JP2006271266A - 高発現および効率的遺伝子導入鳥類 - Google Patents
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Abstract
【課題】 目的タンパク質のトランスジェニック鳥類における発現のさらなる効率化を提供することを課題とする。
【解決手段】 本発明は、目的タンパク質をコードする遺伝子および、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を組み込んだレトロウイルスベクターを用いて樹立したパッケージング細胞に自己複製能欠失型レトロウイルスを生産させ、孵卵開始後２４時間以降１２０時間の鳥受精卵の初期胚に感染させ、その胚を孵化および成長させて得られるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類またはその子孫を提供する。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明は、目的タンパク質をコードする遺伝子および、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を組み込んだレトロウイルスベクターを用いて樹立したパッケージング細胞に自己複製能欠失型レトロウイルスを生産させ、孵卵開始後２４時間以降１２０時間の鳥受精卵の初期胚に感染させ、その胚を孵化および成長させて得られるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類またはその子孫を提供する。
【選択図】 なし
Description
本発明はウッドチャック・肝炎ウイルスの転写後制御因子（ＷＰＲＥ）配列などのｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を有する自己複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いて鳥類受精卵の孵卵開始後２４時間以降の初期胚へ外来遺伝子を導入することを特徴としたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類およびその子孫並びにその作製法に関する。
近年、抗体や生理活性タンパク質に代表される高機能性タンパク質製剤が数多く上市され、医薬品、食品業界で注目されている。しかし生理活性の高いタンパク質医薬品類は、例えば糖鎖修飾のように様々な翻訳後修飾が必要とされるため、生産コストの高い発現システムを用いて製造されているのが現状である。例として、リウマチ治療に用いられる抗ＴＮＦα抗体は臨床試験の結果より一回の投与で体重１ｋｇあたり３ｍｇもの量が必要となり、この量を投与するのに必要な数十万円もの費用が患者の負担となっている。また、別の例として、成長ホルモン分泌不全症の治療薬として用いられるヒト成長ホルモンの投与には、一週間あたりで数万円の費用が必要となっている。
このような現状の中、既存のタンパク質製剤生産方法の代わりとして期待されているのが、トランスジェニック動物にタンパク質を作らせるといういわゆる動物工場である。しかしウシなどの大型哺乳類では性成熟するのに時間がかかり、また大きな飼育スペースを要し、生産コストが大きくなる。また抗体を産生させる場合、ウシなどが本来持っている抗体と目的の抗体を分離することが困難であるという問題がある。
そこで我々の研究室では鳥類に着目した。ニワトリに代表される家禽鳥類は、食肉用、採卵用家畜としての飼育実績が長い。さらに性成熟までの時間が短く、小さなスペースで飼育可能なこと、また、卵に目的タンパク質を蓄積すればニワトリを殺す必要もなく安価なコストでタンパク質を生産できると考えられる。また、ニワトリで抗体を生産する場合、ニワトリ自身の抗体と目的の抗体とを分離することは比較的容易に行うことができるなどから鳥類でのタンパク質製剤生産は有効な手段として期待されている。
ＷＯ２００４／０１６０８１および特開２００２−１７６８８０号は、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類における、目的タンパク質の発現を開示する。しかし、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子の使用を開示も示唆もしない。
Schambach et al, Molecular Therapy Vol. 2, No5., 435-445, 2000は、転写後エンハンサーモジュールの正確な選択が、発現されるべきｃＤＮＡの型に依存することを記載する。しかし、Schambach et alは、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を鳥類に適用して目的タンパク質の生産することを開示も示唆もしない。
Kwon et al, Biochemical and Biophysical Research Communication 320(2004)442-448は、ＷＲＰＥ配列が導入されたトランスジェニックニワトリが、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現することを開示する。しかし、Kwon et alは、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を含む自己複製能欠失型レトルウイルスベクターを、孵卵開始後２４時間以降に鳥類受精卵に導入することを開示も示唆もしない。
Zufferey et al, Journal of Virology, 1999, 2886-2892は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子が、レトロウイルスベクターによって送達された導入遺伝子の発現を増強することを開示する。しかし、Zufferey et alは、ＷＰＲＥ配列を有するレトロウイルスベクターを鳥類に適用して目的タンパク質の生産することを開示も示唆もしない。
ＷＯ９９／１９４７２は、トランスジェニック鳥によるエリスロポエチンの生産を開示する。しかし、孵卵開始後２４時間以降にレトロウイルスベクターを感染させることは開示も示唆もされない。
ＷＯ９９／１９４７２は、トランスジェニック鳥によるエリスロポエチンの生産を開示する。しかし、孵卵開始後２４時間以降にレトロウイルスベクターを感染させることは開示も示唆もされない。
すでに、目的タンパク質を、トランスジェニック鳥類を用いて発現することはなされているが、いまだ発現効率が十分とはいえない。そこで、本願発明は、トランスジェニック鳥類における目的タンパク質の発現のさらなる発現の効率化を課題とする。
驚くべきことに、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を組み込んだ自己複製能欠失型レトロウイルスベクターによって、本発明の課題は達成される。よって、本発明が提供するのは以下の通りである：
ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子および目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターをパッケージング細胞に導入し、組換えレトロウイルスを生産させ、該生産された組換えレトロウイルスを孵卵開始後24時間から120時間（放卵後温めてからの時間が24〜120時間）までの鳥受精卵の初期胚へ導入し、そしてその胚を孵化および成長させる手法により得られるトランスジェニック鳥類およびその作製方法。
ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子および目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターをパッケージング細胞に導入し、組換えレトロウイルスを生産させ、該生産された組換えレトロウイルスを孵卵開始後24時間から120時間（放卵後温めてからの時間が24〜120時間）までの鳥受精卵の初期胚へ導入し、そしてその胚を孵化および成長させる手法により得られるトランスジェニック鳥類およびその作製方法。
本発明により、極めて高い効率で導入遺伝子を発現するトランスジェニック鳥類作製が可能である。また本発明により、感染性ウイルスを放出しない安全なトランスジェニック鳥類による有用タンパク質の効率的、安価な提供が可能となる。
１．定義:
本願明細書中においては、レトロウイルスベクターは、プロウイルス由来のDNA ベクターを意味し、レトロウイルスベクターコンストラクトと呼ばれることもあり、プラスミド中に組み入れられたものは、レトロウイルスベクタープラスミドと呼ばれることもある。本願明細書中で、組換えレトロウイルスは、前記レトロウイルスベクターが逆転写されたRNAがパッケージングされたウイルス粒子のことを意味し、単にウイルス又はウイルス粒子と呼ばれることもあり、他の出願又は刊行物中においては、本件明細書中における組換えレトロウイルスのことも、レトロウイルスベクターと呼ばれていることもある。
本願明細書中においては、レトロウイルスベクターは、プロウイルス由来のDNA ベクターを意味し、レトロウイルスベクターコンストラクトと呼ばれることもあり、プラスミド中に組み入れられたものは、レトロウイルスベクタープラスミドと呼ばれることもある。本願明細書中で、組換えレトロウイルスは、前記レトロウイルスベクターが逆転写されたRNAがパッケージングされたウイルス粒子のことを意味し、単にウイルス又はウイルス粒子と呼ばれることもあり、他の出願又は刊行物中においては、本件明細書中における組換えレトロウイルスのことも、レトロウイルスベクターと呼ばれていることもある。
２．Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥およびその子孫並びにその生産方法
まず、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥およびその子孫並びにその生産方法について説明する。本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類は、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子および、目的タンパク質をコードする遺伝子配列を組み込んだ、好適には自己複製能欠失型である、組換えレトロウイルスを利用することを特徴とする生産方法により生産される。
まず、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥およびその子孫並びにその生産方法について説明する。本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類は、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子および、目的タンパク質をコードする遺伝子配列を組み込んだ、好適には自己複製能欠失型である、組換えレトロウイルスを利用することを特徴とする生産方法により生産される。
２−１．組換えレトロウイルス（概要）
本発明で用いられる組換えレトロウイルスとしては、外来遺伝子を鳥類に導入できる限り、特に限定されない。本発明で用いられる組換えレトロウイルスとしては、安全性の観点から、自己複製能欠失型の組換えレトロウイルスが望ましい。本願発明で用いることができる組換えレトロウイルスとしては、特に限定されるものではないが、例えば、複製能があるものとしては、avian sarcoma leukosis viruses (ASLVs)、特にRous sarcoma virus (RSV)に由来するものがあげられ、自己複製能が欠失した組換えレトロウイルスとしては、遺伝子治療にも用いられている安全でかつ哺乳動物細胞に遺伝子導入した際に比較的安定した発現が期待できる観点からモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、またはレンチウイルスに由来するものが好ましい。
本発明で用いられる組換えレトロウイルスとしては、外来遺伝子を鳥類に導入できる限り、特に限定されない。本発明で用いられる組換えレトロウイルスとしては、安全性の観点から、自己複製能欠失型の組換えレトロウイルスが望ましい。本願発明で用いることができる組換えレトロウイルスとしては、特に限定されるものではないが、例えば、複製能があるものとしては、avian sarcoma leukosis viruses (ASLVs)、特にRous sarcoma virus (RSV)に由来するものがあげられ、自己複製能が欠失した組換えレトロウイルスとしては、遺伝子治療にも用いられている安全でかつ哺乳動物細胞に遺伝子導入した際に比較的安定した発現が期待できる観点からモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、またはレンチウイルスに由来するものが好ましい。
２−２．自己複製能が欠失した組換えレトロウイルスの調製
以下、自己複製能が欠失した組換えレトロウイルスを中心に説明するが、複製能がある組換えレトロウイルスについても、当業者に周知の変更をして同様に用いることができることは言うまでもない。
以下、自己複製能が欠失した組換えレトロウイルスを中心に説明するが、複製能がある組換えレトロウイルスについても、当業者に周知の変更をして同様に用いることができることは言うまでもない。
安全性を考慮し自己複製能を欠失させる方法としては、例えば遺伝子導入ベクターとして用いられるレトロウイルスベクターをプロウイルスから調製する際に、複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖのうちいずれか又は全てを除去することにより、自己複製能を欠失させる方法があり、自己複製能欠失レトロウイルスベクターと呼ぶ。
自己複製能欠失型レトロウイルスベクターは、目的タンパク質をコードする遺伝子配列、トランスジェニック鳥において該目的タンパク質の発現を駆動し得るプロモーター配列および、ｍＲＮＡを安定化し得る配列を含む。
自己複製能欠失型レトロウイルスベクターは、目的タンパク質をコードする遺伝子配列、トランスジェニック鳥において該目的タンパク質の発現を駆動し得るプロモーター配列および、ｍＲＮＡを安定化し得る配列を含む。
２−２−１．パッケージング細胞
組換えレトロウイルスを生産するパッケージング細胞としては、真核細胞である限り特に限定されない。導入されたレトロウイルスベクターの自己複製能を回復させる観点から、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子のうち一部または全部を導入された真核細胞が好ましい。パッケージング真核細胞にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の内一部のみが導入されている場合、残りの遺伝子を導入させることによって、レトロウイルスベクターの自己複製能を回復させ、すなわち組換えレトロウイルスを該パッケージング細胞に生産させる。該残りの遺伝子を導入する方法は、該遺伝子を該パッケージング細胞に導入できる限り特に限定されないが、該遺伝子をコードするプラスミドを、該パッケージング細胞に導入する方法が挙げられる。導入する方法としては特に限定されないが例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。好ましい実施態様では、ｇａｇおよびｐｏｌを構成的に発現するＧＰ２９３細胞に、ｅｎｖ遺伝子を含むプラスミドを導入させる。
組換えレトロウイルスを生産するパッケージング細胞としては、真核細胞である限り特に限定されない。導入されたレトロウイルスベクターの自己複製能を回復させる観点から、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子のうち一部または全部を導入された真核細胞が好ましい。パッケージング真核細胞にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の内一部のみが導入されている場合、残りの遺伝子を導入させることによって、レトロウイルスベクターの自己複製能を回復させ、すなわち組換えレトロウイルスを該パッケージング細胞に生産させる。該残りの遺伝子を導入する方法は、該遺伝子を該パッケージング細胞に導入できる限り特に限定されないが、該遺伝子をコードするプラスミドを、該パッケージング細胞に導入する方法が挙げられる。導入する方法としては特に限定されないが例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。好ましい実施態様では、ｇａｇおよびｐｏｌを構成的に発現するＧＰ２９３細胞に、ｅｎｖ遺伝子を含むプラスミドを導入させる。
２−２−２．ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ
鳥類の細胞にこの複製能欠失型組換えレトロウイルスを効率的に感染させるためには、外皮タンパク質（ｅｎｖ）を、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）とした、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプを用いることが、細胞表面の受容体に関わらず、広域宿主へウイルスの侵入が可能となる観点から望ましいがこれに限定されるものではない。上記のＶＳＶ−Ｇタンパク質を発現するＧＰ２９３細胞としては、ｇａｇ、ｐｏｌを構成的に発現するＧＰ２９３細胞に、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の発現ベクターをコードするプラスミドをトランスフェクトしてもよいがこの方法に限られたものではない。
鳥類の細胞にこの複製能欠失型組換えレトロウイルスを効率的に感染させるためには、外皮タンパク質（ｅｎｖ）を、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）とした、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプを用いることが、細胞表面の受容体に関わらず、広域宿主へウイルスの侵入が可能となる観点から望ましいがこれに限定されるものではない。上記のＶＳＶ−Ｇタンパク質を発現するＧＰ２９３細胞としては、ｇａｇ、ｐｏｌを構成的に発現するＧＰ２９３細胞に、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の発現ベクターをコードするプラスミドをトランスフェクトしてもよいがこの方法に限られたものではない。
２−２−３．外来遺伝子及びプロモーター
本発明において鳥類に導入される目的タンパク質をコードする遺伝子（外来遺伝子）は特に限定されないが、レトロウイルスに由来しない遺伝子であることが望ましい。レトロウイルスに由来しない遺伝子としては特に限定されず、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）などのマーカーとして用いられるタンパク質をコードする遺伝子又は、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、エリスロポエチン例えばｈＥＰＯ、抗体等の有用タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。
本発明において鳥類に導入される目的タンパク質をコードする遺伝子（外来遺伝子）は特に限定されないが、レトロウイルスに由来しない遺伝子であることが望ましい。レトロウイルスに由来しない遺伝子としては特に限定されず、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）などのマーカーとして用いられるタンパク質をコードする遺伝子又は、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、エリスロポエチン例えばｈＥＰＯ、抗体等の有用タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。
これらの遺伝子を発現させるプロモーターは鳥類で働くプロモーターであれば特に限定されない。好ましくは、プロモーターは、トランスジェニック鳥において目的タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結されている。一般的によく用いられる観点からは、サイト・メガロ・ウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター、ミューリン・フォスフォグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなども用いられる。効率的な目的タンパク質の発現の観点からβ−アクチンプロモーター、オボアルブミンプロモーターが好ましい。
２−２−４．ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子
ここにいうｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子は、レトロウイルスによって導入された外来遺伝子を細胞内でｍＲＮＡのポリアデニレーション化を促進またはｍＲＮＡの核外輸送の促進または翻訳活性化に寄与するＤＮＡ配列のことをいい、ｍＲＮＡを安定化しうる転写後調節因子として知られる既知配列としては、スプライシングシグナル（SS: splicing signal）、構成的RNA輸送因子（CTE: constitutive RNA transport element）、 B型肝炎などのヘパドナウイルスの転写後制御因子、ウッドチャック・肝炎ウイルス転写後制御因子（ＷＰＲＥ）などがある。このうち、配列の長さが扱いやすく、動物細胞での目的タンパク発現増強効果の高い観点からウッドチャック・肝炎ウイルス転写後制御因子（ＷＰＲＥ）配列が望ましいがこれに限定されるものではない。
ここにいうｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子は、レトロウイルスによって導入された外来遺伝子を細胞内でｍＲＮＡのポリアデニレーション化を促進またはｍＲＮＡの核外輸送の促進または翻訳活性化に寄与するＤＮＡ配列のことをいい、ｍＲＮＡを安定化しうる転写後調節因子として知られる既知配列としては、スプライシングシグナル（SS: splicing signal）、構成的RNA輸送因子（CTE: constitutive RNA transport element）、 B型肝炎などのヘパドナウイルスの転写後制御因子、ウッドチャック・肝炎ウイルス転写後制御因子（ＷＰＲＥ）などがある。このうち、配列の長さが扱いやすく、動物細胞での目的タンパク発現増強効果の高い観点からウッドチャック・肝炎ウイルス転写後制御因子（ＷＰＲＥ）配列が望ましいがこれに限定されるものではない。
２−２−５ レトロウイルスベクターの調製
上記の目的タンパク質をコードする遺伝子及びプロモーターは、プロウイルス由来のベクターコンストラクトの５‘末端（LTR）及び３’末端（LTR）の間に挿入される。
前記ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子であるＤＮＡ配列の位置は、パッケージング細胞において高ウイルスタイターが得られる限り特に限定されない。例えば、前記ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子としてWPREを用いる場合には、プロウイルス由来のベクターコンストラクトにおいて目的タンパク質をコードする遺伝子(以下目的遺伝子とも言う)のすぐ下流に挿入されるのが望ましいがこれに限定されるものではない。
上記の目的タンパク質をコードする遺伝子及びプロモーターは、プロウイルス由来のベクターコンストラクトの５‘末端（LTR）及び３’末端（LTR）の間に挿入される。
前記ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子であるＤＮＡ配列の位置は、パッケージング細胞において高ウイルスタイターが得られる限り特に限定されない。例えば、前記ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子としてWPREを用いる場合には、プロウイルス由来のベクターコンストラクトにおいて目的タンパク質をコードする遺伝子(以下目的遺伝子とも言う)のすぐ下流に挿入されるのが望ましいがこれに限定されるものではない。
２−２−６．組換レトロウイルスの産生
前記調製したレトロウイルスベクターを、周知の方法、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、又はエレクトロポレーション法などで前記パッケージング細胞、好適にはVSV-G蛋白質を発現する前記パッケージング細胞に導入する。産生された一過性の組換えレトロウイルスを回収する。好適には、組換えレトロウイルスを産生するパッケージング細胞の産生量を測定し、組換えレトロウイルス産生の高い細胞を選抜し増殖することにより、高力価で均一な組換えレトロウイルスを生産することができる。
前記調製したレトロウイルスベクターを、周知の方法、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、又はエレクトロポレーション法などで前記パッケージング細胞、好適にはVSV-G蛋白質を発現する前記パッケージング細胞に導入する。産生された一過性の組換えレトロウイルスを回収する。好適には、組換えレトロウイルスを産生するパッケージング細胞の産生量を測定し、組換えレトロウイルス産生の高い細胞を選抜し増殖することにより、高力価で均一な組換えレトロウイルスを生産することができる。
ウイルスベクターコンストラクト中にｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子であるＤＮＡ配列を導入したことにより顕著にウイルスタイターが上がる。その確認はこのＤＮＡ配列を導入したレトロウイルスベクターを導入した細胞と導入していないレトロウイルスベクターを導入した細胞のウイルスタイターを比較することにより確認できる。ウイルスタイターの測定はｇａｇ、ｐｏｌを構成的に発現するＧＰ２９３細胞に、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の発現ベクターとレトロウイルスベクターをコードするプラスミドを同時にトランスフェクトして組換えレトロウイルスを生産させ、ＮＩＨ３Ｔ３に感染させることで、感染した細胞数の割合により確認することができる。
２−３．組換えレトロウイルスによる鳥類への感染及び、トランスジェニック鳥類の作製
パッケージング細胞等により生産されたレトロウイルスを鳥受精卵の初期胚に導入される方法としては、特に限定されないが、マイクロインジェクション法（Ｂｏｓｓｅｌａｍ、Ｒ．Ａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３、５３３）、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。遺伝子導入効率の観点からマイクロインジェクション法が好ましい。
パッケージング細胞等により生産されたレトロウイルスを鳥受精卵の初期胚に導入される方法としては、特に限定されないが、マイクロインジェクション法（Ｂｏｓｓｅｌａｍ、Ｒ．Ａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３、５３３）、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。遺伝子導入効率の観点からマイクロインジェクション法が好ましい。
生産された組換えレトロウイルスを、孵卵開始後約２４時間以降約１２０時間以前に鳥初期胚に導入する。効率的に目的遺伝子を発現させる観点より、特に限定されない。例えばニワトリの場合では、好ましくは孵卵開始後約４０時間以降６０時間以前、より好ましくは孵卵開始後５０時間以降６０時間以前、およびもっとも好ましくは孵卵開始後約５５時間前後に導入する。ウズラの場合は、好ましくは孵卵開始後45時間から50時間、より好ましくは孵卵開始後48時間前後に導入する。複製欠失型レトロウイルスベクターに上記のプロモーター、目的タンパク質をコードする遺伝子、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を組み込み、パッケージング細胞に導入して生産させた組換えレトロウイルスを鳥類の初期胚に導入させる場合、その導入位置は特に限定されず、例えば胚盤葉又は分化後の血管、心臓に導入することができる。遺伝子導入効率の観点から心臓に導入することが好ましい。また導入組換えレトロウイルス含有溶液量としては好適には2μｌ以上、１０μｌ以下が望ましい。また、外来遺伝子を持った子孫を得るためには、目的遺伝子が、生殖細胞の前駆細胞、又は始原生殖細胞にも導入されることが望ましい。孵化の方法として、該初期胚が発生しおよび成長し得る限り任意の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明者らが開発した人工卵殻による方法（Ｋａｍｉｈｉｒａ，Ｍら（１９９８） Ｄｅｖｅｌｏｐ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，４０，４４９）が挙げられるがこれに限定されない。
孵化した鳥は、公知の獣医学的または畜産学的方法によって成長させる。
本発明の作製法で遺伝子を導入された鳥類は、その体細胞にモザイクキメラ状に遺伝子が導入されたものでありこの一世代目をＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と呼ぶ。またその子孫である導入遺伝子をもった鳥類をＧ１，Ｇ２，Ｇ３〜トランスジェニック鳥類と称する。
本発明の作製法で遺伝子を導入された鳥類は、その体細胞にモザイクキメラ状に遺伝子が導入されたものでありこの一世代目をＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と呼ぶ。またその子孫である導入遺伝子をもった鳥類をＧ１，Ｇ２，Ｇ３〜トランスジェニック鳥類と称する。
なお、作製したパッケージング細胞及びＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の目的タンパク質の含有量を測定する方法としては特に限定されないがＥＬＩＳＡ等を用いることができる。例えば、目的タンパク質がＨＧＨの場合パッケージング細胞を培養した上清、作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の血清、また、その鳥類の産卵した卵白又は卵黄をＨＧＨを認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法及びウエスタンブロット法により測定することができる。また、ｈＥＰＯにおいても同様の方法を用いることにより測定できる。
本発明で使用する鳥類としては、特に限定されるものではなく、例えばニワトリ、ウズラ、七面鳥、カモなどが挙げられる。なかでもニワトリやウズラは入手が容易で産卵種としても多産であり、長年の飼育経験により安全性が認められている点が好ましい。
３．トランスジェニック鳥類の子孫の育種方法
Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を成鳥まで成長させ、非トランスジェニック鳥類（野生型鳥類）又はＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配を行うことによりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に導入した遺伝子を子孫Ｇ１トランスジェニック鳥類へ伝播することができる。遺伝子の伝播の成否は、得られたＧ１トランスジェニック鳥類の血液又は細胞などからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法などにより遺伝子導入を検定することができる。
Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を成鳥まで成長させ、非トランスジェニック鳥類（野生型鳥類）又はＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配を行うことによりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に導入した遺伝子を子孫Ｇ１トランスジェニック鳥類へ伝播することができる。遺伝子の伝播の成否は、得られたＧ１トランスジェニック鳥類の血液又は細胞などからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法などにより遺伝子導入を検定することができる。
作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びＧ１トランスジェニック鳥類での目的タンパク質をコードする遺伝子のコピー数は転写後調節に機能するＤＮＡ配列を導入した鳥類としていない鳥類とで組織又は血液から染色体を調製し、ハイブリダイゼーションなどの比較により確認できる。
作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びＧ１トランスジェニック鳥類での目的タンパク質の発現量はｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を導入した鳥類としていない鳥類とで組織又は血液からｍＲＮＡをとり、ＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザンブロット法などでの比較により調べることができる。
上記したように、得られたＧ１トランスジェニック鳥類の血液又は細胞などからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法などにより遺伝子導入を検定し、遺伝子が導入されている個体を完全体Ｇ１トランスジェニック鳥と呼ぶ。
なお、上記交配には、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類として、例えば、オスの精子に導入遺伝子が存在することをＰＣＲ法等により確認することにより一次選抜したものを用いることもできる。
こうして選抜した完全体Ｇ１トランスジェニック鳥を、他の鳥と交配する。他の鳥は、前記完全体Ｇ１トランスジェニック鳥と交配可能である限り、任意の鳥（同一種であっても異なる種であってもよい）を使用し得る。ホモ接合性完全体トランスジェニック鳥が得られる確率が高い観点から、他の完全体Ｇ１トランスジェニック鳥が好ましい。入手容易である観点から、他のＧ０トランスジェニックキメラ鳥が好ましく、野生型鳥がより好ましい。得られた完全体トランスジェニック鳥を他の鳥と交配し、その子孫を生産できる。
ここにいう交配は公知の畜産学的方法に従って実施できる。自然交配の他、人工交配等も用いることができる。
ここにいう交配は公知の畜産学的方法に従って実施できる。自然交配の他、人工交配等も用いることができる。
得られた、その生殖細胞および全体細胞に目的タンパク質をコードする遺伝子が導入された鳥を、完全体トランスジェニック鳥という。この完全体トランスジェニック鳥は、体全体、例えば卵および血中に目的タンパク質を生産することが可能である。濃縮された目的タンパク質を回収できるという観点から、卵白中に目的タンパク質が生産されるのが好ましい。
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１．ヒト成長ホルモンを発現させるレトロウイルスベクターコンストラクトｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）の作製
ヒト成長ホルモンｃＤＮＡは我々が以前作製したレトロウイルスベクターｐＬＧＯＧ（特許公開２００４−２３６６２６）から用いた。まずこのｐＬＧＯＧをＸｈｏＩ、ＭｌｕＩで切断し、切り出した０．７ｋｂをｐＥＴＢｌｕｅ−２（ノバジェン社製）のＳａｌＩ、ＭｌｕＩサイトに挿入しｐＥＴｈＧＨ（ｃＤＮＡ）を作製した。次にｐＥＴｈＧＨをＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで切り出した断片を、ｐＺｅｏＳＶ２（＋）（インビトロジェン社製）のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトに挿入しｐＺｅｏｈＧＨ（ｃＤＮＡ）を作製した。つづいてこのｐＺｅｏｈＧＨをＮｈｅＩ、ＸｈｏＩで切り出した断片をｐＣＥＰ４のＮｈｅＩ、ＸｈｏＩサイトに挿入しｐＣＥＰｈＧＨ（ｃＤＮＡ）を作製した。次にこのｐＣＥＰｈＧＨ（ｃＤＮＡ）をＨｉｎｄＩＩＩで切断しヒト成長ホルモンｃＤＮＡを含む０．７ｋｂをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＷＯ2004／016081号、特願２００２−２３６０８９）をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｓｃＦｖ−Ｆｃ領域を取り除いたものに挿入し、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）を作製した。
ヒト成長ホルモンｃＤＮＡは我々が以前作製したレトロウイルスベクターｐＬＧＯＧ（特許公開２００４−２３６６２６）から用いた。まずこのｐＬＧＯＧをＸｈｏＩ、ＭｌｕＩで切断し、切り出した０．７ｋｂをｐＥＴＢｌｕｅ−２（ノバジェン社製）のＳａｌＩ、ＭｌｕＩサイトに挿入しｐＥＴｈＧＨ（ｃＤＮＡ）を作製した。次にｐＥＴｈＧＨをＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで切り出した断片を、ｐＺｅｏＳＶ２（＋）（インビトロジェン社製）のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトに挿入しｐＺｅｏｈＧＨ（ｃＤＮＡ）を作製した。つづいてこのｐＺｅｏｈＧＨをＮｈｅＩ、ＸｈｏＩで切り出した断片をｐＣＥＰ４のＮｈｅＩ、ＸｈｏＩサイトに挿入しｐＣＥＰｈＧＨ（ｃＤＮＡ）を作製した。次にこのｐＣＥＰｈＧＨ（ｃＤＮＡ）をＨｉｎｄＩＩＩで切断しヒト成長ホルモンｃＤＮＡを含む０．７ｋｂをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＷＯ2004／016081号、特願２００２−２３６０８９）をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｓｃＦｖ−Ｆｃ領域を取り除いたものに挿入し、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）を作製した。
実施例２．ＷＰＲＥを挿入したヒト成長ホルモンを発現させるレトロウイルスベクターコンストラクトｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗの作製
ＷＰＲＥ領域を増幅するためにテンプレートとして、ｐＷＨＶ８（ＡＴＣＣ４５０９７）を用いて、化学合成オリゴヌクレオチドＷＰＲＥ（ｄｉｒｅｃｔ ＣｌａＩ）５‘−ｃｃａｔｃｇａｔａａｔｃａａｃｃｔｃｔｇｇａｔｔａｃａａａａｔｔｔｇｔｇａ−３’ （配列番号１；下線部はＣｌａＩサイト）とＷＰＲＥ（ｒｅｖｅｒｓ ＣｌａＩ）５‘−ｃｃａｔｃｇａｔｃａｇｇｃｇｇｇｇａｇｇｃｇ−３’ （配列番号２；下線部はＣｌａＩサイト）をプライマーとして用いてＫＯＤ＋にてＰＣＲ（９４℃２分の後９４℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃３０秒を３０サイクル）を行った。増幅した断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ−のＥｃｏＲＶサイトに挿入しｄａｍ−の大腸菌ＪＭ１１０（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に形質転換を行い、これからプラスミドを調製し、ｐＢｌｕｅＷＰＲＥ（ＥｃｏＲＶ）を作製した。最後にｐＢｌｕｅＷＰＲＥ（ＥｃｏＲＶ）をＣｌａＩで切断しＷＰＲＥを含む断片を切り出し、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）のＣｌａＩサイトに挿入して、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗを作製した。
ＷＰＲＥ領域を増幅するためにテンプレートとして、ｐＷＨＶ８（ＡＴＣＣ４５０９７）を用いて、化学合成オリゴヌクレオチドＷＰＲＥ（ｄｉｒｅｃｔ ＣｌａＩ）５‘−ｃｃａｔｃｇａｔａａｔｃａａｃｃｔｃｔｇｇａｔｔａｃａａａａｔｔｔｇｔｇａ−３’ （配列番号１；下線部はＣｌａＩサイト）とＷＰＲＥ（ｒｅｖｅｒｓ ＣｌａＩ）５‘−ｃｃａｔｃｇａｔｃａｇｇｃｇｇｇｇａｇｇｃｇ−３’ （配列番号２；下線部はＣｌａＩサイト）をプライマーとして用いてＫＯＤ＋にてＰＣＲ（９４℃２分の後９４℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃３０秒を３０サイクル）を行った。増幅した断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ−のＥｃｏＲＶサイトに挿入しｄａｍ−の大腸菌ＪＭ１１０（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に形質転換を行い、これからプラスミドを調製し、ｐＢｌｕｅＷＰＲＥ（ＥｃｏＲＶ）を作製した。最後にｐＢｌｕｅＷＰＲＥ（ＥｃｏＲＶ）をＣｌａＩで切断しＷＰＲＥを含む断片を切り出し、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）のＣｌａＩサイトに挿入して、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗを作製した。
実施例３．
実施例１．で作製したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）及びｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗより組換えレトロウイルスを調製するため、トランスフェクションする前日にＧＰ２９３細胞（クロンテック社製）を２４ｗｅｌｌプレートに２×１０５細胞をまきＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）（シグマ社製）１０％ＦＣＳで培養した。培地を新鮮なＤＭＥＭ １０％ＦＣＳに交換し、ｐＶＳＶ−Ｇベクター（クロンテック社製）０．４μｇとｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）及びｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗ０．４μｇをリポフェクション法によりＧＰ２９３細胞に導入した。４８時間後ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）により細胞は夾雑物を除去した。得られた培養上清にポリブレン（シグマ社製）を８μｇ／ｍｌになるように加え組換えウイルス溶液とした。
実施例１．で作製したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）及びｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗより組換えレトロウイルスを調製するため、トランスフェクションする前日にＧＰ２９３細胞（クロンテック社製）を２４ｗｅｌｌプレートに２×１０５細胞をまきＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）（シグマ社製）１０％ＦＣＳで培養した。培地を新鮮なＤＭＥＭ １０％ＦＣＳに交換し、ｐＶＳＶ−Ｇベクター（クロンテック社製）０．４μｇとｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）及びｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗ０．４μｇをリポフェクション法によりＧＰ２９３細胞に導入した。４８時間後ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）により細胞は夾雑物を除去した。得られた培養上清にポリブレン（シグマ社製）を８μｇ／ｍｌになるように加え組換えウイルス溶液とした。
実施例４．
ウイルス溶液のタイターは以下のように測定した。ウイルス溶液をかける前日にＮＩＨ３Ｔ３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を２４ｗｅｌｌプレートに１．５×１０４細胞になるように植え培養した。２−２００倍希釈したウイルス溶液に培地交換した後４８時間後に蛍光顕微鏡によりＧＦＰを発現している細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウイルスタイター（ｃｆｕ／ｍｌ）＝細胞数×希釈率×発現割合
このようにしてタイターを測定した結果、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）とｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）ＷとではＷＰＲＥ配列を挿入したものの方が６倍高かった（図１）。
ウイルス溶液のタイターは以下のように測定した。ウイルス溶液をかける前日にＮＩＨ３Ｔ３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を２４ｗｅｌｌプレートに１．５×１０４細胞になるように植え培養した。２−２００倍希釈したウイルス溶液に培地交換した後４８時間後に蛍光顕微鏡によりＧＦＰを発現している細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウイルスタイター（ｃｆｕ／ｍｌ）＝細胞数×希釈率×発現割合
このようにしてタイターを測定した結果、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）とｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）ＷとではＷＰＲＥ配列を挿入したものの方が６倍高かった（図１）。
実施例５．ヒト成長ホルモンを発現させるレトロウイルスベクターコンストラクトの動物細胞での発現
ヒト成長ホルモンを発現させるレトロウイルスベクターコンストラクトの動物細胞の発現をみるためにＣＨＯ−Ｋ１細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を用いた。まず、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクションする前日に２４ｗｅｌｌプレートに１．５×１０５細胞をまきＦ１２ １０％ＦＣＳ培地（ギブコ社製）にて培養した。次の日培地をＣＨＯ−Ｓ−ＳＭＦＩＩ ｌｏｗ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ギブコ社製）に交換し、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）及びｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗ０．８μｇをリポフェクション法によりＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。６及び２４時間後同培地で培地交換を行い４８時間後に培養上清を回収した。
ヒト成長ホルモンを発現させるレトロウイルスベクターコンストラクトの動物細胞の発現をみるためにＣＨＯ−Ｋ１細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を用いた。まず、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクションする前日に２４ｗｅｌｌプレートに１．５×１０５細胞をまきＦ１２ １０％ＦＣＳ培地（ギブコ社製）にて培養した。次の日培地をＣＨＯ−Ｓ−ＳＭＦＩＩ ｌｏｗ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ギブコ社製）に交換し、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）及びｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗ０．８μｇをリポフェクション法によりＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。６及び２４時間後同培地で培地交換を行い４８時間後に培養上清を回収した。
実施例６．ヒト成長ホルモン発現量の検定
回収した培養上清を１００倍及び１０００倍に希釈して測定に用いた。測定はｈＧＨ ＥＬＩＳＡキット（ロッシュ社製）を用いてマニュアルに従いＥＬＩＳＡ法にて測定した。その結果ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）とｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）ＷとではＷＰＲＥ配列を挿入したものの発現量が３．５倍高かった（図２）。
回収した培養上清を１００倍及び１０００倍に希釈して測定に用いた。測定はｈＧＨ ＥＬＩＳＡキット（ロッシュ社製）を用いてマニュアルに従いＥＬＩＳＡ法にて測定した。その結果ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）とｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）ＷとではＷＰＲＥ配列を挿入したものの発現量が３．５倍高かった（図２）。
Claims (12)
- ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子および目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ組換えレトロウイルスを、孵卵開始後２４時間から１２０時間までの鳥受精卵の初期胚へ導入し、その胚を孵化および成長させて得られ得るＧ０トランスジェニックキメラ鳥類またはその子孫。
- 前記組換えレトロウイルスが更にＶＳＶのＧプロテインを含むシュードタイプである請求項1記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類またはその子孫。
- 該転写後調節因子がウッドチャック・肝炎ウイルスの転写後制御因子（ＷＰＲＥ）である請求項１のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類またはその子孫。
- 該レトロウィルスベクターがモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス由来のベクターであることを特徴とする請求項１のトランスジェニック鳥類またはその子孫。
- 該目的タンパク質がヒト成長ホルモンである請求項１のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類またはその子孫。
- 該鳥類がニワトリである請求項１のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類またはその子孫。
- 前記組換えレトロウイルスを孵卵開始後５０〜６０時間までのニワトリ受精卵の初期胚に導入する請求項6記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類またはその子孫。
- 請求項１のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を得；該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を他の鳥類と交配し、目的遺伝子が導入されている子孫を選抜することにより得られ得る、完全体トランスジェニック鳥類またはその子孫。
- （１）ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子および目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターをパッケージング細胞に導入して生産させた組換えレトロウイルスを、孵卵開始後24時間以降１２０時間の鳥受精卵の初期胚へ導入し、その胚を孵化および成長させることを特徴とする、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類の生産方法。
- （１）ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子および目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターをパッケージング細胞に導入して生産させた組換えレトロウイルスを、孵卵開始後24時間以降１２０時間の鳥受精卵の初期胚へ導入し、その胚を孵化および成長させＧ０トランスジェニックキメラ鳥を得；該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥を他の鳥類と交配し、目的遺伝子が導入されている完全体トランスジェニック鳥を選抜することを特徴とする完全体トランスジェニック鳥の生産方法。
- 他の鳥が、野生型鳥またはＧ０トランスジェニックキメラ鳥である、請求項１０の生産方法。
- 請求項１０の方法によって完全体トランスジェニック鳥を得；該完全体トランスジェニック鳥を成長させ；および血中または卵中から目的タンパク質を回収することを特徴とする；タンパク質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005095758A JP2006271266A (ja) | 2005-03-29 | 2005-03-29 | 高発現および効率的遺伝子導入鳥類 |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP2006271266A true JP2006271266A (ja) | 2006-10-12 |
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ID=37206611
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| JP2005095758A Pending JP2006271266A (ja) | 2005-03-29 | 2005-03-29 | 高発現および効率的遺伝子導入鳥類 |
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| JP (1) | JP2006271266A (ja) |
Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| WO2004016081A1 (ja) * | 2002-08-13 | 2004-02-26 | Kaneka Corporation | レトロウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類での遺伝子発現法およびそれによって得られる遺伝子導入鳥類 |
| JP2004236626A (ja) * | 2003-02-07 | 2004-08-26 | Univ Nagoya | 遺伝子導入鳥類及びそれを用いたタンパク質の生産方法 |
| WO2005021769A1 (ja) * | 2003-08-29 | 2005-03-10 | Kaneka Corporation | レンチウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類作製法及びそれによって得られる遺伝子導入鳥類 |
-
2005
- 2005-03-29 JP JP2005095758A patent/JP2006271266A/ja active Pending
Patent Citations (3)
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| WO2005021769A1 (ja) * | 2003-08-29 | 2005-03-10 | Kaneka Corporation | レンチウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類作製法及びそれによって得られる遺伝子導入鳥類 |
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