JP2005509892A - 高分解能自動ｍａｌｄｉデータ分析 - Google Patents

Abstract

【課題】 非平面表面からＭＡＬＤＩデータを収集できるようにする。
【解決手段】 非平面表面上に置かれた試料からの質量スペクトルデータの収集方法であって、試料の全域に渡って広がる位置の配列が定義される第１ステップと、位置の配列中の複数の位置から個々の質量スペクトルが収集される第２ステップと、質量スペクトル中にピークとして出現するイオンの質量電荷比に基づいて、各位置からの個々の質量スペクトルが質量補正される第３ステップと、試料全域について複数の質量スペクトルが合計される第４ステップとを含む収集方法を提供する。

Description

本発明は、蛋白質又は他の巨大分子などの物質の試料のＭＡＬＤＩスペクトルの定量の改良に関する。

質量分析（以下、ＭＳとする）は、様々な巨大分子、特に本明細書で集合的に巨大分子と称する蛋白質、ペプチド、グリコペプチド、酸素修飾のペプチド、脂質、オリゴ糖及びオリゴヌクレオチドの評価に好ましい方法である。本発明は、蛋白質分析のための一定の適用を含むがそれだけには限らない。そのような巨大分子の評価は、しばしば、その断片を分析することによって行われる。蛋白質の場合、通常これはトリプシンなどの酵素の使用を伴い、このトリプシンは蛋白質を特異的にペプチド断片に切断する。その断片はＭＳによって分析される。一般に、ＭＳによる分析は、高エネルギー源、例えばマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）の場合にはレーザーを用いて、物質の試料の気化及びイオン化を伴う。蛋白質をペプチド断片へ切断するため酵素及びこの断片と共結晶化しレーザーエネルギーを吸収するマトリックスを用いて蛋白質を処理すると、ペプチドのイオン化がもたらされる。この試料をレーザー光によって平らなプレートからガス又は蒸気相へ気化させる。次いで、電荷を帯びた分子が、高電界により加速され、チャンバの末端が検出表面である高真空チャンバ中へと飛行する。飛行時間はイオン化分子の質量／電荷と相関するので、イオン化されてから（検出表面に）衝突するまでの経過時間を使用して分子の質量を決定することができる。その結果、試料中の質量のプロファイル又はスペクトルを得ることができる。このデータが全ての既知の蛋白質配列を含むデータベースで照合されることにより、蛋白質の質量及びその断片がたんぱく質の同定に役立つペプチドの質量を知ることができる。

妥当な分解能を有する蛋白質のＭＡＬＤＩスペクトルを定量するためには、試料は極めて平らな面から分析する必要がある。これにより質量分析計中でイオン全てに、しばしばターゲットターゲットプレートと称する平らな表面上の同位置から出発させて同じ相対的飛行時間を持たせることが可能になる。質量高分解能を実現する能力は、それによって質量定量において高い精度が提供されるので重要である。
ターゲット

しかし、一般に、蛋白質をターゲットプレートに移動させる必要性を無くするために非平面表面からＭＡＬＤＩデータを収集し、より迅速でかつより効率的な蛋白質の評価の方法を生み出すことができることは望ましいはずである。しかし、非平面表面を使用する場合、非平面スポット上の様々な位置からのイオンが非平面表面上の異なる高さにおいて発生し、同じ質量のイオンが異なる飛行時間後にＭＡＬＤＩ検出器に到着し得る結果となる。これは、分解能の損失を生み出し、ＭＡＬＤＩにおいて極めて平らな表面の使用が必要とされる現在の技術に内在する問題となっている。

本発明の目的の１つは、非平面表面からＭＡＬＤＩデータを収集できるようにすることである。
なお、本発明の明細書に含まれている文書、行為、物質、装置、物品などのどんな考察も単に本発明の内容を提供することを目的としたものである。これらの事柄のどれも又は全てについて、従来技術の基礎の一部を形成することの自白であると受け取ったり、又は本出願各の請求項の優先日前にオーストラリア国で存在しているような本発明に関連する分野における通常の一般的な知識であることの自白であると受け取ってはならない。

本発明の第一の広義の態様では、非平面表面上に置かれた試料からの質量スペクトルデータの収集方法であって、試料の全域に渡って広がる位置の配列が定義される第１ステップと、位置の配列中の複数の位置から個々の質量スペクトルが収集される第２ステップと、質量スペクトル中にピークとして出現するイオンの質量電荷比に基づいて、各位置からの個々の質量スペクトルが質量補正される第３ステップと、試料全域について複数の質量スペクトルが合計される第４ステップとを含む収集方法を提供する。

通常、第３ステップでは、スペクトル中の既知のピーク、例えば、トリプシンの自己融解の結果として生じるピークの存在に依存して、個々の質量スペクトルが質量補正される。その際トリプシンは蛋白質を消化するために使用される酵素である。
従って、本発明を使用して、高レベルのスペクトル分解能を持ちつつＭＡＬＤＩのターゲットターゲットプレートによって提供される非常に平らな表面を必要とせずに、例えば、２Ｄゲル膜ブロット、ウエスタンブロットなどの非平面表面から蛋白質を分析することができる。すなわち、非平面表面からＭＡＬＤＩデータを収集できるようにすることができる。

この方法は自動化に適している。
次に、添付図面を参考に本発明の特定の実施形態をただ１つの例によって説明する。

本発明の第一の広義の態様では、高レベルのスペクトル分解能を持ちつつＭＡＬＤＩのターゲットターゲットプレートによって提供される非常に平らな表面を必要とせずに、例えば、２Ｄゲル膜ブロット、ウエスタンブロットなどの非平面表面から蛋白質を分析することができる。すなわち、非平面表面からＭＡＬＤＩデータを収集できるようにすることができる。

［第１実施形態］
蛋白質などの巨大分子を分析するための１つの方法は、ペプチド質量フィンガープリント分析法として知られる技術であり、この分析法では、蛋白質を酵素によって消化し質量分析計で分析していくつかの非常に正確なペプチド質量値を得る。このデータは、蛋白質が消化してなるペプチドの質量に相当するピークのスペクトルを生成して、公知の生体分子に由来する理論的なペプチドの質量を含むデータベースに照合される。これにより、未知の蛋白質（のスペクトル）をデータベース中の公知の蛋白質（のスペクトル）と比較して適合するかどうか決定することができる。

従来技術では、生体分子試料を金属ターゲット上に置き、（データをそこから収集することができる予め定義されたポイントの配列である）プレスキャンラスタを使用してスペクトルの「質」に基づきラスタの各ポイントを整列させる。「質」は、例えば、最高の質のスペクトルと見なされる最高ピーク強度を有するスペクトルのピーク強度に基づいたものでもよい。次いで、この方法では、それらのポイントから上位のもの、通常、使用者によって指定される上位の５ポイント又は上位の９０％に戻って、全５ポイントのデータが収集され平均される。これらのポイントから収集したデータはノイズ判定基準の最小分解能、強度及びシグナル／ノイズ比の基準に適合させなければならないので、自動的に質のパラメータを指定することもできる。通常、２００〜１０００回のレーザーショットによりデータが収集され、プレスキャンラスタには、通常、１ポイント当たり１０回のレーザーショットが行われる。

しかし、非平面表面では表面地形の変動が大きいことにより多ポイントで得たデータの平均化が困難となるので、上記従来技術の方法は平面で有効である。というのは、これは、同じ質量のイオンの飛行時間がまさにその表面高度によって異なりその収集位置の地形に依存するからである。異なる時間に到達するイオンによってスペクトルを平均するとピークの著しい広幅化及び分解能の損失がもたらされる。

本発明では、生体分子を分離精製するための標準的な技術を使用して１つ又は複数の生体分子が調製される。次いで、生体分子が膜に移されＭＡＬＤＩ分析用の試料が調製される。このことは、生体分子が蛋白質の場合、通常、本願に引用される本出願人のオーストラリア特許第７２２５７８号に開示されているようなケミカルプリンタを使用して、膜表面上の蛋白質に洗浄剤、トリプシン及びマトリックスを直接分注することにより行われる。次いで、自動的にデータを収集するために膜が質量分析計に導入される。次に、試料のスポット上においてデータ収集用の２５個のポイントが定義される。スポットは、通常、ポイント間が５０ミクロン間隔の５×５ポイント配列形である。

図２は、データが収集される２５個のポイントを試料のスポットに重ねて例示したものである。２５個のデータポイントの各々において１つのスペクトルが収集される。例えば、第１のポイントで５０回のレーザーショットが収集されて得られたスペクトルが質量補正され保存される。次いで、第２のポイントで５０回のレーザーショットが収集されて質量補正され保存されるという具合に続けられ、１データポイント当たり１つとして合計で２５個のスペクトルが収集される。次いで、２５個の質量補正スペクトルが合計されて、１つ分解能が十分な質量補正スペクトルが得られる。或いは、スペクトルの質に応じて、上位のスペクトルのみを選択して合計することもできる。

質量補正は、スペクトル中に２つの既知のピークを探し、既知のピークに適合するようにそのスペクトルを移動することにより、行うことができる。例えば、蛋白質がトリプシンで消化された場合、蛋白質は自己融解しそれ自体のピークを作製する。「トリプシン関連」ピークが、例えば８４２．４と予想されるが８４２．５で測定された場合、その質量補正には０．１Ｄａの補正が必要とされる。
＜方法＞
＜試料の調製について＞
標準的な技術を使用して血小板蛋白質のブロットが調製され、ブロット表面上の蛋白質の上にＰＶＰ（洗浄剤）、トリプシン及びマトリックスを直接分注するためにケミカルプリンタを使用してＭＡＬＤＩ分析用の試料が調製された。次いで、自動データ収集のためにブロットが質量分析計に導入された。

Ａｘｉｍａ−ＣＦＲ質量分析計を使用して全てのＭＡＬＤＩデータが収集された。収集及び分析のために使用したソフトウェアはＫｒａｔｏｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．社製Ｋｏｍｐａｃｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．１．０である。プロファイル整合のユーティリティもＫｒａｔｏｓ社製であった。
膜中のスペクトルを自動実行で収集するために、試料スポット毎に２５個の方法ファイルを定義した。プレスキャンを使用せずに各方法ファイルにより１つのポイントからのデータが収集されるようにした。５０μｍ間隔の５×５ポイントの配列が定義されるように、２５個の方法ファイルの各々には、そのポイントに対して、前の方法ファイルのポイントからのデータ収集のオフセットを持たせるようにした。図１は、２５個の方法ファイルのオフセットの一例を示し、１〜２５は方法ファイル１〜２５を示している。方法ファイルにおける他の詳細な点は全て同様であった。

オフセットは、（使用したソフトウェアの制限の理由で）正でしか作成できないので、データ収集は下部左手隅のスポットから開始し上部右手隅へ移動する。方法１３は、試料スポットの中心に当たるはずである。図２に、試料スポット上のデータ収集のポイントを図で示す。
各試料スポットから２５個の個々のスペクトルが、配列ポイント毎に１つずつ収集され、自動的に質量補正された。これらの２５個のスペクトルの中から選択された上位のスペクトルがプロファイル整合のユーティリティを用いて加算平均化されて、試料のスポットを代表する分解能が十分なスペクトルが得られた。

この場合は、自動品質調整は使用しなかった。自動品質調整により使用者は収集したスペクトルの最低限の質を定義することができる。膜には、通常２５個のポイントからわずか４個又は５個の良好なスペクトルが収集された。自動品質調整を使用すると品質データを予めフィルタにかけることができ、そのため使用者は２５個全てのスペクトルを分類し最良のスペクトルを選択する必要がなくなるはずである。
＜結果及び考察＞
自動実行は非常に成功し、手動でデータを収集する場合に比べて少ない時間で優れた分解能を有する大量の良質なデータが収集された。

プロファイル整合のユーティリティも十分に機能し、個々のスペクトルの分解能を高いレベルに保っている。
自動データ収集は２時間未満で済んだ。これは、手動でデータを収集するためにかかる時間（通常、６〜８時間）より著しく少ない。
＜自動実行の方法の一例＞
２５個の方法ファイルを作製した。２５個の方法ファイルは、ソフトウェアのラスタオプションで定義したデータ収集用のポイントを除いて全て同様である。データ収集のポイントを表１に示す。

本発明の方法ファイルの一例を表２に示す。

分析するスポットをテキストファイルで定義し、自動実行ソフトウェアにインポートした。テキストファイルには、分析するスポット、使用する方法ファイル、ファイルを保存する場所が記載されている。プレートファイル（個々の試料のスポットの位置を定義する）は、Ｋｒａｔｏｓ社製のユーティリティを使用して自動実行ソフトウェアにインポートされる。試料のスポットの位置は、膜ブロットのスキャン画像及びケミカルプリンタが分析試薬を分注する座標から定義される。

図３ａ及び３ｂは、自動実行において膜から収集されたスペクトルから選択されたピークを示す。ここで、２５個のスペクトルは、ラスタ中の個々のポイントからが収集されたものである。上位５個のスペクトルが選択され、別個に質量補正され平均化された。図３ａ及び３ｂでは、両方とも優れた分解能が示されている。図３ｃ及び３ｄは、複数のポイントに渡ってスペクトルが平均化されて従来の手法で質量補正された場合に得られる結果を示す。図３ｃ及び３ｄは、両方とも不十分な分解能が示されている。

広く記載した本発明の精神又は範囲から逸脱することなしに、本明細書の実施形態に示すように本発明には多数の変形例及び／又は変更例を含ませることができることは当業者には理解されよう。従って、本発明の実施形態は全ての点で例示であり、本発明の実施形態に制限されるものではない。

本発明にかかる高分解能自動ＭＡＬＤＩデータ分析方法は、非平面表面からＭＡＬＤＩデータを収集できるようにすることができるという効果を有し、高分解能自動ＭＡＬＤＩデータ分析方法等として有用である。

２５個の個々の方法ファイルにより定義されたデータ収集用の５×５ポイントの配列を示す図である。 試料のスポットに対するデータ収集用の２５個のポイントを例示する図である。 （ａ）本発明によって得られたスペクトルを示す図である。 （ｂ）本発明によって得られたスペクトルを示す図である。 （ｃ）従来技術の方法によって得られたスペクトルを示す図である。 （ｄ）従来技術の方法によって得られたスペクトルを示す図である。

Claims (11)

1. 非平面表面上に置かれた試料からの質量スペクトルデータの収集方法であって、
   前記試料の全域に渡って広がる位置の配列が定義される第１ステップと、
   前記位置の配列中の複数の位置から個々の質量スペクトルが収集される第２ステップと、
   前記質量スペクトル中にピークとして出現するイオンの質量電荷比に基づいて、各位置からの個々の前記質量スペクトルが質量補正される第３ステップと、
   前期試料全域について複数の前記質量スペクトルが合計される第４ステップと、
   を含む、
   収集方法。
2. 前記質量スペクトルのデータは、高エネルギー源、最も好ましくはレーザーを使用する物質の前記試料を気化及びイオン化することにより生成される、
   請求項１に記載の収集方法。
3. 前記第３ステップは、スペクトル中の１つ又は複数の、通常２つの既知のピークが同定され、前記質量スペクトルが既知のピークに適合するように移動される第３１ステップを有する、
   請求項１に記載の収集方法。
4. 前記試料が置かれる前記非平面表面は膜ブロットである、
   請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記第１ステップでは、前記位置の配列として１６個以上のデータポイントが定義され、
   前記第２ステップでは、１つの前記質量スペクトルが個々の前記データポイントで収集される、
   請求項1から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記第２ステップでは、２０以上、好ましくは５０以上のレーザーショットが個々のデータポイントから収集される、
   請求項５に記載の方法。
7. 前記第４ステップは、前記第３ステップで質量補正された全ての前記質量スペクトルが合計される第４１ステップを有する、
   請求項６に記載の方法。
8. 前記第４ステップは、複数の前記質量スペクトルのみを合計する第４２ステップをさらに含む、
   請求項７に記載の方法。
9. 表面上に置かれた巨大分子の試料の質量／電荷スペクトルが定量される定量方法であって、
   前記試料の全域に渡って広がる位置の配列が定義される第５ステップと、
   前記位置の配列中の複数の位置から個々の前記質量／電荷スペクトルが収集される第６ステップと、
   前記質量／電荷スペクトル中の１つ又は複数の既知のピークが同定され、かつ前記質量／電荷スペクトルが既知のピークの位置に適合するように移動されることによって、イオンの質量電荷比に基づいて前記位置の配列中の複数の位置からの個々の前記質量／電荷スペクトルが補正される第７ステップと、
   前記試料全域について複数の前記質量／電荷スペクトルが合計される第８ステップと、
   を含む、
   定量方法。
10. 前記巨大分子は、蛋白質又はペプチドである、
    請求項９に記載の定量方法。
11. 前記巨大分子は、オリゴ糖である、
    請求項９に記載の定量方法。
    

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