JP2005341870A - 微生物試験方法及びそのためのキット - Google Patents

Abstract

【課題】 ある時点から一定時間経過後の被験面に存在する微生物の増減を、迅速かつ簡易にモニタリングできる微生物試験方法を提供することである。
【解決手段】 一枚の粘着シートに少なくとも二面の微生物の粘着捕集部位を設けた微生物試験用シートを用いることによる。具体的には、試験開始時に一面の粘着捕集部位を被験面に圧着・剥離して微生物を捕集し、一定時間経過後に他の一面の粘着捕集部位に被験面の微生物を捕集し、該捕集した微生物を蛍光物質等の標識物質で標識し、標識された微生物数を計測し、各計測数の差分を比較することによる。
【選択図】図２

Description

本発明は微生物の新規な試験方法に関する。より詳細には、試験開始時及び一定時間経過後に、微生物試験用粘着シートを用いて被験面の微生物を捕集し、該捕集した微生物を標識することにより経時的に被験面の該微生物の増減を判定する微生物の試験方法に関する。

種々の環境中における細菌などの微生物量を迅速かつ簡便に見積もることは、食品産業、医療、その他の現場における衛生管理や品質管理等にとって重要である。
従来、被験面上に存在する肉眼では観察することのできない微生物を観察及び計測するには、培養法、すなわち寒天などで賦形した固形の平板培地を被験面に押し当て、被験面上の微生物を寒天平板培地上に転写し、該微生物をそのまま平板培地上の適当な環境のもとで培養することにより出現するコロニーを肉眼で計測する方法が一般的に利用されていた。例えば、フードスタンプ（日水製薬株式会社製）を使用したアガースタンプ法等が挙げられる。

また、被験面を生理食塩水やリン酸緩衝液等を用いて十分にふき取りながら集積することにより微生物を洗い出し、それに緩衝液を再懸濁させ、寒天平板培地で混釈培養するスワブ法も用いられる。さらに、微生物捕捉能力のあるメンブレンフィルター等を用いる方法も用いられる。このメンブレンフィルター法は、水溶液中の微生物をメンブレンフィルターでろ過することによってメンブレンフィルター上に集積捕集した後、微生物と寒天培地とを十分に接触させて該フィルター上にコロニーを形成させ、コロニー数を計測する方法である。

これらの培養を伴う方法は、培養そのものに１〜２日を要し、又は微生物の種類によりそれ以上の約１週間の培養時間を必要とするので、リアルタイムでの微生物のモニタリングができないという重大な制約があった。さらに天然の細菌の多くは、生きてはいるが培養することができない状態（Rozak, D.B. et al.1984. Canadian Journal of Bacteriology 30:334-338）にあることが知られており、近年では培養せずに生きた微生物の量を見積もる手法に注目が集まっている。

こうした培養を伴わない微生物の検出法の中で、生理活性の有無を簡便に調べる方法としてカルボキシフルオレセインジアセテートを用いる方法（非特許文献１）が知られている。カルボキシフルオレセインジアセテートは、非極性、非蛍光性の化学物質で、細胞膜を容易に透過する。そして、細胞内でエステラーゼにより加水分解され、緑色蛍光を発するカルボキシフルオレセインを生成する。カルボキシフルオレセインは極性を有するため細胞内に蓄積され、青色光で励起すると緑色の蛍光を発する。カルボキシフルオレセイン由来の蛍光を発する細胞は、蛍光顕微鏡等の観察で容易に見分けられるので、細胞内エステラーゼ活性の有無を指標として、培養することなく微生物の生理状態を解析できる。

また近年、固体表面の微生物をサンプリングする手法として、粘着シートを用いる方法が示されている（特許文献１）。これは、非水溶性高分子化合物を主成分とする粘着層を有する微生物試験用粘着シートを、被験体である固体の表面に圧着・剥離して微生物を捕集集積した後、微生物を染色し得る１種以上の蛍光物質を含有する水溶液を該粘着層の表面に接触させ、染色された微生物を観察・計測することにより、迅速且つ簡便に固体表面上の微生物を検出する方法である。

これら微生物を培養することなく染色して測定する方法は、通常、微生物を含むサンプル溶液中で染色液と反応させるか又はフィルター上に微生物を捕集した後、染色液を反応させることにより行われるが、いずれの方法においても蛍光染色された輝点を計数とする微生物数としており、被験面上で実際に増殖した細菌数を検出することはできない。
また、増殖した細菌数を確認するために細胞内エステラーゼ活性の有無を指標とした場合、生菌数よりも多くの細菌数を計数するといった問題点もある。さらに、核酸結合性の蛍光試薬を用いた場合は、例えば生菌と死菌の区別は容易でないことから、増殖した菌数を確認することは困難であった。そのため、生理活性と核酸染色の二重染色法も試みられていたが煩雑であった。従って、食品検査においてはこれら蛍光試薬を用いた方法での正確な生菌数を測定することが困難である。
また、培養法により生菌数を測定し、細菌の増殖を確認することは可能であるが、培養時間が制約となり、迅速に試験結果を必要とする食品検査には十分とはいえない。

Yamaguchi, N. et al. 1997. Microbes and Enviroments 12:1-8 特開２００２−１４２７９７

本発明の目的は、ある時点から一定時間経過後の被験体の表面（以下、「被験面」ともいう）に存在する微生物の増減を迅速かつ簡易にモニタリングできる微生物試験方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、当該方法に使用する微生物試験用シート並びにキットを提供することである。

本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、一枚の粘着シートに少なくとも二面の微生物の粘着捕集部位を設けた微生物試験用粘着シートを用い、試験開始時に一面の粘着捕集部位を被験面に圧着・剥離して微生物を捕集し、一定時間経過後に他の一面の粘着捕集部位に被験面の微生物を捕集し、該捕集した微生物を蛍光物質等の標識物質で標識し、標識された微生物数を計測することで、迅速かつ簡便に微生物の増殖をモニタリングすることができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、
１．一枚の粘着シートに少なくとも二面の微生物の粘着捕集部位を設けた微生物試験用シートを用い、以下の工程を含む被験面の微生物の経時的増減を判定する微生物試験方法：
１）試験開始時に、上記微生物の粘着捕集部位のうち一面を被験面に圧着・剥離して微生物を捕集する工程；
２）一定時間経過後に、上記１）とは別の粘着捕集部位を被験面に圧着・剥離して微生物を捕集する工程；
３）各工程において捕集した微生物を標識物質にて標識し、被験面の微生物数を計測する工程；
４）１）及び２）で捕集した微生物の計測数の差分を比較する工程。
２．上記１）〜４）の工程のうち、２）の工程を異なる時に少なくとも２回以上行う前項１に記載の微生物試験方法。
３．標識物質が、捕集した微生物の生理活性を評価しうる物質である前項１又は２に記載の微生物試験方法。
４．微生物の生理活性を評価しうる物質が、細菌のエステラーゼ活性により蛍光を発揮するカルボキシフルオレセインジアセテートである前項３に記載の微生物試験方法。
５．標識物質が、核酸結合性物質である前項１又は２に記載の微生物試験方法。
６．非水溶性高分子化合物を主成分とする粘着層を有する微生物試験用シートであって、該粘着層を用いて微生物を捕集する粘着捕集部位を少なくとも二面備え、一面は試験開始時の初期値計測のための微生物捕集面であり、他の面は経時的な微生物数の計測のための微生物捕集面であることを特徴とする微生物試験用シート。
７．前項１〜５のいずれか一に記載の微生物試験方法に使用する微生物試験用シート。
８．前項６又は７に記載の微生物試験用シートと、捕集した微生物を標識する標識試薬を含む微生物試験キット。

本発明の微生物試験用シートを用いることにより、経時的に被験面の微生物の増減を迅速かつ簡便に判定することができる。例えば、食品の保存前に採取した微生物量と、保存後に採取した微生物量の差をとることで、食品表面で増殖した微生物、例えば細菌量を迅速かつ簡便に判定することができる。

本発明の微生物試験は、一枚の粘着シートに少なくとも二面の微生物の粘着捕集部位を設けた微生物試験用シートを用いることにより行う。

本発明に使用する微生物試験用シートは、非水溶性高分子化合物を主成分としてなる粘着層が基材上に集積された構造を有する。該粘着層は、被験面上の微生物を捕獲するに十分な粘着性を有するとともに、微生物染色用の水溶液に浸しても粘着剤が溶解しないことを特徴とする、平滑な表面構造を有する層である。

該微生物試験用シートは、基材の粘着層と接する面とは反対面に、基材の強度を強めたり、光学的な散乱防止や蛍光性物質を用いて発色した微生物の視認性を向上させるバックグラウンド色を形成させるために、さらにバッキング層を設けてもよい。

該微生物試験用シートの基材は、非水溶性で、粘着表面に大きな凹凸を形成させず、また、曲面や狭所表面にも自在に圧着させ得る柔軟な材質であれば特に限定されないが、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、塩化ビニル、布、不織布、紙、ポリエチレンラミネート紙等が例示される。中でも、平滑なポリエステル、ポリエチレン、塩化ビニル、ポリウレタンが基材として望ましい。また、基材の厚みは、支持体として十分な強度であれば特に制限はないが、約５〜２００μｍ程度が望ましい。

該微生物試験用シートの粘着捕集部位は、被験面上の微生物を捕獲するのに十分な捕集性を有するとともに、微生物染色用の水溶液を適用しても粘着剤が溶解しない平滑な表面構造を有する層で構成されていれば良い。例えば微生物を蛍光標識する際、蛍光物質が捕集層に含浸しないように、及び捕集層が溶けて捕集した微生物が移動しないように、捕集層の成分には、非水溶性粘着剤を含むものが好ましい。非水溶性粘着剤としては、例えば、アクリル系粘着剤やゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の疎水性粘着剤を用いることができる。さらには、蛍光画像取得に際して光学特性に影響が少ないという観点から、より捕集層の透明性の高いアクリル系粘着剤やシリコーン系粘着剤を選択することが好ましい。

アクリル系粘着剤としては、モノマーとして（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸ノニル、（メタ）アクリル酸デシルなどの（メタ）アクリル酸のアルキルエステルを主成分とし、これに（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸メトキシエチル、（メタ）アクリル酸エトキシエチル、（メタ）アクリル酸ブトキシエチル、（メタ）アクリル酸エチレングリコールといった親水性のモノマーを一種若しくは二種以上共重合させたものが挙げられる。さらに、このような粘着剤層はその粘着特性をより良好にするために、イソシアネート化合物、有機過酸化物、エポキシ基含有化合物、金属キレート化合物といった熱架橋剤による処理や、紫外線、γ線、電子線などの処理を行って架橋を施すことが好適である。

ゴム系粘着剤としては、天然ゴム、ポリイソブチレン、ポリイソプレン、ポリブデン、スチレン−イソプレン系ブロック共重合体、スチレン−ブタジエン系ブロック共重合体などの主ポリマーに粘着付与樹脂としてロジン系樹脂やテルペン系樹脂、クロマン−インデン系樹脂、テルペン−フェノール系樹脂、石油系樹脂を配合したものを用いることができる。シリコーン系粘着剤としては、ジメチルポリシロキサンを主成分とする粘着剤が例示される。

このような粘着捕集層の厚みは、被験面上への接着性や追従性、微生物捕捉性の観点から５〜１００μｍとするのが好ましい。また、捕集した微生物を顕微鏡などで計測するに際しては、粘着捕集部位に集積した微生物に焦点を合わすため、その表面の平滑度（凹凸差）は２０μｍ以下であることが好ましい。平滑度が２０μｍ以下であれば、顕微鏡の焦点の合致範囲が広くなり、計数が容易となる。平滑度は表面粗さ計あるいは電子顕微鏡などで微生物試験用シートの断面を観察し、粘着層表面の凸部の頂点から凹部の最低点までの高度差を測定して求めることができる。

微生物試験用シートに設けた微生物の粘着捕集部位は、被験面に圧着・剥離して微生物を捕集する部位をいう。少なくとも二面設けた粘着捕集部位の大きさは、かかる部位に捕集された微生物の計測数の差分を比較して経時的な増減を判定するため、各々一定面積であることが必要である。一定面積の粘着捕集部位は、一定面積の部分が少なくとも二ヶ所以上剥離できるように切り込みが加えられた剥離ライナーを、微生物試験用シートの粘着層上に重層することで確保することができる。

剥離ライナーを剥離後、露出した粘着捕集部位を被験面に圧着・剥離することにより、微生物を捕集することができる。微生物の捕集工程後、剥離ライナーは、元の位置に戻して微生物捕集作業後の面を覆うこともできる。もとの位置に剥離ライナーを戻すために、粘着捕集部位を露出させるための切り込みを加えた剥離ライナーは、一部分は切り込まないでヒンジ部となるようにすることもできる。このような剥離ライナーの素材は、通常粘着剤の剥離ライナーとして使用されるものであれば良く、その材質は特に限定されるものではない。

本発明の微生物試験用シートは、自体公知の方法により製造することができる。例えば、粘着層に用いられる高分子化合物を含有する溶液を基材上に塗布し、室温から２００℃で乾燥させることによって製造される。他にカレンダー法、キャスティング法や押出し成型法などの方法を用いることもできる。さらに、剥離することにより上記粘着捕集部位を露出させうる剥離ライナーを重層する。かくして得られたシートは、任意の形状に裁断して使用することができる。

本発明の微生物試験用シートを電子線あるいはγ線などの放射線を照射することにより、滅菌すると同時に粘着層に用いる化合物に架橋を施すこともできる。
また、エチレンオキサイドなどのガスによる滅菌を施すこともでき、滅菌した状態で微生物遮断性包材に封入することなどにより無菌状態を保持した形態をとることができる。

本発明の微生物の試験方法について説明する。
具体的には、上記微生物試験用シートを用いて、１）試験開始時に、上記微生物の粘着捕集部位のうち一面を被験面に圧着・剥離して微生物を捕集する工程；２）一定時間経過後に、上記１）とは別の粘着捕集部位を被験面に圧着・剥離して微生物を捕集する工程；３）各工程において捕集した微生物を標識物質にて標識し、被験面の微生物数を計測する工程；４）１）及び２）で捕集した微生物の計測数の差分を比較する工程を含む方法により行う。

本発明の試験方法の対象となる被験物は、微生物試験用シートの粘着捕集部位を圧着・剥離可能なものであれば特に限定されない。例えば食品衛生の現場では、圧着・剥離可能なものであれば食品そのものに適用することができる。また、設備、食品衛生に関連する機器、器具、容器、道具等にも適用することができる。その他、医療の現場では、医療設備、医療機器、医療器具等に適用することができる。

本発明において、「試験開始時」とは、微生物の増減を判定する際の初期をいい、「一定時間経過後」とは、被験面や試験の目的により経時的な微生物の増減を判定するのに必要な時間の経過後をいう。
例えば、食品の場合には、特定の温度、湿度等の環境下で一定時間食品を保存した後の微生物、例えば細菌の増加を確認するために一定時間経過後に捕集することができる。また、設備、機器、容器等については、洗浄、滅菌、除菌処理後の微生物の減少を確認するために、一定時間経過後に微生物を捕集することができる。さらに、目的に応じて、一定時間経過後の異なる時間に何度でも微生物を捕集することができる。複数回の微生物の捕集の為に、試験開始時の粘着捕集部位と必要な回数分の粘着捕集部位を備えた微生物試験用シートを使用することが好ましい。

本発明において、「微生物を標識物質にて標識する」ことは、微生物を捕集した粘着捕集部位に、標識物質等を含有する水溶液を滴下して行うことができる。標識物質としては、色素、発光物質、蛍光物等が挙げられる。例えば微生物を染色しうる溶液、又は微生物と反応して発色しうる物質等を含む溶液等と、微生物を接触させることにより標識することができる。または、検査対象である微生物に含まれる細胞成分や、細胞から放出される物質を標識しうるものであってもよい。その代表的なものとして、核酸やタンパク質を染色する蛍光染色液が挙げられる。特に、捕集した微生物の検出時の生死判定としてエステラーゼ活性をもつ細菌を染色するカルボキシフルオレセインジアセテートが好適に用いられる。

このような微生物の標識は、微生物を捕集した直後に行うこともできるし、微生物を捕集した後に粘着捕集部位を剥離ライナーを重層しておき、最終判定時に他の捕集微生物と同時に標識することもできる。本発明によれば、細菌等の微生物の培養操作を要さないので、数分以内に増殖した細菌を検出することができる。

微生物の検出又は計数は、蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡等の顕微鏡若しくは他の適当な光学機器を用いて光学的画像を形成させ、この像を画像解析することにより行うことができる。他の光学機器としては、微生物をレーザーで高速スキャニングし、個々の微生物から得られたシグナルをグラフィカル表示するレーザースキャニングサイトメーターが例示される。

このような試験の対象となる微生物は、細菌や放線菌などの原核生物、酵母やカビなどの真核生物、下等藻類、ウイルス等が挙げられる。特に食品を被験物とする場合は、大腸菌や大腸菌群等の食品検査対象菌や食中毒菌及び食品の腐敗にかかわる細菌などが測定対象微生物となる。

本発明は又、上記の微生物試験方法に使用するための微生物試験キットを提供する。
本発明の微生物試験キットは、本発明の微生物試験用シートの他、微生物を標識しうる試薬を一種以上含むことができる。

以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。

（実施例１）
１）微生物試験用シートの作製
イソノニルアクリレート／２−メトキシエチルアクリレート／アクリル酸（６５／３０／５仕込重量比）にアゾイソブチロニトリルを重合開始剤として得られたゲル分率４０％（ｗ／ｗ）の共重合体トルエン溶液を得た。この溶液を乾燥時の厚みが２０μｍとなるように２５μｍ厚の透明ポリエステルフィルムに塗布し１３０℃で５分乾燥した。粘着面に剥離ライナーを積層し、微生物試験面のための粘着捕集部位として、剥離部を二面設けた（図１参照）。この剥離部は剥離ライナーの一側面がヒンジ部となっており、微生物を捕集した後は粘着剤面に再貼付することができる（図２参照）。本微生物試験用シートは線量２５ｋグレイのγ線滅菌を行った。

２）微生物の捕集
１）で作製した微生物試験用シートの片方の微生物試験面（初期値測定値）の剥離ライナーを剥がし、食品表面（被験面）に粘着捕集部位を押し付けて圧着した後に剥離し、微生物を捕集した。食品を室温（２５℃）に保存し、４８時間後に残る片方の粘着捕集部位（増殖判定面）を食品表面に押し付け増殖した細菌を捕集した。

３）染色
６−カルボキシフルオレセインジアセテート（シグマ製）を１０ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルフォキシドに溶解した。この液をリン酸緩衝液で６−カルボキシフルオレセインジアセテートの終濃度が４００μｇ／ｍＬとなるように希釈し、染色液を得た。適当量の染色液を２）で得た微生物試験用シートの粘着捕集部位に滴下し、粘着捕集部位全体が染色液と接触するようにして染色を室温で３分間行い、その後染色液をリン酸緩衝液で洗浄除去した。

４）観察
蛍光顕微鏡下、青色光（４９５ｎｍ）で励起を行い、カルボキシフルオレセイン由来の緑色蛍光（５２０ｎｍ）の輝点を１０００倍の倍率で観察し、一視野あたりの微生物数を計数し、１０視野の平均値を求めた。

５）結果
上記により測定した結果を表１に示した。本発明粘着シートの初期値測定面と増殖判定面の微生物数の差から、増加した微生物数をそれぞれ求めた。４８時間保存後に微生物数の増加が判定できた。また、計測時間は１５分と短く迅速な判断を行うことができた。

（比較例）
培養法における食品の微生物数（細菌数）の増加を調べた。食品試料液は、各食品をストマフィルターに採取し、９倍量の滅菌希釈液を加えてストマッカーで均一化して調製した。得られた食品試料液の段階希釈系列サンプルを作製し、標準平板菌数測定法に従って、３５℃、２４時間培養した。
その結果を表２に示した。培養法においても細菌の増殖を計側することは可能であったが、結果を得るまでに最低２４時間の培養時間を要した。

本発明の微生物試験方法により、微生物試験用シートの粘着捕集部位を被験面に圧着・剥離して、存在する微生物を粘着捕集部位に転写し、前培養なしで微生物を染色し、微生物をシングルセルのまま観察することができる。これにより、食品の保存状態の適切さを迅速に判定し、食品の微生物（細菌）検査などに利用することができる。応用分野として、惣菜や弁当などの生鮮食品などの輸送による細菌の増殖量の変化や加工食品の保存期間による細菌量の増加から賞味期限や保存方法を決定するための検査に適用することができる。また、例えば食品衛生に関連する機器、器具、容器、道具等や、医療の現場では医療設備、医療機器、医療器具等の洗浄、除菌、滅菌効果の確認のために適用することができる。

本発明の微生物用試験シートの模式図を示す図である。（実施例１） 本発明の微生物用試験シートの使用態様を示す図である。（実施例１）

符号の説明

１ 粘着捕集部位
２ 剥離ライナー
３ 基材

Claims (8)

1. 一枚の粘着シートに少なくとも二面の微生物の粘着捕集部位を設けた微生物試験用シートを用い、以下の工程を含む被験面の微生物の経時的増減を判定する微生物試験方法：
   １）試験開始時に、上記微生物の粘着捕集部位のうち一面を被験面に圧着・剥離して微生物を捕集する工程；
   ２）一定時間経過後に、上記１）とは別の粘着捕集部位を被験面に圧着・剥離して微生物を捕集する工程；
   ３）各工程において捕集した微生物を標識物質にて標識し、被験面の微生物数を計測する工程；
   ４）１）及び２）で捕集した微生物の計測数の差分を比較する工程。
2. 上記１）〜４）の工程のうち、２）の工程を異なる時に少なくとも２回以上行う請求項１に記載の微生物試験方法。
3. 標識物質が、捕集した微生物の生理活性を評価しうる物質である請求項１又は２に記載の微生物試験方法。
4. 微生物の生理活性を評価しうる物質が、細菌のエステラーゼ活性により蛍光を発揮するカルボキシフルオレセインジアセテートである請求項３に記載の微生物試験方法。
5. 標識物質が、核酸結合性物質である請求項１又は２に記載の微生物試験方法。
6. 非水溶性高分子化合物を主成分とする粘着層を有する微生物試験用シートであって、該粘着層を用いて微生物を捕集する粘着捕集部位を少なくとも二面備え、一面は試験開始時の初期値計測のための微生物捕集面であり、他の面は経時的な微生物数の計測のための微生物捕集面であることを特徴とする微生物試験用シート。
7. 請求項１〜５のいずれか一に記載の微生物試験方法に使用する微生物試験用シート。
8. 請求項６又は７に記載の微生物試験用シートと、捕集した微生物を標識する標識試薬を含む微生物試験キット。

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