JP2007082430A - 脳腫瘍マーカーおよびその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】脳腫瘍に対する新たな治療法、診断学の開発のために悪性脳腫瘍の指標となる脳腫瘍マーカーおよびその用途を提供する。
【解決手段】脳腫瘍の悪性度を判定するために使用する脳腫瘍マーカー遺伝子であって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含み、前記遺伝子の発現量が高いほど、前記脳腫瘍の悪性度が高いと判定する脳腫瘍マーカー遺伝子を提供する。また、脳腫瘍患者の予後を予測するために使用する脳腫瘍マーカー遺伝子であって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含み、前記遺伝子の発現量に基づいて脳腫瘍の予後を予測する方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、脳腫瘍の悪性度の指標となりうる脳腫瘍マーカーおよびその用途に関する。

神経膠腫は原発性脳腫瘍の中で最も頻度の多い腫瘍であり、また悪性神経膠腫は最も予後不良な悪性腫瘍の一つである。最も悪性度の高い神経膠芽腫では生存期間中央値は９〜１２ヶ月にすぎない（非特許文献１及び２）。近年の腫瘍生物学や手術、放射線化学療法の進歩にも拘わらず、生存期間の延長は殆ど認められていない（非特許文献３）。それゆえ新たな診断、治療法に結びつくような新しい分子標的の発見等、腫瘍生物学的な解析が望まれていた。

ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質(Ｃ／ＥＢＰ)は構造的に関連した転写因子のファミリを構成し、これらは正常組織の発達、細胞増殖、分化において重要な役割をはたしていることが報告されている（非特許文献４）。Ｃ／ＥＢＰはロイシンジッパーファミリに属するＤＮＡ結合蛋白であり、Ｃ末端側に共通したロイシンジッパー構造を持つ二量体形成ドメインを有し、これによりホモダイマーもしくは他のＣ／ＥＢＰメンバーやＡＰ−１、ＮＦ−κＢ等の転写因子とヘテロダイマーを形成してＤＮＡと結合し、Ｎ末端側の転写活性もしくはアテニュエーションドメインにより転写調節を行うことが知られている（非特許文献４〜６）。これまでα〜ζの６種類のメンバーが同定されている（非特許文献２及び７〜１５）。これらの発現は成長因子やホルモン、サイトカイン等の影響を受け、組織特異的な発現パターンが認められている（非特許文献４、１６及び１７）。また異なる開始コドンからの翻訳により複数のアイソフォームを持ち、さらに翻訳後のリン酸化の影響も加わって、これらのＤＮＡ結合能や生物学的活性の違いや、他の転写因子との相互作用によって多面的な効果を発現し、多様な組織で細胞の分化、増殖、免疫反応等に重要な役割をはたす遺伝子群の転写調節を行っていると考えられている（非特許文献４及び１８〜２０）。この内、Ｃ／ＥＢＰβはＩＬ−１, ＩＬ−６, ＴＮＦα等の炎症性サイトカインによって誘導され（非特許文献２１）、細胞の増殖、分化、サイトカインに関する遺伝子の発現制御において重要な役割を担っていることが知られている。しかし、Ｃ／ＥＢＰβは、ＩＬ−１β刺激によるＩＬ−６発現に関与するＤＮＡ結合タンパク質(ＮＦ−ＩＬ６)として発見された分子であり（非特許文献９）、最近ではＩＬ−８やＴＮＦαの発現誘導への関与が報告されている（非特許文献２２及び２３）。また、乳癌、卵巣上皮腫、結腸癌、腎細胞癌においてＣ／ＥＢＰβの発現亢進が報告されており、また反対に扁平上皮癌、肝細胞癌においては発現の低下が報告されている。さらに、Ｃ／ＥＢＰβをノックアウトしたマウスで腫瘍形成能への耐性が認められており、上皮の腫瘍化におけるＣ／ＥＢＰβの必要性が示唆されている（非特許文献２４）。
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しかしながら、上述したように乳癌、卵巣上皮腫、結腸癌、腎細胞癌、扁平上皮癌、肝細胞癌におけるＣ／ＥＢＰβの発現に関しては報告されているが、脳腫瘍（神経膠腫）に関してはＣ／ＥＢＰβとの間に密接な相関関係は見出されていなかった。また、治療法の未だに確立されていない脳腫瘍に対する、新たな診断、治療法に結びつくような新しい分子標的の発見等、腫瘍生物学的な解析が期待されていた。

本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、脳腫瘍に対する新たな治療法、診断学の開発のために悪性脳腫瘍の指標となる脳腫瘍マーカーおよびその用途を提供することを目的とする。

上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、悪性度の高い神経膠腫において、Ｃ／ＥＢＰβのタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルの発現の亢進がみられることに着目し、その後細胞生物学的解析によりＣ／ＥＢＰβの発現と悪性神経膠腫細胞の増殖能及び浸潤能との関連が示されたことにより、Ｃ／ＥＢＰβが神経膠腫の悪性化へ関与していることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の請求項１は、脳腫瘍の悪性度を判定するために使用する脳腫瘍マーカーであって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含み、前記遺伝子の発現量が高いほど、前記脳腫瘍の悪性度が高いと判定することを特徴とする脳腫瘍マーカーである。

本発明の請求項２は、脳腫瘍患者の予後を予測するために使用する脳腫瘍マーカーであって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含み、前記遺伝子の発現量に基づいて脳腫瘍患者の予後を予測することを特徴とする脳腫瘍マーカーである。

本発明の請求項３は、前記ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子の発現量が、そのｍＲＮＡ又はタンパク質の少なくとも一方の量により測定されることを特徴とする請求項１又は２に記載の脳腫瘍マーカーである。

本発明の請求項４は、請求項１〜３のいずれかに記載の脳腫瘍マーカー遺伝子を定量するためのｍＲＮＡマーカーであって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βのｍＲＮＡを含むことを特徴とするｍＲＮＡマーカー。

本発明の請求項５は、請求項１〜３のいずれかに記載の脳腫瘍マーカー遺伝子を定量するためのタンパク質マーカーであって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを含むことを特徴とするタンパク質マーカー。

本発明の請求項６は、請求項４記載のｍＲＮＡマーカーを定量するために使用されるオリゴヌクレオチドであって、前記ｍＲＮＡの塩基配列またはその相補塩基配列の一部からなり、前記ｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部分特異的塩基対を形成することを特徴とするオリゴヌクレオチド。

本発明の請求項７は、請求項４記載のｍＲＮＡマーカーを定量するために使用されるプライマーであって、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成することを特徴とするプライマー。

本発明の請求項８は、請求項４記載のｍＲＮＡマーカーを定量するために使用されるプローブであって、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成することを特徴とするプローブ。

本発明の請求項９は、請求項５記載のタンパク質マーカーを定量するための抗体であって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを認識することを特徴とする抗体。

本発明の請求項１０は、請求項４記載のｍＲＮＡマーカーを定量するために使用するキットであって、少なくとも、前記ｍＲＮＡのｃＤＮＡを定量可能なように増幅するために請求項７記載のプライマーと、検出のため前記増幅産物に対合させる請求項８記載のプローブとを含むことを特徴とするキット。

本発明の請求項１１は、請求項５記載のタンパク質マーカーを定量するために使用するキットであって、少なくとも、請求項９記載の抗体及び／又はその標識化抗体を含むことを特徴とするキット。

本発明の請求項１２は、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法である：（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含む脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。

本発明の請求項１３は、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法である：（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質における、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを含む脳腫瘍のタンパク質マーカーの発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。

本発明の請求項１４は、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とするＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含む脳腫瘍マーカー遺伝子又はＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを含む脳腫瘍のタンパク質マーカーの発現を抑制する物質のスクリーニング方法である：（ａ）被験物質と、前記脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーを発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーの発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーの発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。

本発明によれば、悪性脳腫瘍の指標となる脳腫瘍マーカーが提供される。特に、脳腫瘍の悪性度を判定するために使用する脳腫瘍マーカー遺伝子、又は、脳腫瘍患者の予後（生存期間）を予測するために使用する脳腫瘍マーカー遺伝子が提供される。また、この脳腫瘍マーカー遺伝子やタンパク質マーカーを使用することによって、腫瘍マーカーとしての診断応用の他に、新規抗癌剤など創薬への応用が可能となる。さらに、脳腫瘍マーカー遺伝子に対するプローブ等を作製することにより、脳腫瘍マーカー遺伝子を検出し、脳腫瘍の診断を広範囲にかつ確実に行うことができる。また、脳腫瘍を抑制する物質のスクリーニングを行い、新規抗癌剤の開発を進展させることができる。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の「脳腫瘍」は、頭蓋内に発生するすべての腫瘍をいう。このような脳腫瘍の中でも、発生頻度の高い代表的なものが神経膠腫であり、これはさらに、星状細胞腫、神経膠芽腫等を含む。脳腫瘍には、この他、下垂体腺腫、神経鞘腫などがある。

本発明におけるＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）は、ロイシンジッパーファミリに属する転写制御因子であり、これまでα〜ζの６種類のメンバーが同定され、組織特異的な発現パターンが認められている。Ｃ／ＥＢＰβは主に細胞の増殖、分化、サイトカインに関する遺伝子の発現制御において重要な役割を担っていることが知られている。

なお、本発明で使用されたＣ／ＥＢＰβ遺伝子は、ＮＣＢＩの遺伝子データベースにおいて、Ｇｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００５１９４によりアプローチすることができる。

哺乳類由来のＣ／ＥＢＰβ遺伝子は公知であり、例えば、Ｄｅｓｃｏｍｂｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． Ｖｏｌ． ４， １５４１−１５５１，１９９０及びＡｋｉｒａ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ９， １８９７−１９０６，１９９０に記載されている。

本発明で使用することができるＣ／ＥＢＰβ遺伝子の起源は特に限定されず、任意の生物に由来する任意の遺伝子を使用することができる。本発明は、任意の起源に由来するＣ／ＥＢＰβを包含する。例えば、哺乳動物から入手できるＣ／ＥＢＰβ遺伝子を使用してもよい。用語「哺乳動物」とは、哺乳類の任意の個体を意味し、大型動物（牛、羊、馬など）、運動動物（犬及び猫を含む）、及び霊長類（旧世界ザル、新世界ザル、類人猿、ヒトなどを含む）などを含む。例えば、ヒトＣ／ＥＢＰβが使用される。本発明で使用するＣ／ＥＢＰβ遺伝子は、例えばＰＣＲなどの当業者に公知の技術を用いて哺乳動物培養細胞などから得たｃＤＮＡでもよい。

本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子は、脳腫瘍の悪性度を判定するために使用する脳腫瘍マーカー遺伝子であって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含み、前記遺伝子の発現量が高いほど、前記脳腫瘍の悪性度が高いと判定することを特徴とする。

また、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子は、脳腫瘍患者の予後を予測するために使用する脳腫瘍マーカー遺伝子であって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含み、前記遺伝子の発現量に基づいて脳腫瘍患者の予後を予測することを特徴とする。
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子を用いて脳腫瘍の判定において、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の発現量を測定する場合、そのｍＲＮＡを定量してもよく、そのタンパク質を定量してもよい。したがって、Ｃ／ＥＢＰβｍＲＮＡは、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子を定量するためのｍＲＮＡマーカーとすることができ、Ｃ／ＥＢＰβタンパク質は、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子を定量するためのタンパク質マーカーとすることができる。

本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子を定量するための前記ｍＲＮＡマーカーを定量する方法としては、細胞内の特定ｍＲＮＡ量を定量できる方法であれば、特に制限されず、例えば、前記ｍＲＮＡマーカーのｍＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡの塩基配列またはそれらの相補塩基配列の一部からなるオリゴヌクレオチドであって、前記ｍＲＮＡマーカーのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いた方法があげられる。前記プライマーやプローブは、前記オリゴヌクレオチドが前記マーカーｍＲＮＡのｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成するものであれば、前記ｍＲＮＡを検出・定量するための様々な修飾がされたものであってよい。さらに、本発明のプローブを固定化させたＤＮＡチップを作製することも可能である。ＤＮＡチップの作製方法は、当業者には公知である。ＤＮＡチップを用いることにより、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現レベルを検出、測定することができる。

本発明の抗体は、請求項５記載のタンパク質マーカーを定量するための抗体であって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを認識することを特徴とする。本発明の抗体はＣ／ＥＢＰβタンパク質に特異的に結合する性質を有することから、前記抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現したＣ／ＥＢＰβタンパク質を特異的に検出することができる。

抗体の製造方法は公知であり、本発明の抗体も常法に従って製造することができる。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＣ／ＥＢＰβタンパク質を用いて、あるいは常法に従ってこれらＣ／ＥＢＰβタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＣ／ＥＢＰβタンパク質またはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。それゆえ、該抗体には、標識物質によって標識化された抗体も含まれる。

本発明のキットは、請求項４記載のｍＲＮＡマーカーを定量するために使用するキットであって、少なくとも、前記ｍＲＮＡのｃＤＮＡを定量可能なように増幅するために請求項７記載のプライマーと、検出のため前記増幅産物に対合させる請求項８記載のプローブとを含むことを特徴とする。

さらに、本発明のキットは、請求項５記載のタンパク質マーカーを定量するために使用するキットであって、少なくとも、請求項９記載の抗体及び／又はその標識化抗体を含むことを特徴とする。この診断キットは、抗体や標識化抗体を液相中に含むものであってもよく、あるいは抗体や標識化抗体を固相担体に結合したものであってもよい。さらにこの診断キットは、例えば標識化抗体の標識が酵素の場合にはその基質を含むもであってもよく、固相担体を含むものの場合には、固相への非結合分子を洗浄除去するための溶液を含むものであってもよい。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、この発明の診断キットも、この発明によって提供される抗体および／または標識化抗体を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。

本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含む脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。

本発明の悪性脳腫瘍の診断方法において、「被験者」は、例えばＭＲＩ検査等によって脳腫瘍の疑いがあると診察されて患者であり、その「生体試料」とは患者脳からの切除組織あるいは血液等である。評価対象の生体試料は、遺伝子マーカーを含む任意の試料であり得る。患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に従って、生体試料からＲＮＡを調製することができる。また、患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に従って、該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを調製することができる。例えば、被験者の細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅する。その際に、標識ｄＮＴＰを取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることができる。

本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、前記生体試料における脳腫瘍マーカー遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。本発明の診断方法により、脳腫瘍の悪性度の判定、或いは、脳腫瘍患者の生存期間の予後予測を行うことが可能である。健常者の生体試料におけるＣ／ＥＢＰβ遺伝子を含む脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を基準とし、被験者の生体試料における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量が前記基準より高いと悪性脳腫瘍とする。具体的には、本発明の検出方法は、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍の遺伝子マーカーの発現量を測定する。このとき、本発明のプローブやプライマーを適宜用いることができる。

さらに、本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験者の生体試料から調整されるタンパク質における、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを含む脳腫瘍のタンパク質マーカーの発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。

本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、前記生体試料における脳腫瘍のタンパク質マーカーの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。本発明の診断方法により、脳腫瘍の悪性度の判定、或いは、脳腫瘍患者の生存期間の予後予測を行うことが可能である。健常者の生体試料におけるＣ／ＥＢＰβタンパク質を含む脳腫瘍のタンパク質マーカーの発現量を基準とし、被験者の生体試料における前記脳腫瘍のタンパク質マーカーの発現量が前記基準より高いと悪性脳腫瘍とする。具体的には、公知の方法に基づいて、患者の組織の一部を採取し、そこから常法に従ってタンパク質を調製する。その後、例えば、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法など公知の検出方法に基づいて、脳腫瘍のタンパク質マーカーの発現量を検出することができる。このとき、後述する抗体を適宜用いることができる。

本発明のＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含む脳腫瘍マーカー遺伝子又はＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを含む脳腫瘍のタンパク質マーカーの発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験物質と、前記脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーを発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーの発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーの発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。

本発明のＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含む脳腫瘍マーカー遺伝子又はＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを含む脳腫瘍のタンパク質マーカーの発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、前記脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーの発現量を低下させる物質を探索することによって、悪性脳腫瘍を抑制する候補物質を提供するものである。

本発明のスクリーニングに用いられる細胞としては、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含む脳腫瘍マーカー遺伝子又はＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを含む脳腫瘍のタンパク質マーカーを発現する培養細胞全般を挙げることができる。培養細胞においてこれら脳腫瘍マーカーが発現しているか否かは、公知のウェスタンブロット法などにて検出することにより、容易に確認することができる。培養細胞としては、具体的には、例えば癌患者より単離、調製した生体組織や血球由来の細胞、または本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれかを導入した細胞等を挙げることができる。

また、本発明のスクリーニング方法に際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーを発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。

以下に本発明の実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。なお、以下の実施例１〜５において使用される細胞培養、実験方法等は次の通りである。

（細胞培養）
神経膠腫細胞株（Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ、ＯＮ１２、ＮＰ３、ＧＩ−１）を、１０％非動化ウシ胎児血清を添加したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）（Nissui Pharmacoceutical Inc.，Tokyo, Japan）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した。

（対象症例）
新潟大学脳研究所脳神経外科にて手術摘出された神経膠腫４７例（ＷＨＯ グレードII：９例、III：１１例、ＩＶ：２７例、平均年齢４４歳）を対象とした（表１）。高悪性度のものは術後、放射線治療（腫瘍局所４０Ｇｙ、全脳照射２０Ｇｙ）並びにニトロソウレアを中心とした化学療法を施行した。生存期間は診断確定日より患者の死亡日もしくは最終受診日とした。組織診断はＷＨＯ脳腫瘍組織分類（Kleihues P, Louis DN, Scheithauer BW, Rorke LB, Reifenberger G, Burger PC, Cavenee WK: The WHO classification of tumors of the nervous system. J Neuropathol Exp Neurol 61:215-225, 2002）に基づいて行った。なお、本明細書に記載の実験は、新潟大学倫理委員会の規則に則り、全ての対象者からインフォームドコンセントを得ている。

（タンパク質抽出）
細胞ペレットからのタンパク質抽出は、細胞ペレットを氷上にてＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％ Ｎｏｎｉｄｎｅｔ ｐ−４０、０．２５％ ｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＮａＶＯ_３、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ_２ＭｏＯ_４、１０ｎＭ オカダ酸、１μｇ／ｍｌ ベンズアミド、１μｇ／ｍｌ アプロチニン、（全てSigma， Tokyo, Japan））中にホモジナイズし、１５分間室温に静置した後、４℃、１５０００回転、３０分間遠心し、上澄を採取して、−８０℃に保存したものを使用した。

（ウェスタンブロット解析）
神経膠腫細胞株（Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ、ＯＮ１２、ＧI−１）については、前述の通り抽出したタンパク質溶液に２−メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液を添加し、５〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動を行い、ニトロセルロースメンブレン（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）に転写した。転写された膜を、５％スキムミルクを加えたトリス緩衝食塩水でブロッキングした後、一次抗体として抗Ｃ／ＥＢＰβ抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を反応させた。二次抗体に西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、検出は高感度ケミルミネッセンス 法(enhanced chemiluminescence, ＥＣＬ法)によって行った。

（免疫組織化学染色）
試料のうち、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織が使用可能であった２５例（ＷＨＯグレードII：６例、III：６例、ＩＶ：１３例）について検討を行った。５ミクロン切片を作成し、脱パラフィン化の後に１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中にて１２１℃、１０分間加温した。０．３％Ｈ_２Ｏ_２にて内因性ペルオキシダーゼ活性の阻害を行った。１０％ヤギ血清にてブロッキング後、抗Ｃ／ＥＢＰβウサギポリクローナル抗体（１：５０；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）と４℃で４時間反応させた。洗浄後、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼシステム（Vectasin elite ABC kit, Vector Labs, Burlingame, CA）を反応させ、０．０１％３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Sigma）とＰＢＳ０．０１％過酸化水素にて発色させた。

（ＲＮＡ分離と定量ＰＣＲ）
試料４７例全例でＣ／ＥＢＰβｍＲＮＡの発現を検討した。ＲＮＡは凍結組織よりＩｓｏｇｅｎ（Nippongene, Toyama, Japan）を用いて抽出した。第１鎖ｃＤＮＡは試料から得られたｍＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）プライマー、逆転写酵素（Super Script II RNase H, Life Technologies, Grand Island, NY）を用いて作成した。定量ＰＣＲはライトサイクラー（Idaho Technology, Salt Lake City, UT）によるリアルタイムＰＣＲで行った。ＰＣＲ試薬の組成は１×ライトサイクラーＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩ（Rosche Moleculer Biochemicals, Mannheim, Germany）、各プライマー０．５μＭ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２μｌ ｃＤＮＡテンプレートにて行った。ＰＣＲは９５℃１０分間で変性後、９５℃１５分、５５℃５分、７２℃１０分の各サイクルを４０サイクル行った。１９５ｂｐの反応産物はＰＣＲの融解サイクルを経て各サイクルで蛍光強度を測定した。標準化曲線はヒト肝細胞ｃＤＮＡ（Clonetech, Mountain View, CA）から得られたＣ／ＥＢＰβ ｃＤＮＡの一連の段階的３倍希釈溶液により作成した。ＰＣＲ増幅のためのプライマーの塩基配列は以下の通りである。Ｃ／ＥＢＰβセンス鎖：5’-ACAGCGACGAGTACAAGATCC-3’; Ｃ／ＥＢＰβアンチセンス鎖： 5’-GCAGCTGCTTGAACAAGTTCC -3’。

（ＲＮＡサイレンシングによる細胞増殖アッセイ）
ヒトＣ／ＥＢＰβに対する特異的なｓｉＲＮＡはSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz,CA）より購入した。非サイレンシングコントロールを含めたこれらトランスフェクションにはＲＮＡｉ ヒト／マウスコントロールキット （Qiagen, Tokyo)を用い、プロトコールに従って実験を行った。細胞株を９６ウェルプレート（１００μｌ／ｗｅｌｌ）に培養し８０％コンフレントに達した時点で培地を交換（７５μｌ／ｗｅｌｌ）し、ＳｉＲＮＡ１００ｎＭ／２５μｌを混和、トランスフェクションさせた。４８時間の培養後、テトラカラーワン（Seikagaku CO.,Tokyo）を用いて発色し、ＭＴＴアッセイにより生存度を評価した。これらの値は非サイレンシングｓｉＲＮＡによるネガティブコントロールと比較検討した。全て増殖試験は３回以上行い、結果は平均±標準偏差で示した。

（マトリゲルによる細胞浸潤アッセイ）
細胞浸潤アッセイにはマトリゲル（Matrigel）（Becton-Dickinson, Tokyo）を購入し、プロトコールに従って実験を行った。神経膠腫細胞株（Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ）は前述のごとくコントロールを含めてｓｉＲＮＡトランスフェクションを行い24時間後、細胞解離溶液 (Sigma)に浮遊させ、洗浄後使用した。ＭＥＭ１０％ＦＢＳを満たしたウェル（２４ウェルプレート）にマトリゲルチャンバー（底面がマトリゲルで被膜された８μｍ多孔膜よりなる）を静置して充分水和させた後、チャンバーに細胞を播き、２４時間培養した。マトリゲルチャンバー内の細胞を払拭除去し、浸潤して多孔膜裏面に浸潤付着した細胞をギムザ染色液にて染色し、光顕２００倍で１０視野の細胞数を評価した。結果はコントロールとの比率で表し、平均±標準偏差で示した。

（ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−８の定量）
神経膠腫細胞株（Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ）前述の如く培養細胞にｓｉＲＮＡトランスフェクションを行い、４８時間培養後の培養上澄を採取して−８０℃保存したものを使用した。ＩＬ−８の測定にはQuantikine（登録商標）ヒトＩＬ−８イムノアッセイ（Ｒ＆Ｄ systems, Inc. Minneapolis、MN)を使用した。

（統計学的解析）
神経膠腫の各グループ間におけるＣ／ＥＢＰβの発現はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定にて評価し、ｐ<０．０５を統計学的に有意と判定した。生存曲線はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法にて表現し、２群間の検定にはＬｏｇ−ｒａｎｋ検定で評価した。

（神経膠腫組織におけるＣ／ＥＢＰβ発現の免疫組織化学的検討）
神経膠腫組織におけるＣ／ＥＢＰβの局在を調べる為に免疫組織染色を行った。図１に示すように、グレードIIの星状細胞腫（astrocytoma）（Ａ）及び神経膠芽腫（glioblastoma）（Ｂ）のいずれにおいても Ｃ／ＥＢＰβタンパク質は全ての細胞核で症例によって様々な程度に染色された。なお、図１の拡大率は２００倍である。次いで、染色陽性核の比率では表現することが困難であったため、染色強度に基づいてスコア化（０：none（無）, １：weak（弱）, ２：moderate（中）, ３：strong（強）)して組織学的悪性度との相関を検討した。その結果、組織学的悪性度の高いものほど濃染される傾向が認められた(表２)。また染色強度に基づいて対象を２群(weak：０又は１, strong：２又は３)に分けて生存曲線を比較したところ、染色強度の高いものほど生存期間が短く、２群間に有意差を認めた(図２)。

（培養細胞株におけるＣ／ＥＢＰβタンパク質の発現）
神経膠腫細胞株(Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ、ＯＮ１２、ＮＰ３、ＧＩ−１)におけるＣ／ＥＢＰβタンパク質の発現をウェスタンブロットにて検討を行ったがＵ２５１、ＯＮ１２、ＧＩ−１においてＣ／ＥＢＰβの全長型であるＬＡＰ（転写活性化因子）(３６−４５ｋＤ) の発現がみられ、特にＵ２５１， ＯＮ１２， ＧＩ−１において強い発現が認められた (図３)。

（神経膠腫におけるＣ／ＥＢＰβ遺伝子発現と予後の相関）
神経膠腫組織中のＣ／ＥＢＰβｍＲＮＡの発現を対象４７例全例で定量リアルタイムＰＣＲにて測定した。ＲＴ−ＰＣＲによるＣ／ＥＢＰβｍＲＮＡ発現と組織学的悪性度の相関を図４に示す。神経膠芽腫（glioblastoma）群(Ｎ＝２７)は(グレードII 星状細胞腫（astrocytoma） + 悪性星状細胞腫（anaplastic astrocytoma)）群（Ｎ＝２０例）に比し、Ｃ／ＥＢＰβ ｍＲＮＡ発現が高い傾向が認められた。(ｐ＝０．０２７，Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定)。発現は組織学的悪性度と相関し、特に星状細胞腫と神経膠芽腫において有意な差が認められた。

また、Ｃ／ＥＢＰβ ｍＲＮＡ発現量と生命予後の相関を図５に示す。Ｃ／ＥＢＰβｍＲＮＡの発現によって症例を２群[高発現群１９例(＞１．５ｎｇ／ｍｌ), 低発現群２８例(＜１．５ｎｇ／ｍｌ)]に分けて生存曲線で比較した所、高発現群において生存期間が短い傾向が認められた(ｐ＝０．０４３， Logrank検定)。

（Ｃ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡによる神経膠腫細胞株(Ｕ２５１)の増殖能と浸潤能の抑制）
Ｃ／ＥＢＰβの過剰発現はこれまでの検討から神経膠腫の生物学的悪性度を反映していたと考えられる。そこで内因性のＣ／ＥＢＰβを抑制することにより神経膠腫細胞株の増殖能や浸潤能を抑制することができるかどうか確かめるため、Ｃ／ＥＢＰβに特異的なｓｉＲＮＡを導入し、ｍＲＮＡを下方制御することでＣ／ＥＢＰβタンパク質の発現を押さえて細胞増殖能と浸潤能について検討した。ウェスタンブロットによる検討ではｓｉＲＮＡの導入によりβ−アクチンの発現レベルは不変であったが、抗Ｃ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡによってＵ２５１神経膠腫細胞株におけるＣ／ＥＢＰβタンパク質の発現抑制が認められた(図６)。

また、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子サイレンシング下における細胞増殖試験の結果を図７に示す。非サイレンシングｓｉＲＮＡ(ネガティブコントロール)群と比べてＣ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた群で２０％程度の細胞増殖抑制効果が見られたが、有意差は得られなかった(ｐ＝０．０８０，Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定)。

また、Ｕ２５１とＴ９８Ｇにおいて抗−Ｃ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡを導入し、マトリゲルマトリックスに対する細胞浸潤能を検討した。Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子サイレンシング下におけるマトリゲルマトリックスに対する細胞浸潤能試験の結果を図８に示す。非サイレンシングｓｉＲＮＡ(ネガティブコントロール)群と比べて、Ｃ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた群で明らかな細胞浸潤能の低下が認められた(ｐ＝０．００２３, Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定)。また、コントロールｓｉＲＮＡでは全く影響がなかったが、Ｃ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡ導入では著しい浸潤抑制効果が認められた。

（神経膠腫細胞株（Ｕ２５１）のＩＬ−８産生とｓｉＲＮＡによるＩＬ−８産生抑制）
これまで本発明者らの一人である山中は、神経膠腫細胞のサイトカイン産生は炎症反応や血管増生など悪性神経膠腫の臨床像に関与し、また、悪性神経膠腫においてはＩＬ−６やＩＬ−８，ＴＧＦ−β等の炎症性サイトカインが産生されることを報告している（Yamanaka R et al. : Cytokine gene expression on glioma cell lines and specimens. J Neurooncol 21:243-247, 1994）。特にＩＬ−６とＩＬ−８は転写因子であるＣ／ＥＢＰβによって誘導され、Ｃ／ＥＢＰβもこれらのサイトカインで発現誘導されうることが知られている（Akira S, Kishimoto T : NF-IL6 and NF-kappa B in cytokine gene regulation. Adv Immunol 65:1-46, 1997）。それゆえＣ／ＥＢＰβはＩＬ−６，ＩＬ−８の自己増幅性に介在していると考えられる。また、ＩＬ−８は神経膠腫細胞より産生される血管形成性サイトカインであり、悪性神経膠腫における病期の進行に寄与する血管増生の原因の一つとして考えられている（Yamanaka R, Tanaka R, Saitoh T, Okoshi S : Cytokine gene expression on glioma cell lines and specimens. J Neurooncol 21:243-247,1994）。さらに、ＩＬ−６とＩＬ−８はＭＭＰｓ（matrix metalloproteinase：マトリックス分解酵素）の誘導を介して腫瘍細胞の浸潤性にも寄与している可能性が指摘され、ＭＭＰｓによる細胞外マトリックス中コラーゲンの分解は腫瘍細胞の浸潤において非常に重要な役割を果たしていることが報告されている（De Clerck YA, Shimada H, Taylor SM, Langley KE: Matrix metalloproteinases and their inhibitors in tumor progression. Ann N Y Acad Sci 732:222-232, 1994）。ＭＭＰ遺伝子ファミリのサブグループに属するコラゲナーゼ−１は殆どのヒト組織におけるコラーゲン代謝において重要な役割を果たしていること、また、Ｃ／ＥＢＰβはＭＭＰｓ発現を制御し、コラゲナーゼ−１を誘導することが知られている。それゆえＣ／ＥＢＰβは悪性腫瘍細胞の浸潤能に関与している可能性があり、上述した実施例において、Ｃ／ＥＢＰβの発現と腫瘍細胞の増殖能、及び浸潤能との関連が示され、神経膠腫の悪性化への関与が示唆された。そこで、神経膠腫細胞株（Ｕ２５１）のＩＬ−８産生とｓｉＲＮＡによるＩＬ−８産生を調べた。

結果を図９に示す。神経膠腫細胞株に対してＩＬ−１β刺激（１００Ｕ／ｍｌ）を行った後、２４〜４８時間インキュベートした培養上清中にはＥＬＩＳＡ法により経時的にＩＬ−８の産生が認められた。Ｃ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡの導入によりサイレンシングを行ったものはコントロールに比しＩＬ−８の減少がみられ（ｐ＝０．００７３, Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定）、ＩＬ−８の発現が抑制されていた。

ところで、悪性腫瘍におけるＣ／ＥＢＰβ遺伝子の変異は殆ど認められなかったとの報告（Vegesna V, Takeuchi S, Hofmann WK, Ikezoe T, Tavor S, Krug U, Fermin AC, Heaney A, Miller CW, Koeffler HP: C/EBP-beta, C/EBP-delta, PU.1, AML1 genes: mutational analysis in 381 samples of hematopoietic and solid malignancies. Leuk Res 26:451-457,2002）がなされているが、それに対して急性骨髄性白血病の７％においてＣ／ＥＢＰαの変異体が認められ、ドミナントネガティブな切断型（truncated dominant negative form）やＤＮＡ結合能の低下したアイソフォームがみられたとの報告がある（Pabst T, Mueller BU, Zhang P, Radomska HS, Narravula S, Schnittger S, Behre G, Hiddemann W, Tenen DG : Dominant-negative mutations of CEBPA, encoding CCAAT/enhancer binding protein-alpha (C/EBPalpha), in acute myeloid leukemia. Nat Genet 27:263-270,2001）。従って、Ｃ／ＥＢＰαとは異なり、Ｃ／ＥＢＰβは変異によってではなく、タンパク質やｍＲＮＡの発現亢進によって腫瘍発生に寄与している可能性があると考えられる。上述した実施例により、神経膠腫の増殖と浸潤においてＣ／ＥＢＰβが潜在的に関与している可能性が示された。従って、Ｃ／ＥＢＰβは新しい分子標的として、又は予後を予測するマーカー等としての有用性が示唆された。

Ｃ／ＥＢＰβの免疫組織化学染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ａ：グレードＩＩの星状細胞腫、Ｂ：神経膠芽腫である。 免疫組織化学染色によるＣ／ＥＢＰβタンパク質の発現強度と生存期間の相関を示すグラフである。 神経膠腫細胞株における抗Ｃ／ＥＢＰβ抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す図である。 ＲＴ−ＰＣＲによるＣ／ＥＢＰβ ｍＲＮＡ発現と組織学的悪性度の相関を示す図である。 Ｃ／ＥＢＰβ ｍＲＮＡ発現量と生命予後の相関を示す図である。 Ｕ２５１神経膠腫細胞株における抗Ｃ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡを用いたウェスタンブロットの結果を示す図である。 Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子サイレンシング下における細胞増殖試験の結果を示す図である。 Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子サイレンシング下におけるマトリゲルマトリックスに対する細胞浸潤能試験の結果を示す図である。 Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子サイレンシングによるＵ２５１細胞株培養液中のＩＬ−８の結果を示す図である。

Claims (14)

1. 脳腫瘍の悪性度を判定するために使用する脳腫瘍マーカー遺伝子であって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含み、前記遺伝子の発現量が高いほど、前記脳腫瘍の悪性度が高いと判定することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子。
2. 脳腫瘍患者の予後を予測するために使用する脳腫瘍マーカー遺伝子であって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含み、前記遺伝子の発現量に基づいて脳腫瘍患者の予後を予測することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子。
3. 前記ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子の発現量が、そのｍＲＮＡ又はタンパク質の少なくとも一方の量により測定されることを特徴とする請求項１又は２に記載の脳腫瘍マーカー遺伝子。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の脳腫瘍マーカー遺伝子を定量するためのｍＲＮＡマーカーであって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βのｍＲＮＡを含むことを特徴とするｍＲＮＡマーカー。
5. 請求項１〜３のいずれかに記載の脳腫瘍マーカー遺伝子を定量するためのタンパク質マーカーであって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを含むことを特徴とするタンパク質マーカー。
6. 請求項４記載のｍＲＮＡマーカーを定量するために使用されるオリゴヌクレオチドであって、前記ｍＲＮＡの塩基配列またはその相補塩基配列の一部からなり、前記ｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部分特異的塩基対を形成することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
7. 請求項４記載のｍＲＮＡマーカーを定量するために使用されるプライマーであって、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成することを特徴とするプライマー。
8. 請求項４記載のｍＲＮＡマーカーを定量するために使用されるプローブであって、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成することを特徴とするプローブ。
9. 請求項５記載のタンパク質マーカーを定量するための抗体であって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを認識することを特徴とする抗体。
10. 請求項４記載のｍＲＮＡマーカーを定量するために使用するキットであって、少なくとも、前記ｍＲＮＡのｃＤＮＡを定量可能なように増幅するために請求項７記載のプライマーと、検出のため前記増幅産物に対合させる請求項８記載のプローブとを含むことを特徴とするキット。
11. 請求項５記載のタンパク質マーカーを定量するために使用するキットであって、少なくとも、請求項９記載の抗体及び／又はその標識化抗体を含むことを特徴とするキット。
12. 下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法：
    （ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含む脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、
    （ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
13. 下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法：
    （ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質における、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを含む脳腫瘍のタンパク質マーカーの発現量を測定する工程、
    （ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
14. 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とするＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β遺伝子を含む脳腫瘍マーカー遺伝子又はＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質βを含む脳腫瘍のタンパク質マーカーの発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
    （ａ）被験物質と、前記脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーを発現している細胞とを接触させる工程、
    （ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーの発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーの発現量と比較する工程、
    （ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子又はタンパク質マーカーの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。