JP2006235420A

JP2006235420A - 共焦点顕微鏡

Info

Publication number: JP2006235420A
Application number: JP2005052320A
Authority: JP
Inventors: Kenta Mikuriya; 健太御厨; Takashi Yoshida; 隆司吉田; Koshi Kei; 虹之景
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2006-09-07
Also published as: US20060209399A1; US7400446B2

Abstract

【課題】照射スポット数やピンホールサイズをプログラマブルにし、マルチビームスキャン方式において非常にフレキシビリティの高い共焦点顕微鏡を提供する。
【解決手段】試料に複数のビームスポットを照射して蛍光または反射光により前記試料を観察する共焦点顕微鏡において、
レーザ光の位相を変調して前記複数のビームスポットを形成する位相変調素子と、
前記蛍光または反射光のみを透過させる複数のピンホールを形成する液晶素子と、
前記位相変調素子および前記液晶素子を制御する制御手段と、
を備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【選択図】図１

Description

本発明は、共焦点顕微鏡に関し、詳しくは、照射スポット数やピンホールサイズなどをプログラマブルに変更できる共焦点顕微鏡に関するものである。

共焦点顕微鏡は、試料上の収束光点を走査し、試料からの蛍光または反射光などの戻り光を結像させて画像を得ることにより試料を観察するもので、生物やバイオテクノロジーなどの分野における生きた細胞の生理反応観察や形態観察あるいは半導体市場におけるＬＳＩの表面観察などに使用されている。

図２は、従来の共焦点顕微鏡の一例を示した構成図である。
図２において、共焦点スキャナ１１０は、顕微鏡１２０のポート１２２に接続してあり、レーザ光１１１は、マイクロレンズアレイディスク１１２のマイクロレンズ１１７により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１１３を透過後、ピンホールアレイディスク（以下、ニポウディスクという。）１１４の個々のピンホール１１６を通過し、顕微鏡１２０の対物レンズ１２１により、ステージ１２３上の試料１４０に集光される。

試料１４０から出た蛍光信号は、再び対物レンズ１２１を通り、ニポウディスク１１４の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した蛍光信号は、ダイクロイックミラー１１３で反射され、リレーレンズ１１５を介してイメージセンサ１３１に結像されるように共焦点スキャナ１１０より出射される。このような装置では、図示しないモータでニポウディスク１１４を一定速度で回転させており、この回転よるピンホール１１６の移動により試料１４０への集光点を走査している。

ニポウディスク１１４のピンポールが並んでいる平面と、試料１４０の被観察平面と、イメージセンサ１３１の受光面とは互いに光学的に共役関係に配置してあるので、イメージセンサ１３１上には試料１４０の光学的断面像、即ち共焦点画像が結像される（例えば、特許文献１参照。）。

特開平５−６０９８０号公報

このような、共焦点顕微鏡では、ピンホールは視野内で約１０００個あり、１０００本のビームが同時に照射されることになる。
ただし、このままでは多数の点の情報しか得られないため、面情報としの画像を取り込むためには、レーザビームをスキャンすることが必要である。このため、マイクロレンズつき付きニポウディスクを回転させて複数のビームをラスタスキャンすることによって２次元の画像を最速１ｍｓｅｃで形成している。

しかしながら、上述した従来の共焦点顕微鏡においては、ニポウディスクの個々のピンホールによるマルチビームスキャン方式を用いているが、このニポウディスクはピンホールサイズが固定であった。
また、照射光はレーザの拡散光をコリメートしたガウシアン分布であり、原理的に照射光の中央部と周辺部とでは光の強度が均一ではなくシェーディングが生じていた。
さらに、ニポウディスクの面積により試料に照射されるビームの数が制限されるために
視野が狭くなってしまうといった問題があった。

本発明は、このような従来の共焦点顕微鏡が有していた問題を解決しようとするものであり、照射スポット数やピンホールサイズをプログラマブルにし、マルチビームスキャン方式において非常にフレキシビリティの高い共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明は次の通りの構成になった共焦点顕微鏡である。

（１）試料に複数のビームスポットを照射して蛍光または反射光により前記試料を観察する共焦点顕微鏡において、
レーザ光の位相を変調して前記複数のビームスポットを形成する位相変調素子と、
前記蛍光または反射光のみを透過させる複数のピンホールを形成する液晶素子と、
前記位相変調素子および前記液晶素子を制御する制御手段と、
を備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡。

（２）前記位相変調素子は、前記複数のビームスポットの径および位置の少なくともいずれか一方を変化させることを特徴とする（１）に記載の共焦点顕微鏡。

（３）前記液晶素子は、前記複数のピンホールの径および位置の少なくともいずれか一方を変化させることを特徴とする（１）または（２）に記載の共焦点顕微鏡。

（４）前記制御手段は、前記複数のビームスポットの変位および前記複数のピンホールの変位を同期させることを特徴とする（３）に記載の共焦点顕微鏡。

本発明によれば、以下のような効果がある。

請求項１に記載の発明によれば、位相変調素子によりビームスポットパターンを成形するので、レンズ同様の集光効率が実現できると共にスポットサイズと照射位置をプログラマブルに変えることができる。また、透過型ＬＣＤによりピンホールの大きさと位置をプログラマブルに変えることができる。
さらに、励起光である各ビームスポットの強度もプログラマブルに変えることができるのでシェーディングの補正が簡単に実現できる。
加えて、照射範囲を広げることができるので、広い視野が実現できる。

請求項２、請求項３および請求項４に記載の発明によれば、位相変調素子による照射ビームスポットと透過型ＬＤＣによるピンホールの位置合わせがソフトウェアで対応でき、駆動系なしにマルチビームスキャンが実現できる

以下図面を用いて本発明を詳細に説明する。図１は本発明に係る共焦点顕微鏡の一実施例を示した構成図である。

図１において、レーザ光源１は、試料１０に照射される励起光となるレーザ光を出力する。凹レンズ２およびコリメータレンズ３は、レーザ光源１からのレーザ光を平行光にする。位相変調素子４は、平行光となったレーザ光を位相変調してマルチビームスキャン面５（レーザ光集光面）に複数のスポット光として集光させてマルチビームスポットパターンを形成する。詳細には、位相変調素子４は、例えば液晶から成り、電圧制御により各セルが入射光の位相を変調し、レンズ同様の集光効果を奏すると共に任意のパターンの光学像を結像させる。本実施例では、レーザ光集光面でのマルチビームスポットパターンが制御用ＰＣ（パーソナルコンピュータ）１６によってフーリエ変換され、位相変調素子４にはそのフーリエ変換されたパターンが形成されることにより、この位相変調素子を通ったレーザ光が、レーザ集光面でマルチビームスポットパターンとなる。

このマルチビームスポットパターンは、結像レンズ６、ＥＸフィルタ７（励起光の波長以外の光を遮断するフィルタ）を介してダイクロイックミラー８に伝達され、ダイクロイックミラー８の反射により顕微鏡に入射されて対物レンズ９に到達し、対物レンズ９は、スポットパターンを試料に結像させる。

試料１０からの戻り光（蛍光のスポット像）は、対物レンズ９を通ってダイクロイックミラー８を透過し励起光と分離される。さらに、ＢＡフィルタ１１は、ダイクロイックミラー８を透過した蛍光から蛍光波長以外の光を遮断する。結像レンズ１２は、透過型ＬＣＤ（liquid crystal display）１３で形成されたピンホール（マルチピンホール面）にＢＡフィルタ１１を透過した蛍光のスポット像を結像する。リレーレンズ１４は、マルチピンホール面の蛍光スポット像をＣＣＤ（charge-coupled device）カメラ１５の撮像面に結像する。

観察側のピンホールは透過型ＬＣＤ１３の各セルによる光のオン／オフ制御によってプログラマブルに変化させられ、マルチピンホールパターンを形成する。このマルチピンホールパターンは前出のマルチビームスポットバターンと同様のパターンであって、制御用ＰＣ１６によってデータ化され透過型ＬＣＤ１３に送られる。マルチビームのスキャンは位相変調素子４のパターンを変化させることによって行われ、そのパターンに同期して透過型ＬＣＤ１３のピンホールパターンも変化し、２次元画像を形成する。２次元画像はＣＣＤカメラ１５によって数値データ化される。
なお、凹レンズ２からダイクロイックミラー８、ＢＡフィルタ１１からリレーレンズ１４までが共焦点スキャナを構成し、光学顕微鏡に取り付けられる。

ここで、本発明の測定工程の一例を以下に示す。なお、以下の制御は制御用ＰＣ１６により行われる。
（１）予め制御用ＰＣにマルチピンホールパターンを設定する。
（２）マルチピンホールパターンをフーリエ変換する。
（３）マルチピンホールパターンの変位量を設定する。
（４）マルチピンホールパターンを（３）の変位量だけずらしたパターンを作成する。
（５）（４）のパターンをフーリエ変換する。
（６）マルチピンホールパターンとそのフーリエ変換データを保存する。
（７）測定を開始する。
（８）マルチピンホールパターンのフーリエ変換データを位相変調素子へ送る。
（９）マルチピンホールパターンのデータを透過型ＬＣＤへ送る。
（１０）カメラ露光開始。
（１１）マルチピンホールパターンのフーリエ変換データとマルチピンホールパターンのデータを同期させながら切替える。
（１２）カメラ露光終了。

以上により、位相変調素子によりスポットパターンを成形するので、レンズ同様の集光効率が実現できると共にスポットサイズと照射位置をプログラマブルに変えることができる。また、透過型ＬＣＤによりピンホールの大きさと位置をプログラマブルに変えることができる。さらに、励起光である各ビームの強度もプログラマブルに変えることができるのでシェーディングの補正が簡単に実現できる。加えて、照射範囲を広げることができるので、広い視野が実現できる。また、照射スポットとピンホールの位置合わせがソフトウェアで対応できる。
したがって、マルチビームスキャン方式において非常にフレキシビリティの高い共焦点顕微鏡を提供することができる。

なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。

本発明に係る共焦点顕微鏡の一実施例を示す構成図である。従来の共焦点顕微鏡の一例を示した構成図である。

符号の説明

１レーザ光源
２凹レンズ
３コリメータレンズ
４位相変調素子
５マルチビームスキャン面
６結像レンズ
７ＥＸフィルタ
８ダイクロイックミラー
９対物レンズ
１０試料
１１ＢＡフィルタ
１２結像レンズ
１３透過型ＬＣＤ
１４リレーレンズ
１５ＣＣＤカメラ
１６制御用ＰＣ

Claims

試料に複数のビームスポットを照射して蛍光または反射光により前記試料を観察する共焦点顕微鏡において、
レーザ光の位相を変調して前記複数のビームスポットを形成する位相変調素子と、
前記蛍光または反射光のみを透過させる複数のピンホールを形成する液晶素子と、
前記位相変調素子および前記液晶素子を制御する制御手段と、
を備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡。
前記位相変調素子は、前記複数のビームスポットの径および位置の少なくともいずれか一方を変化させることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
前記液晶素子は、前記複数のピンホールの径および位置の少なくともいずれか一方を変化させることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
前記制御手段は、前記複数のビームスポットの変位および前記複数のピンホールの変位を同期させることを特徴とする請求項３に記載の共焦点顕微鏡。