体積±SEMと共に、腫瘍体積をキャリパーで測定した。パーセント(%)値は、ビヒクル-処置マウスと比べた薬物-処置マウスを23日目に測定し、次式：100^*｛1-[(処置23日−処置12日）/（対照23日−対照12日）]｝に従って計算した腫瘍成長阻害の%を示す。^*は、処置群対対照群（P＜0.001）において平均腫瘍体積がほとんど有意でないことを示し、これは一方向バリアンス分析を用いて決定した。NPM-ALKリン酸化の阻害を調べる試験（図6B）については、化合物1の投与後4時間の試験終了時に思いやりを持って安楽死させ、腫瘍を切断し、冷凍し、ビヒクル及び処置群でのALKリン酸化をELISAによって定量した。腫瘍中の化合物1によるキナーゼ標的リン酸化の阻害を次式：%阻害 = 100−[(平均OD処置/平均OD非処置）×100]に従って計算した。

Karpas 299 ALCLモデルを用いて、化合物1は樹立腫瘍（＞200mm³）の顕著な退縮を引き起こす能力を証明した（図6A）。この試験では、化合物1の100mg/kg/日投与は、最初の化合物投与の15日以内に、この投薬群において全てのマウスの完全な腫瘍退縮をもたらした（図6A）。17日後に、化合物1処置を停止し、腫瘍を再-成長させた。腫瘍がより大きなサイズ（＞600mm³）に成長したとき、化合物1処置を更に13日間再開し、腫瘍の完全な退縮を更にもう一度証明した（図6A、表4）。化合物1の細胞減少効果は、in-vitroでのALCL細胞に対する抗-増殖性及びアポトーシス効果の観察と一致する。複数の用量レベル及び時点で、腫瘍NPM-ALKリン酸化阻害と抗腫瘍効果との関係も決定した。c-Met/HGFR-依存性腫瘍モデルでの観察と同様に、十分な投薬間隔（24時間）でのNPM-ALK活性のほとんど完全な阻害（＞90%阻害）は、100mg/kgでの最大抗腫瘍効果(完全な退縮）と一致する（図6A及び6B）。NPM-ALKリン酸化の不完全阻害（25又は50mg/kgでの＜90%阻害）は、次善の抗腫瘍効果と一致する（図6A及び6B）。c-Met/HGFR-依存性癌モデルでの試験と同様に、このデータは、化合物1、すなわちNPM-ALKの他の所望の薬理的標的の阻害と、NPM-ALK-依存性癌モデルでの抗腫瘍効果の程度との関連を支持している。

化合物1の合成
PLEは、ブタ肝臓からの粗エステラーゼ調製物として、Rocheにより製造され、Biocatalytics Inc.によって販売されている酵素であり、一般的にはPLE-ASとして知られている（ICR-123としてBiocatalyticsから購入、硫酸アンモニウム懸濁液として販売されている）。当該酵素は、CAS登録では、「カルボン酸-エステルヒドラーゼ，CAS番号9016-18-6」として分類されている。対応する酵素分類番号はEC 3.1.1.1である。当該酵素は、幅広いエステルの加水分解に対して幅広い基質特異性を有することが知られている。リパーゼ活性は、pH滴定装置における酪酸エチルの加水分解に基づく方法を用いて決定される。1LU（リパーゼ単位）は、22℃。pH8.2で1μmol滴定酪産/分を遊離する酵素の量である。本明細書に報告されている調製物（懸濁液としてのPLE-AS）は一般的に、公表活性が45LU/mgより高い（約40mg/mLのタンパク質量）、不透明の茶緑液として出荷されている。

(1S)-1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロフェニル）エタノール
以下のスキームで化合物(S-1)として示される。(1S)-1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロフェニル）エタノールは、ラセミ体1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロフェニル)酢酸エチルの酵素的加水分解エステル化及びスキームAに従う転位を伴う化学的加水分解の組合せによって調製した。ラセミ体1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロフェニル)酢酸エチル（化合物A2）をスキームAに従って調製した。

1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロフェニル）エタノール(A1):
水素化ホウ素ナトリウム（90mg，2.4mmol）を、2mLの無水CH₃OH中に2',6'-ジクロ-3'-フルオロ-アセトフェノン（Aldrich，カタログ番号52,294-5）（207mg，1mmol）を含む溶液に加えた。反応混合物を室温で1時間攪拌後、濃縮して無色の油状残渣を得た。この残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（0→10%EtOAcのヘキサン溶液）で精製し、化合物A1を無色油として得た（180mg；0.88mmol；収率86.5%）；MS（APCI）（M-H）^-208；¹H NMR(400MHz，クロロホルム-D）δ ppm 1.64(d, J=6.82 Hz, 3 H), 3.02(d, J=9.85 Hz, 1 H), 6.97-7.07(m, 1 H), 7.19-7.33(m, 1 H)。

1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロフェニル）酢酸エチル(A2):
無水酢酸（1.42mL，15mmol）及びピリジン（1.7mL，21mmol）を、20mLのCH₂Cl₂に化合物A1（2.2g, 10.5mmol）を含む溶液に順次加えた。反応混合物を室温で12時間攪拌後、濃縮し、黄色油状残渣を得たこの残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（7→9%EtOAcのヘキサン溶液）で精製し、化合物A2を無色油として得た（2.26g；9.0mmol；収率85.6%）；¹H NMR(400MHz，クロロホルム-D）δ ppm 1.88(d, J=6.82 Hz, 3 H), 2.31(s, 3 H), 6.62(q, J=6.82 Hz, 1 H), 7.25(t, J=8.46 Hz, 1 H), 7.49(dd, J=8.84, 5.05 Hz, 1 H)。

pH電極、オーバーヘッドスターラー及び塩基添加ライン（1M NaOH）を備えた50mLの被覆付フラスコに、1.2mLの100mMリン酸カリウム緩衝液pH 7.0及び0.13mLのPLE AS懸濁液を加えた。次いで、化合物A2（0.13g，0.5mmol，1.00eq）を滴下し、得られた混合物を室温で20時間攪拌し、1M NaOHを用いて7.0の一定のpHを維持した。変換及び反応のeeは、RP-HPLCによって監視し、出発物質が50%消費した（これらの条件下で、約17時間）後に反応を停止した。混合物を次いで10mLの酢酸エチルで3回洗浄し、エステル及びアルコールをR-1及びS-2の混合物として回収した。

窒素雰囲気下で、R-1及びS-2の混合物（0.48mmol）の溶液に、4mLのピリジン中のメタンスルホニルクロリド（0.06mL，0.6mmol）を加えた。反応混合物を室温で3時間攪拌し、次いで濃縮して油を得た。水（20mL）を混合物に加え、次いでEtOAc（20m×2）を加えて水溶液を抽出した。有機層を併せ、乾燥し、濾過し、濃縮して、R-3及びS-2の混合物を得た。更に精製することなく、混合物を次の反応に用いた。¹H NMR(400MHz，クロロホルム-D）δ ppm 1.66(d, J=7.1 Hz, 3 H), 1.84(d, J=7.1 Hz, 3 H), 2.09(s, 3 H), 2.92(s, 3 H), 6.39(q, J=7.0 Hz, 1 H), 6.46(q, J=6.8 Hz, 1 H), 6.98-7.07(m, 1 H), 7.07-7.17(m, 1 H), 7.23-7.30 (m, 1 H), 7.34(dd, J=8.8, 4.80 Hz, 1 H)。

窒素雰囲気下で、4mLのDMFにR-3及びS-2（0.48mmol）を含む混合物に、酢酸カリウム（0.027g，0.26mmol）を加えた。混合物を12時間で100℃まで加熱した。水（20mL）を反応混合物に加え、EtOAc（20mL×2）を加えて水溶液を抽出した。有機層を併せ、乾燥、濾過、濃縮して、S-2の油を得た（72mg，2ステップで収率61%）。光学収率ee：97.6%。¹H NMR(400MHz，クロロホルム-D）δ ppm 1.66(d, J=7.1 Hz, 3 H), 2.09(s, 3 H), 6.39(q, J=6.8 Hz, 1 H), 7.02(t, J=8.5 Hz, 1 H), 7.22-7.30(m, 1 H)。

窒素雰囲気下、0℃で化合物S-2（4.64g，18.8mmol）に、ナトリウムメトキシド（19mmol；0.5Mメタノール液）をゆっくりと加えた。得られた混合物を室温で4時間攪拌した。溶媒を濃縮し、H₂O（100mL）加えた。冷却した反応混合物を酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液でpH 7まで中和した。酢酸エチル（100mL×2）を加え、水溶液を抽出した。有機層を併せ、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、濃縮して、S-1を白色固体（4.36g，収率94.9%）；SFC-MS：97%eeとして得た。¹H NMR(400MHz，クロロホルム-D）δ ppm 1.65(d, J=6.8 Hz, 3 H), 5.58(q, J=6.9 Hz, 1 H), 6.96-7.10(m, 1 H), 7.22-7.36(m, 1 H)。

5-ブロモ-3-[1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-ピリジン-2-イルアミン（ラセミ混合物）：

１．10分間氷浴を用いて、2,6-ジクロロ-3-フルオロアセトフェノン（15g，0.072mmol）を0℃でTHF（150mL，0.5M）に攪拌した。水素化アルミニウムリチウム（2.75g．0.072mol）ゆっくりと加えた。室温で3時間、反応を攪拌した。反応を氷浴で冷却し、水（3mL）を滴下し、15% NaOH（3mL）をゆっくりと加えた。混合物を室温で30分間攪拌した。15% NaOH（9mL）及びMgSO₄を加え、混合物を濾過し、固体を除いた。固体をTHF（50mL）で洗浄し、濾液を濃縮して、1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エタノール（14.8mg，収率95%）を黄色油として得た。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆）δ ppm 1.45(d, 3 H), 5.42(m, 2 H), 7.32(m, 1 H), 7.42(m, 1 H)。

２．トリフェニルホスフィン（8.2g，0.03mmol）及びDEAD（40%トルエン溶液の13.65mL）を含むTHF（200mL）の攪拌溶液に、0℃で、1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エタノール（4.55g，0.021mmol）及び3-ヒドロキシ-ニトロソピリジン（3.35g，0.023mmol）を含むTHF（200mL）を加えた。室温で出発物質が全て消費されるまでの4時間、得られた明るいオレンジ色溶液を窒素雰囲気下で攪拌した。溶媒を除き、粗原料を乾燥シリカゲル上に充填し、酢酸エチル-へキサン（20:80）で溶出し、3-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-ベンジルオキシ)-2-ニトロ-ピリジン（6.21g，0.021mmol，98%）をピンク色固体として得た。¹H NMR(300MHz，CDCl₃）δ ppm 1.8-1.85(d, 3 H), 6.0-6.15(q, 1 H), 7.0-7.1(t, 1 H), 7.2-7.21(d, 1 H), 7.25-7.5(m, 2 H), 8.0-8.05(d, 1 H)。

３．AcOH（650mL)及びEtOH（500mL）の攪拌混合物に、3-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-ベンジルオキシ)-2-ニトロ-ピリジン（9.43g，0.028mmol）及び鉄片（15.7g，0.28mol）を懸濁させた。反応をゆっくりとリフラックスまで加熱し、1時間攪拌した。反応を室温まで冷却し、ジエチルエーテル（500mL）及び水（500mL)を加えた。溶液を炭酸ナトリウムの添加によって注意深く中和した。併せた有機抽出物を飽和NaHCO₃（2×100mL）及び飽和食塩水（1×100mL）で洗浄し、乾燥し（Na₂SO₄）、濾過し、濃縮して減圧乾燥して、3-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-ベンジルオキシ)-ピリジン-2-イルアミン（9.04g，0.027mol，99%)を明るいピンク色固体として得た。¹H NMR(300MHz，CDCl₃）δ ppm 1.8-1.85(d, 3 H), 4.9-5.2(brs, 2 H), 6.7-6.84(q, 1 H), 7.0-7.1(m, 1 H), 7.2-7.3(m, 1 H), 7.6-7.7(m, 1 H)。

４．3-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-ベンジルオキシ)-ピリジン-2-イルアミン（9.07g，0.03mol)アセトニトリルの攪拌溶液を氷浴で0℃に冷却した。この溶液に、N-ブロモコハク酸イミド（NBS）（5.33g，0.03mmol）を滴下した。反応を0℃で15分間攪拌した。反応を濃縮して減圧下で乾燥した。得られた褐色油をEtOAc（500mL）に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。溶媒を減圧下除き、5-ブロモ-3-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-ベンジルオキシ)-ピリジン-2-イルアミン（5.8g，0.015mmol，51%）を白色結晶固体として得た。¹H NMR(300MHz，CDCl₃）δ ppm 1.85-1.95(d, 3 H), 4.7-5.0(brs, 2 H), 5.9-6.01(q, 1 H), 6.8-6.95(d, 1 H), 7.01-7.2(t, 1 H), 7.4-7.45(m, 1 H), 7.8-7.85(d, 1 H)。

5-ブロモ-3-[1(R)-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-ピリジン-2-イルアミン：

ラセミ体について上に記載したようにして、鏡像異性体的に純粋なR異性体を調製した。但し、鏡像異性体的に純粋な出発物質は上記のものを使用した。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆）δ ppm 1.74(d, 3 H), 6.40(m, 1 H), 6.52(brs, 2 H), 7.30(m, 1 H), 7.48(m, 1 H), 7.56(s, 1 H); MS m/z 382（M+1）。

4-メタンスルホニルオキシ-ピペリジン-1-カルボン酸 tert-ブチルエステル(2)

4-ヒドロキシ-ピペリジン-1-カルボン酸 tert-ブチルエステル（7.94g，39.45mmol）を含むCH₂Cl₂（100mL）の攪拌溶液を0℃に冷却し、NEt₃（5.54mL，39.45mmol）をゆっくりと加え、メタンスルホニルクロリド（3.06mL，39.45mmol）及びDMAP（48mg，0.39mmol)を加えた。混合物を室温で終夜攪拌した。この混合物に、水（30mL）を加えた。CH₂Cl₂（3×30mL）で抽出後、乾燥（Na₂SO₄)し、溶媒を減圧留去し、4-メタンスルホニルオキシ-ピペリジン-1-カルボン酸 tert-ブチルエステルを白色固体（11.00g，収率＞99%）として得た。¹H NMR(400MHz，CDCl₃）δ ppm 4.89(m, 1 H), 3.69(m, 2 H), 3.31(m, 2 H), 3.04(s, 3 H), 1.95(m, 2 H), 1.83(m, 2 H), 1.46(s, 9 H)。

tert-ブチル-4-[4-(4,4,5,5,-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)-1H-ピラゾール-1-イル]ピペリジン-1-カルボキシレート

tert-ブチル-4-(4-ヨード-1H-ピラゾール-1-イル)ピペリジン-1-カルボキシレート(3)
4-ヨードピラゾール（0.57mmol）のDMF（2L）の攪拌溶液に4℃で、NaH（1.2eq.，0.68mmol）を滴下した。得られた混合物を4℃で1時間攪拌し、4-メタンスルホニルオキシ-ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル、化合物2（1.1eq.，0.63mmol）を加えた。得られた混合物を100℃で12時間加熱した。反応をH₂Oでクエンチし、EtOAcで数回抽出した。併せた有機層を乾燥、濾過、濃縮して、オレンジ色油を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（5%EtOAcのペンタン溶液で溶出）で精製し、化合物3を白色固体として得た（140g，66%）。

tert-ブチル-4-[4-(4,4,5,5,-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)-1H-ピラゾール-1-イル]ピペリジン-1-カルボキシレート(4)
ビス(ピナコラト)ジボラン（1.4eq.，134g，0.52mmol）及び酢酸カリウム（4eq.，145g，1.48mmol）を、化合物3（140g，0.37mol）の1.5LのDMSO溶液に順次加えた。混合物を窒素で数回パージし、ジクロロビス(トリフェニルホスフィノ)パラジウム(II)（0.05eq.，12.9g，0.018mmol）を加えた。得られた混合物を80℃で2時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、セライトベッドを通して濾過し、EtOAcで洗浄した。濾液を飽和NaCl（500mL×2）で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（5%EtOAcのペンタン溶液で溶出）で精製し、化合物4を白色固体として得た（55g，40%）。

3-[(R)-1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-5-(1-ピペリジン-4-イル-1H-ピラゾール-4-イル)-ピリジン-2-イルアミン(1)

3-[(R)-1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-5-(4,4,5,5-テトラメチル-[1,3,2]ジオキサボロラ-2-イル)-ピリジン-2-イルアミン（15.22g，35.64mmol）及び4-(4-ブロモ-ピラゾール-1-イル)-ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル（14.12g，42.77mmol）のDME（143mL）の攪拌溶液に、Na₂CO₃（11.33g，10692mmol）の水溶液（36mL）を加えた。この溶液を脱ガスし、窒素で3回チャージした。この溶液にPd(Ph₃)₂Cl₂（1.25mg，1.782mmol）を加えた。反応溶液を脱ガスし、再度、窒素で3回チャージした。反応溶液を約16時間（又は、ボランピナコールエステルが消費されるまで）、油浴で87℃で攪拌し、室温まで冷却し、EtOAc（600mL）で希釈した。反応混合物をセライトパッドで濾過し、EtOAcで洗浄した。このEtOAc溶液を飽和食塩水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濃縮した。粗生成物をEtOAc/ヘキサン系（Biotage 90+カラム：600mL 100%ヘキサンで平衡化、分画1：2250mL 50% EtOAc/ヘキサン リニア、分画2：4500mL 75% EtOAc/ヘキサン リニア、分画3：4500mL 100% EtOAc）で溶出して、シリカゲルカラムで精製し、0.15のRf（50%EtOAc/へキサンを有する、4-(4-｛6-アミノ-5-[(R)-1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-ピリジン-3-イル｝-ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル（11.8g，収率60%，純度約95%）を得た。MS m/e 550(M+1)⁺。

4-(4-｛6-アミノ-5-[(R)-1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-ピリジン-3-イル｝-ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル（11.8g，21.45mmol）のCH₂Cl₂（59mL，0.2M）溶液に、4N HCl/ジオキサン（21mL）を加えた。この溶液を終夜攪拌して固体を形成した。この固体をガラス棒で砕き、超音波をかけ、固体中に含まれている出発物質を放出させた。追加の4N HCl/ジオキサン（21mL）を加え、LCMSが出発物質を示さない室温で更に2時間攪拌した。懸濁液を、濾紙を敷いたブフナー漏斗で濾過した。5%未満の生成物を含むため、母液を保存した。固体を500mLビーカーに移し、HPLC水を固体が完全に溶解するまで加えた。固体Na₂CO₃を加えてpHを10に調整した。LCMSが水層に生成物を示さなくなるまで、水溶液をCH₂Cl₂（5×200mL）で抽出した。CH₂Cl₂溶液をNa₂SO₄で乾燥し濃縮した。粗生成物をCH₂Cl₂（10mL）及びMeOH（1mL）に再溶解し、CH₂Cl₂/MeOH/NEt₃系（Biotage 40+カラム：副生成物を与える600mL 100% CH₂Cl₂で平衡化、分画1：1200mL 10% MeOH/CH₂Cl₂ リニア、分画2：2400mL 10% MeOH/CH₂Cl₂ ステップ、分画3：2400mL 9% MeOH/1% CH₂Cl₂）で溶出して、シリカゲルカラムで精製した。所望の分画を回収し、3-[(R)-1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-5-(1-ピペリジン-4-イル-1H-ピラゾール-4-イル)-ピリジン-2-イルアミン（7.19g，合計収率75%，白色固体）。MS m/e 450(M+1)⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆）δ ppm 7.92(s, 3 H), 7.76(s, 1 H), 7.58(m, 1 H), 7.53(s, 1 H), 7.45(m, 1 H), 6.90(s, 1 H), 6.10(m, 1 H), 5.55(bs, 2 H), 4.14(m, 1 H), 3.05(m, 2 H), 2.58(m, s H), 1.94(m, 2 H), 1.80(d, 3 H), 1.76(m, 2 H)。

固体生成物 3-[(R)-1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-5-(1-ピペリジン-4-イル-1H-ピラゾール-4-イル)-ピリジン-2-イルアミンをジクロロメタンに溶解し、溶媒をゆっくりと濃縮し、微結晶固体を得た。高真空乾燥後、試料を、194℃の融点を有する、単一結晶多型Aであると確認した。

図1は、化合物1による、組換えヒトc-Met/HGFRATPキナーゼ活性のATP-競争阻害を示す図である。 図2Aは、所定の用量の化合物1又はビヒクルのみを11日間、樹立GTL-16癌を担持する胸腺欠損マウスに経口的に投与した図である。GTL-16でのc-Met/HGFRリン酸化の阻害を調べる試験である。 図2Bは、所定の用量の化合物1又はビヒクルのみを11日間、樹立GTL-16癌を担持する胸腺欠損マウスに経口的に投与した図である。GTL-16癌成長阻害を調べる試験である。 図3Aは、所定の用量の化合物1又はビヒクルのみを9日間、樹立U87MG癌（150mm³）を担持する胸腺欠損マウスに経口的に投与した図である。癌成長阻害を調べる試験である。 図3Bは、所定の用量の化合物1又はビヒクルのみを9日間、樹立U87MG癌（150mm³）を担持する胸腺欠損マウスに経口的に投与した図である。C-Met/HGFRリン酸化阻害を調べる試験である。 図4Aは、大きな樹立GTL-16異種移植片を担持する胸腺欠損マウスへの化合物1の毎日の経口投与を示す図である。胸腺欠損マウスにおける、大きな樹立GTL-16癌異種移植片の退縮を示す。 図4Bは、大きな樹立GTL-16異種移植片を担持する胸腺欠損マウスへの化合物1の毎日の経口投与を示す図である。化合物1の毎日の経口投与後のマウスの体重を示す。 図5Aは、樹立NCI-H441又はPC-3癌異種移植片を担持する胸腺欠損マウスへの化合物1の毎日の経口投与を示す図である。樹立NCI-H441を担持する胸腺欠損マウスでの癌退縮を示す。 図5Bは、樹立NCI-H441又はPC-3癌異種移植片を担持する胸腺欠損マウスへの化合物1の毎日の経口投与を示す図である。樹立PC-3癌異種移植片を担持する胸腺欠損マウスでの退縮を示す。 図6Aは、NPM-ALK-依存性リンパ腫モデル（Karpas 299 ALCLモデル）における化合物1の抗癌性を示す図である。癌成長阻害を調べる試験である。 図6Bは、NPM-ALK-依存性リンパ腫モデル（Karpas 299 ALCLモデル）における化合物1の抗癌性を示す図である。NPM-ALKリン酸化阻害を調べる試験である。

Claims (13)

1. 異常細胞の成長を処置する必要のある哺乳動物において当該成長を処置する方法であって、(R)-3-[1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-5-(1-ピペリジン-4-イル-1H-ピラゾール-4-イル)-ピリジン-2-イルアミン又は薬学的に許容される塩の治療上有効量を当該哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
2. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。
3. 前記哺乳動物がイヌである、請求項１記載の方法。
4. 前記の異常細胞成長が少なくとも1つの遺伝子組換えチロシンキナーゼにより仲介される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 前記の異常細胞成長が、肝細胞成長因子受容体（c-Met/HGFR）キナーゼ又は未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）により仲介される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
6. 前記の異常細胞成長が、肝細胞成長因子受容体（c-Met/HGFR）キナーゼにより仲介される、請求項５記載の方法。
7. 前記の異常細胞成長が、未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）により仲介される、請求項５記載の方法。
8. 前記の異常細胞成長が癌である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
9. 前記癌が、肺癌、骨肉種、膵癌、皮膚癌、頭部又は頚部の癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、結腸癌、乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経（CNS）腫瘍、中枢神経原発悪性リンパ腫、脊髄軸癌、脳幹膠腫、下垂体腺腫及びそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項８記載の方法。
10. 前記癌が、非小細胞肺癌（NSCLC）、扁平上皮細胞癌、ホルモン性-難治性前立腺癌、乳頭状腎細胞癌、直腸結腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）及び胃癌からなる群より選ばれる、請求項８記載の方法。
11. 前記化合物又はその薬学的に許容される塩が、(R)-3-[1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-5-(1-ピペリジン-4-イル-1H-ピラゾール-4-イル)-ピリジン-2-イルアミン及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として投与される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. (R)-3-[1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロ-フェニル)-エトキシ]-5-(1-ピペリジン-4-イル-1H-ピラゾール-4-イル)-ピリジン-2-イルアミンを投与することによって細胞のc-Met/HGFRキナーゼ活性を阻害する方法。
13. 前記細胞が、ヒト肺癌A549、ヒト胃癌GTL-16、ヒト結腸癌HT-29、ヒト結腸癌Colo205、ヒト腎癌A498、ヒト腎癌786-O、ヒト乳癌MBA-MD-231、イヌ腎由来（MDCK）上皮細胞、P-糖タンパク質を発現させるために設計されたMDCK細胞（MDCK-MDR1）、mIMCD3マウス腎上皮、HUVEC（ヒト臍静脈内皮細胞）、腎癌Caki-1、並びにヒト野生型c-Met/HGFR、及びHGFR-V10921、HGFR-H1094R、HGFR-Y1230C及びHGFR-M1250Tを含む変異c-Met/HGFRを発現させるために設計されたNIH-3T3細胞からなる群より選ばれる、請求項１２記載の方法。

Images