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JP2005536438A - 過分極活性化型環状ヌクレオチド依存性チャンネルに標的を定めることによる疼痛の治療 - Google Patents

過分極活性化型環状ヌクレオチド依存性チャンネルに標的を定めることによる疼痛の治療 Download PDF

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JP2005536438A JP2003503155A JP2003503155A JP2005536438A JP 2005536438 A JP2005536438 A JP 2005536438A JP 2003503155 A JP2003503155 A JP 2003503155A JP 2003503155 A JP2003503155 A JP 2003503155A JP 2005536438 A JP2005536438 A JP 2005536438A
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ドウビン，アドリーン
グオ，ホング−シング
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リウ，チヤングル
ルオ，リン
ブラウン，シーン
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Abstract

ペースメーカー（過分極活性化型陽イオン非選択的、ＨＣＮ）イオンチャンネルの顕著に高められた活性は、異痛症ラットの知覚細胞中の自発発火を支配する。ＨＣＮイオンチャンネル特異的遮断薬ＺＤ７２８８は、異痛症を用量依存性かつ完全に抑制する。神経傷害は、高密度のＩｈを発現する大型ＤＲＧニューロンの集団を増大させ、また、ＨＣＮ ｍＲＮＡ発現を調節する。ＨＣＮペースメーカーチャンネルに標的を定めることによる疼痛の新たな治療方法が開発される。加えて、疼痛の治療に有用な組成物の新たな同定方法を開示する。

Description

本発明は疼痛の治療に関する。より具体的には、本発明は、ニューロパシー性疼痛および炎症性疼痛の治療のための治療標的として過分極活性化型環状ヌクレオチド依存性（ＨＣＮペースメーカー）チャンネルを使用することに関する。
疼痛は罹患者にとって破壊的である可能性がある。疼痛の原因は、炎症、傷害、疾患、筋攣縮、および神経障害事象もしくは症候群の発症を包含する可能性がある。一般に、疼痛は、組織損傷を生じさせることが可能であるのに十分な強度の機械的、熱的もしくは化学的刺激に身体組織がさらされる場合に経験される。疼痛は、刺激が除去されるかもしくは傷害された組織が治癒する場合に解消する。しかしながら、現実の神経組織への炎症性感作もしくは損傷の条件下では、自発性疼痛が、見かけの組織治癒にもかかわらず慢性もしくは永続的になるかもしれない。疼痛は、外的刺激の非存在下で感じられるかもしれず、また、刺激により経験される疼痛は、不均衡に強くかつ持続性になるかもしれない。
炎症性疼痛は、外科手術、有害な物理的、化学的もしくは熱的事象、生物学的病原体による感染、および／または特発性／自己免疫過程から生じる可能性がある。炎症性疼痛の原因は多く、そして、限定されるものでないが、感染症、熱傷性疼痛、慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、強直性脊椎炎、変形性関節症、大腸炎、過敏性腸疾患、心炎、皮膚炎、筋炎、神経炎および膠原血管病、ならびに癌を挙げることができる。炎症性疼痛の現在の治療方法は多くの短所および欠陥を有する。例えば、破壊的自己免疫過程を抑制するのに普遍的に使用されるコルチコステロイドは、限定されるものでないが、感染症に対する易患性、組織の弱化、および骨折につながる骨密度の喪失、ならびに眼の白内障形成を挙げることができる、望ましくない副作用をもたらす可能性がある。
ニューロパシー性疼痛は、末梢もしくは中枢神経系の傷害もしくは疾患により誘発される疼痛と定義される。ニューロパシー性疼痛の病状は不均質であり、そして、限定されるものでないが、機械的神経傷害、例えば手根管症候群、椎間円板ヘルニア形成による神経根障害；切断後症候群、例えば断端痛、幻肢痛；代謝性疾患、例えば糖尿病性ニューロパシー；神経向性ウイルス性疾患、例えば帯状疱疹、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）疾患；癌、例えば腫瘍浸潤、神経組織の刺激もしくは圧迫；癌放射線治療後のような放射線神経炎；例えば癌、ＨＩＶもしくは結核の化学療法のような外因性物質により引き起こされる神経毒性；炎症性および／もしくは免疫学的機構、例えば多発性硬化症、腫瘍随伴性症候群；神経系限局性虚血、例えば視床症候群（有痛知覚消失）；複数の神経伝達物質系の機能不全、例えば神経因性疼痛（ＣＲＰＳ）；ならびに特発性原因、例えば三叉神経痛を挙げることができる。
いずれの病因の慢性疼痛の長期治療も非常に挑戦的であるかもしれない。疼痛は慣習的鎮痛薬に応答するかもしれないとは言え、副作用が許容できないかもしれないか、もしくは、問題の薬物の鎮痛効果に対する耐性が治療を問題の多いものにするかもしれない。イブプロフェンおよびアスピリン（双方とも非ステロイド性抗炎症薬）での治療は、消化管の副作用により制限されるかもしれない。アヘン薬物（モルヒネ、コデイン、ヒドロコドン、オキシコドンなど、および誘導体）での慢性治療は、副作用（鎮静、便秘など）、薬物耐性もしくは離脱現象を伴う疼痛管理の困難、ならびに社会的要因（アヘン製剤消費の汚名、物質濫用の潜在性、薬物転用、生産性の喪失などについての懸念）により、患者もしくは医師のいずれかにとって許容できないかもしれない。
ニューロパシー性疼痛は治療するのがとりわけ困難であることは、前臨床研究者および臨床家双方に公知である。アヘン製剤および非ステロイド性抗炎症薬のような普遍的に使用される鎮痛薬は、ニューロパシー性疼痛を軽減するのにしばしば無効である。モルヒネ様薬物（アヘン薬物）に関して、認識される有効性は鎮静とともになされなければならないかもしれない（すなわち、患者は疼痛に関して治療するには鎮静されすぎる）。また、ニューロパシー性疼痛を治療するためのアヘン製剤の使用は、治療を問題の多いものにする耐性およびエスカレートする用量要求を伴うことがよりありそうであるかもしれない。従って、これらの化合物の鎮痛効果は一時的であるかもしれない。これらの鎮痛薬で治療される患者の大多数は疼痛を経験し続け、そして、疼痛解消を全く経験しないかもしれない。多数のいわゆる「補助」鎮痛薬、すなわち、三環性抗うつ薬（例えばアミトリプチリン、ノルトリプチリン、デシプラミン、イミプラミン）、ある種の抗痙攣薬（例えばカルバマゼピン、ギャバペンチン、フェニトイン、ラモトリジン）、抗不整脈薬メキシレチン、リドカインおよびトカイニド、ならびにバクロフェン（ＧＡＢＡ−Ｂアゴニスト）およびクロニジン（α２アドレナリン作動性アゴニスト）のような多様な雑多な薬物のような鎮痛薬と典型的に考えられない薬物が、ニューロパシー性疼痛治療の主力となっている。これらの作用物質は、しかしながら、制限された有効性、もしくは、鎮静から心血管系の影響ないし生命を脅かす骨髄抑制までの範囲にわたる重大な副作用の欠点もまたある。薬理学的（神経ブロック、脊髄注射剤、埋込可能な薬物送達装置）および非薬理学的（例えば埋込可能な神経／脊髄刺激剤、神経切除処置）双方の多数の侵襲的治療が存在し；全部が、制限された有効性、およびそれぞれの処置による合併症に対する既知の潜在性という短所の双方の欠点がある。鎮痛薬の現在の全装備の制限は、ニューロパシー性疼痛の治療のための独創的な機構をもつ新規方法および戦略の開発を要求する。
病因の多様性にもかかわらず、多くのニューロパシー性疼痛症候群は共通の臨床的特徴を共有する。ニューロパシー性疼痛の症状は、末端の灼熱感、うずき、電撃、ピンおよび針、こわばり、しびれの異常な感覚、身体のゆがみの感覚、異痛症（皮膚の無害な刺激により惹起される疼痛）、痛覚過敏（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）（痛みに対する低下された閾値、例えば穏やかな熱的刺激が疼痛を引き起こす）、痛覚過敏（ｈｙｐｅｒｐａｔｈｉａ）（上昇された疼痛閾値、しかしながら閾値が一旦越えられれば誇張された疼痛応答を伴う）、加重（反復性の軽度の刺激での疼痛の累積的悪化）、ならびに冒された領域の他の知覚機能の非存在下での疼痛を包含する。これらの観察結果は、多くのニューロパシー性疼痛症候群が普遍的機構を共有するかもしれないという提案に至った。
多様な動物モデルを使用する実験は、末梢および／もしくは中枢神経系における自発的活動が、疼痛を説明することができる機構である可能性があることを示唆した。動物モデル研究からの矛盾しない観察結果は、冒された脊髄レベルの後根神経節の一次求心性ニューロンが自発放電を立証することである。これらの放電はＡβおよびＡδ線維と優先的に関連するとは言え、高められたＣ線維活動もまた必要とするかもしれない。付加的な研究は、これらの一次求心性ニューロンがシナプスを形成する脊髄後角の二次ニューロン中での自発的もしくは異常に容易に惹起される放電を立証した。結果として、自発放電もしくは異常な興奮性を抑制する治療は、それにより疼痛を低下させることができると考えられる（非特許文献１）。とりわけ、他の正常なニューロン伝達を妨害することなく自発／過興奮性放電を選択的に抑制する薬物もしくは化合物は、疼痛症候群の治療で有用であることがありそうである。
Ｇｏｌｄ、（２０００）Ｐａｉｎ ８４：１１７−２０
本発明は、疼痛、好ましくはニューロパシー性もしくは炎症性疼痛の新規治療を開発するための特異的治療標的としてはたらく可能性がある、疼痛に関与するこれまで未知の細胞成分、すなわちＨＣＮペースメーカーチャンネルの役割を教示する。
一局面において、本発明は、１種もしくはそれ以上の他の鎮痛薬の存在もしくは非存在下で被験体の知覚細胞中のＨＣＮペースメーカーチャンネルにより媒介される電流もしくはＨＣＮサブユニットの発現を低下させる、予防上有効な用量の組成物を被験体に投与することを含んで成る、それの必要な被験体における疼痛の発生の予防方法に関する。
別の局面において、本発明は、１種もしくはそれ以上の他の鎮痛薬の存在もしくは非存在下で被験体の知覚細胞中のＨＣＮペースメーカーチャンネルにより媒介される電流の電流密度、もしくはＨＣＮサブユニットの発現を低下させる、治療上有効な用量の組成物を被験体に投与することを含んで成る、それの必要な被験体における疼痛の治療方法に関する。
別の局面において、本発明は：
（ａ）試験化合物をＨＣＮペースメーカータンパク質と接触させること；および
（ｂ）ＨＣＮペースメーカーチャンネルに媒介される電流を低下させる化合物の能力を決定すること
の段階を含んで成る、疼痛の治療に有用な化合物の同定方法に関する。場合によっては、該方法はさらに：
該化合物を疼痛の動物モデルに投与すること
を含んで成る付加的な段階の付加により確認することができる。
本発明は：
（ａ）ＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列、もしくはＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列に結合するタンパク質と試験化合物を接触させること；および
（ｂ）該試験化合物が、前記調節配列により制御されるＨＣＮ遺伝子の発現を低下させるかどうかを決定すること
の段階を含んで成る、疼痛の治療に有用な化合物の別の同定方法に関する。場合によっては、該方法はさらに：
該化合物を疼痛の動物モデルに投与すること
を含んで成る付加的な段階の付加により確認することができる。
本発明は：
（ａ）試験化合物、ＨＣＮペースメーカータンパク質の測定可能に標識されたリガンド、およびＨＣＮペースメーカータンパク質を組み合わせること；ならびに
（ｂ）ＨＣＮペースメーカータンパク質への標識されたリガンドの結合の量の低下によりＨＣＮペースメーカータンパク質への該化合物の結合を測定すること
の段階を含んで成る、疼痛の治療に有用な化合物のなお別の同定方法に関する。場合によっては、該方法はさらに：
該化合物を疼痛の動物モデルに投与すること
を含んで成る付加的な段階の付加により確認することができる。
ＨＣＮタンパク質のカルボキシ末端に特異的に結合する抗体もまた本発明に包含される。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳述された記述および請求の範囲から明らかであろう。
＜発明の詳細な記述＞
本発明は疼痛の治療に関する。とりわけ、本発明は、疼痛、好ましくはニューロパシー性疼痛もしくは炎症性疼痛の治療のための新規方法および戦略を開発するための新たな治療標的、すなわちＨＣＮペースメーカーチャンネルを提供する。
ＨＣＮペースメーカーチャンネルは疼痛に関与する。
過分極活性化型環状ヌクレオチド依存性（ＨＣＮ）チャンネルは、心およびニューロンの脱分極に固有の高頻度律動性振動の原因であるペースメーカーチャンネルの一ファミリーとして最近同定された。
ペースメーカー電流は、心およびニューロンのペースメーカー細胞の発火率を調節する、過分極活性化型陽イオン選択的な内向き電流である。この電流は、しばしば、Ｉｈ（「過分極」）、Ｉｆ（「奇妙な」）もしくはＩｑ（「風変わりな」）と略称される。Ｉｈは心の洞房結節および房室結節、ならびに心室のプルキンエ線維（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ、（１９９５）Ａｃｔａ Ｃａｒｄｉｏｌ ５０：４１３−２７）における正常な歩調取り（ｐａｃｅｍａｋｉｎｇ）、ならびに生理学的条件下での心筋細胞の異常な自動的活動（Ｏｐｔｈｏｆ、（１９９８）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ３８：５３７−４０．）に寄与する。Ｉｈはまた、ニューロンの反復発火およびニューロンの網状構造における振動性挙動も媒介する。加えて、それは、ある種の興奮性細胞の静止電位を設定するよう作用し、また、シナプスの可塑性および精子の活性化において機能するかもしれない（Ｐａｐｅ、（１９９６）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５８：２９９−３２７）。
ペースメーカー電流Ｉｈは、過分極に際しての活性化、小型単一チャンネルの伝導度、細胞内環状ヌクレオチドによる調節、Ｋ＋およびＮａ＋双方に対する浸透性、ならびにＬｉ＋に対する乏しい浸透性を包含する異常な特徴を有する。Ｉｈは、Ｎａ＋（−７０ｍＶ付近の静止膜電位での内向きの流れ）およびＫ＋（−７０ｍＶ付近の静止膜電位での外向きの流れ）双方により媒介され、そして、生理学的条件下で約−３０もしくは−４０ｍＶの逆転電位を有する（Ｈｏら（１９９４）、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ ４２６：６８−７４）（Ｍｅｒｃｕｒｉら、（１９９５）Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ７：４６２−９）。
ペースメーカー電流を伝導するイオンチャンネルをコードする４種の遺伝子が最近クローン化された。これらの遺伝子はＨＮＣファミリーに属し、そしてそれぞれＨＣＮ１、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３およびＨＣＮ４と呼称された。ＨＣＮチャンネルは、電圧依存性Ｋ＋チャンネルと構造的特徴を共有する。これらの特徴は、孔ループ中のＧＹＧ Ｋ＋チャンネルシグネチャ配列および推定の電圧センサーである高度に正に荷電したＳ４ドメインを包含する（Ｇａｕｓｓら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５８３−７；Ｌｕｄｗｉｇら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５８７−９１；Ｓａｎｔｏｒｏら、（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９４：１４８１５−２０；Ｓａｎｔｏｒｏら、（１９９８）Ｃｅｌｌ ９３：７１７−２９）。ＨＣＮチャンネルは、それらが６個の膜貫通ドメインを所有し、かつ、活性化の電圧依存性を調節することができる細胞内環状ヌクレオチド結合ドメインを組込むために、Ｋ＋チャンネルのｅａｇファミリー（例えばｅｒｇ、ｅａｇ、ｅｌｋ）および植物のＫ＋チャンネルのＫＡＴ１ファミリー（Ｂｉｅｌら、（１９９９）Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １３６：１６５−８１）に対し最も相同である。例えば、ＨＣＮ２へのｃＡＭＰの結合は、活性化曲線を最低２０ｍＶ右方へ移動し、従って静止膜電位でのチャンネル活動を高める。これら４種のＨＣＮチャンネルは実質的な相同性を共有するが、しかし、異なる活性化の動力学および環状ＡＭＰに対する応答性の程度を有する。
げっ歯類ニューロパシー性疼痛モデルで観察される増大された自発放電の重要な一特徴は律動性（律動性発火であろうと律動性バースト発火であろうと）である。この特徴は、増大された自発放電の生成のための根底にある非無作為の過程を示唆する。本発明において、われわれは、ニューロパシー性疼痛および他の型の疼痛におけるＨＣＮペースメーカーチャンネルの可能な役割を検討した。
本明細書で使用されるところの「ＨＣＮペースメーカーチャンネル」は、過分極活性化型環状ヌクレオチド依存性チャンネルである膜チャンネルを指す。「ＨＣＮペースメーカーチャンネル」は、Ｎａ＋（細胞外環境から細胞質への内向きの流れ）およびＫ＋（外向きの流れ）双方を伝導し、そして、生理学的条件下で約−３０もしくは−４０ｍＶの逆転電位を有する。哺乳動物のチャンネルの単一チャンネル伝導度は極めて低いと考えられる（Ｐａｐｅ、（１９９６）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５８：２９９−３２７）。ＨＣＮペースメーカーチャンネルはＨＣＮペースメーカーチャンネルサブユニットの四量体を含むことがありそうである。ＨＣＮペースメーカーチャンネルは、それが最低２種の異なるＨＣＮペースメーカーチャンネルサブユニットから作成される場合はヘテロメリック、もしくは、それが同一のＨＣＮペースメーカーチャンネルタンパク質サブユニットから作成される場合はホモメリックであるかもしれない。ＨＣＮペースメーカーチャンネルはまた、Ｍｉｒｐ１のような補助分子（ａｃｃｅｓｓｏｒｉｅｓ）としての他のサブユニットも含有するかもしれない（Ｙｕら、（２００１）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ８８：Ｅ８４−７．）。
本明細書で使用されるところの「ＨＣＮポリペプチド」もしくは「ＨＣＮサブユニット」は、ＨＣＮ遺伝子ファミリーの１メンバー、過分極活性化型の環状ヌクレオチドに調節されるチャンネルのサブユニットもしくは単量体であるポリペプチドを指す。ＨＣＮポリペプチド、例えばＨＣＮ１、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３もしくはＨＣＮ４が、ホモメリックもしくはヘテロメリックいずれかのカリウムチャンネル、ＨＣＮペースメーカーチャンネルの一部である場合、該チャンネルは過分極活性化型の環状ヌクレオチド依存性の活性を有する。ＨＣＮポリペプチドという用語は、従って：（１）ヒトＨＣＮ１（配列番号４）、ヒトＨＣＮ２（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）タンパク質＿Ｉｄ：ＮＰ＿００１１８５）、ヒトＨＣＮ３（配列番号１０）およびヒトＨＣＮ４（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）タンパク質＿Ｉｄ：ＮＰ＿００５４６８）のようなＨＣＮペースメーカーチャンネルファミリーメンバーのポリペプチドに対する約６０％より大きいアミノ酸配列の同一性、好ましくは約６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５％のアミノ酸配列の同一性を有する配列を有する；（２）上述されたようなＨＣＮペースメーカーチャンネルファミリーメンバーのポリペプチドを含んで成る免疫原に対し生じられた抗体、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、およびそれらの保存的に改変された変異体に結合する；（３）ヒトＨＣＮ１（配列番号３）、ヒトＨＣＮ２（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号：ＮＭ＿００１１９４）、ヒトＨＣＮ３（配列番号９）およびヒトＨＣＮ４（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号：ＮＭ＿００５４７７）のようなＨＣＮペースメーカーチャンネルファミリーメンバーのポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするＤＮＡ分子によりコードされる；または（４）上述されたようなＨＣＮペースメーカーチャンネルファミリーメンバーのポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーにより増幅することができるＤＮＡ分子によりコードされる、多形変異体、対立遺伝子、突然変異体、および種間の相同物を指す。
例示的な高ストリンジェンシーもしくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は：６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄を伴う、４２℃でインキュベートされる５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、もしくは６５℃でインキュベートされる５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを包含する。
本明細書で使用されるところの「ＨＣＮペースメーカー遺伝子」は、（１）ヒトＨＣＮ１（配列番号４）、ヒトＨＣＮ２（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）タンパク質＿Ｉｄ：ＮＰ＿００１１８５）、ヒトＨＣＮ３（配列番号１０）およびヒトＨＣＮ４（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）タンパク質＿Ｉｄ：ＮＰ＿００５４６８）のようなＨＣＮペースメーカーチャンネルファミリーメンバーのポリペプチドに対する約６０％より大きいアミノ酸配列の同一性、好ましくは約６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５％のアミノ酸配列の同一性を有する配列を有するタンパク質をコードする；（２）上述されたようなＨＣＮペースメーカーチャンネルファミリーメンバーのポリペプチドを含んで成る免疫原に対し生じられた抗体、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、およびそれらの保存的に改変された変異体に結合することが可能なタンパク質をコードする；（３）ヒトＨＣＮ１（配列番号３）、ヒトＨＣＮ２（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号：ＮＭ＿００１１９４）、ヒトＨＣＮ３（配列番号９）およびヒトＨＣＮ４（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号：ＮＭ＿００５４７７）のようなＨＣＮペースメーカーチャンネルファミリーメンバーのポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする；または（４）上述されたようなＨＣＮペースメーカーファミリーのポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーにより増幅することができるＤＮＡ分子を指す。
本明細書で使用されるところの「ＨＣＮペースメーカーチャンネルファミリー」という用語は、ＨＣＮ１、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３もしくはＨＣＮ４のような既知のＨＣＮペースメーカーメンバーに普遍的な構造ドメインを有しかつそれらに対する十分なアミノ酸もしくはヌクレオチド配列の同一性を有する、２種もしくはそれ以上のタンパク質もしくは核酸分子を意味することを意図している。ファミリーのメンバーは同一もしくは異なるいずれかの種からであることができる。例えば、ファミリーはヒト起源の２種もしくはそれ以上のタンパク質を含むことができるか、または、ヒト起源の１種もしくはそれ以上のタンパク質および非ヒト起源の１種もしくはそれ以上を含むことができる。
本発明において、われわれは、対照動物からのものと比較した疼痛の動物モデルからの後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン中のＨＣＮサブユニットのｍＲＮＡおよびタンパク質、ならびにＨＣＮペースメーカーサブユニットにより媒介される全細胞電流のレベルを検討した。
本明細書で使用されるところの「対照動物（１種もしくは複数）」は、疼痛症候群を表さない多様な前臨床動物を包含する。「疼痛の動物モデル」は疼痛症候群を表す多様な前臨床動物を包含する。ニューロパシー性疼痛の普遍的に研究されるげっ歯類モデルは：慢性狭窄傷害（ＣＣＩもしくはベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ））モデル；神経腫もしくは軸索切断モデル；脊髄神経結紮（ＳＮＬもしくはチャング（Ｃｈｕｎｇ））モデル；および部分的坐骨神経離断もしくはゼルツァー（Ｓｅｌｔｚｅｒ）モデル（Ｓｈｉｒら、（１９９０）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ １１５：６２−７）を包含する。ニューロパシー性疼痛モデルは、限定されるものでないが、数種の外傷性神経傷害調製物（Ｂｅｎｎｅｔｔら、（１９８８）Ｐａｉｎ ３３：８７−１０７；Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄら、（２０００）Ｐａｉｎ ８７：１４９−５８；Ｋｉｍら、（１９９２）Ｐａｉｎ ５０：３５５−３６３；Ｓｈｉｒら、（１９９０）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ １１５：６２−７）、神経炎症モデル（Ｃｈａｃｕｒら、（２００１）Ｐａｉｎ ９４：２３１−４４；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、（２０００）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ８６１：１０５−１６）糖尿病性ニューロパシー（Ｃａｌｃｕｔｔら、（１９９７）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １２２：１４７８−８２）、ウイルスで誘発されるニューロパシー（Ｆｌｅｅｔｗｏｏｄ−Ｗａｌｋｅｒら、（１９９９）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８０：２４３３−６．）、ビンクリスチンニューロパシー（Ａｌｅｙら、（１９９６）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ７３：２５９−６５；Ｎｏｚａｋｉ−Ｔａｇｕｃｈｉら、（２００１）Ｐａｉｎ ９３：６９−７６．）、およびパクリタキセルニューロパシー（Ｃａｖａｌｅｔｔｉら、（１９９５）Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １３３：６４−７２）を挙げることができる。炎症性疼痛の普遍的に研究されるげっ歯類モデルは：フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）誘発性炎症モデル、実験的熱傷モデル、カラギーナン炎症性痛覚過敏モデル、ホルマリン試験、ならびにラットの炎症を起こされた膝および足関節モデルを包含する。
薬理学的および他の介入に対する疼痛および治療応答の評価は、挙動的および電気生理学的評価を包含する多様な方法でなされ、後者は「代理」結果を提供する。「代理」評価は、生理学的知見を挙動と相互に関係づけることを試みる。最良に研究された代理応答は、１）一次求心性ニューロン、および２）脊髄の後角の脊髄視床路ニューロンの電気生理学的応答などがある。
１．２種の完全長のヒトＨＣＮペースメーカーチャンネルｃＤＮＡを単離しかつ特徴づけした。
２種の完全長のヒトＨＣＮペースメーカーｃＮＤＡ配列（配列番号３（ｈＨＣＮ１）および配列番号９（ｈＨＣＮ３）を、それぞれヒト脊髄ｃＤＮＡおよびヒトマラソン レディ（Ｍａｒａｔｈｏｎ ｒｅａｄｙ）脳ｃＤＮＡから単離かつクローン化した。該２種のＤＮＡ分子はそれぞれ、２種のポリペプチドすなわち配列番号４および配列番号１０をコードする（実施例１）。
われわれは、２種の新たに単離された完全長のヒトＨＣＮペースメーカーｃＤＮＡ配列が、卵母細胞発現系（図１および実施例２）もしくは哺乳動物発現系（図２および実施例３）のいずれかで、機能的ＨＣＮペースメーカーチャンネルを形成するタンパク質産物をコードすることを立証した。
われわれは、その後、類似の配列を単離したことを見出し、そして別の場所に開示した（第Ｗｏ００６３３４９号、同第Ｗｏ０１９０１４２号、同第Ｗｏ０２０２６３０号、同第Ｗｏ０２１２３４０号および同第Ｗｏ９９３２６１５号明細書を参照されたい）。
２．ＨＣＮチャンネルの特異的遮断は、動物ニューロパシー性疼痛モデルにおける傷害された一次求心の自発発火および触覚性異痛症を抑制した。
われわれは、対照、または以前に結紮されたＬ４もしくはＬ５（ＳＮＬ）が興奮された神経−ＤＲＧ調製物中の末梢神経線維に対する細胞外記録をインビトロで実施した（実施例４）。自発放電が、傷害後１ないし３週に、ＤＲＧ中のＡα／βニューロンおよび若干のＡδニューロン（それらの伝導速度により区別される）から生じた（図３）。自発活動電位は律動性である傾向があった。Ａβ線維からの放電は、延長された観察期間の持続時間の間、Ｉｈ電流の特異的遮断薬である（ＢｏＳｍｉｔｈら、（１９９３）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １１０：３４３−９）１００μＭのＺＤ７２８８の浴適用（ｂａｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）により完全に抑制されたが、しかし、ＨＣＮチャンネルファミリーメンバー間で選択性を有しなかった（図３ａ、図４）。線維の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）（Ａβ、Ａδ）は、データ収集後に、惹起された活動電位により決定し；自発放電の抑制と区別して、ＺＤ７２８８の適用後に観察された惹起された活動電位の伝導遮断は存在しなかった。従って、これらのデータは、（１）Ｉｈは傷害された一次求心の自発発火の生成に決定的に重要である、および（２）Ｉｈの遮断は自発活動のみを抑制するが、しかし、ニューロン伝導の全身性（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ）障害（もしくは神経ブロック）を引き起こさないことを具体的に説明する。
われわれはまた、動物挙動研究においてＩｈの役割も試験した。異痛症、もしくは触覚に対する病理学的感受性は、ニューロパシーの症状の最もやっかいなもののひとつであり、そして、刺激に対する大型有髄知覚線維（Ａβ）の異常な応答から生じると考えられる。本発明において、われわれは、ＳＮＬ（一側Ｌ５／６結紮）モデルを使用して、触覚性異痛症におけるＩｈの役割を研究した（実施例５）。われわれは、ＺＤ７２８８（１０ｍｇ／ｋｇ）が、完全な知覚遮断もしくは無感覚の証拠を伴わず、かつ、挙動に対する明白な有害な影響を伴わず、用量依存性の様式で、覚醒ＳＮＬラットにより表される触覚性異痛症を抑制したことを観察した（図５）。明らかに、Ｉｈは、触覚性異痛症として明示される病理学的ニューロン活動に寄与する。
上述された結果は、Ｉｈが、傷害された一次求心の自発発火の生成に決定的に重要であること、および、Ｉｈの遮断はこうした異常な発火に関連するニューロパシー性疼痛挙動を軽減することを初めて立証した。
３．ＨＣＮチャンネルの特異的遮断は、急性の熱的刺激に対する臨床上関係のある大きさの鎮痛を生じなかった。
ＨＣＮチャンネルの特異的遮断（ＺＤ７２８８）でみられる抗異痛症効果がニューロパシー性疼痛と独立の全身性鎮痛効果であるかどうかを試験するために、ホットプレート試験を実施して、正常ラットで急性の熱的に誘発された疼痛状態に対するＺＤ７２８８の効果を評価した（実施例６）。統計学的有意差は、４５もしくは６０分でＺＤ７２８８および生理的食塩水での処理の間で見られず；統計学的に有意の小さな差異のみが７５分（およそ１５％）で見られた（図６）。
これらの結果は、ＨＣＮチャンネルの特異的遮断が、急性の熱的刺激に対する臨床上関係のある大きさの鎮痛を生じないことを立証する。従って、ＳＮＬモデルでの抗異痛症効果は、知覚機能の全身性障害を表さない。加えて、これらの結果は、ＺＤ７２８８が、認識された有害な刺激に応答するラットの能力を損なわないことを立証し；従って、異痛症の閾値に対するＺＤ７２８８の効果は、運動応答の阻害もしくは認識低下によらない。
４．ＨＣＮチャンネルの特異的遮断は、動物の炎症性疼痛モデルで触覚性異痛症を抑制した。
われわれはまた、ニューロパシー性疼痛と機械的および薬理学的に異なる炎症性疼痛におけるＨＣＮの役割も試験した（実施例７）。ラットの一方の後肢へのフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）の注入後に、動物は、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛を使用して測定されるところの顕著な触覚性異痛症を発症した（基礎、図７）。炎症性疼痛に対し有効であることが既知である薬物、モルヒネに類似に、ＺＤ７２８８は、正常のＣＦＡ注入前レベルに向かっての足の閾値の復帰を引き起こすことにより示されるとおり、ＣＦＡ注入されたラットで異痛症を抑制した（図７）。イブプロフェンもまた若干の有効性を示した。
しかしながら、１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．のＺＤ７２８８でのＨＣＮチャンネルの遮断は、炎症性疼痛の２種の異なるモデル、すなわち、後肢炎症のラットカラギーナンモデル、および後肢炎症のラットのフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）モデルにおいて、（改変されたハーグリーブス（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ）装置を使用して測定される）熱的痛覚過敏に対する影響を有しなかった。上に示されたとおり、ＨＣＮ遮断はまた、ホットプレート試験における急性の熱的に惹起された疼痛に対してもほとんど効果を有しなかった。
われわれのデータは、ＨＣＮチャンネルの特異的遮断が、ニューロパシー性疼痛および炎症性疼痛双方の動物モデルにおいて触覚性異痛症を抑制したとは言え、末梢（例えば皮膚）における侵害受容器感作の存在下でさえ、温度感覚がＩｈ遮断により影響を及ぼされないことを示す。これらの結果は、機械的／触覚感覚と、熱的痛覚過敏を包含する熱的認識との間の薬理学的差異を強調し、また、ＺＤ７２８８の効果は、Ａδ線維（熱に惹起される疼痛の「迅速」成分を変換する原因である）よりもＡβ線維（熱的感覚において役割を演じることが知られていない、機械的／触覚感覚を変換する原因である）に対してずっとより大きいというわれわれの観察結果と矛盾しないようである。われわれの結果は、ＨＣＮチャンネルの特異的遮断が、一般に機械的刺激に応答する疼痛を抑制するのに有効である可能性があることを示唆する。
５．ＨＣＮチャンネルの特異的遮断は、熱傷疼痛の動物モデルにおいて自発性疼痛を抑制した。
われわれはさらに、自発性疼痛におけるＨＣＮチャンネルの役割を試験した（実施例８）。モルヒネおよびＺＤ７２８８双方が、熱傷疼痛の動物モデルにおいて自発性疼痛を抑制した（図８）。有害な挙動的影響は示されなかった。従って、Ｉｈ遮断は、第一度の熱傷により導き出される自発性疼痛に対して高度に有効である。
われわれのデータは、実際の熱的接触からの除去後長く経験される自発的な進行中の熱傷後疼痛が、即座の熱的認識と同一の変換機構に頼らず、そして２つの型の疼痛を薬理学的に識別することができることを示す。熱傷後疼痛は組織損傷の明白な結果であるため、われわれの結果は、熱傷によるような組織損傷が内在するＨＣＮチャンネルの活性化につながることをはっきりと示唆する。
６．ＨＣＮのｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルの特異的測定。
ＤＲＧ中のＨＣＮのｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルは、ＨＣＮのｍＲＮＡもしくはタンパク質を特異的に検出することが可能な化合物もしくは作用物質とＤＲＧを接触させることにより測定される。
ＨＣＮ ｍＲＮＡを検出するための好ましい作用物質は、ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能な標識された核酸プローブである。例えば、ＨＣＮ１ ｍＲＮＡに特異的な核酸プローブは、配列番号３の核酸のような完全長ｃＤＮＡ、または、配列番号３の長さが最低１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチドのかつストリンジェントな条件下でＨＣＮ１ ｍＲＮＡにハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドのようなその一部分であることができる。好ましくは、ＨＣＮ１ ｍＲＮＡに特異的な核酸プローブは、ストリンジェントな条件下で、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３もしくはＨＣＮ４のｍＲＮＡでなく、ＨＣＮ１ ｍＲＮＡにのみハイブリダイズすることができる。
ＨＣＮタンパク質を検出するための好ましい作用物質は、該ポリペプチドに特異的に結合することが可能な抗体、好ましくは検出可能な標識を伴う標識された抗体である。抗体はポリクローナルもしくはモノクローナルであることができる。無傷の抗体またはそのフラグメント（例えばＦａｂもしくはＦ（ａｂ）２）を使用することができる。
核酸プローブもしくは抗体に関しての「標識された」という用語は、プローブもしくは抗体に検出可能な物質を結合（すなわち物理的に連結）することによるプローブもしくは抗体の直接標識、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性によるプローブもしくは抗体の間接的標識を包含することを意図している。間接的標識の例は、蛍光で標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光で標識されたストレプトアビジンでそれを検出することができるようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を包含する。
ＤＲＧ中のＨＣＮのタンパク質およびｍＲＮＡはインビトロならびにインビボでアッセイすることができる。例えば、ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術は、ノーザンハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲを包含する。ポリペプチドの検出のためのインビトロ技術は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光法を包含する。ｍＲＮＡの検出のためのインビボ技術は、下述される転写融合を包含する。加えて、実施例９に記述されるとおり、ＨＣＮのｍＲＮＡもしくはタンパク質は、（特定の亜細胞区画への、ならびに／もしくは神経原線維濃縮体およびアミロイド斑のような疾患と関連した神経病理学的構造内への局在化されたメッセンジャーＲＮＡおよびタンパク質に対する）インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学によってもまたアッセイすることができる。
加えて、陽電子射出断層撮影（ＰＥＴ）画像化のような定量的方法は、生存するヒト脳中のＨＣＮタンパク質の変化の非侵襲的手段による評価を可能にする（Ｓｅｄｖａｌｌ Ｇら（１９８８）、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｅｒ；５：２７−３３）。トレーサー量のＨＣＮに結合する放射トレーサーを被験体に静脈内で注入し、そして、該被験体の脳中の放射標識の分布を画像化することができる。ＰＥＴ画像化の手順は当業者に既知である。
７．ニューロパシー性疼痛の動物モデルの知覚ニューロンにおけるＨＣＮペースメーカーチャンネルの異常な機能。
本発明はさらに、ニューロパシー性疼痛の動物モデルの知覚ニューロンにおけるＨＣＮペースメーカーチャンネルの異常な発現および活性を立証した。
最初に、Ｌ５／６ ＤＲＧ全体での４種のＨＣＮサブタイプのｍＲＮＡレベルの定量的実時間ＰＣＲ（実施例９）比較は、偽手術された（ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｅｄ）ＤＲＧで、転写物の豊富さ（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）の順位がＨＣＮ１＞＞ＨＣＮ２＞ＨＣＮ３、ＨＣ４であったことを示した（図９）。これらの結果は、ＨＣＮ３が検出されなかったマウスＤＲＧ全体で記述された相対的豊富さとわずかに異なる。神経結紮されたラットからのＤＲＧにおいて、われわれは、コーディング配列の３’端に向けられるプライマー対を使用して、ＨＣＮ１ ｍＲＮＡの有意の減少を観察した。注目すべきは、有意な減少がイントロン＃１（Ｌｕｄｗｉｇら、（１９９９）Ｅｍｂｏ Ｊ １８：２３２３−９）を含有する５’領域にわたるプライマー対を使用して観察されなかった。有意の変化はＨＣＮ３およびＨＣＮ４のｍＲＮＡで観察されなかった（図９）。コーディング配列の３’端に向けられる独特のプローブを使用するインサイチューハイブリダイゼーションは、ＨＣＮ１およびＨＣＮ２のｍＲＮＡの減少が全ニューロンにわたって一般化され、かつ、いずれかの特定のニューロン亜集団に限定されなかったことを示した。
第二に、免疫組織化学的分析（実施例９）は、神経傷害後に、検出されたＨＣＮチャンネルタンパク質の量の変化が、ＨＣＮ ｍＲＮＡの量で見られた変化に酷似したことを示した。隣接する１０μｍの切片の免疫組織化学的染色は、ＨＣＮ１、ＨＣＮ２およびＨＣＮ３が優勢に、しかし独占的にでなく、より大型のニューロンのプロフィルの膜領域中に共局在化されたことを示した。ＨＣＮ１のＮもしくはＣいずれかの末端に向けられた２種の異なる抗体は、双方が、神経結紮されたラットからの大型ニューロン中の低下された膜の描写を示した。ＨＣＮ１の免疫反応性の低下はウェスタンブロットにより定量化され、すなわち、チューブリンに対し正規化されたＨＣＮ１のバンド密度の平均は、１６．３±１．７の対照に比較して傷害されたＤＲＧで１０．１±１．１（次元なし、±ＳＥＭ）でより低かった（Ｐ＜．０２、対応のないｔ検定）。ＨＣＮ２の免疫反応性の顕著な低下もまた、ＰＣＲおよびインサイチューのデータと再度歩調を合わせて、対照に比較して傷害されたＤＲＧで明らかであった。ＨＣＮ３の免疫反応性の分布は傷害後の大型ニューロンにおけるより濃い膜近傍の染色を示唆した一方、これらの変化は決定的とみなされるには十分に明瞭でなかった。特異的なＨＣＮ４の免疫反応性は、おそらく低いタンパク質発現レベルにより、対照もしくは傷害されたいずれのＤＲＧでも背景と区別することができなかった。
第三に、解離されたＤＲＧニューロンからの全細胞パッチクランプ記録（実施例１０）は、神経結紮されたニューロンでの、より高いＩｈ電流密度に向かっての移動を示した。われわれは、パッチクランプ法の全細胞構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を使用して、神経結紮された（ＳＮＬ）もしくは偽手術されたラットのＬ５ ＤＲＧからの単一の急性に解離された大型ニューロンにおけるＩｈを比較した。双方の群のほぼ全部の大型ニューロン（直径５０±１μｍ、平均±ＳＥＭ）が、それらの電圧および時間依存性の活性化、ならびにＣｓ＋（３ｍＭ）およびＺＤ２７８８（５０μＭ）に対するそれらの感受性により明示されるとおり、Ｉｈと矛盾しない電流を表した。しかしながら、−１１４ｍＶで測定された電流密度の分布は、２群のニューロン間で顕著に異なった。ＳＮＬ大型Ｌ５ニューロンにおける際だった知見は、約９２％が、対照ニューロン（図１０、斜線を付けられた棒）の約４２％に比較して、４ｐＡ／ｐＦより大きなＩｈを発現した（図１０、黒棒）ような、より高いＩｈ電流密度分布に向かっての移動であった。本明細書で使用されるところの「Ｉｈ電流密度」という用語は、膜キャパシタンス（細胞表面積の尺度）に対し正規化された電流段階（ｖｏｌｔａｇｅ ｓｔｅｐ）により導き出される定常状態の内向き電流を指す。神経傷害後に、低いＩｈ電流密度を有するニューロンの集団は有意に減少し、そして、高い電流密度を表すニューロンの集団が有意に増大した（図１０）。この結果は、傷害されたニューロン中で発現されるＩｈの増大により、そして低発現ニューロンの集団の喪失によらないことがありそうである。この時間点で、ＳＮＬ傷害モデルにおけるＤＲＧ細胞喪失の証拠が存在しないからである（Ｌｅｋａｎら、（１９９７）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８１：５２７−３４）。対照および傷害された神経節からの細胞は細胞の大きさに関して識別不可能であり、そして、従って、電流密度の増大は、解離された神経節調製物で測定されるところの、発現されたＩｈの増大によりかつＳＮＬニューロンの表面積の減少によらなかった。
神経結紮されたニューロンにおけるより高いＩｈ電流密度に向かっての観察された移動は、（例えば、Ｉｈ活性化の電流依存性の移動から生じるとみられるところの）開放確率（ｏｐｅｎ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（ｐｏ）の増大、機能性チャンネルの数の増大、もしくは単一のチャンネルが流す電流の増大を包含する多数のパラメータによる可能性がある。本明細書で使用されるところの「活性化閾値」は電流が最初に検出される電圧を指す。本明細書で使用されるところの「開放確率（ｐｏ）」は、チャンネルが開放の伝導状態にある時間の割合を指す。
実際、われわれは、Ｉｈの活性化閾値が、対照に比較してＳＮＬラットからのＤＲＧ細胞中で有意により正であったことを見出した（実施例１０および図１１）。さらに、われわれは、静止膜電位が、ＳＮＬニューロンの静止電位へのＩｈのより大きな寄与と矛盾せず、−７１．９±１．９ｍＶ（ｎ＝１４）の対照に比較して、−６４．８±１．０ｍＶ（ｎ＝２２；ｐ＜．００５）のＳＮＬニューロンで有意により正であったことを見出した。ＳＮＬ ＤＲＧニューロンが、−１００ｍＶ未満への電圧段階により活性化される場合に活性化のより迅速な動力学を有する傾向が存在した（図１１）。この差異は、より脱分極された値へのＩｈの活性化の閾値の移動に関係することがありそうである。
８．Ｉｈはリドカインにより遮断される。
全身に投与されるリドカインは、かねて、ニューロパシー性疼痛の有用な治療であることが知られている（総説については、［Ｃｈａｐｌａｎ、（１９９７）Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ（Ｂｉｅｂｕｙｃｋ、Ｊ．ら編）レイバン プレス（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク］を参照されたい）。心律動不全に対し安全かつ治療的とみなされる範囲内の血漿薬物濃度を達成するように全身に投与される場合に、リドカインは、ニューロパシー性疼痛状態において特異的抗痛覚過敏活性を示す一方、それは、実験もしくは臨床の急性疼痛状態で全身鎮痛薬として有用であるようでない。抗痛覚過敏活性は正常の知覚機能の遮断を伴わずに選択的に起こり；とりわけ、この効果に必要とされる濃度は、末梢神経の伝導遮断を達成するのに必要な濃度の非常にずっと下である。
これらの同一の選択的抗痛覚過敏効果はニューロパシー性疼痛の前臨床モデルで立証可能である（再度、Ｃｈａｐｌａｎ、１９９７ 上記；また、Ａｂｒａｍら、（１９９４）Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ８０：３８３−３９１；Ｃｈａｐｌａｎら、（１９９５）Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ８３：７７５−７８５を参照されたい）。しかしながら、抗痛覚過敏効果は、前臨床モデルにおいてナトリウムチャンネル遮断化合物の一般的特性でない。すなわち、例えば、リドカインに構造的に類似であるブピバカインはいかなる抗痛覚過敏活性も所有しない［Ｃｈａｐｌａｎ（１９９９）Ｏｐｉｏｉｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｎｏｎ−ｃａｎｃｅｒ ｐａｉｎ（Ｅ．，Ｋ．とＷｉｅｓｅｎｆｅｌｄ−Ｈａｌｌｉｎ，Ｚ．編）（ＩＡＳＰ プレス（ＩＡＳＰ Ｐｒｅｓｓ））］。これらの同一のモデルにおいて、全身に投与されるリドカインは、ＺＤ７２８８についてここで示されるデータに類似の様式で、傷害された末梢神経における異所性発火もまた停止することが詳細に立証されている（Ｄｅｖｏｒら、（１９９２）Ｐａｉｎ ４８：２６１−２６８）。
リドカインは一般にナトリウムチャンネル遮断薬とみなされるため、抗痛覚過敏効果の機械論的基礎は、現在まで、ナトリウムチャンネル遮断に帰されていない。本発明は、リドカインが、急性に解離されたラット後根神経節ニューロンにおけるＩｈを濃度依存性の様式で遮断することを示した（実施例１２および図１２）。この遮断は、リドカインがナトリウムチャンネルを遮断する範囲にほぼ類似である濃度範囲にわたって起こる（Ｇｏｌｄら、（２００１）Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ２９９：７０５−１１．）。リドカインは、異なる調製物、すなわちウサギ洞房結節においてＩｈを遮断することが以前に報告されており（Ｒｏｃｃｈｅｔｔｉら、（１９９９）Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３４：４３４−９．）；以前に報告された３８．２マイクロモル濃度というＥＤ５０は、ここで記述される２３マイクロモル濃度というＥＤ５０に匹敵する。同様に、リドカインの細胞外に制限される四級アミド類似物ＱＸ−３１４は、５もしくは１０ｍＭで細胞内に適用される場合にＩｈを遮断する（Ｐｅｒｋｉｎｓら、（１９９５）Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ７３：９１１−５）。
従って、ニューロパシー性疼痛における全身に投与されるリドカインの治療効果は、ナトリウムチャンネル遮断よりはむしろリドカインによるＨＣＮチャンネルの遮断に完全にもしくは部分的に存するかもしれない。これは、臨床文献における例を伴い、ニューロパシー性疼痛におけるＨＣＮチャンネルに向けられる化合物の有用性に関する潜在性の付加的な立証を提供し、また、加えて、われわれのスクリーニング技術により同定される別のＩｈ遮断化合物の立証を提供する。
本発明は、ＨＣＮペースメーカーチャンネルの異常な機能が、重要なことに痛みを伴う神経傷害後の自発的電気挙動および異常な静止膜電位に寄与することを初めて立証した。ＨＣＮチャンネルの特異的遮断は、神経傷害、炎症および機械的刺激から生じる疼痛、ならびに自発性疼痛を抑制した。ＨＣＮ遮断の効果は、モデル特異的に反して、感覚様相特異的であるようである。例えば、同一の炎症性ＣＦＡ疼痛モデルにおいて、動物にＺＤ７２８８を投与することによるＨＣＮチャンネルの特異的薬理学的遮断は、熱的痛覚過敏に対し影響を有しなかったが、しかし、触覚性異痛症を顕著に抑制した。最も影響を及ぼされる様相は自発性疼痛および触覚性異痛症であり、これらは臨床試験においてニューロパシー性疼痛を伴う患者の２つの最もやっかいな愁訴である。この観察結果は、正常な感覚の全身性喪失を引き起こすことなく疼痛を選択的に停止する薬理学的治療の能力に対する重要な意味を有する。
本発明は、一般に疼痛症候群を支配する病態生理学の全く新たな統合体（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を提供し、これらの障害を予防もしくは治療するための有用な介入に向かって指向された研究を可能にする。類推によって、疼痛として明示される自発活動に至るニューロンの制御不全から得られる洞察は、限定されるものでないが癲癇様障害、精神疾病、心不整脈、耳鳴り、トゥーレット症候群、片側バリスム、舞踏病アテトーシス、睡眠時無呼吸、新生児突然死症候群、過敏性腸症候群および不穏下肢症候群を挙げることができる、異所性もしくは過度の自発的電気活動または自発活動の制御不全を伴う他の障害を解明することができる。
ＨＣＮタンパク質のカルボキシ末端を特異的に結合する抗体
本発明は、ＨＣＮタンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端を特異的に結合する抗体を包含する。本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわち、ＨＣＮポリペプチドのＣ末端のような抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。抗原を特異的に結合する分子は抗原のみを結合するが、しかしサンプル、例えば抗原ポリペプチドを天然に含有する生物学的サンプル中の他の分子を実質的に結合しない。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分の例は、ペプシンのような酵素で抗体を処理することにより生じさせることができるＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメントを包含する。
多様な態様において、本発明の実質的に精製された抗体もしくはそれらのフラグメントは、ヒト、非ヒト、キメラおよび／もしくは人化抗体であることができる。本発明のこうした抗体は、限定されるものでないがヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウマ、ニワトリもしくはウサギ抗体を挙げることができる。加えて、本発明のこうした抗体はポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であることができる。本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」もしくは「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特定のエピトープと免疫反応することが可能なただ１種の抗原結合部位を含有する抗体分子の集団を指す。「ポリクローナル抗体」という用語は、１種以上のエピトープと免疫反応することが可能な本発明のポリペプチド（１種もしくは複数）に対し向けられる抗体を指す。とりわけ好ましいポリクローナル抗体調製物は、本発明のポリペプチド（１種もしくは複数）に対し向けられる抗体のみを含有するものである。
本明細書で使用されるところの「抗原」という用語は、宿主の免疫系を刺激して体液性および／もしくは細胞性の抗原特異的応答をなすことができる１種もしくはそれ以上のエピトープを含有する分子を指す。該用語はまた、「免疫原」とも本明細書で互換性に使用する。
本明細書で使用されるところの「エピトープ」という用語は、特異的抗体分子が結合する抗原もしくはハプテン上の部位を指す。該用語はまた、「抗原決定子」もしくは「抗原決定部位」とも本明細書で互換性に使用する。
本明細書で使用されるところの「ＨＣＮタンパク質のカルボキシ末端」もしくは「ＨＣＮタンパク質のＣ末端」という用語は、遊離のカルボキシル（−ＣＯＯＨ）基を有するＨＣＮタンパク質の末端を含んで成るがしかしＨＣＮタンパク質の６個の膜貫通セグメントを包含しないＨＣＮタンパク質のフラグメントを指す。ＨＣＮタンパク質のＣ末端の例は、最後の膜貫通セグメントと環状ヌクレオチド結合ドメイン（ＣＮＢＤ）との間のリンカー領域、ＣＮＢＤ、ＨＣＮの最後の５０アミノ酸残基を包含する一番端のＣ末端、もしくはそれらの組合せであることができる。
ＨＣＮタンパク質の単離されたＣ末端は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的技術を使用して抗体を生成させるための免疫原として使用することができる。該免疫原は、ＨＣＮタンパク質のＣ末端の最低８（好ましくは２０、３０もしくはそれ以上）アミノ酸残基を含んで成り、そして、該ペプチドに対して生じられた抗体が該タンパク質と特異的免疫複合体を形成するようなタンパク質のエピトープを包含する。抗原性ペプチドにより包含される好ましいエピトープは、該タンパク質の表面上に配置される領域、例えば本発明のタンパク質の親水性領域である。タンパク質上の疎水性もしくは親水性領域は、疎水性プロット形成ソフトウェアプログラムを使用して同定することができる。免疫原は、宿主細胞からの組換え発現、タンパク質の化学合成もしくはインビトロ転写／翻訳のような当業者に既知のタンパク質発現および単離技術を使用して得ることができる。とりわけ好ましい免疫原組成物は、例えば非動物宿主細胞、すなわち細菌宿主細胞から組換え的に発現された免疫原のような他の動物タンパク質を含有しないものである。
ポリクローナル抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどのような適する被験体動物を免疫化することにより生じさせることができ、ウサギが好ましい。免疫前血清を最初の免疫感作前に収集する。各動物は、免疫アジュバントとともにもしくは伴わずにのいずれかで、約０．００１ｍｇと約１０００ｍｇとの間の免疫原を受領する。許容できるアジュバントは、限定されるものでないが、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈殿物、コリネバクテリウム パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）およびｔＲＮＡを含有する油中水型乳剤を挙げることができる。初期免疫感作は、好ましくは、皮下で（ＳＣ）、腹腔内に（ＩＰ）もしくは双方のいずれかで複数の部位でのフロイントの完全アジュバント中のポリペプチドよりなる。各動物は、抗体力価を測定するために定期的間隔で、好ましくは毎週採血する。動物は、初期免疫感作後に追加抗原刺激の注入を受領してももしくはしなくてもよい。追加抗原刺激の注入を受領する動物は、一般に、フロイントの不完全アジュバント中の等量の抗原を同一経路により投与される。追加抗原刺激の注入は最大力価が得られるまで約３週間間隔で投与する。各追加抗原刺激免疫感作後約７日に、もしくは単回免疫感作後ほぼ毎週、動物を採血し、血清を収集し、そしてアリコートを約−２０℃で保存する。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、免疫原で近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃを免疫化することにより調製する。マウスは、上で論考されたところの等容量の許容できるアジュバント中に組込まれた約０．１ｍｌの緩衝液もしくは生理的食塩水中の約０．００１ｍｇないし約１．０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇのＨＣＮのＣ末端ポリペプチドで、ＩＰもしくはＳＣ経路により免疫化する。フロイントのアジュバントが好ましく、フロイントの完全アジュバントを初期免疫感作に使用し、そしてフロイントの不完全アジュバントをその後使用する。マウスは第０日に初期免疫感作を受領し、そして約２ないし約３０週間休ませる。免疫化されたマウスに、リン酸緩衝生理的食塩水のような緩衝溶液中の約０．００１ないし約１．０ｍｇの免疫原の１回もしくはそれ以上の追加抗原刺激免疫感作を静脈内（ＩＶ）経路により投与する。抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾リンパ球を、当該技術分野で既知の標準的手順により免疫化されたマウスから脾を除去することにより得る。ハイブリドーマ細胞を、安定なハイブリドーマの形成を可能にすることができる条件下で、脾リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と混合することにより生じさせる。融合パートナーは、限定されるものでないが：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０を挙げることができ、Ｓｐ２／０が一般に好ましい。抗体産生細胞および骨髄腫細胞は、約３０％から約５０％までの濃度のポリエチレングリコール（分子量約１０００）中で融合させる。融合されたハイブリドーマ細胞を、当該技術分野で既知の手順により、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での成長により選択する。上清液を、約第１４、１８および２１日に成長陽性のウェルから収集し、そして、抗原として本発明のポリペプチドを使用する固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより抗体産生についてスクリーニングする。培養液はまた、ｍＡｂのアイソタイプを決定するためにオークターロニー沈降アッセイでも試験する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎのソフトアガー技術（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＫｒｕｓｅとＰａｔｅｒｓｏｎ編、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９７３中Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、もしくは制限希釈の技術）のような技術によりクローン化する。
モノクローナル抗体は、プライミング後最低約４日に、約１×１０６ないし約６×１０６個のハイブリドーマ細胞を用いるプリスタンプライミングされたＢａｌｂ／ｃマウスの注入（マウスあたりおよそ０．５ｍｌ）によりインビボで産生させることができる。腹水を、細胞移入後およそ８〜１２日で収集し、そしてモノクローナル抗体を当該技術分野で既知の技術により精製する。
モノクローナルＡｂは、当該技術分野で公知の組織培地中でハイブリドーマを成長させることにより、インビトロでもまた製造することができる。高密度のインビトロ細胞培養を実施して、当該技術分野で公知の中空線維培養技術、エアリフトリアクター、ローラーボトル、もしくはスピナーフラスコ培養技術を使用して大量のｍＡｂを製造してよい。ｍＡｂは当該技術分野で既知の技術により精製する。
腹水もしくはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、限定されるものでないが、沈降法、受動凝集法、酵素免疫抗体（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を挙げることができる多様な血清学的もしくは免疫学的アッセイにより測定する。抗体分子は、哺乳動物（例えば血液から）もしくは培養物細胞から単離することができ、そしてＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製することができる。あるいは、例えばアフィニティークロマトグラフィーによる（例えば部分的に精製）もしくは精製を選択することができるか、例えば、本発明の組換え的に発現されかつ精製（もしくは部分的に精製）された免疫原を、本明細書に記述されるとおり製造し、そして例えばクロマトグラフィーカラムのような固体支持体に共有もしくは非共有結合する。その後、該カラムを使用して、多数の異なるエピトープに対し向けられた抗体を含有するサンプルから本発明のタンパク質に特異的な抗体を親和性精製することができ、それにより、実質的に精製された抗体組成物、すなわち汚染する抗体を実質的に含まないものを生じさせる。実質的に精製された抗体組成物により、この情況において、抗体サンプルが、せいぜい３０％のみ（乾燥重量で）の本発明の免疫原上のもの以外のエピトープに対し向けられた汚染する抗体を含有し、そして、好ましくはせいぜい２０％、なおより好ましくはせいぜい１０％、および最も好ましくはせいぜい５％（乾燥重量で）のサンプルが汚染する抗体であることを意味している。精製された抗体組成物は、組成物中の抗体の最低９９％が本発明の所望の免疫原に対し向けられることを意味している。
加えて、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができるヒトおよび非ヒト双方の部分を含んで成るキメラおよび人化モノクローナル抗体のような組換え抗体は、本発明の範囲内にある。キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有するもののような、異なる部分が異なる動物種由来である分子である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号明細書を参照されたい）。人化抗体は、非ヒト種からの１種もしくはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からの枠組み領域を有する非ヒト種からの抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書を参照されたい）。こうしたキメラおよび人化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により、例えばＰＣＴ公開第ＷＯ ８７／０２６７１号明細書；欧州特許出願第１８４，１８７号明細書；ＰＣＴ公開第ＷＯ ８６／０１５３３号明細書；および米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記述される方法を使用して、製造することができる。
完全にヒトの抗体が、ヒト患者の治療的治療にとりわけ望ましい。こうした抗体は、例えば、内因性の免疫グロブリンＨおよびＬ鎖遺伝子を発現することが不可能であるがしかしヒトＨおよびＬ鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して製造することができる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば本発明の免疫原で、通常の様式で免疫化する。該抗原に対し向けられるモノクローナル抗体は慣習的ハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスにより持たれるヒト免疫グロブリントランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）が、Ｂ細胞分化の間に再配列し、そしてその後、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。従って、こうした技術を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を製造することが可能である。ヒト抗体を製造するための本技術の概観については、ＬｏｎｂｅｒｇとＨｕｓｚａｒ（（１９９５）、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を製造するための本技術の詳述された論考、ならびにこうした抗体を製造するためのプロトコルについては、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号および同第５，５４５，８０６号明細書を参照されたい。
ＨＣＮに対し向けられた抗体を使用して、アフィニティークロマトグラフィーもしくは免疫沈降法のような標準的技術により、ＨＣＮポリペプチドを単離することができる。さらに、こうした抗体を使用して、ポリペプチドの豊富さおよび発現のパターンを評価するために該タンパク質を（例えば細胞ライセートもしくは細胞上清中で）検出することができる。検出可能な物質を抗体に結合してタンパク質の検出を助長することができる。こうした検出可能な物質は、多様な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質もしくは放射活性物質であることができる。適する酵素の例は、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適する補欠分子団複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適する蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンを包含し；発光物質の一例はルミノールを包含し；生物発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを包含し、そして、適する放射活性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓもしくは３Ｈを包含する。
さらに、本発明の抗体（もしくはそのフラグメント）は、ＨＣＮチャンネルを通る電流の伝導度を阻害することのような所定の生物学的応答を改変するために、治療薬もしくは放射活性金属イオンのような治療部分に結合することができる。治療部分は、古典的な化学的治療薬に制限されるとして解釈されるべきでない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を所有するタンパク質もしくはポリヌクレオチドであってよい。こうした治療部分を抗体に結合するための技術は公知であり、例えば、Ａｍｏｎら、（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６（アラン Ｒ．リス インク（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．））；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、（１９８７）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、ｐｐ．６２３−５３（マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．））；およびＴｈｏｒｐｅら、（１９８２）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９−５８を参照されたい。
ＨＣＮペースメーカーチャンネルに標的を定めることによる疼痛の低下方法
本発明は、ＨＣＮペースメーカーチャンネルに標的を定めることによる、疼痛、好ましくはニューロパシー性疼痛もしくは炎症性疼痛の新たな低下方法を提供する。
本明細書で使用されるところの「疼痛」という用語は、刺激もしくは神経応答に関して記述される疼痛、例えば体性疼痛（有害な刺激に対する正常な神経応答）およびニューロパシー性疼痛（しばしば明瞭な有害な入力を伴わない、傷害されたもしくは変えられた知覚経路の異常な応答）；一時的に分類される疼痛、例えば慢性疼痛および急性疼痛；その重症度に関して分類される疼痛、例えば軽度、中程度、もしくは重度；ならびに疾患状態もしくは症候群の症状もしくは結果である疼痛、例えば炎症性疼痛、癌性疼痛、ＡＩＤＳ性疼痛、関節障害、偏頭痛、三叉神経痛、心虚血および糖尿病性ニューロパシーを包含する疼痛の全部の範疇を指す（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｐｐ．９３−９８（Ｗｉｌｓｏｎら編、第１２版 １９９１）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９９９）Ｊ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．４２：１４８１−１４８５（それぞれそっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。
本明細書で使用されるところの「ニューロパシー性疼痛」は、末梢もしくは中枢の知覚経路の傷害もしくは疾患により誘発される疼痛を指し、ここでは疼痛はしばしば明白な有害な入力を伴わずに発生もしくは持続する。それは、手根管症候群、中枢性疼痛、神経因性疼痛（ＣＲＰＳ）、糖尿病性ニューロパシー、オピオイド耐性疼痛、幻肢痛、乳房摘出後疼痛、視床症候群（有痛知覚消失）、腰部神経根障害；癌関連ニューロパシー、疱疹性神経痛、ＨＩＶ関連ニューロパシー、多発性硬化症、ならびに免疫学的機構、複数の神経伝達物質系の機能不全、神経系限局性虚血および神経毒性により引き起こされる疼痛よりなる群から選択される。
本明細書で使用されるところの「炎症性疼痛」は炎症により誘発される疼痛を指す。こうした型の疼痛は急性もしくは慢性であるかもしれず、そして、制限なしに、日焼け、慢性関節リウマチ、変形性関節症、大腸炎、心炎、皮膚炎、筋炎、神経炎および膠原血管病を包含する炎症を特徴とするいずれかの数の病状によることができる。
本明細書で使用されるところの「被験体」という用語は、治療、観察もしくは実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
本明細書で使用されるところの「対照個体」という用語は、疼痛症候群を有しないものとそれを比較する被験体のものと同一の動物を指す。
「予防上有効な用量」という用語は、研究者、獣医師、医師もしくは他の臨床家により探究されているところの疼痛の発症を被験体において阻害する有効成分もしくは製薬学的作用物質の量を指し、疼痛の遅延はＨＣＮペースメーカーチャンネル活性の調節により媒介される。有効成分もしくは製薬学的作用物質の予防上有効な用量の決定方法は当該技術分野で既知である。
別の局面において、本発明は、被験体の知覚細胞中のＨＣＮペースメーカーチャンネルにより媒介される電流を低下させる治療上有効な用量の組成物を被験体に投与することを含んで成る、それの必要な被験体における疼痛、好ましくはニューロパシー性疼痛もしくは炎症性疼痛の治療方法に関する。
本発明はさらに、モルヒネもしくは他のアヘン製剤受容体アゴニスト；ナルブフィンもしくは他の混合型オピオイドアゴニスト／アンタゴニスト；トラマドール；バクロフェン；クロニジンもしくは他のα−２アドレナリン受容体アゴニスト；アミトリプチリンもしくは他の三環性抗うつ薬；ギャバペンチンもしくはプレギャバリン、カルバマゼピン、フェニトイン、ラモトリジンまたは他の抗痙攣薬；および／あるいはリドカイン、トカイニドもしくは他の局所麻酔薬／抗不整脈薬のような１種もしくはそれ以上の他の鎮痛薬もしくは補助物質とともに、被験体の知覚細胞中のＨＣＮペースメーカーチャンネルにより媒介される電流を低下させる予防上もしくは治療上有効な用量の組成物を被験体に投与することによる、それの必要な被験体における疼痛、好ましくはニューロパシー性疼痛もしくは炎症性疼痛の発症を予防するもしくはそれを治療するための併用療法を提供する。
「治療上有効な用量」という用語は、疼痛の所望の低下を生じさせる単独のもしくは他の鎮痛薬と一緒の有効組成物の量を指す。被験体の知覚ニューロンからのＩｈのより高い電流密度を特徴とする病状を治療する場合には、疼痛の所望の低下は、疼痛に苦しめられていない対照個体で見出される正常範囲内であるレベルまでの、被験体の知覚ニューロンからのＩｈの低下された電流密度を伴う。
本明細書で使用されるところの「組成物」という用語は、指定された量の指定された成分を含んで成る生成物、ならびに、指定された量の指定された成分の組合せから直接もしくは間接的に生じられるいずれかの生成物を包含することを意図しているが、但し、指定された量の指定された成分は、それの必要な被験体における疼痛、好ましくはニューロパシー性疼痛もしくは炎症性疼痛の治療方法で以前に使用されていない。例えば、本明細書で使用されるところの「組成物」という用語は、以前に疼痛の治療方法で使用されていた、化合物リドカイン、クロニジン、およびＨＣＮのいずれかの他の阻害剤を包含しない。ＨＣＮの「阻害剤」という用語は下で定義する。
一態様において、本発明は、例えば被験体の知覚細胞中の孔を封鎖すること、非伝導状態を安定化すること、もしくはＩｈ活性化の電圧依存性を移動させることにより、ＨＣＮチャンネルの開放確率を低下させる治療上有効な用量の組成物を被験体に投与することによる、それの必要な被験体における疼痛、好ましくはニューロパシー性疼痛もしくは炎症性疼痛の治療方法を提供する。好ましくは、該組成物はチャンネルを通る電流の流れを遮断するか、もしくは、知覚ニューロン中のＨＣＮペースメーカーチャンネルの活性化閾値をより負の電位に向かって移動させる。こうした化合物の一例はＺＤ７２８８であり；他者は下述される方法により同定することができる。
別の態様において、本発明は、被験体の知覚細胞中のＨＣＮチャンネルのイオン伝導度を低下させる治療上有効な用量の組成物を被験体に投与することによる、それの必要な被験体における疼痛、好ましくはニューロパシー性疼痛もしくは炎症性疼痛の治療方法を提供する。こうした組成物の例は、限定されるものでないが、ＺＤ７２８８、ＺＭ−２２７１８９（アストラ ゼネカ（Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ））、ザテブラジン（Ｚａｔｅｂｒａｄｉｎｅ）、ＤＫ−ＡＨ２６８、アリニジン（ベーリンガー インゲルハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ））、イバブラジン（Ｓｅｒｖｉｅｒ）を挙げることができる。単一のＨＣＮチャンネルの伝導度を低下させるより多くの化合物を、下述される方法を使用して同定することができる。
なお別の態様において、本発明は、被験体の知覚細胞中の機能的ＨＣＮチャンネルの数を減少させる治療上有効な用量の組成物を被験体に投与することによる、それの必要な被験体における疼痛、好ましくはニューロパシー性疼痛もしくは炎症性疼痛の治療方法を提供する。好ましくは、該方法は、被験体の知覚細胞中のＨＣＮペースメーカータンパク質の発現を低下させる組成物を必要とする。こうした組成物の例は、ＨＣＮの転写もしくは翻訳を抑制する化合物を包含し、これらは下述される方法により同定することができる。加えて、アンチセンス核酸もしくは短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）もまた、遺伝子治療によりＨＣＮペースメーカータンパク質の発現を低下させるのに使用することができる。
本発明は、被験体の知覚細胞中のＨＣＮペースメーカータンパク質の発現を低下させることによるアンチセンス核酸もしくはｓｉＲＮＡに基づく戦略に従う。アンチセンス核酸戦略の原理は、遺伝子発現の配列特異的抑制はｍＲＮＡと相補的アンチセンス種との間の細胞内ハイブリダイゼーションにより達成することができるという仮説に基づく。ハイブリッドのＲＮＡ二重鎖の形成が、その後、標的ＨＣＮ ｍＲＮＡのプロセシング／輸送／翻訳および／もしくは安定性を妨害するかもしれない。ハイブリダイゼーションはアンチセンス効果が起こるために必要とされる。アンチセンス戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡの注入およびアンチセンスＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクションを包含する多様なアプローチを使用してよい。アンチセンス効果により誘導される表現型効果は、タンパク質レベル、タンパク質活性の測定値および標的ｍＲＮＡレベルのような基準の変化に基づく。
アンチセンス核酸は、ＨＣＮペースメーカー遺伝子のコーディング鎖全体もしくはその一部分のみに相補的であることができる。アンチセンス核酸分子はまた、ＨＣＮペースメーカー遺伝子のコーディング鎖の非コーディング領域の全部もしくは一部にも相補的であることができる。非コーディング領域（「５’および３’非翻訳領域」）は、コーディング領域に隣接しかつアミノ酸に翻訳されない５’および３’配列である。好ましくは、非コーディング領域は、ＨＣＮペースメーカーチャンネル遺伝子の転写もしくは翻訳の調節領域である。「調節領域」もしくは「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子（例えばポリアデニル酸化シグナル、およびリボソーム結合部位（細菌発現のための）ならびにオペレーター）を包含することを意図している。こうした調節配列は記述され、そして当業者に既知の多様な方法を使用して容易に決定することができる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）中を参照されたい）。調節配列は、多くの型の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、およびある宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば組織特異的調節配列）を包含する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ヒトＨＣＮ１（配列番号３）、ヒトＨＣＮ２（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号：ＮＭ＿００１１９４）、ヒトＨＣＮ３（配列番号９）もしくはヒトＨＣＮ４（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号：ＮＭ＿００５４７７）のヌクレオチド配列に相補的である、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであることができる。アンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手順を使用する化学合成および酵素的連結反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または該分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された多様に改変されたヌクレオチドを使用して化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を生成させるために使用することができる改変されたヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシトネチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｉ−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、．５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを包含する。アンチセンス核酸分子はＣＣ−アノマー核酸分子であることができる。ＣＣ−アノマー核酸分子は相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、その中で鎖が相互に平行に走る（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）もしくはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似物（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）も含むことができる。
あるいは、アンチセンス核酸はまた、核酸がアンチセンスの向きにサブクローニングされている発現ベクターを使用して生物学的に製造することもできる（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは目的の標的核酸に対しアンチセンスの向きのものであることができる）。すなわち、ＤＮＡ分子は、ＨＣＮペースメーカータンパク質をコードするｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を見込む様式で、調節配列に操作可能に連結される。多様な細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の継続的発現を指図する、アンチセンスの向きにクローン化された核酸に操作可能に連結される調節配列、例えばウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサーを選ぶことができるか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的もしくは細胞型特異的発現を指図する調節配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、高効率調節領域の制御下にアンチセンス核酸が生じられる組換えプラスミド、ファージミドもしくは弱毒化ウイルスの形態にあることができ、その活性はベクターが導入される細胞型により決定されることができる。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら（（１９８６）、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１））を参照されたい。
それらがＨＣＮタンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするかもしくはそれらに結合して、それにより、例えば転写および／もしくは翻訳を阻害することにより該タンパク質の発現を阻害するような本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には被験体に投与されるかもしくはインサイチューで生成される。該ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための慣習的ヌクレオチド相補性、もしくは、例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝中での特異的相互作用によることができる。アンチセンス核酸分子は、無傷の血液脳関門による中枢神経系（ＣＮＳ）からのそれらの排除を回避するために、直接注入、または、損傷を受けた組織もしくは細胞の近傍への外科的埋込を介して被験体に投与することができる。直接注入もしくは埋込によるＣＮＳへの核酸分子の成功裏の送達は報告されている（例えば、Ｏｔｔｏら、（１９８９）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２２：８３−９１；Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第６版、ｐｐ ２４４；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９２３１−９２３５；およびＯｒｉｔｚら、（１９９０）、Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓ．３８６：１８を参照されたい）。
あるいは、アンチセンス核酸分子を、選択された細胞に標的を定めるように改変し、そしてその後全身に投与することができる。例えば、全身投与のために、それらが例えば細胞表面の受容体もしくは抗原に結合するペプチドもしくは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することにより選択された細胞表面上で発現された受容体もしくは抗原に特異的に結合するようなアンチセンス分子を改変することができる。
アンチセンス核酸分子はまた、該アンチセンス配列を持つ本明細書に記述されるベクターからの発現によりインサイチューでも生成させることができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩもしくはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
好ましい一態様において、それの必要な被験体における疼痛の治療方法は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を必要とする。数種の生物体において、二本鎖ＲＮＡの導入は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）として知られる過程により遺伝子発現を抑制するための強力なツールであることが判明している。多くの生物体は、遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞中に存在する場合にいかなる遺伝子も抑制する（ｓｉｌｅｎｃｅ）機構を所有する。特定の遺伝子の活性を低下させるのにｄｓＲＮＡを使用する技術は、蠕虫、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を使用して最初に開発され、そしてＲＮＡ干渉もしくはＲＮＡｉと命名された（Ｆｉｒｅら、（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１）。ＲＮＡｉは、以来、多くの生物体で有用であることが見出され、また、最近、培養物中の哺乳動物細胞に拡大された（Ｍｏｓｓによる総説、（２００１）、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：Ｒ７７２−５を参照されたい）。
重要な進歩が、ＲＮＡｉが２１〜２５ヌクレオチドの短鎖ＲＮＡの生成を必要とすることが示された場合になされた（Ｈａｍｍｏｎｄら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：２９３−６；Ｚａｍｏｒｅら、（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：２５−３３）。これらの短鎖干渉ＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡは、当初、該過程を開始するより大きなｄｓＲＮＡから生じられるかもしれず、そして徐々に分解される標的ＲＮＡに対し相補的である。ｓｉＲＮＡは、それら自身が各端で短いオーバーハングと二本鎖形成され；それらはガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）として作用して、相補的領域中の標的の単一の切断を指図する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １５：１８８−２００；Ｚａｍｏｒｅら、（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：２５−３３）。
インビトロ系からの長さ２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）のｓｉＲＮＡの製造方法、および細胞もしくは生物体中で遺伝子のｍＲＮＡを干渉するためのｓｉＲＮＡの使用は、第ＷＯ０１７５１６４ Ａ２号明細書に記述され、その内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
ｓｉＲＮＡはまた、安定な発現系を使用して哺乳動物細胞からインビボでも作成することができる。例えば、哺乳動物細胞中での短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成を指図するｐＳＵＰＥＲと命名されたベクター系が最近報告され（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−３．）、そして、その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。
ｐＳＵＰＥＲ上で、Ｈ１−ＲＮＡプロモーターを、遺伝子特異的ターゲッティング配列（同一の配列の逆相補体（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）から短鎖スペーサーにより分離された標的転写物からの１９−ｎｔの配列）および終止シグナルとしての５個のチミジン（Ｔ５）の前にクローン化した。生じる転写物は、それ自身に折り重なり、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Ｌｅｔ−７のものに似た１９塩基対のステム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を形成すると予測される。ループ（短鎖スペーサー）の大きさは、好ましくは９ｂｐである。転写の十分に定義された開始および連続した５個のチミジン（Ｔ５）よりなる終止シグナルを伴うポリアデノシン尾部を欠く短鎖ＲＮＡ転写物が産生された。最も重要なことには、終止部位での転写物の切断は２番目のウリジンの後であり、合成ｓｉＲＮＡの端に似た転写物を生じ、これは２個の３’のオーバーハングするＴもしくはＵヌクレオチドもまた含有する。ｐＳＵＰＥＲから発現されたｓｉＲＮＡは、合成ｓｉＲＮＡと同じくらい効率的に遺伝子発現を低下させる（ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）ことが可能である。
本発明は、（ａ）ＨＣＮ遺伝子のｍＲＮＡの標的を分解に定めるｓｉＲＮＡを細胞もしくは生物体中に導入すること；（ｂ）（ａ）で生じられた細胞もしくは生物体を、該細胞もしくは生物体中でＨＣＮ遺伝子のｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ干渉が起こる条件下で維持すること、の段階を含んで成る、それの必要な被験体における疼痛の治療方法を提供する。ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド合成を介して化学的に、第ＷＯ０１７５１６４号明細書に記述されるものに類似のインビトロ系から、もしくは本明細書に記述されるｐＳＵＰＥＲに類似のインビボの安定な発現ベクターから製造することができる。ｓｉＲＮＡは、本明細書に記述されるアンチセンス核酸のものと同様に投与することができる。
治療の間、組成物の治療上有効な用量は、治療されている特定の病状、該病状の重症度、年齢、身体状態、大きさおよび重量を包含する個々の患者のパラメータ、治療の持続期間、使用されるその特定の作用物質の性質ならびに付随する治療（ある場合）、特定の投与経路、ならびに、保健の専門家の知識および専門知識内の類似の因子に依存することができる。通常の熟練の医師もしくは獣医師は、該病状を治療もしくはその進行を予防するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定かつ処方することができる。毒性を伴わずに有効性を生じる範囲内の薬物の濃度の達成における至適の精度は、標的部位への薬物の利用可能性の動力学に基づくレジメンを必要とする。これは、薬物の分布、平衡および排泄の考慮を必要とする。最大用量、すなわち健全な医学的判断に従った最高の安全用量を使用することが一般に好ましい。しかしながら、患者は、医学的、心理学的もしくは他の理由から、より低用量もしくは耐えられる用量を強く要求するかもしれないことが、当業者により理解されるであろう。
有効組成物の投与の１日投薬量は、１日あたり、患者あたり０．０１から１，０００ｍｇまでの広範な範囲にわたって変動してよい。経口投与のためには、組成物は、好ましくは、治療されるべき患者への投薬量の症候的調節のため、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０および５０．０ミリグラムの有効成分を含有する割線付きもしくは割線なし錠剤の形態で提供する。有効量の薬物を、通常、１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重までの投薬量レベルで供給する。該範囲は、より具体的には、１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重までである。
有利には、本発明の有効成分は単一の１日用量で投与してよいか、もしくは、総１日投薬量を１日２、３もしくは４回の分割された用量で投与することができる。さらに、組成物は、局所で、もしくは、例えば当業者に公知であるところの経皮貼付剤を使用して経皮経路を介して投与することができる。好ましくは、本発明の有効成分は、米国特許第ＵＳ５９１４１３１号明細書に記述されるところの経皮放出速度制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌａｓｅ−ｒａｔｅ）機構により鎮痛治療を生じるために、延長された時間の期間にわたって投与してよい。投薬量はまた、静脈内で、筋肉内注入により、または神経、神経節もしくは脊髄の近傍への注入により投与してもよい。該有効成分はまた、被験体がＨＣＮペースメーカーチャンネルの機能不全に苦しめられているかどうかを評価するための診断試験としても投与してよい。
本発明の有効成分はまた、例えば静脈内注入により外的供給源、もしくは身体内に置かれた化合物の供給源のいずれかからの連続的注入によっても投与してよい。内的供給源は、例えば浸透により継続的に放出される注入されるべき化合物を含有する埋込まれた液溜め、および：（ａ）例えばドデカン酸塩もしくは親油性エステルのような非常にわずかに水溶解性の誘導体の形態の、注入されるべき化合物の油性懸濁物のような液体に基づくか；または（ｂ）注入されるべき化合物の埋込まれた支持体、例えば合成樹脂もしくは蝋性物質の形態の固体であってよい埋込物を包含する。該支持体は、化合物の全部を含有する単一の実体（ｂｏｄｙ）、もしくはそれぞれが送達されるべき化合物の部分を含有する一連のいくつかの実体であってよい。内的供給源中に存在する有効成分の量は、治療上有効な量の該化合物が長い時間の期間にわたって送達されるようであるべきである。
本明細書に開示される有効組成物は、いかなる潜在的毒性も最小限にしつつ疼痛の至適の治療を得るために、慣例の試験により定義された適切な投薬量で単独で使用してよい。加えて、上述された他の鎮痛薬の共投与もしくは連続投与が望ましいかもしれない。有効成分が別個の投薬形態にある１種以上の有効成分との併用治療のためには、有効成分を付随して投与することができるか、もしくはそれらをそれぞれ別個のずらされた時間に投与することができる。投与の投薬量は、数種の作用物質を組合せて所望の効果を達成する場合に調節する。これらの多様な作用物質の投薬量は、個別に至適化しかつ相乗的結果を達成するように組合せてよく、ここで、病状は、いずれかの作用物質を単独で使用した場合にそうであるとみられるよりも低下される。
疼痛の治療に有用である化合物の同定。
本発明はさらに、疼痛治療に有用である化合物の効率的な同定方法を提供する。一般に、該方法は：１）ＨＣＮペースメーカータンパク質の発現；２）ＨＣＮペースメーカーチャンネルの開放確率；もしくは３）ＨＣＮペースメーカーチャンネルのイオン伝導度、を増大もしくは減少させる化合物を同定することを必要とする。好ましくは、該方法はさらに、同定された化合物を動物疼痛モデルに投与して疼痛に対するその治療効果を試験することの段階を必要とする。
該化合物同定方法は、慣習的な実験室の形式であることができるか、もしくは高スループットに適合させることができる。「高スループット」という用語は、同時に複数のサンプルの容易なスクリーニング、およびロボット操作の能力を可能にするアッセイ設計を指す。高スループットアッセイの別の望ましい特徴は、所望の分析を達成するために試薬の使用量を低下させるかもしくは操作の数を最小限にするよう至適化されるアッセイ設計である。アッセイ形式の例は、液体を取り扱う実験に使用される９６穴もしくは３８４穴プレート、浮揚液滴（ｌｅｖｉｔａｔｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔ）および「実験室チップ（ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ）」微小チャンネルチップを包含する。プラスチック用金型および液体取り扱い装置の小型化が進歩しているため、もしくは改良されたアッセイ装置が設計されているため、本発明の設計を使用してより多数のサンプルが実施されるかもしれないことが、当業者により公知である。
候補化合物は多数の化学的分類を包含するとは言え、典型的には、それらは有機化合物である。好ましくは、それらは小有機分子、すなわち５０以上しかしなお約２５００未満の分子量を有するものである。候補化合物は、ポリペプチドとの構造的相互作用に必要な官能性化学基を含んで成り、また、典型的には、最低１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、好ましくは該官能性化学基の最低２個、およびより好ましくは該官能性化学基の最低３個を包含する。候補化合物は、上で同定された官能基の１個もしくはそれ以上で置換された環状の炭素もしくは複素環構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含むことができる。候補化合物はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上の誘導体もしくは構造的類似物のような生体分子、またはそれらの組合せなどであることもできる。化合物が核酸である場合、該化合物は典型的にはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であるとは言え、非天然の結合もしくはサブユニットを有する改変された核酸もまた企図している。
候補化合物は、合成もしくは天然の化合物のライブラリーを包含する広範な供給源から得られる。例えば、多数の手段が、無作為化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、無作為ペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを包含する広範な有機化合物および生体分子の無作為および指向された合成に利用可能である。候補化合物はまた：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）を包含する、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることもできる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーが利用可能であるか、もしくは容易に製造される。加えて、天然のおよび合成で製造されるライブラリーおよび化合物は、慣習的な化学的、物理的および生化学的手段により容易に改変することができる。
さらに、既知の薬理学的作用物質を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような指向されたもしくは無作為の化学的改変にかけて該作用物質の構造的類似物を製造してもよい。候補化合物は、無作為に選択することができるか、または、ＨＣＮペースメーカーチャンネルに結合かつ／もしくはその機能を調節する存在する化合物に基づくことができる。例は：ＺＤ７２８８、ＺＭ−２２７１８９（アストラ ゼネカ（Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ））、ザテブラジン（Ｚａｔｅｂｒａｄｉｎｅ）、ＤＫ−ＡＨ２６８、アリニジン（ベーリンガー インゲルハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ））、イバブラジン（Ｓｅｒｖｉｅｒ）、クロニジンおよびリドカインを包含する。従って、候補作用物質の供給源は、既知のＨＣＮペースメーカーチャンネル活性化物質もしくは阻害剤に基づく分子のライブラリーであり、ここで、化合物の構造が、より多いもしくは少ない化学的部分または異なる化学的部分を含有するように該分子の１個もしくはそれ以上の位置で変化される。類似物の活性化物質／阻害剤のライブラリーの創製において該分子になされる構造的変化は、指向された、無作為、または指向されたおよび無作為の置換および／もしくは付加の双方の組合せであることができる。コンビナトリアルライブラリーの製造の当業者は、存在するＨＣＮペースメーカーチャンネルの活性化物質／阻害剤に基づくこうしたライブラリーを容易に製造することができる。
多様な他の試薬もまた混合物中に包含することができる。これらは、至適のタンパク質−タンパク質および／もしくはタンパク質−核酸結合を助長するのに使用してよい、塩、緩衝剤、中性タンパク質（例えばアルブミン）、洗剤などのような試薬を包含する。こうした試薬はまた、反応成分の非特異的もしくは背景の相互作用も低下させるかもしれない。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌薬などのようなアッセイの効率を向上させる他の試薬もまた使用してよい。
１．ＨＣＮペースメーカータンパク質の発現を増大もしくは減少させる化合物を同定する。
本明細書で使用されるところの「ＨＣＮペースメーカータンパク質の発現を増大もしくは減少させる化合物」は、ＨＣＮペースメーカー遺伝子の転写および／もしくは翻訳を増大もしくは減少させる化合物を包含する。本発明は、ＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列もしくは該調節配列に実質的に結合する細胞成分と化合物を接触させること；および、該調節配列により制御される遺伝子の発現に対する該化合物の影響を測定すること、の段階を含んで成る、こうした化合物の同定方法を提供し；ここで、ＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列は宿主細胞内もしくは細胞を含まない系中のいずれかにある。「調節配列」という用語は上で定義されるとおりである。
好ましい一態様において、該方法は、宿主細胞内のＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列を必要とする。細胞に基づくアッセイは：（１）ＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列もしくはＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列に結合する細胞成分を有する細胞と化合物を接触させること；（２）該調節配列により制御されるＨＣＮもしくはレポーター遺伝子の発現に対する該化合物の影響を測定すること；および（３）該化合物の影響を参照対照のものと比較すること、の段階を含んで成る。宿主細胞は天然のＨＣＮ宿主細胞、もしくは組換え宿主細胞であることができる。参照対照は、試験化合物が溶解されるベヒクルのみを含有する。いくつかのアッセイ方法を、細胞の内側のＨＣＮもしくはレポーター遺伝子の発現に対する該化合物の影響を測定するのに使用することができる。例えば、レポーター遺伝子に連結されたＨＣＮペースメーカーの調節配列を含んで成る遺伝子もしくはタンパク質融合物を使用することができる。本明細書で使用されるところの「レポーター遺伝子」は、慣習的な実験室技術を使用して測定することができる遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。こうしたレポーター遺伝子は、限定されるものでないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびグアニンキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。レポーター遺伝子の転写のみがＨＣＮペースメーカーの調節配列の制御下にあるような遺伝子融合物を構築する。該タンパク質融合物は、レポーター遺伝子タンパク質の転写および翻訳双方がＨＣＮペースメーカーの調節配列の制御下にあるように構築する。好ましくは、同一のレポーター遺伝子、しかし異なる調節配列（すなわちＨＣＮペースメーカーファミリーに関係しない遺伝子の調節配列）を含んで成る第二の遺伝子もしくはタンパク質融合物を使用して、アッセイの特異性を増大させることができる。ＧＦＰのようなレポーター遺伝子の発現に対する化合物の影響は、当業者に既知の方法により測定することができる。例えば、ＧＦＰの発現に対する化合物の影響は、蛍光計を使用して、細胞からの緑色蛍光の発射に対する該化合物の影響として測定することができる。あるいは、特徴的な電圧および時間依存性の活性化プロフィル、またはＣｓ＋もしくはＺＤ７２８８に対する感受性の特定の範囲のような、ＨＣＮペースメーカーチャンネルに帰される細胞の表現型もまた、ＨＣＮペースメーカータンパク質の発現に対する化合物の影響を測定するのに使用することができる。加えて、化合物の影響は、上述された方法（すなわちノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットなど）を使用して細胞の内側のＨＣＮもしくはレポーターのｍＲＮＡもしくはタンパク質の量を直接測定することにより、アッセイすることができる。
上述された細胞に基づく方法は、ＨＣＮ遺伝子の調節配列への結合を介して直接ＨＣＮの発現を調節する化合物を同定するのみならずしかしまたその活性がＨＣＮの発現に影響する他の細胞成分への結合を介して間接的にＨＣＮの発現を調節する化合物も同定することに注意されたい。例えば、ＨＣＮ遺伝子の転写の活性化物質もしくは阻害剤の活性を調節する化合物を、本明細書に記述される方法を使用して同定することができる。
別の態様において、本発明は、細胞を含まないアッセイ系中のＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列を必要とする。細胞を含まないアッセイは：（１）細胞を含まない系中で、ＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列、もしくはＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列に結合する細胞成分に化合物を接触させること；（２）該調節配列により制御されるＨＣＮもしくはレポーター遺伝子の発現に対する該化合物の影響を測定すること；および（３）該化合物の影響を参照対照のものと比較すること、の段階を含んで成る。参照対照は、試験化合物が溶解されるベヒクルのみを含有する。細胞を含まないアッセイ系の例は、インビトロ翻訳および／もしくは転写系を包含し、これらは当業者に既知である。例えば、調節配列を包含する完全長のＨＣＮペースメーカーｃＤＮＡをプラスミドにクローン化することができる。その後、この構築物を鋳型として使用して、ＨＣＮペースメーカータンパク質をインビトロ転写および翻訳系中で製造することができる。あるいは、合成のＨＣＮペースメーカーｍＲＮＡ、もしくはＨＣＮペースメーカータンパク質産生細胞から単離されたｍＲＮＡは、限定されるものでないがコムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を挙げることができる多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳することができる。該調節配列により制御されるＨＣＮもしくはレポーター遺伝子の発現に対する化合物の影響は、上述された方法を使用するＨＣＮもしくはレポーターのｍＲＮＡもしくはタンパク質の量の直接測定によりモニターすることができる。
２．ＨＣＮペースメーカーチャンネルの阻害剤もしくは活性化物質の同定方法。
ＨＣＮペースメーカーチャンネルの「阻害剤」もしくは「遮断薬」、「活性化物質」もしくは「開放物質（ｏｐｅｎｅｒ）」、および「調節物質」は、ＨＣＮチャンネル機能のインビトロおよびインビボアッセイを使用して同定される阻害もしくは活性化分子を指す。とりわけ、「阻害剤」もしくは「遮断薬」は、活性化を低下、遮断、予防、遅延、チャンネル活性を不活性化、脱感作もしくはダウンレギュレートする、またはチャンネルの非活性化を加速するもしくは高める化合物を指す。「活性化物質」もしくは「開放物質」は、活性化を増大、開放（ｏｐｅｎ）、活性化、助長する、高める、感作する、もしくはチャンネル活性をアップレギュレートする、または不活性化を遅らせる（ｄｅｌａｙ）もしくは遅くする（ｓｌｏｗ）化合物である。「調節物質」は「阻害剤」および「活性化物質」双方を包含する。
本発明はさらに、ＨＣＮペースメーカーチャンネルの阻害剤もしくは活性化物質の同定方法を提供する。該方法は、ＨＣＮペースメーカーサブユニットと試験化合物を接触させること；およびＨＣＮペースメーカーチャンネルの機能に対する該化合物の影響を測定すること、の段階を含んで成る。
化合物との細胞接触に必要な時間の量は、例えば、ＺＤ７２８８のようなＨＣＮペースメーカー調節物質とともに時間経過を進ませること、および細胞の変化を時間の関数として測定することにより、経験的に決定する。
本明細書で使用されるところの「機能」という用語は、ＨＣＮペースメーカーの特徴的活性の発現を指す。例えば、しかし制限としてでなく、ＨＣＮチャンネルの機能は、該チャンネルにより伝導されるＩｈ電流、該チャンネルの電圧および時間依存性活性化、ならびにＣｓ＋およびＺＤ７２８８に対するチャンネルの感受性により測定されるかもしれない。
多様なアッセイ方法を使用して、ＨＣＮペースメーカーチャンネルの機能に対する化合物の影響を測定することができる。スクリーニング方法のいくつかは、本発明の範囲を制限することなく、実施例１３〜１５で本明細書で具体的に説明する。好ましい一態様において、Ｉｈ電流密度を増大もしくは減少させる化合物は、試験化合物をＨＣＮチャンネルと接触させること、および異なる条件下でパッチクランプ技術もしくは電圧クランプ技術を用いてＩｈ電流を測定することにより、あるいは、放射性同位元素もしくは非放射性同位元素流動アッセイ、または電圧感受性色素を使用する蛍光アッセイでイオンの流れを測定することにより、同定することができる（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄら、（１９８８）、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．，８８：６７−７５；Ｄａｎｉｅｌら、（１９９１）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２５：１８５−１９３；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙら、（１９９４）、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３７：５９−７０を参照されたい）。好ましくは、組換えＨＣＮサブユニットを発現する組換え宿主細胞、組換え宿主細胞から調製された細胞膜、もしくは脂質二重層に組込まれた実質的に精製されたＨＣＮタンパク質を該アッセイに使用する。本明細書で使用されるところの「組換えＨＣＮサブユニット」は、組換えＤＮＡ技術により産生される；すなわちＨＣＮサブユニットをコードする外因性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生されるＨＣＮサブユニットを指す。あるいは、ＤＲＧ細胞のような内因性ＨＣＮチャンネルを発現する天然の宿主細胞、もしくは天然の宿主細胞からの膜タンパク質もまたアッセイに使用することができる。こうしたアッセイ方法に便宜的な試薬は当該技術分野で既知である。例示的アッセイを本明細書で記述する。
阻害の程度を検査するために、ＨＣＮチャンネルを含んで成るサンプルもしくはアッセイを、潜在的活性化物質もしくは阻害剤化合物で処理し、そして試験化合物を含まない対照サンプルと比較する。対照サンプル（試験化合物で処理されない）に１００％の相対的ＨＣＮ活性値を割り当てる。ＨＣＮサブユニットを含んで成るチャンネルの阻害は、対照に関してのＨＣＮ活性値が約７５％、好ましくは５０％、より好ましくは２５〜０％である場合に達成される。ＨＣＮサブユニットを含んで成るチャンネルの活性化は、対照に関してのＨＣＮ活性値が１１０％、より好ましくは１５０％、最も好ましくは最低２００〜５００％より高いまたは１０００％もしくはより高い場合に達成される。
本発明の方法の測定手段は、２種の細胞（ＨＣＮチャンネルサブユニットを含有する一方および同一のクローンから発するがしかしＨＣＮチャンネルサブユニットを欠く第二の細胞）を比較することによりさらに定義することができる。双方の細胞を同一の試験化合物と接触させた後に、２種の細胞間のＨＣＮ活性の差異を比較する。この技術はまた、これらのアッセイの背景ノイズの確立においても有用である。当業者は、これらの対照機構が、機能的ＨＣＮチャンネルの調節に応答する細胞の変化の容易な選択もまた可能にすることを認識するであろう。
「細胞」という用語は最低１個の細胞を指すが、しかし、検出方法の感度に適切な複数の細胞を包含する。本発明に適する細胞は、細菌、酵母もしくは真核生物であるかもしれない。
別の好ましい態様において、結合アッセイを使用して、ＨＣＮサブユニットに結合しそしてこうしたＨＣＮサブユニットを含んで成るＨＣＮチャンネルの機能を潜在的に阻害もしくは活性化することが可能である化合物を同定することができる。例示的一方法は：（ａ）放射活性のＺＤ７２８８のようなＨＣＮサブユニットの標識されたリガンドおよび試験化合物とともにＨＣＮサブユニットをインキュベートすることであって、そしてここで該接触は標識されたリガンドがＨＣＮサブユニットへの平衡結合に達することを可能にするのに十分な時間の間であり；（ｂ）結合されない標識されたリガンドからＨＣＮサブユニットを分離すること；ならびに（ｃ）ＨＣＮサブユニットへの標識されたリガンドの結合の量の減少により、該サブユニットへのリガンド結合を阻害する化合物を同定すること、の段階を含んで成る。好ましくは、ＨＣＮサブユニットを発現するＨＣＮ宿主細胞（組換えもしくは天然）を結合アッセイに使用することができる。より好ましくは、ＨＣＮ宿主細胞から調製された膜を結合アッセイに使用することができる。さらに好ましくは、実質的に精製されたＨＣＮサブユニットタンパク質を結合アッセイに使用することができる。
本明細書で使用されるところの「実質的に精製された」という用語は、該タンパク質もしくはその生物学的に活性の部分が、該タンパク質が由来する細胞もしくは組織供給源からの細胞性物質もしくは他の汚染するタンパク質を実質的に含まない、または、化学的に合成される場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないことを意味する。「細胞性物質を実質的に含まない」という専門語は、該タンパク質が、それが単離もしくは組換え的に産生される細胞の細胞成分から分離されているタンパク質の調製物を包含する。従って、細胞性物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％もしくは５％（乾燥重量で）未満の異種タンパク質（本明細書で「汚染するタンパク質」ともまた称される）を有するタンパク質の調製物を包含する。該タンパク質もしくはその生物学的に活性の部分が組換え的に産生される場合、それはまた、好ましくは、培地を実質的に含まない。すなわち、培地は該タンパク質調製物の容量の約２０％、１０％もしくは５％未満に相当する。該タンパク質を化学合成により製造する場合、それは、好ましくは、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。すなわち、それは、該タンパク質の合成に関与する化学的前駆物質もしくは他の化学物質から分離されている。従って、該タンパク質のこうした調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満の、目的のポリペプチド以外の化学的前駆物質もしくは化合物を有する。
結合されない標識されたリガンドからのＨＣＮサブユニットの分離は多様な方法で達成することができる。便宜的には、成分の最低１種を固体支持体上に固定し、それから結合されない成分が容易に分離されるかもしれない。該固体支持体は、広範な材料から、および広範な形状、例えばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子などで作成することができる。該支持体は、好ましくは、主として背景結合を最小限にするために、ならびに分離の容易さおよび費用のために、Ｓ／Ｎ比を最大化するように選ぶ。
分離は、例えばビーズもしくはディップスティックを液溜めから取り出すこと、マイクロタイタープレートのウェルのような液溜めを空にするもしくは希釈すること、またはビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラムもしくはフィルターを洗浄溶液もしくは溶媒ですすぐことにより遂げられるかもしれない。分離段階は、好ましくは複数回のすすぎもしくは洗浄を包含する。例えば、固体支持体がマイクロタイタープレートである場合、ウェルは、塩、緩衝液、洗剤、非特異的タンパク質などのような特異的結合に参画しないインキュベーション混合物の成分を典型的に包含する洗浄溶液で数回洗浄されるかもしれない。固体支持体が磁性ビーズである場合、該ビーズは、洗浄溶液で１回もしくはそれ以上洗浄され、そして磁石を使用して単離されるかもしれない。
直接検出（例えば放射活性、発光、光学もしくは電子密度など）または間接的検出（例えば、ＦＬＡＧエピトープのようなエピトープ標識、ワサビペルオキシダーゼのような酵素標識など）を提供するもののような、広範な標識を使用してＨＣＮリガンドを標識することができる。
標識の性質および他のアッセイ成分に依存する多様な方法を使用して標識が検出されるかもしれない。例えば、標識は、固体支持体に結合されている間、もしくは固体支持体からの分離の後に検出してよい。標識は、光学もしくは電子密度、放射活性放射、非放射性エネルギー伝達などにより直接検出されるか、または、抗体複合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、ストレプトアビジン−ビオチン複合物などで間接的に検出されるかもしれない。標識の検出方法は当該技術分野で公知である。
ＨＣＮペースメーカーチャンネルを通るイオンの流れを増大もしくは減少させる化合物を同定するためのなお別のアッセイは、「仮想遺伝学」を必要とする。その方法は第ＷＯ ９８／１１１３９号明細書に記述され、かつ、本明細書に完全に組み込まれる。
以下の実施例はしかしながらそれにそれを制限することなく本発明を具体的に説明する。
ヒトＨＣＮ１およびＨＣＮ３ ｃＤＮＡのクローニング
１．ヒトＨＣＮ１ ｃＤＮＡのクローニング。
われわれは、部分的ラットＨＣＮ１コーディング領域配列（ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受託ＩＤ ＡＦ１５５１６３）を使用してヒトゲノム草案（ｄｒａｆｔ）配列に質問して、推定のヒトＨＣＮ１の翻訳開始および終止部位を同定した。これらはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のｈｔｇｓ ｃｏｎｔｉｇ番号ＡＣ０１３３８４およびＡＣ０２６６２１内で同定された。２種のプライマー、すなわち配列番号１、５’ＡＣＧ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＧＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＡＧＧ ＡＧＧ ＣＧＧ ＣＡＡ ＧＣＣ ＣＡＡ Ｃ３’、および配列番号２、５’ＡＣＧ ＴＡＧ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＡＡＡ ＴＴＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＡＡＴ ＣＧＴ ＧＧＣ Ｔ３’を使用して、鋳型としてヒト脊髄ｃＤＮＡを使用してヒトＨＣＮ１のコーディング領域をＰＣＲ増幅した。２．７ｋｂのＰＣＲフラグメントをｐｃＤＮＡ ３．１／Ｚｅｏにクローン化し、そして完全なヒトＨＣＮ１ ｃＤＮＡを配列決定した。完全なヒトＨＣＮ１のヌクレオチド配列を配列番号３に描き、また、ヒトＨＣＮ１タンパク質の推定されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。
２．ヒトＨＣＮ３ ｃＤＮＡのクローニング
われわれは、ラットＨＣＮ３ ｃＤＮＡ配列（＃ＡＦ２４７４５２）を使用してジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ＤＮＡデータベースに質問して、推定のヒトＨＣＮ３ ｃＤＮＡを同定した。ラットＨＣＮ３の３’端に対する高い相同性をもつＫＩＡＡ１５３５タンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡ（ＡＢ０４０９６８）を同定した。２種のプライマー、すなわち配列番号５、５’ＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＧＧＡＡＧＴＧＡＧ３’（ＡＢ０４０９６８から設計された）、および配列番号６、５’ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３’（アダプター）を使用して、鋳型としてヒト脳マラソン−レディ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してヒトＨＣＮ３の５’端をＰＣＲ増幅した。生じるアンプリコンを配列決定してヒトＨＣＮ３の５’端配列を得た。その後、２種のプライマー、すなわち配列番号７：５’ＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧ３’、および配列番号８：５’ＡＣＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＴＴＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣ３’を使用して、完全なヒトＨＣＮ３ ｃＤＮＡを増幅した。生じる２．３ｋｂのＰＣＲフラグメントを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ ３．１／Ｚｅｏ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））および卵母細胞発現ベクターｐＧＥＭＨＥにクローン化し、そして完全なヒトＨＣＮ３ ｃＤＮＡを配列決定した。完全なヒトＨＣＮ３のヌクレオチド配列を配列番号９に描き、また、ヒトＨＣＮ３タンパク質の推定されるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
ヒトＨＣＮ３の２３２５塩基対のヌクレオチド配列は、７７４アミノ酸のポリペプチドをコードする単一の大きな読取り枠を示した。最初の同じ読み枠のメチオニンを、約８６ｋＤａの推定される分子量（Ｍｒ）をもつヒト過分極活性化型陽イオン非選択性の環状ヌクレオチドに調節されるタンパク質を予測する１個の読取り枠の開始コドンとして指摘した。
ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中のＨＣＮ１によりコードされる機能的タンパク質の特徴づけ
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を、以前に記述されかつ当該技術分野で既知の標準的方法［Ｆｒａｓｅｒら（１９９３）．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｄ．Ｉ．Ｗａｌｌｉｓ、オックスフォード大学出版局ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード：６５−８６］を使用して調製かつ注入した。成体雌性アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）（ナスコ（Ｎａｓｃｏ）、ウィンスコンシン州フォートアトキンソン）からの卵巣葉を細かく分離し、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調節された、８２．５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する、公称でＣａを含まない生理的食塩水（ＯＲ−２）で数回すすぎ、そして０．２％コラゲナーゼタイプ１（ＩＣＮ バイオメディカルズ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、オハイオ州オーロラ）を含有するＯＲ−２中で２〜５時間穏やかに振とうした。卵胞層のおよそ５０％が除去された場合に、段階ＶおよびＶＩの卵母細胞を選択し、そして７５％ＯＲ−２および２５％ＮＤ−９６よりなる媒体ですすいだ。ＮＤ−９６は：ＮａＯＨでｐＨ７．０に調節された、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有した。細胞外Ｃａ＋２を徐々に増加させ、そして細胞を注入前２〜２４時間、ＮＤ−９６中で維持した。インビトロ転写のため、ヒトＨＣＮ１を含有するｐＧＥＭ ＨＥ（Ｌｉｍａｎら、（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ ９：８６１−７１）をＮｈｅＩで直鎖状にし、そしてキャップ類似物ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの存在下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて転写した。合成されたｃＲＮＡを酢酸アンモニウムおよびイソプロパノールで沈殿させ、そして５０μｌのヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。ｃＲＮＡを、ホルムアルデヒドゲル（１％アガロース、１×ＭＯＰＳ、３％ホルムアルデヒド）を使用して、１、２および５μｌのＲＮＡマーカー（ギブコ ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））、０．２４〜９．５ｋｂ）に対して定量した。
卵母細胞に５０ｎｌのヒトＨＣＮ１ ＲＮＡ（１〜１０ｎｇ）を注入した。対照卵母細胞は５０ｎｌの水を注入した。卵母細胞を、ヒトＨＣＮ１の発現についての分析前にＮＤ−９６中で２日間インキュベートした。インキュベーションおよびコラゲナーゼ消化は室温で実施した。注入された卵母細胞は、１８℃で４８穴細胞培養クラスター（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）；マサチューセッツ州ケンブリッジ）中で維持した。全細胞電圧活性化電流を、以前に記述されかつ当該技術分野で既知の標準的方法（Ｄａｓｃａｌら、（１９８７）Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ ４０９：５１２−２０）を使用する慣習的な２電極電圧クランプ（ジーンクランプ（ＧｅｎｅＣｌａｍｐ）５００、アクソン インストゥルメンツ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて注入２日後に測定した。約１ＭΩの抵抗を有した微小電極に３Ｍ ＫＣｌを満たした。細胞は室温で約１０ｍｌ／分にてＮＤ９６で連続的に灌流した。膜電圧は、示されない限り−３０ｍＶでクランプした。
卵母細胞を−３０ｍＶの保持電位からの一連の過分極電圧段階で攻撃した。２０ｍＶ間隔で−４０から−１８０ｍＶへの電圧段階（８００ｍｓｅｃの持続時間）を、０．１Ｈｚのサンプリング速度で卵母細胞に適用した。過分極電圧段階は、約−６０ｍＶの閾値を有する内向き電流を活性化した。対照を注入された卵母細胞は、約−１２０ｍＶより下の電位で内向き電流を示さなかったが、しかしながら、内因性の内向き電流は、−１２０ｍＶ近くの閾値を有するＨＣＮおよび対照を注入された卵母細胞双方で活性化された。ＨＣＮ１を注入された卵母細胞において−６０、−８０および−１００ｍＶで観察された内向き電流は、対照卵母細胞で観察された電流より有意により大きかった（ｐ＜０．０５）（図１）。Ｃｓ＋（ＣｓＣｌとしてＮＤ−９６に添加された３ｍＭ）は、ＨＣＮ１を注入された卵母細胞（ｎ＝３）において低い閾値の内向き電流を可逆的に遮断したが、しかしながら、Ｃｓ＋は内因性の電流に対する影響を有しなかった。Ｃｓ＋は、−８０、−１００および−１２０ｍＶに進めること（ｓｔｅｐｐｉｎｇ）によりＩｈが惹起された場合にＨＣＮ１電流をそれぞれ９４、９２および９０％遮断した。従って、ＨＣＮ１を注入された卵母細胞は、外的Ｃｓ＋に感受性でありかつＩｈ電流と一致した、過分極で活性化される内向き電流を発現した。
全細胞パッチクランプによる哺乳動物発現系中のヒトＨＣＮ３サブユニットの機能の特徴づけ
１．ＨＥＫ２９３細胞中での機能的なクローン化されたヒトＨＣＮ３の発現
安定なトランスフェクション：半付着性のコンフルエントな野性型ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞は、移動され、ＨＥＫ培地［ＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、ニューヨーク州グランドアイランド）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋２００倍希釈ペニシリン／ストレプトマイシン］で希釈され、そして３７℃での一夜インキュベーション後に７５％の細胞コンフルエンスを確実にするのに十分な密度で１０ｃｍ皿でプレーティングするまで、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ−４Ｎａの存在下でインキュベートした。トランスフェクションは、製造元のプロトコルに従ってスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州チャッツワース）を使用して実施した。血清を含まないＤＭＥＭ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））で希釈された１０マイクログラムのｈＨＣＮ３−ｐＣＤＮＡ３．１ ＺｅｏプラスミドＤＮＡ（０．３ｍｌの最終容量）および０．０６ｍｌのスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）試薬（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））を含んで成るトランスフェクション混合物を１０秒間ボルテックス攪拌し、そして室温で１０分間インキュベートして、リポソーム／ＤＮＡ複合体形成を助長した。その後、血清を含まないＤＭＥＭ培地で１回洗浄された付着性細胞をトランスフェクション混合物（３ｍｌのＤＭＥＭ培地を補充された）に添加した。３７℃で２時間のインキュベーション後に、トランスフェクション混合物中の細胞を新鮮ＨＥＫ培地中３７℃で一夜成長させた。トランスフェクション４８時間後に細胞を１５ｃｍ培養皿に継代しそしてゼオシン（４００μｇ／ｍｌ）選択（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバード）下で維持し、そして、個々の細胞コロニーを選択しかつＨＣＮ電流の発現について電気生理学的に試験した。
ｈＨＣＮ３プラスミドを含有する細胞クローンのＰＣＲによる確認：過分極で活性化される電流を示すｈＨＣＮ３でトランスフェクトされた細胞系、およびトランスフェクトされないＨＥＫ ２９３細胞を、８０％コンフルエントまで１０ｃｍ培養皿で成長させた。全ＲＮＡを、製造元のプロトコルに従ってトライゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用い細胞から単離した。分光測光的定量後に、トランスフェクトされないおよび潜在的なｈＨＣＮ３を発現するの双方のＨＥＫ２９３細胞から単離された１マイクログラムの全ＲＮＡを、製造元のプロトコルに従ってスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ逆転写酵素（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用いｃＤＮＡに逆転写した。合成されたｃＤＮＡを、１ｍｌあたり１０ナノグラムの最終濃度までポリイノシンを補充されたヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏで５倍希釈し、７０℃で５分間加熱し、そして追加の２分間氷上に置いた。希釈されたｃＤＮＡを、使用者に定義されるプロトコルに従ってライトサイクラー［ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ］（Ｒ）ＰＣＲ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、インジアナ州インジアナポリス）の鋳型として使用した。ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）ＰＣＲで使用されたプライマー配列は、ｈＨＣＮ３のプラスミド由来の転写物の陽性の同定を可能にしならびに可能な内因性のＨＥＫ ２９３ ｈＨＣＮ３発現を示すように選択した。これらのプライマー配列は、配列番号１１、５’ＡＧＣＴＴＣＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＣＡＣＣ３’（ｈＨＣＮ３遺伝子特異的センスオリゴ）、配列番号１２、５’ＡＧＣＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＣＣ３’（ｈＨＣＮ３遺伝子特異的アンチセンスオリゴ）、および配列番号１３、５’ＡＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡ３’（ｐｃＤＮＡ３．１ Ｚｅｏプラスミド特異的アンチセンスオリゴ）を包含した。
ＰＣＲ産物は臭化エチジウムアガロースゲル電気泳動により分画し、そして紫外光下で可視化した。予測される分子量のアンプリコンを、製造元のプロトコルに従ってｐＣＲ４−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターにサブクローニングし、そして配列決定して配列の同一性を確認した。実際、ｈＨＣＮ３遺伝子特異的配列が、安定にトランスフェクトされた細胞から成功裏に増幅かつ同定されたが、しかし対照細胞系からはされなかった。
２．ヒトＨＥＫ２９３細胞系中のヒト過分極活性化型非選択的陽イオンチャンネルＨＣＮ３の特徴づけ。
パッチクランプ：全細胞パッチクランプ技術（Ｈａｍｉｌｌら、（１９８１）Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ ３９１：８５−１００）を使用して、上で得られたヒトＨＣＮ３を安定に発現するＨＥＫ２９３からの電圧で活性化される電流を記録した。トランスフェクトされた細胞を１２ｍｍのカバーガラス上で１日間以上維持した。細胞は、ＤＩＣノマルスキ（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）光学系を伴うニコン ダイアフォト（Ｄｉａｐｈｏｔ）３００を使用して可視化した。細胞は、別の方法で示されない限り、生理学的溶液中で連続的に灌流した（約０．５ｍｌ／分）。使用された標準的生理学的溶液（１Ｃａ タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）（「タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）」））は：１３０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ半（ｈｅｍｉ−）Ｎａ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３、ウェスコール（Ｗｅｓｃｏｒ）５５００蒸気圧（ウェスコール インク（Ｗｅｓｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ユタ州ローガン）を使用して測定されるところの２９５〜３００ｍＯｓｍ）を含有した。記録電極はホウケイ酸キャピラリー管（Ｒ６；ガーナー グラス（Ｇａｒｎｅｒ Ｇｌａｓｓ）、カリフォルニア州クレアモント）から作製し、先端を歯科用辺縁蝋（マイルス ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、インジアナ州サウスベント）で被覆し、そして、以下の細胞内溶液、すなわち１００ｍＭグルコン酸カリウム、２５ｍＭ ＫＣｌ、０．４８３ｍＭ ＣａＣｌ２、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ半Ｎａ−ＨＥＰＥＳおよび１ｍＭ Ｋ４−ＢＡＰＴＡ（１００ｎＭの遊離Ｃａ＋２）；ｐＨ７．４、２９０ｍＯｓｍを達成するようにＤ−ブドウ糖を添加した）を含有する場合に１〜２ＭΩの抵抗を有した。液相界面電位は、経験的におよびコンピュータプログラムＪＰＣａｌｃ（Ｂａｒｒｙ、（１９９４）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５１：１０７−１６）を使用しての双方で決定されるとおり、標準的ピペットおよび浴溶液を使用して−１４ｍＶであった。示された全部の電圧を液相界面電位について補正した。電流および電圧シグナルを検出し、かつアクソパッチ（Ａｘｏｐａｔｃｈ）１Ｄパッチクランプ増幅器（アクソン インストゥルメンツ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ）で２ｋＨｚにてフィルターをかけ（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）、ディジデータ（ＤｉｇｉＤａｔａ）１２００Ｂ実験室インターフェース（アクソン インストゥルメンツ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））およびＰＣ互換性コンピュータ系を用いてディジタルで記録し、そしてオフライン分析のため磁気ディスクに保存した。データ取得および分析はＰＣｌａｍｐソフトウェアを用いて実施した。
パラメータ決定：総膜キャパシタンス（Ｃｍ）を使用して、電流を細胞の大きさに対し正規化した。Ｃｍは、１０ｍＶ／ｍｓの速度で生成される−６４ｍＶからの３０ｍＶの過分極電圧傾斜後の最大電流と、最終電位（−９４ｍＶ）での定常状態の電流との間の差異として決定した（Ｄｕｂｉｎら、（１９９９）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９：１３７１−８１；Ｄｕｂｉｎら、（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：３０７９９−８１０）。Ｉｈはゆっくりと発生するため、電流は、過分極誘発性電流の発生前に定常状態に達した。
全細胞の過分極誘発性電流は、キャパシタンスの（ｃａｐａｃｉｔａｔｉｖｅ）過渡電流の終了時の初期基礎電流と、１〜３秒の電圧段階の終了時の最大の内向き電流との間の差異として決定した。決定された値は、３ｍＭ ＣｓＣｌ（同一細胞中のＩｈを完全に遮断する）により遮断された電流と有意に異ならなかった。膜電位を電圧パルス間で−６４ｍＶに保持し、そして、−６４ｍＶで細胞をクランプするのに必要とされる電流を継続的にモニターした。Ｉｈ活性化のための電圧プロトコルは、Ｉｈを活性化するための一群の電圧段階の前に−５４ｍＶへの段階を包含した。
活性化の動力学を、Ｐｃｌａｍｐ ＣＬＡＭＰＦＩＴソフトウェアパッケージ（アクソン インストゥルメンツ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））の４−ｐｔ平滑化フィルター近似（ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ ｆｉｔ）を用いるＣｈｅｂｙｓｈｅｖを使用して決定した。電流は、２指数近似により最良に記述することができた。
過分極で活性化される伝導度の変化の見かけの逆転電位（Ｖｒｅｖ；電流が存在しなかった電圧）は、電圧傾斜プロトコル（Ｄｕｂｉｎら、（１９９９）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９：１３７１−８１；Ｄｕｂｉｎら、（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：３０７９９−８１０）もしくは尾部（ｔａｉｌ）電流分析のいずれかを使用して測定した。膜電位は電圧パルスの間で−６４ｍＶに保持した。２秒ごとに、膜電位を４５０ｍｓｅｃ間−１６４ｍＶに進めてＩｈをほぼ完全に活性化し、次いで、０．５ｍＶ／ｍｓｅｃの速度で−１６４ｍＶから＋３６ｍＶまで電圧を傾斜させた。生じる全細胞電圧の段階および傾斜誘発性の電流を、３ｍＭ ＣｓＣｌの存在および非存在下でオンラインの漏出差引（ｌｅａｋ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を伴わずに記録した。Ｖｒｅｖは、Ｃｓ感受性電流が０であった電圧（Ｃｓの存在および非存在下で電流と電圧の関係が相互に交差した電圧）、もしくは傾斜誘発性の電流が合併した電圧であった。尾部電流は、Ｉｈを活性化しそしてその後１０ｍＶの増分で−８４ないし−１４ｍＶに進めることにより測定した。尾部電流分析において、Ｖｒｅｖは、非活性化電流が符合を逆転した電圧であった。制御は、−３０およびそれ以上の正への電圧段階により導き出される電流が内因性の外向き電流の活性化により混同されなかったことを示すために、Ｉｈを遮断する細胞外Ｃｓ＋の存在下で行った。この低いＣｓ＋濃度で、内因性の外向きのＫ＋電流に対する影響はほとんどもしくは全く存在せず、また、Ｃｓ＋は、約−４０ｍＶよりさらに負の膜電位で導き出された電流を強く遮断した。
結果：Ｉｈの活性化、動力学および薬理学的特徴を伴う電流が、ヒトＨＣＮ３でトランスフェクトされた細胞系で観察された。これらの電流は対照系統で観察されなかった。過分極電圧パルスは、ＨＣＮ３／ＨＥＫ細胞でゆっくり発生する内向き電流を活性化した（図２）。電流の活性化の閾値は−８７±２ｍＶ（ｎ＝１０）であった。該閾値は試験された５種の独立した細胞系について類似であった。過分極で誘発される内向き電流（「Ｉｈ」）は３ｍＭ ＣｓＣｌにより完全に遮断された。Ｃｓ＋の影響は迅速に可逆的であった。非常に負の電圧で、Ｃｓ＋に感受性でなかったノイズ電流が発生した。特異的アンタゴニストＺＤ７２８８（トクリス クックソン インク（Ｔｏｃｒｉｓ Ｃｏｏｋｓｏｎ Ｉｎｃ）、ミズーリ州ボールウィン）（５０μＭ）は、電流を９８±２％（ｎ＝３）遮断した。遮断のゆっくりした発生は以前の報告と矛盾せず、そして、細胞内の孔前室（ｐｏｒｅ ｖｅｓｔｉｂｕｌｅ）へのＺＤ７２８８の結合によることがありそうであり（Ｓｈｉｎら、（２００１）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ８０：３３７ａ）；ＺＤ７２８８の効果は最低１５分の洗い流し（ｗａｓｈｏｕｔ）期間の間に復帰しなかった。ＺＤ７２８８（５０μＭ）の浴適用に以前に曝露されかつその後洗浄されていた新たな細胞を記録のため選択した場合、３個の細胞のうち３個が検出可能なＩｈを示さなかった一方、以前には試験された６個の細胞のうち６個がＩｈを発現したことが見出された。従って、ＨＣＮ３に媒介される電流はＣｓ＋およびＺＤ７２８８双方に感受性であった。ＨＣＮ３／ＨＥＫ細胞中の過分極で活性化される電流は、文献に報告されかつＫ＋およびＮａ＋双方による媒介と矛盾しないものに類似の逆転電位を有した。尾部電流分析により、Ｖｒｅｖは−４４±４ｍＶ（ｎ＝４）であった。類似の結果が、電圧傾斜プロトコルを使用して測定されたＣｓ＋感受性電流から得られた（−４１±５ｍＶ；ｎ＝３）。
ＨＣＮチャンネルの特異的遮断は動物ニューロパシー性疼痛モデルにおける傷害された一次求心の自発発火を抑制した
体重１２０〜１５０ｇの雄性シュプラグ ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット（ハルラン（Ｈａｒｌａｎ）、インジアナ州インジアナポリス）を実験に使用した。動物は、一定の周囲温度ならびに食物および水への自由な接近を伴い、１２／１２時間の逆転された明暗周期（明周期は午後９時から午前９時までであった）下に、コーンチップの敷きわらを伴うプラスチックケージ中に２匹の群で収容した。
脊髄神経結紮のための外科手術は、Ｌ５およびＬ６の代わりにＬ４およびＬ５の結紮という電気生理学的研究のための改変を伴い、以前に記述された（Ｋｉｍら、（１９９２）Ｐａｉｎ ５０：３５５−３６３）とおり実施し；電気生理学の方法は、以前に公表されかつ下に要約されるとおりであった（Ｌｅｅら、（１９９９）Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ８１：２２２６−３３）。
単一単位記録を、術後第７と２３日との間のある時点でＬ４もしくはＬ５後根神経微細線維から行った。イソフルラン麻酔下で、Ｌ４およびＬ５ ＤＲＧを、後根および脊髄神経と一緒に取り出した。ＤＲＧは、後根に対してＤＲＧおよび脊髄神経の別個の区画をもつインビトロ記録チャンバーに入れた。ＤＲＧ／脊髄神経区画は、４〜５ｍｌ／分の速度の酸素添加された（９５％Ｏ２および５％ＣＯ２）人工的脳脊髄液（ＡＣＳＦ；ｍＭでの組成：ＮａＣｌ １３０、ＫＣｌ ３．５、ＮａＨ２ＰＯ４ １．２５、ＮａＨＣＯ３ ２４、Ｄ−ブドウ糖 １０、ＭｇＣｌ２ １．２、ＣａＣｌ２ １．２、ｐＨ＝７．３）で灌流した。後根区画は鉱物油で満たした。温度は温度制御された水浴により３４±１℃で保った。異所性放電を、細かく分離された後根神経線維束から記録し、また、脊髄神経はタングステン双極（１ｍｍの隙間）電極を使用して刺激した。線維型を、それらの伝導速度に従って分類した。すなわち、＞１４ｍ／秒はＡβ、２〜１４ｍ／秒はＡδ、および＜２ｍ／秒はＣ線維。
細かい微細線維を、単一の自発単位（＞１Ｈｚ）を振幅および波形に基づいて単離することができるまでばらばらにした。ニューロン活動をＡＣ連結増幅器（ＷＰＩ、ＩＳＯ−８０Ａ）で増幅し、そしてその後、出力を窓弁別器（ｗｉｎｄｏｗ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒ）（ＷＰＩ、Ｎ−７５０）に供給した。窓弁別器の出力を使用して、データ取得系（ＣＥＤ−１４０１、スパイク（ｓｐｉｋｅ）２）により、刺激周囲時間ヒストグラム（ｐｅｒｉｓｔｉｍｕｌｕｓ ｔｉｍｅ ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）（ＰＳＴＨ）を構築した。
単位記録は細かく分離された後根線維から行った。自発的に活動性の単位が見出されれば、基礎の活動を最低１０分間記録した。この基礎線の測定の間に活動が安定でなかった（連続的増大もしくは減少）場合は、完全な１０分の安定な活動が記録されるまで基礎期間を延長したか、もしくは該単位を廃棄しかつ別の線維を細かく分離した。基礎線の記録の間に、活動電位をサンプリングし、そして、伝導速度の決定のための記録の終了時の電気的に惹起された活動との比較のため、ディジタルオシロスコープ（テクトロニクス（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ）、）に保存した。安定な基礎線が得られれば、ＡＣＳＦに溶解されたＺＤ７２８８を灌流物に５分間添加した。対照実験のため、ＡＣＳＦをＺＤ７２８８適用と同一経路により５分間適用した。薬物適用を開始した後に、単位活動を３０分間モニターした。伝導速度（ＣＶ）は、電気刺激がしばしば単位の発火パターンを変えたため、実験の終了時に測定した。実験の終了時に、異所性放電は通常はなお存在したとは言え、発火率は低下した。しかしながら、最高用量のＺＤ７２８８（１００μＭ）に曝露された若干の単位は、３０分の観察期間の終了時でなお抑制状態（ｓｉｌｅｎｔ）であった。単位が完全に喪失された場合には、ＣＶは、ディジタルで保存された活動電位を参照することにより測定した。
５分の瓶（ｂｉｎ）の間のスパイクの数を、４０分の期間（１０分の基礎および残存する３０分）にわたって計算した（図３）。各数を、最初の１０分の間の発火頻度からの変化のパーセンテージに変換した（図４）。データは平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表した。統計学的分析は、一元ＡＮＯＶＡ、次いで各時間点でのデュネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）の多重比較により実施した。
ＨＣＮチャンネルの特異的薬理学的遮断はＳＮＬ（チャング（Ｃｈｕｎｇ））モデルでみられるニューロパシー性疼痛挙動を選択的に抑制する。
ＺＤ７２８８（ＢｏＳｍｉｔｈら、（１９９３）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １１０：３４３−９）は、末梢神経（Ｔａｋｉｇａｗａら、（１９９８）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８２：６３１−４）およびＤＲＧニューロン（Ｃａｒｄｅｎａｓら、（１９９９）Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｌｏｎｄ）５１８：５０７−２３；Ｙａｇｉら、（１９９８）Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ８０：１０９４−１０４）においてＩｈを抑制することが報告されている。以前に坐骨神経結紮されたラットからの付属される坐骨神経断片を伴うインビトロＤＲＧ調節物中での反復性活動電位のＺＤ７２８８での抑制もまた最近報告された（Ｙａｇｉら、（２０００）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｐａｉｎ １６：１０９−１１７）。
ＳＮＬ（脊髄神経結紮）モデルの調製：全研究は、カリフォルニア大学サンディエゴ校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）およびＲＷＪＰＲＩの機関の動物管理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）のガイドラインを遵守して実施した。雄性ハルラン シュプラグ−ドーレイ（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（１００〜１５０ｇ）を、１２／１２時間の逆転された明周期（２１時〜９時に明）を伴い、固体底部およびおがくずの敷きわらを伴うケージに収容し、そして食物ペレットおよび水に自由に接近させた。動物は外科的介入後に２匹の群で収容した。外科的ニューロパシーを以下のとおり創製して、チャング（Ｃｈｕｎｇ）モデルともまた普遍的に称されるＳＮＬもしくは脊髄神経結紮モデルと普遍的に称されるモデルを創製した。イソフルラン／酸素麻酔下に、背側正中線切開をおよそＬ３−Ｓ２から行った。鋭的および鈍的剥離の混合物を使用して、左Ｌ６／Ｓ１後方関節内突起を、Ｌ６横突起の十分な可視化を可能にするよう露出かつ切除し、Ｌ６横突起を穏やかに取り出した。下にある筋膜の慎重な細分（ｔｅａｓｉｎｇ）は、椎間孔からのそれらの出現に対し遠位の左Ｌ４およびＬ５脊髄神経を露出させた。該神経を穏やかに分離し、そしてＬ５、およびいくつかの場合にはＬ４（インビトロ電気生理学の記録のため）もしくはＬ６いずれかの神経を６−０絹縫合物質できつく結紮した。その後、創傷を止血について検査し、そして二層で閉鎖した。４ｇより大きい閾値を伴う動物を不成功の調製物とみなした（Ｃｈａｐｌａｎら、（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５３：５５−６３）。この手順のいくつかのバージョンにおいては、Ｌ５およびＬ６双方を結紮することに注意されたいが；しかしながら、Ｌ５の切開もしくは結紮単独での挙動の転帰は、Ｌ５およびＬ６双方の結紮に匹敵することが示されている（Ｋｉｎｎｍａｎら、（１９９５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６４：７５１−６７）。
挙動評価：異痛症の挙動的兆候は以下のとおり報告された。簡潔には、ラットを針金の網状底部つき試験ケージに移し、そして１０〜１５分間順応させた。ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（シュテールティング（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）、イリノイ州ウッドデール）を使用して、Ｃｈａｐｌａｎら（Ｃｈａｐｌａｎら、（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５３：５５−６３）により翻案されたところのＤｉｘｏｎのアップダウン（ｕｐ−ｄｏｗｎ）法（Ｄｉｘｏｎ、（１９８０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２０：４４１−４６２）を使用して、足の引っ込め（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）の５０％機械的閾値を測定した。およそ２．５ｇの曲げ重量（ｂｕｃｋｌｉｎｇ ｗｅｉｇｈｔ）を所有したもので開始する、製造元（シュテールティング（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）、イリノイ州ウッドデール）により３．６１、３．８４、４．０８、４．１７、４．３１、４．５６、４．７４、４．９３、５．１８と呼称される一連の較正されたフィラメントを、フィラメントを曲がらせた圧で左後肢の足底表面に連続して適用した。足の持ち上げ（ｌｉｆｔｉｎｇ）を正の応答として記録し、そして、次に最も軽いフィラメントを次の測定のため選んだ。５秒後の応答の非存在は、増大する重量の次のフィラメントの使用を促した。この規範を、挙動の最初の変化後４回の測定がなされるまで、または、５回の連続する負の（１５ｇの得点を与えられる）もしくは正の（０．３５ｇの得点）得点が生じるまで継続した。正および負の得点の生じる連続を使用して、以前に記述された（Ｃｈａｐｌａｎら、（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５３：５５−６３）とおりに５０％応答閾値を内挿した。
薬物投与：異痛症の基礎線の文書化（ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）後に、生理学的生理的食塩水で希釈されたＺＤ７２８８を、１０、３および１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．でラットの群に投与した。足の閾値を投与０．５、１、２、４および２４時間後に試験した。用量および薬物の効果を比較するために、生の足閾値を、以下の式すなわち％ＭＰＥ＝［薬物後閾値（ｇ）−薬物前異痛症基礎閾値（ｇ）］／［結紮前基礎閾値（ｇ）］−薬物前異痛症基礎閾値（ｇ）］×１００を使用して、最大可能薬物効果のパーセント（％ＭＰＥ）として正規化した。薬物前最大異痛症（基礎）閾値は０％薬物効果（異痛症の抑制がない）を反映すると想定し、また、結紮前閾値は１００％の効果、すなわち足閾値の正常への復帰を引き起こす薬物効果と指定し、結紮前基礎は異痛症の完全な抑制を表すと考えた。
結果：ＺＤ７２８８は、７５．７±１５．４％の有効性およびおよそ３ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を伴い、用量依存性の様式で異痛症応答を抑制した。不利な挙動の影響はみられず；ラットは正常運動機能を有した。図５を参照されたい。
ＺＤ７２８８の抗異痛症効果は無感覚もしくは運動傷害によらず、かつ、ＺＤ７２８８は全身鎮痛薬でない
挙動の評価：急性の熱的に誘発される疼痛状態に対する薬物効果を評価するために、ラットを５５℃の表面上に置き、そして足舐め（ｐａｗ ｌｉｃｋ）までの待ち時間（ｌａｔｅｎｃｙ）を秒で観察することにより、ホットプレート試験を実施した。熱表面曝露の２０秒のカットオフを、組織損傷を予防するために使用した。
薬物投与：正常ラットに、時間０にＺＤ７２８８、１０ｍｇ／ｋｇもしくは同等容量の生理的食塩水をｉ．ｐ．投与した。挙動の評価を、薬物投与後４５、６０および７５分に実施した。
結果：統計学的有意差は、４５もしくは６０分にＺＤ７２８８と生理的食塩水での処理の間で見られず；統計学的に有意のしかし非常に小さな差異が７５分にみられた（およそ１５％）。従って、ＨＣＮチャンネルの特異的遮断は、急性の熱的刺激に対して臨床上関連する大きさの鎮痛を生じず；ＳＮＬモデルにおける抗異痛症効果は選択的である。加えて、これらの結果は、ＺＤ７２８８が認識された有害な刺激に応答するラットの能力を損なわないことを立証し；従って、異痛症の閾値に対するＺＤ７２８８の効果は、運動応答の阻害もしくは認識低下によらない。図６を参照されたい。
ＣＦＡ誘発性の触覚性異痛症はＨＣＮチャンネルの特異的薬理学的遮断により遮断された
体重２３０〜２８０ｇの、合計２５匹の雄性シュプラグ ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット（ハルラン（Ｈａｒｌａｎ）、インジアナ州インジアナポリス）を実験に使用した。動物は、一定の周囲温度ならびに食物および水への自由な接近を伴い、１２／１２時間の逆転された明暗周期（明周期は午後９時から午前９時までであった）下に、コーンチップの敷きわらを伴うプラスチックケージ中に２匹の群で収容した。機械的引っ込め閾値の基礎試験（下を参照されたい）後に、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ；５０％／１００μｌ、生理的食塩水に溶解された、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、米国ミズーリ州セントルイス）を、Ｏ２中イソフルランを用いる気体麻酔下に左後肢の足底表面に注入（ｓ．ｃ．）した。２４時間後に、機械的感受性を、アップダウン法（Ｃｈａｐｌａｎら、１９９４）を使用してｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントに対する５０％足引っ込め閾値の中央値を決定することにより再度測定した。ラットを金属製網状床上のプラスチックカバー（９×９×２０ｃｍ）下に置いた。試験された領域はＣＦＡ注入された後肢の足底表面の足蹠間の中間無毛領域であった。足底領域を、およそ対数の増分の屈曲力を伴う一連の１２種のｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ値：３．６１、３．８０、４．００、４．２０、４．６１、４．８０、５．００、５．２０、５．４０、５．６０、５．８０；０．４１、０．６３、１、１．５８、２．５１、４．０７、６．３１、１０、１５．８、２５．１、３９．８および６３．１ｇに同等）で触れた。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛は、足底表面に対してわずかな屈曲を引き起こすのに十分な力で足底表面に垂直に提示し、そしておよそ２〜３秒間保持した。足の不意の引っ込め（足の縮め（ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ））を応答として記録した。基礎測定直後に、ベヒクル（生理的食塩水）もしくはＺＤ７２８８（１０ｍｇ／ｋｇ）、イブプロフェン（３０ｍｇ／ｋｇ）、モルヒネ（３ｍｇ／ｋｇ）の１種を腹腔内に投与した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を、化合物投与後４時間まで、３０分もしくは１時間ごとに反復した。
ラットの軽度熱的傷害モデルにおける自発性疼痛は、ＨＣＮチャンネルの特異的薬理学的遮断により遮断された。
標準化された第１度熱傷をラットで誘発した（Ｌｏｆｇｒｅｎら、（１９９８）Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ３２：１７３−１７７）。Ｏ２中イソフルラン（４％）の混合物での深い揮発性麻酔下に、足底表面を湿らされたホットプレート（５６℃）の上に２０秒間接触させた間、動物の左後足の背部に８４ｇのおもりを置いた。この熱傷の１０分後に、ベヒクル（生理的食塩水）、モルヒネ（３ｍｇ／ｋｇ）もしくはＺＤ７２８８（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に注入した。
自発性疼痛は、各群で化合物もしくはベヒクル注入０．５および１時間後に評価した。自発性疼痛を評価するために、動物を金属製網状床上の透明なプラスチックカバー下に置いた。１０分を順応に見込んだ。順応後に、足を床から持ち上げた、もしくは防護姿勢を保持した時間の累積量を、上のとおり指定された１０分の間隔の間、測定した。歩行もしくは毛づくろいに関連する足の持ち上げは計数しなかった。３ｍｇ／ｋｇで、自発性の縮めおよび防護のモルヒネの抑制の有効性は約８９．６±２．１％（３０分および６０分の時間点の平均：平均±ＳＥＭ；Ｐ＜．０００１対生理的食塩水、フィッシャーのＰＬＳＤを伴う一元ＡＮＯＶＡ）であった。同様に、ＺＤ７２８８の有効性は約８９．１±１５．７％（ｐ＜．０００１対生理的食塩水、フィッシャーのＰＬＳＤを伴う一元ＡＮＯＶＡ）であった（図８）。
ニューロパシー性疼痛のＳＮＬモデルのＤＲＧにおけるＨＣＮメッセージＲＮＡおよびタンパク質のレベルの変化。
方法：ラットを上で詳述されたところのＳＮＬ（Ｌ５／６）もしくは偽結紮で準備した。挙動試験を上のとおり実施して、ニューロパシーラットにおける異痛症の存在および偽ラットにおける非存在を報告した。
ＲＮＡ定量：外科手術１週間後に全ＲＮＡを各ラットの左Ｌ５／Ｌ６ ＤＲＧから抽出した（ＲＮイージー（ＲＮＥａｓｙ）、キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））。慣習的第一鎖ｃＤＮＡ合成を、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ（ライフ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して収量の１／１０で実施し；生じる調製物の１／１６をＰＣＲ反応による鋳型として使用した。サンプルは、反応あたり１０００倍希釈のＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ（モレキュラー プローブス インク（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を含むキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｔａｑ マスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、ｉサイクラー［ｉＣｙｃｌｅｒ］（Ｒ）（バイオラッド インク（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ．））を使用して同時に分析した。順および逆プライマー（ジェンセット（Ｇｅｎｓｅｔ）、カリフォルニア州ラホヤ）は以下のとおりであった。すなわち、ＨＣＮ１：ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）＃ＡＦ２４７４５０（ＮＭ＿０５３３７５）の塩基３０８−３２９および５４８−５７０；ＨＣＮ２：ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）＃ＡＦ２４７４５１の３３２−３４９および４６４−４９２；ＨＣＮ３：ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）＃ＡＦ２４７４５２（ＮＭ＿０５３６８５）の１４０−１５７および３１８−３３７；ならびにＨＣＮ４：ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）＃ＡＦ２４７４５３の５８９−６１０および７７７−８０５。これらのＰＣＲアンプリコンは、ゲノムＤＮＡの増幅を妨げるように大型のイントロンにわたった。加えて、３’に向けられたプライマー対を使用して、ヌクレオチド２３９１−２４１３および２５８９−２６２０よりなるＨＣＮ１（ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）＃ＡＦ２４７４５０／ＮＭ＿０５３３７５）を研究した。シクロフィリンＡ（ペプチジルプロリル異性化酵素Ａ）を増幅するのに使用されたプライマーは：ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）＃ＮＭ＿０１７１０１の１５７−１８２および４９６−５２１であった。生成物をｐＣＲ（Ｒ）４−ＴＯＰＯベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化しかつ配列決定した。相対蛍光を増幅の対数直線期の間に比較し、また、コピー数はプラスミドの標準希釈に基づき計算した。サンプルは、測定されたシクロフィリンの値を、１００％抽出を表すと想定される実験あたりの測定（回収）されるシクロフィリンの最大量についての値により割ることにより、従ってシクロフィリンの値を１の画分に転換することにより、同時に測定されるシクロフィリンを使用してＲＮＡ抽出効率の差異について正規化した。試験サンプルをその後、それらのそれぞれのシクロフィリン画分により分割した。シクロフィリンの値は、対照とＳＮＬ ＤＲＧとの間で有意に変動しなかった。
インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学：左（傷害された）および右（傷害されない）Ｌ５後根神経節を、同一の低温型（ｃｒｙｏｍｏｌｄ）に埋込み、そして同時に加工した。ジゴキシゲニンに基づく検出系をインサイチューハイブリダイゼーションに使用した（Ｂｒａｉｓｓａｎｔら、（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ １：１０−１６）。ＨＣＮ１、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３およびＨＣＮ４の標識されたアンチセンスおよびセンスｃＲＮＡプローブは、それぞれ、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ２４７４５０（ＮＭ＿０５３３７５）（ＨＣＮ１）、ＡＦ２４７４５１（ＨＣＮ２）、ＡＦ２４７４５２（ＮＭ＿０５３６８５）（ＨＣＮ３）およびＡＦ２４７４５３（ＨＣＮ４）をもつ配列の塩基２３９１−２６０２、１４４８−１８８０、１９０７−２２３２および３４５９−３８１５に対応した。
免疫組織化学のため、固定後切片を５％正常ヤギ血清中でブロッキングし、その後ウサギ抗ＨＣＮ抗体とともに４℃で一夜インキュベートした（抗ＨＣＮ−１、２０００倍；アロモーン ラブス（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）、５００倍；抗ＨＣＮ２、５００倍、アロモーン ラブス（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）；抗ＨＣＮ３ １０００倍）。二次抗体適用後に、切片をベクタステイン エリート ＡＢＣ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ）キット（ベクター ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））で発色させ、そして３，３’−ジアミノベンジジンテトル塩酸塩で可視化した。一次抗体のペプチドもしくは融合タンパク質の前吸収および脱落を陰性対照として実施した。
結果：全Ｌ５／６ ＤＲＧ中の４種のＨＣＮサブタイプのｍＲＮＡレベルの定量的実時間ＰＣＲ比較は、偽手術されたＤＲＧにおいて、転写物の豊富さの順位がＨＣＮ１＞＞ＨＣＮ２＞ＨＣＮ３、ＨＣＮ４であったことを示した。神経結紮されたラットからのＤＲＧにおいて、われわれはＨＣＮ１分子の３’端のアンプリコンの有意の減少を観察したが、しかしＨＣＮ１分子の５’端はしなかった。われわれはまた、ＨＣＮ２ ｍＲＮＡの有意の減少も観察したが、しかしながらＨＣＮ３／４ ｍＲＮＡレベルは変化しなかった（図９）。３’に向けられたプローブ配列を使用するインサイチューハイブリダイゼーションは、ＱＰＣＲ検出されるＨＣＮ１ ｍＲＮＡ（３’端）の減少が、ニューロン中の可視化されたＨＣＮ１メッセージの減少に反映されたことを示した。ＨＣＮ２ ｍＲＮＡの減少が明瞭に見られた。ＨＣＮ１およびＨＣＮ２のメッセージの減少は、いかなる特定のニューロン亜集団にも制限されず、また、ＨＣＮ３の細胞分布は変えられなかった。
隣接する１０μ切片の免疫組織化学的染色は、ＨＣＮ１、２および３が優先的に、しかし独占的にでなく、より大型のニューロンのプロフィルの膜領域に共局在化されることを示した。神経傷害後、免疫反応性の分布の変化は、ｍＲＮＡレベルでみられるものに酷似した。ＨＣＮ１のＣ末端に向けられた抗体は、対照に比較して、神経結紮されたラットからの大型ニューロンにおける低下された膜の描写を示した。Ｎ末端に向けられた抗体もまた、対照に比較して低下されたＨＣＮ１の免疫反応性を示した。ＨＣＮ２の免疫反応性の顕著な低下もまた、ＰＣＲおよびインサイチューのデータと歩調を合わせて、傷害されたＤＲＧにおいて、対照に比較して明白であった。ＨＣＮ３の免疫反応性の分布は傷害後の大型ニューロンにおけるより濃い膜近傍の染色を示唆した一方、これらの変化は決定的とみなされるには十分明瞭でなかった。
偽対照に対するＳＮＬラットにおけるＨＣＮペースメーカーチャンネルの異常な活性
方法：ラットは上のＳＮＬモデル（Ｌ５結紮）に従って準備した。偽ラットは同一に、しかし神経外傷を回避するために横突起の切除を伴わず、かつ神経結紮を伴わず準備した。７日後にラットを頚部脱臼により殺し、そして、同側Ｌ４（結紮なし）およびＬ５ ＤＲＧを、立体顕微鏡下に微細な鉗子を用いて迅速に摘出し、そしてペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を含有する氷冷タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）中に入れた。
ＤＲＧニューロンの解離および培養：ＳＮＬ、偽結紮およびナイーブなラットのＬ５レベル、ならびにＳＮＬラットのＬ４レベルからのＤＲＧを取り出し、そして、解離前に、追加の２ｍＭ Ｃａ＋２を含む氷冷タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ−ブドウ糖、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＮａＯＨで７．４に調節されたｐＨ）（タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ））中で維持した。神経節を、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを含有するタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）中、新たに調製されたコラゲナーゼ／プロテアーゼ溶液（２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、タイプ１Ａ）および１ｍｇ／ｍｌプロテアーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、タイプＸＩＶ））を含有する２４穴組織培養プレートに移して（ウェルあたり１〜２個）神経節を解離させた。酵素中での４５分のインキュベーション（３７℃；５％ＣＯ２）後に、神経節をＲＴで０．５ｍｌタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）溶液中で５回（各洗浄５分間）徹底的に洗浄し；別個のパスツールピペットを各実験条件に使用した。神経節は、１０％ＦＢＳ（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ）、＃ＳＨ３００７０．０３）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）１５０７０−０６３）を補充された１ｍｌのＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）＃１１９６５−０９２）を含有するエッペンドルフチューブに個別に移し、そして、減少する直径の口焼きされたパスツールピペットで細胞の分散を助長するために穏やかに摩砕した。細胞懸濁物（５０〜１００μｌ）を、新たに被覆されたポリ−Ｄ−リシンカバーガラスの中央に滴下し、そして３７度Ｃ（５％ＣＯ２）で３０分インキュベートした。その後、培地（０．５ｍｌ）をウェルに添加した。プレーティング直前に、約５０μｌの滅菌濾過されたポリ−Ｄリシン溶液（３００Ｋ、水中１ｍｇ／ｍｌ）を１２ｍｍの円形＃１カバーガラス（ＶＷＲ）の表面上に広げ、そしてＲＴで１５分後に、水中での徹底的な洗浄により除去した。
パッチクランプ記録：全細胞パッチクランプ技術（Ｈａｍｉｌｌら、（１９８１）Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ ３９１：８５−１００）を使用して、プレーティング後４時間と２日との間に、突起を伴わない円形もしくは楕円形の細胞体をもつ急性に解離されたＤＲＧニューロンからの電圧に活性化される電流を記録した。細胞は、ＤＩＣノマルスキ（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）光学系を伴うニコン ダイアフォト（Ｄｉａｐｈｏｔ）３００を使用して可視化した。細胞を、顕微鏡の接眼鏡中の十字線を使用して、小型（１６〜３１μｍ）、中型（３２〜４２μｍ）もしくは大型（＞４２μｍ）と同定した（Ｖｉｌｌｉｅｒｅら、（１９９６）Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ７６：１９２４−４１）。＞４２μｍの直径をもつ細胞のみをこの試験で包含した。細胞外溶液はタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）であった。記録電極はホウケイ酸キャピラリー管（Ｒ６；ガーナー グラス（Ｇａｒｎｅｒ Ｇｌａｓｓ）、カリフォルニア州クレアモント）から作製し、先端を歯科用辺縁蝋（マイルス ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、インジアナ州サウスベント）で被覆し、そして、以下の細胞内溶液、すなわち１３０ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ半Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰおよび０．１ｍＭ ＥＧＴＡ；ｐＨ７．４、ウェスコール（Ｗｅｓｃｏｒ）５５００蒸気圧（ウェスコール インク（Ｗｅｓｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ユタ州ローガン）を使用して測定されるところの２９０ｍＯｓｍを達成するようにＤ−ブドウ糖を添加した）を含有する場合に、２〜２．５ＭΩの抵抗を有した。ＣｓＣｌ（３ｍＭ）を含有するタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）を、過分極に活性化される電流の阻害を示すために浴適用した。ＺＤ７２８８を、このアンタゴニストに対する電流の感受性を決定するために、５０μＭで適用した。
電流および電圧シグナルを検出し、かつアクソパッチ（Ａｘｏｐａｔｃｈ）１Ｄパッチクランプ増幅器（アクソン インストゥルメンツ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて２ｋＨｚにてフィルターをかけ、ディジデータ（ＤｉｇｉＤａｔａ）１２００Ｂ実験室インターフェース（アクソン インストゥルメンツ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））およびＰＣ互換性コンピュータ系を用いてディジタルで記録し、そしてオフライン分析のため磁気ディスクに保存した。データ取得および分析はＰＣｌａｍｐソフトウェアを用いて実施した。
電流の調節物質を、浴添加により、もしくは細胞２〜３個分の直径だけ離れて配置された近くのパフピペット（ｐｕｆｆｅｒ ｐｉｐｅｔｔｅ）から適用した。パフピペットは、内容物の圧射出に際しての水柱（ｐｌｕｍｅ）の程度を示すための０．０５％迅速（ｆａｓｔ）緑色色素を含有した。
パラメータ決定：実施例３で上述されたと同一。
結果：対照およびＳＮＬの神経節中のほぼ全部の大型ニューロン（直径＞４２μｍ）が、電圧および時間依存性の様式の過分極による活性化、ならびに細胞外Ｃｓ＋（３ｍＭ）およびＺＤ７２８８（５０μＭ）による効率的な遮断により立証されるところの、Ｉｈと矛盾しない電流を発現した。Ｉｈ電流の逆転電位は、ＳＮＬ（−３１．３±３．８、ｎ＝４）および対照細胞（−３４．３±４．０、ｎ＝６）中で以前に報告された値に類似であった。対照ＤＲＧからの大型ニューロンは、０から−２１．３ｐＡ／ｐＦ（細胞キャパシタンスに対し正規化される）までの範囲にわたるＩｈを発現した。大部分（約５８％）は４ｐＡ／ｐＦ未満を発現した（図１０、斜線を付けられた棒）。ＳＮＬ大型Ｌ５ニューロンにおける際だった知見は、わずか約８％が＜４ｐＡ／ｐＦのＩｈを発現したような、Ｉｈ電流密度分布の移動であった（図１０、黒棒）。対照条件下で低い発現を有するニューロンの集団は、傷害後に高レベルの発現に移動していたようであった。活性化の閾値電圧および静止膜電位は、ＳＮＬニューロン中で有意により正の電位に移動した。ＳＮＬのＤＲＧニューロンが、−１００ｍＶ未満への電圧段階により活性化される場合に、活性化のより迅速な動力学を有する傾向が存在した（図１１）。この差異は、傷害されたニューロンにおけるＩｈの活性化の閾値の、より脱分極された値への移動に関係することがありそうである。
リドカインによるＨＣＮの遮断
リドカインを、この公知のＮａチャンネル遮断薬が他の作用機序を有する可能性があるかどうかを決定するために、傷害されていないラットからの解離されたＬ４後根神経節ニューロン中で発現されるＩｈに対するその効果について試験した。
ＤＲＧを摘除し、解離しそして実施例１０で記述されるとおりポリ−Ｄ−リシン被覆されたカバーガラス上で３〜４日培養した。Ｉｈを、ピペット溶液が実施例３で使用された溶液であったことを除いて実施例１０に記述された方法に従ったパッチクランプ技術の全細胞構成を使用して測定した。ニューロンを、−５０ｍＶの保持電位からの一群の過分極電圧パルス（１０ｍＶの増分での−６０ｍＶないし−１５０ｍＶ）で攻撃した。Ｉｈは６００ｍｓｅｃの持続時間の試験パルスの終了時に測定した。リドカインは中性のｐＨで浴適用し、そして、対照Ｉｈの阻害パーセントを、リドカインが定常状態の遮断を達成した後に測定した。−１３４ｍＶで観察された定常状態の電流を、示された濃度のリドカインのインキュベーション後の対照のパーセントとしてプロットする。Ｉｈの濃度依存性の遮断が、２３マイクロモル濃度のＥＤ５０を伴い見られた。リドカイン遮断は可逆的であった。データは、−１．５、−２．０および−２．２ｐＡ／ｐＦの対照Ｉｈ密度を有する３個の細胞から得た。
抗原としての組換えラットＨＣＮ Ｃ末端ポリペプチドのクローニングおよび精製
５’プライマー、配列番号１４、５’ｇｃＧＧＡＴＣＣｃｃｇｇａｃｃｔｃｇｇｇｇｃｃｇｃｃｃａｃｔ３’中にＢａｍＨＩ部位、および３’プライマー、配列番号１５、５’ｇｃＧＡＡＴＴＣｔｃａｃａｔｇｔｔｇｇｃａｇａａａｔｔｔｇｇ３’中のＥｃｏＲＩ部位をもつＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲは、鋳型としてチャング（Ｃｈｕｎｇ）ＤＲＧ ｃＤＮＡを用い、９４℃４分間、９４℃３０秒間、６４℃３０秒間、７２℃３０秒間の４０周期、およびその後７２℃１０分間行った。ＰＣＲから生じる精製されたＨＣＮ３フラグメントＤＮＡ、およびｐＧＥＸ−３Ｘベクター（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化した。その後、消化されたＨＣＮ３フラグメントを、ＤＮＡ連結を介して、消化されたｐＧＥＸ−３Ｘ上のＧＳＴ遺伝子の下流に同じ読み枠で融合した。得られたプラスミド構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αコンピテント細胞（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））に形質転換し、形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で増幅し、そして細胞から単離した。プラスミド構築物のＤＮＡ配列を配列決定分析により確かめた。正しいプラスミド構築物を、ＧＳＴ−ＨＣＮ３融合タンパク質発現のため大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１コンピテント細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に形質転換した。融合タンパク質をその後、製造元（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））からの標準的ＧＳＴ融合タンパク質精製プロトコルに従ってＢＬ２１形質転換体から精製した。透析でのさらなる精製後に、融合タンパク質を抗体生成のためＲ＆Ｒ ラビトリー（Ｒ＆Ｒ Ｒａｂｂｉｔｒｙ）（ワイオミング州スタンウッド）に提出した。
ＧＳＴ−ＨＣＮ３融合タンパク質は、ラットＨＣＮ３（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）タンパク質Ｉｄ番号：ＡＡＦ６２１７５）のアミノ酸７１２−７８０、配列番号１６、
ｇｐｒｇｒｐｌｓａｓｑｐｓｌｐｑｒａｔｇｄｇｓｐｒｒｋｇｓｇｓｅｒｌｐｐｓｇｌｌａｋｐｐｇｔｖｑｐｓｒｓｓｖｐｅｐｖｔｐｒｇｐｑｉｓａｎｍ
を含んで成る。
類似の手順に従って、実質的に精製されたＧＳＴ−ＨＣＮ１融合タンパク質もまた作成しかつ抗体発生に使用した。ＨＣＮ１の３’フラグメントをクローン化するために使用されたＰＣＲプライマーは：配列番号１７、５’ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＣＡＣＴＧＧ３’、および配列番号１８、５’ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＧ３’であった。生じるＧＳＴ−ＨＣＮ１融合タンパク質は、ラットＨＣＮ１（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）タンパク質Ｉｄ番号：ＡＡＦ６２１７３）のアミノ酸８４２−９１０、配列番号１９、
ｔｖｈｓｔｇｌｑａｇｓｒｓｔｖｐｑｒｖｔｌｆｒｑｍｓｓｇａｉｐｐｎｒｇｖｐｐａｐｐｐｐａａｖｑｒｅｓｐｓｖｌｎＫｄｐｄａｅｋｐｒｆａｓｎｌ
を含んで成る。
ＨＣＮペースメーカーチャンネルの調節物質の同定に有用な電気生理学的アッセイ
電圧クランプ技術を使用してＨＣＮチャンネル機能の遮断薬を同定する。一例において、しかし本例に制限されずに、パッチクランプ技術の全細胞構成を使用して、哺乳動物細胞、好ましくはＨＣＮチャンネルを安定に発現する細胞系中で発現されるＨＣＮにより媒介される電流を遮断する化合物についてスクリーニングする。別の例において、組換えＨＣＮチャンネルを発現する卵母細胞を、２電極電圧クランプ技術を使用してスクリーニングする。一般的方法は実施例２および３に提示する。該スクリーニングは以下の方法により実施する。すなわち、電流と電圧の関係を、細胞が−４０から−１５０ｍＶまでの電圧パルスで攻撃される対照条件下で決定する。その後、反復性の単一パルスプロトコルを適用して、ＨＣＮチャンネルを電圧パルスにより−１１０ｍＶより負に十分に活性化する。電流の振幅が安定化した後に、化合物を５０μＭの濃度で浴適用する。ＺＤ７２８８を包含する多くの化合物が遮断の非常にゆっくりとした発生を有するため、電圧パルスを１０分間継続的に（例えば１０、１５もしくは３０秒ごとに）適用する。定常状態の内向きのＨＣＮに媒介される電流の振幅を測定し、そして基礎の振幅と比較する。電流と電圧の関係を、化合物への１０分の曝露後に測定して、電圧依存性のわずかな変化を同定する。
ＨＣＮペースメーカーチャンネルの調節物質の同定に有用な結合アッセイ
高親和性リガンドの結合はＨＣＮペースメーカー機能の調節物質を見出すために有用である可能性がある。現在、マイクロモル濃度以下の親和性をもつ既知の調節物質は存在しない一方、この目的上有用であるかもしれない多数の選択的化合物が存在し；こうした分子は、限定されるものでないがＺＤ７２８８、ザテブラジン、およびＨＣＮタンパク質に特異的な抗体を挙げることができる。ＨＣＮタンパク質と相互作用することが既知の分子もしくはリガンドを、検出のために、放射活性で標識するかもしくは蛍光分子に結合する。これらのアッセイはさらに、ＨＣＮタンパク質を外因性に発現するＨＣＮ宿主細胞（組換えもしくは天然の）のようなＨＣＮタンパク質の供給源、またはこれらの供給源のいずれかからの精製されたＨＣＮタンパク質、および天然の組織、天然の組織からの単離された膜などを包含するかもしれない陰性対照を必要とする。
こうしたアッセイの一例を示す。実施例２に記述された細胞系のようなＨＣＮペースメーカーを発現する細胞を、０．５×１０６〜２×１０６個の細胞／ｍｌで０．１％ＢＳＡの包含を伴う氷冷外部溶液（ｍＭで：１３０ ＮａＣｌ、２ ＣａＣｌ２、４ ＭｇＣｌ２、１０ ブドウ糖、２０ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）に懸濁する。その後、１２５Ｉ−ＺＤ７２８８（０．１〜１０μＭ、トクリス（ＴＯＣＲＩＳ））もしくは他の適する標識されたリガンドを細胞懸濁物に添加し、そして、混合物を、定期的な穏やかな攪拌を伴い氷上で１時間インキュベートする。混合物を５，０００×ｇで５分間遠心分離し、そして上清を除去する。ペレットを可溶化し、そして放射活性をγ計数器（パッカード バイオサイエンス（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））で評価する。
特異的ＺＤ７２８８結合を１００μＭの標識されないＺＤ７２８８の存在下で測定する。試験化合物を結合反応に包含し、そして、活性の化合物は、ＨＣＮペースメーカータンパク質発現細胞への放射標識されたＺＤ７２８８の結合を高めるもしくは阻害するものである。
上の例において、ＨＣＮペースメーカータンパク質の供給源はＨＣＮペースメーカーを発現する細胞系である。このアッセイはまた、精製されたＨＣＮペースメーカータンパク質、または天然の組織もしくは細胞系由来のＨＣＮペースメーカータンパク質を含有するミクロソームでも実施することができることに注目すべきである。
ＨＣＮ活性についての細胞に基づく蛍光アッセイ
多数の蛍光アッセイ形式を利用してＨＣＮチャンネル機能を測定することができる。ＨＣＮチャンネルはＫ＋、Ｎａ＋およびＲｂ＋に浸透可能であるため、Ｎａ＋およびＫ＋の蛍光指示薬もしくは放射活性トレーサー、ならびにＲｂ＋の流れを測定するための非放射活性ＡＡＳ技術もしくは放射活性８６Ｒｂを使用して、細胞に基づく系でイオンチャンネル機能を測定することができる。ＨＣＮを発現する細胞を光学底（ｏｐｔｉｃａｌ ｂｏｔｔｏｍ）マルチウェルアッセイプレート中で成長させる。成長培地を細胞から除去し、そして細胞にナトリウム感受性蛍光色素、例えばＳＢＦＩ（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を１時間負荷する。色素溶液を除去し、そして細胞を小容量のナトリウムを含まない溶液に入れる。アッセイプレートを蛍光プレートリーダー上に置き、そして細胞質ナトリウム濃度を測定する。その後、細胞外ナトリウム濃度を１０と１４０ｍＭとの間の濃度に上昇させ、そして、細胞質ナトリウム濃度の生じる増大を蛍光の変化として測定する。このアッセイは、ＨＣＮチャンネルがナトリウムに浸透性であるという事実を利用する。Ｃｓ＋、ＺＤ７２８８およびザテブラジンのようなＨＣＮチャンネルの遮断薬を、いくつかのウェルに包含して、代替のナトリウム進入経路に比較してＨＣＮチャンネルを通るナトリウム流入の画分を測定する。試験化合物をいくつかのウェルに添加し、そしてナトリウム流入に対するそれらの影響を、添加される化合物を伴わない対照ウェル、およびＨＣＮの既知の遮断薬を含有するウェルと比較する。別の例において、低濃度のＫ＋を、Ｎａ＋の流入を阻害するために、短いインキュベーション期間の間、Ｋ＋の非存在下で維持される細胞に戻し添加する（ａｄｄｅｄ ｂａｃｋ）ことができる（Ｐａｐｅ、１９９６を参照されたい）。低濃度のＫ＋（１〜１０ｍＭ）の戻し添加（ａｄｄｂａｃｋ）に際して、Ｎａ＋の浸透性を高めることができ、そしてＮａ＋流入を測定することができる。活性化の電圧を右方に移動させかつ開放の確率を高めるのに低ｍＭ範囲のＭｎ＋２を使用してよい（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏら、（１９９１）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ４７：４４９−５２）。あるいは、低ｐＨを使用して、より脱分極された電位でチャンネルを開放することができるような活性化の電圧依存性を移動させることができる（Ｓｔｅｖｅｎｓら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１３：６３１−５．）。一例において、ＨＣＮ遮断薬は、チャンネルの画分が試験される細胞の静止膜電位で開放である条件下でＨＣＮチャンネルにより媒介される構成的なイオンの流れを阻害するそれらの能力により同定することができる。
上述されたものに対する一代替法は、膜電位に感受性の蛍光色素を使用する。ＨＣＮを発現する細胞を光学底マルチウェルアッセイプレート中で成長させる。成長培地を細胞から除去し、そして、細胞を、膜電位色素もしくはＦＲＥＴ対ＣＣ２−ＤＭＰＥおよびＤｉＳＢＡＣ２（３）（オーロラ バイオサイエンシーズ コーポレーション（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、それぞれカタログ番号００ １００ ０１０および００ １００ ００８）とともにインキュベートする。アッセイは、外部ナトリウム濃度が上昇されかつＨＣＮチャンネルを通る生じるナトリウム流入を膜電位感受性色素の蛍光の変化として間接的に測定することができる場合に、上のとおり実施することができる。あるいは、ＨＣＮチャンネルは、細胞外イオン組成を変えること、もしくは細胞を過分極させることが既知の化合物を添加することのいずれかにより、過分極する細胞により活性化することができる。このアッセイにおいて、膜電位をモニターし、そしてＨＣＮ成分を、セシウムもしくはＺＤ７２８８のようなＨＣＮ遮断薬の存在下でなされた記録を差し引くことにより同定する。あるいは、低ｐＨを使用して、チャンネルがより脱分極された電位で開放であるような活性化の電圧依存性を移動させることができる（Ｓｔｅｖｅｎｓら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１３：６３１−５．）。一例において、ＨＣＮ遮断薬は、膜電位の蛍光（過分極）を減少させるそれらの能力により同定することができる。
発明にかかる、過分極で活性化される電流がヒトＨＣＮ ｃＲＮＡ（ＨＣＮ１）もしくは水（対照）を前に注入されたツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞で導き出された。該図は、８００ｍｓｅｃの電圧段階の終了時の示された試験パルス電位での平均±ＳＥＭの内向き電流を示す。内向き電流は、−６０ｍＶ（四角；卵母細胞の２個の別個のバッチからのｎ＝４個の卵母細胞）に等しいかもしくはより大きい過分極段階により、ＨＣＮ１を注入された卵母細胞中で導き出された。対照の姉妹卵母細胞（三角；卵母細胞の２個の別個のバッチからのｎ＝８個の卵母細胞）では、約−１４０ｍＶまで、測定可能な時間依存性の内向き電流は存在しなかった。生理学的範囲の電圧段階で有意差が存在した（＊印はｐ＜０．０５を示す；スチューデントのｔ検定）。再現可能な結果が２個の別個の卵母細胞のバッチから得られ、そしてデータをプールした。 発明にかかる、低閾値の過分極に活性化される電流が、ヒトＨＣＮ３を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞で導き出された。（ａ）。ゆっくり活性化する内向き電流が（ｂ）で示される電圧プロトコルにより導き出された。電流と電圧の関係（ｃ）は、−８４ｍＶ近くの活性化の閾値電圧を示した（電圧軸は−１４ｍＶの界面電位補正を包含することに注意されたい）。（ｄ）。内向き電流は対照細胞で観察されない（（ｂ）で示されると同一の電圧プロトコル）。細胞内溶液：グルコン酸カリウム ＩＳ；細胞外溶液：タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）。保持電位は−６４ｍＶであった。 発明にかかる、１〜３週間前にＬ４／５脊髄神経結紮（ＳＮＬ）で準備されていたラットからの興奮された後根、後根神経節および脊髄神経の連続（ｉｎ−ｃｏｎｔｉｎｕｉｔｙ）調製物を使用して得られたデータを具体的に説明する。自発放電はＡＣＳＦ浴中インビトロで記録した（実施例４を参照されたい）。図（ａ）および（ｂ）において、ＡβおよびＡδニューロン（伝導速度により区別される）の自発発火に対する１００マイクロモル濃度のＺＤ７２８８（Ｉｈの特異的遮断薬；（ＢｏＳｍｉｔｈら、（１９９３）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １１０：３４３−９））の浴適用の影響の例を具体的に説明する。図（ａ）：ＺＤ７２８８ １００マイクロモル濃度の適用前および後の典型的なＡβ線維からの単一線維インビトロ記録のヒストグラム（ｙ軸＝スパイク／秒）は、異所性発火の完全な抑制が３〜４分後に達成されたことを示す。ヒストグラムの上の水平の棒は、調製物へのＺＤ７２８８の適用のタイミングおよび持続時間を示す。挿入図（ａ）（ｉ）は、基礎のスパイク頻度を具体的に説明する、薬物適用前の１秒の記録期間の拡大図を示し；挿入図（ａ）（ｉｉ）は発火の低下を具体的に説明する、ＺＤ７２８８適用後の１秒の記録期間を示す。描かれた線維の伝導速度は３１．３ｍ／秒（Ａβ範囲）であった。図（ｂ）：Ａδ線維からの（ａ）でのような単一線維記録は、ＺＤ７２８８適用後の発火の減衰を示す。ヒストグラムの上の水平の棒は、調製物へのＺＤ７２８８の適用のタイミングおよび持続時間を示す。挿入図（ｂ）（ｉ）は、基礎のスパイク頻度を具体的に説明する、薬物適用前の１秒の記録期間の拡大図を示し；挿入図（ｂ）（ｉｉ）は発火の低下の程度を具体的に説明する、ＺＤ７２８８適用後の１秒の記録期間を示す。描かれた線維の伝導速度は７．８ｍ／秒（Ａδ範囲）であった。 発明にかかる、ＺＤ７２８８適用後の、図３（上）に具体的に説明される単一線維記録実験における基礎からの発火の変化パーセント（ｙ軸）の時間経過（ｘ軸）を示す。０〜５分の間の水平の棒はＺＤ７２８８ １００マイクロモル濃度の適用のタイミングおよび持続時間を示す。データ点および誤差の棒は、１群あたり７〜８本の線維の平均±ＳＥＭを示す。記号：黒四角＝ＡＣＳＦ対照（組合せられたＡβおよびＡδ線維）；白四角＝Ａδ線維；白丸＝Ａβ線維。＊＝Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ、次いでデュネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）の多重比較。 発明にかかる、ＳＮＬラットにより表された異痛症は、１ｍｇ／ｋｇ（白四角）、３ｍｇ／ｋｇ（白丸）もしくは１０ｍｇ／ｋｇ（黒四角）のＺＤ７２８８のｉ．ｐ．投与により、生理的食塩水ベヒクル（黒丸）と比較して用量依存性の様式で遮断された。（ａ）Ｙ軸はｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛からの足の引っ込めの５０％閾値を示し；Ｘ軸は、結紮前の基礎の足の閾値（正常）、薬物直前の基礎の閾値（最大の異痛症、「基礎」）および薬物投与後の時間点を具体的に説明する修正された時間経過を示す。薬物投与のタイミングを矢印により示す。（ｂ）ＺＤ７２８８のＥＤ５０が異痛症抑制について約３ｍｇ／ｋｇであることを示す用量応答曲線として分析された同一のデータ。用量および薬物効果を比較するために、生の足の閾値を、以下の式すなわち％ＭＰＥ＝［薬物後閾値（ｇ）−薬物前異痛症基礎閾値（ｇ）］／［結紮前基礎閾値（ｇ）］−薬物前異痛症基礎閾値（ｇ）］×１００を使用して、最大可能薬物効果のパーセント（％ＭＰＥ、Ｙ軸）として正規化した。薬物前の最大の異痛症（基礎）閾値は０％の薬物効果（異痛症の抑制なし）を反映すると想定し、また、結紮前閾値は１００％効果、すなわち足の閾値の正常への復帰を引き起こす薬物効果と指定し、結紮前基礎は異痛症の完全な薬性を表すと考えた。 発明にかかる、薬物処理を伴うおよび伴わない、正常ラットにおける有害な熱的刺激からの逃避挙動（後肢をなめること）を立証するまでの待ち時間を測定する５５℃ホットプレート試験を使用して測定されるところの急性の熱的に惹起された疼痛に対するｉ．ｐ．のＺＤ７２８８ １０ｍｇ／ｋｇ（黒丸）の最小の効果を具体的に説明する。黒丸；ＺＤ７２８８ １０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．（Ｎ＝８）；白丸；生理的食塩水ベヒクル ｉ．ｐ．（Ｎ＝８）。＊＝ｐ＜０．０５、７５分の時間点のみのｔ検定；Ｎ＝１群あたり８匹。 発明にかかる、炎症性疼痛のラットのフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）足モデルにおいて、異痛症は、ＺＤ７２８８でのＨＣＮ遮断、ならびにモルヒネおよびイブプロフェンでの処理により抑制されたが、しかしギャバペンチンによってはされなかった。全部の薬物はｉ．ｐ．投与した。記号：ＺＤ７２８８ １０ｍｇ／ｋｇ、黒丸；イブプロフェン ３０ｍｇ／ｋｇ、白丸；モルヒネ ３ｍｇ／ｋｇ、黒三角；ギャバペンチン １００ｍｇ／ｋｇ、白三角。Ｙ軸：足の引っ込めの閾値（ｇ）。Ｘ軸：正常の基礎の閾値、ＣＦＡ投与後の最大の異痛症の時間点、および薬物投与後の時間点。Ｎ＝１群あたり６匹。 発明にかかる、自発性疼痛挙動がラットの軽度熱的傷害モデルで遮断された。薬物（モルヒネ、ＺＤ７２８８もしくは生理的食塩水）を、軽度熱的傷害１０分後に投与した。２個の別個の１０分の間隔すなわち腹腔内のベヒクルもしくは薬物の投与３０および６０分後の間に自発性疼痛挙動が表された（足の持ち上げ、足を振ること、足の防護姿勢）時間の総量を記録した。図ａ：生データを提示する。Ｙ軸：累積自発性疼痛挙動時間（秒）。Ｘ軸：薬物投与後時間（時間）。モルヒネ（斜線を付けられた棒、ｎ＝３）およびＺＤ７２８８（黒棒、ｎ＝６）双方が、投与後３０および６０分双方で、生理的食塩水（白棒、ｎ＝９）に比較して、自発性疼痛挙動のほぼ完全な抑制を示した（＊＝Ｐ＜．０００１、一元ＡＮＯＶＡ）。図ｂ：データを有効性パーセント（生理的食塩水に対する）に転換した。有効性パーセントの平均（Ｙ軸）（０＝効果なし、１００％＝自発性疼痛の完全な抑制）は、（１−（観察された疼痛得点／全体の生理的食塩水疼痛得点の平均））×１００として計算し；２個の時間点の有効性パーセントを平均した。モルヒネの全体的有効性パーセントは８９．６±２．１（平均±ＳＥＭ）、ＺＤ７２８８については８９．１±１５．７であり；＊＝Ｐ＜．０００１（対生理的食塩水）、フィッシャーのＰＬＳＤを伴う一元ＡＮＯＶＡ。 発明にかかる、神経傷害された（ＳＮＬ）および対照（偽）ラットの一次求心性ニューロンの細胞体中のＨＣＮ ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。４種のＨＣＮサブタイプの相対的豊富さを、偽対照ラットに対して１週間神経結紮されたラットからの全Ｌ５／６ ＤＲＧで同時に測定した。Ｙ軸は、ハウスキーピング遺伝子シクロフィリンＡに対し正規化された、蛍光により検出されるところの相対的ｍＲＮＡコピー数を表す。図（Ａ）：偽対照に比較して、ＳＮＬサンプル中のＨＣＮ１ ｍＲＮＡの有意の減少が、コーディング配列の３’端に向かう領域（図中の標識された３’）を増幅したプライマーを使用して見られた一方、イントロン＃１（Ｌｕｄｗｉｇら、（１９９９）Ｅｍｂｏ Ｊ １８：２３２３−９）の領域にわたる５’領域のアプリコン（図中の標識された５’）の豊富さの有意の変化は見られなかった。図（Ｂ）：ＨＣＮ２ ｍＲＮＡの有意の減少が、イントロン＃１の領域（上のとおり）中のアンプリコンについて、ＳＮＬサンプル中で見られた。図（Ｃ）ＳＮＬと対照との間の有意差は、再度、イントロン＃１の領域中のアンプリコンを使用して、ＨＣＮ３について観察されなかった。図（Ｄ）：ＳＮＬと対照との間の有意差は、ＨＣＮ４についてこの領域中のアンプリコンについて観察されなかった。Ｎ＝８匹のＳＮＬおよび８匹の偽対照ラット。＊印はＰ＜．０２、対応のないｔ検定を示す。 発明にかかる、Ｉｈは、−１１４ｍＶへの段階で、対照（斜線を付けられた棒）およびＳＮＬ（黒棒）双方のＬ５大型ニューロン中で検出された。細胞の大きさに正規化された、大型ＤＲＧニューロン中のＩｈピーク電流の分布を示す（電流密度）。ニューロンのずっとより大きな集団が、偽対照に比較してＳＮＬ手術されたラットで高レベルのＩｈを発現した。 発明にかかる、Ｉｈ活性化の電圧依存性を、尾電流分析を使用して測定し、ここで、以前の電圧段階により開放されたチャンネルを通る電流をそれらが不活性化する前に測定した。白丸は偽ニューロンを表し、そして黒丸はＳＮＬニューロンを表す。尾電流は、−１０ｍＶの増分で−４４と−１５４ｍＶとの間の一連の電圧への＞２秒の持続時間の前パルス後に−６４もしくは−５４ｍＶへの段階から測定した。尾電流を測定した電圧（−６４もしくは−５４ｍＶ）は、尾電流が正確な測定値を提供するのに十分に大きくかつ他の電圧依存性チャンネル電流による汚染がほとんど存在しなかったために選んだ。データを、最も過分極する前パルス後に観察された最大の尾電流に対して正規化し（ｙ軸：１は最大電流である）、その後、ボルツマン関数により近似し、そして最大の活性化の半分までの電圧（Ｖ０．５）および曲線の傾きを決定した。活性化の閾値をこれらのプロットから推定し、そして、ＳＮＬラットのニューロンでの閾値が対照（平均±ＳＥＭ：７３．９±１．９ｍＶ、ｎ＝３５）に比較して有意により正（−６４．３±１．０ｍＶ、ｎ＝４４；ｐ＜＜０．００１）であった＞２秒の試験段階の終了時に電流を測定することにより決定された値に類似であった。Ｖ０．５はＳＮＬニューロンで−８２．５±２．９ｍＶであると計算され（Ｎ＝１７）；これもまた対照すなわち−９１．０±２．６から有意に異なった（ｐ＜．０５、ｔ検体）。傾きは、しかしながら、ＳＮＬについて９．５±１．１（Ｎ＝１５）および対照について９．３±１．１（Ｎ＝１１）で、有意に異ならなかった。 発明にかかる、正常ラットのＬ４後根神経節ニューロン（大型ニューロン、直径＞４２ミクロン）中の天然にＩｈに対する中性のｐＨで浴適用されたリドカイン塩酸塩の効果を具体的に説明する。Ｙ軸：−１３４ｍＶでの電流の阻害パーセント。Ｘ軸：対数で表されたリドカイン塩酸塩の濃度（Ｍ）。Ｉｈの濃度依存性の遮断が、２３マイクロモル濃度のＥＤ５０を伴い見られた。データは３個の細胞から得た。
【配列表】
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Claims (35)

  1. 被験体の知覚細胞中のＨＣＮペースメーカーチャンネルにより媒介される電流を低下させる、治療上有効な用量の組成物を被験体に投与することを含んで成る、それの必要な被験体における疼痛の治療方法。
  2. 組成物が１種の鎮痛薬とともに送達される、請求項１記載の方法。
  3. 前記疼痛が炎症性疼痛である、請求項１記載の方法。
  4. 前記組成物が、被験体の知覚細胞中のＨＣＮタンパク質サブユニットの発現を低下させる、請求項１記載の方法。
  5. 前記組成物が、被験体の知覚細胞中のＨＣＮペースメーカーチャンネルの開放確率を低下させる、請求項１記載の方法。
  6. 前記組成物が、被験体の知覚細胞中のイオンに対するＨＣＮペースメーカーチャンネルの伝導度を低下させる、請求項１記載の方法。
  7. 前記組成物が、ＨＣＮ１もしくはＨＣＮ３チャンネルの阻害剤である、請求項１記載の方法。
  8. 疼痛が、手根管症候群疼痛、背部痛、頚部痛、坐骨神経痛、肋間神経痛、オピオイド耐性疼痛、頭痛、群発性頭痛、偏頭痛、三叉神経痛、関節炎、変形性関節症および癌関連疼痛よりなる群から選択される、請求項１記載の方法。
  9. 前記組成物が、ＺＤ７２８８、ＺＭ−２２７１８９、ザテブラジン（Ｚａｔｅｂｒａｄｉｎｅ）、ＤＫ−ＡＨ２６８、アリニジンおよびイバブラジンから選択される、請求項１記載の方法。
  10. 前記他の鎮痛薬が、モルヒネもしくは他のアヘン受容体アゴニスト；ナルブフィンもしくは他の混合型オピオイドアゴニスト／アンタゴニスト；トラマドール；バクロフェン；クロニジンもしくは他のα−２アドレナリン受容体アゴニスト；アミトリプチリンもしくは他の三環性抗うつ薬；ギャバペンチンもしくはプレギャバリン、カルバマゼピン、フェニトイン、ラモトリジンもしくは他の抗痙攣薬；および／またはリドカイン、トカイニドもしくは他の局所麻酔薬／抗不整脈薬から選択される、請求項１記載の方法。
  11. 被験体の知覚細胞中のＨＣＮサブユニットの発現を低下させる、治療上有効な用量の組成物を被験体に投与することを含んで成る、それの必要な被験体における疼痛の治療方法。
  12. 組成物が、ＨＣＮ遺伝子のアンチセンス核酸もしくはそれに特異的なｓｉＲＮＡ分子を含んで成り、かつ、該アンチセンス核酸もしくはｓｉＲＮＡ分子がＨＣＮ遺伝子の発現を特異的に抑制する、請求項１２記載の方法。
  13. 前記アンチセンス核酸もしくはｓｉＲＮＡ分子がＨＣＮ１もしくはＨＣＮ３遺伝子の発現を特異的に抑制する、請求項１３記載の方法。
  14. ＨＣＮタンパク質のカルボキシ末端に選択的に結合する抗体。
  15. 抗体が、ＨＣＮ１もしくはＨＣＮ３タンパク質のカルボキシ末端に選択的に結合する、請求項１５記載の抗体。
  16. （ａ）試験化合物をＨＣＮペースメーカータンパク質と接触させること；および
    （ｂ）ＨＣＮペースメーカーチャンネルにより媒介される電流を低下させるの能力を決定すること
    の段階を含んで成る、疼痛の治療に有用な化合物の同定方法。
  17. 化合物を疼痛の最低１種の動物モデルで試験することの段階をさらに含んで成る、請求項１７記載の方法。
  18. タンパク質がＨＣＮ１もしくはＨＣＮ３ペースメーカーサブユニットである、請求項１７記載の方法。
  19. 前記ＨＣＮペースメーカータンパク質が実質的に精製される、請求項１７記載の方法。
  20. 前記ＨＣＮペースメーカータンパク質が膜と会合される、請求項１７記載の方法。
  21. 前記ＨＣＮペースメーカータンパク質が宿主細胞から発現される、請求項１７記載の方法。
  22. （ａ）試験化合物を、ＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列もしくはＨＣＮペースメーカー遺伝子の調節配列に結合する細胞成分と接触させること；および
    （ｂ）該試験化合物が、前記調節配列により制御される遺伝子の発現を低下させるかどうかを決定すること
    の段階を含んで成る、疼痛の治療に有用な化合物の同定方法。
  23. 化合物を疼痛の最低１種の動物モデルに対し試験することの段階をさらに含んで成る、請求項２３記載の方法。
  24. 調節配列がＨＣＮ１もしくはＨＣＮ３遺伝子の調節配列である、請求項２３記載の方法。
  25. ＨＣＮ調節配列により制御される遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項２３記載の方法。
  26. ＨＣＮ調節配列により制御される遺伝子がＨＣＮ遺伝子である、請求項２３記載の方法。
  27. 調節配列およびその制御される遺伝子が宿主細胞の内側にある、請求項２３記載の方法。
  28. （ａ）試験化合物、ＨＣＮペースメーカータンパク質の測定可能に標識されたリガンド、およびＨＣＮペースメーカータンパク質を組み合わせること；ならびに
    （ｂ）ＨＣＮペースメーカータンパク質への標識されたリガンドの結合の量の低下により、ＨＣＮペースメーカータンパク質への該化合物の結合を測定すること
    の段階を含んで成る、疼痛の治療に有用な化合物の同定方法。
  29. 化合物を疼痛の最低１種の動物モデルで試験することの段階を付加的に含んで成る、請求項２９記載の方法。
  30. 前記ＨＣＮペースメーカータンパク質が実質的に精製される、請求項２９記載の方法。
  31. 前記ＨＣＮペースメーカータンパク質が膜と会合される、請求項２９記載の方法。
  32. 前記ＨＣＮペースメーカータンパク質が宿主細胞中で発現される、請求項２９記載の方法。
  33. 前記タンパク質がＨＣＮ１もしくはＨＣＮ３ペースメーカータンパク質である、請求項２９記載の方法。
  34. ＨＣＮペースメーカータンパク質の１種もしくはそれ以上の阻害剤を包含する組成物を動物に投与することの段階を含んで成る、動物における疼痛の治療方法。
  35. ＨＣＮペースメーカータンパク質の１種もしくはそれ以上の阻害剤を含んで成る組成物を動物に投与することを含んで成る、炎症性疼痛の治療方法。
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